EA004046B1

EA004046B1 - Олигосахариды, способ их получения и содержащие их фармацевтические композиции

Info

Publication number: EA004046B1
Application number: EA200200479A
Authority: EA
Inventors: Пьер Мурье; Элизабет Перрэн; Кристиан Висков; Жан-Мари Штутцманн; Флоранс Валь
Original assignee: Авентис Фарма С.А.
Priority date: 1999-10-22
Filing date: 2000-10-18
Publication date: 2003-12-25
Also published as: DK1226148T3; HRP20020330B1; ES2376409T3; EE200200208A; FR2800074B1; KR100872215B1; CA2388369C; BR0014939A; EP1226148A2; CA2388369A1; CN1379781A; JP2003512385A; ATE534656T1; AU781414B2; PT1226148E; PL363052A1; EE05091B1; JP4733329B2; TR200201102T2; NZ518539A

Abstract

Настоящее изобретение относится к олигосахаридам формулыих смесям, их диастереоизомерам, способу получения и содержащим их фармацевтическим композициям.

Description

Настоящее изобретение относится к олигосахаридам формулы

(I) ’е их смесям, их диастереоизомерам, способу их получения и содержащим их фармацевтическим композициям.

Дисахариды-сульфаты, имеющие на восстановительном конце структуру 1,6-ангидро, были описаны Н.Р. \Ус55с1. ЕСагЬойубга1е СйетШту, 11(8), 1039-1052 (1992). Ни о какой их фармакологической активности не упоминалось.

В патенте ЕР 84999 и авторами Υ. 1с1нка\\'а с сотр., СатЬойубт. Век., 141, 273-282 (1985), были также описаны трисахариды-сульфаты со звеном 1,6-ангидро в качестве промежуточных продуктов для получения высших олигосахаридов. Эти трисахариды обладают слабой активностью анти-Ха.

В формуле I является целым числом от 0 до 25; Κ₁, Я₃, Я₄ и Я₅, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М; Я₂ и Я₆, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСН₃; и М обозначает натрий, кальций, магний или калий.

Эти олигосахариды содержат, таким образом, четное число сахаридов.

Я₄ в формуле I является преимущественно атомом водорода, а η преимущественно является целым числом от 0 до 10, предпочтительно от 0 до 6 и еще более предпочтительно от 1 до 6.

Олигосахариды формулы I могут быть получены действием гидроксида щелочного металла или четвертичного аммония на олигосахариды формулы

в которой η является целым числом от 0 до 25; Κι, Я₃, В₄ и Я₅, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М; К₂ и Κ₆, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСН₃; и М обозначает натрий, кальций, магний или калий, или их смеси.

Названную реакцию проводят в водной среде при температуре от 40 до 80°С и рН от 10 до 13.

В качестве возможно используемого гидроксида щелочного металла можно назвать гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид лития и гидроксид цезия.

В качестве возможно используемого гидКоличество гидроксида щелочного металла или четвертичного аммония должно быть достаточным для того, чтобы рН реакционной среды в процессе реакции сохранялся постоянным. Для этой цели гидроксид щелочного металла или четвертичного аммония необходимо добавлять непрерывно в течение всей реакции.

Гидроксид щелочного металла или четвертичного аммония используется преимущественно в виде 1-5%-ного водного раствора.

Реакцию проводят преимущественно при температуре от 60 до 70°С.

рН реакционной среды преимущественно равен 11-12,5.

Реакцию останавливают путем подкисления реакционной среды, например добавлением кислой смолы, такой как смола ЛтЬетШе 1В120^Я(Ника).

Олигосахариды формулы I могут быть при необходимости очищены с помощью гельпроникающей хроматографии на геле типа полиакриламидагароза, таком как гель, поставляемый под маркой и11тоде1 АСА202^Я (Вюкерта), в соответствии с прописью, приведенной ниже для разделения промежуточных олигосахаридов формулы II. Олигосахариды формулы I, у которых η равно 0 или 1, также могут быть в случае необходимости очищены на колонке с окисью алюминия с использованием в качестве элюента смеси вода-этанол.

Промежуточные олигосахариды формулы II и их смеси могут быть получены разделением с помощью гелевой хроматографии смеси олигосахаридов III, полученной ферментативной деполимеризацией гепарина или щелочной деполимеризацией бензилового эфира гепарина или полусинтетического бензилового эфира гепарина.

Названную выше хроматографию проводят на колонках, заполненных гелем типа полиакриламид-агароза, поставляемым под маркой и11тоде1 АСА 202^Κ (Вюкерта). Преимущественно используют батарею колонок с полиакриламидагарозным гелем. Число используемых колонок зависит от объема, геля и разделяемых олигосахаридов. Смесь элюируют с помощью раствора, содержащего фосфатный буфер и хлорид натрия. Фосфатный буфер представляет собой преимущественно 0,02 моль/л раствор ЫаН₂РО₄/ Ыа₂НРО₄ (рН 7), содержащий 0,1 моль/л хлорида натрия. Детекцию различных фракций осуществляют с помощью УФ спектрометрии (254 нм) и ионной спектрометрии ДВЕ). Получаемые при этом фракции могут быть затем при необходимости очищены, например с помощью хроматографии 8АХ (к1топд ашоп ехсйапде) с использованием известных специалистам способов, в частности способов, описанных К.С. Ртсе и Κ.Ι. ЫпНагФ, СатЬойубта1е Яекеатсй, 190, 219233 (1989), А. Ьагпк)аег, 8.Н. Напкеп и Р.В. ОЧегдаагФ СатЬойубта1е Рекеатсй, 266, 37-52 (1995) и в патенте XVО 90/01501 (пример 2).

роксида четвертичного аммония можно назвать гидроксид тетрабутиламмония.

Фракции после этого лиофилизируют и затем обессоливают на заполненной гелем колонке, такой как колонка с гелем 8ерйабех С10^Я (Рйаттас1а Вюейешюак).

