CN1379781A - 新的低聚糖、其制备方法及其药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及下式所示低聚糖、它们的混合物,非对映异构体,它们的制备方法以及含有它们的药物组合物。

Description

新的低聚糖、其制备 方法及其药物组合物
本发明涉及下式所示低聚糖：
它们的混合物、非对映异构体，它们的制备方法与含有它们的药物组合物。
H.P.WESSEL在《碳水化合物化学杂志》(J.Carbohydrate Chemistry)，11(8)，1039-1052(1992)中曾描述过在还原端具有1，6-脱水结构的硫酸化二糖；未提到它们有任何药理学活性。
在专利EP 84999和由Y.ICHIKAWA及其同事在《碳水化合物研究》(Carbohydr.Res.)，141，273-282(1985)中也曾描述过作为制备高级低聚糖的中间产物的含有1，6-脱水结构单元的硫酸化三糖。这些三糖具有低的抗Xa活性。
在式(I)中，n是0-25的整数，R1、R3、R4和R5相同或不同，它们代表氢原子或SO3M基团，R2和R6相同或不同，它们代表氢原子或SO3M或COCH3基团，以及M是钠、钙、镁或钾。
这些低聚糖于是含有偶数糖。
在式(I)中，R4优选地是氢原子。
优选地，n是0-10的整数，特别地0-6的整数，更特别地1-6的整数。
式(I)所示低聚糖可通过碱金属氢氧化物或季铵氢氧化物与下式所示低聚糖反应制备：
Figure A0081453100051
式中，n是0-25的整数，R1、R3、R4和R5相同或不同，它们代表氢原子或SO3M基团，R2和R6相同或不同，它们代表氢原子或SO3M或COCH3基团，以及M是钠、钙、镁或钾，或它们的混合物。
这个反应在含水介质中，在温度40-80℃与pH 10-13的条件下进行。
作为可以使用的碱金属氢氧化物，可以列举氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化铯。
作为可以使用的季铵氢氧化物，可以列举四丁基氢氧化铵。
碱金属氢氧化物或季铵氢氧化物的量应足以使反应介质的pH在整个反应期间都保持稳定。因此，在整个反应期间很有必要连续地添加碱金属氢氧化物或季铵氢氧化物。
优选地，碱金属氢氧化物或季铵氢氧化物呈1-5％水溶液形式。
优选地，该反应在温度60-70℃下进行。
有利地，反应pH是11-12.5。
通过酸化反应介质，例如通过添加像Amberlite IR 120树脂(Fluka)之类的酸性树脂可中止反应。
可以采用聚丙烯酰胺-琼脂糖(例如以商标Ultrogel ACA202销售的产品(Biosepra))类凝胶通过渗透色谱，按照下述方案任选地纯化式(I)所示低聚糖，以便分离式(II)所示中间低聚糖。用氧化铝柱，以水-乙醇混合物作为洗脱剂，也可任选地纯化其中n为0或1的式(I)所示低聚糖。
酶解聚肝素，或碱解聚肝素苄酯或半合成肝素苄酯所得到的低聚糖(III)混合物，经凝胶色谱分离可以得到式(II)所示中间低聚糖及其混合物。
用装有聚丙烯酰胺-琼脂糖(例如以商标ultrogel ACA202锁售的产品(Biosepra))类凝胶的柱进行这种色谱分离。优选地，使用一组聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶柱。使用的柱数随凝胶和待分离低聚糖的体积而变。使用含有磷酸盐和氯化钠缓冲液的溶液洗脱该混合物。优选地，磷酸盐缓冲液是0.02摩尔/升NaH2PO4/Na2HPO4(pH7)的溶液，其中含有0.1摩尔/升氯化钠。采用紫外光谱法(254纳米)和离子法(IBF)检测不同的馏分。然后，如此得到的馏分例如可以采用SAX(强阴离子交换)色谱法，按照本领域技术人员已知的方法，特别地按照K.G.Rice和R.J.Linhardt，《碳水化合物研究》(Carbohydrate Research)190，219-233(1989)，A.Larnkjaer，S.H.Hansen和P.B.Ostergaard，《碳水化合物研究》，266，37-52(1995)和专利WO 90/01501(实施例2)中描述的方法任选地进行纯化。然后，这些馏分进行冻干，再用凝胶柱，例如Sépadex G10凝胶柱(Pharmacia Biochemicals)脱盐。
