WO2006111348A1 - Verwendung von heparin und heparinderivaten zur modulation des neuritenwachstum-kontrollierenden nogo-rezeptors - Google Patents

Verwendung von heparin und heparinderivaten zur modulation des neuritenwachstum-kontrollierenden nogo-rezeptors Download PDF

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WO2006111348A1
WO2006111348A1 PCT/EP2006/003523 EP2006003523W WO2006111348A1 WO 2006111348 A1 WO2006111348 A1 WO 2006111348A1 EP 2006003523 W EP2006003523 W EP 2006003523W WO 2006111348 A1 WO2006111348 A1 WO 2006111348A1
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heparin
ngr
cells
nogo66
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PCT/EP2006/003523
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Mario Mezler
Alfred Hahn
Nicole Teusch
Reinhold Müller
Bernhard K. MÜLLER
Achim Möller
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Abbott Gmbh & Co. Kg
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia

Definitions

  • the present invention relates to the use of heparin and heparin derivatives for the modulation of the Nogo receptor.
  • the invention relates to the use of heparin and heparin derivatives for the manufacture of medicaments for influencing aberrant neurite plasticity, and also to methods of treating diseases or conditions characterized by aberrant neurite plasticity.
  • Nerve cells are information-processing cells that, as receptor cells, capture, for example, stimuli from the body or environment (heat, cold, pressure, chemical stimuli, etc.) and convert it into bioelectric signals, which are sent to the brain via downstream, forwarding neurons , There, a perception takes place as a corresponding sensation.
  • sensations can be perceived, for example, for which there is no corresponding physical or chemical cause in the environment.
  • disturbances can also lead to the fact that actually existing stimuli are no longer perceived from the body or in the environment and that the human body can no longer respond or only react less to external stimuli.
  • Clinically important examples of the first-mentioned disorders are phantom pains, in which the affected persons after amputation of limbs still perceive pain sensations from the no longer existing body part.
  • Other clinically important examples include neuralgia, in which sensory disturbances of neurons lead to unfounded pain sensations. Also physiological causes can trigger pain sensations. For example, in diabetic polyneuropathy the disturbed sugar and thus also the water balance of the patient can lead to a functional change of neurons lead, which can express itself in motor function losses, but also pain sensation.
  • CNS central nervous system
  • nerve cells of the peripheral nervous system are in principle capable of regeneration after injury, it has long been believed that this is for
  • Nerve cells of the CNS is not true. It was already recognized early on that the inability of axons to regenerate was due to inhibitory factors in the CNS
  • MAG myelin-associated glycoprotein
  • NogoA also referred to as reticulone-4
  • IN-1 antigen most likely to be identical to Nogo-A (for review, see Lee et al., Nature Reviews (2003) 2, 1-). 7).
  • Nogo-A recent research also deals with the other two ligands of Nogo-A.
  • Nogo-A is a transmembrane protein found predominantly in adult oligodendrocytes
  • Nogo-A interacts with the Nogo receptor (NgR) 1, a protein linked to the membrane of neurons via glycosylphosphatidyinositol, which is also the receptor for the other two known myelin-derived inhibitors of neurite outgrowth, MAG and OMgp (Liu et al., Science (2002) 297 , 1190-1193; Domeniconi et al., Neuron (2002) 35, 283-290; Wang et al., Nature (2002) 417, 941-944).
  • NgR Nogo receptor 1
  • Nogo-66 A Nogo-A peptide of 66 amino acids, Nogo-66, appears to be responsible for interaction with NgR and is sufficient to reproduce the inhibitory effect of Nogo-A on the growth of NgR-bearing neurites (Foumier et al. Nature (2001) 409, 341-346).
  • a reduction of Nogo-66 to its first 40 amino acids leads to a loss of the inhibitory effect, so that the Nogo-A-mediated, inhibitory effect of myelin on the growth of neurites can be reversed (GrandPre et al., Nature (2002) 417, 547-551).
  • the signal transduction of NgR into the cell interior of the nerve cell is not fully understood yet.
  • NgR itself is bound to the membrane of the nerve cell via a lipid anchor, so it can not transmit any signal to the cytoplasm itself.
  • co-receptors which might be responsible for signal transmission into the cell interior after interaction with NgR, the neurotrophin receptor p75 (Wang et al., Nature (2002) 420, 74-78), LINGO-1 (Mi et al. Nature Neurosci. (2004), 7, 221-228) and the p75-related receptor TROY / TAJ (Park et al., Neuron (2005), 45, 345-351, Shao et al., Neuron (2005), 45, 353). 359).
  • the present invention is therefore based on the object to find new drug classes and in particular to provide non-peptidic agents by which the effect of NgR, in interaction with its NogoA ligand or the other two described ligands MAG and OMgp, can be modulated.
  • the invention therefore relates to the use of an active substance selected from heparins and heparin derivatives for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases or pathological conditions associated with disorders of neurite outgrowth, neurite regeneration and neurite plasticity, wherein the active ingredient in particular the interaction between the Nogo receptor and its ligands AP-Nogo66 modulated.
  • the heparin or heparin derivative functions particularly as an agonist of NgR.
  • blocking of this interaction was observed, with blocking taking place with an IC 50 value of at most 100 ⁇ M, such as 0.01 to 80 or 0.1 to 70, or 1 to 50 or 5 to 30 ⁇ M.
  • activation of the NgR is achieved by the interaction.
  • a blockage of nerve fibers is achieved, for example a collapse of nerve fibers or a collapse of growth cones.
  • Preferred active substances modulate, in particular induce, in an actin cytoskeleton transformation (ACR) test a cell contraction with an IC 50 value of at most 100 ⁇ M, such as at most about 60 ⁇ M or at most about 40 ⁇ M or at most about 20 ⁇ M, such as eg with an IC 50 value in the range of about 0.01 to 80 or 0.1 to 70, or 1 to 50 or 5 to 30 ⁇ M.
  • ACR actin cytoskeleton transformation
  • Preferred drugs modulate the outgrowth of neurites in neuronal cell culture with an IC 50 of at most about 1000 ⁇ M such as 0.01 to 800 or 0.1 to 700, or 1 to 500 or 5 to 300 ⁇ M or 5 to 200.5 to 100 or 5 to 50 ⁇ M, in which context the modulation of the outgrowth of neurites in particular means an inhibition of outgrowth.
  • active ingredients having a molecular mass of at least about 500 Da, for example about 1000 to 10,000 Da 1 or 1,500 to 6,000 Da or 4,000 to 5,000 Da, or mixtures thereof are preferably used, it being possible for the average molecular weight to be in one of the ranges indicated. ,
  • Nonlimiting examples of useful active substances or mixtures of active ingredients are: Clivarine, Arixtra and heparinoids, which comprise di-, tetra- and hexasaccharide fragments.
  • a medicament provided according to the invention may contain one or more heparins or heparin derivatives, optionally in the form of physiologically acceptable salts or solvates, and optionally one or more physiologically acceptable carriers or excipients.
  • the present invention relates to the use of the above-identified drugs for the treatment of disease states, which conditions are associated with neurite plasticity disorder, and in particular are selected from neuropathic pain, shingles, facial rose, trigeminal neuralgia, post laminectomy syndrome, phantom pain, persistent burning pain Surgery and diabetic polyneuropathy.
  • Fig. 1 shows the schematic structure of the plasmid pAP-tag5 / PPC / hNOGO66Nr.5 (Fig. 1a) and the plasmid psec hNogoR 27-450 EGFP 6xHIS Apa (Fig. 1b).
  • FIG. 2 shows the schematic structure of the plasmids pIRES / hNOGO R / hp75 (FIG. 2a), pcDNA3 hRhoA wt (FIG. 2b), PcDNA4 (mycHis) A h RhoA wt (FIG. 2c) and pcDNA3.1 (V5-4). His) hp75 No.16 ( Figure 2d).
  • Figure 3a shows the immunological detection of expressed RhoA by means of positive clones isolated according to the invention (# 1 to # 8) of the triplet transfectant HEK293 RhoA / NgR / p75, cell homogenates of the clones designated by numbers (#) (Clones 1 to 9) were separated by SDS-PAGE and tested by immunoblotting with mouse monoclonal anti-RhoA antibody.
  • Positive control (C) obtained by transient transfection with 100 ng of pcDNA4 (mycHis) A hRhoA wt; as marker (M) was used: Benchmark Prestain Protein Ladder, Invitrogen, Order # # 10748-010.
  • 3b shows the result of a FACS analysis of expressed cell surface receptors hNgR and hp75 of a HEK293 triplet transfectant (clone # 4 and # 8) and non-transformed HEK293 cells (above) according to the invention, in each case for analyzes with anti-p75 or Anti-NgR antibodies.
  • Figure 4 shows the binding of AP-Nogo66 to microtiter plates coated with either low glycosylated or highly glycosylated His-Nogo receptor (His-NogoRlow or His-NogoRhigh). The binding is expressed in relative fluorescence units (RFU) after measurement with a fluorogenic substrate
  • REU relative fluorescence units
  • Fig. 5 shows the competition of binding of AP-Nogo66 to NogoR-coated plates by clivarine (closed diamonds) or Arixtra (open diamonds).
  • Figure 6 shows the competition for binding of AP-Nogo66 to NogoR-coated plates by clivarine (closed diamonds).
  • Figure 7 shows the effect of clivarine on cell contraction in the ACR assay with HEK / Rho / NgR / p75 cells
  • Figure 8 shows the effect of the pentasaccharide Arixtra on cell contraction in the ACR assay with HEK293Rho / NgR / p75 cells
  • Fig. 9 shows the effect of clivarine on the outgrowth of neurites of mouse cortical neurons in cell culture (upper row from left to right: no clivarine, 10 ⁇ M and 30 ⁇ M of clivarin; lower row: 100 ⁇ M and 300 ⁇ M of clivarin).
  • 10 shows a detailed view of the effect of clivarine on the outgrowth of neurites of mouse cortical neurons in cell culture (left: without clivarin, right: 300 ⁇ M of clivarin).
  • An "active substance" which can be used according to the invention comprises at least one heparin, heparin derivative or heparinoid.
  • a “disorder of neurite plasticity” refers to a pathological condition in which an increased, uncontrolled, undirected and / or excessive neurite growth or outgrowth of neurites in a mammal is observed, which is defined by false-growing neurites synaptic, often permanent, miscarriages which, in turn, have physical and psychological consequences such as mismatches may be responsible for the occurrence of aberrant functions, such as neuropathic pain (Tang et al., J. Neurosci., 2004, 24, 819) - 827), epileptic seizures as a result of brain injury (Chuckowree et al., Neuroscientist (2004), 10, 280-285) and phantom sensations.
  • a " neurite growth disorder " refers, in accordance with the invention, to a pathological condition that occurs in response to injury or damage in the mammalian nervous system, in which inadequate neurite outgrowth or neuronal sprouting is observed, or which is defined by partial or total failure Repair ie neurite regeneration of severed, damaged neuronal connections with the consequence of a partial or complete, often irreversible, functional failure, such as the occurrence of paraplegia as a result of spinal cord injury.
  • a “treatment” or “therapy” can be acute, prophylactic and chronic.
  • a disease state can be completely eliminated or alleviated due to a therapy proposed according to the invention.
  • heparin describes a group of sulfated / sulfonated mucopolysaccharides, also referred to as glycosaminoglycans Heparin molecules consist of usually unbranched chains of sulfated saccharide building blocks, which primarily contain glucosamine, glucuronic acid and iduronic acid, and a molecular weight in the range of about 500 to 50,000, such as about 1000 to 10000 Da, or 1500 to 6000 Da or 4000 to 5000 Da ..
  • heparins are characterized by disaccharide units of ⁇ -1, 4-glycosidically linked D-glucosamine and L-iduronic acid units and by Disaccharide units of ⁇ -1, 4-glycosidically linked D-glucosamine and D-glucuronic acid units
  • sulfate groups sulfone groups
  • iduronic acid residues are 2-O-sulfated, glucosamine residues N-su lfatiert and optionally also 6-O-sulfated.
  • Glucuronic acid residues are often not sulfated.
  • the disaccharide units are in turn ⁇ -1, 4-glycosidically linked to heparin molecules.
  • the number and arrangement of these disaccharide units may also vary, so that the term heparin describes a variety of structurally different molecules, which may be distinguished, for example, elementally or by their chain length, their molecular weight or their charge.
  • Heparins are well known to the person skilled in the art, descriptions can be found, for example, in Capila and Linhardt (Angew. Chemie 2002, 114, 426-450) and in Bruchhausen, Dannhardt, Ebel, Frahm, Jrenthal, Holzgrabe (ed), Hager's Handbook of Pharmaceutical Practice, Volume 8, Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, 5th ed., 1993.
  • Heparin derivatives are substances obtained according to the invention by chemical or enzymatic modification of heparins.
  • the term also includes, in particular, substances with lower average molecular weights compared to naturally occurring heparins Such low molecular weight heparin derivatives can be obtained, for example, by chemical or enzymatic cleavage of heparins or by
  • heparin derivatives may be derivatized on their functional sulfate and / or sulfonate side groups, and / or one or more Have CC double bonds in their carbohydrate building blocks.
  • Derivatives also include salts, in particular physiologically acceptable salts, of heparins, in particular alkali and alkaline earth metal salts, such as sodium, calcium, magnesium or barium salts.
  • heparinoids describes a group of substances having a heparinic action, ie heparinoids inhibit blood coagulation and the development of thromboses, for example vegetable oligosaccharides and polysaccharides, eg polysulfates or sulfated animal derived from alginic acid, pectins, xylans, starches and dextrans
  • vegetable oligosaccharides and polysaccharides eg polysulfates or sulfated animal derived from alginic acid, pectins, xylans, starches and dextrans
  • pentosan polysulfates for example sodium pentosulfonate
  • xylan sulfates for example ⁇ -1-4-D-xylan-2,3-bis (hydrogensulfant), xylanpoly (hydrogen sulfate) and sodium salts thereof
  • dextran sulfate chitin sul
  • Plygalacturonic acid sulfate methyl ester methylglucoside
  • alginate sulfates e.g.
  • Heparinoids can either be obtained from natural sources, or they are prepared semi-synthetic or fully synthetic, usually by sulfating the aforementioned plant or animal polysaccharides, for example, reacted with chlorosulfonic acid and neutralized liberated hydrochloric acid with bases.
  • low molecular weight heparins which are to be understood as meaning those having an average molar mass of less than 10,000.
  • the term “molecular weight” or “molecular weight” is to be understood as meaning, in particular, dalton.
  • Low molecular weight heparins include, in particular, those known as “heparin fragment 4-6", “heparin fragment 4.5-8” and “heparin fraction” having average molecular weights of 4,000 to 6,000, 4,500 to 8,000 and 4,000 to 5,000 known heparin fragments, for example obtained by fractionation of naturally occurring heparins or by chemical or enzymatic cleavage of heparin.
  • heparins of natural origin are administered.
  • Heparin from the lungs, liver or intestinal mucosa of bovine or porcine are useful, with heparin of porcine intestinal mucosa and bovine lung being frequently used.
  • heparin- active substances which can be used according to the invention
  • those skilled in the art can, without undue burden, determine further suitable active ingredients by following the teaching according to the invention. He can use the various test methods described herein, which allow a characterization of potential drug candidates.
  • test system explained in more detail in the Experimental Section, such as NgR plate test, ACR assay and neuronal cell culture test.
  • heparin derivatives Based on the low molecular weight heparin derivatives clivarine (molecular weight about 4500) and Arixtra (pentasaccharide with a molecular weight of about 1750) it has been shown according to the invention that they can bind to NgR. It was confirmed that this binding competes with the binding of Nogo66 to NgR, although heparins and heparin derivatives are completely different molecular species compared to Nogo as the natural ligand of NgR. In addition, it could be shown that Clivarin and Arixtra cause the same effect as Nogo66, ie inhibition of neurite outgrowth.
  • heparins and heparin derivatives are useful in the present invention for the treatment of diseases or pathological conditions associated with a neurite degeneration disorder or for the preparation of medicaments for such treatment.
  • Diseases or pathological conditions that can be treated with heparin or heparin-based medicaments according to the present invention include those that result in massive neurite outgrowth and that can be abolished or alleviated by induction of neurite growth inhibition (Tang et al. Neurosci. (2004), 24, 819-827).
  • Examples include neuropathic pain, often caused by nerve cell damage and the massive and uncontrolled neurite outgrowth itself, such as injury, e.g. in amputations, by alcohol abuse, toxic substances, or viral infection of a nerve.
  • Other examples may include shingles, facial rose, trigeminal neuralgia, post laminectomy syndrome, phantom pain, prolonged burning pain after surgery, Alzheimer's disease and diabetes related neuropathic pain and diabetic polyneuropathy, respectively. Alleviation or elimination of the pain is possible by inducing the retraction or withdrawal of aberrant neurites of the affected nerve cells or the neurites of intervening neurons by way of stimulus transmission to the brain. In this case, the heparins or heparin derivatives would exert an agonistic effect on NgR.