Если очистку осуществляют, не прибегая к помощи хроматографии 8ЛХ, лиофилизаты могут быть очищены простым осаждением или подвергнуты фракционированию с помощью известных специалистам способов, в частности с помощью способа, описанного в патенте ЕЯ 2548672. В общем случае операции проводят в соответствии со следующей прописью.

Очищаемую лиофилизированную фракцию растворяют при 25°С в приблизительно десяти объемах дистиллированной воды. С помощью добавки метанола или этанола осаждают желаемый олигосахарид, контролируя его чистоту с помощью хроматографии ЖХВР (жидкостной хроматографии высокого разрешения). Добавку метанола или этанола определяют в зависимости от желаемых чистоты и выхода олигосахарида. Эта операция может быть проведена в несколько последовательных этапов, исходя из начального раствора лиофилизата. С этой целью высаливающий агент (метанол или этанол) добавляют малыми порциями, отделяя после каждого добавления образующийся осадок. Полученные таким образом осадки анализируют с помощью хроматографии ЖХВР. В зависимости от желаемых чистоты и выхода собирают соответствующие им фракции осадка.

Для промежуточных продуктов формулы II, у которых п=0, 1 или 2, целесообразно исходить из смеси III, получаемой с помощью ферментативной деполимеризации.

Эту деполимеризацию проводят с использованием гепариназы I (ЕС 4.2.2.7) в растворе фосфатного буфера с рН 7 в присутствии хлорида натрия и БСА (бычьего сывороточного альбумина) при температуре в пределах от 10 до 18°С, предпочтительно при 15°С, в течение 8-10 суток, предпочтительно 9 суток. Деполимеризация может быть остановлена, например, нагреванием реакционной среды до 100°С в течение 2 мин, а смесь может быть выделена лиофилизацией. На 25 г гепарина предпочтительно используют 7 меж.ед. гепариназы I. Фосфатный буфер обычно содержит 0,05 моль/л ЫаН₂РО₄/ Ыа₂НРО₄ (рН 7) в присутствии 0,1 моль/л хлорида натрия. Концентрация БСА обычно составляет 2%.

Для промежуточных продуктов формулы II, у которых п=0, 1, 2, 3 или 4, целесообразно исходить из смеси III, получаемой деполимеризацией бензилового эфира гепарина.

Бензиловый эфир гепарина может быть получен с помощью методов, описанных в патентах И8 5389618, ЕР 40144, ЕЯ 2548672. Степень эстерификации в этом случае составляет от до 100%, преимущественно от 70 до 90%.

Деполимеризацию проводят в водной среде с помощью гидроксида щелочного металла (например, гидроксида лития, гидроксида натрия, гидроксида калия или гидроксида цезия) или гидроксида четвертичного аммония (например, гидроксида тетрабутиламмония) преимущественно в молярной концентрации от 0,1 до 0,2 моль/л при температуре от 40 до 80°С в течение времени от 5 до 120 мин. В предпочтительном варианте реакцию проводят в течение 5-15 мин при температуре от 60 до 70°С с использованием 0,15 моль/л раствора гидроксида натрия. Реакцию деполимеризации останавливают с помощью нейтрализации, добавляя кислоту, такую как уксусная кислота. После добавления 10% мас./об. ацетата натрия смесь олигосахаридов осаждают добавкой метанола преимущественно в количестве 2 об. на 1 об. реакционной среды, после чего смесь отфильтровывают.

В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, смесь олигосахаридов, полученную после химической деполимеризации в виде водного раствора, обогащают с помощью ультрафильтрации на мембранах с соответствующим номинальным пределом разделения (типа РеШеоп из регенерированной целлюлозы, поставляемых фирмой МтШроте), причем тип мембраны подбирают в соответствии с типом выделяемых обогащенных олигосахаридов. Для олигосахаридов II, у которых п=0, используют мембрану с номинальным пределом разделения 1 кДа, для олигосахаридов II, у которых п=1, используют мембрану 1 кДа или 3 кДа, для олигосахаридов II, у которых п=2, используют мембрану 3 кДа, для олигосахаридов II, у которых п=3 или 4, используют мембрану 5 кДа. В процессе этой операции собирают фильтрат, а задержанный материал отбрасывают. В результате операции фракция обогащенного продукта может составлять от 50 до 10% исходной смеси олигосахаридов, при этом она содержит не менее 80% желаемого олигосахарида.

Для промежуточных продуктов формулы II, у которых п= от 0 до 25, целесообразно исходить из смеси III, получаемой деполимеризацией полусинтетического бензилового эфира полисахарида-сульфата. Полусинтетический бензиловый эфир полисахарида-сульфата получают из полусинтетических полисахаридов-сульфатов, получаемых из полисахарида К5 с помощью методов, описанных в патентах XVО 94/29352 и νθ 96/14425. Условия эстерификации, деполимеризации и выделения такие же, как те, которые описаны выше для бензилового эфира гепарина.

Во всех описанных выше способах исходный гепарин может быть получен от свиньи, овцы, козы или быка и может быть взят из слизи, легких или кожи животных. Преимущественно используют гепарин из слизи свиньи, овцы или из легких быка, причем предпочтительнее из слизи свиньи.

