DE69831805T2

DE69831805T2 - Dextranderivate, verfahren zu deren herstellung und verwendungen als arzneimittel mit spezifischer, biologischer wirkung

Info

Publication number: DE69831805T2
Application number: DE69831805T
Authority: DE
Inventors: Frederic Chaubet; Remi Huynh; Latifa Dahri; Jose Correia; Marcel Jozefowicz; Jacqueline Jozefonvicz
Original assignee: Biodex SARL
Current assignee: Biodex SARL
Priority date: 1997-12-11
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2008-01-24
Anticipated expiration: 2018-12-12
Also published as: ATE305942T1; DE69831805D1; US6646120B1; FR2772382A1; EP0990002B1; WO1999029734A1; FR2772382B1; CA2280949C; AU1567799A; EP0990002A1; CA2280949A1; JP2001523300A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Dextranderivate und ihre Anwendungen als Medikamente mit spezifischer biologischer Wirkung wie beispielsweise Wundheilung, anti-komplementärer Wirkung (Plasmaersatz), proliferationsmodulierender Wirkung oder anti-koagulierender Wirkung und spezifischer mit einer anti-thrombotischen Wirkung, ebenso wie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Verschiedene Dextrane, die mit Seitenketten substituiert sind, die Carboxylat- und Sulfonatgruppen tragen, sind beschrieben worden. Insbesondere beschreiben das französische Patent 2,461,724 und das französische Patent 2,555,589 Dextrane, die mit den besagten Gruppen substituert sind, die entsprechend anti-koagulierende Eigenschaften und anti-koagulierende und anti-inflammatorische Eigenschaften zeigen; das europäische Patent EP 0 462 194 beschreibt die Zell- und Geweberegenerationseigenschaften derartiger substituierter Dextrane.
Es ist auch gezeigt worden, dass derartige substituierte Derivate andere biologische Aktivitäten aufweisen können, abhängig vom Umfang der Substitution mit den Gruppen; insbesondere beschreibt das europäische Patent 0 514 449 Dextrane (D), die mit Carboxymethylgruppen (CM) und Carboxymethylbenzylamidsulfonaten (BS) mit der allgemeinen Formel D_XCM_yBS_Z substituiert sind, wobei X, das die durchschnittliche Anzahl von nicht-substituierten Saccharideinheiten pro 100 Saccharideinheiten angibt, geringer oder gleich 50 ist, Y, das die durchschnittliche Anzahl der Carboxymethylgruppen pro 100 Saccharideinheiten angibt, zwischen 10 und 90 beträgt, und Z, das die durchschnittliche Anzahl von Carboxymethylbenzylamidsulfonaten pro 100 Saccharideinheiten angibt, zwischen 15 und 35 beträgt, um ein Mittel zu erhalten, das das Wachstum von Tumorzellen inhibiert.
Diese verschiedenen Derivate, deren Struktur in 1 zusammengefasst ist, werden im allgemeinen durch statistische Substitution des Dextrans mit drei verschiedenen Gruppen erhalten: Carboxymethyl (CM), Carboxymethylbenzylamid (B) und Carboxymethylbenzylamidsulfonat (S) (Sulfonierung am Aromatenring durch Chlorsulfonsäure).
Genauer:

a) die Carboxymethylierung des Dextrans (Herstellung von CMD) wird durchgeführt in einem basischen wässrigen Medium mittels Monochloressigsäure. Drei aufeinanderfolgende Carboxymethylierungen sind erforderlich, um einen Substitutionsgrad des Dextrans zu erhalten, ausgedrückt als die relative Anzahl von freien Hydroxylgruppen in einer Glucosideinheit des Dextrans (ds), der zwischen 0,7 und 1,1 beträgt;
b) die Kopplung des Benzylamins an die Carboxymethylgruppe (Herstellung von CMDB) basiert auf der Fähigkeit der Caroboxylatfunktion, ein instabiles gemischtes Anhydrid herzustellen, das in der Lage ist, mit einem Reagens zu reagieren, das eine primäre Aminfunktion (R-NH₂) trägt. Zwei unterschiedliche Prozesse oder Aktivierungsreaktionen wurden verwendet, um die Ausbildung eines gemischen Anhydrids zu erreichen: – Einwirkung des Isobutylchlorformates (CIB) oder – Einwirkung des N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolins (EEDQ). In beiden Fällen wird die Reaktion in einem heterogenen Medium ausgeführt: Wasser/Dimethylformamid oder Wasser/Ethanol. Diese zwei Kopplungsprozesse ergeben einen Substitutionsgrad (ds) von etwa 0,08 bis 0,12 in einem einzelnen Schritt. Im Falle der Kopplung mit EEDQ kann der ds 0,25 bis 0,30, in einem einzelnen Schritt, erreichen, wenn das Zwischenprodukt bei einer Temperatur von 30 bis 40°C aktiviert wird. Wie bei der Carboxymethylierung, ist es, um hohe ds-Werte für Benzylamin zu erreichen, nicht möglich, die Konzentration der verschiedenen Reagenzien zu erhöhen. Es ist somit erforderlich, sukzessive Kopplungen durchzuführen, um die Reaktionsausbeute zu verbessern. Das nach der erste Kopplung präzipitierte, gewaschene und getrocknete CMDB wird einer zweiten und/oder dritten Kopplung unter genau den gleichen Bedingungen wie die erste unterzogen, ohne die durch die erste Kopplung bedingten Substitutionen zu berücksichtigen.
c) Die Sulfonierung oder Sulfatierung erfolgt durch die Wirkung von Monochlorsulfonsäure auf das CMDB in einem wasserfreien organischen Medium (z. B. Dichlormethan) und in heterogener Phase, wobei das CMDB nicht in Dichlormethan löslich ist. In einem derartigen heterogenen Medium erfolgt die Verteilung der Sulfate in den Saccharideinheiten ungleichmäßig (RICKETTS, C.R., J. Chem. Soc., 1956, 3752-3756). Es ist erforderlich, die Reaktion mit überschüssiger Monochlorsulfonsäure durchzuführen, während gleichzeitig die Hydrolyse der Polysaccharidkette vermieden wird.