  • Diseases or pathological conditions associated with a neurite regeneration disorder or which may be abolished or alleviated by stimulation or enhancement of neurite regeneration include those selected from spinal cord injury, brain injury, traumatic brain injury, stroke, and mechanical condition Central nervous system injury, central nervous system injury due to ischemia, infection-related CNS injury, Parkinson's disease, Huntington's chorea, amyotrophic lateral sclerosis and other motoneuron diseases, Morbus Alzheimer's disease, poliomyelitis, Hirschsprung's disease, paraplegia, diplegia, tetraplegia, infantile neuroaxonal dystrophy (Thatlberg's disease), localized neuroaxonal dystrophy (Hallervorden-Spatz's disease), Waller's degeneration, viral meningitis, bacterial meningitis and axon ischemia. and neurodegenerative diseases such as, in particular, multiple sclerosis, post-polio syndrome, spina bifida, spinal muscular atrophy, tumors such as brain tumor and spinal cord
  • the invention encompasses the preparation of pharmaceutical agents (medicaments) for the treatment of an individual, preferably a mammal, in particular a human, animal or pet.
  • the active compounds or combinations of active substances described above are usually administered in the form of pharmaceutical compositions comprising a pharmaceutically acceptable excipient with at least one active ingredient according to the invention and optionally other active ingredients.
  • These compositions may be administered, for example, by oral, topical, rectal, transdermal, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraperitoneal, intracutaneous or intranasal routes, especially intravenously, subcutaneously or orally.
  • suitable pharmaceutical formulations are solid dosage forms, such as powders, powders, granules, tablets, enteric coated tablets, coat, point and shift tablets, lozenges, chewable tablets, lozenges, sachets, cachets, dragees, capsules, such as hard and soft gelatin capsules, globules, Suppositories or vaginal dosage forms, semi-solid dosage forms, such as ointments, creams, hydrogels, pastes or patches, and liquid dosage forms, such as solutions, emulsions, especially oil-in-water emulsions, suspensions, such as lotions, injection and infusion preparations, eye and Ear drops, nose drops, nasal spray and tinctures.
  • solid dosage forms such as powders, powders, granules, tablets, enteric coated tablets, coat, point and shift tablets, lozenges, chewable tablets, lozenges, sachets, cachets, dragees, capsules, such as hard and soft gelatin capsules, glob
  • Implanted delivery devices may also be used to deliver inhibitors of the invention.
  • liposomes, microspheres or polymer matrices can also be used.
  • Particularly preferred are parenteral dosage forms and those for administration in situ to the site where the action of the heparins and / or heparin derivatives of the invention is to be exhibited.
  • Such dosage forms include in particular infusion or injection solutions containing heparins and / or heparin derivatives, furthermore microcarriers on which heparins and / or heparin derivatives are releasably or covalently immobilized, and implantable depot devices for releasing the heparins and / or heparin derivatives.
  • active compounds or combinations of agents according to the invention are usually mixed or diluted with an excipient.
  • Excipients may be solid, semi-solid or liquid materials which serve as a vehicle, carrier, adsorbent or medium for the active ingredient or drug combinations.
  • Suitable excipients include, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starches, gum acacia, calcium phosphate, alginates, tragacanth, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, cellulose derivatives, e.g. Methylcellulose, water, syrups and methylcellulose.
  • the formulations may include pharmaceutically acceptable carriers or conventional adjuvants such as lubricants, for example, tallow, magnesium stearate and mineral oil; Wetting agents; emulsifying and suspending agents; preservatives such as methyl and propyl hydroxybenzoates; antioxidants; Antiirritatives; chelating agents; coating aids; Emulsion stabilizers film former; gelling agents;
  • Odor masking agents include: skorrigentie ⁇ ; resins; Hydrocolloids; Solvents; Solubilizing agents; Neutralizing agents; permeation; pigments; quaternary ammonium compounds; Refatting and superfatting agents; Ointment, cream or oil bases; Silicone derivatives; spreading aids; stabilizers; Sterilanzien; suppository bases; Tablet excipients such as binders, fillers, lubricants, disintegrants or coatings; Propellant; Desiccant; Opacifiers; Thickener; waxes; plasticizers; Include white oils.
  • a related embodiment is based on expert knowledge, such as in Fiedler, HP, Lexicon of excipients for pharmacy, cosmetics and related fields, 4th edition, Aulendorf: ECV Editio Kantor Verlag, 1996, is shown; See also Hager's Handbook of Pharmaceutical Practice, Springer Verlag, Heidelberg.
  • a pharmaceutical agent comprising a solid dosage form.
  • This solid dosage form has, for example, a total drug content of about 1 to 20 mg, such as. B. 2 to 10 mg, per unit dose and may be in the form of a pill, a tablet, an extrudate or granules.
  • the solid dosage form is e.g. prepared by mixing the active ingredient or combination of active ingredients with the pharmaceutically acceptable carrier and solidifying the mixture to the active ingredient core. This dissolves or disperses the active ingredient or drug combination in an inert liquid, mixes him / her with the carrier and removes the solvent during or after solidification. If appropriate, the drug core can then be provided with an enteric coating before the sugar is coated in the usual way.
  • a suitable dose and a corresponding dosing schedule may be about 0.1 to 50 mg, e.g. 2 to 12 mg, drug or drug combination as defined above and administered 1 to 3 times daily until the desired treatment success is observed.
  • the amount of a pharmaceutical composition of the present invention when administered in situ to the site of action, will ensure an administration concentration of heparins and / or heparin derivatives which will produce the desired pharmacological effect
  • the pharmaceutical composition of the invention may contain other active pharmacological ingredients whose concurrent staggered administration is therapeutically useful.
  • Mez 402 GCCACCATG ⁇ GGATATACAAGGGTGTGATCC (SEQ ID NO: 1); Oligo from amino acid R1055 (italics) with start ATG (underlined) and Kozak sequence (bold)
  • Mez 404 CTTCAGAGAATCAACTAAATCATC (SEQ ID NO: 2); Oligo to amino acid K1120 (bold)
  • cDNA was used as template in frontal cortex (made with Superscript first Strand synthesis System for RT-PCR, Invitrogen, Carlsbad, CA) (Novak et al., Brain Res. Mol. Brain, 2002, 107 (2): 183-189) performed a PCR.
  • the reaction was carried out by standard method, as described by Innis et al. (PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) with Herculase (Stratagene, La JoIIa, USA).
  • the obtained DNA fragment with a size of 207 bp was purified with the QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) according to the manufacturer's instructions.
  • the amplified, purified fragment was in pcDNA3.1V5-His TOPO (SEQ ID NO: 6) (pcDNA3.1 / V5-His TOPO TA Expression Kit, # K4800-01).
  • SEQ ID NO: 6 pcDNA3.1 / V5-His TOPO TA Expression Kit, # K4800-01.
  • E. coli TOP10 cells (Invitrogen, Carlsbad, CA) were isolated by standard methods as described in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor, (1989)). Selection for plasmid-carrying cells was achieved by the antibiotic ampicillin.
  • the Nogo66 coding sequence was excised with XbaI from the above plasmid pcDNA3.1V5-His hNOGO66 and cloned into the plasmid pAP-tag5 (GenHunter Cooperation, Ten, TN, USA) via XbaI.
  • the plasmid pAPtag5 / PPC / hNOGO66 no. 5 is obtained. (SEQ ID NO: 3) shown in Rg. 1a.
  • HEK293 cells were cultured in growth medium (DMEM with 10% fetal bovine serum with the addition of penicillin / streptomycin) at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • growth medium DMEM with 10% fetal bovine serum with the addition of penicillin / streptomycin
  • the cells were seeded in plates with 6 wells (1x 10 6 per Weil) and incubated overnight.
  • Cells were transfected with a cocktail containing 1 ⁇ g of plasmid DNA (pAP-tag5 / PPC / hNOGO66 # 5) and 3 ⁇ l of Fugene® (ROCHE Diagnostics, Mannheim) according to the manufacturer's instructions.
  • a HEK293 clone (clone # 5) producing AP-Nogo66 was propagated in culture medium (RPMI Glutamax + 10% FCS, 150 ⁇ g / ml Zeocin, Antibiotic / Antimycotic) by repeated passage (approximately 20) in culture flasks.
  • the AP-Nogo66 expression was checked after every second or third passage in the Dot Blot Test (with NBT / BCIP reagent).
  • the cells were first cultured to near confluency in triple flasks, then changed to expression medium (Pro293a-CDM medium (Biowhittaker, # 12-764Q), 2 mM glutamine, antibiotic / antimycotic). Subsequently, the cells were cultured for 3 to 4 days at 37 ° C, the supernatants were removed and centrifuged (1500 rpm, 5 min). The supernatants were collected at -8O 0 C.
  • expression medium Pro293a-CDM medium (Biowhittaker, # 12-764Q)
  • 2 mM glutamine 2 mM glutamine
  • antibiotic / antimycotic antibiotic / antimycotic
  • the AP-Nogo66 pool was immunoprecipitated with anti-AP agarose.
  • the precipitate was denatured by heating for 10 minutes at 95 ° C in the presence of 5% mercaptoethanol and thus removed from the agarose beads, finally by West analysis using antibodies specific for AP and Nogo66 (anti-Nogo66 antibody NogoA12A, Alpha Diagnostics International , San Antonio, Texas, USA) (data not shown).
  • Mey 36 GCC ⁇ CCATGGGGGCAGGTGCCACC (SEQ ID NO: 5; oligo with start codon (bold) with Kozak sequence (italic)
  • Mey 35 TCACACIGGGGATGTGGCAG (SEQ ID NO: 4); Oligo with stop codon (bold) a base exchange T instead of C (underlined) since the oligo is derived from the published rat sequence
  • PCR analogous to Nogo 66 cloning, Preparation Example 1 with the primer pair Mey 35/71 in cDNA from the cell line SH-SY5Y (human neuroblastoma cell line ATCC # CRL-2266) was performed. PCR with Mey35 / 71 provided a 1348 bp fragment. This was cleaned.
  • Neomycin start 2596 stop: 3390
  • Plasmid pIRES (Clontech, Palo Alto, USA) (.mu.l 40; 1, 5 h at 37 0 C) with Xba I and Not I (Roche Diagnostics) using a restriction mixture containing 5 ug DNA, 2 ul Xba I 1 2 ul Not I 1 Boil 4 ⁇ l 10x buffer H (Roche) and 32 ⁇ l water. cut: The excised fragment was recovered from a DNA gel in a conventional manner using the Qiagen Gel Extraction Kit.
  • Plasmid pcDNA3.1 hp75 prepared as described above, was treated with Spe I and Not I (Roche Diagnostics) using a restriction assay (40 ⁇ l, 1.5 h at 37 ° C.) containing 5 ⁇ g of DNA, 2 ⁇ l of Spe I 1 2 ⁇ l Not I 1 4 ⁇ l 10x Buffer H (Roche), 32 ⁇ l bidistilled water. The excised fragment was recovered from a DNA gel in a conventional manner using the Qiagen Gel Extraction Kit.
  • pcDNA hNgR CDS1 commercially purchased from RZPD (German Resource Center for Genome Research GmbH, clone No .: IRAL-p962L1427Q2) containing the coding sequence for human Nogo receptor, was prepared using a restriction assay of 13 ⁇ l, 1 h at 37 ° C.) containing 5 ug DNA, 1.5 ul Hind III (Roche), 1, 5 ul 10x buffer B (Roche) and 10 ul water redistilled digested (blunt end). The excised fragment was recovered from a DNA gel in a conventional manner using the Qiagen Gel Extraction Kit.
  • the purified pcDNA h NgR HindIII blunt fragment was then digested with EcoRI using a restriction assay (15 ⁇ l, 1 h at 37 ° C.) containing 10 ⁇ l eluate (from Qiagen Hit clean-up), 1.5 ⁇ l EcoR I (Roche ), 1, 5 ⁇ l 10x Buffer H (Roche) and 2.0 ⁇ l bidistilled water, digested and restriction digested using the Qiagen Gel Extraction Kit from a DNA gel.
  • pIRES hp75 was (prepared as above) (27 .mu.l, 1, 5 h at 37 0 C) with EcoR I and Hind IM using a restriction mixture containing 5 ug DNA, 1, 5 ul of EcoR I,
  • the resulting construct pIRES hNgR hp75 ( Figure 2a, SEQ ID NO: 10) was then transformed into the bacterial strain SuperComp XL2 Blue (Stratagene).
  • the plasmid pOTB7 RhoA (purchased commercially from RZPD, German Research Center for Genome Research GmbH, clone No .: IRAL-p962A174) containing the human RhoA GTPase coding sequence was amplified using the following restriction approach (25 ⁇ l, 1.5 h at 37 0 C) containing 5 ug DNA, 1, 5 ul of EcoR I 1 1, 5 .mu.l Xho I (Roche), 3 .mu.l of double-distilled 1ox buffer H (Roche) and 19 .mu.l of water. digested.
  • pcDNA4 (mycHis) (Invitrogen, Carlsbad, USA) (1 25 .mu.l, 5 h at 37 0 C) was determined using the following restriction mixture containing 5 ug DNA, 1.5 ul EcoR I, 1, 5 ⁇ l Xho I (Roche), 3 ⁇ l 1 ⁇ buffer H (Roche) and 19 ⁇ l bidistilled water. also digested.
  • the preparation is carried out analogously to pcDNA4 (mycHis) A hRhoA wt, but instead of pcDNA4 (mycHis) the above-described plasmid pcDNA3.1V5- His TOPO is used.
  • Neo 2620-3411 amp 4919-5779 compl Production
  • Example 3 Generation of stable recombinant HEK cell lines
  • HEK293 wild-type cells (cultured in RPMI-glutamax + 10% dial FCS + 1% antibiotic-antimycotic) were transfected with the plasmid pIRES hNgR hp75 in a first transfection step.
  • 2 ⁇ g of plasmid DNA in 100 ⁇ l of serum-free RPMI-Gutamax medium and 2 ⁇ 10 6 cells in 12 ⁇ l of LIPOFECTAMINE (Invitrogen) were mixed in culture dishes with 10 wells per batch in 100 ⁇ l of serum-free RPMI-Gutamax medium, and 15 to 20 minutes incubated at room temperature. It was then filled with serum-free medium to a total volume of 1 ml per Trans Stammionsanthesis.
  • Clones were isolated from the dilution giving the first separated clones.
  • Sterile mini-glass cylinders BASF
  • BASF Sterile mini-glass cylinders
  • the end of the mini-glass cylinder wetted with petroleum jelly was carefully placed on the previously selected individual clones.
  • the single clone should be completely enclosed by the mini glass cylinder.
  • 40 ⁇ l of trypsin Gibco, trypsin-EDTA
  • the trypsin was allowed to act on the cells for 1-2 minutes.
  • the cells were resuspended by repeatedly drawing (3-4 times) and dispensing the trypsin with an Eppendorf pipette (sterile tip). The resuspended cells were completely removed from the miniature with the Eppendorf pipette. Transferred glass cylinder into a 24-well plate (tissue culture plate, Falcon, Becton Dickinson, each well containing 1 ml of medium RPMI-glutamax + 5% dialysed FCS).
  • the HEK293 cells were washed with PBS.
  • Adherent cells were detached with PBS 1 containing 5 mM EDTA.
  • 2 ⁇ 10 6 cells were transferred to an Eppendorf tube and centrifuged for 2 minutes at 1300 rpm.
  • the cells were resuspended in PBS containing 1% BSA (1 ml / vial) and centrifuged for 2 minutes at 1300 rpm.
  • pellets were resuspended with 0.1 ml PBS / 1% BSA including primary antibody (mouse anti-human p75 1: 100, or goat anti-human NogoR 1:50) and incubated at 4 ° C for 90 minutes. Then 0.1 ml of PBS / 1% BSA was added, mixed and centrifuged for 2 minutes at 1300 rpm.
  • primary antibody mouse anti-human p75 1: 100, or goat anti-human NogoR 1:50
  • pellets were incubated in PBS containing 1% BSA (0.1 ml / vial) and secondary antibodies (anti-mouse FITC 1: 100 or anti-goat FITC 1: 100); resuspended and incubated at 4 ° C for 60 minutes.
  • BSA 0.1 ml / vial
  • secondary antibodies anti-mouse FITC 1: 100 or anti-goat FITC 1: 100
  • a positive clone (clone 5) of the HEK293 NgR / p75 cell line prepared in accordance with a) is transfected in an analogous manner with the plasmid pcDNA4 (mycHis) A hRhoA.
  • the mixtures were split into RPMI-glutamax (+ 10% dialysed FCS + 1% antibiotic-antimycotic + G418; 800 ⁇ g / ml, + Zeocin (Invitrogen) 125 ⁇ g / ml)
  • RhoA detection a cell homogenate derived from each clone was analyzed by SDS-PAGE gel electrophoresis (NuPAGE polyacrylamide gel 4-12%, 1.5 mm, Invitrogen Carlsbad, USA); the protein samples were denatured with 5% mercaptoethanol)) and tested after immunoblotting with mouse monoclonal anti-RhoA antibody (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) by standard method. A typical result is shown in FIG. 3a. For positive clones, a RhoA band with a molecular weight of about 21 kD is observed.
  • HEK293 wt cells are transfected with the plasmid pcDNA3 hRhoA wt.
  • the samples were split into RPMI-glutamax (+ 10% dialysed.
