CN112931177B - 一种获取无附生菌石莼的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于藻类研究领域，公开了一种获取无附生菌石莼的方法，包括：A、将新鲜石莼置于灭菌的原位海水中，用灭菌的毛笔在所述新鲜石莼表面刷洗，获得刷洗石莼藻体；B、将所述刷洗石莼与多酶清洗剂混合，超声清洗，获得酶洗石莼藻体；C、将所述酶洗石莼与抗生素混合，进行除菌，获得除菌石莼藻体；D、将所述除菌石莼藻体放入已灭菌的培养基培养，获得无附生菌石莼，解决现有技术无法获取正常生长的无附生菌石莼的问题。

Description

一种获取无附生菌石莼的方法
技术领域
本发明属于藻类研究领域，特别涉及一种获取无附生菌石莼的方法。
背景技术
藻类方面从理论到技术已经得到了前所未有的发展，但与其他学科相比较而言，其起步较晚，发展相对滞后，无法获得一些藻的无菌株是制约藻类学科研究的主要因素。藻类的研究很大程度上受限于获得研究目标藻种无菌株的困难。
就石莼而言，附着细菌在石莼的形态发生中起着重要作用。由于微生物之间常常会存在着某种特殊的关系或者共生、内生、寄生等，一旦破坏这种关系，就会不利于藻类的生长，给无菌株的制备带来困难；有的时候却是因为常规的方法在去除杂菌的过程中同时对藻类产生抑制或者杀死，所以迄今为止，仍然没有一整套通用的方法适用于所有的藻种细菌的诱导作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种获取无附生菌石莼的方法，解决现有技术无法获取正常生长的无附生菌石莼的问题。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案如下：
一种获取无附生菌石莼的方法，包括：
A、将新鲜石莼置于灭菌的原位海水中，用灭菌的毛笔在所述新鲜石莼表面刷洗，获得刷洗石莼藻体；
B、将所述刷洗石莼与多酶清洗剂混合，超声清洗，获得酶洗石莼藻体；
C、将所述酶洗石莼分为两部分，一部分所述酶洗石莼用无菌海水冲洗后破碎离心，过滤上清液，获得无菌提取液；
D、将所述酶洗石莼另一部分与抗生素混合，进行除菌，获得除菌石莼藻体；
E、将所述除菌石莼藻体加入已灭菌的培养基和所述无菌提取液，进行培养，获得无附生菌石莼。
现有研究表明，石莼的形态建成甚至生长都需要其附生菌提供活性物质或其诱导产生的活性物质，但无法知晓这种活性物质的具体成分，导致通常状态下的无附生菌石莼均无法正常生长。而本发明在实验过程中发现，经过将酶洗石莼进行破碎，获得无菌提取液，加入到培养基中，就可以使无附生菌石莼在保持无附生菌状态下得到正常生长。
优选的，包括：
A、将所述新鲜石莼置于灭菌的原位海水中，用灭菌的毛笔在所述新鲜石莼表面刷洗，获得所述刷洗石莼藻体；
B、将所述刷洗石莼与放入锥形瓶，按所述刷洗石莼：无菌海水：所述多酶清洗剂的体积质量比为2g：300ml：10ml进行混合，放在摇床上180rpm振荡2h后，超声清洗10mim-15min，获得所述酶洗石莼藻体；
C、将所述酶洗石莼按质量比1:1分为两部分，一部分所述酶洗石莼用无菌海水冲洗3次，之后放置于超声破碎仪中以300w，10s：10s超声破碎20mins，之后倒入离心管中，在4℃，6000rpm下高速离心15min，之后超净工作台操作，倒出上清液，用0.22μm滤膜抽滤，获得所述无菌提取液；
D、将所述酶洗石莼另一部分与抗生素混合，进行5天-7天的除菌处理，获得所述除菌石莼藻体；
E、将所述除菌石莼藻体，放入灭菌锥形瓶中，按所述除菌石莼藻体：已灭菌的所述培养基：所述无菌提取液的体积质量比为2g：300ml：10ml进行混合，光照培养箱温度20℃，光照强度100μmol/(m2.s)，光暗周期为12h：12h，用充气泵持续充无菌空气培养，获得所述无附生菌石莼。
