DE102005017799A1

DE102005017799A1 - Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Modulation des Neuritenwachstum-kontrollierenden Nogo-Rezeptors

Info

Publication number: DE102005017799A1
Application number: DE102005017799A
Authority: DE
Inventors: Mario Mezler; Alfred Hahn; Nicole Teusch; Reinhold Müller; Bernhard K. MÜLLER; Achim Möller
Original assignee: Abbott GmbH and Co KG
Current assignee: Abbott GmbH and Co KG
Priority date: 2005-04-18
Filing date: 2005-04-18
Publication date: 2006-10-19

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Modulation des Nogo-Rezeptors. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines Wirkstoffs, ausgewählt unter Heparinen und Heparinderivaten, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen, die mit einer Störung der Neuriten-Plastizität oder einer Störung des Neuriten-Wachstums einhergehen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Modulation des Nogo-Rezeptors. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Herstellung von Arzneimitteln zur Beeinflussung aberranter Neuriten-Plastizität oder zur Stimulierung der Neuriten-Regeneration sowie weiterhin Verfahren zur Behandlung von Krankheiten oder krankhaften Zuständen, die charakterisiert sind durch aberrante Neuriten-Plastizität oder durch eine Störung der Neuriten-Regeneration.
Hintergrund der Erfindung
Nervenzellen (Neuronen) sind informationsverarbeitende Zellen, die als Rezeptorzellen beispielsweise Reize aus dem Körper oder der Umgebung (Hitze, Kälte, Druck, chemische Reize, usw.) erfassen und in bioelektrische Signale umwandeln, die über nachgeschaltete, weiterleitende Neuronen an das Gehirn geschickt werden. Dort erfolgt eine Wahrnehmung als entsprechende Sinnesempfindung.
Kommt es zu Störungen dieses Prozesses, so können beispielsweise Sinnesempfindungen wahrgenommen werden, für die in der Umwelt keine entsprechende physikalische oder chemische Ursache existiert. Im umgekehrten Fall können Störungen auch dazu führen, dass tatsächlich vorhandene Reize aus dem Körper oder in der Umwelt nicht mehr wahrgenommen werden und dass der menschliche Körper auf äussere Reize nicht mehr oder nur vermindert reagieren kann.
Klinisch wichtige Beispiele für die erstgenannten Störungen sind Phantomschmerzen, bei denen die Betroffenen nach Amputation von Gliedmaßen noch Schmerzempfindungen aus dem gar nicht mehr vorhandenen Körperteil wahrnehmen. Als weitere klinisch wichtige Beispiele sind Neuralgien zu nennen, bei denen Sensibilitätsstörungen von Neuronen zu unbegründeten Schmerzempfindungen führen. Auch physiologische Ursachen können Schmerzempfindungen auslösen. Beispielsweise kann bei diabetischer Polyneuropathie der gestörte Zucker- und damit auch der Wasserhaushalt des Patienten zu einer Funktionsveränderung von Neuronen führen, die sich in motorischen Funktionsverlusten, aber auch Schmerzempfindung äußern kann.
Klinisch wichtige Beispiele für die letztgenannten Störungen sind Verletzungen von Neuronen des Zentralen Nervensystems (ZNS), die zu einer Degeneration dieser Zellen und dem Verlust ihrer Funktion führen. Verletzungen des Hirns oder Rückenmarks führen daher – je nach Ausmaß der Schädigung von Neuronen oder deren Neuriten (Axonen) – zu einem teilweisen oder totalen Funktionsverlust der durch diese Nervenzellen vermittelten Sensorik und Motorik. Man spricht dabei vom Krankheitsbild der Querschnittslähmung. In Deutschland sind jährlich etwa 1000 unfallbedingte Querschnittslähmungen (Angaben der Fördergemeinschaft der Querschnittgelähmten) und in den Vereinigten Staaten etwa 10.000 Betroffene zu erwarten (Berkowitz et al. Spinal Cord Injury: An analysis of medical and social costs (Demos Medical New York, 1998)). Angesichts des die Lebensqualität des Betroffenen drastisch einschränkenden Krankheitsbildes besteht ein hoher Bedarf an therapeutischen Mitteln oder therapeutischen Verfahren zur Therapie, d.h. Beseitigung oder zumindest Linderung, des Krankheitszustandes.
Während Nervenzellen des peripheren Nervensystems im Prinzip zur Regeneration nach Verletzung befähigt sind, wurde lange Zeit angenommen, dass dies für Nervenzellen des ZNS nicht zutrifft. Es wurde bereits früh erkannt, dass die Unfähigkeit von Axonen zur Regeneration durch inhibitorische Faktoren im ZNS bedingt waren (Ramon y Cajal, Degeneration and regeneration of the nervous system, Hafner, New York, 1928). In neueren Untersuchungen wurden molekulare Determinanten für diese inhibitorische Wirkung entdeckt. In der Myelinscheide wurden als inhibitorische Molekeküle das Myelin-assoziierte Glycoprotein (MAG), das Oligodendrozyten-Myelin-Glycoprotein (OMgp), NogoA (auch als Reticulon-4 bezeichnet) und das IN-1-Antigen, das höchstwahrscheinlich mit Nogo-A identisch ist, beschrieben (als Übersichtsartikel siehe Lee et al., Nature Reviews (2003) 2, 1–7). Neuere Forschungen befassen sich insbesondere neben Nogo-A auch mit den anderen beiden Liganden des Nogo-Rezeptors, MAG und OMgp).
Nogo-A ist ein Transmembranprotein, das vorwiegend in Oligodendrozyten des adulten ZNS von Säugetieren exprimiert wird (als Übersichtsartikel siehe Schwab, Current Opinion in Neurobiology (2004) 14:118–124). Nogo-A tritt in Wechselwirkung mit dem Nogo-Rezeptor (NgR), einem über Glycosylphosphatidyinositol an die Membran von Neuronen gebundenen Protein, der auch den Rezeptor für die beiden anderen bekannten, von Myelin abgeleiteten Inhibitoren des Neuxitenwachstums, MAG und OMgp, darstellt (Liu et al. Science (2002) 297, 1190–1193; Domeniconi et al. Neuron (2002) 35, 283–290; Wang et al. Nature (2002) 417, 941–944). Ein Peptid von Nogo-A aus 66 Aminosäuren, Nogo-66, scheint für die Interaktion mit NgR verantwortlich zu sein und ist ausreichend, um die inhibitorische Wirkung von Nogo-A auf das Wachstum von NgR-aufweisenden Neuriten zu reproduzieren (Fournier et al. Nature (2001) 409, 341–346). Eine Verkürzung von Nogo-66 auf dessen erste 40 Aminosäuren dagegen führt zu einem Verlust der inhibitorischen Wirkung, so dass der durch Nogo-A vermittelte, inhibierende Effekt von Myelin auf das Wachstum von Neuriten aufgehoben werden kann (GrandPré et al. Nature (2002) 417, 547–551). Die Signaltransduktion von NgR in das Zellinnere der Nervenzelle ist noch nicht vollständig verstanden. NgR ist selbst nur über einen Lipidanker an die Membran der Nervenzelle gebunden, kann also selbst kein Signal ins Zytoplasma übertragen. Als mögliche Co-Rezeptoren, die nach Wechselwirkung mit NgR für eine Signalübertragung ins Zellinnere verantwortlich sein könnten, wurden der Neuxotrophin-Rezeptor p75 (Wang et al. Nature (2002) 420, 74–78), LINGO-1 (Mi et al. Nature Neurosci. (2004), 7, 221–228) sowie der p75 verwandte Rezeptor TROY/TAJ (Park et al. Neuron (2005), 45, 345–351; Shao et al. Neuron (2005), 45, 353–359) beschrieben.

Bisher wurde in mehreren Ansätzen versucht, die Erkenntnisse über die Wechselwirkung von Nogo-A mit NgR für die Regeneration von Neuriten umzusetzen. Neben der bereits erwähnten Reproduzierung des Nogo-A-Effekts (inhibitorische Wirkung auf das Neuritenwachstum) durch Nogo-66 (Fournier et al. Nature (2001) 409, 341–346) konnte durch Gabe des 40 Aminosäure langen Fragmentes von Nogo-66, NEP 1–40, bei Ratten auch eine gegenteilige Wirkung, also eine Regeneration nach Rückenmarksverletzung erzielt werden (Lee und Strittmatter J. Neurose Sci. (2003) 23, 4219–4227).

In analoger Weise wurden funktionelle Verbesserungen nach Behandlung von Ratten mit Rückenmarksverletzungen durch Antikörper gegen Nogo-A berichtet (Bregemann et al., Nature (1995) 378, 498–501; Merkler et al., J. Neurosci. (2001) 21, 3665–3673; Fiedler et al., Protein Eng. (2002) 15, 931–941; Brosamle et al., J. Neurosci. (2000) 20, 8061–8068). Weiterhin existieren Berichte über eine lösliche Version von NgR, der mit membrangebundenem NgR um Nogo konkurriert und auf diese Weise die durch Nogo vermittelte Inhibition des Neuritenwachstums blockiert. Bei Kenntnis der molekularbiologischen und biochemischen Wechselwirkungen sollte es somit möglich sein, sowohl die Neuritendegeneration als auch die Neuritenregeneration gezielt zu beeinflussen.

Bisher stellen jedoch alle Versuche, in das vorstehend beschriebene System der Wechselwirkung zwischen Nogo und NgR einzugreifen, auf Peptid- beziehungsweise Proteinansätze ab, sei es durch Verwendung von Nogo-abgeleiteten Peptiden, die an NgR binden, durch Antikörper gegen Nogo-A, die eine Wechselwirkung zwischen Nogo-A und NgR verhindern, oder durch lösliche Formen von NgR, die wiederum mit Membran-gebundenem NgR konkurrieren. Obwohl die Möglichkeit kleiner, nichtpeptidischer Moleküle zur Blockierung von NgR gegenüber den drei bekannten Liganden Nogo, MAG und OMgp diskutiert wurde, liegen noch keine Berichte über solche Moleküle vor (Lee et al., Nature Reviews (2003) 2, 1–7).

Die Wechselwirkung von Heparinen und sulfatierten Heparinderivaten mit einer Vielzahl von Proteinen und deren Bedeutung für die Gehirnentwicklung wurde vor kurzem gezeigt (Inatani et al. Science (2003), 302, 1044–1046; Bülow und Hobert, Neuron (2004), 41, 723–746). Die Wechselwirkung von Heparinen, Heparansulfat und verwandten Verbindungen mit Zelladhäsionsmolekülen, Wachstumsfaktoren, Chemokinen und Proteanen ist bekannt (Capita und Linhardt, Angewandte Chemie (2002) 114, 426–450) und ihre Wirkungen auf wachsende Nervenfasern während der Embryonalentwicklung des Nervensystems ist gut dokumentiert. Ein Einfluss auf die Regeneration des menschlichen Nervensystems nach Verletzung oder auf das aberrante Neuritenwachstum als Reaktion auf Verletzung oder Schädigung ist jedoch nicht bekannt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zu Grunde, neue Wirkstoffklassen zu finden und insbesondere nicht-peptidische Wirkstoffe bereitzustellen, durch welche die Wirkung des NgR, in Wechselwirkung mit seinem NogoA-Liganden oder den anderen beiden beschriebenen Liganden MAG und OMgp, moduliert werden kann.