  • Preparation Example 4 Preparation of His-NogoR fusion protein Basis for the expression and purification of recombinant His-NogoR fusion protein (Genbank: NM_023004) was the stably transfected with the vector "pcDNA4 / hNogoR-TM6" HEK 293 cell line "CHO"
  • the starting point for the production of the NgR-HIS expression plasmid was the cDNA clone pOTB7 IRALp962L1427Q2, which was purchased from RZPD GmbH (Berlin, Germany). From the plasmid DNA was amplified by PCR using the oligonucleotide primers:
  • hNogoR Hind III CCAAGCTTATGAAGAGGGCGTCCGCTGGAGGGAG (SEQ ID NO: 17)
  • hNogoR Eco RI -TM CCGAATTCTAGGGCACCTGAGCCTTCTGAGTCACC (SEQ ID NO: 18)
  • the cDNA was cut with the restriction endonucleases HindIII and EcoR1 and, after renewed gel purification, ligated into the HindIII / EcoRI cut vector pcDNA4 / MycHIS A (Invitrogen, Carlsbad, USA) to become.
  • HindIII / EcoRI cut vector pcDNA4 / MycHIS A Invitrogen, Carlsbad, USA
  • E. coli Top10 One Shot cells Invitrogen, Carlsbad, USA
  • a positive recombinant clone was amplified, the sequence verified and the plasmid DNA isolated with the Plasmid Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
  • the newly formed plasmid vector "pcDNA4 / hNogoR-TM6” was transfected with the transfection reagent "Fugene 6" (Roche, Mannheim, Germany) according to the manufacturer in CHO-K1.
  • the transfection reagent "Fugene 6" (Roche, Mannheim, Germany) according to the manufacturer in CHO-K1.
  • Nogo receptor expression and secretion of the protein in the culture medium was checked in dot blot with anti-HIS specific antibodies (# 1922416, Roche, Mannheim, Germany).
  • the cell clone was propagated under normal cell culture conditions and seeded in a well stack. After 21 days of growth under FCS, the medium was replaced with fresh serum-free medium. After 3 days, 40 liters of serum-free cell culture supernatant were recovered. This supernatant was concentrated to 1 liter using a Fresenius Hemoflow F60 (factor 40). Subsequently, 50 ml of Ni-NTA Superflow Beads (Qiagen, Hilden) preequilibrated with PBS were added to the concentrate and stirred at 4 ° C for 3 hours. The beads were sedimented by switching off the stirrer (overnight at 4 ° C), the supernatant was discarded and the Ni-NTA beads filled into a column.
  • Ni-NTA Superflow Beads Qiagen, Hilden
  • the beads were washed at room temperature with three column volumes of 2M NaM phosphate buffer, 30 mM NaCl pH 8.0. Subsequent washes with 5 column volumes of 2M NaM phosphate buffer, 30 mM NaCl, 1 mM Imidazole pH 8.0.
  • the bound Hexa-His-tagged NgR was eluted with 20 mM Na phosphate buffer, 30 mM NaCl, 10 mM Imidazole pH8.0.
  • the eluate was dialyzed overnight against 25 mM Tris / HCl pH 7.0. The dialysate was added at room temperature to a Q-Sepharose column (Amersham Biosciences, 1.6 x 3 cm, volume 6 ml). Subsequently, the following buffers were used:
  • Buffer A 50 mM Tris / HCl; pH 7.0;
  • Buffer B 50 mM Tris / HCl; 1M NaCl; pH 7.0
  • hNogoR Hind III CC AAGCTT ATGAAGAGGGCGTCCGCTGGAGGGAG
  • hNogoR Eco RI -TM CC GAATTCTAGGGCACCTGAGCCTTCTGAGTCACC (SEQ ID NO: 18)
  • the desired EGFP-encoding nucleotide sequence was amplified initially from the plasmid pEGFP-N3 by means of PCR using the oligonucleotide primers according to SEQ ID NO: 19 and 20. After gel purification with the QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany), the cDNA with the restriction endonucleases Apal and EcoRI cut to be ligated after renewed gel purification in the also Apal / EcoRI cut plasmid psecTAG2A. In this way the plasmid psecEGFP2-6xHIS is obtained.
  • the desired NogoR-encoding nucleotide sequence was amplified from the plasmid pOTB7 by means of PCR using the oligonucleotide primers according to SEQ ID NO: 17 and 18.
  • the cDNA was cut with the restriction endonucleases HindIII and EcoRI in order, after renewed gel purification, to be ligated into the likewise HindIII / EcoRI cut plasmid psecEGFP2-6xHIS.
  • This plasmid vector was transfected with the transfection reagent "Fugene 6" (Roche, Mannheim, Germany) according to the manufacturer's instructions in CHO-K1
  • EGFP-positive single cells were screened according to the "Best FL-1 Signal" criterion using a fluorescence-assisted cell sorter (FACSVantage SE, Becton Dickinson) and as single cells in 96 well
  • the cells were cultured in serum-free medium (analogous to Preparation 4), 10 liters of media supernatant were removed after three days and concentrated to 1, 3 liters. After isolation of the protein via the His component by a Ni-NTA superflow agarose (analogous to Preparation 4) and a Mono-Q anion exchange column, the protein was finally purified by a Superose 12 column and fractionated.
  • Embodiment 1 Binding of AP-Nogo66 to NgR
  • the cells were then resuspended in 0.1 ml PBS / 1% BSA containing 1000 nM competitor (EGFP-NogoR, anti-NogoR antibody, His-Nogo66 or MAG-Fc) (control without competitor) and 30 min at room temperature (RT) incubated. After addition of 0.1 ml of PBS / 1% BSA containing 25 nM AP-Nogo66, incubation was carried out at RT for 45 min. The cell suspension was then centrifuged, the pellet resuspended in PBS / 1% BSA (1 ml / tube) and the suspension centrifuged for 2 min at 1300 rpm.
  • nM competitor EGFP-NogoR, anti-NogoR antibody, His-Nogo66 or MAG-Fc
  • the pellets were then resuspended in 0.1 ml PBS / 1% BSA containing anti-alkaline phosphatase (Sigma A-2951) and incubated at RT for 30 min. After re-centrifugation, the cell pellets were resuspended in PBS / 1% BSA (1 ml / tube) and centrifuged for 2 min at 1300 rpm. The pellets were resuspended in 0.1 ml PBS / 1% BSA containing anti-mouse phycoerythrin (Sigma; P-9287 diluted 1: 100) and incubated at 4 ° C for 30 min.
  • the cell suspension was centrifuged, resuspended in PBS / 1% BSA (1 ml / tube), again 2 centrifuged at 1300 rpm and finally suspended in 1 ml PBS. This suspension was used for FACS analysis (FACScan, Becton Dickinson).
  • NgR occurs in a low-glycosylated and a high-glycosylated form (about 80 kDa and 120 kDa, respectively) (see Preparation Example 4).
  • the low-glycosylated receptor His-NogoRlow was obtained in fractions 4-7 of a Q-Sepharose column in 20 mM NaPi, 140 mM NaCl, pH 7.4 with approximately 90% purity, corresponding to the high-glycosylated receptor His-NogoRhigh in fractions 28-31 with a purity greater than 95%.
  • Microtiter plates (Nunc Maxisorb) were coated with 0.1 ml of 1 ⁇ g / ml His-NogoRlow or His-NogoRhigh in Na carbonate buffer, pH 9, overnight at 4 ° C. After a two-hour blocking step with 2% BSA in Tris-HCl, pH 7.2, at room temperature, 0.1 ml of AP-Nogo66 was added. The AP-Nogo66 stock solution (3 ⁇ g / ml) was diluted with buffer (Tris-HCl with 0.1% BSA, pH 7.2) to the indicated initial concentrations, which were then further diluted twice.
  • buffer Tris-HCl with 0.1% BSA, pH 7.2
  • the microtiter plates were washed with wash buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.2, and 0.05% Tween 20) during each incubation step.
  • wash buffer 10 mM Tris-HCl, pH 7.2, and 0.05% Tween 20
  • the binding of AP-Nogo66 was detected with a fluorescent substrate (AttoPhos, Roche 1 681 982) and the fluorescence units were measured (Polarstar meter, BMG).
  • His-NogoRlow binds better to AP-Nogo66 than His-NogoRhigh.
  • Exemplary embodiment 2 AP-Nogo66 competition test with Clivarin and Arixtra
  • a 2-hour blocking step with 2% bovine serum albumin (BSA) in 20 mM Tris-HCl, pH 7.2) at room temperature was followed by incubation with 0.1 ml of a 4 ⁇ g / ml concentrated NgR-His solution (Preparation Example 4, fraction 4-7, concentration 2.83 mg / ml) in Tris-HCl, pH 7.2 with 0.1% BSA for 90 minutes at room temperature.
  • BSA bovine serum albumin
  • the concentration of AP-Nogo66 was 0.1 nM. This AP-Nogo66 concentration is below the K 0 between AP-Nogo66 and NgR (0.6 nM). After incubation for 90 minutes followed by washing (wash buffer, see above), the NgR (Nogo receptor) -linked AP activity of AP-Nogo66 was detected by addition of the fluorescent substrate AttoPhos prepared according to the manufacturer's instructions (Roche, 1681 982) Measured at room temperature for 15-30 minutes in a microtiter plate reader (Polarstar, BMG) at 440 nm excitation and 560 nm emission wavelengths. The results are shown in Fig. 5 and Fig. 6, wherein the measurement results are given in relative fluorescence units (RFU).
  • REU relative fluorescence units
  • IC 50 value is less than 1 ⁇ M for clivarine and less than 50 ⁇ M for Arixtra.
  • Clivarin is able to completely block the interaction between AP-Nogo66 and NgR.
  • RhoGTPase activation assay To investigate whether the heparin derivatives clivarin or Arixtra (pentasaccharide) induce a comparable cellular signal as that caused by the interaction between Nogo-66 and NgR, or inhibit such a signal, a cellular RhoGTPase activation assay was used.
  • stimulation of the NgR / p75 receptor complex with myelin proteins, such as Nogo-66 activates Rho GTPase, which binds GTP.
  • Rho GTPase in turn activates the serine threonine kinase ROCK (Rho-associated kinase), a specific downstream target of Rho.
  • ROCK serine threonine kinase
  • the activation of ROCK leads to the phosphorylation of several cytoskeletal proteins, which leads to a change of the cell morphology, in particular a cell contraction.
  • Phalloidin Alexa 568 or 488 (dye for fluorescence staining of F-actin, Molecular Probes, Eugene, USA)
  • DAPI Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate Molecular Probes, Eugene, USA
  • Exemplary embodiment 5 Effect of clivarine in neuronal outgrowth experiments To investigate the effect of clivarine in vitro, neural
  • GB5 per liter 26.6 g NaHCO 3, 44.4 g of glucose, sterile filtered.
  • Plating medium (PM) per liter 0.8 mM glutamine, 100 ml heat-inactivated fetal
  • FCS Calf serum
  • EM Maintenance medium per liter: 0.8 mM glutamine, 100 ml heat-inactivated
  • cortical neurons pregnant mice were killed by overstretching, the abdomen was opened, the uterus was removed with the embryos and washed in PBS. The uterus was cut longitudinally with a fine preparation scissors, the embryos were removed and dissected free. The embryos were sacrificed by cervical dissection, the brain removed and the forebrain cortex prepared. The cortices are incubated in each 1 ml of a 0.1% trypsin solution for 5 minutes at 37 C C, the reaction was stopped with maintenance medium (EM) and triturated minutes 5 after incubation in a total of 10 ml of EM with fire-polished Pasteur pipettes of decreasing opening diameter.
  • EM maintenance medium
  • the cell suspension was centrifuged off for 10 minutes at 1200 rpm and the supernatant was filtered off with suction and discarded.
  • the cell pellet was taken up in 8 ml of EM and gently resuspended.
  • the cells were counted in a Neubauer counting chamber, the cell count was adjusted to approximately 500,000 cells / 0.5 ml in EM and pre-aggregated. For this purpose, 200 ⁇ l of the cell suspension per well were placed on glass chamber slides (LabTek, Order No. 177402) and incubated for 24 h at 37 ° C. This forms neuron aggregates.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Modulation des Nogo-Rezeptors. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung eines Wirkstoffs, ausgewählt unter Heparinen und Heparinderivaten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen, die mit einer Störung der Neuriten-Plastizität einhergehen.

Description

Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Modulation des Neuriten- wachstum-kontrollierenden Noqo-Rezeptors.
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Modulation des Nogo-Rezeptors. Die Erfindung betrifft insbesondere die Verwendung von Heparin und Heparinderivaten zur Herstellung von Arzneimitteln zur Beeinflussung aberranter Neuriten-Plastizität sowie weiterhin Verfahren zur Behandlung von Krankheiten oder krankhaften Zuständen, die charakterisiert sind durch aberrante Neuriten-Plastizität .
Hintergrund der Erfindung
Nervenzellen (Neuronen) sind informationsverarbeitende Zellen, die als Rezeptorzellen beispielsweise Reize aus dem Körper oder der Umgebung (Hitze, Kälte, Druck, chemische Reize, usw.) erfassen und in bioelektrische Signale umwandeln, die über nachgeschaltete, weiterleitende Neuronen an das Gehirn geschickt werden. Dort erfolgt eine Wahrnehmung als entsprechende Sinnesempfindung.
Kommt es zu Störungen dieses Prozesses, so können beispielsweise Sinnesempfindungen wahrgenommen werden, für die in der Umwelt keine entsprechende physikalische oder chemische Ursache existiert. Im umgekehrten Fall können Störungen auch dazu führen, dass tatsächlich vorhandene Reize aus dem Körper oder in der Umwelt nicht mehr wahrgenommen werden und dass der menschliche Körper auf äußere Reize nicht mehr oder nur vermindert reagieren kann.
Klinisch wichtige Beispiele für die erstgenannten Störungen sind Phantomschmerzen, bei denen die Betroffenen nach Amputation von Gliedmaßen noch Schmerzempfindungen aus dem gar nicht mehr vorhandenen Körperteil wahrnehmen. Als weitere klinisch wichtige Beispiele sind Neuralgien zu nennen, bei denen Sensibilitätsstörungen von Neuronen zu unbegründeten Schmerzempfinduπgen führen. Auch physiologische Ursachen können Schmerzempfindungen auslösen. Beispielsweise kann bei diabetischer Polyneuropathie der gestörte Zucker- und damit auch der Wasserhaushalt des Patienten zu einer Funktionsveränderung von Neuronen führen, die sich in motorischen Funktionsverlusten, aber auch Schmerzempfindung äußern kann.
Klinisch wichtige Beispiele für die letztgenannten Störungen sind Verletzungen von Neuronen des Zentralen Nervensystems (ZNS), die zu einer Degeneration dieser Zellen und dem Verlust ihrer Funktion führen. Verletzungen des Hirns oder Rückenmarks führen daher - je nach Ausmaß der Schädigung von Neuronen oder deren Neuriten (Axonen) - zu einem teilweisen oder totalen Funktionsverlust der durch diese Nervenzellen vermittelten Sensorik und Motorik. Man spricht dabei vom Krankheitsbild der Querschnittslähmung. In Deutschland sind jährlich etwa 1000 unfallbedingte Querschnittslähmungen (Angaben der Fördergemeinschaft der Querschnittgelähmten) und in den Vereinigten Staaten etwa 10.000 Betroffene zu erwarten (Berkowitz et al. Spinal Cord Injury: An analysis of medical and social costs (Demos Medical New York, 1998)). Angesichts des die Lebensqualität des Betroffenen drastisch einschränkenden Krankheitsbildes besteht ein hoher Bedarf an therapeutischen Mitteln oder therapeutischen Verfahren zur Therapie, d.h. Beseitigung oder zumindest Linderung, des Krankheitszustandes.
Während Nervenzellen des peripheren Nervensystems im Prinzip zur Regeneration nach Verletzung befähigt sind, wurde lange Zeit angenommen, dass dies für
Nervenzellen des ZNS nicht zutrifft. Es wurde bereits früh erkannt, dass die Unfähigkeit von Axonen zur Regeneration durch inhibitorische Faktoren im ZNS bedingt waren
(Ramon y Cajal, Degeneration and regeneration of the nervous System, Hafner, New
York, 1928). In neueren Untersuchungen wurden molekulare Determinanten für diese inhibitorische Wirkung entdeckt. In der Myelinscheide wurden als inhibitorische
Molekeküle das Myelin-assoziierte Glycoprotein (MAG), das Oligodendrozyten-Myelin-
Glycoprotein (OMgp), NogoA (auch als Reticulon-4 bezeichnet) und das IN-1 -Antigen, das höchstwahrscheinlich mit Nogo-A identisch ist, beschrieben (als Übersichtsartikel siehe Lee et al., Nature Reviews (2003) 2, 1-7). Neuere Forschungen befassen sich insbesondere neben Nogo-A auch mit den anderen beiden Liganden des Nogo-
Rezeptors, MAG und OMgp).