优选的，步骤B中，所述多酶清洗剂包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、表面活性剂中的一种或多种；步骤C中，所述抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素、放线菌酮中的一种或多种。
多酶清洗剂可以裂解石莼表面的大多菌细胞，且多酶清洗剂对菌的伤害大，对藻体本身无明显伤害。经过实验惊喜地发现，使用多酶清洗剂灭菌后，再使用氨苄青霉素、卡那霉素、放线菌酮对石莼进行联合除菌，不仅能将石莼上的附生菌完全杀灭，而且能保持石莼的正常生长，从而实现了正常生长的无附生菌石莼的获取。
优选的，步骤C中，所述抗生素包括：所述氨苄青霉素、所述卡那霉素、所述放线菌酮按质量浓度比6:5:5混合。
优选的，步骤C中，所述氨苄青霉素的工作浓度为60ug/ml、所述卡那霉素的工作浓度为50ug/ml、所述放线菌酮的工作浓度为50ug/ml，联合对所述酶洗石莼进行除菌。
藻体表面的细菌种类是十分复杂的，石莼表面主要是革兰氏阴性菌(α-变形菌、γ-变形菌、拟杆菌门等)、革兰氏阳性菌(放线菌门)等，用单一抗生素无法完全除菌。与单一抗生素相比，使用氨苄青霉素、卡那霉素、放线菌酮进行联合除菌，不仅能确保石莼表面细菌的完全杀灭，并且每种抗生素浓度用量更小，对藻体本身的伤害也相应减小。
优选的，步骤D中，光照时间为每天9:00～21:00，完成12h：12h的光照周期；所述充气泵上设置0.22μm滤头过滤空气，获得所述无菌空气。
优选的，步骤D中，所述培养基为F/2培养基，包括如下步骤配置：
①分别配置NaNO3母液、NaH2PO4.2H2O母液、Na2EDTA母液、微量元素母液、FeCl3·6H2O母液、维生素溶液母液；
②将所述NaNO3母液、所述NaH2PO4.2H2O母液、所述Na2EDTA母液、所述微量元素母液混合，高温灭菌；
③灭菌完成后在超净工作台操作，分别加入所述FeCl3·6H2O母液、所述维生素溶液母液，并用超纯水定容；
④调节pH至8.0，获得工作液。
优选的，所述工作液中，所述NaNO3母液、所述NaH2PO4.2H2O母液、所述Na2EDTA母液、所述微量元素母液与超纯水的体积比1:1:1:1:1:0.01:1000。
优选的，所述NaNO3母液包括NaNO3与超纯水按体积质量比7.5g：100ml配置；所述NaH2PO4.2H2O母液包括NaH2PO4.2H2O与超纯水按体积质量比0.565g：100ml配置；所述Na2EDTA母液包括Na2EDTA与超纯水按体积质量比0.436g：100ml配置；所述微量元素母液包括CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O与超纯水按体积质量比0.01g：0.023g：0.012g：0.18g：0.007g：1000ml配置；所述FeCl3·6H2O母液包括FeCl3·6H2O与超纯水按体积质量比0.316g：100ml配置；所述维生素溶液母液包括维生素B12、盐酸硫胺素、生物素与超纯水按体积质量比5mg：1mg：5mg：10000ml配置。
优选的，步骤②中，所述高温灭菌为在105℃高温蒸汽下，灭菌15min；步骤③中，所述所述FeCl3·6H2O母液和所述维生素溶液母液使用前经过0.22μm滤头抽滤灭菌；步骤④中，使用1M的NaOH溶液或1M的HCl溶液调节pH。
实施本发明，具有如下有益效果：
本发明实现了正常生长的无附生菌石莼的获取，为后续对藻菌关系的研究提供了更好的实验体。针对无附生菌石莼进行研究，能丰富对细菌和石莼共生关系的认识，可以排除一定附生菌的影响来研究外界条件对石莼的影响，更直接的观察外界条件变化对石莼本身的影响。