Kurzfassung der Erfindung

Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Heparinen und Heparinderivaten, für die überraschenderweise ein Einfluss auf die Wechselwirkung zwischen Nogo-A und NgR gefunden wurde. Erfindungsgemäß wurde nämlich überra schenderweise festgestellt dass Heparine und Heparinderivate zur Wechselwirkung mit NgR befähigt sind.

Gegenstand der Erfindung ist daher Verwendung eines Wirkstoffs, ausgewählt unter Heparinen und Heparinderivaten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen, die mit Störungen des Neuritenwachstums, der Neuriten-Regeneration sowie der Neuriten-Plastizität einhergehen, wobei der Wirkstoff insbesondere die Interaktion zwischen dem Nogo-Rezeptor und dessen Liganden AP-Nogo66 moduliert.

Insbesondere beobachtete man erfindungsgemäß eine Blockierung dieser Wechselwirkung, wobei eine Blockierung mit einem IC₅₀-Wert von höchstens 100 μM, wie z.B. 0,01 bis 80 oder 0,1 bis 70, oder 1 bis 50 oder 5 bis 30 μM, erfolgt.

Bevorzugte Wirkstoffe modulieren, insbesondere induzieren, in einem Aktin-Cytoskelett-Umformungs (ACR) -Test eine Zellkontraktion mit einem IC₅₀-Wert von höchstens 100 μM, wie z.B. höchstens etwa 60 μM oder höchstens etwa 40 μM oder höchstens etwa 20 μM, wie z.B. mit einem IC₅₀-Wert im Bereich von etwa 0,01 bis 80 oder 0,1 bis 70, oder 1 bis 50 oder 5 bis 30 μM.

Bevorzugte Wirkstoffe modulieren, insbesondere stimulieren, das Auswachsen von Neuriten in neuronaler Zellkultur mit einem IC₅₀-Wert von höchstens etwa 1000 μM wie z.B. 0,01 bis 800 oder 0,1 bis 700, oder 1 bis 500 oder 5 bis 300 μM oder 5 bis 200, 5 bis 100 oder 5 bis 50 μM.

Vorzugsweise werden erfindungsgemäß Wirkstoffe mit einer Molekülmasse von mindestens etwa 500 Da, wie z.B. etwa 1000 bis 10000 Da, oder 1500 bis 6000 Da oder 4000 bis 5000 Da, oder Gemische davon eingesetzt, wobei die mittlere Molekülmasse dann in einem der angegebenen Bereiche liegen kann.

Als nichtlimitierende Beispiele für brauchbare Wirkstoffe oder Wirkstoffgemische sind zu nennen: Clivarin, Arixtra sowie Heparinoide, die Di-, Tetra- und Hexasaccharidfragmenten umfassen.

Ein erfindungsgemäß bereitgestelltes Medikament kann dabei ein oder mehrere Heparine oder Heparinderivate, gegebenenfalls in Form physiologisch verträglicher Salze oder Solvate, und gegebenenfalls einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger oder Exzipienten enthalten.

Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung der oben bezeichneten Wirkstoffe zur Behandlung von Krankheitszuständen, wobei diese Zustände mit einer Störung der Neuriten-Plastizität einhergehen, und insbesondere ausgewählt sind unter neuropathischem Schmerz, Gürtelrose, Gesichtsrose, Trigeminusneuralgie, Postlaminektomiesyndrom, Phantomschmerz, anhaltendem brennendem Schmerz nach Operation und diabetischer Polyneuropathie.

Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung der oben bezeichneten Wirkstoffe zur Behandlung von Krankheitszuständen, wobei die Krankheiten oder pathologischen Zustände mit einer Störung der Neuriten-Regeneration einhergehen, und insbesondere ausgewählt sind unter Rückenmarksverletzung, Hirnverletzung, Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, mechanisch bedingter Verletzung des Zentralnervensystems, ischämisch bedingter Verletzung des Zentralnervensystems, infektionsbedingter Verletzung des Zentralnervensystems, Morbus Parkinson, Poliomyelitis, Hirschsprung's Krankheit, Paraplegie, Diplegie, Tetraplegie, infantiler neuroaxonaler Dystrophie (Seitelberg-Krankheit), lokalisierter neuroaxonaler Dystrophie (Hallervorden-Spatz-Krankheit), Waller-Degeneration, viraler Meningitis, bakterieller Meningitis und Axon-Ischämie. und neurodegenerativen Erkrankungen, wie insbesondere Multiple Sklerose, post-Polio Syndrom, Spina bifida, spinale Muskelatrophie, Tumoren (Hirntumor, Rückenmarkstumor), transverser Myelitis.

Kurze Beschreibung der Figuren

1 zeigt den schematischen Aufbau des Plasmids pAP-tag5/PPC/hNOGO66Nr.5 (1a) und des Plasmids psec hNogoR 27–450 EGFP 6 × HIS Apa (1b).

2 zeigt den schematischen Aufbau der Plasmide pIRES/hNOGO R/hp75 (2a), pcDNA3 hRhoA wt (2b), PcDNA4 (mycHis)A h RhoA wt (2c) und pcDNA3.1(V5-His) hp75 Nr. 16 (2d).

3a zeigt den immunologischen Nachweis von exprimiertem RhoA durch erfindungsgemäß isolierte positive Klone (#1 bis #8) der Tripletransfektante HEK293 RhoA/NgR/p75, wobei Zellhomogenisate der mit Nummern (#) bezeichneten Klone (Klone 1 bis 9) über SDS-PAGE getrennt und über Immunoblotting mit monoklonalem Maus-anti-RhoA Antikörper getestet wurden. Positive Kontrolle (C) erhalten durch transiente Transfektion mit 100 ng pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt; als Marker (M) wurde verwendet: Benchmark Prestain Protein Ladder, Invitrogen, Bestellnummer #10748–010.

3b zeigt das Ergebnis einer FACS-Analyse von exprimierten Zelloberflächenrezeptoren hNgR und hp75 einer erfindungsgemäß hergestellten HEK293-Tripletransfektante (Klon #4 und #8) sowie von nichttransformierten HEK293-Zellen (oben), jeweils für Analysen mit Anti-p75- bzw. Anti-NgR- Antikörpern.

4 zeigt die Bindung von AP-Nogo66 an Mikrotiterplatten, die entweder mit niedrigglykosyliertem oder hochglykosyliertem His-NogoRezeptor (His-NogoRlow oder His-NogoRhigh) beschichtet sind. Die Bindung ist in relativen Fluoreszenteinheiten (RFU) nach Messung mit einem fluorogenen Substrat ausgedrückt

5 zeigt die Kompetition der Bindung von AP-Nogo66 an NogoR-beschichtete Platten durch Clivarin (geschlossene Rauten) oder Arixtra (offene Rauten).

6 zeigt die Kompetition der Bindung von AP-Nogo66 an NogoR-beschichtete Platten durch Clivarin (geschlossene Rauten).

7 zeigt die Wirkung von Clivarin auf die Zellkontraktion im ACR-Assay mit HEK/Rho/NgR/p75-Zellen

8 zeigt die Wirkung des Pentasaccharids Arixtra auf die Zellkontraktion im ACR-Assay mit HEK293Rho/NgR/p75-Zellen

9 zeigt die Wirkung von Clivarin auf das Auswachsen von Neuriten kortikaler Neurone der Maus in der Zellkultur (obere Reihe von links nach rechts: kein Clivarin, 19 μM und 30 μM Clivarin; untere Reihe: 100 μM und 300 μM Clivarin).

10 zeigt in einer Detailansicht die Wirkung von Clivarin auf das Auswachsen von Neuriten kortikaler Neurone der Maus in Zellkultur (links: ohne Clivarin, rechts: 300 μM Clivarin).

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

a) Allgemeine Begriffe

Ein erfindungsgemäß brauchbarer „Wirkstoff" umfasst wenigstens ein Heparin, Heparinderivat oder Heparinoid.

Eine „Störung der Neuriten-Plastizität" betrifft erfindungsgemäß einen pathologischen Zustand, bei dem man ein vermehrtes, unkontrolliertes, ungerichtetes und/oder exzessives Neuritenwachstum bzw. Auswachsen oder Aussprossen von Neuriten bei einem Säuger beobachtet. Dieser Zustand ist definiert durch falsch wachsende Neuriten, die synaptische, häufig dauerhafte, Fehlverschaltungen eingehen, welche wiederum physische und psychische Konsequenzen haben. Solche Fehlverschaltungen können z.B. Ursache sein für das Auftreten von aberranten Funktionen, wie z.B. von neuropathischem Schmerz (Tang et al. J. Neurosci. (2004), 24, 819–827), epileptischen Anfällen als Folge von Hirnverletzungen (Chuckowree et al. Neuroscientist (2004), 10, 280–285) und von Phantomsensationen.

Eine „Störung des Neuriten-Wachstums" betrifft erfindungsgemäß einen als Reaktion auf eine Verletzung oder Schädigung im Nervensystem eines Säugers auftretenden pathologischen Zustand, bei dem man ein ungenügendes Neuritenwachstum oder ein nicht ausreichendes neuronales Aussprossen beobachtet oder der definiert ist durch ein teilweises oder vollständiges Versagen der Reparatur d.h. der Neuriten-Regeneration durchtrennter, geschädigter neuronaler Verbindungen mit der Konsequenz eines teilweisen oder vollständigen, häufig irreversiblen Funktionsausfalls, wie z.B. das Auftreten einer Querschnittslähmung als Folge einer Rückenmarksverletzung.

Eine „Behandlung" oder „Therapie" kann erfindungsgemäß akut, prophylaktisch und chronisch erfolgen. Ein Krankheitszustand kann aufgrund einer erfindungsgemäß vorgeschlagenen Therapie vollständig beseitigt oder gelindert werden.

b) Erfindungsgemäße Wirkstoffe

Der Begriff „Heparin" beschreibt eine Gruppe sulfatierter/sulfonierter Mucopolysaccharide, die auch als Glycosaminoglycane bezeichnet werden. Heparinmoleküle bestehen aus üblicherweise unverzweigten Ketten von sulfatierten Saccharidbausteinen, die vor allem Glucosamin, Glucuronsäure und Iduronsäure enthalten und ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 500 bis 50000, wie z.B. etwa 1000 bis 10000 Da, oder 1500 bis 6000 Da oder 4000 bis 5000 Da, aufweisen. Strukturell sind Heparine gekennzeichnet durch Disaccharid-Einheiten aus α-1,4-glycosidisch verknüpften D-Glucosamin- und L-Iduronsäure-Einheiten sowie durch Disaccharid-Einheiten aus α-1,4-glycosidisch verknüpften D-Glucosamin- und D-Glucuronsäure-Einheiten. Sowohl die Stellung als auch die Anzahl der Sulfatgruppen (Sulfongruppen) ist variabel. Diese können sowohl über Sauerstoff (O-sulfatiert) als auch über Stickstoff (N-sulfatiert) gebunden sein. Häufig sind Iduronsäurereste 2-O-sulfatiert, Glucosaminreste N-sulfatiert und gegebenenfalls auch 6-O-sulfatiert. Glucuronsäurereste hingegen sind häufig nicht sulfatiert. Die Disaccharid-Einheiten sind wiederum α-1,4-glycosidisch miteinander zu Heparinmolekülen verbunden. Die Anzahl und Anordnung dieser Disaccharid-Einheiten kann ebenfalls variieren, so dass der Begriff Heparin eine Vielzahl strukturell unterschiedlicher Moleküle beschreibt, die beispielsweise elementaranalytsisch oder anhand ihrer Kettenlänge, ihres Molekulargewichts oder ihrer Ladung unterschieden werden können.