不用SAX色谱法进行纯化时，这些冻干物可任选地采用简单沉淀法纯化，或按照本领域技术人员已知的方法，特别地按照在专利FR 2 548 672中描述的方法进行分离。一般地，按照下述方案操作：
待纯化的冻干馏分在25℃溶于约10个体积蒸馏水中。通过添加甲醇或乙醇沉淀所需的低聚糖，同时用CLHP色谱(高效液相色谱)控制其富集情况。根据所述低聚糖的所需纯度与产率决定甲醇或乙醇的添加。同样地，可以从冻干物的初始溶液开始，相继地多步骤进行这种操作。为此，分小份再加入不溶解试剂(甲醇或乙醇)，在每次加入后就分离生成的沉淀物。如此制备的沉淀用CLHP色谱分析。根据要求的纯度和产率，可收集适当部分沉淀。
对于n＝0、1或2的式(II)所示中间产物，优选使用通过酶解聚法得到的混合物(III)为原料。
这种解聚作用使用肝素酶I(EC 4.2.2.7)，在pH7磷酸盐缓冲液中，在氯化钠和BSA(牛血清白蛋白)存在下，在温度10-18℃，优选地15℃下进行8-10天，优选地9天。例如通过将反应介质加热到100℃达2分钟停止这种解聚作用，再采用冻干法回收该混合物。优选地每25克肝素使用7UI肝素酶I。磷酸盐缓冲液一般地在0.1摩尔/升氯化钠存在下含有0.05摩尔/升NaH2PO4/Na2HPO4(pH7)。BSA浓度一般是2％。
对于其中n＝0、1、2、3或4的式(II)所示中间产物，优选地使用通过肝素苄酯解聚得到的混合物(III)为原料。
根据US 5 389 618、EP 40144、FR2 548 672中描述的方法可以制备肝素苄酯。酯化率优选地是50-100％。更优选地，酯化率是70-90％。
解聚过程在含水介质中，使用碱金属氢氧化物(例如氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铯)或季氨氢氧化物(例如四丁基氢氧化铵)、优选地以摩尔浓度为0.1-0.2摩尔/升在温度40-80℃进行5-120分钟。在优选实施方式中，在温度60-70℃下，使用0.15摩尔/升氢氧化钠溶液操作5～15分钟。通过加入醋酸之类的酸进行中和可停止解聚作用。在以重量/体积计加入10％醋酸钠后，通过加入甲醇，优选地每1个反应介质体积加入2个体积甲醇沉淀低聚糖混合物，然后过滤。
根据本发明的一个优选方面，在化学解聚后得到的低聚糖混合物呈含水溶液形式，可用具有适当标称截止点的超滤膜(Millipore销售的用再生纤维素制的Pellicon类超滤膜)进行超滤富集；膜的类型随待回收的富集低聚糖种类而变。对于其中n＝0的低聚糖(II)，应使用1kDa标称截止点的超滤膜，对于其中n＝1的低聚糖(II)，应使用1kDa或3kDa的膜，对于其中n＝2的低聚糖(II)，应使用3kDa的膜，对于其中n＝3或4的低聚糖(II)，应使用5kDa的膜。在这种操作过程中，回收渗透物，排掉保留物。因此，富集的产品部分可以占初始低聚糖混合物的50-10％，同时保留至少80％所需低聚糖。
对于其中n＝0-25的式(II)所示中间产物，优选使用由半合成的硫酸化多糖苄酯经解聚作用所得到的混合物(III)为原料。使用由K5多糖得到的半合成硫酸化多糖并按照专利WO 94/29352和WO 96/14425中描述的方法制备该半合成的硫酸化多糖苄酯。酯化、解聚和回收的条件与上述肝素苄酯的条件相同。
在所有上述方法中，初始肝素可以来自猪、羊或牛的肝素，还可以来自动物的粘液、肺或皮肤。优选地，使用来自猪、羊粘液或牛肺的肝素，更优选地来自猪粘液。
式(I)所示低聚糖具有消炎的性质，因此可以用来预防与治疗同涉及产生细胞毒素物质[例如一氧化氮(NO)]的炎性过程相关的疾病，当嗜中性粒细胞或巨噬细胞在组织中移行并被活化时，它们尤其释放出细胞毒性物质的诱导形式。由于使局部缺血组织布满血管的动脉闭塞或痉挛，在这种组织部位产生嗜中性粒细胞的活化作用、移行、粘连和浸润。这些缺血可能发生在脑部(脑卒中综合征)或心肌部位(心肌梗塞)或者下肢(所谓末梢缺血)。式(I)所示低聚糖因此还可以用于预防和/或治疗其中脑炎起作有害的可能导致死亡的作用的神经变性疾病，其中可以列举脑缺血，心肌缺血(心肌梗塞)，末梢缺血，中枢神经系统创伤，特别是颅，脊柱和颅脊柱创伤，斑状硬化，神经性疼痛和末梢神精病，运动神经元疾病，其中包括肌萎缩性脊髓侧索硬化，神经型爱滋病，阿尔茨海默病，帕金森氏病和Huntington舞蹈病以及某些骨关节炎，特别是关节定位的骨关节炎。