Олигосахариды формулы I обладают противовоспалительными свойствами и могут, таким образом, быть использованы для профилактики или лечения болезней, связанных с воспалительным процессом, при котором происходит продукция цитотоксических веществ, таких как закись азота (N0), индуцируемая форма которых высвобождается, в частности, нейтрофилами или макрофагами, когда последние мигрируют и активируются в ткани. Активация, миграция, слипание и инфильтрация нейтрофилов происходят в затронутых ишемией зонах ткани в результате закупорки или спазма артерии, питающей эту ткань. Такие ишемии могут возникать либо в головном мозге (нарушение мозгового кровообращения), либо в сердечной мышце (инфаркт миокарда), либо в нижних конечностях (так называемые периферические ишемии). Олигосахариды формулы I могут быть, таким образом, использованы для профилактики и/или лечения нейродегенеративных заболеваний, в случае которых воспаление мозга играет разрушающую роль с возможным летальным исходом, из которых можно назвать церебральные ишемии, ишемии сердца (инфаркт миокарда), периферические ишемии, повреждения центральной нервной системы и, в частности, черепные, спинно-мозговые и черепно-спинномозговые травмы, рассеянный склероз, невропатические боли и периферические невропатии, заболевания двигательных нейронов, в том числе боковой амиотрофический склероз, нейроСПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и хорея Гентингтона, и некоторые формы остеоартритов, в частности локализованных в суставах.

Противовоспалительная активность этих продуктов доказана ίη νίνο в тесте на продукцию ΝΟχ (нитрит и нитрат), индуцируемую липополисахаридом (ЬР8), полученным от Ε.οοίί способом, описанным М.УатакЬйа с сотр., Еиг. I. РЬагтасо1., 338, 2, 151-158 (1997) или ТЕ. δίκίίίΐο с сотр., Ат. 1. Искри. Се11 Μοί. Βίοί., 13, 1, 45-53 (1995).

Мышам-самцам СИ1 (СНаг1ек Кщег, 25-35 г) вводят внутривенно в момент времени ТО 0,5 мг/кг олигосахарида в виде шариков, в момент времени Т+15 мин подкожно 1 или 2 мг/кг олигосахарида. В момент времени Т+30 мин вводят 100 мг/кг липополисахарида (ЬР8), полученного от Е.тоН (81дта Ь3129, серотип 0127:В8). В момент времени Т+3 час вновь вводят подкожно 1 или 2 мг/кг олигосахарида. В момент времени Т+5 ч 30 мин с помощью глазной пункции отбирают пробу крови и определяют концентрации ΝΟχ (нитрит и нитрат) в плазме, используя колориметрический метод Грисса после восстановления нитрата в нитрит с помощью нитратредуктазы следующим образом: 12 рл образца плазмы смешивают с 88 рл деионизованной воды и инкубируют в темноте в течение 1 ч при комнатной температуре с 40 рл фосфатного буфера (0,31М, рН 7,5), 20 рл β-НАДФН (восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат) (0,86 мМ), 20 рл ФДА (флавинадениндинуклеотид) (0,11 мМ) и 20 рл нитратредуктазы (2 ед./мл) (Βοей^^ηде^ Маппйет). Добавляют 10 рл ΖηδΟ₄ (1М) для осаждения белков и после смешения образцы центрифугируют при 20000д в течение 5 мин. В заключение 50 рл супернатанта инкубируют 10 мин при комнатной температуре со 100 рл реактива Грисса (1%-ный раствор сульфаниламида в 0,1%-ном растворе смеси фосфорная кислота/нафтилэтилендиамин в деионизованной воде (об./об.)). Оптические плотности замеряют при 540 нм на микропластинчатом спектрофотометре, производя по два замера на каждую точку. В качестве стандарта в колориметрическом методе используют ΚNОз и №N02.

Олигосахариды изобретения в названном испытании ингибируют образование ΝΟχ более чем на 50%.

Из предпочтительных олигосахаридов формулы I можно, в частности, назвать олигосахариды, у которых:

- η равно 0, И! и И₆ обозначают радикал 8О₃№ и М обозначает натрий, и смесь его диастереоизомеров,

- η равно 1, К.₁, И₂, И₃, и И₆ обозначают радикал 8О₃№, И₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий, и смесь его диастереоизомеров,

- η равно 2, К.₁, И₂, И₃, и И₆ обозначают радикал 8О₃№, И₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий, и смесь его диастереоизомеров,

- η равно 2, К.₁, И₂, И₃ и И₆ обозначают радикал 8О₃№, обозначает атом водорода или радикал 80₃№, И₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий, и смесь его диастереоизомеров (производное 1,6-ангидро-А1к-1к-Пк).

Получение олигосахаридов формулы I и промежуточных продуктов иллюстрируют следующие примеры.

В этих примерах используют следующие значения сокращений:

ΔΕ: (4-дезокси-2-0-сульфо-а-Ь-треогексенпиранозилурониевая кислота)-(1 ^4)-2дезокси-2-сульфамино-6-0-сульфо-а-Э-глюкопираноза, тринатриевая соль, или ΔΑρ28-(1^4)α-^-С1сNρ2868.

Ц: (2-сульфо-а-Ь-идопиранозилурониевая кислота)-(1^4)-2-дезокси-2-сульфамино-6-0сульфо-а-Э-глюкопираноза, тетранатриевая соль, или α-^-IάοΑρ28-(1^4)-α-^-С1сNρ2868.

Пк: (а-Ь-идопиранозилурониевая кислота)(1^4)-2-дезокси-2-сульфамино-6-0-сульфо-аΌ-глюкопираноза, тринатриевая соль, или а-ЬIάοΑρ-(1^4)-α-^-6ίсNρ2868,

Шб: (2-сульфо-а-Ь-идоииранозилурониевая кислота)-(1 >4)-2-дезокси-2-сульфамино-аΌ-глюкоиираноза, тринатриевая соль, или α-Ь1боАр28-(1>->4)-а-О-61сЫр28,

1боАр: идоииранозилурониевая кислота, 61сЫр: 2-дезокси-2-аминоглюкоиираноза, АИАр: 4-дезокси-а-Ь-треогексенииранозилурониевая кислота,

8: сульфат.

Примеры иолучения смесей формулы II

Пример А. Получение олигосахаридов формулы II, у которых п=0, 1 и 2, ферментативной деиолимеризацией и разделением.