Nogo-A ist ein Transmembranprotein, das vorwiegend in Oligodendrozyten des adulten
ZNS von Säugetieren exprimiert wird (als Übersichtsartikel siehe Schwab, Current Opinion in Neurobiology (2004) 14:1 18-124). Nogo-A tritt in Wechselwirkung mit dem Nogo-Rezeptor (NgR)1 einem über Glycosylphosphatidyinositol an die Membran von Neuronen gebundenen Protein, der auch den Rezeptor für die beiden anderen bekannten, von Myelin abgeleiteten Inhibitoren des Neuritenwachstums, MAG und OMgp, darstellt (Liu et al. Science (2002) 297, 1190-1193; Domeniconi et al. Neuron (2002) 35, 283-290; Wang et al. Nature (2002) 417, 941-944). Ein Peptid von Nogo-A aus 66 Aminosäuren, Nogo-66, scheint für die Interaktion mit NgR verantwortlich zu sein und ist ausreichend, um die inhibitorische Wirkung von Nogo-A auf das Wachstum von NgR-aufweisenden Neuriten zu reproduzieren (Foumier et al. Nature (2001) 409, 341-346). Eine Verkürzung von Nogo-66 auf dessen erste 40 Aminosäuren dagegen führt zu einem Verlust der inhibitorischen Wirkung, so dass der durch Nogo-A vermittelte, inhibierende Effekt von Myelin auf das Wachstum von Neuriten aufgehoben werden kann (GrandPre et al. Nature (2002) 417, 547-551 ). Die Signaltransduktion von NgR in das Zellinnere der Nervenzelle ist noch nicht vollständig verstanden. NgR ist selbst nur über einen Lipidanker an die Membran der Nervenzelle gebunden, kann also selbst kein Signal ins Zytoplasma übertragen. Als mögliche Co-Rezeptoren, die nach Wechselwirkung mit NgR für eine Signalübertragung ins Zellinnere verantwortlich sein könnten, wurden der Neurotrophin-Rezeptor p75 (Wang et al. Nature (2002) 420, 74- 78), LINGO-1 (Mi et al. Nature Neurosci. (2004),7, 221-228) sowie der p75 verwandte Rezeptor TROY/TAJ (Park et al. Neuron (2005), 45, 345 - 351 ; Shao et al. Neuron (2005), 45, 353 - 359) beschrieben.
Bisher wurde in mehreren Ansätzen versucht, die Erkenntnisse über die Wechselwirkung von Nogo-A mit NgR für die Regeneration von Neuriten umzusetzen. Neben der bereits erwähnten Reproduzierung des Nogo-A-Effekts (inhibitorische Wirkung auf das Neuritenwachstum) durch Nogo-66 (Foumier et al. Nature (2001 ) 409, 341-346) konnte durch Gabe des 40 Aminosäure langen Fragmentes von Nogo-66, NEP 1-40, bei Ratten auch eine gegenteilige Wirkung, also eine Regeneration nach Rückenmarksverletzung erzielt werden (Lee und Strittmatter J. Neurose Sei. (2003) 23, 4219-4227).
In analoger Weise wurden funktionelle Verbesserungen nach Behandlung von Ratten mit Rückenmarksverletzungen durch Antikörper gegen Nogo-A berichtet (Bregemann et al., Nature (1995) 378, 498-501; Merkler et al., J. Neurosci.. (2001) 21 , 3665-3673; Fiedler et al., Protein Eng. (2002) 15, 931-941 ; Brosamle et al., J. Neurosci.. (2000) 20, 8061-8068). Weiterhin existieren Berichte über eine lösliche Version von NgR1 der mit membrangebundenem NgR um Nogo konkurriert und auf diese Weise die durch Nogo vermittelte Inhibition des Neuritenwachstums blockiert. Bei Kenntnis der molekularbiologischen und biochemischen Wechselwirkungen sollte es somit möglich sein, sowohl die Neuritendegeneration als auch die Neuritenregeneration gezielt zu beeinflussen.
Bisher stellen jedoch alle Versuche, in das vorstehend beschriebene System der Wechselwirkung zwischen Nogo und NgR einzugreifen, auf Peptid- beziehungsweise Proteinansätze ab, sei es durch Verwendung von Nogo-abgeleiteten Peptiden, die an NgR binden, durch Antikörper gegen Nogo-A, die eine Wechselwirkung zwischen Nogo-A und NgR verhindern, oder durch lösliche Formen von NgR, die wiederum mit Membran-gebundenem NgR konkurrieren. Obwohl die Möglichkeit kleiner, nicht- peptidischer Moleküle zur Blockierung von NgR gegenüber den drei bekannten Liganden Nogo, MAG und OMgp diskutiert wurde, liegen noch keine Berichte über solche Moleküle vor (Lee et al., Nature Reviews (2003) 2, 1-7).
Die Wechselwirkung von Heparinen und sulfatierten Heparinderivaten mit einer Vielzahl von Proteinen und deren Bedeutung für die Gehirnentwicklung wurde vor kurzem gezeigt (Inatani et al. Science (2003), 302, 1044-1046; Bülow und Hobert, Neuron (2004), 41 , 723-746). Die Wechselwirkung von Heparinen, Heparansulfat und verwandten Verbindungen mit Zelladhäsionsmolekülen, Wachstumsfaktoren, Chemokinen und Proteasen ist bekannt (Capila und Linhardt, Angewandte Chemie (2002) 114, 426-450) und ihre Wirkungen auf wachsende Nervenfasern während der Embryonalentwicklung des Nervensystems ist gut dokumentiert. Ein Einfluss auf die Regeneration des menschlichen Nervensystems nach Verletzung oder auf das aberrante Neuritenwachstum als Reaktion auf Verletzung oder Schädigung ist jedoch nicht bekannt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zu Grunde, neue Wirkstoffklassen zu finden und insbesondere nicht-peptidische Wirkstoffe bereitzustellen, durch welche die Wirkung des NgR, in Wechselwirkung mit seinem NogoA-Liganden oder den anderen beiden beschriebenen Liganden MAG und OMgp, moduliert werden kann.
Kurzfassung der Erfindung Die Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Heparinen und Heparinderivaten, für die überraschenderweise ein Einfluss auf die Wechselwirkung zwischen Nogo-A und NgR gefunden wurde. Erfindungsgemäß wurde nämlich überraschenderweise festgestellt dass Heparine und Heparinderivate zur Wechselwirkung mit NgR befähigt sind.
Gegenstand der Erfindung ist daher Verwendung eines Wirkstoffs, ausgewählt unter Heparinen und Heparinderivaten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen, die mit Störungen des Neuritenwachstums, der Neuriten-Regeneration sowie der Neuriten-Plastizität einhergehen, wobei der Wirkstoff insbesondere die Interaktion zwischen dem Nogo- Rezeptor und dessen Liganden AP-Nogo66 moduliert. Bei Medikamenten zur Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen, die mit Störungen der Neuriten-Plastizität einhergehen, fungiert das Heparin oder Heparinderivat insbesondere als Agonist des NgR.
Insbesondere beobachtete man erfindungsgemäß eine Blockierung dieser Wechselwirkung, wobei eine Blockierung mit einem IC50-Wert von höchstens 100 μM, wie z.B. 0,01 bis 80 oder 0,1 bis 70, oder 1 bis 50 oder 5 bis 30 μM, erfolgt.
Durch die Wechselwirkung wird insbesondere eine Aktivierung des NgR erzielt. Dadurch wird insbesondere eine Blockierung von Nervenfasern erzielt, beispielsweise eine Kollabierung von Nervenfasern oder ein Kollaps von Wachstumskegeln.
Bevorzugte Wirkstoffe modulieren, insbesondere induzieren, in einem Aktin- Cytoskelett-Umformungs (ACR) -Test eine Zellkontraktion mit einem IC50-Wert von höchstens 100 μM, wie z.B. höchstens etwa 60 μM oder höchstens etwa 40 μM oder höchstens etwa 20 μM, wie z.B. mit einem IC50-Wert im Bereich von etwa 0,01 bis 80 oder 0,1 bis 70, oder 1 bis 50 oder 5 bis 30 μM.
Bevorzugte Wirkstoffe modulieren das Auswachsen von Neuriten in neuronaler Zellkultur mit einem IC50-Wert von höchstens etwa 1000 μM wie z.B. 0,01 bis 800 oder 0,1 bis 700, oder 1 bis 500 oder 5 bis 300 μM oder 5 bis 200, 5 bis 100 oder 5 bis 50 μM, wobei in diesem Zusammenhang unter der Modulierung des Auswachsens von Neuriten insbesondere eine Hemmung des Auswachsens zu verstehen ist. Vorzugsweise werden erfindungsgemäß Wirkstoffe mit einer Molekülmasse von mindestens etwa 500 Da, wie z.B. etwa 1000 bis 10000 Da1 oder 1500 bis 6000 Da oder 4000 bis 5000 Da, oder Gemische davon eingesetzt, wobei die mittlere Molekülmasse dann in einem der angegebenen Bereiche liegen kann..
Als nichtlimitierende Beispiele für brauchbare Wirkstoffe oder Wirkstoffgemische sind zu nennen: Clivarin, Arixtra sowie Heparinoide, die Di-, Tetra- und Hexasaccharidfragmenten umfassen.
Ein erfindungsgemäß bereitgestelltes Medikament kann dabei ein oder mehrere Heparine oder Heparinderivate, gegebenenfalls in Form physiologisch verträglicher Salze oder Solvate, und gegebenenfalls einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger oder Exzipienten enthalten.
Gegenstand der Erfindung ist insbesondere die Verwendung der oben bezeichneten Wirkstoffe zur Behandlung von Krankheitszuständen, wobei diese Zustände mit einer Störung der Neuriten-Plastizität einhergehen, und insbesondere ausgewählt sind unter neuropathischem Schmerz, Gürtelrose, Gesichtsrose, Trigeminusneuralgie, Postlaminektomiesyndrom, Phantomschmerz, anhaltendem brennendem Schmerz nach Operation und diabetischer Polyneuropathie.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt den schematischen Aufbau des Plasmids pAP-tag5/PPC/hNOGO66Nr.5 (Fig. 1a) und des Plasmids psec hNogoR 27-450 EGFP 6xHIS Apa (Fig. 1b).
Fig. 2 zeigt den schematischen Aufbau der Plasmide pIRES/hNOGO R/hp75 (Fig. 2a), pcDNA3 hRhoA wt (Fig. 2b), PcDNA4 (mycHis)A h RhoA wt (Fig. 2c) und pcDNA3.1 (V5-His) hp75 Nr.16 (Fig. 2d).
Fig. 3a zeigt den immunologischen Nachweis von exprimiertem RhoA durch erfindungsgemäß isolierte positive Klone (#1 bis #8) der Tripletransfektante HEK293 RhoA/NgR/p75, wobei Zellhomogenisate der mit Nummern (#) bezeichneten Klone (Klone 1 bis 9) über SDS-PAGE getrennt und über Immunoblotting mit monoklonalem Maus-anti-RhoA Antikörper getestet wurden. Positive Kontrolle (C) erhalten durch transiente Transfektion mit 100 ng pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt; als Marker (M) wurde verwendet: Benchmark Prestain Protein Ladder, Invitrogen, Bestellnummer #10748- 010.
Fig. 3b zeigt das Ergebnis einer FACS-Analyse von exprimierten Zelloberflächenrezeptoren hNgR und hp75 einer erfindungsgemäß hergestellten HEK293-Tripletransfektante (Klon #4 und #8) sowie von nichttransformierten HEK293- Zellen (oben), jeweils für Analysen mit Anti-p75- bzw. Anti-NgR- Antikörpern.
Fig. 4 zeigt die Bindung von AP-Nogo66 an Mikrotiterplatten, die entweder mit niedrigglykosyliertem oder hochglykosyliertem His-NogoRezeptor (His-NogoRlow oder His-NogoRhigh) beschichtet sind. Die Bindung ist in relativen Fluoreszenteinheiten (RFU) nach Messung mit einem fluorogenen Substrat ausgedrückt
Fig. 5 zeigt die Kompetition der Bindung von AP-Nogo66 an NogoR-beschichtete Platten durch Clivarin (geschlossene Rauten) oder Arixtra (offene Rauten).
Fig. 6 zeigt die Kompetition der Bindung von AP-Nogo66 an NogoR-beschichtete Platten durch Clivarin (geschlossene Rauten).
Fig. 7 zeigt die Wirkung von Clivarin auf die Zellkontraktion im ACR-Assay mit HEK/Rho/NgR/p75-Zellen
Fig. 8 zeigt die Wirkung des Pentasaccharids Arixtra auf die Zellkontraktion im ACR- Assay mit HEK293Rho/NgR/p75-Zellen
Fig. 9 zeigt die Wirkung von Clivarin auf das Auswachsen von Neuriten kortikaler Neurone der Maus in der Zellkultur (obere Reihe von links nach rechts: kein Clivarin, 10 μM und 30 μM Clivarin; untere Reihe: 100 μM und 300 μM Clivarin). Fig. 10 zeigt in einer Detailansicht die Wirkung von Clivarin auf das Auswachsen von Neuriten kortikaler Neurone der Maus in Zellkultur (links: ohne Clivarin, rechts: 300 μM Clivarin).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
a) Allgemeine Begriffe
Ein erfindungsgemäß brauchbarer „Wirkstoff' umfasst wenigstens ein Heparin, Heparinderivat oder Heparinoid.
Eine „Störung der Neuriten-Plastizität" betrifft erfindungsgemäß einen pathologischen Zustand, bei dem man ein vermehrtes, unkontrolliertes, ungerichtetes und/oder exzessives Neuritenwachstum bzw. Auswachsen oder Aussprossen von Neuriten bei einem Säuger beobachtet. Dieser Zustand ist definiert durch falsch wachsende Neuriten, die synaptische, häufig dauerhafte, Fehlverschaltungen eingehen, welche wiederum physische und psychische Konsequenzen haben. Solche Fehlverschaltungen können z.B. Ursache sein für das Auftreten von aberranten Funktionen, wie z.B. von neuropathischem Schmerz (Tang et al.J. Neurosci. (2004), 24, 819 - 827), epileptischen Anfällen als Folge von Hirnverletzungen (Chuckowree et al. Neuroscientist (2004), 10, 280 - 285) und von Phantomsensationen.
Eine „Störung des Neuriten-Wachstums" betrifft erfindungsgemäß einen als Reaktion auf eine Verletzung oder Schädigung im Nervensystem eines Säugers auftretenden pathologischen Zustand, bei dem man ein ungenügendes Neuritenwachstum oder ein nicht ausreichendes neuronales Aussprossen beobachtet oder der definiert ist durch ein teilweises oder vollständiges Versagen der Reparatur d.h. der Neuriten- Regeneration durchtrennter, geschädigter neuronaler Verbindungen mit der Konsequenz eines teilweisen oder vollständigen, häufig irreversiblen Funktionsausfalls, wie z.B. das Auftreten einer Querschnittslähmung als Folge einer Rückenmarksverletzung.
Eine „Behandlung" oder „Therapie" kann erfindungsgemäß akut , prophylaktisch und chronisch erfolgen. Ein Krankheitszustand kann aufgrund einer erfindungsgemäß vorgeschlagenen Therapie vollständig beseitigt oder gelindert werden. b) Erfindungsgemäße Wirkstoffe
Der Begriff „Heparin" beschreibt eine Gruppe sulfatierter/sulfonierter Mucopolysaccharide, die auch als Glycosaminoglycane bezeichnet werden. Heparinmoleküle bestehen aus üblicherweise unverzweigten Ketten von sulfatierten Saccharidbausteinen, die vor allem Glucosamin, Glucuronsäure und Iduronsäure enthalten und ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 500 bis 50000, wie z.B. etwa 1000 bis 10000 Da, oder 1500 bis 6000 Da oder 4000 bis 5000 Da, aufweisen. Strukturell sind Heparine gekennzeichnet durch Disaccharid-Einheiten aus α-1 ,4- glycosidisch verknüpften D-Glucosamin- und L-Iduronsäure-Einheiten sowie durch Disaccharid-Einheiten aus α-1 ,4-glycosidisch verknüpften D-Glucosamin- und D- Glucuronsäure-Einheiten. Sowohl die Stellung als auch die Anzahl der Sulfatgruppen (Sulfongruppen) ist variabel. Diese können sowohl über Sauerstoff (O-sulfatiert) als auch über Stickstoff (N-sulfatiert) gebunden sein. Häufig sind Iduronsäurereste 2-O- sulfatiert, Glucosaminreste N-sulfatiert und gegebenenfalls auch 6-O-sulfatiert. Glucuronsäurereste hingegen sind häufig nicht sulfatiert. Die Disaccharid-Einheiten sind wiederum α-1 ,4-glycosidisch miteinander zu Heparinmolekülen verbunden. Die Anzahl und Anordnung dieser Disaccharid-Einheiten kann ebenfalls variieren, so dass der Begriff Heparin eine Vielzahl strukturell unterschiedlicher Moleküle beschreibt, die beispielsweise elementaranalytsisch oder anhand ihrer Kettenlänge, ihres Molekulargewichts oder ihrer Ladung unterschieden werden können.
Dem Fachmann sind Heparine gut bekannt, Beschreibungen finden sich beispielsweise in Capila und Linhardt (Angew. Chemie 2002, 114, 426-450) und in Bruchhausen, Dannhardt, Ebel, Frahm, Hackenthal, Holzgrabe (Hrsg), Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Band 8, Springer- Verlag, Berlin Heidelberg, 5. Aufl., 1993.