根据M.YAMASHITA及其同事在《Eur.J.Pharmacol》，338，2，151-158(1997)或J.E.SHELLITO及其同事在《Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.》，13，1，45-53(1995)中描述的方案，在通过来自大肠杆菌的脂多糖(LPS)诱导产生NOx(亚硝酸盐和硝酸盐)的试验中，证明了这些产品在活体内的消炎活性。
在TO采用药团静脉内给药方式，往雄CD1鼠(Charles河，25-35克)注射0.5毫克/千克低聚糖，在T+15分钟，采用皮下给药方式注射1或2毫克/千克低聚糖。在T+30分钟，给药100毫克/千克来自大肠杆菌的脂多糖(LPS)(SigmaL3129，血清型0127：B8)。在T+3小时，重新采用皮下给药方式注射1或2毫克/千克低聚糖。在T+5小时30分钟，采用眼穿刺取血样，再以下述方式，在用硝酸盐还原酶将硝酸盐还原成亚硝酸盐后，采用Griess比色法测定血清中NOx(亚硝酸盐和硝酸盐)浓度：12微升血清试样与88微升去离子水混合，再在室温下与40微升磷酸盐缓冲液(0.31M，pH7.5)，20微升β-NADPH(还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)(0.86mM)，20微升FDA(黄素腺嘌呤二核苷酸)(0.11mM)和20微升硝酸盐还原酶(2U/毫升)(Boehringer Mannheim)一起在黑暗中培养1小时。添加10微升ZnSO4(1M)，以便沉淀蛋白质，在混合后，试样在20 000克下离心5分钟。最后，50微升上清液与100微升Griess试剂(1％磺胺，在0.1％磷酸/萘乙二胺于去离子水中的混合物中，以体积/体积计)一起在室温下培养10分钟。采用微板分光光度法于540纳米读取光密度；每个点测量两次。KNO3和NaNO3用作该比色法的标准。
在这个试验中，本发明的低聚糖可多于50％的比率抑制NOx形成。
在优选的式(I)所示低聚糖中，特别可以列举下述低聚糖，其中：
-n等于0，R1和R6代表SO3Na基团，M是钠，与它们的非对映异构体混合物，
-n等于1，R1、R2、R3、R5、R6代表SO3Na基团，R4代表氢原子，M是钠，与它们的非对映异构体混合物，
-n等于2，R1、R2、R3、R5、R6代表SO3Na基团，R4代表氢原子，M是钠，与它们的非对映异构体混合物，
-n等于2，R1、R2、R3、R6代表SO3Na基团，R5代表氢原子或SO3Na基团，R4代表氢原子，M是钠，与它们的非对映异构体混合物(ΔIs-Is-IIs 1，6脱水衍生物)。
下述实施例代表了式(I)所示低聚糖和中间产物的制备方法。
在这些实施例中，缩写的意义如下：
ΔIs：(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-己-烯吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃型葡萄糖，四钠盐或ΔUAp2S-(1→4)-α-D-G1cNp2S6S
Is：(2-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃型葡萄糖，四钠盐或α-L-IdoAp2S-(1→4)-α-D-G1cNp2S6S
IIs：(α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃型葡萄糖，三钠盐或α-L-IdoAp-(1→4)-α-D-G1cNp2S6S
IIIs：(2-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-α-D-吡喃型葡萄糖，三钠盐或α-L-IdoAp2S-(1→4)-α-D-G1cNp2S
IdoAp：艾杜吡喃糖基糖醛酸
GlcNp：2-脱氧-2-氨基吡喃型葡萄糖
ΔUap：4-脱氧-α-L-苏-己-烯吡喃糖基糖醛酸
S：硫酸盐
式(II)混合物的制备实施例
实施例A-通过酶解聚和分离制备其中n＝0，1和2的式(II)所示低聚糖