Растворяют 25 г геиарина в 250 мл раствора фосфатного буфера, содержащего 0,05 моль/л ΝαΗ₂ΡΟ₄/Να₂ΗΡ0₄ (рН=7), 0,2 моль/л хлорида натрия и 2% БСА (бычьего сывороточного альбумина). В смесь вводят 7 меж. ед. геиариназы I (ЕС 4.2.2.2.7), охлаждают иолученный раствор до 15°С и выдерживают ири этой темиературе в течение всей реакции деиолимеризации. За иротеканием реакции следят иутем стуиенчатого отбора ироб, анализируемых с иомощью гель ироникающей хроматографии. По истечении 9 суток ферментативную реакцию останавливают, нагревая реакционную среду в течение двух минут ири 100°С. Смесь иосле этого охлаждают и лиофилизируют, иолучая таким образом смесь олигосахаридов III.

Полученную смесь олигосахаридов III хроматографируют ио следующей методике: хроматографию ироводят на колонках, заиолненных иолиакриламид-агарозным гелем, известным иод названием ийгоде1 АСА 202, и элюируют смесь раствором, содержащим фосфатный буфер (0,02 моль/л ЫаН₂РО₄/Ыа₂НРО₄), рН=7, и 0,1 моль/л хлорида натрия. Детекцию осуществляют с иомощью УФ сиектрометрии (254 нм) и ионной сиектрометрии (1ВБ). Продукты могут быть затем ири необходимости очищены с иомощью хроматографии 8АХ Щгопд апюп ехсйапде) или фракционным осаждением ио методу, оиисанному в иатенте БК 2548672. Выделенные фракции иродукта лиофилизируют и затем обессоливают на колонке, заиолненной гелем 8ерйабех 610^К (Рйагтааа ВюсйетюаП).

Исиользуя эту методику, иолучают 3 г дисахарида Ιδ и 1100 мг смеси гексасахарида, содержащего, как иравило, 55% ироизводного Δ[δШ-Еб, 35% АШ-Ш-Нб и 10% АШ-Ш-Шб. Эта смесь может быть очищена с исиользованием известных сиециалистам сиособов, иозволяющих выделение каждого из комионентов, или исиользована как таковая для иревращения в 1,6ангидро-ироизводные формулы I. Следует отметить, что в ироцессе этого иревращения гексасахарид ΔΙδ-Ιδ-ΙΙΙδ не может дать соединений формулы I.

Пример В. Получение олигосахаридов формулы II, у которых п=0, 1, 2, 3 или 4, деиолимеризацией бензилового эфира геиарина и разделением.

a. Получение бензилового эфира геиарина.

Бензиловый эфира геиарина иолучают как оиисано в иримере 2 иатента И8 5389618.

b. Деиолимеризация.

Растворяют 100 г бензилового эфира геиарина в 1,9 л деминерализованной воды. Смесь нагревают до 60°С ири иеремешивании. После образования гомогенного раствора вводят в один ирием ириблизительно 35 мл 23%-ного раствора гидроксида натрия. После ироведения реакции в течение 10 мин раствор охлаждают и нейтрализуют 80 мл ириблизительно 2н. раствора уксусной кислоты. К иолученному раствору добавляют 10% мас./об. ацетата натрия. Смесь олигосахаридов осаждают добавлением ириблизительно 2 объемов метанола. Осадок отделяют фильтрацией, дважды иромывают метанолом и сушат ири 50°С и иониженном давлении. После сушки иолучают 73,8 г смеси олигосахаридов II.

c. Обогащение олигосахарида с п=1.

Растворяют 30 г иолученной выше смеси олигосахаридов в ириблизительно 35 объемах воды. Этот раствор иодвергают ультрафильтрации на мембране 3 кДа (РеШсоп). После иолучения 600 мл фильтрата задержанную часть разбавляют 500 мл воды. Продолжают оиерацию до иолучения доиолнительных 450 мл фильтрата. Обе фракции фильтрата объединяют и затем досуха уиаривают ири иониженном давлении. Получают 6,1 г желтовато-белого твердого вещества. Анализ этого вещества с иомощью гельироникающей хроматографии указывает на содержание в нем ириблизительно 30% олигосахаридов формулы II, у которых п=1.

б. Фракционирование иодвергнутых ультрафильтрации смесей олигосахаридов.

Обогащенную смесь фракционируют на колонках, заиолненных иолиакриламидагарозным гелем, известным иод названием И11годе1 АСА 202 (исиользуют 4 иоследовательно расиоложенных колонки с диаметром 10 см и высотой 50 см). 5 г обогащенной ультрафильтрацией смеси растворяют в 25 мл воды, иосле чего элюируют 0,2 моль/л раствором хлорида натрия со скоростью 5 мл/мин. Отбирают с низа колонки фракции ио 25 мл. Детекцию иродуктов осуществляют с иомощью УФ сиектрометрии (254 нм) и ионной сиектрометрии (1ВБ). Фракции иродукта с п=1 выделяют, лиофилизируют и затем обессоливают на колонке, заиолненной гелем 8ер11абех 610. После лиофилизации иолучают 1 г тетрасахарида, содержащего, как иравило, 70% ироизводного ΔΙδ-Ιδ формулы II (К₁, К₂, К₃, К₅, Кб = 8О₃Ыа; К₄ = Н и М = Ыа). Производное ΔΙδ-Ιδ может быть ири необходимости очищено с иомощью хроматографии 8АХ Щгопд ашоп ехсйапде) или, что является иредиочтительным, фракционным осаждением ио методу, оиисанному в иатенте БК 2548672.