Dem Fachmann sind Heparine gut bekannt, Beschreibungen finden sich beispielsweise in Capita und Linhardt (Angew. Chemie 2002, 114, 426–450) und in Bruchhausen, Dannhardt, Ebel, Frahm, Hackenthal, Holzgrabe (Hrsg), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 8, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 5. Aufl., 1993.

Unter „Heparinderivaten" werden erfindungsgemäß durch chemische oder enzymatische Modifizierung von Heparinen erhaltene Substanzen verstanden. Der Begriff umfasst insbesondere auch Substanzen mit niedrigeren mittleren Molekulargewichten im Vergleich zu natürlich vorkommenden Heparinen. Solche Heparinderivate mit niedrigem Molekulargewicht können beispielsweise durch chemische oder enzymatische Spaltung von Heparinen oder durch chemische Synthese erhalten werden. Zusätzlich können Heparinderivate am ihren funktionalen Sulfat- und/oder Sulfonat-Seitengruppen derivatisiert sein, und/oder eine oder mehrere C-C-Doppelbindungen in ihren Kohlehydratbausteinen aufweisen. Derivate umfassen außerdem Salze, insbesondere physiologisch verträgliche Salze, von Heparinen, wie insbesondere Alkali- und Erdalkalimetallsalze, wie Natrium-, Calcium-, Magnesium- oder Bariumsalze.

Der Begriff „Heparinoide" beschreibt eine Gruppe von Substanzen mit heparinartiger Wirkung, d.h. Heparinoide hemmen die Blutgerinnung und die Entstehung von Thrombosen. Hierzu gehören beispielsweise pflanzliche Oligo- und Polysaccharide, z.B. aus Alginsäure, Pektinen, Xylanen, Stärken und Dextranen hergestellte Polysulfate oder sulfatierte tierische Glykosaminglykane. Insbesondere zu nennen sind Pentosanpolysulfate, z.B. Natriumpentosansulfonat, Xylansulfate, z.B. β-1-4-D-Xylan-2,3-bis(hydrogensulfant), Xylanpoly(hydrogensulfat) sowie Natriumsalze davon, Dextransulfate, Chitinsulfate, Chondroitinpolysulfate, auch Mucopolysaccharidpolyschwefelsäureester genannt, Polyvinylsulfonsäuren, auch Polyethylensulfonsäuren genannt, z.B. Natriumapolat, Plygalacturonsäuresulfat(methylestermethyglucosid), Alginatsulfate, z.B. Natriulginatsulfat und Polymannuronsäuresulfat. Heparinoide können entweder aus natürlichen Quellen gewonnen werden, oder sie werden semi- oder vollsynthetisch hergestellt, üblicherweise indem man die zuvor genannten pflanzlichen oder tierischen Polysaccharide sulfatiert, beispielsweise mit Chlorsulfonsäure umsetzt und freiwerdende Chlorwasserstoffsäure mit Basen neutralisiert.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind niedermolekulare Heparine bevorzugt, wobei darunter solche mit einer durchschnittlichen Molmasse von weniger als 10.000 verstanden werden sollen. Niedermolekulare Heparine umfassen insbesondere die unter der Bezeichnungen „Heparinfragment 4–6", „Heparinfragment 4,5–8" und „Heparinfraktion" mit durchschnittlichen Molmassen von 4000 bis 6000, 4500 bis 8000 bzw. 4000 bis 5000 bekannten Heparinfragmente. Niedermolekulare Heparine können beispielsweise durch Fraktionierung natürlich vorkommender Heparine oder durch chemische oder enzymatische Spaltung von Heparin gewonnen werden.

Ganz besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die unter den Handelsnamen Clivarin^® (Heparinfragment mit einem mittleren Molekulargewicht ca. 3150 bis 5150, erhältlich durch Nitrilspaltung von Schweinedarmmukosa, Abbott GmbH & Co. KG) und Arixtra^® (Pentasaccharid mit einem Molekulargewicht von ca 1750, Sanofi-Synthelabo) bekannten niedermolekularen Heparinderivate.

Im Allgemeinen werden erfindungsgemäß, gegebenenfalls modifizierte, Heparine natürlichen Ursprungs verabreicht. Heparine aus der Lunge, Leber oder Darmschleimhaut von Rindern oder aus Schweinen sind brauchbar, wobei Heparine aus Schweinedarmmucosa und aus Rinderlunge häufig verwendet werden.

Zusätzlich zu den konkret genannten, erfindungsgemäß brauchbaren Heparin-Wirkstoffen kann der Fachmann unter Befolgung der erfindungsgemäßen Lehre ohne unzumutbaren Aufwand weitere geeignete Wirkstoffe ermitteln. Er kann sich dabei der verschiedenen hierin beschriebenen Testmethoden bedienen, die eine Charakterisierung potentieller Wirkstoffkandidaten ermöglichen. Insbesondere sei auf die im Experimentellen Teil näher erläuterten Testsystem, wie NgR-Plattentest, ACR-Assay und Neuronaler Zellkulturtest verwiesen.

Beispiele für IC₅₀-Werte von Clivarin und Arixtra in verschiedenen Assays sind in folgender Tabelle zusammengefasst:

c) Erfindungsgemäß beobachtete Wechselwirkungen von Wirkstoffen

Anhand der niedrigmolekularen Heparinderivate Clivarin (Molekulargewicht ca. 4500) und Arixtra (Pentasaccharid mit einem Molekulargewicht von ca 1750) wurde erfindungsgemäß gezeigt, dass diese an NgR binden können. Dabei wurde bestätigt, dass diese Bindung mit der Bindung von Nogo66 an NgR konkurriert, obwohl Heparine und Heparinderivate im Vergleich zu Nogo als dem natürlichen Liganden von NgR völlig unterschiedliche Molekülarten darstellen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Clivarin und Arixtra den gleichen Effekt auslösen wie Nogo66, d.h. eine Hemmung des Neuritenwachstums.

Heparine und Heparinderivate sind erfindungsgemäß folglich für die Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen brauchbar, die mit einer Störung der Neu riten-Degeneration einhergehen, bzw. zur Herstellung von Medikamenten für eine solche Behandlung.

d) Erfindungsgemäße therapeutische Ansätze

Krankheiten oder pathologische Zustände, die erfindungsgemäß mit Medikamenten auf der Basis von Heparinen oder Heparinderivaten behandelt werden können, umfassen solche, die mit einer Störung des Neuritenwachstums einhergehen, zu massivem Neuritenwachstum führen und die durch oder durch Induktion einer Neuriten-Wachstumshemmung aufgehoben oder gelindert werden können (Tang et al. J. Neurosci. (2004), 24, 819–827). Beispiele hierfür sind neuropathische Schmerzen, die oft durch Schädigung von Nervenzellen und das dadurch ausgelöste massive und unkontrollierte Neuritenwachstum selbst auftreten, etwa durch Verletzungen, z.B. bei Amputationen, durch Alkoholmissbrauch, giftige Substanzen, oder Virusinfektion eines Nerven. Als weitere Beispiele können Gürtelrose, Gesichtsrose, Trigeminusneuralgie, Postlaminektomiesyndrom, Phantomschmerz, anhaltender brennender Schmerz nach Operation und durch Diabetes bedingter neuropatischer Schmerz bzw. diabetische Polyneuropathie genannt werden. Eine Linderung oder Beseitigung der Schmerzen ist durch Induktion des Einziehens oder des Zurückziehens von aberranten Neuriten der betroffenen Nervenzellen oder der Neuriten zwischengeschalteter Nervenzellen auf dem Weg der Reizweiterleitung in das Gehirn möglich. In diesem Fall würden die Heparine oder Heparinderivate eine agonistische Wirkung auf NgR ausüben.

Krankheiten oder pathologische Zustände, die mit einer Störung der Neuriten-Regeneration einhergehen oder durch Stimulierung oder Steigerung einer Neuriten-Regeneration mit Medikamenten auf der Basis von Heparinen oder Heparinderivaten aufgehoben oder gelindert werden können, umfassen solche, die ausgewählt sind unter Rückenmarksverletzung, Hirnverletzung, Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, mechanisch bedingter Verletzung des Zentralnervensystems, ischämisch bedingter Verletzung des Zentralnervensystems, infektionsbedingter Verletzung des Zentralnervensystems, Morbus Parkinson, Chorea Huntington, amyotropher Lateralsklerose und anderen Motoneuronenerkrankungen, Morbus Alzheimer, Poliomyelitis, Hirschsprung's Krankheit, Paraplegie, Diplegie, Tetraplegie, infantiler neuroaxonaler Dystrophie (Seitelberg-Krankheit), lokalisierter neuroaxonaler Dystrophie (Hallervorden-Spatz-Krankheit), Waller-Degeneration, viraler Meningitis, bakterieller Meningitis und Axon-Ischämie. und neurodegenerativen Erkrankungen, wie insbesondere Multiple Sklerose, post-Polio Syndrom, Spina bifida, spinale Muskelatrophie, Tumoren, wie Hirntumor und Rückenmarkstumor, und transverser Myelitis.

e) Erfindungsgemäße Formulierungen/Medikamente

Die Erfindung umfasst die Herstellung pharmazeutischer Mittel (Arzneimittel) zur Behandlung eines Individuums, vorzugsweise eines Säugers, insbesondere eines Menschen, Nutz- oder Haustieres. So werden die oben beschriebenen Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen gewöhnlich in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Wirkstoff und gegebenenfalls weitere Wirkstoffe umfassen. Diese Zusammensetzungen können beispielsweise auf oralem, lokalem, rektalem, transdermalem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, intrakutanem oder intranasalem Weg, insbesondere intravenös, subkutan oder oral verabreicht werden.

Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, magensaftresistente überzogene Tabletten, Mantel-, Punkt- und Schichttabletten, Pastillen, Kautabletten, Lutschtabletten, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln wie Hart- und Weichgelatinekapseln, Globuli, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arzneiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbesondere Öl-in-Wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotionen, Injektions- und Infusionszubereitungen, Augen- und Ohrentropfen, Nasentropfen, Nasenspray und Tinkturen. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verabreichung erfindungsgemäßer Inhibitoren verwendet werden. Ferner können auch Liposomen, Mikrosphären oder Polymermatrizes zur Anwendung kommen.

Besonders bevorzugt sind parenterale Dosierungsformen und solche zur Verabreichung in situ an den Ort, an dem die Wirkung der erfindungsgemäßen Heparine und/oder Heparinderivate entfaltet werden soll. Solche Dosierungsformen umfassen insbesondere Heparine und/oder Heparinderivate enthaltende Infusions- oder Injektionslösungen, weiterhin Mikroträger, auf denen Heparine und/oder Heparinderivate freisetzbar oder kovalent immobilisiert sind, sowie implantierbare Depotvorrichtungen zur Freisetzung der Heparine und/oder Heparinderivate.