Die Verhältnisse von [HSO₃Cl]/[gebundenen B-Einheiten] für die CMDBs und [HSO₃Cl]/[freie OH] für das CMD reichen von 0,8 bis 3.
Um im wesentlichen eine Sulfonierung der Aromatenringe (B-Einheiten) zu erreichen, sollte das Molverhältnis 3 sein, wohingegen um eine Sulfatierung der Hydroxylfunktionen zu erreichen, die von den Glucosideinheiten getragen werden (Herstellung von Sulfatfunktionen), das Molverhältnis von [HSO₃Cl]/[freie OH] etwa 1 beträgt. In einem jeden Fall sollte die Konzentration von Chlorsulfonsäure im Reaktionsmedium nicht 0,15 M überschreiten. Unter diesen Bedingungen hängt der Prozentsatz der Einheiten, die eine Sulfonatfunktion tragen, von dem Prozentsatz der Einheiten ab, die mit Benzylamidgruppen substituiert sind. Eine neue Studie (MAIGA-REVEL O. et al., Carbohydrates Polymers, 1997, 32, 89-93) hat gezeigt, dass die anti-koagulierende Wirkung der CMDSu (=Carboxymethyldextransulfat) und CMDBS (=Carboxymethyldextranbenzylamidsulfonat)-Dextranderivate des Standes der Technik von ihrem Schwefelgehalt abhängt, jedoch CMDBS eine bessere anti-koagulierende Aktivität aufweist als CMDSu bei einem identischen Schwefelgehalt.
Die unter den oben beschriebenen Bedingungen erhaltenen Dextranderivate weisen den Nachteil auf, dass sie eine ungleichmäßige Verteilung der chemischen Gruppen und der Größe der Polysaccharidketten aufweisen, was zu einem heterogenen Endprodukt führt, dessen Eigenschaften schwer zu steuern sind.
Die Erfinder haben ein neues Verfahren zur Herstellung von Dextranderivaten entwickelt, das eine bessere Herstellung der speziell definierten Produkte erlaubt (kontrollierbarer Substitutionsgrad, gleichmäßige Verteilung der geladenen oder ungeladenen chemischen Gruppen und gleichmäßige Größe der Polysaccharidketten im Endprodukt, Auswahl und bessere Reproduzierbarkeit der erwünschten Aktivität).
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung sind Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, worin
D eine Polysaccharidkette darstellt, die bevorzugterweise aus einer Verkettung von Glucosideinheiten besteht,
CM Carboxymethylgruppen darstellt,
B Carboxymethylbenzylamidgruppen darstellt,
Su Sulfatgruppen darstellt (Sulfatierung der freien Hydroxylfunktionen, die von den Glucosideinheiten getragen werden),
S Sulfonatgruppen darstellt (Sulfonierung der aromatischen Ringe),
a, b, c und d den Substitutionsgrad (ds) darstellen, ausgedrückt relativ zur Anzahl freier Hydroxylgruppen in einer Glucosideinheit des Dextrans, mit Gruppen CM, B, Su und S; wobei a ≥ 0,3, b gleich 0 oder ≥ 0,1 ist, c gleich 0 oder ≥ 0,1 ist und d gleich 0 oder ≤ 0,15 ist, unter der Bedingung, dass wenn d = 0 ist, a und b 0 sind, wobei die Produkte folgendes zeigen:

– eine gleichmäßige Größenverteilung der Ketten, dargestellt durch ein symmetrisches Gass-Elutionsprofil bei der leistungsstarken sterischen Ausschlusschromatographie, und
– eine gleichmäßige Verteilung der geladenen chemischen Gruppen, dargestellt durch ein Elutionsprofil mit einer einzelnen symmetrischen Spitze bei der Niederdruckionenaustauschchromatographie.

Diese Produkte werden als Copolymere betrachtet, die aus fiktiven Untereinheiten R-OH und R-OX bestehen, wobei X ein Methylcarboxylat (CM), Benzylamid (B), Sulfat (Su), oder Sulfonat (S)-Gruppe ist, die Polysaccharidkette des unsubstituierten Dextrans aus 300 fiktiven R-OH Untereinheiten besteht, statt der 100 Glucosideinheiten, mit Blick darauf, dass eine unsubstituierte Glucosideinheit drei freie Hydroxylgruppen umfasst. Entsprechend enthält ein Methylcarboxylatdextran (DCM) mit einem Substitutionsgrad (ds) von 1,2 1,20 substituierte Gruppen (R-CM) und 1,80 freie Hydroxylgruppen (R-OH) pro Glucosideinheit.
Somit erhält man im Gegensatz zu den heterogenen Produkten des Standes der Technik homogene Produkte mit einer gezielten Zusammensetzung, bei der sich die bioaktiven chemischen Gruppen entlang den makromolekularen Ketten in einer spezifischen Reihenfolge befinden, was dem Produkt eine biologische Eigenschaft verleiht, die nicht von einem Produkt mit der gleichen Gesamtzusammensetzung gezeigt werden würde, bei dem aber die Verteilung der Gruppen entlang den makromolekularen Ketten verschieden ist (insbesondere unterschiedliche Herstellung).
Mit anderen Worten verleiht bei den Dextranderivaten gemäß der Erfindung die Verteilung der chemischen Gruppen dem Endprodukt eine spezifische biologische Eigenschaft; die Folge einer derartigen Verteilung besteht darin, dass die chemische Zusammensetzung einer jeden Polysaccharidkette identisch ist mit der chemischen Gesamtzusammensetzung des Produktes. Entsprechend gibt es eine optimale chemische Zusammensetzung für eine maximale spezifische Aktivität; es besteht somit eine direkte Beziehung zwischen der betrachteten biologischen Aktivität und der chemischen Gesamtzusammensetzung des Produktes.
Zum Beispiel:

