CN102864191A - 肝素双糖混合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肝素双糖混合物，其制备方法，使用该双糖混合物作为标准物质对肝素或者低分子量肝素进行HPLC分析的方法，以及所述双糖混合物的应用。
Description
技术领域
本发明涉及肝素双糖混合物，其制备方法，使用该双糖混合物作为标准物质对肝素或者低分子量肝素进行HPLC分析的方法，以及所述双糖混合物的应用。
背景技术
肝素(heparin)是一种糖胺聚糖类天然药物，于1916年被Mclean发现具有抗凝血功能。1935年开始用作临床抗凝药物，成为仅次于胰岛素的第2大天然产物药物。广泛用于治疗血栓塞、暴发性流脑、败血症、肾炎、急性心肌梗塞、动脉硬化等疾病，还具有澄清血浆脂质，降低胆固醇，抗平滑肌增生、促进纤维蛋白溶解等作用。
肝素的化学本质是长短不一的酸性粘多糖长链的混合物，由硫酸化或乙酰化不同的己糖醛酸(UA)和葡萄糖胺(GlcN)双糖单位交替连接构成，形成分子量4～40kDa的糖链混合物。
为了从肝素源中产生低分子量肝素，必须将较长的肝素多糖链打断成较短的低分子量链。这一过程可以通过化学或酶的解聚作用来进行。
将肝素用酶法或β消除法充分分解为双糖时，主要产生8种双糖：
α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS-6S(I-S)
α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNAc-6S(I-A)
α-ΔUA-[1→4]-GlcNS-6S(II-S)
α-ΔUA-[1→4]-GlcNAc-6S(II-A)
α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS(III-S)
α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNAc(III-A)
α-ΔUA-[1→4]-GlcNS(IV-S)
α-ΔUA-[1→4]-GlcNAc(IV-A)
这8种双糖在猪肠黏膜或其它来源的肝素和低分子肝素中的含量大致保持恒定，利用这一点，通过分析双糖组成可以判断肝素或低分子肝素的来源，也可分析生产中的批次间差异。
以SAX-HPLC法测定肝素或低分子肝素中的双糖种类和含量比例，可作为一种质量是否合格的检测手段。由于所用SAX-HPLC柱会在使用过程中渐渐因柱效下降而引起双糖出峰位置漂移，这会对双糖成分的判断带来干扰，需要在每次使用前先以标准双糖来标定出峰位置；并且，由于其中I-S含量过高，会掩盖其他弱势峰是在HPLC图谱上如果有某个组分峰极高大时，其他组分峰在图上就太弱小以至于接近基线而像是噪音峰，不利于对其他双糖含量进行分析。
本申请的发明人经过长期研究发现，通过本发明方法生产的双糖混合物中不仅含有上述8种标准肝素双糖，而且这8种双糖的比例比较温和，使用本发明双糖混合物作为HPLC分析中的标准物质时，8个标准物的峰都能比较明显地辨别出。在每次测定前均先用此混合双糖做标定，则每次测定目标物的双糖组分能确定辨别。
并且，本发明中的标准双糖混合物，不但可以用做HPLC分析时的标准，还可以用来检测以肝素双糖为作用底物的酶如肝素双糖脱硫酸酶、肝素双糖双键消除酶等的存在。在肝素酶中有时会含有这两种杂质酶，其存在会导致肝素酶作用的最终产物被继续作用，从而影响肝素酶降解反应后的色谱分析。所以在使用前对肝素酶中是否含有这二种杂质酶做检测是很重要的。
与现有技术中的相关方法相比，本发明简单易操作，具有极高的实际使用价值。
本发明提出一种标准双糖混合物的制备方法，通过将肝素先用肝素酶I充分降解为二糖、四糖、六糖混合物，取其中的四糖和六糖，再分别以肝素酶II、III联合充分降解，分离出产生的双糖，这样得到两种混合双糖，均含所有8种前述标准肝素双糖，而且这8种双糖的比例比较温和。可以使用这二种混合双糖之一或其混合物，作为HPLC分析的标准物质。
因此，本发明方法的创新点之一在于先用肝素酶I充分作用肝素，将肝素中含量过高的I-S双糖除掉大部分，这样获得的双糖混合物色谱图上不致因I-S峰过于高大而掩盖其他弱势双糖峰；另外将这样的双糖混合物用于检测肝素双糖脱硫酸酶、肝素双糖双键消除酶等为本发明首创。
发明内容
在本发明的一方面中，本发明提供了一种标准双糖混合物，在所述混合物中，含有肝素双糖1-8，肝素双糖1-8分别为：I-S，I-A，II-S，II-A，III-S，III-A，IV-S，IV-A。。