Unter „Heparinderivaten" werden erfindungsgemäß durch chemische oder enzymatische Modifizierung von Heparinen erhaltene Substanzen verstanden. Der Begriff umfasst insbesondere auch Substanzen mit niedrigeren mittleren Molekulargewichten im Vergleich zu natürlich vorkommenden Heparinen. Solche Heparinderivate mit niedrigem Molekulargewicht können beispielsweise durch chemische oder enzymatische Spaltung von Heparinen oder durch chemische Synthese erhalten werden. Zusätzlich können Heparinderivate am ihren funktionalen Sulfat- und /oder Sulfonat-Seitengruppen derivatisiert sein, und/oder eine oder mehrere C-C-Doppelbindungen in ihren Kohlehydratbausteinen aufweisen. Derivate umfassen außerdem Salze, insbesondere physiologisch verträgliche Salze, von Heparinen, wie insbesondere Alkali- und Erdalkalimetallsalze, wie Natrium-, Calcium-, Magnesiumoder Bariumsalze.
Der Begriff „Heparinoide" beschreibt eine Gruppe von Substanzen mit heparinartiger Wirkung, d.h. Heparinoide hemmen die Blutgerinnung und die Entstehung von Thrombosen. Hierzu gehören beispielsweise pflanzliche Oligo- und Polysaccharide, z.B. aus Alginsäure, Pektinen, Xylanen, Stärken und Dextranen hergestellte Polysulfate oder sulfatierte tierische Glykosaminglykane. Insbesondere zu nennen sind Pentosanpolysulfate, z.B. Natriumpentosansulfonat, Xylansulfate, z.B. ß-1-4-D-Xylan- 2,3-bis(hydrogensulfant), Xylanpoly(hydrogensulfat) sowie Natriumsalze davon, Dextransulfate, Chitinsulfate, Chondroitinpolysulfate, auch
Mucopolysaccharidpolyschwefelsäureester genannt, Polyvinylsulfonsäuren, auch Polyethylensulfonsäuren genannt, z.B. Natriumapolat,
Plygalacturonsäuresulfat(methylestermethyglucosid), Alginatsulfate, z.B.
Natriulginatsulfat und Polymannuronsäuresulfat. Heparinoide können entweder aus natürlichen Quellen gewonnen werden, oder sie werden semi- oder vollsynthetisch hergestellt, üblicherweise indem man die zuvor genannten pflanzlichen oder tierischen Polysaccharide sulfatiert, beispielsweise mit Chlorsulfonsäure umsetzt und freiwerdende Chlorwasserstoffsäure mit Basen neutralisiert.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind niedermolekulare Heparine bevorzugt, wobei darunter solche mit einer durchschnittlichen Molmasse von weniger als 10.000 verstanden werden sollen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind unter Angaben der Molmasse oder des Molekulargewichts insbesondere Dalton zu verstehen. Niedermolekulare Heparine umfassen insbesondere die unter der Bezeichnungen „Heparinfragment 4-6", „Heparinfragment 4,5-8" und „Heparinfraktion" mit durchschnittlichen Molmassen von 4000 bis 6000, 4500 bis 8000 bzw. 4000 bis 5000 bekannten Heparinfragmente. Niedermolekulare Heparine können beispielsweise durch Fraktionierung natürlich vorkommender Heparine oder durch chemische oder enzymatische Spaltung von Heparin gewonnen werden.
Ganz besonders bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die unter den Handelsnamen Clivarin® (Heparinfragment mit einem mittleren Molekulargewicht ca. 3150 bis 5150, erhältlich durch Nitrilspaltung von Schweinedarmmukosa, Abbott GmbH & Co. KG) und Arixtra® (Pentasaccharid mit einem Molekulargewicht von ca 1750, Sanofi-Synthelabo) bekannten niedermolekularen Heparinderivate.
Im Allgemeinen werden erfindungsgemäß, gegebenenfalls modifizierte, Heparine natürlichen Ursprungs verabreicht. Heparine aus der Lunge, Leber oder Darmschleimhaut von Rindern oder aus Schweinen sind brauchbar, wobei Heparine aus Schweinedarmmucosa und aus Rinderlunge häufig verwendet werden.
Zusätzlich zu den konkret genannten, erfindungsgemäß brauchbaren Heparin- Wirkstoffen kann der Fachmann unter Befolgung der erfindungsgemäßen Lehre ohne unzumutbaren Aufwand weitere geeignete Wirkstoffe ermitteln. Er kann sich dabei der verschiedenen hierin beschriebenen Testmethoden bedienen, die eine Charakterisierung potentieller Wirkstoffkandidaten ermöglichen. Insbesondere sei auf die im Experimentellen Teil näher erläuterten Testsystem, wie NgR-Plattentest, ACR- Assay und Neuronaler Zellkulturtest verwiesen.
Beispiele für IC50-Werte von Clivarin und Arixtra in verschiedenen Assays sind in folgender Tabelle zusammengefasst:
Figure imgf000012_0001
c) Erfindungsgemäß beobachtete Wechselwirkungen von Wirkstoffen
Anhand der niedrigmolekularen Heparinderivate Clivarin (Molekulargewicht ca. 4500) und Arixtra (Pentasaccharid mit einem Molekulargewicht von ca 1750) wurde erfindungsgemäß gezeigt, dass diese an NgR binden können. Dabei wurde bestätigt, dass diese Bindung mit der Bindung von Nogo66 an NgR konkurriert, obwohl Heparine und Heparinderivate im Vergleich zu Nogo als dem natürlichen Liganden von NgR völlig unterschiedliche Molekülarten darstellen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Clivarin und Arixtra den gleichen Effekt auslösen wie Nogo66, d.h. eine Hemmung des Neuritenwachstums.
Heparine und Heparinderivate sind erfindungsgemäß folglich für die Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen brauchbar, die mit einer Störung der Neuriten-Degeneration einhergehen, bzw. zur Herstellung von Medikamenten für eine solche Behandlung.
d) Erfindungsgemäße therapeutische Ansätze
Krankheiten oder pathologische Zustände, die erfindungsgemäß mit Medikamenten auf der Basis von Heparinen oder Heparinderivaten behandelt werden können, umfassen solche, die zu massivem Neuritenwachstum führen und die durch oder durch Induktion einer Neuriten-Wachstumshemmung aufgehoben oder gelindert werden können (Tang et al.J. Neurosci. (2004), 24, 819 - 827). Beispiele hierfür sind neuropathische Schmerzen, die oft durch Schädigung von Nervenzellen und das dadurch ausgelöste massive und unkontrollierte Neuritenwachstum selbst auftreten, etwa durch Verletzungen, z.B. bei Amputationen, durch Alkoholmissbrauch, giftige Substanzen, oder Virusinfektion eines Nerven. Als weitere Beispiele können Gürtelrose, Gesichtsrose, Trigeminusneuralgie, Postlaminektomiesyndrom, Phantomschmerz, anhaltender brennender Schmerz nach Operation, Morbus Alzheimer und durch Diabetes bedingter neuropatischer Schmerz bzw. diabetische Polyneuropathie genannt werden. Eine Linderung oder Beseitigung der Schmerzen ist durch Induktion des Einziehens oder des Zurückziehens von aberranten Neuriten der betroffenen Nervenzellen oder der Neuriten zwischengeschalteter Nervenzellen auf dem Weg der Reizweiterleitung in das Gehirn möglich. In diesem Fall würden die Heparine oder Heparinderivate eine agonistische Wirkung auf NgR ausüben.
Krankheiten oder pathologische Zustände, die mit einer Störung der Neuriten- Regeneration einhergehen oder durch Stimulierung oder Steigerung einer Neuriten- Regeneration aufgehoben oder gelindert werden können, umfassen solche, die ausgewählt sind unter Rückenmarksverletzung, Hirnverletzung, Schädel-Hirn- Trauma, Schlaganfall, mechanisch bedingter Verletzung des Zentralnervensystems, ischämisch bedingter Verletzung des Zentralnervensystems, infektionsbedingter Verletzung des Zentralnervensystems, Morbus Parkinson, Chorea Huntington, amyotropher Lateralsklerose und anderen Motoneuronenerkrankungen, Morbus Alzheimer, Poliomyelitis, Hirschsprung's Krankheit, Paraplegie, Diplegie, Tetraplegie, infantiler neuroaxonaler Dystrophie (Seitelberg-Krankheit), lokalisierter neuroaxonaler Dystrophie (Hallervorden-Spatz-Krankheit), Waller-Degeneration, viraler Meningitis, bakterieller Meningitis und Axon-Ischämie. und neurodegenerativen Erkrankungen, wie insbesondere Multiple Sklerose, post-Polio Syndrom, Spina bifida, spinale Muskelatrophie, Tumoren , wie Hirntumor und Rückenmarkstumor, und transverser Myelitis.
e) Erfindungsgemäße Formulierungen/Medikamente
Die Erfindung umfasst die Herstellung pharmazeutischer Mittel (Arzneimittel) zur Behandlung eines Individuums, vorzugsweise eines Säugers, insbesondere eines Menschen, Nutz- oder Haustieres. So werden die oben beschriebenen Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen gewöhnlich in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht, die einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Wirkstoff und gegebenenfalls weitere Wirkstoffe umfassen. Diese Zusammensetzungen können beispielsweise auf oralem, lokalem, rektalem, transdermalem, subkutanem, intravenösem, intramuskulärem, intraperitonealem, intrakutanem oder intranasalem Weg, insbesondere intravenös, subkutan oder oral verabreicht werden.
Beispiele geeigneter pharmazeutischer Formulierungen sind feste Arzneiformen, wie Pulver, Puder, Granulate, Tabletten, magensaftresistente überzogene Tabletten, Mantel-, Punkt- und Schichttabletten, Pastillen, Kautabletten, Lutschtabletten, Sachets, Cachets, Dragees, Kapseln wie Hart- und Weichgelatinekapseln, Globuli, Suppositorien oder vaginale Arzneiformen, halbfeste Arzneiformen, wie Salben, Cremes, Hydrogele, Pasten oder Pflaster, sowie flüssige Arzneiformen, wie Lösungen, Emulsionen, insbesondere ÖI-in-Wasser-Emulsionen, Suspensionen, beispielsweise Lotionen, Injektions- und Infusionszubereitungen, Augen- und Ohrentropfen, Nasentropfen, Nasenspray und Tinkturen. Auch implantierte Abgabevorrichtungen können zur Verabreichung erfindungsgemäßer Inhibitoren verwendet werden. Ferner können auch Liposomen, Mikrosphären oder Polymermatrizes zur Anwendung kommen. Besonders bevorzugt sind parenterale Dosierungsformen und solche zur Verabreichung in situ an den Ort, an dem die Wirkung der erfindungsgemäßen Heparine und/oder Heparinderivate entfaltet werden soll. Solche Dosierungsformen umfassen insbesondere Heparine und/oder Heparinderivate enthaltende Infusions- oder Injektionslösungen, weiterhin Mikroträger, auf denen Heparine und/oder Heparinderivate freisetzbar oder kovalent immobilisiert sind, sowie implantierbare Depotvorrichtungen zur Freisetzung der Heparine und/oder Heparinderivate.
Bei der Herstellung der Zusammensetzungen werden erfindungsgemäße Wirkstoffe oder Wirkstoffkombinationen gewöhnlich mit einem Exzipienten vermischt oder verdünnt. Exzipienten können feste, halbfeste oder flüssige Materialien sein, die als Vehikel, Träger, Adsorbens oder Medium für den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombinationen dienen.
Zu geeigneten Exzipienten gehören beispielsweise Lactose, Dextrose, Succrose, Sorbitol, Mannitol, Stärken, Akaziengummi, Calciumphosphat, Alginate, Traganth, Gelantine, Calciumsilikat, mikrokristalline Cellulose, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose, Cellulosederivate, wie z.B. Methylcellulose, Wasser, Sirupe und Methylcellulose. Ferner können die Formulierungen pharmazeutisch akzeptable Träger oder übliche Hilfsstoffe, wie Gleitmittel, beispielsweise Talg, Magnesiumstearat und Mineralöl; Netzmittel; emulgierende und suspendierende Mittel; konservierende Mittel, wie Methyl- und Propylhydroxybenzoate; Antioxidantien; Antireizstoffe; Chelatbildner; Dragierhilfsmittel; Emulsionsstabilisatoren Filmbildner; Gelbildner;
Geruchsmaskierungsmittel; Geschmackskorrigentieπ; Harze; Hydrokolloide; Lösemittel; Lösungsvermittler; Neutralisierungsmittel; Permeationsbeschleuniger; Pigmente; quaternäre Ammoniumverbindungen; Rückfettungs- und Überfettungsmittel; Salben-, Creme- oder Öl-Grundstoffe; Silikon-Derivate; Spreithilfsmittel; Stabilisatoren; Sterilanzien; Suppositoriengrundlagen; Tabletten-Hilfsstoffe, wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Sprengmittel oder Überzüge; Treibmittel; Trocknungsmittel; Trübungsmittel; Verdickungsmittel; Wachse; Weichmacher; Weißöle umfassen.
Eine diesbezügliche Ausgestaltung beruht auf fachmännischem Wissen, wie beispielsweise in Fiedler, H. P., Lexikon der Hilfsstoffe für Pharmazie, Kosmetik und angrenzende Gebiete, 4. Auflage, Aulendorf: ECV-Editio-Kantor- Verlag, 1996, dargestellt ist; vgl auch Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, Springer Verlag, Heidelberg.
In einer Ausführungsform wird beispielsweise ein pharmazeutisches Mittel bereitgestellt, das eine feste Dosierungsform umfasst. Diese feste Dosierungsform hat beispielsweise einem Gesamt-Wirkstoffgehalt von etwa 1 bis 20 mg, wie z. B. 2 bis 10 mg, je Dosiseinheit und kann in Form einer Pille, einer Tablette, eines Extrudats oder eines Granulat vorliegen.
Die feste Dosierungsform wird z.B. hergestellt, indem man den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination mit dem pharmazeutisch verträglichen Träger mischt und die Mischung zum Wirkstoffkern verfestigt. Dabei löst oder dispergiert man den Wirkstoff oder die Wirkstoffkombination in einer inerten Flüssigkeit, mischt ihn/sie mit dem Träger und entfernt das Lösungsmittel während oder nach der Verfestigung. Den Wirkstoffkern kann man dann gegebenenfalls mit einem magensaftresistenten Überzug versehen, bevor man den Kern in üblicher Weise dragiert.
Art und Dauer der Verabreichung der erfindungsgemäßen Arzneimittel obliegen der Entscheidung des behandelnden Arztes. Dieser kann in Abhängigkeit vom gewählten Verabreichungsweg, von der Wirksamkeit der konkreten Wirkstoffzusammensetzung, der Art und Schwere der zu behandelnden Erkrankung, vom Befinden des Patienten und von dessen Ansprechen auf die Therapie eine geeignete Dosis und einen entsprechenden Dosierungsplan festlegen. Beispielsweise kann eine geeignete Einzeldosis etwa 0,1 bis 50 mg, wie z.B. 2 bis 12 mg, Wirkstoff oder Wirkstoffkombination gemäß obiger Definition enthalten und 1 bis 3-mal täglich verabreicht werden, bis der gewünschte Behandlungserfolg zu beobachten ist.
Typischerweise wird die Menge einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung bei in situ-Verabreichung an den Wirkungsort eine Verabreichungskonzentration an Heparinen und/oder Heparinderivaten sicherstellen, welche den gewünschten pharmakologischen Effekt bewirkt
Falls für bestimmte Therapien erforderlich, kann die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung weitere aktive pharmakologische Bestandteile umfassen, deren gleichzeitige der zeitlich versetzte Verabreichung therapeutisch nützlich ist.
Die Erfindung wird nachfolgend durch nachfolgende nicht-limitierende Beispiele näher erläutert.
Experimenteller Teil
I. Herstellungsbeispiele
Herstellungsbeispiel 1 : Herstellung von AP-Nogo66 (Nogo-66, enthaltend ein N- terminales alkalische Phosphatase-Tag):
a) Klonierung des Nogo66 Fragments von hNogoA
Es wurde ausgegangen von der publizierten hNogoA Sequenz (NCBI): AF148537. Die beiden folgenden synthetischen Oligonukleotide wurden von der publizierten Sequenz abgeleitet:
Mez 402: GCCACCATGΛGGATATACAAGGGTGTGATCC (SEQ ID NO:1 ); Oligo ab Aminosäure R1055 (kursiv) mit Start ATG (unterstrichen) und Kozak Sequenz (fett)
Mez 404: CTTCAGAGAATCAACTAAATCATC (SEQ ID NO:2); Oligo bis Aminosäure K1120 (fett)
Mit diesen beiden Oligos wurde in frontal cortex cDNA als Template (hergestellt mit Superscript first Strand synthesis System for RT-PCR; Invitrogen, Carlsbad, CA) (Novak et al., Brain Res. Mol. Brain, 2002, 107(2): 183-189) eine PCR durchgeführt. Die Reaktion wurde nach Standardmethode, wie Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) mit Herculase (Stratagene, La JoIIa, USA), durchgeführt. Das erhaltene DNA Fragment mit einer Grosse von 207 bp wurde mit dem QIAEX Il Gel Extraction Kit (QIAGEN GmbH, Hilden, Germany) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das amplifizierte, gereinigte Fragment wurde in pcDNA3.1V5-His TOPO (SEQ ID NO:6) (pcDNA3.1/V5-His TOPO TA Expression Kit, #K4800-01 ) gesetzt. Mit dem so erhaltenen Konstrukt pcDNA3.1V5-His hNOGO66 wurden E. coli TOP10 Zellen (Invitrogen, Carlsbad, CA) nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor, (1989)) beschrieben transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Antibiotikum Ampicillin erreicht.