– die Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wie oben definiert, worin a ≥ 0,6, b ≠ 0, und c gleich 0 oder ≤ 0,5 und d ≤ 0,1 oder d gleich 0 ist, sind im wesentlichen Wundheilmittel, bevorzugterweise wenn sie eine molare Masse aufweisen zwischen 3.000 und 500.000 g/Mol; die als Wundheilungsmittel bevorzugten Dextranderivate sind jene, bei denen a zwischen 0,7 und 0,9; c ≤ 0,5 und d ≤ 0,15 oder gleich 0 ist;
– die Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wie oben definiert, bei denen a ≥ 0,3, b ≠ 0, c gleich 0 oder ≤ 0,4 ist, und d ≤ 0,15 oder gleich 0 ist, sind im wesentlichen Mittel mit anti-komplementärer Wirkung und Plasmaersatz, bevorzugterweise wenn sie eine Molmasse zwischen 10.000 und 60.000 g/Mol aufweisen; die Dextranderivate, die als Mittel mit anti-komplementärer Wirkung und als Plasmaersatz bevorzugt sind, sind jene, bei denen a zwischen 0,40 und 1,15, b ≤ 0,4, c ≤ 0,2 und d ≤ 0,15 oder gleich 0 ist;
– die Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wie oben definiert, bei denen a ≥ 0,5, b ≠ 0, c gleich 0 oder ≤ 0,4 und d ≤ 0,15 ist, sind im wesentlichen Mittel zum Modulieren der Zellproliferation, bevorzugterweise wenn sie eine Molmasse zwischen 3.000 und 100.000 g/Mol aufweisen; die Dextranderivate, die als Mittel für die Modulierung der Zellproliferation bevorzugt sind, sind jene, bei denen a zwischen 0,5 und 1,2 ist, b zwischen 0,2 und 0,6 ist, c zwischen 0,1 und 0,4 ist und d ≤ 0,15 oder gleich 0 ist; und
– die Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wie oben definiert, bei denen a ≥ 0,4, c ≥ 0,3 und d ≤ 0,15 oder gleich 0 sind, sind im wesentlichen anti-koagulierende Agenzien, bevorzugterweise wenn sie eine Molmasse zwischen 3.000 und 20.000 g/Mol und einen Wert für b ≠ 0 aufweisen.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung sind Medikamente, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als Wirkstoff wenigstens ein Dextranderivat, wie hierin oben definiert umfassen, optional kombiniert mit einem weiteren Wirkstoff und/oder wenigstens einem pharmazeutisch akzeptablen Vehikel und/oder einem physiologisch aktiven Träger, bevorzugterweise einem Liposom umfassen.
Die Wirkstoffe sind aus der Gruppe ausgewählt umfassend die Dextrane, die Wachstumsfaktoren (beispielsweise Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) oder ein basischer FGF), Lokalanästhetika, Antiinfektiva, Serumproteine und Kollagen.
Die vorliegende Erfindung hat auch zum Gegenstand ein Verfahren zur Herstellung (Verfahren 1) von Dextranderivaten mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wie hierin oben definiert, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Carboxymethylierung umfassend (i) die Aktivierung eines unsubstituierten Dextrans, indem Dextran in Kontakt gebracht wird mit einem zweiphasigen flüssigen wässrig-alkoholischen Medium für wenigstens eine Stunde unter Rühren, (ii) Hinzugeben der Monochloressigsäure zu dem aktivierten Produkt, bei einer Temperatur zwischen 40 und 90°C, bevorzugterweise 60°C, wobei das Verhältnis R_CM, das gleich der Anzahl von Molen von Monochloressigsäure/Anzahl der Mole von OH ist, zwischen 0,3 und 2 beträgt, (iii) Isolieren und optional Reinigen des erhaltenen Dextranmethylcarboxylates (DCM).
b) Koppeln von Benzylamin mit den Carboxymethylgruppen (Benzylamidierung) umfassend (i) Kontaktieren, für wenigstens zwei Stunden in einem sauren wässrigen Medium, des in a) erhaltenen DCM mit einem primären Amin (Benzylamin), in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids wie beispielsweise 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-meta-p-Toluensulfonat (CMC) oder dem Chlorhydrat von 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimid (EDC) als Kopplungsreagens bei einer Temperatur zwischen 0°C und 30°C, wobei das molare Verhältnis von CMC/CM zwischen 0,25 und 2 und das molare Verhältnis von Benzylamin/CM zwischen 0,25 und 2 beträgt, (ii) Isolieren des erhaltenen Dextranmethylcarboxylbenzylamids (DCMB), und optional dessen Reinigung. Ein derartiger Schritt, der in einem homogenen Medium und in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids als Kopplungsreagens durchgeführt wird, erlaubt eine bessere Steuerung der Reaktion und damit der Herstellung des Endproduktes, wobei dieses Produkt eine gleichmäßige Kettengrößenverteilung, dargestellt durch ein Gausssymmetrisches Elutionsprofil bei sterischer Hochleistungsausschlusschromatographie, und eine gleichmäßige Verteilung geladener chemischer Gruppen aufweist, wie dargestellt durch ein Elutionsprofil mit einer einzelnen symmetrischen Spitze bei Niederdruckionenaustauschchromatographie.
c) Sulfatierung umfassend (i) die Bildung eines Trialkylammoniumsalzes des in b) erhaltenen DCMB, (ii) die Solubilisierung des in einem wasserfreien polaren Lösungsmittel, im allgemeinen eine Lewis-Base (Elektronendonator), wie beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF), erhaltenen Salzes und (iii) Hinzugeben zu dem gelösten Salz eines Komplexes auf der Grundlage von Schwefeltrioxid, wie beispielsweise SO₃-Pyridin, SO₃-Triethylamin oder SO₃-DMF, gelöst in dem gleichen Lösungsmittel, bei einer Temperatur von weniger als 70°C, wobei das Molarverhältnis des Schwefeltrioxidkomplexes zu freiem OH zwischen 0,25 und 12 beträgt und optional
d) Sulfonierung der Gruppen B durch Mischen, unter Rühren, eines Derivates von DCMBSu in Suspension in einem wasserfreien Lösungsmittel mit Chlorsulfonsäure, die in dem gleichen Lösungsmittel gelöst ist, bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und dem Siedepunkt des verwendeten Lösungsmittels.