Bei der Herstellung der Zusammensetzungen werden erfindungsgemäße Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen gewöhnlich mit einem Exzipienten vermischt oder verdünnt. Exzipienten können feste, halbfeste oder flüssige Materialien sein, die als Vehikel, Träger, Adsorbens oder Medium für den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombinationen dienen.

Zu geeigneten Exzipienten gehören beispielsweise Lactose, Dextrose, Succrose, Sorbitol, Mannitol, Stärken, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginate, Traganth, Gelantine, Calciumsilikat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Cellulosederivate, wie z.B. Methylcellulose, Wasser, Sirupe und Methylcellulose. Ferner können die Formulierungen pharmazeutisch akzeptable Träger oder übliche Hilfsstoffe, wie Gleitmittel, beispielsweise Talg, Magnesiumstearat und Mineralöl; Netzmittel; emulgierende und suspendierende Mittel; konservierende Mittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate; Antioxidantien; Antireizstoffe; Chelatbildner; Dragierhilfsmittel; Emulsionsstabilisatoren Filmbildner; Gelbildner; Geruchsmaskierungsmittel; Geschmackskorrigentien; Harze; Hydrokolloide; Lösemittel; Lösungsvermittler; Neutralisierungsmittel; Permeationsbeschleuniger; Pigmente; quaternäre Ammoniumverbindungen; Rückfettungs- und Überfettungsmittel; Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe; Silikon-Derivate; Spreithilfsmittel; Stabilisatoren; Sterilanzien; Suppositoriengrundlagen; Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge; Treibmittel; Trocknungsmittel; Trübungsmittel; Verdickungsmittel; Wachse; Weichmacher; Weißöle umfassen.

Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie beispielsweise in Fiedler, H.P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor-Verlag, 1996, dargestellt ist; vgl auch Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Springer Verlag, Heidelberg.

In einer Ausführungsform wird beispielsweise ein pharmazeutisches Mittel bereitgestellt, das eine feste Dosierungsform umfasst. Diese feste Dosierungsform hat beispielsweise einem Gesamt-Wirkstoffgehalt von etwa 1 bis 20 mg, wie z. B. 2 bis 10 mg, je Dosiseinheit und kann in Form einer Pille, einer Tablette, eines Extrudats oder eines Granulat vorliegen.

Die feste Dosierungsform wird z.B. hergestellt, indem man den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination mit dem pharmazeutisch verträglichen Träger mischt und die Mischung zum Wirkstoffkern verfestigt. Dabei löst oder dispergiert man den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination in einer inerten Flüssigkeit, mischt ihn/sie mit dem Träger und entfernt das Lösungsmittel während oder nach der Verfestigung. Den Wirkstoffkern kann man dann gegebenenfalls mit einem magensaftresistenten Überzug versehen, bevor man den Kern in üblicher Weise dragiert.

Art und Dauer der Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel obliegen der Entscheidung des behandelnden Arztes. Dieser kann in Abhängigkeit vom gewählten Verabreichungsweg, von der Wirksamkeit der konkreten Wirkstoffzusammensetzung, der Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung, vom Befinden des Patienten und von dessen Ansprechen auf die Therapie eine geeignete Dosis und einen entsprechenden Dosierungsplan festlegen. Beispielsweise kann eine geeignete Einzeldosis etwa 0,1 bis 50 mg, wie z.B. 2 bis 12 mg, Wirkstoff oder Wirkstoffkombination gemäß obiger Definition enthalten und 1 bis 3-mal täglich verabreicht werden, bis der gewünschte Behandlungserfolg zu beobachten ist.

Typischerweise wird die Menge einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bei in situ-Verabreichung an den Wirkungsort eine Verabreichungskonzentration an Heparinen und/oder Heparinderivaten sicherstellen, welche den gewünschten pharmakologischen Effekt bewirkt Falls für bestimmte Therapien erforderlich, kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung weitere aktive pharmakologische Bestandteile umfassen, deren gleichzeitige der zeitlich versetzte Verabreichung therapeutisch nützlich ist.

Die Erfindung wird nachfolgend durch nachfolgende nicht-limitierende Beispiele näher erläutert.

Experimenteller Teil

I. Herstellungsbeispiele

Herstellungsbeispiel 1: Herstellung von AP-Nogo66 (Nogo-66, enthaltend ein N-erminales alkalische Phosphatase-Tag):

a) Klonierung des Nogo66 Fragments von hNogoA

Es wurde ausgegangen von der publizierten hNogoA Sequenz (NCBI): AF148537. Die beiden folgenden synthetischen Oligonukleotide wurden von der publizierten Sequenz abgeleitet:

Mez 402: GCCACCATGAGGATATACAAGGGTGTGATCC (SEQ ID NO: 1); Oligo ab Aminosäure R1055 (kursiv) mit Start ATG (unterstrichen) und Kozak Sequenz (fett)
Mez 404: CTTCAGAGAATCAACTAAATCATC (SEQ ID NO: 2); Oligo bis Aminosäure K1120 (fett)

Mit diesen beiden Oligos wurde in frontal cortex cDNA als Template (hergestellt mit Superscript first strand synthesis system for RT-PCR; Invitrogen, Carlsbad, CA) (Novak et al., Brain Res. Mol. Brain, 2002, 107(2): 183–189) eine PCR durchgeführt. Die Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) mit Herculase (Stratagene, La Jolla, USA), durchgeführt. Das erhaltene DNA Fragment mit einer Grösse von 207 by wurde mit dem QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das amplifizierte, gereinigte Fragment wurde in pcDNA3.1V5-His TOPO (SEQ ID NO: 6) (pcDNA3.1N5-His TOPO TA Expression Kit, #K4800–01) gesetzt. Mit dem so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1V5-His hNOGO66 wurden E.coli TOP 10 Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1989)) beschrieben transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Antibiotikum Ampicillin erreicht.

Die Identifikation von neun Klonen mittels PCR zeigte bei drei Klonen eine Bande in der richtigen Größe von 207 bp. Die Richtigkeit der Sequenz wurde mittels Sequenzanalyse überprüft.

Die kodierende Nogo66-Sequenz wurde mit Xbal aus obigem Plasmid pcDNA3.1V5-His hNOGO66 herausgeschnitten und in das Plasmid pAP-tag5 (GenHunter Cooperation, Nashville, TN, USA) über Xbal einkloniert. Man erhält das Plasmid pAP-tag5/PPC/hNOGO66 Nr. 5. (SEQ ID NO: 3) dargestellt in 1a.

b) Herstellung der stabilen Zelllinie:

HEK293 Zellen wurden in Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum unter Zusatz von Penicillin/Streptomycin) bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert. Für die Transfektion wurden die Zellen in Platten mit 6 Wells (1 × 10⁸ pro Well) ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden mit einem Cocktail, der 1 μg Plasmid DNA (pAP-tag5/PPC/hNOGO66 Nr. 5) und 3 μl Fugene6 (ROCHE Diagnostics, Mannheim) enthielt, nach Angaben der Herstellers transfiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin abgelöst, in eine Zellkulturflasche mit 175 cm² Grundfläche überführt und die Selektion durch Zugabe von 150 μg/ml Zeocin in Wachstumsmedium gestartet. Heranwachsende Zeocin-resistente Zellkolonien wurden nach etwa 4 Wochen mit Trypsin abgelöst und mit einem Zellsorter in 96-well Platten vereinzelt. Nach etwa drei Wochen wurde ein Aliqout des Mediumüberstands der herangewachsenen Einzellzellkolonien, deren Konfluenz zu diesem Zeitpunkt zwischen 5 und 85% abgeschätzt wurde, auf Nitrozellulose pipettiert. Durch Zugabe einer Lösung von NBT (Nitroblau-Tetrazoliumsalz) und BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat) wurde die Proteinexpression über die Aktivität der Alkalischen Phosphatase anhand der entstehenden Färbung nachgeweisen.

c) Expression von AP-Nogo66:

Ein HEK293 Klon (Klon Nr. 5), welcher AP-Nogo66 produziert, wurde in Kulturmedium (RPMI Glutamax +10% FCS, 150 μg/ml Zeocin, Antibiotic/Antimycotic) durch mehrmalige Passage (ca. 20) in Kulturflaschen vermehrt. Die AP-Nogo66 Expression wurde nach jeder zweiten oder dritten Passage im Dot Blot Test (mit NBT/BCIP Reagens) überprüft.

Um AP-Nogo66 in Serum-freiem Medium zu produzieren wurden die Zellen zunächst bis fast zur Konfluenz in Triple-Flasks kultiviert, dann erfolgte ein Mediumwechsel zu Expressionsmedium (Pro293a – CDM Medium (Biowhittaker; #12-764Q), 2 mM Glutamin, Antibiotic/Antimycotic). Daraufhin wurden die Zellen 3–4 Tage bei 37°C kultiviert, die Überstände wurden abgenommen und abzentrifugiert (1500 Upm, 5 min). Die Überstände wurden bei –80°C gesammelt. Zur weiteren Verarbeitung wurden sie aufgetaut, mit Proteinaseinhibitoren (PMSF 0,1 mM, Pefabloc SC 1 mM) versetzt und in Amicon Tubes (Millipore) aufkonzentriert und die AP-Nogo66 Konzentration wurde bestimmt (ca. 3 μg/ml) (Mw von monomerer AP: 67 kDa und monomerem AP-Nogo66 etwa. 75 kDa in SDS Gelen).

Der AP-Nogo66-Pool wurde mit anti-AP-Agarose immunopräzipitiert. Das Präzipitat wurde durch 10-minütiges Erhitzen bei 95°C in Gegenwart von 5% Mercaptoethanol denaturiert und so von den Agarose Beads entfernt, schließlich durch Westen-Analyse mittels Antikörpern mit Spezifität für AP und Nogo66 (anti-Nogo66 Antikörper NogoA12A, Alpha Diagnostics International, San Antonio, Texas, USA) verifiziert (Daten nicht gezeigt).

Durch Gelchromatographie (Superose 12, Amersham Biosciences. Laufmittel: 20 mM Natriumphosphat, 140 mM Natriumchlorid, pH 7.4) wurde bestimmt, dass AP-Nogo66 als Dimer läuft und ein Mw von etwa 140 kDa aufweist.