附图说明
图1是无附生菌石莼的第一共聚焦扫描图；
图2是无附生菌石莼的第二共聚焦扫描图；
图3是无附生菌石莼的第三共聚焦扫描图；
图4是有菌石莼的第一共聚焦扫描图；
图5是有菌石莼的第二共聚焦扫描图；
图6是有菌石莼的第三共聚焦扫描图；
图7是无附生菌石莼的鲜重变化实验图；
图8是有菌石莼的鲜重变化实验图；
图9是无附生菌石莼的PSⅡ最大光能转化效率实验图；
图10是有菌石莼的PSⅡ最大光能转化效率实验图；
图11是无附生菌石莼的PSⅡ实际光能转化效率实验图；
图12是有菌石莼的PSⅡ实际光能转化效率实验图；
图13是灭菌锥形瓶无菌培养示意图；
其中，瓶塞1，进气管2，出气管3，过滤头4。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，但本领域技术人员了解，下述实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改变和变化，都在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种获取无附生菌石莼的方法，包括：
A、将新鲜石莼称重4g，将称量好的藻体置于灭菌的原位海水中，用灭菌的毛笔在藻体表面刷洗；
B、将初步处理后的石莼放入锥形瓶，加入600ml无菌海水和20ml多酶清洗剂，多酶清洗剂包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、表面活性剂，本实施例使用市售3M快速高效多酶清洗液剂(明尼苏达矿业制造医用器材有限公司)，放在摇床上180rpm振荡2h后，超声清洗10mim-15min；
C、将多酶清洗剂处理后的石莼取一半，用无菌海水冲洗3次，放置于超声破碎仪(Ultrasonic Homogenizer JY92-ⅡN)中300w，10s：10s超声破碎20mins，将破碎液倒入离心管，4℃，6000rpm高速离心15min，在紫外无菌操作台中，倒出上清液，用0.22μm滤膜抽滤，获得无菌提取液，命名为Thallium；
D、将多酶清洗剂处理后的石莼另一半在超净工作台内操作，配置3种抗生素组合：氨苄青霉素6mg/ml；卡那霉素5mg/ml；放线菌酮5mg/ml上述抗生素各取1ml加入到100mlF/2培养基中(已灭菌锥形瓶)使其工作浓度为50ug/ml、50ug/ml、60ug/ml联合对另一半石莼进行除菌，进行5天-7天的除菌处理，获得所述除菌石莼藻体；
E、将所述除菌石莼藻体，放入500ml灭菌锥形瓶中，加入300ml已灭菌的F/2培养基和10ml无菌提取液Thallium，光照培养箱温度20℃；光照强度100μmol/(m2.s)；光暗周期为12h：12h(光照时间9:00-21:00)；用充气泵24h充无菌空气(用0.22μm滤头过滤)培养，得到无附生菌石莼。灭菌锥形瓶如图13所示，用瓶塞1进行密封，瓶塞1上设置进气管2和出气管3，进气管2一端连接充气泵，另一端深入到锥形瓶内液面以下，出气管3保持在液面以上一段距离。进气管2和出气管3上分别设置过滤头4，过滤头4为0.22μm聚四氟乙烯(PTFE)过滤头，可以过滤，获得无菌空气。
培养基为F/2培养基，包括如下步骤配置：
①分别配置NaNO3母液、NaH2PO4.2H2O母液、Na2EDTA母液、微量元素母液、FeCl3·6H2O母液、维生素溶液母液，如表1～表3所示，用超纯水分别溶解定容；
②配置1000ml工作液时分别加入①～④母液1ml，高温蒸汽灭菌105℃，15min；
③灭此步骤在超净工作台操作，灭菌后分别加入母液5)1ml，⑥10ul(可用0.22um抽滤灭菌)，定容至1L；
④用1M NaOH或HCl调节pH至8.0，获得工作液。
表1 F/2 Medium