Unerwarteter Weise erlaubt das Verfahren der Erfindung, dass der Substitutionsgrad des Dextrans bei einer Anzahl von Schritten gesteuert wird, die signifikant geringer ist als die Anzahl von Schritten in den Verfahren nach dem Stand der Technik, um Produkte mit einem Gauss-symmetrischen Elutionsprofil bei sterischer Hochleistungsausschlusschromatographie mit einem Elutionsprofil mit einer einzelnen Spitze bei Niederdruckionenaustauschchromatographie und mit der erwünschten biologischen Aktivität zu ergeben, mit Ausbeuten, die signifikant höher sind als jene nach dem Stand der Technik.
Zusätzlich erlaubt das Verfahren gemäß der Erfindung, ein Produkt mit einer erwünschten chemischen Zusammensetzung für die ausgewählte biologische Eigenschaft reproduzierbar zu synthetisieren. Somit entspricht eine biologische Aktivität bevorzugterweise einer gegebenen Zusammensetzung eines Produktes.
Beispielsweise ergibt Schritt a), in einem einzigen Schritt, einen ds mit CM von 1,0 ± 0,1 pro Glucosideinheit und eine Ausbeute von mehr als oder gleich 80%, für einen Wert von R_CM = 0,85, in einem gemischten Medium aus Wasser/tert.-Butanol oder Wasser/Isopropanol (15/85 Vol./Vol.) unter Rühren für zwei Stunde bei 60°C. Ausgehend von einem DCM mit einem ds von CM = 1 erhält man, für ein Molverhältnis von CMC/CM von 0,75 und einem Molverhältnis von 1 für Benzylamin/CM und unter Rühren bei Raumtemperatur für 16 Stunden, ein DCMB-Produkt mit einem ds mit CM von 0,70 ± 0,05 und einen ds mit B von 0,30 ± 0,03, mit einer Ausbeute von mehr als 80%; und Schritt c) ergibt eine Ausbeute von ≥ 60%.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens beträgt in Schritt a) das Verhältnis Wasser:Alkohol zwischen 10/90 (Vol./Vol.) und 25/75 (Vol./Vol.) und beträgt bevorzugterweise 15/85 (Vol./Vol.).
Als eine Variante umfasst das Verfahren (Verfahren 2) zur Herstellung der Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wie hierin oben definiert, bei der a ≠ 0, b von 0 verschieden und d = 0 ist, die folgenden Schritte:

a) Herstellung von N-Methylphenyl-2-chloracetamid durch Kontaktieren eines Benzylamins mit Chloracetylchlorid, gefolgt von Isolieren und Reinigen des Produktes;
b) Kontaktieren des Dextrans, das in einer basischen wässrig-alkoholischen Lösung gelöst ist, sukzessiv mit N-Methylphenyl-2-chloracetamid in alkoholischer Lösung, das in Schritt a) erhalten wird, in Gegenwart von Monochloressigsäure in alkoholischer Lösung, wobei die erhaltene Mischung bei einer Temperatur oberhalb 40°C gehalten wird, bevorzugterweise bei 60°C, gefolgt von Isolieren und optionalem Reinigen des erhaltenen DCMB und
c) Sulfatieren des in b) erhaltenen Produktes umfassend (i) Ausbildung eines Trialkylammoniumsalzes, (ii) Auflösen des erhaltenen Salzes in einem wasserfreien polaren Lösungsmittel, im allgemeinen einer Lewis-Base wie beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF), (iii) Hinzugeben eines Komplexes zu dem gelösten Salz basierend auf Schwefeltrioxid wie beispielsweise SO₃-Pyridin, SO₃-Triethylamin oder SO₃-DMF, gelöst in dem gleichen Lösungsmittel, bei einer Temperatur von weniger als 70°C, wobei das Molverhältnis von dem Komplex auf der Basis von Schwefeltrioxid zu freiem OH zwischen 0,25 und 12 beträgt, und (iv) Isolieren und optionales Reinigen des erhaltenen DCMBSu.