Die Identifikation von neun Klonen mittels PCR zeigte bei drei Klonen eine Bande in der richtigen Größe von 207 bp. Die Richtigkeit der Sequenz wurde mittels Sequenzanalyse überprüft.
Die kodierende Nogo66-Sequenz wurde mit Xbal aus obigem Plasmid pcDNA3.1V5- His hNOGO66 herausgeschnitten und in das Plasmid pAP-tag5 (GenHunter Cooperation, Nashville, TN, USA) über Xbal einkloniert. Man erhält das Plasmid pAP- tag5/PPC/hNOGO66 Nr.5. (SEQ ID NO:3) dargestellt in Rg. 1a.
b) Herstellung der stabilen Zelllinie:
HEK293 Zellen wurden in Wachstumsmedium (DMEM mit 10% fötalem Rinderserum unter Zusatz von Penicillin/Streptomycin) bei 37°C und 5% CO2 kultiviert. Für die Transfektion wurden die Zellen in Platten mit 6 Wells (1x 106 pro Weil) ausgesät und über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden mit einem Cocktail, der 1 μg Plasmid DNA (pAP-tag5/PPC/hNOGO66 Nr.5) und 3μl Fugeneθ (ROCHE Diagnostics, Mannheim) enthielt, nach Angaben der Herstellers transfiziert. Zwei Tage später wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin abgelöst, in eine Zellkulturflasche mit 175cm2 Grundfläche überführt und die Selektion durch Zugabe von 150μg/ml Zeocin in Wachstumsmedium gestartet. Heranwachsende Zeocin-resistente Zellkolonien wurden nach etwa 4 Wochen mit Trypsin abgelöst und mit einem Zellsorter in 96-well Platten vereinzelt. Nach etwa drei Wochen wurde ein Aliqout des Mediumüberstands der herangewachsenen Einzellzellkolonien, deren Konfluenz zu diesem Zeitpunkt zwischen 5 und 85% abgeschätzt wurde, auf Nitrozellulose pipettiert. Durch Zugabe einer Lösung von NBT (Nitroblau-Tetrazoliumsalz) und BCIP (5-Brom-4-chlor-3- indolylphosphat) wurde die Proteinexpression über die Aktivität der Alkalischen Phosphatase anhand der entstehenden Färbung nachgeweisen. c) Expression von AP-Nogo66:
Ein HEK293 Klon (Klon Nr. 5), welcher AP-Nogo66 produziert, wurde in Kulturmedium (RPMI Glutamax +10% FCS, 150 μg/ml Zeocin, Antibiotic / Antimycotic) durch mehrmalige Passage (ca. 20) in Kulturflaschen vermehrt. Die AP-Nogo66 Expression wurde nach jeder zweiten oder dritten Passage im Dot Blot Test (mit NBT/BCIP Reagens) überprüft.
Um AP-Nogo66 in Serum-freiem Medium zu produzieren wurden die Zellen zunächst bis fast zur Konfluenz in Triple-Flasks kultiviert, dann erfolgte ein Mediumwechsel zu Expressionsmedium (Pro293a - CDM Medium (Biowhittaker; # 12-764Q),2mM Glutamin, Antibiotic / Antimycotic). Daraufhin wurden die Zellen 3 - 4 Tage bei 37 °C kultiviert, die Überstände wurden abgenommen und abzentrifugiert (1500 Upm, 5 min). Die Überstände wurden bei -8O0C gesammelt. Zur weiteren Verarbeitung wurden sie aufgetaut, mit Proteinaseinhibitoren (PMSF 0,1 mM, Pefabloc SC 1 mM) versetzt und in Amicon Tubes (Millipore) aufkonzentriert und die AP-Nogo66 Konzentration wurde bestimmt (ca. 3 μg/ml) (Mw von monomerer AP: 67 kDa und monomerem AP-Nogo66 etwa. 75 kDa in SDS Gelen).
Der AP-Nogo66-Pool wurde mit anti-AP-Agarose immunopräzipitiert. Das Präzipitat wurde durch 10-minütiges Erhitzen bei 95°C in Gegenwart von 5% Mercaptoethanol denaturiert und so von den Agarose Beads entfernt, schließlich durch Westen-Analyse mittels Antikörpern mit Spezifität für AP und Nogo66 (anti-Nogo66 Antikörper NogoA12A, Alpha Diagnostics International, San Antonio, Texas, USA) verifiziert (Daten nicht gezeigt).
Durch Gelchromatographie (Superose 12, Amersham Biosciences. Laufmittel: 20 mM Natriumphosphat, 140 mM Natriumchlorid, pH 7.4) wurde bestimmt, dass AP-Nogo66 als Dimer läuft und ein Mw von etwa 140 kDa aufweist.
In Vorversuchen wurde festgestellt, dass AP-Nogo66, nicht aber GST-Nogo66 funktionell aktiv war (Versuche nicht gezeigt). Es wird daher vermutet, dass NgR- Liganden womöglich als Dimer vorliegen müssen, um funtionell zu sein. Wie die Kristallstruktur der Alkalischen Phosphatase zeigt, wird die Dimerisierung vom AP-Tag induziert Herstellungsbeispiel 2: Herstellung von Konstrukten zur Generierung von rekombinanten HEK Zelllinien
a) Kloπierung von hp75; Herstellung von pcDNA3.1(V5-His)hp75 Nr.16 (Fig. 2d)
Es wurde von den publizierten Sequenzen für humanes p75 ausgegangen: NM_002507; M 14764 (die beide 100% identisch sind ). Die folgenden Oligonukleotide wurden von der publizierten Sequenz abgeleitet:
Mey 36: GCCΛCCATGGGGGCAGGTGCCACC (SEQ ID NO:5 ; Oligo mit Start-Codon (fett) mit Kozak Sequenz (kursiv)
Mey 35: TCACACIGGGGATGTGGCAG (SEQ ID NO:4); Oligo mit Stop Codon (fett) ein Basenaustausch T statt C (unterstrichen) da das Oligo von der publizierten Ratten Sequenz abgeleitet ist
Mey 71 : GCAGCCCCATCAGTCCGC (SEQ ID NO:6); Oligo beginnend 64 Basenpaare vor Start ATG
Anschließend wurde eine PCR (analog zu Nogo 66 Klonierung, Herstellungsbeispiel 1 ) mit dem Primerpaar Mey 35/71 in cDNA aus der Zelllinie SH-SY5Y (humane Neuroblastomazellinie ATCC # CRL-2266) durchgeführt. Die PCR mit Mey35/71 lieferte ein 1348 bp Fragment. Dieses wurde gereinigt.
Eine anschließende PCR mit dem Primerpaar Mey 35/36 im Mey 35/71 -Fragment ergab eine deutliche Bande (Fragmentgröße: 1284 bp). Diese wurde gereinigt. Dann wurde diese Bande in pcDNA3.1/V5-His TOPO Vector (SEQ ID NO: 7; pcDNA3.1(V5- HiS)TOPO TA Expression Kit Invitrogen #K4800-01) ungeschnitten eingesetzt (Prinzip Topoisomerase). Mit dem so erhaltenen Konstrukt (pcDNA3.1 hp75) wurden TOP10 Zellen nach Standardmethoden (analog zu Nogo 66 Klonierung, Herstellungsbeispiel 1 ) transformiert.
13 Klone dieser Transformation wurden überprüft und vier Klone mit der richtigen Orientierung ( Nr.13 , 15 , 16 und 18 ) konnten identifiziert werden. Klon Nr16 wurde weiter verwendet. Die Sequenz des enthaltenen Konstruktes (pcDNA3.1(V5-His)hp75 Nr.16 ; vgl. auch Figur 2d) ist in SEQ ID NO:8 dargestellt. Weitere Informationen zu dieser Sequenz sind im folgenden Abschnitt zusammengefasst.
Human p75 start: 40 stop: 1320
Neomycin start:2596 stop:3390
Ampicillin start:4897 stop:5757 compl.
Bgh pA start: 1487 stop: 1701
SV40 pA start:3416 stop:3654 His tag start:1441 stop:1458
V5 Epitope start: 1397 stop: 1438
F1 ori start: 1764 stop:2177
SV40 promoter + ori start:2242 stop:2567 pUC ori start:4086 stop:4759
b) Herstellung von pIRES hp75
Plasmid pIRES (Clontech, PaIo Alto, USA) wurde mit Xba I und Not I (Roche Diagnostics) unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (40 μl;1 ,5 h bei 37 0C) enthaltend 5 μg DNA, 2 μl Xba I1 2 μl Not I1 4 μl 10x Puffer H (Roche) und 32 μl Wasser bidest. geschnitten: Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.
Plasmid pcDNA3.1 hp75, hergestellt wie oben beschrieben, wurde mit Spe I und und Not I (Roche Diagnostics) unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (40 μl;1,5 h bei 37 0C) enthaltend 5 μg DNA, 2 μl Spe I1 2 μl Not I1 4 μl 10x Puffer H (Roche), 32 μl Wasser bidest geschnitten. Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.
Die auf diese Weise hergestellten Restriktionsfragmente wurden unter Verwendung des folgenden Ansatzes über Nacht bei 16 0C ligiert: 5 μl hp75-Konstrukt, 2 μl geschnittener pIRES, 1 ,5 μl T4-DNA Ligase (Roche) 3 μl 10x Puffer T4 (Roche), 20,5 μl Wasser bidest. Diese Ligation mit der Bezeichnung pIRES hp75 wurde dann in den Bakterienstamm SuperComp XL2 Blue (Stratagene) transformiert. c) Herstellung von pIRES hNgR hp75 (Fig. 2a)
pcDNA hNgR CDS1 , kommerziell erworben von RZPD (Deutsches Resourcenzentrum für Genomforschung GmbH, Klon. Nr.: IRAL-p962L1427Q2), enthaltend die kodierende Sequenz für humanen Nogo-Rezeptor, wurde unter Verwendung eines Restriktionsansatzes 13 μl;1 h bei 37 0C) enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl Hind III (Roche), 1 ,5 μl 10x Puffer B (Roche) und 10 μl Wasser bidest verdaut (blunt end). Das ausgeschnittene Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel in herkömmlicher Weise gewonnen.
Zum Auffüllen der Enden wurden 20 μl des geschnittenes pcDNA h NgR CDS1- Konstrukt in einem Ansatz (100μl; 30 min 11 0C), enthaltend 2 μl T4-DNA Polymerase (Roche), 10 μl 10x Puffer T4 (Roche), 1 μl 100 mM DTT (Gibco), 10 μl 20 mM NTP Mix (Stratagene) und 77 μl Wasser bidest. inkubiert. Das T4-fill-in wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA-Gel gewonnen.
Zur Dephosphorylierung, um eine Re-Ligierung der blunt ends zu vermeiden, wurden 50 μl des T4 fill-ins des h NgR CDS1-Konstruktes mit 2 μl Alkalische Phosphatase (Roche), 10 μl 10x Puffer (Roche) und 38 μl Wasser bidest. zunächst 30 min bei 37 0C und anschließend 15 min bei 65 0C inkubiert. Das so erhaltene Dephosphorylierungskonstrukt wurde schließlich mit Qiagen Hit c!ean-up aufgereinigt.
Das gereinigte pcDNA h NgR Hind III blunt Fragment wurde dann mit EcoRI unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (15 μl,1 h bei 37 0C), enthaltend 10 μl Eluat (aus Qiagen Hit clean-up), 1 ,5 μl EcoR I (Roche), 1 ,5 μl 10x Puffer H (Roche) und 2,0 μl Wasser bidest., verdaut und mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem DNA- Gel nach Restriktion gewonnen.
pIRES hp75 (wie oben hergestellt) wurde mit EcoR I und Hind IM unter Verwendung eines Restriktionsansatzes (27 μl, 1 ,5 h bei 37 0C), enthaltend 5 μg DNA, 1 ,5 μl EcoR I,
1 ,5 μl Hind III, 4 μl 10x Puffer H (Roche) und 20 μl Wasser bidest. geöffnet. Das gewünschte hp75 Fragment wurde mit Hilfe des Qiagen Gelextraktionskit aus einem
DNA-Gel nach Restriktion gewonnen und mit dem oben hergestellten hNgR-Konstrukt unter Verwendung eines Ligationsansatzes, enthaltend 5 μl NgR-Konstrukt, 2 μl geschnittener pIRES hp75, 1 ,5 μl T4-DNA Ligase (Roche), 3 μl 10x Puffer T4 (Roche) und 20,5 μl Wasser bidest. über Nacht 16 0C ligiert. Das erhaltene Konstrukt pIRES hNgR hp75 (Fig 2a; SEQ ID NO: 10) wurde dann in den Bakterienstamm SuperComp XL2 Blue (Stratagene) transformiert.
Weitere Sequenzinformationen zu pIRES hNgR hp75 sind in folgendem Abschnitt zusammengefasst:
CMV prom. 108 - 857
NOGO R 1202-2620
IRES 2658-3238 hp75 3294-4574
SV40pA 4648-4869
Hori 4964-5419
Neo 5483-6856 amp 7261-8121 pUC ori 8266-93 compl
d) Herstellung von pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt (Fig. 2c)
Das Plasmid pOTB7 RhoA (kommerziell erworben von RZPD, Deutsches Resourcenzentrum für Genomforschung GmbH, Klon. Nr.: IRAL-p962A174), das die kodierende Sequenz für humane RhoA GTPase enthält, wurde unter Verwendung des folgenden Restriktionsansatzes (25 μl, 1 ,5 h bei 37 0C), enthaltend 5 μg DNA, 1 ,5 μl EcoR I1 1 ,5 μl Xho I (Roche), 3 μl 1Ox Puffer H (Roche) und 19 μl Wasser bidest. verdaut.
In einem zweiten Ansatz wurde pcDNA4(mycHis) (Invitrogen, Carlsbad, USA) unter Verwendung des folgenden Restriktionsansatzes (25 μl, 1 ,5 h bei 37 0C), enthaltend 5 μg DNA, 1,5 μl EcoR I, 1 ,5 μl Xho I (Roche), 3 μl 1Ox Puffer H (Roche) und 19 μl Wasser bidest. ebenfalls verdaut.
Anschließend wurden die geschnittenen Fragmente, wie oben beschrieben gereinigt und ligiert, wobei man das Plasmid pcDNA4(mycHis)A h RhoA wt (vgl. Fig. 2c; SEQ ID NO: 13.) erhält. Das erhaltene Konstrukt wurde dann in den Bakterienstamm SuperComp XL2 Blue (Stratagene) transformiert. Weitere Sequenzinformationen zu pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt sind in folgendem Abschnitt zusammengefasst:
CMV prom. 197-851
RhoA 1058-1636
His 2437-2454 myc 2392-2421
Bgh pA 2480-2707
SV40 pA 4143-4273 flori 2753-3181 amp 5477-6334 compl pUC ori 4656-5329
Zeo 3639-4010
EM7 prom. 3565-3620
SV40 prom. 3209-3517
d) Herstellung von pcDNA3 hRhoA wt (Fig. 2b)
Die Herstellung erfolgt in Analogie zu pcDNA4(mycHis)A hRhoA wt, wobei man aber anstelle von pcDNA4(mycHis) das oben bereits beschriebenen Plasmid pcDNA3.1V5- His TOPO verwendet.
Weitere Sequenzinformationen zu pcDNA3 hRhoA wt (vgl. Fig. 2b; SEQ ID NO: 15) sind in folgendem Abschnitt zusammengefasst:
CMV prom. 6124-6778 h RhoA 127-705
Bgh pA 1478-1718
SV40 pA 3402-3597
SV40 ori 2259-2584
CoIEI ori 4141-4515 flori 1788-2201
Neo 2620-3411 amp 4919-5779 compl Herstellunqsbeispiel 3: Generierunq stabiler rekombinanter HEK Zelllinien
Menschliche embryonale Nierenzellen (HEK293) (ATCC = American Tissue Culture Collection, Bestellnr.: CRL-1573) wurden wie im folgenden beschrieben transfiziert und kultiviert.
a) Herstellung der Doppel-Transfektante HEK293 NgR/p75
HEK293 Wildtyp- Zellen (kultiviert in RPMI-Glutamax + 10% dial. FCS + 1 % Antibiotic- Antimycotic) wurden in einem ersten Transfektionsschritt mit dem Plasmid pIRES hNgR hp75 transfiziert. Dazu wurden in Kulturschalen mit 10 Vertiefungen je Ansatz 2 μg Plasmid-DNA in 100 μl serumfreien RPMI-Gutamax Medium und 2 x 106 Zellen in 12 μl LIPOFECTAMINE (Invitrogen) in 100 μl serumfreien RPMI-Gutamax Medium vermischt, und 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Man füllte dann mit serumfreien Medium auf ein Gesamtvolumen von 1 ml je Transfektionsansatz auf. Anschließend gab man zu jeder Schale 2 ml serumfreies RPMI-Gutamax Medium und man inkubierte 6 h bei 37 0C. Dann erfolgte ein Mediumwechsel auf RPMI-Glutamax + 5% dialysiertes FCS und inkubierte 1 Tag bei 37 0C. Anschließend wurden die Schaleninhalte gesplittet (in unterschiedlichen Verdünnungen: 1 :10; 1 :50, 1 :100, 1 :250, 1 :500, 1 :1000; 1 Ansatz/ Schale pro Verdünnung) (in RPMI-Glutamax + 10% dialysiertes FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic (Invitrogen) + G418 (Geneticin; Invitrogen); 800 μg/ml)
Klone wurden aus derjenigen Verdünnung isoliert, die die ersten separierten Klone ergab. Sterile Mini-Glaszylinder (BASF) wurden mit einer sterilen Pinzette mit einem Ende in sterile Vaseline (BASF) vorsichtig eingetaucht. Das mit der Vaseline benetzte Ende der Mini-Glaszylinder wurde auf die zuvor ausgewählten Einzelklone vorsichtig aufgesetzt. Der Einzelklon sollte vollständig vom Mini-Glaszylinder umschlossen sein. In die Mini-Glaszylinder wurden nun mit einer Eppendorf-Pipette mit steriler Spitze 40 μl Trypsin (Gibco, Trypsin-EDTA) zugegeben. Das Trypsin ließ man 1-2 Minuten auf die Zellen einwirken. Durch mehrmaliges (3-4 Mal) Anziehen und Abgeben des Trypsins mit einer Eppendorf-Pipette (sterile Spitze) wurden die Zellen resuspendiert. Die resuspendierten Zellen wurden mit der Eppendorf-Pipette vollständig vom Mini- Glaszylinder in eine 24-well Platte (Tissue culture plate, Falcon, Becton Dickinson, jedes well enthielt 1 ml Medium RPMI-Glutamax + 5% dialysiertes FCS) überführt.