在本发明的另一方面，本发明提供了如上所述的标准双糖混合物的制备方法，所述方法包括：
步骤1、肝素样品用肝素酶I(编号EC 4.2.2.7.)降解；
步骤2、对步骤1所得的降解产物中的二、四、六糖进行分离，得到二糖，四糖，六糖；
步骤3、步骤2中分离出的四糖、六糖分别用肝素酶II(肝素裂解酶II)、肝素酶III(编号EC 4.2.2.8.)降解；
步骤4、两种降解物分别用层析柱分离，分别分离出二糖和四糖；
步骤5、步骤4得到两种二糖混合物，即为本发明的第一种双糖混合物和第二种双糖混合物。
在进一步的实施方案中，所述步骤1的降解作用可以在4℃～35℃下进行，优选在8℃～30℃下进行，更优选在室温下(25℃)进行。
在进一步的实施方案中，所述步骤1的降解作用可以进行2-48小时，更优选2-24小时。
在进一步的实施方案中，在步骤2中，利用柱层析方法对步骤1中所得的降解产品进行分离；优选在该方法中使用分子量分离范围100-10000的凝胶过滤柱，比如聚丙烯酰胺类、葡聚糖凝胶类、琼脂糖凝胶类，或其他类凝胶过滤柱；优选使用Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)。
在上述步骤2的洗脱过程中，本领域技术人员可以根据选择的洗脱柱选择适当的洗脱液进行洗脱，例如氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢铵。在优选的实施方案中，例如在洗脱柱为Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)的情形中，可以使用0.1-1.0M(更优选0.2M)碳酸氢铵平衡并洗脱。
在洗脱分离过程中，洗脱液的流速可以由本领域技术人员适当选择，优选0.1-5.0ml/min，最优选0.1-1.0ml/min。
在进一步的实施方案中，所述步骤3的降解作用可以在4℃～35℃下进行，优选在8℃～25℃下进行，更优选在室温下进行。
在进一步的实施方案中，所述步骤3的降解作用可以进行6-48小时，更优选6-24小时。
在进一步的实施方案中，在步骤4中，利用分子量分离范围100-10000的凝胶过滤柱，比如聚丙烯酰胺类、葡聚糖凝胶类、琼脂糖凝胶类，或其他类凝胶过滤柱；优选使用Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)。
在上述步骤2的洗脱过程中，本领域技术人员可以根据选择的洗脱柱选择适当的洗脱液进行洗脱，例如氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢铵等等的水溶液。在优选的实施方案中，例如在洗脱柱为Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)的情形中，可以使用0.1-1.0M(更优选0.2M)碳酸氢铵平衡并洗脱。
在洗脱分离过程中，洗脱液的流速可以由本领域技术人员适当选择，优选0.1-5.0ml/min，最优选0.1-1.0ml/min。
在上述实施方案中，所述标准双糖混合物既可以是上述方法中获得的双糖混合物1，也可以是双糖混合物2，还可以是双糖混合物1和2的混合物。
在进一步优选的实施方案中，最优选步骤1为：取肝素样品，溶于Tris-HCl(50mM，含CaCl210mM，pH7.0)缓冲液中，优选肝素与Tris-HCl的质量体积比为200∶1-10(mg∶ml)，加入肝素酶I(50mM Tris-HCl溶液，含CaCl210mM，pH7.0)2-20IU，在室温下，酶解2-24小时。
在进一步优选的实施方案中，最优选步骤2为：取步骤1中获得的降解产物，上一根Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以0.2M碳酸氢铵平衡并洗脱，流速0.1-1.0ml/min，分部收集，先后得到六糖、四糖、双糖，将四糖和六糖分别汇合收集，60℃旋转浓缩。
在进一步优选的实施方案中，最优选步骤3为：向步骤2获得的四、六糖组分中，分别加入0.1-2.0IU肝素酶II和0.2-5.0IU肝素酶III(均为50mM Tris-HCl溶液，含CaCl210mM，pH7.0)，在室温下，酶解6-24小时。
在进一步优选的实施方案中，最优选步骤4为：将步骤3中获得的两种降解物分别上一根Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以0.2M碳酸氢铵平衡并洗脱，流速0.1-1.0ml/min，分部收集，先后得到四糖、双糖