将25克肝素溶解于250毫升磷酸盐缓冲液中，该缓冲液含有0.05摩尔/升NaH2PO4/Na2HPO4(pH＝7)，0.2摩尔/升氯化钠和2％BSA(牛血清白蛋白)。在该混合物中加入7UI肝素酶I(EC4.2.2.2.7)，再将得到的溶液冷却到15℃，然后在整个解聚反应期间都保持在这个温度下。通过分批等分取样，并采用凝胶渗透色谱法分析跟踪反应进程。9天后，通过将反应介质加热到100℃达2分钟可使酶反应停止。冷却的混合物再冻干。这样得到式(III)所示低聚糖混合物。
得到的式(III)所示低聚糖混合物然后按照下述方法进行色谱分离：使用装填已知商品名Ultrogel ACA 202的聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶的柱进行色谱分离，再用含有pH＝7磷酸盐缓冲液(0.02摩尔/升NaH2PO4/Na2HPO4)和0.1摩尔/升氯化钠的溶液洗脱该混合物。用紫外光谱法(254纳米)和离子法(IBF)进行检测。这些产物可以任选地用SAX(强阴离子交换)色谱或根据专利FR 2 548 672描述的方法采用分段沉淀进行纯化。回收的产物馏分进行冻干，再用sephadex G10凝胶(Pharmacia Biochemicals)填充柱脱盐。
采用这种方法，得到3克Is二糖，1100毫克典型地含有55％ΔIs-Is-Is衍生物、35％ΔIs-Is-IIs和10％ΔIs-Is-IIIs的六糖混合物。这后一种混合物可以按照本领域技术人员公知的方法进行纯化，将其分离成单一组分，或原样用于将其转化成式(I)所示1，6脱水衍生物。值得指出的是，在这种转化过程中，ΔIs-Is-IIIs六糖不能导致生成式(I)所示化合物。
实施例B-通过肝素苄酯的解聚和分离制备其中n＝0，1、2、3或4的式(II)所示低聚糖
a-制备肝素苄酯
根据专利US 5 389 618的实施例3制备肝素苄酯。
b-解聚
将100克肝素苄酯溶解于1.9升软化水中。该混合物在搅拌下升温到60℃。在得到均匀溶液后，仅一次加入约35毫升23％氢氧化钠溶液。在反应10分钟后，再冷却该溶液，然后用80毫升约2N醋酸溶液进行中和。往这种溶液添加以重量/体积计10％醋酸钠。通过加入约2体积甲醇沉淀低聚糖混合物。该沉淀经过滤分离后，用甲醇洗涤两次，再在50℃减压下干燥。干燥后得到73.8克低聚糖(II)混合物。
c-其中n＝1的低聚糖的富集
将30克前面得到的低聚糖混合物溶解于约35体积水中。这种溶液用3kDa膜(Pellicon)进行超过滤。流出600毫升渗透液时，用500毫升水稀释保留物。继续这种操作直到又放出450毫升渗透液为止。这两份渗透液合并，然后在减压下浓缩至干。得到6.1克微黄白色固体。用凝胶渗透色谱分析固体，结果表明，它含有约30％其中n＝1的式(II)所示低聚糖。
d-已超滤的低聚糖混合物的分离
富集的混合物用装有已知商品名为Ultrogel ACA 202的聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶柱进行分离(使用4根串联的直径10厘米、高50厘米柱)。将5克采用超滤富集的混合物溶解于25毫升水中，然后用0.2摩尔/升氯化钠溶液以5毫升/分速率洗提。在柱底回收多个25毫升馏分。采用紫外光谱法(254纳米)和离子法(IBF)检测产物。其中n＝1的产物馏分合并，冻干，再用sephadex G10凝胶填充柱脱盐。冻干后，得到1克典型地含有70％式IIΔIs-Is衍生物(R1、R2、R3、R5、R6＝SO3Na；；R4＝H和M＝Na)的四糖。ΔIs-Is衍生物可以任选地采用SAX(强阴离子交换)色谱纯化，或根据专利FR 2 548 672中描述的方法，采用分步沉淀按照优选特性纯化。
实施例1