成分 含量 Per
①NaNO<sub>3</sub> 7.5g 100ml
②NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>.2H<sub>2</sub>O 0.565g 100ml
③Na<sub>2</sub> EDTA 0.436g 100ml
④微量元素
⑤Fecl<sub>3</sub>·6H2O 0.316g 100ml
⑥维生素溶液
表2 ④微量元素溶液(Trace elements stock solution)
Figure BDA0002940926950000061
表3⑥维素溶液(Vitamin solution)大母液配置
Figure BDA0002940926950000062
Figure BDA0002940926950000071
⑥维素溶液最终母液配置：取1ml大母液，定容至100ml，获得维生素溶液母液。
对该无附生菌石莼进行共聚焦扫描，结果如图1～3所示。
从图1～3可以看出，石莼表面不存在荧光点，且细胞间也不存在荧光点，表明处理后的石莼经过培育，石莼表面、石莼细胞间未携带有附生菌，可以获得无附生菌石莼。
对比例1
一种石莼的培育方法，操作与条件控制同实施例1，区别在于，获得无菌提取液Thallium后，省略步骤D，直接将2g新鲜石莼，放入500ml灭菌锥形瓶中，加入300ml已灭菌的F/2培养基和10ml无菌提取液Thallium，光照培养箱温度20℃；光照强度100μmol/(m2.s)；光暗周期为12h：12h(光照时间9:00-21:00)；用充气泵24h充无菌空气(用0.22μm滤头过滤)培养，获得石莼。灭菌锥形瓶如图13所示，用瓶塞1进行密封，瓶塞1上设置进气管2和出气管3，进气管2一端连接充气泵，另一端深入到锥形瓶内液面以下，出气管3保持在液面以上一段距离。进气管2和出气管3上分别设置过滤头4，过滤头4为0.22μm聚四氟乙烯(PTFE)过滤头，可以过滤，获得无菌空气。对该石莼进行共聚焦扫描，结果如图4～6所示。
从图4～6可以看出，石莼表面存在明显荧光点，且细胞间也存在有荧光点，表明未处理的新鲜石莼即使在无菌状态中培育，石莼表面、石莼细胞间仍携带有附生菌，无法获得无附生菌石莼。
效果例1
对实施例1与对比例1获得的石莼进行鲜重变化对比实验，结果如图7、图8所示。
从图7、图8可以看出，无附生菌石莼的鲜重增重与有附生菌石莼相比没有明显差别，证明运用本发明方法在无附生菌状态下可以保证石莼的正常生长。
效果例2
对实施例1与对比例1获得的石莼进行PSⅡ最大光能转化效率对比实验，结果如图9、图10所示。对实施例1与对比例1获得的石莼进行PSⅡ实际光能转化效率对比实验，结果如图11、图12所示。
从图9、图10可以看出，无附生菌石莼的PSⅡ最大光能转化效率显著低于有附生菌石莼，而从图11、图12可以看出，无附生菌石莼的PSⅡ实际光能转化效率与有附生菌石莼相当，甚至略优于有附生菌石莼，证明运用本发明方法在无附生菌状态下可以保证石莼的正常生长，并且石莼的光能转化效能由附生菌产生，又被附生菌消耗。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (7)

1.一种获取无附生菌石莼的方法，其特征在于，包括：
A、将新鲜石莼置于灭菌的原位海水中，用灭菌的毛笔在所述新鲜石莼表面刷洗，获得刷洗石莼藻体；
B、将所述刷洗石莼藻体放入锥形瓶，按所述刷洗石莼藻体：无菌海水：多酶清洗剂的体积质量比为2g：300ml：10ml进行混合，放在摇床上180rpm振荡2h后，超声清洗10min -15min，获得酶洗石莼藻体；