在进一步的实施方案中，本发明提供了如上所述的标准双糖混合物的制备方法，所述方法包括：：
步骤1、取肝素样品，溶于Tris-HCl(50mM，含CaCl210mM，pH7.0)缓冲液中，优选肝素与Tris-HCl的质量体积比为200∶1-10(mg∶ml)，加入肝素酶I(50mMTris-HCl溶液，含CaCl210mM，pH7.0)2-20IU，在室温下，酶解2-24小时；
步骤2、取步骤1中获得的降解产物，上一根Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以0.2M碳酸氢铵平衡并洗脱，流速0.1-1.0ml/min，分部收集，先后得到六糖、四糖、双糖，将四糖和六糖分别汇合收集，60℃旋转浓缩；
步骤3、向步骤2获得的四、六糖组分中，分别加入0.1-2.0IU肝素酶II和0.2-5.0IU肝素酶III(均为50mM Tris-HCl溶液，含CaCl210mM，pH7.0)，在室温下，酶解6-24小时；
步骤4、将步骤3中获得的两种降解物分别上一根Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以0.2M碳酸氢铵平衡并洗脱，流速0.1-1.0ml/min，分部收集，先后得到四糖、双糖；
步骤5、步骤4得到两种二糖混合物，分别汇合收集，60℃旋转浓缩至1-10ml，冷冻干燥，得到本发明的双糖混合物1和双糖混合物2。
以上步骤中，肝素酶I，肝素酶II、肝素酶III为可商业获得的酶，来源于IBEX公司或SIGMA公司或其他公司生产的，从天然菌体发酵并分离纯化而来的产品，或者经基因工程表达并纯化的产品。
Bio-Gel P6柱为商业获得纯化填料装填的柱子，填料来源于BIO-RAD公司生产的层析纯化填料产品，柱子为普通玻璃柱。
在本发明的另一方面，本发明提供了根据上述方法获得的双糖混合物，该双糖混合物可以为第一种双糖混合物、第二种双糖混合物或者二者的混合物。
在优选的实施方案中，所述第一种双糖混合物为双糖混合物1，其中8种肝素双糖的摩尔含量分别为：I-S，47％；I-A，1.3％；II-S，18.9％；II-A，12.5％；III-S，3.7％；III-A，3.3％；IV-S，4.9％；IV-A，6.7％。
在优选的实施方案中，所述第二种双糖混合物为双糖混合物2，其中8种肝素双糖的摩尔含量分别为：I-S，40.6％；I-A，5.7％；II-S，37.7％；II-A，1.2％；III-S，9.9％；III-A，2.3％；IV-S，1.7％；IV-A，0.98％。
在本发明的另一方面，本发明提供了使用本发明的双糖混合物检测肝素双糖作用酶的存在的方法，所述方法包括：
1)将本发明的双糖混合物配成1-10mg/ml溶液；
2)向步骤1的溶液中加入可能含有肝素双糖作用酶的物质，比如肝素双糖脱硫酸酶、肝素双糖双键消除酶等，室温反应6-24小时；
3)用SAX-HPLC法(例如，色谱操作条件可以见表1)测定步骤2)反应后的双糖图谱，对比步骤1)中使用的双糖混合物的SAX-HPLC图谱，观察各成分的色谱峰面积变化。
在步骤1)中，可以使用任何适宜的溶剂，但是优选使用Tris-HCl溶液(50mM，含CaCl210mM，pH7.0)作为溶剂。
在上述方法中，如果有某种双糖色谱峰面积减少而另一种双糖色谱峰面积增多，意味着该酶能催化一种双糖变成另一种双糖。如果有某种双糖色谱峰面积减少而无他种双糖色谱峰面积增多，则意味着该酶能作用该双糖引起双键消除。这样的酶作为杂质存在于肝素酶中，会对酶反应带来极大的干扰。事先检测其存在，可将干扰提前排除。
附图说明：
图1步骤2中，二糖、四糖、六糖的A232值对洗脱管数图谱
图2步骤3中，四糖组分的A232值对洗脱管数图谱
图3步骤3中，六糖组分的A232值对洗脱管数图谱
图4双糖混合物1的SAX-HPLC图谱
图5双糖混合物2的SAX-HPLC图谱
图6一种催化I-S双糖脱去2位硫酸基的酶作用混合双糖后的SAX-HPLC图谱
图7一种能将肝素双糖中ΔUA双键破坏掉的酶作用混合双糖后的SAX-HPLC图谱
具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
请对以下实施例中所使用的原料、仪器以及操作方法进行说明
实施例1：标准双糖混合物的制备
步骤1：肝素的酶I降解：取200mg肝素，溶于2ml Tris-HCl(50mM，含CaCl210mM，pH7.0)缓冲液中，加入肝素酶I(50mM Tris-HCl溶液，含CaCl210mM，pH7.0)12IU，室温酶解24小时；