往保持在66℃的反应器中加入5毫升0.0063摩尔/升氢氧化钠溶液。这时测量该溶液的pH，并取作目标值(pH＝11.35)。在搅拌下，一次加入30毫克式(II)所示低聚糖，其式中n等于0，R1和R6＝SO3Na基团；M＝Na。这时可通过连续添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH，并保持到pH11.35。10小时后，停止加氢氧化钠溶液，将反应混合物冷却到25℃。这时通过添加AmberliteIR120树脂，将溶液的pH调节到6-7。该混合物用Whatman GF/B膜过滤，然后在温度约25℃下，在减压(2.7千帕)下浓缩至干。该产物用0.5毫升蒸馏水溶解，再冻干。这样得到29毫克式(I)所示低聚糖的非对映异构体混合物，其式中n等于0，R1和R6＝SO3Na基团；M＝Na[(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺氨基-β-D-吡喃甘露糖，三钠盐]]：在D2O中的质谱，400MHz，T＝298K，δ，以ppm计：3.15(1H，s，H2)，3.75(2H，m，H6和H3)，3.88(1H，m，H4)，4.20(1H，d，J＝8Hz，H6)，4.22(1H，t，J＝5Hz，H3’)，4.58(1H，m，H2’)，4.75(1H，m，H5)，5.53(1H，s，H1)，5.60(1H，dd，J＝6和1Hz，H1’)，6.03(1H，d，J＝5Hz，H4’)；(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺氨基-β-D-吡喃型葡萄糖，三钠盐)：在D2O中的质谱，400MHz，T＝298K，δ，以ppm计：3.34(1H，dd，J＝7和2Hz，H2)，3.72(1H，t，J＝8Hz，H6)，3.90(1H，m，H3)，4.03(1H，s，H4)，4.20(1H，d，J＝8Hz，H6)，4.23(1H，t，J＝5Hz，H3’)，4.58(1H，m，H2’)，4.78(1H，m，H5)，5.50(1H，s，H1)，5.60(1H，dd，J＝6和1Hz，H1’)，6.03(1H，d，J＝5Hz，H4’)]。
实施例2
往保持在62℃的反应器中加入33.3毫升0.0063摩尔/升氢氧化钠溶液。这时测量该溶液的pH，并取作目标值(pH＝11.15)。在搅拌下，一次加入200毫克式(II)所示低聚糖，其中n等于1，R1、R2、R3、R5和R6代表SO3Na基团；R4代表氢原子和M是钠。这时可通过连续添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH，并保持到pH11.15。在12小时后，停止加入氢氧化钠，将反应混合物冷却到25℃。这时通过加入Amberlite IR120树脂，将溶液的pH调节到6-7。该混合物用Whatman GF/B膜过滤，然后在温度约25℃下，在减压(2.7千帕)下浓缩至干。该产物用3毫升蒸馏水溶解，再冻干。这样得到230毫克式(I)所示低聚糖，其中n等于1，R1、R2、R3、R5和R6代表SO3Na基团；R4代表氢原子和M是钠，呈非对映异构体混合物形式[(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃型葡萄糖-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺氨基-β-D-吡喃甘露糖，七钠盐]]：在D2O中的质谱，400MHz，T＝298K，δ，以ppm计：3.15(1H，s，H2)，3.25(1H，m，H2″)，3.60(1H，m，H3″)，3.70-4.70(14H，成群的，H3/H4/H6，H2’/H3’/H4’/H5’，H4”/H5”/H6”，H2/H3)，4.75(1H，m，H5)，5.20-5.40(2H，m，H1’和H1”)，5.45(1H，m，H1)，5.56(1H，m，H1)，5.94(1H，d，J＝5Hz，H4)；(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺氨基-β-D-吡喃型葡萄糖，七钠盐)]：在D2O中的质谱，400MHz，T＝298K，δ，以ppm计：3.25(1H，m，H2”)，3.42(1H，dd，J＝4和1Hz，H2)，3.60(1H，m，H3”)，3.70-4.70(14H，成群的，H3/H4/H6，H2’/H3’/H4’/H5’，H4”/H5”/H6”，H2/H3)，4.75(1H，m，H5)，5.20-5.40(2H，m，H1’和H1”)，5.45(1H，m，H1)，5.52(1H，m，H1)，5.94(1H，d，J＝5Hz，H4)]。
实施例3