Der Nachweis von positiven Klonen erfolgte mittels FACS wie nachfolgend beschrieben.
FACS-Analyse - Reagenzien:
Figure imgf000026_0001
FACS-Analyse - Durchführung:
Zunächst wurden die HEK293-Zellen mit PBS gewaschen. Adhärente Zellen wurden mit PBS1 enthaltend 5 mM EDTA abgelöst. Anschließend wurden 2 x 106 Zellen in ein Eppendorff-Gefäß überführt und 2 Minuten bei 1300 Upm zentrifugiert. Die Zellen wurden in PBS, enthaltend 1 % BSA (1 ml/Gefäß) resuspendiert und 2 Minuten bei 1300 Upm zentrifugiert.
Die Pellets wurden erneut mit 0,1 ml PBS/1 % BSA einschließlich Primärantikörper (Maus-anti-Human p75 1:100, oder Ziege-anti-Human NogoR 1 :50) resuspendiert und 90 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend gab man 0,1 ml PBS/1 % BSA hinzu, mischte und zentrifugierte 2 Minuten bei 1300 Upm.
Die Pellets wurden in PBS, enthaltend 1 % BSA (0,1 ml/Gefäß) und Sekundärantikörper (anti-Maus-FITC 1:100; oder anti-Ziege-FITC 1:100); resuspendiert und 60 Minuten bei 4°C inkubiert.
Man gab PBS, enthaltend 1 % BSA (1 ml/Gefäß) hinzu, mischte und zentrifugierte 2 Minuten bei 1300 Upm. Nach Abzentrifugation wurden die Pellets erneut in PBS/ 0,1 % Propidiumjodid zur Detektion toter Zellen resuspendiert. Nach Resuspendieren erfolgte eine FACS-Analyse (FACScan, Firma Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland). Dabei wurde die Überexpression der Rezeptoren NgR und p75 an der Zelloberfläche bestimmt (Ergebnisse nicht gezeigt).
b) Herstellung der Triple-Transfektante HEK293 RhoA/NgR/p75
Ein gemäß a) hergestellter positiver Klon (Klon 5) der Zelllinie HEK293 NgR/p75 wird in analoger Weise mit dem Plasmid pcDNA4(mycHis)A hRhoA transfiziert. Im letzten Schritt erfolgte eine Splittung der Ansätze in RPMI-Glutamax (+ 10% dialysiertes. FCS + 1% Antibiotic-Antimycotic + G418; 800 μg/ml, + Zeocin (Invitrogen) 125 μg/ml)
Zum Nachweis positiver Klone wurde diese durch Immunoblotting auf RhoA Expression und durch FACS Analyse auf Expression der Rezeptoren NgR und p75 getestet.
Zum RhoA-Nachweis wurde ein von dem jeweiligen Klon abgeleitetes Zellhomogenat durch SDS-PAGE-Gelelektrophorese (NuPAGE Polyacrylamid Gel 4-12%, 1 ,5 mm stark Invitrogen Carlsbad, USA); die Proteinproben wurden mit 5% Mercaptoethanol denaturiert) aufgetrennt und nach Immunoblotting mit monoklonalem Maus-anti-RhoA Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA) nach Standardmethode getestet. Ein typisches Ergebnis ist in Figur 3a dargestellt. Bei positiven Klonen beobachtet man eine RhoA-Bande mit einem Molekulargewicht von etwa 21 kD.
Zum Nachweis der Expression von NgR und p75 wurde eine FACS-Analyse wie oben beschrieben durchgeführt. Ein typisches Ergebnis ist in Figur 3b dargestellt.
c) Herstellung der Einfach-Transfektante HEK293 RhoA
HEK293 wt Zellen werden mit dem Plasmid pcDNA3 hRhoA wt transfiziert. Im letzten Schritt erfolgte eine Splittung der Ansätze in RPMI-Glutamax (+ 10% dialysiertes. FCS + 1 % Antibiotic-Antimycotic + G418; 800 μg/ml). Ansonsten wurde in Analogie zu a) und b) verfahren.
Herstellungsbeispiel 4: Herstellung von His-NogoR Fusionsprotein Grundlage für die Expression und Aufreinigung von rekombinanten His-NogoR Fusionsprotein (Genbank:NM_023004) war die stabil mit dem Vektor „pcDNA4/hNogoR-TM6" transfizierte HEK 293 Zelllinie „CHO"
Im Folgenden wird zunächst die Herstellung dieser Zelllinie beschrieben: Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Sambrook, J. & Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd edn. CoId Spring Harbor, NY: CoId Spring Harbor Laboratory durchgeführt.
Ausgangspunkt für die Herstellung des NgR-HIS Expressionsplasmids war der bei der RZPD GmbH (Berlin, Deutschland) käuflich erworbene cDNA Klon pOTB7 IRALp962L1427Q2. Aus der Plasmid-DNA wurde mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer:
hNogoR Hind III: CCAAGCTTATGAAGAGGGCGTCCGCTGGAGGGAG (SEQ ID NO: 17) hNogoR Eco Rl -TM: CCGAATTCTAGGGCACCTGAGCCTTCTGAGTCACC (SEQ ID NO:18)
die gewünschte kodierende Nukleotidsquenz amplifiziert.
Nach Gelaufreinigung mit dem QIAquick Gelextraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) wurde die cDNA mit den Restriktionsendonucleasen Hindill und EcoR1 geschnitten, um nach erneuter Gelaufreinigung in den ebenfalls Hindlll/EcoR1 geschnittenen Vektor pcDNA4/MycHIS A (Invitrogen, Carlsbad, USA) ligiert zu werden. Nach Transformation in E. coli Top10 One Shot Zellen (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurde ein positiver rekombinanter Klon amplifiziert, die Sequenz verifiziert und die Plasmid-DNA mit dem Plasmid Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
Der so neu entstandene Plasmid-Vektor „pcDNA4/hNogoR-TM6" wurde mit dem Transfektionsreagenz „Fugene 6" (Roche, Mannheim, Deutschland) nach Angaben des Herstellers in CHO-K1 transfiziert. Nach Selektion der „positiven" Zellen mit 800 μg/ml G418 in MEM Medium (#M4528, Sigma, München, Deutschland) enthaltend 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurden serielle Verdünnungen der Zellsuspension hergestellt, so dass ausgehend von einem Einzelklon die Zelllinie „CHO-K1/" identifiziert werden konnte.
Die Identität der Nogo-Rezeptor Expression und Sekretion des Proteins ins Kulturmedium wurde im Dot Blot mit anti-HIS spezifischen Antikörpern (#1922416, Roche, Mannheim, Deutschland) überprüft.
Der Zellklon wurde unter normalen Zellkulturbedingungen vermehrt und in einen Wannenstapel eingesät. Nach 21 Tagen des Wachstums unter FCS wurde das Medium durch frisches serumfreies Medium ersetzt. Nach 3 Tagen wurden 40 Liter serumfreier Zellkulturüberstand gewonnen. Dieser Überstand wurde mit Hilfe einer Fresenius Hemoflow F60 auf 1 Liter konzentriert (Faktor 40). Anschließend wurden 50ml Ni-NTA-Superflow Beads (Qiagen, Hilden), welche mit PBS voräquilibriert waren, zu dem Konzentrat gegeben und bei 4°C für 3 Stunden gerührt. Die Beads wurden durch Abstellen des Rührers sedimentiert (über Nacht bei 4°C), der Überstand wurde verworfen und die Ni-NTA Beads in eine Säule gefüllt. Die Beads wurden bei Raumtemperatur mit drei Säulenvolumen 2OmM Na-Phosphatpuffer, 30OmM NaCI pH8.0 gewaschen. Anschließende erfolgten Waschschritte mit 5 Säulenvolumen 2OmM Na-Phosphatpuffer, 30OmM NaCI, 1OmM Imidazole pH8.0. Eluiert wurde der gebundene Hexa-His-getaggte NgR mit 2OmM Na-Phosphatpuffer, 30OmM NaCI, 10OmM Imidazole pH8.0. Das Eluat wurde über Nacht gegen 25mM Tris/HCI pH7.0 dialysiert.Das Dialysat wurde bei Raumtemperatur auf eine Q-Sepharose Säule (Amersham Biosciences, 1.6 x 3cm ; Volumen 6ml) gegeben. Anschließend wurde mit folgenden Puffern gearbeitet:
Puffer A : 5OmM Tris/HCI ; pH7.0;
Puffer B : 5OmM Tris/HCI ; 1 M NaCI ; pH7.0
Mit einem Fluß von 2ml / min wurde mit folgendem Gradienten eluiert: 0% Puffer B für 5 Säulenvolumen; 0-50% Puffer B in 12 Säulenvolumen; 50-100% Puffer B in 2 Säulenvolumen, sowie 100% Puffer B in 5 Säulenvolumen.
Pro Säulenvolumen wurden zwei Fraktionen gewonnen. Diese wurden durch Standard
SDS-Gelelektrophorese analysiert. Fraktionen mit der höchsten NgR-Reinheit wurden für den Anteil des hoch-glykosylierten Rezeptors (Molekulargewicht ca. 110.000- 120.000), sowie für den Anteil des niedrig-glykosylierten Rezeptors (Molekulargewicht ca. 75.000-90.000) vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden gegen 2OmM Na- Phosphatpuffer, 14OmM NaCI pH 7.4 bei 4°C über Nacht dialysiert. Die Dialysate wurden anschließend durch einen 0.2μm Sterilfilter filtriert und bei 4°C aufbewahrt.
Herstellungsbeispiel 5: Herstellung von EGFP-NogoR Fusionsprotein
Die Herstellung erfolgte unter Anwendung molekularbiologischer Standardtechniken gemäß Sambrook, J. & Russell, D. W. (2001 ).
Folgende Primer wurden dazu eingesetzt:
Für die Bereitstellung von NogoR 27-450
hNogoR Hind III: CC AAGCTT ATGAAGAGGGCGTCCGCTGGAGGGAG
(SEQ ID NO: 17)
hNogoR Eco Rl -TM: CC GAATTCTAGGGCACCTGAGCCTTCTGAGTCACC (SEQ ID NO:18)
Für die Bereitstellung von EGFP:
EGFP EcoRI CCGAATTCTGATGGTGAGCAAGGG (SEQ ID NO: 19)
EGFP Apal CCGGGCCCCTTGTACAGCTCGTCCA (SEQ ID NO:20)
Folgende käuflich erhältliche Plasmide wurden eingesetzt:
pOTB7 Cat.Nr.: IRALp962L1427Q2 (RZPD) pEGFP-N3 Cat Nr.: 6080-1 (Clontech) psecTAG2A Cat Nr.: V900-20 (Invitrogen)
Zur Klonierung wurde zunächt aus dem Plasmid pEGFP-N3 mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer gemäß SEQ ID NO: 19 und 20 die gewünschte EGFP-kodierende Nukleotidsquenz amplifiziert. Nach Gelaufreinigung mit dem QIAquick Gelextraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) wurde die cDNA mit den Restriktionsendonucleasen Apal und EcoRI geschnitten, um nach erneuter Gelaufreinigung in das ebenfalls Apal/EcoRI geschnittene Plasmid psecTAG2A ligiert zu werden. Auf diese Weise erhält man das Plasmind psecEGFP2-6xHIS.
In einem nächsten Schritt wurde aus dem Plasmid pOTB7 mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotidprimer gemäß SEQ ID NO: 17 und 18 die gewünschte NogoR-kodierende Nukleotidsquenz amplifiziert. Nach Gelaufreinigung mit dem QIAquick Gelextraction Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) wurde die cDNA mit den Restriktionsendonucleasen Hindill und EcoRI geschnitten, um nach erneuter Gelaufreinigung in das ebenfalls Hindlll/EcoRI geschnittene Plasmid psecEGFP2- 6xHIS ligiert zu werden.
Nach Transformation des Plasmids in E. coli Top10 One Shot Zellen (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurde ein positiver rekombinanter Klon amplifiziert, die Sequenz verifiziert und die Plasmid-DNA mit dem Plasmid Mini-Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Auf diese Weise erhält man das Plasmid psec hNogoR 27-450 EGFP 6xHIS (Fig. 1 b).
Dieser Plasmid-Vektor wurde mit dem Transfektionsreagenz „Fugene 6" (Roche, Mannheim, Deutschland) nach Angaben des Herstellers in CHO-K1 transfiziert. Nach
Selektion der „positiven" Zellen mit 800 μg/ml G418 in MEM Medium (#M4528, Sigma,
München, Deutschland) enthaltend 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml
Penicillin/Streptavidin (Invitrogen, Carlsbad, USA) wurden EGFP-positive Einzelzellen nach dem Kriterium „Best FL-1 Signal" mit einem FACS (fluorescence-assisted cell sorter; (FACSVantage SE, Becton Dickinson) gescreent und als Einzelzellen in 96 well
Platten in MEM Medium (800 μg/ml G418 in MEM Medium (#M4528, Sigma, München,
Deutschland), enthaltend 10% FCS, 2 mM L-Glutamin, 100 U/ml Penicillin/Streptavidin
(Invitrogen, Carlsbad, USA)) kultiviert. Nach ca. 2 Wochen wurden die Einzelklone anhand der Expression von EGFP mit einem Fluoreszenz Scanner (Tycoon Scanner, Wellenlänge 526 nm) analysiert.
Auf diese Weise wurde ein Einzelklon die Zelllinie mit der Bezeichnung „CHO- K1/hNogoR 27-450 AA EGFP B3" identifiziert. Die Identität der Fusionsprotein Expression und Sekretion des Proteins ins Kulturmedium wurde über Western Blot überprüft (analog Herstellungsbeispiel 4).
Zur Produktion des NgR-EGFP Proteins wurden die Zellen in serumfreiem Medium (analog Herstellungsbeispiel 4) kultiviert, 10 Liter Medienüberstand nach drei Tagen abgenommen und auf 1 ,3 Liter konzentriert. Nach einer Isolierung des Proteins über die His-Komponente durch eine Ni-NTA superflow Agarose (analog Herstellungsbeispiel 4) und eine Anionenaustauscher-Säule Mono-Q wurde das Protein schließlich durch eine Superose 12-Säule gereinigt und fraktioniert.
II. Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1: Bindung von AP-Nogo66 an NgR
a) FACS-Analyse
Zellkulturen von HEK293, die natürlicherweise NgR exprimieren, wurden mit PBS gewaschen und mit 5 mM EDTA enthaltendem PBS von den Kulturgefäßen abgelöst. Jeweils 2 x 106 Zellen wurden in Eppendorf-Röhrchen übertragen und 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Danach wurden die Zellen in 1 % BSA enthaltendem PBS (PBS/1%BSA) resuspendiert (1 ml/Röhrchen) und erneut 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Die Zellen wurden dann in 0,1 ml PBS/1%BSA resuspendiert, der 1000 nM Kompetitor (EGFP-NogoR, Anti-NogoR-Antikörper, His-Nogo66 oder MAG-Fc) enthielt (Kontrolle ohne Kompetitor) und 30 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach Zugabe von 0,1 ml PBS/1 %BSA, das 25 nM AP-Nogo66 enthielt, wurde 45 min bei RT inkubiert. Die Zellsuspension wurde dann zentrifugiert, das Pellet in PBS/1%BSA resuspendiert (1 ml/Röhrchen) und die Suspension 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Die Pellets wurden dann in 0,1 ml PBS/1%BSA resuspendiert, das Anti- Alkalische-Phosphatase (Sigma A-2951) enthielt, und 30 min bei RT inkubiert. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellpellets in PBS/1%BSA (1 ml/Röhrchen) resuspendiert und 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert. Die Pellets wurden in 0,1 ml PBS/1%BSA resuspendiert, das Anti-Maus-Phycoerythrin (Sigma; P-9287; 1 :100 verdünnt) enthielt, und 30 min bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Zellsuspension zentrifugiert, in PBS/1 %BSA resuspendiert (1 ml/Röhrchen), erneut 2 min bei 1300 U/min zentrifugiert und schließlich in 1 ml PBS suspendiert. Diese Suspension wurde für die FACS-Analyse (FACScan, Becton Dickinson) verwendet.