步骤2：二、四糖片段的分离：取酶I降解产物，上一根Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以0.2M碳酸氢铵平衡并洗脱，流速0.3ml/min，分部收集，共收集130管，每管1.5ml，测定A232值(A232指使用1cm光径比色皿在分光光度计上测得的232nm的吸收值)，以A232值对洗脱管数作图(以洗脱管数为X轴，以A232为Y轴做图)，洗脱图谱上显示主要的3个峰，见图1，由后至前分别是二糖、四糖、六糖，将四糖和六糖分别汇合收集，60℃旋转浓缩至1ml；
步骤3：四、六糖片段的酶II、III联合降解：向步骤2得到的四、六糖组分，分别加入1IU肝素酶II和2IU肝素酶III(均为50mM Tris-HCl溶液，含CaCl210mM，pH7.0)，室温酶解24小时；
步骤4：联合酶解物的分离：步骤3得到的四、六糖组分再次降解物，分别上一根Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，洗脱条件同于步骤2，四、六糖组分再次降解物洗脱图谱上均显示主要的2个峰，见图2、3，由后至前分别是二糖、四糖，将两者分离出的二糖分别汇合收集，60℃旋转浓缩至1ml，冷冻干燥，由此得到双糖混合物1和双糖混合物2；
所述标注双糖混合物为双糖混合物1或者双糖混合物2或者二者的混合物。实施例2：双糖混合物组成的鉴定和含量测定：
采用SAX-HPLC法，色谱条件见表1，洗脱梯度和双糖出峰时间分别见表2、3，两种双糖混合物的SAX-HPLC图谱见图4、5，双糖的摩尔百分含量标示于图上。由于色谱图中除8种所述肝素双糖的吸收峰外，尚含有其它几个微小的吸收峰，这导致混合物中8种双糖峰面积积分定量后比例之和小于100％。这几个微小吸收峰可能是几种微量的、难以确定化学本质的、非主要肝素双糖或三糖、四糖，也可能是溶剂峰，暂时不能确定。
双糖混合物1中，8种肝素双糖的摩尔含量分别为：I-S，47％；I-A，1.3％；II-S，18.9％；II-A，12.5％；III-S，3.7％；III-A，3.3％；IV-S，4.9％；IV-A，6.7％。
双糖混合物2，中8种肝素双糖的摩尔含量分别为：I-S，40.6％；I-A，5.7％；II-S，37.7％；II-A，1.2％；III-S，9.9％；III-A，2.3％；IV-S，1.7％；IV-A，0.98％。
表1 SAX-HPLC法的色谱条件
| 检测器/波长 | 紫外检测器/232nm |
| 色谱柱 | Waters Spherisorb S5-SAX，4.6mm×250mm×5μm |
| 预柱 | Waters Spherisorb SAX，4.6mm×10mm×5μm |
| 柱温 | 室温 |
| 流动相 | 洗提液A和洗提液B进行梯度洗脱 |
| 流速 | 1.40ml/min |
| 进样量 | 25μl |
| 采集时间 | 70min |
洗提液A为pH2.9的2.5mM磷酸二氢钠溶液，洗提液B为pH3.0的1.0M高氯酸钠溶液。洗脱梯度和双糖出峰时间分别见表2、3。双糖的摩尔百分含量＝双糖峰面积/∑面积。
表2洗脱梯度表
| 时间(min) | 流速(ml/min) | 洗提液A％ | 洗提液B％ | Curve |
| 0 | 1.4 | 97 | 3 | - |
| 40 | 1.4 | 40 | 60 | 6 |
| 60 | 1.4 | 20 | 80 | 6 |
| 70 | 1.4 | 97 | 3 | 1 |
表3双糖的洗脱顺序如下表：
| 双糖 | 保留时间(分钟) | 分子量 |
| IV-A | ～4.0 | 401 |
| IV-S | ～7.8 | 461 |
| II-A | ～8.9 | 503 |
| III-A | ～9.9 | 503 |
| II-S | ～12.3 | 563 |
| III-S | ～13.6 | 563 |
| I-A | ～16.4 | 605 |
| I-S | ～19.1 | 665 |
实施例3：使用双糖混合物检测肝素双糖作用酶的存在