往保持在62℃的反应器中加入16.7毫升0.0063摩尔/升氢氧化钠溶液。这时测量该溶液的pH，并取作目标值(pH＝11.7)。在搅拌下，一次加入100毫克式(II)所示低聚糖，其中n等于2，R1、R2、R3、R5和R6代表SO3Na基团；R4代表氢原子和M是钠。这时可通过连续添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH，并保持到pH11.7。10小时后，停止添加氢氧化钠，将反应混合物冷却到25℃。通过添加Amberlite IR120树脂，将溶液的pH调节到6-7。该混合物用WhatmanGF/B膜过滤，然后在温度约25℃下减压(2.7千帕)浓缩至干。该产物用3毫升蒸馏水溶解，再冻干。这样得到108毫克式(I)所示低聚糖，其中n等于2，R1、R2、R3、R5和R6代表SO3Na基团；R4代表氢原子和M是钠，呈非对映异构体混合物状。将由六糖构成的糖标记为A-F，A是1，6-脱水残基，F是不饱和糖醛酸残基。[(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃型葡萄糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃型葡萄糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺氨基-β-D-吡喃甘露糖，十一钠盐]]：在D2O中的质谱，600MHz，T＝298K，δ，以ppm计：3.15(1H，s，H2(A))，3.25(2H，m，H2(C+E))，3.60(2H，m，H3(C+E)，3.65-4.50(19H，成群的，H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+E)/H5(C+E)/H6(A+C+E))，4.60(1H，s，H2(F))，4.80(3H，m，H5(A+B+D))，5.18(1H，s，H1(D))，5.30(1H，s，H1(B))，5.34(1H，d，H1(C))，5.36(1H，d，H1(E))，5.46(1H，s，H1(F))；5.57(1H，s，H1(A))；5.95(1H，d，J＝5Hz，H4(F))；(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃型葡萄糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-2-脱氧-2-磺氨基-6-O-磺基-α-D-吡喃型葡萄糖基-(1→4)-2-O-磺基-α-L-艾杜吡喃糖基糖醛酸-(1→4)-1，6-脱水-2-脱氧-2-磺氨基-β-D-吡喃型葡萄糖，十一钠盐)]：在D2O中的质谱，600MHz，T＝298K，δ，以ppm计：3.25(2H，m，H2(C+E))，3.42(1H，m，H2(A))，3.60(2H，m，H3(C+E))，3.65-4.50(19H，成群的，H2(B+D)/H3(A+B+D+F)/H4(A+B+C+D+E)/H5(C+E)/H6(A+C+E))，4.60(1H，s，H2(F))，4.80(3H，m，H5A+B+D)，5.18(1H，s，H1(D))，5.31(1H，s，H1(B))，5.34(1H，d，H1(C))，5.36(1H，d，H1(E))，5.46(1H，s，H1(F))；5.52(1H，s，H1(A))；5.95(1H，d，J＝5Hz，H4(F))。
实施例4
往保持在62℃的反应器中加入4毫升0.0316摩尔/升氢氧化钠溶液。这时测量该溶液的pH，并取作目标值(pH＝11.8)。在搅拌下，一次加入100.8毫克式(II)所示低聚糖混合物，其中n等于2，含有55％ΔIs-Is-Is(R1、R2、R3、R5及R6代表SO3Na基团；R4代表氢原子和M代表Na)，35％ΔIs-Is-IIs(R1、R2、R3和R6代表SO3Na基团；R5代表SO3Na基团或氢原子，R4代表氢原子和M代表钠)，和10％ΔIs-Is-IIIs(R1、R2、R3、R5和R6代表SO3Na基团；R4代表氢原子和M是钠，C6碳的SO3Na官能团被氢取代)。这时可通过连续添加0.5摩尔/升氢氧化钠溶液调节pH，并保持到pH11.8。11小时后，停止添加氢氧化钠，将反应混合物冷却到25℃。这时通过添加Amberlite IR120树脂，将溶液的pH调节到6-7。