Пример 1. В реактор при температуре 66°С загружают 5 мл 0,0063 моль/л раствора гидроксида натрия. Измеряют рН раствора и принимают его значение в качестве целевого (рН 11,35). Добавляют при перемешивании в один прием 30 мг олигосахарида формулы II, у которого η равно 0, К₁ и К₆ обозначают радикал 8О₃Иа и М обозначает натрий. После этого корректируют рН и поддерживают его равным 11,35 с помощью непрерывного добавления 0,5 моль/л раствора гидроксида натрия. Через 10 ч добавление гидроксида натрия прекращают и реакционную смесь охлаждают до 25°С. После этого доводят рН раствора до 6-7, добавляя смолу АтЬегШе I. 120. Смесь фильтруют на мембране \νΐιηΙιηηη СГ/В и досуха упаривают при пониженном давлении (2,7 кПа) при температуре, близкой к 25°С. Продукт забирают 0,5 мл дистиллированной воды и лиофилизируют, получая 29 мг смеси диастериоизомеров олигосахарида формулы I, у которого η равно 0, Κι и К₆обозначают радикал 8Θ₃,Ν;·ι и М обозначает натрий [(4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4енпиранозилурониевая кислота)-(1 ^4)-1,6-ангидро-2-дезокси-2-сульфамино-в-Э-маннопираноза, тринатриевая соль: спектр ПМР в Э₂О. 400 МГц, Т=298К, δ в м.д.: 3,15(1Н, с, Н2), 3,75(2Н, м, Н6 и Н3), 3,88(1Н, м, Н4), 4,20(1Н, д, 1=8 Гц, Н6), 4,22(1Н, т, 1=5 Гц, Н3'), 4,58(1Н, м, Н2'), 4,75(1Н, м, Н5), 5,53(1Н, с, Н1), 5,60(1Н, дд, 1=6 и 1 Гц, Н1'), 6,03(1Н, д, 1=5 Гц, Н4');

(4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4енпиранозилурониевая кислота)-(1 ^4)-1,6-ангидро-2-дезокси-2-сульфамино-Р-О-глюкопираноза, тринатриевая соль): спектр ПМР в И₂О, 400 МГц, Т=298К, δ в м.д.: 3,34(1Н, дд, 1=7 и 2 Гц, Н2), 3,72(1Н, т, 1=8 Гц, Н6), 3,90(1Н, м, Н3), 4,03(1Н, с, Н4), 4,20(1Н, д, 1=8 Гц, Н6), 4,23(1Н, т, 1=5 Гц, Н3'), 4,58(1Н, м, Н2'), 4,78(1Н, м, Н5), 5,50(1Н, с, Н1), 5,60(1Н, дд, 1=6 и 1 Гц, Н1'), 6,03(1Н, д, 1=5 Гц, Н4')].

Пример 2. В реактор при температуре 62°С загружают 33,3 мл 0,0063 моль/л раствора гидроксида натрия. Измеряют рН раствора и принимают его значение в качестве целевого (рН 11,15). Добавляют при перемешивании в один прием 200 мг олигосахарида формулы II, у которого η равно 1, К_ь Κ₂, Κ₃, Κ₅ и Κ₆ обозначают радикал 8О₃№, К₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий. После этого корректируют рН и поддерживают его равным 11,15 с помощью непрерывного добавления 0,5 моль/л раствора гидроксида натрия. Через 12 ч добавление гидроксида натрия прекращают и реакционную смесь охлаждают до 25°С. После этого доводят рН раствора до 6-7, добавляя смолу АтЬегШе I. 120. Смесь фильтруют на мембране ^йа!тап СГ/В и досуха упаривают при пониженном давлении (2,7 кПа) при температуре, близкой к 25°С. Продукт забирают 3 мл дистиллированной воды и лиофилизируют, получая

230 мг олигосахарида формулы I, у которого η равно 1, .1, .2, .3, .5 и .6 обозначают радикал 8О₃№1, К₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий, в виде смеси диастереоизомеров [(4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4-енпиранозилурониевая кислота)-(1^4)-2-дезокси-2сульфамино-6-О-сульфо-а-Э-глюкопиранозил(1^4)-(2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилурониевая кислота)-(1^4)-1,6-ангидро-2-дезокси-2сульфамино-в-Э-маннопираноза, гептанатриевая соль): спектр ПМР в И₂О, 400 МГц, Т=298К, δ в м.д.: 3,15 (1Н, с, Н2), 3,25 (1Н, м, Н2), 3,60 (1Н, м, Н3), 3,70-4,70 (14Н, массив, Н3/Н4/Н6, Н2'/Н3'/Н4'/Н5', Н4/Н5/Н6, Н2'/Н3'), 4,75 (1Н, м, Н5), 5,20-5,40 (2Н, м, Н1' и Н1), 5,45 (1Н, м, Н1'), 5,56 (1Н, м, Н1), 5,94 (1Н, д, 1=5 Гц, Н4);

(4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4енпиранозилурониевая кислота)-(1 ^4)-2-дезокси-2-сульфамино-6-О-сульфо-а-Э-глюкопиранозил-(1^4)-(2-О-сульфо-а-Ь-идопиранозилурониевая кислота)-(1 ^4)- 1,6-ангидро-2-дезокси-2-сульфамино-в-О-глюкопираноза, гептанатриевая соль): спектр ПМР в И₂О, 400 МГц, Т=298К, δ в м.д.: 3,25 (1Н, м, Н2), 3,42 (1Н, дд, 1=4 и 1 Гц, Н2), 3,60 (1Н, м, Н3), 3,70-4,70 (14Н, массив, Н3/Н4/Н6, Н2'/Н3'/Н4'/Н5',

Н4/Н5/Н6, Н2'/Н3'), 4,75 (1Н, м, Н5), 5,205,40 (2Н, м, Н1' и Н1), 5,45 (1Н, м, Н1'), 5,52 (1Н, м, Н1), 5,94(1Н, д, 1=5 Гц, Н4)].