In Gegenwart von 1000 nM EGFP-NogoR oder Anti-Nogo-R-Antiköper wurde die Bindung von AP-Nogo66 an HEK293 im wesentlichen auf die Stärke des Hintergrundsignals reduziert (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass AP- Nogo66 an NgR von HEK293 bindet, wobei eine Wechselwirkung mit NogoR erfolgt, die durch Kompetition mit EGFP-NogoR oder Anti-NogoR-Antikörper unterbunden wird.
b) Bindung von AP-Nogo66 an NgR (direkt an Mikrotiterplatten gebunden)
NgR kommt in einer niedrig-glykosylierten und einer hoch-glykosylierten Form (etwa 80 kDa bzw. 120 kDa) vor (vgl. Herstellungsbeispiel 4). Der niedrig-glykosylierte Rezeptor His-NogoRlow wurde in den Fraktionen 4-7 einer Q-Sepharose-Säule in 20 mM NaPi, 140 mM NaCI, pH 7,4 mit ca 90% Reinheit erhalten, der hoch-glykosylierte Rezeptor His-NogoRhigh entsprechend in den Fraktionen 28-31 mit einer Reinheit von mehr als 95%. Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorb) wurden mit 0,1 ml 1 μg/ml His- NogoRlow bzw. His-NogoRhigh in Na-Carbonat-Puffer, pH 9, über Nacht bei 4°C beschichtet. Nach einem zweistündigen Blockierungsschritt mit 2% BSA in Tris-HCI, pH 7,2, bei Raumtemperatur wurde 0,1 ml AP-Nogo66 zugegeben. Die AP-Nogo66- Stammlösung (3 μg/ml) wurde mit Puffer (Tris-HCI mit 0,1 % BSA, pH 7,2) auf die angegebenen Anfangskonzentrationen verdünnt, die dann zweifach weiterverdünnt wurden. Die Mikrotiterplatten wurden während jedes Inkubationsschrittes mit Waschpuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,2, un d0,05% Tween 20) gewaschen. Die Bindung von AP-Nogo66 wurde mit einem fluorgenen Substrat (AttoPhos, Roche 1 681 982) nachgewiesen und die Fluoreszenzeinheiten gemessen (Polarstar-Messgerät, BMG). Wie in Fig. 4 gezeigt ist, bindet His-NogoRlow besser an AP-Nogo66 als His- NogoRhigh.
Ausführungsbeispiel 2: AP-Nogo66 Kompetitionstest mit Clivarin und Arixtra
Alle Mengenangaben beziehen sich auf eine einzelne Vertiefung der Mikrotiterplatte („Well"). Nach jedem Inkubationsschritt wurden die Platten mit Waschpuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7.2 and 0.05% Tween20) gewaschen. Mikrotiterplatten (Nunc Maxisorb) wurden mit 0,1 ml einer 1 μg/ml konzentrierten anti- NgR Antikörperlösung (R&D Systems, AF1208) in Natriumcarbonat-Puffer (5OmM) bei pH 9,0, über Nacht bei 4°C beschichtet. Einem 2-stündigen Blockierungsschritt mit 2% Rinderserumalbumin (bovine serum albumin (BSA) in 20 mM Tris-HCI, pH 7,2) bei Raumtemperatur folgte eine Inkubation mit 0,1 ml einer 4 μg/ml konzentrierten NgR-His Lösung (Herstellungsbeispiel 4; Fraktion 4-7; Konzentration 2,83 mg/ml) in Tris-HCI, pH7,2 mit 0,1 % BSA für 90 Minuten bei Raumtemperatur.
Für die Kompetitionsexperimente wurden die Substanzen Clivarin (Clivarin 1.750, Mw 4500 Da, Abbott) und Arixtra (Fondaparinux-Na; Mw 1700 Da, Sanofi-Synthelabo) mit Puffer (Tris-HCI pH 7.2 mit 0.1% BSA) verdünnt in die vorbereiteten, über Bindung an anti-NgR (Beschichtung mit 1 μg/ml) mit NgR beschichteten (His-NgR; Faktion 4-7; 4μg/ml als Fänger) Mikrotiterplatten gegeben und anschließend ohne Waschschritt AP- Nogo66 zupipettiert. Die Konzentrationen von Clivarin und Arixtra lagen zwischen 0,1 und 100 μM. Die Konzentration von AP-Nogo66 betrug 0,1 nM. Diese AP-Nogo66 Konzentration liegt unter dem K0 zwischen AP-Nogo66 und NgR (0,6 nM). Nach 90 Minuten Inkubation und anschließendem Waschen (Waschpuffer, siehe oben) wurde die an NgR (Nogo Rezeptor) gebundene AP-Aktivität von AP-Nogo66 durch Zugabe des nach den Anweisungen des Herstellers vorbereiteten Fluoreszenz-Substrates AttoPhos (Roche, 1 681 982) nach 15-30 Minuten bei Raumtemperatur in einem Mikrotiterplatten-Leser (Polarstar, BMG) bei 440 nm Excitations- und 560 nm Emissionswellenlänge gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 und Fig. 6 gezeigt, wobei die Messergebnisse in relativen Fluoreszenz-Einheiten (relative Fluorescence Units; RFU) angegeben sind. Sie zeigen die Kompetition der AP-Nogo66 Bindung an NgR durch Clivarin und Arixtra. Der IC5O Wert liegt bei Clivarin unter 1 μM und bei Arixtra bei unter 50 μM. Clivarin ist in der Lage die Interaktion zwischen AP-Nogo66 und NgR vollständig zu blockieren.
Ausführungsbeispiel 3: AP-Nogo66 Kompetitionstest mit Oligosacchariden
Zur Bestimmung der kleinsten funktionellen Einheit der Saccharide wurden Untersuchungen mit Di-, Tetra und Hexasacchariden (als Verdauungsprodukte von Heparin durch Heparinase) als Kompetitoren durchgeführt. Die Saccharide wurden von der Firma Dextra Labs bezogen (Disaccharid: ID1002; 2) Tetrasaccharid: ID1004; 3) Hexasaccharid: ID1006). Die Versuchsdurchführung erfolgte analog zu Ausführungsbeispiel 2 .
Die getesteten Saccharide zeigten die in folgender Tabelle zusammengefassten IC50- Werte:
Figure imgf000035_0001
Ausführungsbeispiel 4: Aktin-Zytoskelett-Umformungstest (actin cytoskeletal rearrangement (ACR)-TeSt) mit Heparinderivaten
Um zu untersuchen, ob die Heparinderivate Clivarin bzw. Arixtra (Pentasaccharid) ein vergleichbares zelluläres Signal auslösen, wie das durch die Wechselwirkung zwischen Nogo-66 und NgR verursachte, oder aber ein solches Signal inhibieren, wurde ein zellulärer RhoGTPase Aktivierungsssay verwendet. Bei diesem Assay aktiviert die Stimulation des NgR/p75-Rezeptorkomplexes mit Myelin-Proteinen, wie beispielsweise Nogo-66, die Rho-GTPase, welche GTP bindet. Aktivierte Rho-GTPase aktiviert ihrerseits die Serin-Threonin-Kinase ROCK (Rho-assoziierte Kinase), ein spezifisches Downstream-Target von Rho. Die Aktivierung von ROCK führt zur Phosphorylierung mehrerer Zytoskelettproteine, was zu einer Veränderung der Zellmorphologie führt, wie insbesondere einer Zellkontraktion.
Nachfolgend wird ein solcher Aktin-Zytoskelett-Umformungstest im Allgemeinen beschrieben :
a) Materialien:
Hek293 RhoA/NgR/p75 (s.o.) AP-Nogo66 (s.o.) MTP Biocoat Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen RPMI-Glutamax (Invitrogen)
Phalloidin Alexa 568 oder 488 (Farbstoff zur Fluoreszenzfärbung von F-Aktin; Molecular Probes, Eugene, USA)
DAPI (Hoechst 33342, Trihydrochlorid, Trihydrat Molecular Probes, Eugene, USA)
b) Versuchsdurchführung:
4 x 104 Zellen werden in MTP Biocoat Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zwei Tage vor dem eigentlichen Versuchsbeginn überimpft. Die so erhaltenen Zelllinien wurden mit der jeweiligen Testsubstanz bei verschiedenen Konzentrationen (Clivarin- Konzentrationen 2, 5, 10, 20, 40, 80 μM; PentasaccharidKonzentrationen 10, 20, 40, 80, 160, 320 μM) in den angegebenen Konzentrationen 10 min lang inkubiert oder blieben unbehandelt. Die Stimulation der Zellen erfolgte mit dem NgR-Liganden AP- Nogo-66 (9,6 μg/ml) in Kulturmedium enthaltend 5% FCS. Für jede Versuchsreihe wird ein unstimulierter Kontrollansatz (ohne AP-Nogo66) hergestellt. Nach einer 5- bis 10- minütigen Stimulationsperiode wird die Aktivierung mit kalter PBS unterbrochen. Die Zellen werden mit 3 - 4 %-iger Paraformaldehydlösung fixiert, mit PBS, enthaltend 0,2 % Triton X-100 permeabilisiert und 30 - 45 Minuten mit Phalloidin Alexa 568 oder 488 inkubiert. Zusätzlich erfolgt eine 5 minütige Inkubation mit DAPI zur Kernfärbung. Die Zellen werden mit Hilfe eines Epifluoreszenzmikroskops (Axiovert 25) visualisiert. Fluoreszenzmikrogramme können beispielsweise mit einer gekühlten CCD Kamera von Zeiss aufgenommen und der prozentuale Anteil kontrahierter Zellen, bezogen auf die Gesamtzellzahl ermittelt werden.
Die Ergebnisse sind in Fig. 7 und Fig. 8 (Clivarin bzw. Arixtra) gezeigt. Clivarin bzw. Arixtra führen zu einer Auslösung der Signalkaskade und zu Kontraktion der Zellen, wobei als Kontrolle unbehandelte Zellen dienten, die unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zugabe von Saccharid, jeweils 0 % Kontraktion zeigten. Tetrasaccharid bzw. Hexasaccharid induzierten die Zellkontraktion mit IC50-Werten von > 80 μM bzw. 60 μM (Daten nicht gezeigt).
Ausführungsbeispiel 5: Wirkung von Clivarin bei neuronalen Auswachsversuchen Um die Wirkung von Clivarin in vitro zu untersuchen, wurden neuronale
Auswachsversuche durchgeführt. Dazu wurden kortikale Neuronen der Maus präpariert, wobei die folgenden Medien verwendet wurden:
Stockmedium pro Liter: 90 ml GB5, 100 ml Minimum Essential Medium - Eagle (10x;
Gibco, Bestell Nr.: 21430.020), ad 1000 ml mit Millipore Wasser. pH 7,0, 280-310 mosm.
GB5 pro Liter: 26,6 g NaHCO3, 44,4 g Glucose, sterilfiltriert. Plattiermedium (PM) pro Liter: 0,8 mM Glutamin, 100 ml hitzeinaktiviertes fötales
Kälberserum (FCS), 100 ml hitzeinaktiviertes Pferdeserum, ad 1000 ml mit
Stockmedium
Erhaltungsmedium (EM) pro Liter: 0,8 mM Glutamin, 100 ml hitzeinaktiviertes
Pferdeserum, ad 1000 ml mit Stockmedium Trypsinlösung: 0,1 % Trypsin, 0,04% EDTA in PBS ohne Calcium/Magnesium, sterilfiltriert.
Für die Gewinnung korticaler Neuronen wurden trächtige Mäuse (embryonic day 15 (E15)) durch Überstrecken getötet, deren Bauchraum eröffnet, der Uterus mit den Embryonen entnommen und in PBS gewaschen. Mit einer Feinpräparationsschere wurde der Uterus längs aufgeschnitten, die Embryonen entnommen und freipräpariert. Die Embryonen wurden durch Genickschnitt getötet, das Gehirn entnommen und der Vorderhirn-Kortex präpariert. Die Kortices werden in je 1ml einer 0,1%igen Trypsinlösung für 5 Minuten bei 37CC inkubiert, die Reaktion mit Erhaltungsmedium (EM) abgestoppt und nach 5-minütiger Inkubation in insgesamt 10 ml EM mit feuerpolierten Pasteurpipetten mit absteigendem Öffnungsdurchmesser trituiert. Die Zellsuspension wurde 10 Minuten bei 1200 U/min abzentrifugiert und der Überstand abgesaugt und verworfen. Das Zellpellet wurde in 8 ml EM aufgenommen und vorsichtig resuspendiert. Die Zellen wurden in einer Neubauer Zählkammer ausgezählt, die Zellzahl auf ca. 500.000 Zellen/0,5 ml in EM eingestellt und prä-aggregiert. Dazu wurden pro Well 200 μl der Zellsuspension auf Glas-Chamberslides (LabTek, Bestell Nr. 177402) gegeben und für 24 h bei 37°C inkubiert. Dabei bilden sich Neuronenaggregate. Nach 24 Sunden wurde nochmals 200 μl EM zugegeben, und der Inhalt einer Vertiefung auf zwei Platten mit 24 Vertiefungen verteilt, in die zuvor jeweils ein vorbereitetes rundes Glasplättchen (Beckton Dickinson, BioCoat, Bestell Nr.: 354085) gelegt worden war.
Diese Glasplättchen wurden entweder wie vom Hersteller geliefert (beschichtet mit Poly-L-Lysin) verwendet, oder sie wurden zusätzlich mit Clivarin in unterschiedlichen
Konzentrationen beschichtet. Dazu wurde je 50 μl Clivarin (verdünnt in PBS) auf die
Plättchen gegeben und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurden die Plättchen mit Plattiermedium gewaschen, das Medium abgesaugt und die oben beschriebenen
Aggregate in insgesamt 500 μl EM ausplattiert. Das Auswachsen der Neuriten aus Aggregaten kortikaler Neuronen der Maus wurde nach weiteren 48 Stunden evaluiert.
Die Ergebnisse sind in Fig. 9 (obere Reihe von links nach rechts: kein Clivarin, 10 μM und 30 μM Clivarin; untere Reihe: 100 μM und 300 μM Clivarin) und Fig. 10
(Detailaufnahme eines neuronalen Aggregats; links: ohne Clivarin, rechts: 300 μM
Clivarin) gezeigt. Eine schwache Inhibition des Auswachsens von Neuriten wurde durch Hexasaccharid bei einer Konzentration von 100 μM erzielt.
Auf Oberflächen fixiertes Clivarin führte in diesem Test dazu, dass das Auswachsen der Neuriten in konzentrationsabhängiger Weise inhibiert wurde. Neuronale Aggregate verloren außerdem die Adhärenz an Oberflächen, wenn Clivarin in das Kulturmedium gegeben wurde (Ergebnisse nicht gezeigt).

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung eines Wirkstoffs, ausgewählt unter Heparinen und Heparinderivaten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Zuständen, die mit einer Störung der Neuriten-Plastizität einhergehen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei der Wirkstoff die Interaktion zwischen dem Nogo-Rezeptor und dessen Liganden AP-Nogo66 moduliert.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei eine Blockierung mit einem IC50-Wert von höchstens 100 μM erfolgt.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff in einem Aktin-Cytoskelett-Umformungs (ACR) -Test eine Zellkontraktion mit einem IC50-Wert von höchstens 100 μM induziert.
5. Verwendung nach Anspruch 1 , wobei der Wirkstoff das Auswachsen von Neuriten in neuronaler Zellkultur mit einem IC50-Wert von höchstens etwa 1000 μM moduliert.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff eine Molekülmasse von etwa 500 Da bis 10.000 Da aufweist.
7. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Wirkstoff ausgewählt ist unter Clivarin, Arixtra sowie Heparinoiden, die Di-, Tetra- und Hexasaccharidfragmente umfassen.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament ein oder mehrere Heparine oder Heparinderivate, gegebenenfalls in
Form physiologisch verträglicher Salze oder Solvate, und gegebenenfalls einen oder mehrere physiologisch verträgliche Träger oder Exzipienten enthält.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff in einer Dosierungsform, ausgewählt unter Infusionslösungen und Depotformulierungen, vorliegt.
10. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zustände mit einer Störung der Neuriten-Plastizität oder mit aberrantem Neuritenwachstum einhergehen, und ausgewählt sind unter neuropathischem Schmerz, Gürtelrose, Gesichtsrose, Trigeminusneuralgie, Postlaminektomiesyndrom, Phantomsensationen, anhaltendem brennendem Schmerz nach Operation und diabetischer Polyneuropathie, Schizophrenie und alle Erkrankungen des schizoiden Formenkreises, Morbus Alzheimer, Epilepsien und durch Hirnverletzungen verursachte Fehlfunktionen die auf aberrantem, exzessiven und/oder unkontrolliertem Neuritenwachstum beruhen.
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