In Vorversuchen wurde festgestellt, dass AP-Nogo66, nicht aber GST-Nogo66 funktionell aktiv war (Versuche nicht gezeigt). Es wird daher vermutet, dass NgR-Liganden womöglich als Dimer vorliegen müssen, um funtionell zu sein. Wie die Kristallstruktur der Alkalischen Phosphatase zeigt, wird die Dimerisierung vom AP-Tag induziert Herstellungsbeispiel 2: Herstellung von Konstrukten zur Generierung von rekombinanten HEK Zelllinien

a) Klonierung von hp75; Herstellung von pcDNA3.1(V5-His)hp75 Nr. 16 (2d)

Es wurde von den publizierten Sequenzen für humanes p75 ausgegangen:

NM_002507; M14764 (die beide 100% identisch sind). Die folgenden Oligonukleotide wurden von der publizierten Sequenz abgeleitet:
Mey 36: GCCACCATGGGGGCAGGTGCCACC (SEQ ID NO: 5; Oligo mit Start-Codon (fett) mit Kozak Sequenz (kursiv)
Mey 35: TCACACTGGGGATGTGGCAG (SEQ ID NO: 4); Oligo mit Stop Codon (fett) ein Basenaustausch T statt C (unterstrichen) da das Oligo von der publizierten Ratten Sequenz abgeleitet ist
Mey 71: GCAGCCCCATCAGTCCGC (SEQ ID NO: 6); Oligo beginnend 64 Basenpaare vor Start ATG

Anschließend wurde eine PCR (analog zu Nogo 66 Klonierung, Herstellungsbeispiel 1) mit dem Primerpaar Mey 35/71 in cDNA aus der Zelllinie SH-SY5Y (humane Neuroblastomazellinie ATCC #CRL-2266) durchgeführt. Die PCR mit Mey 35/71 lieferte ein 1348 by Fragment. Dieses wurde gereinigt.

Eine anschließende PCR mit dem Primerpaar Mey 35/36 im Mey 35/71-Fragment ergab eine deutliche Bande (Fragmentgröße: 1284 bp). Diese wurde gereinigt. Dann wurde diese Bande in pcDNA3.1/V5-His TOPO Vector (SEQ ID NO: 7; pcDNA3.1(V5-His)TOPO TA Expression Kit Invitrogen #K4800-01) ungeschnitten eingesetzt (Prinzip Topoisomerase). Mit dem so erhaltenen Konstrukt (pcDNA3.1 hp75) wurden TOP 10 Zellen nach Standardmethoden (analog zu Nogo 66 Klonierung, Herstellungsbeispiel 1) transformiert.

13 Klone dieser Transformation wurden überprüft und vier Klone mit der richtigen Orientierung (Nr. 13, 15, 16 und 18) konnten identifiziert werden. Klon Nr 16 wurde weiter verwendet. Die Sequenz des enthaltenen Konstruktes (pcDNA3.1(V5-His)hp75 Nr. 16; vgl. auch 2d) ist in SEQ ID NO: 8 dargestellt. Weitere Informationen zu dieser Sequenz sind im folgenden Abschnitt zusammengefasst.

b) Herstellung von pIRES hp75

Plasmid pIRES (Clontech, Palo Alto, USA) wurde mit Xba I und Not I (Roche Diagnostics) unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (40 μl; 1,5 h bei 37°C) enthaltend 5 μg DNA, 2 μl Xba I, 2 μl Not I, 4 μl 10 × Puffer H (Roche) und 32 μl Wasser bidest. geschnitten: Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.

Plasmid pcDNA3.1 hp75, hergestellt wie oben beschrieben, wurde mit Spe I und und Not I (Roche Diagnostics) unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (40 μl; 1,5 h bei 37°C) enthaltend 5 μg DNA, 2 μl Spe I, 2 μl Not I, 4 μl 10 × Puffer H (Roche), 32 μl Wasser bidest geschnitten. Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.

Die auf diese Weise hergestellten Restriktionsfragmente wurden unter Verwendung des folgenden Ansatzes über Nacht bei 16°C ligiert: 5 μl hp75-Konstrukt, 2 μl geschnittener pIRES, 1,5 μl T4-DNA Ligase (Roche) 3 μl 10 × Puffer T4 (Roche), 20,5 μl Wasser bidest. Diese Ligation mit der Bezeichnung pIRES hp75 wurde dann in den Bakterienstamm SuperComp XL2 Blue (Stratagene) transformiert.

c) Herstellung von pIRES hNgR hp75 (2a)

pcDNA hNgR CDS1, kommerziell erworben von RZPD (Deutsches Resourcenzentrum für Genomforschung GmbH, Klon.Nr.: IRAL-p962L1427Q2), enthaltend die kodierende Sequenz für humanen Nogo-Rezeptor, wurde unter Verwendung eines Restriktionsansatzes 13 μl; 1 h bei 37°C) enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl Hind III (Roche), 1,5 μl 10 × Puffer B (Roche) und 10 μl Wasser bidest verdaut (blunt end). Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.

Zum Auffüllen der Enden wurden 20 μl des geschnittenes pcDNA h NgR CDS1-Konstrukt in einem Ansatz (100 μl; 30 min 11°C), enthaltend 2 μl T4-DNA Polymerase (Roche), 10 μl 10 × Puffer T4 (Roche), 1 μl 100 mM DTT (Gibco), 10 μl 20 mM NTP Mix (Stratagene) und 77 μl Wasser bidest. inkubiert. Das T4-fill-in wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel gewonnen.

Zur Dephosphorylierung, um eine Re-Ligierung der blunt ends zu vermeiden, wurden 50 μl des T4 fill-ins des h NgR CDS1-Konstruktes mit 2 μl Alkalische Phosphatase (Roche), 10 μl 10 × Puffer (Roche) und 38 μl Wasser bidest. zunächst 30 min bei 37°C und anschließend 15 min bei 65°C inkubiert. Das so erhaltenen Dephosphorylierungskonstrukt wurde schließlich mit Qiagen Hit clean-up aufgereinigt.

Das gereinigte pcDNA h NgR Hind III blunt Fragment wurde dann mit EcoRI unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (15 μl,1 h bei 37°C), enthaltend 10 μl Eluat (aus Qiagen Hit clean-up), 1,5 μl EcoR I (Roche), 1,5 μl 10 × Puffer H (Roche) und 2,0 μl Wasser bidest., verdaut und mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel nach Restriktion gewonnen.

pIRES hp75 (wie oben hergestellt) wurde mit EcoR I und Hind III unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (27 μl, 1,5 h bei 37°C), enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl EcoR I, 1,5 μl Hind III, 4 μl 10 × Puffer H (Roche) und 20 μl Wasser bidest. geöffnet. Das gewünschte hp75 Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel nach Restriktion gewonnen und mit dem oben hergestellten hNgR-Konstrukt unter Verwendung eines Ligationsansatzes, enthaltend 5 μl NgR-Konstrukt, 2 μl geschnittener pIRES hp75, 1,5 μl T4-DNA Ligase (Roche), 3 μl 10 × Puffer T4 (Roche) und 20,5 μl Wasser bidest. über Nacht 16°C ligiert. Das erhaltene Konstrukt pIRES hNgR hp75 (2a; SEQ ID NO: 10) wurde dann in den Bakterienstamm SuperComp XL2 Blue (Stratagene) transformiert.

Weitere Sequenzinformationen zu pIRES hNgR hp75 sind in folgendem Abschnitt zusammengefasst:

CMV prom.	108–857
NOGO R	1202–2620
IRES	2658–3238
hp75	3294–4574
SV40pA	4648–4869
f1ori	4964–5419
Neo	5483–6856
amp	7261–8121
pUC ori	8266–93 compl.

d) Herstellung von pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt (2c)

Das Plasmid pOTB7 RhoA (kommerziell erworben von RZPD, Deutsches Resourcenzentrum für Genomforschung GmbH, Klon.Nr.: IRAL-p962A174), das die kodierende Sequenz für humane RhoA GTPase enthält, wurde unter Verwendung des folgenden Restriktionsansatzes (25 μl, 1,5 h bei 37°C), enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl EcoR I, 1,5 μl Xho I (Roche), 3 μl 10 × Puffer H (Roche) und 19 μl Wasser bidest. verdaut.

In einem zweiten Ansatz wurde pcDNA4(mycHis) (Invitrogen, Carlsbad, USA) unter Verwendung des folgenden Restriktionsansatzes (25 μl, 1,5 h bei 37°C), enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl EcoR I, 1,5 μl Xho I (Roche), 3 μl 10 × Puffer H (Roche) und 19 μl Wasser bidest. ebenfalls verdaut.

Anschließend wurden die geschnittenen Fragmente, wie oben beschrieben gereinigt und ligiert, wobei man das Plasmid pcDNA4(mycHis)A h RhoA wt (vgl. 2c; SEQ ID NO: 13.) erhält. Das erhaltene Konstrukt wurde dann in den Bakterienstamm Super-Comp XL2 Blue (Stratagene) transformiert.

Weitere Sequenzinformationen zu pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt sind in folgendem Abschnitt zusammengefasst:

CMV prom.	197–851
RhoA	1058–1636

His	2437–2454
myc	2392–2421
Bgh pA	2480–2707
SV40 pA	4143–4273
f1ori	2753–3181
amp	5477–6334 compl.
pUC ori	4656–5329
Zeo	3639–4010
EM7 prom.	3565–3620
SV40 prom.	3209–3517

d) Herstellung von pcDNA3 hRhoA wt (2b)

Die Herstellung erfolgt in Analogie zu pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt, wobei man aber anstelle von pcDNA4(mycHis) das oben bereits beschriebenen Plasmid pcDNA3.1V5-His TOPO verwendet.

Weitere Sequenzinformationen zu pcDNA3 hRhoA wt (vgl. 2b; SEQ ID NO: 15) sind in folgendem Abschnitt zusammengefasst:

CMV prom.	6124–6778
h RhoA	127–705
Bgh pA	1478–1718
SV40 pA	3402–3597
SV40 ori	2259–2584
ColE1 ori	4141–4515
f1ori	1788–2201
Neo	2620–3411
amp	4919–5779 compl.

Herstellungsbeispiel 3: Generierung stabiler rekombinanter HEK Zelllinien

Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293) (ATCC = American Tissue Culture Collection, Bestellnr.: CRL-1573) wurden wie im folgenden beschrieben transfiziert und kultiviert.

a) Herstellung der Doppel-Transfektante HEK293 NgR/p75

HEK293 Wildtyp- Zellen (kultiviert in RPMI-Glutamax + 10% dial. FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic) wurden in einem ersten Transfektionsschritt mit dem Plasmid pIRES hNgR hp75 transfiziert. Dazu wurden in Kulturschalen mit 10 Vertiefungen je Ansatz 2 μg Plasmid-DNA in 100 μl serumfreien RPMI-Gutamax Medium und 2 × 10⁶ Zellen in 12 μl LIPOFECTAMINE (Invitrogen) in 100 μl serumfreien RPMI-Gutamax Medium vermischt, und 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Man füllte dann mit serumfreien Medium auf ein Gesamtvolumen von 1 ml je Transfektionsansatz auf. Anschließend gab man zu jeder Schale 2 ml serumfreies RPMI-Gutamax Medium und man inkubierte 6 h bei 37°C. Dann erfolgte ein Mediumwechsel auf RPMI-Glutamax + 5% dialysiertes FCS und inkubierte 1 Tag bei 37°C. Anschließend wurden die Schaleninhalte gesplittet (in unterschiedlichen Verdünnungen: 1:10; 1:50, 1:100, 1:250, 1:500, 1:1000; 1 Ansatz/Schale pro Verdünnung) (in RPMI-Glutamax + 10% dialysiertes FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic (Invitrogen) + G418 (Geneticin; Invitrogen); 800 μg/ml)

Klone wurden aus derjenigen Verdünnung isoliert, die die ersten separierten Klone ergab. Sterile Mini-Glaszylinder (BASF) wurden mit einer sterilen Pinzette mit einem Ende in sterile Vaseline (BASF) vorsichtig eingetaucht. Das mit der Vaseline benetzte Ende der Mini-Glaszylinder wurde auf die zuvor ausgewählten Einzelklone vorsichtig aufgesetzt. Der Einzelklon sollte vollständig vom Mini-Glaszylinder umschlossen sein. In die Mini-Glaszylinder wurden nun mit einer Eppendorf-Pipette mit steriler Spitze 40 μl Trypsin (Gibco, Trypsin-EDTA) zugegeben. Das Trypsin ließ man 1–2 Minuten auf die Zellen einwirken. Durch mehrmaliges (3–4 Mal) Anziehen und Abgeben des Trypsins mit einer Eppendorf-Pipette (sterile Spitze) wurden die Zellen resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden mit der Eppendorf-Pipette vollständig vom Mini-Glaszylinder in eine 24-well Platte (Tissue culture plate, Falcon, Becton Dickinson, jedes well enthielt 1 ml Medium RPMI-Glutamax + 5% dialysiertes FCS) überführt.