Пример 3. В реактор при температуре 62°С загружают 16,7 мл 0,0063 моль/л раствора гидроксида натрия. Измеряют рН раствора и принимают его значение в качестве целевого (рН 11,7). Добавляют при перемешивании в один прием 100 мг олигосахарида формулы II, у которого η равно 2, .1, .2, .3, .5 и .6 обозначают радикал 8О₃№1, К₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий. После этого корректируют рН и поддерживают его равным 11,7 с помощью непрерывного добавления 0,5 моль/л раствора гидроксида натрия. Через 10 ч добавление гидроксида натрия прекращают и реакционную смесь охлаждают до 25°С. После этого доводят рН раствора до 6-7, добавляя смолу АтЬегШе I. 120. Смесь фильтруют на мембране ^йаΐтаη СГ/В и досуха упаривают при пониженном давлении (2,7 кПа) при температуре, близкой к 25°С. Продукт забирают 3 мл дистиллированной воды и лиофилизируют, получая 108 мг олигосахарида формулы I, у которого η равно 2, .1, .2, .3, .5 и .6 обозначают радикал 8О₃№1, К₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий, в виде смеси диастереоизомеров. Отмечают символами от А до Г сахара, которые образуют гексасахариды, где А представляет собой остаток 1,6-анигидро и Г-остаток ненасыщенной урониевой кислоты.

[((4-Дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4енпиранозилурониевая кислота)-(1 ^4)-2-дезокси-2-сульфамино-6-О-сульфо-а-Э-глюкопира11 нозил-(1^4)-(2-О-сульфо-а-Ь-идоииранозилурониевая кислота)-( 1 ^4)-2-дезокси-2-сульфамино-6-О-сульфо-а-Э-глюкоииранозил(1 ^4)-(2-О-сульфо-а-Ь-идоииранозилурониевая кислота)-(1 ^4)-1,6-ангидро-2-дезокси-2сульфамино-Р-Э-манноиираноза, ундеканатриевая соль): сиектр ПМР в И₂О, 600 МГц, Т=298К, δ в м.д.: 3,15 (1Н, с, Н2(А)), 3,25 (2Н, м, Н2(С+Е)), 3,60 (2Н, м, Н3 (С+Е)), 3,65-4,50 (19Н, массив, Η2(Β+Ό)/Η3(Α+Β+Ό+Ε)/

Η4(Α+Β+Ο+Ό+Ε)/Η5 (С+Е)/Н6(А+С+Е)), 4,60 (1Н, с, Η2 (Е)), 4,80 (3Η, м, Η5 (Α+Β+Ό)), 5,18 (1Η, с, Η1(Ό)), 5,30 (1Η, с, Н1(В)), 5,34 (1Н, д, Н1(С)), 5,36 (1Н, д, Н1(Е)), 5,46 (1Н, с, Η1(Ε)),

5,57 (1Η, с, Н1(А)), 5,95(1Н, д, 1=5 Гц, Η4(Ε));

(4-дезокси-2-О-сульфо-а-Ь-трео-гекс-4енииранозилурониевая кислота)-(1 ^4)-2-дезокси-2-сульфамино-6-О-сульфо-п-О-глюкоииранозил-( 1 ^4)-(2-О-сульфо-а-Ь-идоииранозилурониевая кислота)-( 1 ^4)-2-дезокси-2-сульфамино-6-О-сульфо-а-Э-глюкоииранозил(1 ^4)-(2-О-сульфо-а-Ь-идоииранозилурониевая кислота)-(1 ^4)-1,6-ангидро-2-дезокси-2сульфамино-Р-Э-глюкоиираноза, ундеканатриевая соль): сиектр ПМР в И₂О, 600 МГц, Т=298К, δ в м.д.: 3,25(2Н, м, Н2(С+Е)), 3,42 (1Н, м, Н2(А)), 3,60(2Н, м, Н3(С+Е)), 3,65-4,50(19Н, массив, Н2(Β+^)/Н3(Α+Β+^+Е)/Н4(Α+Β+С+

О+Е)/Н5(С+Е)/Н6(А+С+Е)), 4,60(1Н, с, Η2(Ε)),

4,80 (3Н, м, Н5 (Α+Β+Ό)), 5,18 (1Н, с, Η1(Ό)), 5,31(1Н, с, Н1(В)), 5,34 (1Н, д, Н1(С)), 5,36(1Н, д, Η1 (Е)), 5,46 (1Н, с, Η1(Ε)), 5,52(1Н, с, Η1 (А)), 5,95 (1Н, д, 1=5 Гц, Н4 (Е)).

Пример 4. В реактор ири темиературе 62°С загружают 4 мл 0,0316 моль/л раствора гидроксида натрия. Измеряют рН раствора и иринимают его значение в качестве целевого (рН 11,8). Добавляют ири иеремешивании в один ирием 100,8 мг смеси олигосахаридов формулы II, у которых η равно 2, содержащей 55% ироизводного ΔΙδ-Ιδ-Ιδ (Κ₁, В₂, В₃, В₅ и В₆ обозначают радикал 8О₃Ыа, В₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий), 35% ΔΙδ-Ιδ-ΙΙδ (Κ₁, В₂, В₃и В₆ обозначают радикал 8О₃№1. В₅ обозначает радикал 8О₃Ыа или атом водорода, В₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий) и 10% ΔΙδ-Ιδ-ΙΙΙδ (Κ₁, В₂, В₃, В₅ и В₆ обозначают радикал 8О₃Ыа, В₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий, иричем функция 8О₃М у углерода С6 заменена водородом). После этого корректируют рН и иоддерживают его равным 11,8 с иомощью неирерывного добавления 0,5 моль/л раствора гидроксида натрия. Через 11 ч добавление гидроксида натрия ирекращают и реакционную смесь охлаждают до 25°С. После этого доводят рН раствора до 6-7, добавляя смолу ΑπίΒογΙιΙο ΙΚ 120. Смесь фильтруют на мембране Айа1тап СЕ/Β и досуха уиаривают ири иониженном давлении (2,7 кПа) ири темиературе, близкой к 25°С. Продукт забирают 1,5 мл дистиллированной воды и лиофилизируют, иолучая 110 мг смеси олигосахаридов формулы Ι, у которых η равно 2, содержащей, в частности, ироизводное 1,6-ангидро^И-И-П (Κ₁, В₂, В₃, В₅и В₆ обозначают радикал 8О₃Ыа, В₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий) и ироизводное 1,6-ангидро-ΔIδ-Iδ-IIδ (Κ₁, Κ₂, В₃ и В₆обозначают радикал 8О₃Ыа, В₅ обозначает радикал 8О₃№ или атом водорода, В₄ обозначает атом водорода и М обозначает натрий). Анализ с иомощью ЖХВР (жидкостной хроматографии высокого разрешения) в режиме ионных иар иозволяет следить за иревращением ироизводных формулы Ι.