将双糖混合物1，在Tris-HCl溶液(50mM，含CaCl210mM，pH7.0)中配成1mg/ml溶液，向其中加入可能含有肝素双糖作用酶杂质的肝素酶样品1、2、3，室温反应24小时，测定SAX-HPLC双糖谱，观察各成分的色谱峰面积变化。结果发现样品1中双糖各成分的色谱峰面积没有变化，这说明这个酶中不含肝素双糖作用酶；样品2中双糖I-S色谱峰面积减少，同时双糖II-S色谱峰面积增多，见图6，这意味含有一种能催化I-S双糖脱去α-ΔUA-2S-[1→4]-GlcNS-6S中2位硫酸基的酶；样品3中各种双糖色谱峰面积同时减少，除含量最丰富的I-S还能看到外，其它双糖的色谱峰都看不见了，见图7，这意味含有一种能将双糖中ΔUA上的双键破坏掉的酶，引起232nm紫外吸收的消减，使色谱峰减弱甚至消失。
Claims (17)
1.双糖混合物，其特征在于，在所述混合物中，含有肝素双糖1-8，肝素双糖1-8分别为：I-S，I-A，II-S，II-A，III-S，III-A，IV-S，IV-A。
2.根据权利要求1的双糖混合物，其特征在于，所述混合物为混合物1，其中8种肝素双糖的摩尔含量分别为：I-S，47％；I-A，1.3％；II-S，18.9％；II-A，12.5％；III-S，3.7％；III-A，3.3％；IV-S，4.9％；IV-A，6.7％。
3.根据权利要求1的双糖混合物，其特征在于，所述混合物为混合物2，其中8种肝素双糖的摩尔含量分别为：I-S，40.6％；I-A，5.7％；II-S，37.7％；II-A，1.2％；III-S，9.9％；III-A，2.3％；IV-S，1.7％；IV-A，0.98％。
4.根据权利要求1所述的双糖混合物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、肝素样品用肝素酶I降解；
步骤2、对步骤1所得的降解产物中的二、四、六糖进行分离，得到二糖，四糖，六糖；
步骤3、步骤2中分离出的四糖和六糖均使用肝素酶II和肝素酶III降解；
步骤4、降解物分别用层析柱分离，分别分离出二糖和四糖；
步骤5、步骤4得到两种二糖混合物，即第一种混合物和第二种混合物。
5.根据权利要求4的方法，其中所述步骤1的降解作用可以在4℃～35℃下进行。
6.根据权利要求5的方法，其中所述步骤1的降解作用在室温下进行。
7.根据权利要求6的方法，其中所述步骤1的降解作用在室温下进行2-24小时。
8.根据权利要求4～7任一项的方法，其中在步骤2中，利用柱层析方法对步骤1中所得的降解产品进行分离。
9.根据权利要求8的方法，其中在步骤2中，使用Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)对步骤1中所得的降解产品进行分离。
10.根据权利要求4～9任一项的方法，其中所述步骤3的降解作用可以在4℃～35℃下进行。
11.根据权利要求10的方法，其中所述步骤3的降解作用在室温下进行。
12.根据权利要求11的方法，其中所述步骤3的降解作用在室温下进行6-24小时。
13.根据权利要求4～12任一项的方法，其中在步骤4中，使用Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)进行分离。
14.根据权利要求4～13任一项的方法，包括以下步骤：
步骤1、取肝素样品，溶于Tris-HCl缓冲液中，加入肝素酶I，在室温下，酶解2-24小时；
步骤2、取步骤1中获得的降解产物，上一根Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以碳酸氢铵溶液平衡并洗脱，分部收集，先后得到六糖、四糖、双糖，将四糖和六糖分别汇合收集，浓缩；
步骤3、向步骤2获得的四糖和六糖组分中，分别加入肝素酶II和肝素酶III，在室温下，酶解6-24小时；
步骤4、将步骤3中获得的降解物上Bio-Gel P6柱(1.5×100cm)，以碳酸氢铵溶液平衡并洗脱，分部收集，先后得到四糖和双糖；
步骤5、步骤4得到二糖混合物，分别汇合收集，旋转浓缩，冷冻干燥，得到本发明的第一种双糖混合物和第二种双糖混合物。
15.一种检测肝素双糖作用酶的存在的方法，所述肝素双糖作用酶为肝素双糖脱硫酸酶或肝素双糖双键消除酶，或其它能以肝素双糖为作用底物引起可检测变化的酶，所述方法包括：
1)将权利要求1～3任一项的双糖混合物配成1-10mg/ml溶液；
2)向步骤1的溶液中加入可能含有肝素双糖作用酶的物质，室温反应6-24小时；
3)用上述SAX-HPLC法测定步骤2)反应后的双糖图谱，对比步骤1)中使用的双糖混合物的SAX-HPLC图谱，观察各成分的色谱峰面积变化，进行判定。
16.根据权利要求4～14任一项的方法获得的双糖混合物。
17.根据权利要求16的混合物，其为混合物1、混合物2或者二者的混合物。
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