Der Nachweis von positiven Klonen erfolgte mittels FACS wie nachfolgend beschrieben. FACS-Analyse – Reagenzien:

FACS-Analyse – Durchführung:

Zunächst wurden die HEK293-Zellen mit PBS gewaschen. Adhärente Zellen wurden mit PBS, enthaltend 5 mM EDTA abgelöst. Anschließend wurden 2 × 10⁶ Zellen in ein Eppendorff-Gefäß überführt und 2 Minuten bei 1300 Upm zentrifugiert. Die Zellen wurden in PBS, enthaltend 1% BSA (1 ml/Gefäß) resuspendiert und 2 Minuten bei 1300 Upm zentrifugiert.

Die Pellets wurden erneut mit 0,1 ml PBS/1% BSA einschließlich Primärantikörper (Maus-anti-Human p75 1:100, oder Ziege-anti-Human NogoR 1:50) resuspendiert und 90 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend gab man 0,1 ml PBS/1% BSA hinzu, mischte und zentrifugierte 2 Minuten bei 1300 Upm.

Die Pellets wurden in PBS, enthaltend 1% BSA (0,1 ml/Gefäß) und Sekundärantikörper (anti-Maus-FITC 1:100; oder anti-Ziege-FITC 1:100); resuspendiert und 60 Minuten bei 4°C inkubiert.

Man gab PBS, enthaltend 1% BSA (1 ml/Gefäß) hinzu, mischte und zentrifugierte 2 Minuten bei 1300 Upm. Nach Abzentrifugation wurden die Pellets erneut in PBS/0,1 Propidiumjodid zur Detektion toter Zellen resuspendiert. Nach Resuspendieren erfolgte eine FACS-Analyse (FACScan, Firma Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland).

Dabei wurde die Überexpression der Rezeptoren NgR und p75 an der Zelloberfläche bestimmt (Ergebnisse nicht gezeigt).

b) Herstellung der Triple-Transfektante HEK293 RhoA/NgR/p75

Ein gemäß a) hergestellter positiver Klon (Klon 5) der Zelllinie HEK293 NgR/p75 wird in analoger Weise mit dem Plasmid pcDNA4(mycHis)A hRhoA transfiziert. Im letzten Schritt erfolgte eine Splittung der Ansätze in RPMI-Glutamax (+ 10% dialysiertes. FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic + G418; 800 μg/ml, + Zeocin (Invitrogen) 125 μg/ml) Zum Nachweis positiver Klone wurde diese durch Immunoblotting auf RhoA Expression und durch FACS Analyse auf Expression der Rezeptoren NgR und p75 getestet.

Zum RhoA-Nachweis wurde ein von dem jeweiligen Klon abgeleitetes Zellhomogenat durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese (NuPAGE Polyacrylamid Gel 4–12%, 1,5 mm stark Invitrogen Carlsbad, USA); die Proteinproben wurden mit 5% Mercaptoethanol denaturiert) aufgetrennt und nach Immunoblotting mit monoklonalem Maus-anti-RhoA Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) nach Standardmethode getestet. Ein typisches Ergebnis ist in 3a dargestellt. Bei positiven Klonen beobachtet man eine RhoA-Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 21 kD.

Zum Nachweis der Expression von NgR und p75 wurde eine FACS-Analyse wie oben beschrieben durchgeführt. Ein typisches Ergebnis ist in 3b dargestellt.

c) Herstellung der Einfach-Transfektante HEK293 RhoA

HEK293 wt Zellen werden mit dem Plasmid pcDNA3 hRhoA wt transfiziert. Im letzten Schritt erfolgte eine Splittung der Ansätze in RPMI-Glutamax (+ 10% dialysiertes. FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic + G418; 800 μg/ml). Ansonsten wurde in Analogie zu a) und b) verfahren.

Herstellungsbeispiel 4: Herstellung von His-NogoR Fusionsprotein

Grundlage für die Expression und Aufreinigung von rekombinanten His-NogoR Fusionsprotein (Genbank: NM_023004) war die stabil mit dem Vektor „pcDNA4/hNogoR-TM6" transfizierte HEK 293 Zelllinie „CHO"

Im Folgenden wird zunächst die Herstellung dieser Zelllinie beschrieben: Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Sambrook, J. & Russell, D. W. (2001). Mo lecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory durchgeführt.

Ausgangspunkt für die Herstellung des NgR-HIS Expressionsplasmids war der bei der RZPD GmbH (Berlin, Deutschland) käuflich erworbene cDNA Klon pOT87/RALp962L1427Q2. Aus der Plasmid-DNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer:

hNogoR Hind III: CCAAGCTTATGAAGAGGGCGTCCGCTGGAGGGAG (SEQ ID NO: 17)
hNogoR Eco RI–TM: CCGAATTCTAGGGCACCTGAGCCTTCTGAGTCACC (SEQ ID NO: 18) die gewünschte kodierende Nukleotidsquenz amplifiziert.

Nach Gelaufreinigung mit dem QIAquick Gelextraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) wurde die cDNA mit den Restriktionsendonucleasen Hind III und EcoR1 geschnitten, um nach erneuter Gelaufreinigung in den ebenfalls Hind III/EcoR1 geschnittenen Vektor pcDNA4/MycHIS A (Invitrogen, Carlsbad, USA) ligiert zu werden. Nach Transformation in E.coli Top 10 One Shot Zellen (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurde ein positiver rekombinanter Klon amplifiziert, die Sequenz verifiziert und die Plasmid-DNA mit dem Plasmid Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.

Der so neu entstandene Plasmid-Vektor „pcDNA4/hNogoR-TM6" wurde mit dem Transfektionsreagenz „Fugene 6" (Roche, Mannheim, Deutschland) nach Angaben des Herstellers in CHO-K1 transfiziert. Nach Selektion der „positiven" Zellen mit 800 μg/ml G418 in MEM Medium (#M4528, Sigma, München, Deutschland) enthaltend 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurden serielle Verdünnungen der Zellsuspension hergestellt, so dass ausgehend von einem Einzelklon die Zelllinie „CHO-K1/" identifiziert werden konnte.

Die Identität der Nogo-Rezeptor Expression und Sekretion des Proteins ins Kulturmedium wurde im Dot Blot mit anti-HIS spezifischen Antikörpern (#1922416, Roche, Mannheim, Deutschland) überprüft.

Der Zellklon wurde unter normalen Zellkulturbedingungen vermehrt und in einen Wannenstapel eingesät. Nach 21 Tagen des Wachstums unter FCS wurde das Medium durch frisches serumfreies Medium ersetzt. Nach 3 Tagen wurden 40 Liter serumfreier Zellkulturüberstand gewonnen. Dieser Überstand wurde mit Hilfe einer Fresenius Nemoflow F60 auf 1 Liter konzentriert (Faktor 40). Anschließend wurden 50 ml Ni-NTA-Superflow Beads (Qiagen, Hilden), welche mit PBS voräquilibriert waren, zu dem Konzentrat gegeben und bei 4°C für 3 Stunden gerührt. Die Beads wurden durch Abstellen des Rührers sedimentiert (über Nacht bei 4°C), der Überstand wurde verworfen und die Ni-NTA Beads in eine Säule gefüllt. Die Beads wurden bei Raumtemperatur mit drei Säulenvolumen 20 mM Na-Phosphatpuffer, 300 mM NaCl pH 8.0 gewaschen. Anschließende erfolgten Waschschritte mit 5 Säulenvolumen 20 mM Na-Phosphatpuffer, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazole pH 8.0. Eluiert wurde der gebundene Hexa-Hisgetaggte NgR mit 20 mM Na-Phosphatpuffer, 300 mM NaCl, 100 mM Imidazole pH 8.0. Das Eluat wurde über Nacht gegen 25 mM Tris/HCl pH 7.0 dialysiert. Das Dialysat wurde bei Raumtemperatur auf eine Q-Sepharose Säule (Amersham Biosciences, 1.6 × 3cm; Volumen 6 ml) gegeben. Anschließend wurde mit folgenden Puffern gearbeitet:

Puffer A: 50 mM Tris/HCl; pH 7.0;
Puffer B: 50 mM Tris/HCl; 1M NaCl; pH 7.0

Mit einem Fluß von 2 ml/min wurde mit folgendem Gradienten eluiert:
0% Puffer B für 5 Säulenvolumen; 0–50% Puffer B in 12 Säulenvolumen; 50–100% Puffer B in 2 Säulenvolumen, sowie 100% Puffer B in 5 Säulenvolumen.

Pro Säulenvolumen wurden zwei Fraktionen gewonnen. Diese wurden durch Standard SDS-Gelelektrophorese analysiert. Fraktionen mit der höchsten NgR-Reinheit wurden für den Anteil des hoch-glykosylierten Rezeptors (Molekulargewicht ca. 110.000–120.000), sowie für den Anteil des niedrig-glykosylierten Rezeptors (Molekulargewicht ca. 75.000–90.000) vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden gegen 20 mM Na-Phosphatpuffer, 140 mM NaCl pH 7.4 bei 4°C über Nacht dialysiert. Die Dialysate wurden anschließend durch einen 0.2 μm Sterilfilter filtriert und bei 4°C aufbewahrt.

Herstellungsbeispiel 5: Herstellung von EGFP-NogoR Fusionsprotein

Die Herstellung erfolgte unter Anwendung molekularbiologischer Standardtechniken gemäß Sambrook, J. & Russell, D. W. (2001).

Folgende Primer wurden dazu eingesetzt:
Für die Bereitstellung von NogoR 27–450

hNogoR Hind III: CC AAGCTT ATGAAGAGGGCGTCCGCTGGAGGGAG (SEQ ID NO: 17)
hNogoR Eco RI–TM: CC GAATTCTAGGGCACCTGAGCCTTCTGAGTCACC (SEQ ID NO: 18)

Für die Bereitstellung von EGFP:

EGFP EcoRI CCGAATTCTGATGGTGAGCAAGGG (SEQ ID NO: 19)
EGFP Apal CCGGGCCCCTTGTACAGCTCGTCCA (SEQ ID NO: 20)

Folgende käuflich erhältliche Plasmide wurden eingesetzt:

pOTB7 Cat.Nr.: IRALp962L1427Q2 (RZPD)
pEGFP-N3 Cat Nr.: 6080–1 (Clontech)
psecTAG2A Cat Nr.: V900–20 (Invitrogen)

Zur Klonierung wurde zunächt aus dem Plasmid pEGFP-N3 mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer gemäß SEQ ID NO: 19 und 20 die gewünschte EGFP-kodierende Nukleotidsquenz amplifiziert. Nach Gelaufreinigung mit dem QIAquick Gelextraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) wurde die cDNA mit den Restriktionsendonucleasen Apal und EcoRI geschnitten, um nach erneuter Gelaufreinigung in das ebenfalls Apal/EcoRI geschnittene Plasmid psecTAG2A ligiert zu werden. Auf diese Weise erhält man das Plasmind psecEGFP2-6 × HIS.