Das Vorhandensein der obigen Schritte b) und c) macht es möglich, die gleiche Gleichmäßigkeit des Endproduktes zu erhalten, wie die in dem obigen Verfahren 1 erhaltene.
Um die Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DMC_aB_bSu_cS_d, wie hierin oben definiert, herzustellen, wobei a verschieden von 0, b = 0 und d = 0 ist (→DMCSu) (Verfahren 3), ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst:

a) Carboxymethylierung eines nichtsubstituierten Dextrans unter den oben angegebenen Bedingungen, und
b) Sulfatieren des in a) erhaltenden DMC unter den oben angegebenen Bedingungen.

Neben den vorhergehenden Ausführungsformen umfasst die Erfindung auch andere Ausführungsformen, die sich aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Beispiele zur Ausführung des Verfahrens, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, ebenso wie aus den beigefügten Figuren ergeben, wobei
1 schematisch die Struktur eines mit den verschiedenen chemischen Gruppen substituierten Dextrans zeigt, die an die Glucosideinheiten gebunden sind, wobei die Position des Substituenten an den verschiedenen Kohlenstoffen der Glucosidbasiseinheiten bei 2 beispielhaft gezeigt ist;
2 das sterische Hochleistungsausschlusschromatogramm zeigt, das mit einem Dextranderivat erhalten wird, wie es oben definiert ist (DMCBSu);
3 das Ionenaustauschchromatogramm zeigt, dass mit einem Dextranderivat erhalten wird, wie es oben beschrieben ist (DMCBSu).
Es sollte jedoch auf jeden Fall verstanden werden, dass diese Beispiele lediglich zu Zwecken der Veranschaulichung des Gegenstandes der Erfindung angegeben sind und sie in keinster Weise eine Beschränkung darstellen.
BEISPIEL 1: Physiko-chemische Charakterisierung der erhaltenen Produkte.
*Säure-Base-Test
Der azidimetrische Test liefert eine Abschätzung der Anzahl von Milliäquivalenten von Carboxylmethylgruppen und erlaubt, die Zusammensetzung des Endproduktes zu bestimmen.
*Verfahrensweise
Eine Titrationskalibrierung bestimmt die Molarität des Natriumhydroxyds mittels eines Standards: Kaliummonohydrogenphthalat.
Zwischen 15 und 25 mg eines gereinigten, getrockneten (unter Vakuum bei 40°C) und sehr genau abgewogenen Produktes werden in einer Mischung aus Wasser/Aceton (50:50, Vol./Vol.) gelöst, so dass eine Lösung mit einer Endkonzentration von etwa 0,25 mg/ml erhalten wird.
Der auftretende pH, der dann zwischen 7 und 8 ist, wird auf zwischen 2,8 und 3 abgesenkt unter Verwendung einer 10% HNO₃-Lösung. Das Hinzugeben der Titrationslösung erfolgt mit einer automatischen Präzisionsmikrobürette mit einem Gesamtvolumen von 5 ml. Wenigstens drei Tests werden an einem jeden Produkt durchgeführt und die Ergebnisse, ausgedrückt als Milliäquivalente der Carboxymethylfunktionen pro Gramm Polymer, erlauben die Berechnung des Substitutionsgrades mit Carboxymethyl. Dieses Verfahren erlaubt auch, den Substitutionsgrad mit B-Einheiten abzuschätzen durch die Differenz der Anzahl der Milliäquivalente von Carboxymethylfunktionen vor und nach Benzylamidierung. Für alle Produkte wurden die Zusammensetzungen mit Hilfe der Elementaranalyse bestimmt.
*Elementaranalyse von Stickstoff, Schwefel und Chlor
Die Bestimmung des Stickstoffs und des Schwefels durch Elementaranalyse, ausgedrückt als Gramm des Elements pro 100 g Produkt, erlaubt es, den Prozentsatz der Substitution mit Benzylamid (B), Sulfonat (S) bzw. Sulfat (Su)-Gruppen zu bestimmen.
Die Bestimmung des Chlors erlaubt es, den Reinheitsgrad der Proben zu überprüfen, wobei der Prozentsatz an Salz (NaCl) 1 bis 2% nach der Reinigung nicht überschreiten darf.
*Desulfatierung der Produkte (DCMBSuS)
Das Produkt in der Form des Natriumsalzes (250 mg, 10 ml) wird langsam bei Raumtemperatur mit 3 ml Kationenaustauschharz gerührt (Amberlite IR 120 H⁺, 16–45 Mesh, Gesamtaustauschkapazität: 1,9 mÄq/ml). Nach 2 Stunden wird die saure Lösung filtiert, mit Pyridin (1 bis 2 ml) bis zu einem pH von 6 bis 6,5 neutralisiert und bis zur Trockne eingedampft. Das erhaltene Pyridinsalz wird dreimal mit 10 ml wasserfreiem Ethanol aufgenommen und bis zur Trockne verdampft.
Der Rückstand wird in 25 ml einer "90:9:1" Mischung aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Methanol und Pyridin dispergiert. Die Lösung wird in einem auf 90°C erhitzten Ölbad für 72 Stunden gerührt. Die Reaktion wird gestoppt durch Hinzugeben von 20 ml kaltem doppeltdestillierten Wasser und die Mischung wird dann mit wässriger 1 M NaOH-Lösung neutralisiert. Das desulfatierte Produkt wird durch sterische Niederdruckausschlusschromatrographie auf einer Sephadex-Säule G15 gereinigt und dann diafiltriert in einer Zelle, die mit einer Membran mit einer Ausschlussschwelle von 1.000 Da versehen ist. Es werden zwischen 160 und 210 mg des desulfatierten Produktes erhalten.
*Bestimmung der Molmasse
Die Molmasse der hergestellten Produkte wird bestimmt durch sterische Hochleistungsausschlusschromatographie (HPSEC). Drei Säulensysteme wurden verwendet:

– zwei in Serie geschaltete Säulen (Si300 diol und Hma Sec Bio 40), die einen Fraktionierungsbereich zwischen 10⁶ und 5.000 g/Mol abdecken,
– eine Zorbax GF450-Säule (Ausschlussbereich: 450.000–20.000 g/Mol),
– eine TSK Gel G2000-Säule (Ausschlussbereich: 40.000–1.000 g/Mol).