Полученные данные ЖХВР указывают на то, что иревращение осуществляется с ироизводными ΔΙδ-Ιδ-Ιδ и ΔΙδ-Ιδ-ΙΙδ.

Пример 5. В реактор ири темиературе 66°С загружают 8,6 мл 0,025 моль/л раствора гидроксида лития. Измеряют рН раствора и иринимают его значение в качестве целевого (рН 11,68). Добавляют ири иеремешивании в один ирием 50 мг олигосахарида формулы ΙΙ, у которого η равно 0, Κι и В₆ обозначают радикал 8О₃Ыа и М обозначает натрий. После этого корректируют рН и иоддерживают его равным 11,68 с иомощью неирерывного добавления 0,466 моль/л раствора гидроксида лития. Через 8 ч добавление гидроксида лития ирекращают и реакционную смесь охлаждают до 25°С. Анализ с иомощью ЖХВР (жидкостной хроматографии высокого разрешения) в режиме ионных иар иозволяет следить за иревращением ироизводного формулы Ι, у которого η равно 0, Κι и В₆обозначают радикал 8О₃Ыа и М обозначает натрий или литий. Полученные данные ЖХВР указывают на то, что иревращение осуществляется на 100%. Выход на основании сравнения с эталонными данными составляет 81,2%.

Пример 6. В реактор ири темиературе 66°С загружают 8,3 мл 0,0063 моль/л раствора гидроксида калия. Измеряют рН раствора и иринимают его значение в качестве целевого (рН 11,1). Добавляют ири иеремешивании в один ирием 50 мг олигосахарида формулы ΙΙ, у которого η равно 0, Κ| и В₆ обозначают радикал 8О₃Ыа и М обозначает натрий. После этого корректируют рН и иоддерживают его равным 11,1 с иомощью неирерывного добавления 0,515 моль/л раствора гидроксида калия. Через 24 ч добавление гидроксида калия ирекращают и реакционную смесь охлаждают до 25°С. Анализ с иомощью ЖХВР (жидкостной хроматографии высокого разрешения) в режиме ионных иар иозволяет следить за иревращением ироизводного формулы Ι, у которого η равно 0, В! и В₆ обозначают радикал 8О₃Ыа и М обозначает натрий или калий. Полученные данные ЖХВР указывают на то, что иревращение осуществляется на 100%.

Выход на основании сравнения с эталонными данными составляет 75,6%.

Пример 7. В реактор при температуре 66°С загружают 8,3 мл 0,0063 моль/л раствора гидроксида цезия. Измеряют рН раствора и принимают его значение в качестве целевого (рН 10,75). Добавляют при перемешивании в один прием 50 мг олигосахарида формулы II, у которого η равно 0, К₁ и К₆ обозначают радикал 8О₃Ыа и М обозначает натрий. После этого корректируют рН и поддерживают его равным 10,75 с помощью непрерывного добавления 0,476 моль/л раствора гидроксида цезия. Через 20 ч добавление гидроксида цезия прекращают и реакционную смесь охлаждают до 25°С. Анализ с помощью ЖХВР (жидкостной хроматографии высокого разрешения) в режиме ионных пар позволяет следить за превращением производного формулы I, у которого η равно 0, К₁ и К₆ обозначают радикал 8Ο₃Ν;·ι и М обозначает натрий или цезий. Полученные данные ЖХВР указывают на то, что превращение осуществляется на 90,3%. Выход на основании сравнения с эталонными данными составляет 73%.

Пример 8. В реактор при температуре 66°С загружают 8,3 мл 0,0063 моль/л раствора гидроксида тетрабутиламмония. Измеряют рН раствора и принимают его значение в качестве целевого (рН 10,95). Добавляют при перемешивании в один прием 50 мг олигосахарида формулы II, у которого η равно 0, К₁ и Кб обозначают радикал 8Θ₃Ν;·ι и М обозначает натрий. После этого корректируют рН и поддерживают его равным 10,95 с помощью непрерывного добавления 0,521 моль/л раствора гидроксида тетрабутиламмония. Через 16 ч добавление гидроксида цезия прекращают и реакционную смесь охлаждают до 25°С. Анализ с помощью ЖХВР (жидкостной хроматографии высокого разрешения) в режиме ионных пар позволяет следить за превращением производного формулы I, у которого η равно 0, К₁ и К₆ обозначают радикал 8Θ₃Ν;·ι и М обозначает натрий или тетрабутиламмоний.

Полученные данные ЖХВР указывают на то, что превращение осуществляется на 96,7%. Выход на основании сравнения с эталонными данными составляет 65%.

Лекарственные средства по изобретению содержат в качестве активного начала по меньшей мере один олигосахарид формулы I или смесь олигосахаридов формулы I в виде композиции, в которой активное начало ассоциировано с любым другим фармацевтически совместимым продуктом, который может быть как инертным, так и физиологически активным. Лекарственные средства по изобретению могут применяться внутривенно, подкожно, перорально, ректально, местно и пульмонарно (ингаляцией).