In einem nächsten Schritt wurde aus dem Plasmid pOTB7 mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer gemäß SEQ ID NO: 17 und 18 die gewünschte NogoRkodierende Nukleotidsquenz amplifiziert. Nach Gelaufreinigung mit dem QIAquick Gelextraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) wurde die cDNA mit den Restrikti onsendonucleasen Hind III und EcoRI geschnitten, um nach erneuter Gelaufreinigung in das ebenfalls Hind III/EcoRI geschnittene Plasmid psecEGFP2-6 × HIS ligiert zu werden.

Nach Transformation des Plasmids in E.coli Top 10 One Shot Zellen (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurde ein positiver rekombinanter Klon amplifiziert, die Sequenz verifiziert und die Plasmid-DNA mit dem Plasmid Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Auf diese Weise erhält man das Plasmid psec hNogoR 27–450 EGFP 6 × HIS (1b).

Dieser Plasmid-Vektor wurde mit dem Transfektionsreagenz „Fugene 6" (Roche, Mannheim, Deutschland) nach Angaben des Herstellers in CHO-K1 transfiziert. Nach Selektion der „positiven" Zellen mit 800 μg/ml G418 in MEM Medium (#M4528, Sigma, München, Deutschland) enthaltend 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurden EGFP-positive Einzelzellen nach dem Kriterium „Best FL-1 Signal" mit einem FACS (fluorescence-assisted cell sorter; (FACSVantage SE, Becton Dickinson) gescreent und als Einzelzellen in 96 well Platten in MEM Medium (800 μg/ml G418 in MEM Medium (#M4528, Sigma, München, Deutschland), enthaltend 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, USA)) kultiviert. Nach ca. 2 Wochen wurden die Einzelklone anhand der Expression von EGFP mit einem Fluoresczenz Scanner (Tycoon Scanner, Wellenlänge 526 nm) analysiert.

Auf diese Weise wurde ein Einzelklon die Zelllinie mit der Bezeichnung „CHO-K1/hNogoR 27–450 AA EGFP B3" identifiziert.

Die Identität der Fusionsprotein Expression und Sekretion des Proteins ins Kulturmedium wurde über Western Blot überprüft (analog Herstellungsbeispiel 4).

Zur Produktion des NgR-EGFP Proteins wurden die Zellen in serumfreiem Medium (analog Herstellungsbeispiel 4) kultiviert, 10 Liter Medienüberstand nach drei Tagen abgenommen und auf 1,3 Liter konzentriert. Nach einer Isolierung des Proteins über die His-Komponente durch eine Ni-NTA superflow Agarose (analog Herstellungsbeispiel 4) und eine Anionenaustauscher-Säule Mono-Q wurde das Protein schließlich durch eine Superose 12-Säule gereinigt und fraktioniert.

Ausführungsbeispiel 1: Bindung von AP-Nogo66 an NgR
a) FACS-Analyse
Zellkulturen von HEK293, die natürlicherweise NgR exprimieren, wurden mit PBS gewaschen und mit 5 mM EDTA enthaltendem PBS von den Kulturgefäßen abgelöst. Jeweils 2 × 10⁶ Zellen wurden in Eppendorf-Röhrchen übertragen und 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Danach wurden die Zellen in 1% BSA enthaltendem PBS (PBS/1% BSA) resuspendiert (1 ml/Röhrchen) und erneut 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Die Zellen wurden dann in 0,1 ml PBS/1% BSA resuspendiert, der 1000 nM Kompetitor (EGFP-NogoR, Anti-NogoR-Antikörper, His-Nogo66 oder MAG-Fc) enthielt (Kontrolle ohne Kompetitor) und 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach Zugabe von 0,1 ml PBS/1% BSA, das 25 nM AP-Nogo66 enthielt, wurde 45 min bei RT inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann zentrifugiert, das Pellet in PBS/1% BSA resuspendiert (1 ml/Röhrchen) und die Suspension 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Die Pellets wurden dann in 0,1 ml PBS/1% BSA resuspendiert, das Anti-Alkalische-Phosphatase (Sigma A-2951) enthielt, und 30 min bei RT inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellpellets in PBS/1% BSA (1 ml/Röhrchen) resuspendiert und 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Die Pellets wurden in 0,1 ml PBS/1% BSA resuspendiert, das Anti-Maus-Phycoerythrin (Sigma; P-9287; 1:100 verdünnt) enthielt, und 30 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert, in PBS/1% BSA resuspendiert (1 ml/Röhrchen), erneut 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert und schließlich in 1 ml PBS suspendiert. Diese Suspension wurde für die FACS-Analyse (FACScan, Becton Dickinson) verwendet.
In Gegenwart von 1000 nM EGFP-NogoR oder Anti-Nogo-R-Antiköper wurde die Bindung von AP-Nogo66 an HEK293 im wesentlichen auf die Stärke des Hintergrundsignals reduziert (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass AP-Nogo66 an NgR von HEK293 bindet, wobei eine Wechselwirkung mit NogoR erfolgt, die durch Kompetition mit EGFP-NogoR oder Anti-NogoR-Antikörper unterbunden wird.
b) Bindung von AP-Nogo66 an NgR (direkt an Mikrotiterplatten gebunden)
NgR kommt in einer niedrig-glykosylierten und einer hoch-glykosylierten Form (etwa 80 kDa bzw. 120 kDa) vor (vgl. Herstellungsbeispiel 4). Der niedrig-glykosylierte Rezeptor His-NogoRlow wurde in den Fraktionen 4–7 einer Q-Sepharose-Säule in 20 mM NaPi, 140 mM NaCl, pH 7,4 mit ca 90% Reinheit erhalten, der hoch-glykosylierte Rezeptor His-NogoRhigh entsprechend in den Fraktionen 28–31 mit einer Reinheit von mehr als 95%. Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorb) wurden mit 0,1 ml 1 μg/ml His-NogoRlow bzw. His-NogoRhigh in Na-Carbonat-Puffer, pH 9, über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach einem zweistündigen Blockierungsschritt mit 2% BSA in Tris-HCl, pH 7,2, bei Raumtemperatur wurde 0,1 ml AP-Nogo66 zugegeben. Die AP-Nogo66-Stammlösung (3 μg/ml) wurde mit Puffer (Tris-HCl mit 0,1% BSA, pH 7,2) auf die angegebenen Anfangskonzentrationen verdünnt, die dann zweifach weiterverdünnt wurden. Die Mikrotiterplatten wurden während jedes Inkubationsschrittes mit Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,2, und 0,05% Tween 20) gewaschen. Die Bindung von AP-Nogo66 wurde mit einem fluorgenen Substrat (AttoPhos, Roche 1 681 982) nachgewiesen und die Fluoreszenzeinheiten gemessen (Polarstar-Messgerät, BMG). Wie in 4 gezeigt ist, bindet His-NogoRlow besser an AP-Nogo66 als His-NogoRhigh.
Ausführungsbeispiel 2: AP-Nogo66 Kompetitionstest mit Clivarin und Arixtra
Alle Mengenangaben beziehen sich auf eine einzelne Vertiefung der Mikrotiterplatte („Welt"). Nach jedem Inkubationsschritt wurden die Platten mit Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.2 and 0.05% Tween20) gewaschen.
Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorb) wurden mit 0,1 ml einer 1 μg/ml konzentrierten anti-NgR Antikörperlösung (R&D Systems, AF1208) in Natriumcarbonat-Puffer (50 mM) bei pH 9,0, über Nacht bei 4°C beschichtet. Einem 2-stündigen Blockierungsschritt mit 2% Rinderserumalbumin (bovine serum albumin (BSA) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,2) bei Raumtemperatur folgte eine Inkubation mit 0,1 ml einer 4 μg/ml konzentrierten NgR-His Lösung (Herstellungsbeispiel 4; Fraktion 4–7; Konzentration 2,83 mg/ml) in Tris-HCl, pH 7,2 mit 0,1% BSA für 90 Minuten bei Raumtemperatur.
Für die Kompetitionsexperimente wurden die Substanzen Clivarin (Clivarin 1.750, Mw 4500 Da, Abbott) und Arixtra (Fondaparinux-Na; Mw 1700 Da, Sanofi-Synthelabo) mit Puffer (Tris-HCl pH 7.2 mit 0.1% BSA) verdünnt in die vorbereiteten, über Bindung an anti-NgR (Beschichztung mit 1 μg/ml) mit NgR beschichteten (His-NgR; Faktion 4–7; 4 μg/ml als Fänger) Mikrotiterplatten gegeben und anschließend ohne Waschschritt AP-Nogo66 zupipettiert. Die Konzentrationen von Clivarin und Arixtra lagen zwischen 0,1 und 100 μM. Die Konzentration von AP-Nogo66 betrug 0,1 nM. Diese AP-Nogo66 Konzentration liegt unter dem K_D zwischen AP-Nogo66 und NgR (0,6 nM). Nach 90 Minuten Inkubation und anschließendem Waschen (Waschpuffer, siehe oben) wurde die an NgR (Nogo Rezeptor) gebundene AP-Aktivität von AP-Nogo66 durch Zugabe des nach den Anweisungen des Herstellers vorbereiteten Fluoreszenz-Substrates AttoPhos (Roche, 1 681 982) nach 15–30 Minuten bei Raumtemperatur in einem Mikrotiterplatten-Leser (Polarstar, BMG) bei 440 nm Excitations- und 560 nm Emissionswellenlänge gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 und 6 gezeigt, wobei die Messergebnisse in relativen Fluoreszenz-Einheiten (relative Fluorescence Units; RFU) angegeben sind. Sie zeigen die Kompetition der AP-Nogo66 Bindung an NgR durch Clivarin und Arixtra. Der IC₅₀ Wert liegt bei Clivarin unter 1 μM und bei Arixtra bei unter 50 μM. Clivarin ist in der Lage die Interaktion zwischen AP-Nogo66 und NgR vollständig zu blockieren.
Ausführungsbeispiel 3: AP-Nogo66 Kompetitionstest mit Oligosacchariden
Zur Bestimmung der kleinsten funktionellen Einheit der Saccharide wurden Untersuchungen mit Di-, Tetra und Hexasacchariden (als Verdauungsprodukte von Heparin durch Heparinase) als Kompetitoren durchgeführt. Die Saccharide wurden von der Firma Dextra Labs bezogen (Disaccharid: ID 1002; 2) Tetrasaccharid: ID 1004; 3) Hexasaccharid: ID 1006). Die Versuchsdurchführung erfolgte analog zu Ausführungsbeispiel 2.
Die getesteten Saccharide zeigten die in folgender Tabelle zusammengefassten IC₅₀-Werte:
Ausführungsbeispiel 4: Aktin-Zytoskelett-Umformungstest (actin cytoskeletal rearrangement (ACR)-Test) mit Heparinderivaten
Um zu untersuchen, ob die Heparinderivate Clivarin bzw. Arixtra (Pentasaccharid) ein vergleichbares zelluläres Signal auslösen, wie das durch die Wechselwirkung zwischen Nogo-66 und NgR verursachte, oder aber ein solches Signal inhibieren, wurde ein zellulärer RhoGTPase Aktivierungsssay verwendet. Bei diesem Assay aktiviert die Stimulation des NgR/p75-Rezeptorkomplexes mit Myelin-Proteinen, wie beispielsweise Nogo-66, die Rho-GTPase, welche GTP bindet. Aktivierte Rho-GTPase aktiviert ihrerseits die Serin-Threonin-Kinase ROCK (Rho-assoziierte Kinase), ein spezifisches Downstream-Target von Rho. Die Aktivierung von ROCK führt zur Phosphorylierung mehrerer Zytoskelettproteine, was zu einer Veränderung der Zellmorphologie führt, wie insbesondere einer Zellkontraktion.
Nachfolgend wird ein solcher Aktin-Zytoskelett-Umformungstest im Allgemeinen beschrieben
a) Materialien:

Hek293 RhoA/NgR/p75 (s.o.)
AP-Nogo66 (s.o.)
MTP Biocoat Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen
RPMI-Glutamax (Invitrogen)
Phalloidin Alexa 568 oder 488 (Farbstoff zur Fluoreszenzfärbung von F-Aktin; Molecular Probes, Eugene, USA)
DAPI (Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat Molecular Probes, Eugene, USA)

b) Versuchsdurchführung:
4 × 10⁴ Zellen werden in MTP Biocoat Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zwei Tage vor dem eigentlichen Versuchsbeginn überimpft. Die so erhaltenen Zelllinien wurden mit der jeweiligen Testsubstanz bei verschiedenen Konzentrationen (Clivarin-Konzentrationen 2, 5, 10, 20, 40, 80 μM; PentasaccharidKonzentrationen 10, 20, 40, 80, 160, 320 μM) in den angegebenen Konzentrationen 10 min lang inkubiert oder blieben unbehandelt. Die Stimulation der Zellen erfolgte mit dem NgR-Liganden AP-Nogo-66 (9,6 μg/ml) in Kulturmedium enthaltend 5% FCS. Für jede Versuchsreihe wird ein unstimulierter Kontrollansatz (ohne AP-Nogo66) hergestellt. Nach einer 5- bis 10-minütigen Stimulationsperiode wird die Aktivierung mit kalter PBS unterbrochen. Die Zellen werden mit 3–4%-iger Paraformaldehydlösung fixiert, mit PBS, enthaltend 0,2% Triton X-100 permeabilisiert und 30 – 45 Minuten mit Phalloidin Alexa 568 oder 488 inkubiert. Zusätzlich erfolgt eine 5 minütige Inkubation mit DAPI zur Kernfärbung. Die Zellen werden mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskops (Axiovert 25) visualisiert. Fluoreszenzmikrogramme können beispielsweise mit einer gekühlten CCD Kamera von Zeiss aufgenommen und der prozentuale Anteil kontrahierter Zellen, bezogen auf die Gesamtzellzahl ermittelt werden.
Die Ergebnisse sind in 7 und 8 (Clivarin bzw. Arixtra) gezeigt. Clivarin bzw. Arixtra führen zu einer Auslösung der Signalkaskade und zu Kontraktion der Zellen, wobei als Kontrolle unbehandelte Zellen dienten, die unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zugabe von Saccharid, jeweils 0% Kontraktion zeigten.
Ausführungsbeispiel 5: Wirkung von Clivarin bei neuronalen Auswachsversuchen
Um die Wirkung von Clivarin in vitro zu untersuchen, wurden neuronale Auswachsversuche durchgeführt. Dazu wurden kortikale Neuronen der Maus präpariert, wobei die folgenden Medien verwendet wurden:

Stockmedium pro Liter: 90 ml GB5, 100 ml Minimum Essential Medium – Eagle (10x; Gibco, Bestell Nr.: 21430.020), ad 1000 ml mit Millipore Wasser. pH 7,0, 280–310 mosm.
GB5 pro Liter: 26,6 g NaHCO₃, 44,4 g Glucose, sterilfiltriert.
Plattiermedium (PM) pro Liter: 0,8 mM Glutamin, 100 ml hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum (FCS), 100 ml hitzeinaktiviertes Pferdeserum, ad 1000 ml mit Stockmedium
Erhaltungsmedium (EM) pro Liter: 0,8 mM Glutamin, 100 ml hitzeinaktiviertes Pferdeserum, ad 1000 ml mit Stockmedium
Trypsinlösung: 0,1% Trypsin, 0,04% EDTA in PBS ohne Calcium/Magnesium, sterilfiltriert.

Für die Gewinnung korticaler Neuronen wurden trächtige Mäuse (embryonic day 15 (E15)) durch Überstrecken getötet, deren Bauchraum eröffnet, der Uterus mit den Embryonen entnommen und in PBS gewaschen. Mit einer Feinpräparationsschere wurde der Uterus längs aufgeschnitten, die Embryonen entnommen und freipräpariert. Die Embryonen wurden durch Genickschnitt getötet, das Gehirn entnommen und der Vorderhirn-Kortex präpariert. Die Kortices werden in je 1 ml einer 0,1%igen Trypsinlösung für 5 Minuten bei 37°C inkubiert, die Reaktion mit Erhaltungsmedium (EM) abgestoppt und nach 5-minütiger Inkubation in insgesamt 10 ml EM mit feuerpolierten Pasteurpipetten mit absteigendem Öffnungsdurchmesser trituiert. Die Zellsuspension wurde 10 Minuten bei 1200 U/min abzentrifugiert und der Überstand abgesaugt und verworfen. Das Zellpellet wurde in 8 ml EM aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. Die Zellen wurden in einer Neubauer Zählkammer ausgezählt, die Zellzahl auf ca. 500.000 Zellen/0,5 ml in EM eingestellt und prä-aggregiert. Dazu wurden pro Well 200 μl der Zellsuspension auf Glas-Chamberslides (LabTek, Bestell Nr. 177402) gegeben und für 24 h bei 37°C inkubiert. Dabei bilden sich Neuronenaggregate. Nach 24 Sunden wurde nochmals 200 μl EM zugegeben, und der Inhalt einer Vertiefung auf zwei Platten mit 24 Vertiefungen verteilt, in die zuvor jeweils ein vorbereitetes rundes Glasplättchen (Beckton Dickinson, BioCoat, Bestell Nr.: 354085) gelegt worden war.
Diese Glasplättchen wurden entweder wie vom Hersteller geliefert (beschichtet mit Poly-L-Lysin) verwendet, oder sie wurden zusätzlich mit Clivarin in unterschiedlichen Konzentrationen beschichtet. Dazu wurde je 50 μl Clivarin (verdünnt in PBS) auf die Plättchen gegeben und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurden die Plättchen mit Plattiermedium gewaschen, das Medium abgesaugt und die oben beschriebenen Aggregate in insgesamt 500 μl EM ausplattiert. Das Auswachsen der Neuriten aus Aggregaten kortikaler Neuronen der Maus wurde nach weiteren 48 Stunden evaluiert. Die Ergebnisse sind in 9 (obere Reihe von links nach rechts: kein Clivarin, 19 μM und 30 μM Clivarin; untere Reihe: 100 μM und 300 μM Clivarin) und 10 (Detailaufnahme eines neuronalen Aggregats; links: ohne Clivarin, rechts: 300 μM Clivarin) gezeigt.
Auf Oberflächen fixiertes Clivarin führte in diesem Test dazu, dass das Auswachsen der Neuriten in konzentrationsabhängiger Weise inhibiert wurde. Neuronale Aggregate verloren außerdem die Adhärenz an Oberflächen, wenn Clivarin in das Kulturmedium gegeben wurde (Ergebnisse nicht gezeigt).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verwendung eines Wirkstoffs, ausgewählt unter Heparinen und Heparinderivaten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen, die mit einer Störung der Neuriten-Plastizität oder einer Störung des Neuriten-Wachstums einhergehen.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Wirkstoff die Interaktion zwischen dem Nogo-Rezeptor und dessen Liganden AP-Nogo66 moduliert.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei eine Blockierung mit einem IC₅₀-Wert von höchstens 100 μM erfolgt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff in einem Aktin-Cytoskelett-Umformungs (ACR)–Test eine Zellkontraktion mit einem IC₅₀-Wert von höchstens 100 μM induziert.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Wirkstoff das Auswachsen von Neuriten in neuronaler Zellkultur mit einem IC₅₀-Wert von höchstens etwa 1000 μM moduliert.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff eine Molekülmasse von etwa 500 Da bis 10.000 Da aufweist.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt ist unter Clivarin, Arixtra sowie Heparinoiden, die Di-, Tetra- und Hexasaccharidfragmente umfassen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament ein oder mehrere Heparine oder Heparinderivate, gegebenenfalls in Form physiologisch verträglicher Salze oder Solvate, und gegebenenfalls einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger oder Exzipienten enthält.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff in einer Dosierungsform, ausgewählt unter Infusionslösungen und Depofformulierungen, vorliegt.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zustände mit einer Störung der Neuriten-Plastizität, mit aberrantem Neuritenwachstum oder mit einem gestörten Neuritenwachstum einhergehen, und ausgewählt sind unter neuropathischem Schmerz, Gürtelrose, Gesichtsrose, Trigeminusneuralgie, Postlaminektomiesyndrom, Phantomsensationen, anhaltendem brennendem Schmerz nach Operation und diabetischer Polyneuropathie, Schizophrenie und alle Erkrankungen des schizoiden Formenkreises, Epilepsien und durch Hirnverletzungen verursachte Fehlfunktionen die auf aberrantem, exzessiven und/oder unkontrolliertem Neuritenwachstum beruhen.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Krankheiten oder pathologischen Zustände mit einer Störung der Neuriten-Regeneration einhergehen, und ausgewählt sind unter Rückenmarksverletzung, Hirnverletzung, Schädel-Hirn-Trauma, Schlaganfall, mechanisch bedingter Verletzung des Zentralnervensystems, ischämisch bedingter Verletzung des Zentralnervensystems, infektionsbedingter Verletzung des Zentralnervensystems, Morbus Parkinson, Chorea Huntington, amyotropher Lateralsklerose und anderen Motoneuronenerkrankungen, Morbus Alzheimer, Poliomyelitis, Hirschsprung's Krankheit, Paraplegie, Diplegie, Tetraplegie, infantiler neuroaxonaler Dystrophie (Seitelberg-Krankheit), lokalisierter neuroaxonaler Dystrophie (Hallervorden-Spatz-Krankheit), Waller-Degeneration, viraler Meningitis, bakterieller Meningitis und Axon-Ischämie. und neurodegenerativen Erkrankungen, wie insbesondere Multiple Sklerose, post-Polio Syndrom, Spina bifida, spinale Muskelatrophie, Tumoren, wie Hirntumor und Rückenmarkstumor, und transverser Myelitis.