Sie werden unter Verwendung eines Kits von Pullulanen (853.000 bis 5.800 g/Mil); enzymatischen Dextrans (Oligosaccharid, 1.500 g/Mol); Melezitose (Trisaccharid, 522 g/Mol); Saccharose (Disaccharid, 342 g/Mol) und Glucose (Monosaccharid, 180 g/Mol) kalibriert. Die zu analysierenden Proben werden hergestellt (zu 2 mg/mL) und mit einer Lösung eluiert aus 0,15 M NaCl, 0,05 M Na₂HPO₄ gepuffert auf pH 7,3. Nach der Filtration durch einen Filter mit einer Porosität von 0,2 μm werden 100 μl der Probe injiziert, wobei die Flussrate mittels einer Pumpe vom Typ Waters 510 angepasst wird und der Nachweis am Säulenende durch Differenzialrefraktometrie erfolgt. Die durch die GPC Chromstar-Analyse-Software bearbeiteten Chromatogramme erlauben es, die Gewichtsmittelmolmasse (Mp) und die Zahlenmittelmolmasse (Mn) ebenso wie den Polydispersionsindex der Produkte zu bestimmen.
*Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR)
1 mg des zu analysierenden Produktes wird mit einer Lösung aus 150 mg KBr in 1 ml bidestillierten Wassers gemischt. Die Mischung wird durch einen Filter mit einer Porosität von 0,45 μm filtriert, eingefroren und lyophilisiert; mit dem erhaltenen Pulver wird eine Scheibe hergestellt und das Spektrum unmittelbar aufgezeichnet. Die Vorrichtung ist ein FTIR-Spektrometer (Perkin Elmer Model 1600) und die Spektren werden auf einem Computer mit der IRDM Software (Perkin Elmer) verarbeitet.
BEISPIEL 2: Herstellung verschiedener DCMBSu mit b = 0 oder b ≠ 0.

Die unten angegebene Tabelle 1 zeigt die verschiedenen erhaltenen Derivate und ihre Eigenschaften, erstellt nach der Analyse des Endproduktes. TABELLE 1

Produkte	Synthese-Bedingungen	Substitutionsgrad der Zusammensetzung ± 10%			Molmasse	Biologische Hauptaktivität
Produkte	Synthese-Bedingungen	CM	B	Su	(g/Mol)	Biologische Hauptaktivität
DCMBSu1	a	0,75	0,20	0,15	48000	SP
DCMBSu2	b	0,80	0,25	0,15	70 000	SP
DCMBSu3	c	1,10	0,40	0,40	59 000	C
DCMBSu4	d	0,70	0,30	0,25	48 000	SP
DCMBSu5	e	0,80	0,35	0,15	56 000	MP
DCMBSu6	f	0,60	0,50	0,30	63 000	MP
DCMBSu7	g	0,70	0,30	0,16	70 000	MP
DCMBSu8	h	0,70	0,20	0,35	67 000	SP
DCMBSu	i	1,00	0	0,37	70 000	AC
SP = Plasmaersatz, C = Wundheilung, AC = anti-koagulierend, MP = Zellwachstumsmodulator