该混合物用Whatman GF/B膜过滤，然后在温度约25℃下，在减压(2.7千帕)下浓缩至干。该产物用1.5毫升蒸馏水溶解，再冻干。这样得到110毫克式(I)所示低聚糖混合物，其中n等于2，特别地含有ΔIs-Is-Is 1，6-脱水衍生物(R1、R2、R3、R5和R6代表SO3Na基团；R4代表氢原子和M是钠)和ΔIs-Is-IIs1，6-脱水衍生物(R1、R2、R3和R6代表SO3Na基团；R5代表SO3Na基团或氢原子，R4代表氢原子和M是钠)。离子对方式的CLHP(高效液相色谱)分析能跟踪向式(I)所示衍生物的转化。在这种情况下，CLHP测定表明ΔIs-Is-Is，ΔIs-Is-IIs衍生物发生了转化。
实施例5
往保持在66℃的反应器中加入8.6毫升0.025摩尔/升氢氧化锂溶液。这时测量该溶液的pH，并取目标值(pH＝11.68)。在搅拌下，一次加入50毫克式(II)所示低聚糖，其中n等于0，R1和R6代表SO3Na基团和M是钠。这时可通过连续添加0.466摩尔/升氢氧化锂溶液调节pH，并保持到pH11.68。8小时后，停止添加氢氧化锂，将反应混合物冷却到25℃。离子对方式的CLHP(高效液相色谱)分析能跟踪向其中n等于0，R1和R6代表SO3Na基团和M是钠或锂的式(I)所示衍生物的转化。在这种情况下，CLHP测定表明转化达到100％。使用外标的产率是81.2％。
实施例6
往保持在66℃的反应器中加入8.3毫升0.0063摩尔/升氢氧化钾溶液。这时测量该溶液的pH，并取作目标值(pH＝11.1)。在搅拌下，一次加入50毫克式(II)所示低聚糖，其中n等于0，R1和R6代表SO3Na基团和M是钠。这时可通过连续添加0.515摩尔/升氢氧化钾溶液调节pH，并保持到pH11.1。在24小时后，停止添加氢氧化钾，将反应混合物冷却到25℃。离子对方式的CLHP(高效液相色谱)分析能跟踪向其中n等于0，R1和R6代表SO3Na基团和M是钠或钾的式(I)所示衍生物的转化。在这种情况下，CLHP测定表明转化达到100％。使用外标的产率是75.6％。
实施例7
往保持在66℃的反应器中加入8.3毫升0.0063摩尔/升氢氧化铯溶液。这时测量该溶液的pH，并取作目标值(pH＝10.75)。在搅拌下，一次加入50毫克式(II)所示低聚糖，其中n等于0，R1和R6代表SO3Na基团和M是钠。这时可通过连续添加0.476摩尔/升氢氧化铯溶液调节pH，并保持到pH10.75。20小时后，停止添加氢氧化铯，将反应混合物冷却到25℃。离子对方式的CLHP(高效液相色谱)分析能跟踪向其中n等于0，R1和R6代表SO3Na基团和M是钠或铯的式(I)所示衍生物的转化。在这种情况下，CLHP测定表明转化达到90.3％。使用外标的产率是73％。
实施例8
往保持在66℃的反应器中加入8.3毫升0.0063摩尔/升四丁基氢氧化铵溶液。这时测量该溶液的pH，并取作目标值(pH＝10.95)。在搅拌下，一次加入50毫克式(II)所示低聚糖，其中n等于0，R1和R6代表SO3Na基团和M是钠。这时可通过连续添加0.521摩尔/升四丁基氢氧化铵溶液调节pH，并保持到pH10.95。16小时后，停止添加氢氧化铯，将反应混合物冷却到25℃，离子对方式的CLHP(高效液相色谱)分析能跟踪向其式中n等于0，R1和R6代表SO3Na基团和M是钠或四丁基铵的式(I)所示衍生物的转化。在这种情况下，CLHP测定表明转化达到96.7％。使用外标的产率是65％。
本发明的药物含有至少一种式(I)所示低聚糖或式(I)低聚糖混合物作为活性组分，呈组合物形式，其中该活性组分与药学上相容的任何其他可以是惰性或生理学活性的化合物结合。本发明的药物可以通过静脉内、皮下、口、直肠、局部或肺部(吸入)用药方式给药。
用于静脉内或皮下给药的无菌组合物一般是含水溶液。这些组合物还可以含有添加剂，特别是润湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。可以多种方式进行灭菌，例如通过往该组合物中加入灭菌剂进行无菌过滤，或通过辐照。这些组合物还可以制备成无菌的固体组合物，它们可以在使用时溶于无菌的水中或任何其他可注射的无菌介质中。