C、将所述酶洗石莼藻体按质量比1:1分为两部分，一部分所述酶洗石莼藻体用无菌海水冲洗3次，之后放置于超声破碎仪中以300w，10s：10s超声破碎20min，之后倒入离心管中，在4℃，6000rpm下高速离心15min，之后超净工作台操作，倒出上清液，用0.22µm滤膜抽滤，获得无菌提取液；
D、将所述酶洗石莼藻体另一部分与抗生素混合，进行5天-7天的除菌处理，获得除菌石莼藻体；
E、将所述除菌石莼藻体，放入灭菌锥形瓶中，按所述除菌石莼藻体：已灭菌的培养基：所述无菌提取液的体积质量比为2g：300ml：10ml进行混合，光照培养箱温度20℃，光照强度100µmol/(m2·s)，光暗周期为12 h：12 h，用充气泵持续充无菌空气培养，获得无附生菌石莼；
步骤B中，所述多酶清洗剂包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、表面活性剂中的一种或多种；步骤D中，所述抗生素包括：氨苄青霉素、卡那霉素、放线菌酮按质量浓度比6:5:5混合。
2.如权利要求1所述获取无附生菌石莼的方法，其特征在于，步骤D中，所述氨苄青霉素的工作浓度为60µg/ml、所述卡那霉素的工作浓度为50µg/ml、所述放线菌酮的工作浓度为50µg/ml，联合对所述酶洗石莼藻体进行除菌。
3.如权利要求1所述获取无附生菌石莼的方法，其特征在于，步骤E中，光照时间为每天9:00~21:00，完成12 h：12 h的光照周期；所述充气泵上设置0.22µm滤头过滤空气，获得所述无菌空气。
4.如权利要求1所述获取无附生菌石莼的方法，其特征在于，步骤D中，所述培养基为F/2培养基，包括如下步骤配置：
①分别配置NaNO3母液、NaH2PO4·2H2O母液、Na2EDTA母液、微量元素母液、FeCl3·6H2O母液、维生素溶液母液；
②将所述NaNO3母液、所述NaH2PO4·2H2O母液、所述Na2EDTA母液、所述微量元素母液混合，高温灭菌；
③灭菌完成后在超净工作台操作，分别加入所述FeCl3·6H2O母液、所述维生素溶液母液，并用超纯水定容；
④调节pH至8.0，获得工作液。
5.如权利要求4所述获取无附生菌石莼的方法，其特征在于，所述工作液中，所述NaNO3母液、所述NaH2PO4·2H2O母液、所述Na2EDTA母液、所述微量元素母液、所述FeCl3·6H2O母液、所述维生素溶液母液与超纯水的体积比1:1:1:1:1:0.01:1000。
6.如权利要求4所述获取无附生菌石莼的方法，其特征在于，所述NaNO3母液包括NaNO3与超纯水按体积质量比7.5g：100ml配置；所述NaH2PO4·2H2O母液包括NaH2PO4·2H2O与超纯水按体积质量比0.565g：100ml配置；所述Na2EDTA母液包括Na2EDTA与超纯水按体积质量比0.436g：100ml配置；所述微量元素母液包括CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、MnCl2·4H2O、Na2MoO4·2H2O与超纯水按体积质量比0.01g：0.023g：0.012g：0.18g：0.007g：1000ml配置；所述FeCl3·6H2O母液包括FeCl3·6H2O与超纯水按体积质量比0.316g：100ml配置；所述维生素溶液母液包括维生素B12、盐酸硫胺素、生物素与超纯水按体积质量比5mg：1mg：5mg：10000ml配置。
7.如权利要求4所述获取无附生菌石莼的方法，其特征在于，步骤②中，所述高温灭菌为在105℃高温蒸汽下，灭菌15 min；步骤③中，所述FeCl3·6H2O母液和所述维生素溶液母液使用前经过0.22µm滤头抽滤灭菌；步骤④中，使用1M 的NaOH溶液或1M的 HCl溶液调节pH。
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