a) DCMBSu1
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l Reaktor dispergiert, der bei Raumtemperature gehalten wird und mit einem Rührwerk ausgestattet ist.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml bidestilliertem Wasser in einem 500 ml Becher gelöst. Die enthaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für eine Stunde gerührt.
72,9 g (0,77 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/OH = 2,5) in einem 1 l Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehenen Reaktor eingeführt und die Mischung mit Hilfe eines an dem Reaktor angebrachten Thermostaten auf 60°C gebracht. Die Mischung wird unter Rühren bei dieser Temperatur für 1 Stunde 30 Minuten gehalten.
Die wässrige Phase wird danach wiedergewonnen und verdünnt, bis ein Volumen von 2,5 l erhalten wird. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird bei konstanten Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 5.000 g/Mol mit bidestilliertem Wasser gereinigt, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 28 g/l. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert.
70 g (0,289 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad CM von 1,0 ± 0,1 werden erhalten.
Benzylamidierung
Der pH der obigen Lösung wird auf 4,75 eingestellt. Die Mischung wird auf 4°C gekühlt. 62,3 g Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM = 0,5). Nachdem das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden 16 ml Benzylamin schnell hinzugegeben (Molverhältnis Benzylamin/CM = 0,5). Die Mischung wird dann für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wird dann bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 5.000 g/Mol ultrafiltriert, sukzessive mit 15 l Osmose-behandeltem Wasser auf einen pH von 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration dieser Lösung beträgt 21 g/l (3 l). 20 ml dieser konzentrierten Lösung werden für die Analysen eingefroren und lyophilisiert. Der Substitutionsgrad mit MC und B beträgt 0,79 ± 0,07 und 0,22 ± 0,03.
Sulfatierung
Die Sulfatierung erfordert die Herstellung des Triethylammoniumsalzes von DCMB.
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine IR 120 H+ Kationenaustauschsäule (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin bis auf einen pH nahe 7,0 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 65 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 65 g (0,365 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C für 5 Stunden getrocknet, zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material. Dieses Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden, der mit einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem versehen ist, in 1,7 l DMSO gelöst, das über Molekularsiebe mit 4 Å vorgetrocknet ist. 24,5 g (0,154 Mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,4) des SO₃-Pyridinkomplexes werden in 300 ml DMSO gelöst und langsam zu der Lösung des Triethylammoniumsalzes hinzugegeben. Die Mischung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt, indem 2 l doppelt-destilliertes Wasser mit 4°C zu der Mischung zugegeben werden und der pH des Mediums auf 7,5 bis 8 unter Verwendung von 2M NaOH-Lösung gebracht wird. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO-Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten ist und bei konstantem Volumen mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgrenze von 5.000 g/Mol ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und auf ein konstantes Volumen an der gleichen Membran ultrafiltriert, sukzessiv mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens konzentriert, eingefroren und lyophilisiert. 60 g DCMBSu1 werden so erhalten. Die Elementaranalyse des Schwefels ergibt einen ds mit Sulfatgruppen von 0,15 ± 0,02.
b) DCMBSu2
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem 2 l Reaktor mit einem Mantel dispergiert, der bei Raumtemperatur gehalten wird und mit einem Rührwerk versehen ist.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem 500 ml Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Die Mischung wird für eine Stunde gerührt.
87,5 g (0,93 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol in einem 1 l Becher (Molverhältnis Säure/OH = 3) gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehenen Reaktor eingeführt und die Mischung mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten auf 60°C gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur für 2 Stunden unter Rühren gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und verdünnt, bis ein Volumen von 2,5 l erhalten wird. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol mit doppelt-destilliertem Wasser gereinigt, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 28 g/l. 20 ml dieser Lösung werden für die Analysen eingefroren und lyophilisiert.
70 g (0,28 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit CM von 1,1 ± 0,1 werden erhalten.
Benzylamidierung
Der pH der oben erhaltenen Lösung wird auf 4,75 eingestellt. Die Mischung wird auf 4°C gekühlt. 87,5 g Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM = 0,7). Wenn das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden schnell 22,2 ml Benzylamin hinzugegeben (Molverhältnis Benzylamid/CM = 0,7). Die Mischung wird dann für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wird dann bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer molekularen Ausschlussgrenze von 5.000 g/Mol ultrafiltriert, sukzessive mit 15 ml Osmose-behandeltem Wasser auf einen pH von 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration dieser Lösung beträgt 21 g/l (3 l). 20 ml dieser konzentrierten Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert. Die Substitutionsgrade mit CM und B beträgt 0,85 ± 0,07 bzw. 0,27 ± 0,03.
Sulfatierung
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine IR 120 H+-Kationenaustauschharzsäule (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin auf einen pH nahe 7,0 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 65 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 65 g (0,365 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C über 5 Stunden getrocknet, zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material. Dieses Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden, der mit einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem versehen ist, in einem über einem Molekularsieb mit 4 Å vorgetrocknetem DMSO gelöst. 22,9 g (0,144 Mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,4) des SO₃-Pyridinkomplexes werden in 300 ml DMSO gehst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 2 l doppelt-destilliertem Wasser mit 4°C zur der Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,5 bis 8 unter Verwendung einer 2 M NaOH-Lösung eingestellt. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten wird, und wird mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol auf ein konstantes Volumen ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und bei konstantem Volumen an der gleichen Membran sukzessive mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens konzentriert, eingefroren und lyophilisiert. 60 g DCMBSu2 mit einem Substitutionsgrad mit Su-Gruppen von 0,15 ± 0,02 werden somit erhalten.
c) DCMBSu3
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l Reaktor dispergiert, der bei Raumtemperatur gehalten wird und mit einem Rührwerk versehen ist.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem 500 ml Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C abgekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für eine Stunde gerührt.
72,9 g (0,77 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/OH = 2,5) in einem 1 l Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in dem mit einem Mantel versehenen Reaktor eingeführt und die Mischung auf 60°C mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur unter Rühren für 2 Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und gereinigt:

– entweder durch eine Doppelpräzipitation in 3 l Methanol. Das solchermaßen gewonnene Präzipitat wird zweifach mit Methanol gewaschen und in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C getrocknet,
– oder durch Tangentialfiltration an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 Dalton.