作为口服的固体组合物，可以使用片剂、丸剂、粉剂(明胶胶囊、袋剂)或颗粒剂。在这些组合物中，在氩气流下，活性组分与一种或多种如淀粉、纤维素、糖、乳糖或二氧化硅之类的惰性稀释剂混合。这些组合物还可以含有除稀释剂之外的其他物质，例如一种或多种润滑剂，像硬脂酸镁或滑石，促进口腔吸收的试剂，染色剂，包衣剂(糖衣丸剂)或清漆。
作为口服的液体组合物，可以使用药学可接受的溶液，悬液、乳液、糖浆和酏剂，它们含有如水、乙醇、甘油、植物油或石蜡油之类的惰性稀释剂。这些组合物还含有除稀释剂外的其它物质，例如润湿剂、增甜剂、增稠剂、香料或稳定剂。
直肠给药组合物是栓剂或直肠用胶囊，它们含有除活性产品外的赋形剂，例如椰子油、半合成甘油酯或聚乙二醇。
局部用药组合物例如可以是膏、洗剂、洗眼剂、漱口剂、滴鼻剂或气雾剂。
其剂量取决于所需效果、治疗时间和给药途径；这些剂量一般是每天每千克皮下用药为0.5-10毫克，即体重60千克成人每天为3-60毫克。
一般地，医生根据待治疗者的年龄、体重和所有其他的固有因素决定合适的剂量。
本发明还涉及与导致细胞毒素物质(例如氧化氮，NO)产生的炎性过程相关的疾病的预防或治疗。式(I)所示低聚糖因此可以用于预防和/或治疗其中脑炎起着可能导致死亡的有害作用的神经变性疾病，其中可以列举中枢神经系统缺血，脑缺血，视网膜和耳蜗缺血，心肌缺血(心肌梗塞)，末梢缺血、中枢神经系统创伤，特别是颅，脊柱和颅脊柱创伤，视网膜和耳蜗创伤，斑状硬化，神经性疼痛和末梢神经病，运动神经元疾病，其中包括肌萎缩性脊髓侧索硬化，神精型爱滋病，阿尔茨海默病，帕金森氏病和Huntington舞蹈病以及某些骨关节炎，特别是关节定位的骨关节炎。

Claims (15)

1、下式所示低聚糖：
Figure A0081453100021
式中，n是0-25的整数，R1、R3、R4和R5相同或不同，它们代表氢原子或SO3M基团，R2和R6相同或不同，它们代表氢原子或SO3M或COCH3基团，以及M是钠、钙、镁或钾，这些低聚糖的混合物以及它们的非对映异构体。
2、权利要求1的式(I)所示低聚糖，其中R4代表氢原子，这些低聚糖的混合物以及它们的非对映异构体。
3、权利要求1或2的式(I)所示低聚糖，其中n是0-10的整数，这些低聚糖的混合物以及它们的非对映异构体。
4、权利要求1或2的式(I)所示低聚糖，其中n是0-6的整数，这些低聚糖的混合物以及它们的非对映异构体。
5、权利要求1或2的式(I)所示低聚糖，其中n是1-6的整数，这些低聚糖的混合物以及它们的非对映异构体。
6、权利要求1的式(I)所示低聚糖的制备方法，其特征在于碱金属氢氧化物或季铵氢氧化物与下式所示低聚糖进行反应：
Figure A0081453100022
式中，n是0-25的整数，R1、R3、R4和R5相同或不同，它们代表氢原子或SO3M基团，R2和R6相同或不同，它们代表氢原子或SO3M或COCH3基团，以及M是钠、钙、镁或钾，或它们的混合物，再分离这些低聚糖或它们的混合物。
7、权利要求6的方法，其特征在于在温度40-80℃与pH10-13的条件下，在含水介质中进行该反应。
8、权利要求6或7的方法，其特征在于使用1-5％碱金属氢氧化物或季铵氢氧化物水溶液。
9、权利要求6-8中任一项的方法，其特征在于该反应在温度60-70℃下进行。
10、权利要求6-9中任一项的方法，其特征在于反应的pH是11-12.5。
11、权利要求6-10中任一项的方法，其特征在于碱金属氢氧化物或季铵氢氧化物是氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铯或四丁基氢氧化铵。
12、含有至少一种权利要求1的低聚糖作为活性组分的药物组合物。
13、含有至少一种权利要求1-5中任一项的低聚糖作为活性组分的药物组合物。
14、权利要求1-5中任一项的式(I)所示低聚糖在制备用于预防或治疗与导致氧化氮(NO)产生的炎性过程相关的疾病的药物方面的用途。
15、权利要求14的式(I)所示低聚糖在制备用于预防和治疗下述疾病的药物中的用途：脑缺血，心肌缺血，末梢血管缺血，骨关节炎，中枢神经系统创伤，颅、脊柱和颅脊柱创伤，斑状硬化，神经性疼痛和末梢神经病，运动神经元疾病，肌萎缩性脊髓侧索硬化，神经型爱滋病，阿尔滋海默病，帕金森氏病和Huntington舞蹈病。
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