Стерильные композиции для внутривенного и подкожного применения обычно являются водными растворами. Эти композиции могут также содержать адъюванты, в частности смачивающие, изотонизирующие, эмульгирующие, диспергирующие и стабилизирующие агенты. Стерилизация может быть осуществлена различными способами, например асептической фильтрацией, введением в композицию стерилизующих агентов, облучением. Эти композиции могут быть также приготовлены в виде твердых стерильных композиций, которые непосредственно перед применением могут быть растворены в стерильной воде или любой другой пригодной для инъекций стерильной среде.

В качестве твердых композиций для перорального применения могут быть использованы таблетки, пилюли, порошки (желатиновые капсулы, крахмальные облатки) или гранулы. Активное начало в композициях смешивают в токе аргона с одним или несколькими инертными разбавителями, такими как крахмал, целлюлоза, сахароза, лактоза или кремнезем. Эти композиции могут также содержать другие, отличные от разбавителей, вещества, например одно или несколько маслянистых материалов, таких как стеарат магния или тальк, агент, способствующий всасыванию при пероральном применении, краситель, оболочка (драже) или лак.

В качестве жидких композиций для перорального применения можно использовать фармацевтически приемлемые растворы, суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, такие как вода, этиловый спирт, глицерин, растительные масла или парафиновое масло. Эти композиции могут содержать другие, отличные от разбавителей, вещества, например смачивающие, подслащивающие, загущающие, ароматизирующие или стабилизирующие продукты.

Композициями для ректального применения являются суппозитории или ректальные капсулы, которые кроме активного продукта содержат эксципиенты, такие как масло какао, полусинтетические глицериды или полиэтиленгликоли.

Композиции для местного применения могут, например, представлять собой кремы, лосьоны, глазные капли, полоскания, капли для носа или аэрозоли.

Дозы зависят от желаемого эффекта, от продолжительности лечения и от пути введения. Обычно они составляют от 0,5 до 10 мг/кг в сутки при подкожном применении, что соответствует суточной дозе от 3 до 60 мг для взрослого человека весом 60 кг.

В общем случае врач должен определить подходящую дозу в зависимости от возраста, веса и всех остальных факторов, связанных с проходящим лечение лицом.

Изобретение относится также к способу предупреждения и лечения болезней, связанных с воспалительным процессом, при котором происходит продукция цитотоксических веществ, таких как закись азота (ΝΟ). Олигосахариды формулы I могут таким образом быть использованы для предупреждения и/или лечения нейро15 дегенеративных заболеваний, в случае которых воспаление мозга играет разрушающую роль с возможным летальным исходом, из которых можно назвать ишемии центральной нервной системы, церебральные ишемии, ишемии сетчатки и внутреннего уха, ишемии сердца (инфаркт миокарда), периферические ишемии, повреждения центральной нервной системы и, в частности, черепные, спинномозговые и черепно-спинномозговые травмы, травмы сетчатки и внутреннего уха, рассеянный склероз, невропатические боли и периферические невропатии, заболевания двигательных нейронов, в том числе боковой амиотрофический склероз, нейроСПИД, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и хорея Гентингтона, и некоторые формы остеоартритов, в частности, локализованных в суставах.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Олигосахариды формулы в которой η является целым числом от 0 до 25; Я₁, Я₃, Я₄ и К₅. одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М; Я₂ и Я₆, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСН₃ и М обозначает натрий, кальций, магний или калий, смесь этих олигосахаридов и их диастереоизомеры.
2. Олигосахариды формулы I по п.1, у которых Я₄ обозначает атом водорода, смесь этих олигосахаридов и их диастереоизомеры.
3. Олигосахариды формулы I по одному из пп.1 или 2, у которых η является целым числом от 0 до 10, смесь этих олигосахаридов и их диастереоизомеры.
4. Олигосахариды формулы I по одному из пп.1 или 2, у которых η является целым числом от 0 до 6, смесь этих олигосахаридов и их диастереоизомеры.
5. Олигосахариды формулы I по одному из пп.1 или 2, у которых η является целым числом от 1 до 6, смесь этих олигосахаридов и их диастереоизомеры.
6. Способ получения олигосахаридов формулы I по п.1, отличающийся тем, что гидроксид щелочного металла или четвертичного аммония вводят во взаимодействие с олигосахаридами формулы в которой η является целым числом от 0 до 25; К₁, Я₃, Я₄ и Я₅, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М; Я₂ и Я₆, одинаковые или разные, обозначают атом водорода или радикал 8О₃М или СОСН₃ и М обозначает натрий, кальций, магний или калий, или их смеси, и выделяют олигосахариды или их смеси.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что реакцию проводят в водной среде при температуре от 40 до 80°С и рН от 10 до 13.
8. Способ по одному из пп.6 или 7, отличающийся тем, что используют 1-5%-ный водный раствор гидроксида щелочного металла или четвертичного аммония.
9. Способ по одному из пп.6-8, отличающийся тем, что реакцию проводят при температуре от 60 до 70°С.
10. Способ по одному из пп.6-9, отличающийся тем, что рН реакционной среды составляет от 11 до 12,5.
11. Способ по пп.6-10, отличающийся тем, что гидроксидом щелочного металла или четвертичного аммония является гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид лития, цезия или гидроксид тетрабутиламмония.
12. Фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного начала по меньшей мере один олигосахарид по п.1.
13. Фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного начала по меньшей мере один олигосахарид по одному из пп.1-5.
14. Применение олигосахаридов формулы I по одному из пп.1-5 для получения лекарственного средства, пригодного для профилактики или лечения заболеваний, связанных с воспалительным процессом, при котором происходит образование закиси азота (N0).
15. Применение олигосахаридов формулы I по п.14 для получения лекарственного средства, пригодного для профилактики и лечения церебральных, сердечных или периферических сосудистых ишемий, остеоартритов, повреждений центральной нервной системы, черепных, спинно-мозговых и черепно-спинно-мозговых травм, рассеянного склероза, невропатических болей и периферических невропатий, заболеваний двигательных нейронов, бокового амиотрофического склероза, нейро-СПИДа, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и хореи Гентингтона.