Die gereinigte Lösung wird dann konzentriert und lyophilisiert. 70 g (0,289 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit CM von 1,0 ± 0,1 werden erhalten.
Erneute Carboxymethylierung des DCM
Die 70 g (0,289 Mol oder 0,578 Mol freies OH) von dem erhaltenen DCM werden in 1.035 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 3 l Reaktor dispergiert, der bei Raumtemperatur gehalten wird und mit einem Rührwerk versehen ist.
46,4 g (1,16 Mol) NaOH werden in 265 ml in einem 500 ml Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für eine Stunde gerührt.
54,6 g (0,578 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/freies OH = 1) in einem 1 l Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehenen Reaktor eingeführt und die Reaktion mit Hilfe eines an dem Reaktor angebrachten Thermostaten auf 60°C gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur unter Rühren für zwei Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und verdünnt, bis ein Volumen von 2,5 l erhalten ist. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol mit doppelt-destilliertem Wasser gereinigt, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 30 g/l. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert.
75 g (0,26 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit CM von 1,58 ± 0,12 werden erhalten.
Benzylamidierung
Der pH der obigen Lösung wird auf 4,75 eingestellt. 169 g Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM=1). Wenn das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden 43,7 Mol Benzylamin (Molverhältnis Benzylamin/CM = 1) schnell hinzugegeben. Die Mischung wird dann für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wird dann bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol sukzessiv mit 15 l Osmose-behandeltem Wasser auf pH 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration dieser Lösung beträgt 22 g/l (3 l). 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert. Der Substitutionsgrad mit CM und B beträgt 1,15 ± 0,10 bzw. 0,44 ± 0,04.
Sulfatierung
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine Säule mit IR 120 H+-Kationenaustauschharz (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin auf einen pH nahe 7 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 70 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 70 g (0,24 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C für 5 Stunden zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material getrocknet. Dieses Salz wird dann, in einem Dreihalskolben mit rundem Boden, der mit einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem versehen ist, in 1,7 DMSO gelöst, das über Molekularsiebe mit 4 Å vorgetrocknet ist. 30,7 g (0,193 Mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,8) des SO₃-Pyridinkomplexes werden in 300 ml DMSO gelöst und dann langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 2 l doppelt-destilliertem Wasser mit 4°C zur Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,5 bis 8 gebracht mittels 2 M NaOH-Lösung. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO-Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten wird, und wird bei konstantem Volumen mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und auf ein konstantes Volumen an derselben Membran sukzessive mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens konzentriert, eingefroren und lyophilisiert. 65 g DCMBSu3 mit einem Substitutionsgrad mit Sulfatgruppen von 0,40 ± 0,04 werden solchermaßen erhalten.
d) DCMBSu4
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l Reaktor dispergiert, der bei Raumtemperatur gehalten und mit einem Rührwerk versehen ist.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem 500 ml Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für 1 Stunde gerührt.
72,9 g (0,77 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/OH = 2,5) in einem 1 l Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehenen Reaktor eingeführt und die Mischung wird mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten auf 60°C gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur, unter Rühren, für 2 Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und verdünnt, bis ein Volumen von 2,5 l erhalten wird. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol gereinigt, mit doppelt-destilliertem Wasser, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 28 g/l. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert.
Man erhält 70 g (0,284 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit CM von 1,05 ± 0,10.
Benzylamidierung
Der pH der obigen Lösung wird auf 4,75 eingestellt. 126,5 g des Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM = 0,8). Wenn das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden 32,6 ml Benzylamin schnell hinzugegeben (Molverhältnis Benzylamin/CM = 0,8). Die Mischung wird danach für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wird dann bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol sukzessiv mit 15 l Osmose-behandelten Wasser auf pH 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration dieser Lösung beträgt 21 g/l (3 l). 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert. Der Substitutionsgrad mit MC und B beträgt 0,74 ± 0,06 bzw. 0,33 ± 0,03.
Sulfatierung
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine Säule mit IR 120 H+-Kationenaustauschharz (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin auf einen pH nahe 7,0 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 65 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 65 g (0,38 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C für 5 Stunden zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material getrocknet. Dieses Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden und einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem in 1,7 l DMSO gelöst, das über Molekularsieben mit 4 Å vorgetrocknet war. 30,2 g (0,154 Mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,5) des SO₃-Pyridinkomplexes werden in 300 ml DMSO gelöst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 2 l doppelt-destilliertem Wasser mit 4°C zur Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,5 bis 8 unter Verwendung einer 2 M NaOH-Lösung eingestellt. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten wird, und auf ein konstantes Volumen mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und auf ein konstantes Volumen an der gleichen Membran sukzessive mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens gereinigt, eingefroren und lyophilisiert. 60 g DCMBSu4 mit einem Substitutionsgrad mit Su-Gruppen von 0,25 ± 0,03 werden somit erhalten.
e) DCMBSu5
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l Reaktor dispergiert, der bei Raumtemperatur gehalten und mit einem Rührwerk versehen ist.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem 500 ml Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für 1 Stunde gerührt.
117,2 g (0,124 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/OH = 4) in einem 1 l Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehen Reaktor eingeführt und die Mischung wird mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten auf 60°C gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur, unter Rühren, für 2 Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und verdünnt, bis ein Volumen von 2,5 l erhalten wird. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol mit doppelt-destilliertem Wasser gereinigt, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 28 g/l. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert.
70 g (0,271 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit MC von 1,2 ± 0,11 werden erhalten.
Benzylamidierung
Der pH der obigen Lösung wird auf 4,75 eingestellt. 124,1 g des Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM = 0,9). Wenn das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden 35,5 ml Benzylamin schnell hinzugegeben (Molverhältnis Benzylamin/CM = 0,9). Die Mischung wird danach für 16 Stunden bei Raumtemperatur gehalten.
Die Mischung wird dann bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol sukzessiv mit 15 l Osmose-behandelten Wassers auf pH 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration dieser Lösung beträgt 21 g/l (3 1). 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert. Der Substitutionsgrad mit CM und B beträgt 0,84 ± 0,07 bzw. 0,38 ± 0,04.
Sulfatierung
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine Säule mit IR 120 H+-Kationenaustauschharz (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin auf einen pH nahe 7 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 67 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 67 g (0,33 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C für 5 Stunden getrocknet, zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material. Dieses Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden und einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem in 1,7 l DMSO gelöst, das über Molekülsiebe mit 4 Å vorgetrocknet war. 21 g (0,132 Mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,4) des SO₃- Pyridinkomplexes werden in 300 ml DMSO gelöst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 2 l doppelt-destillierten Wassers mit 4°C zur Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,5 bis 8 unter Verwendung einer 2 M NaOH-Lösung gebracht. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten wird, und bei konstantem Volumen mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und auf ein konstantes Volumen an der gleichen Membran sukzessive mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens konzentriert, eingefroren und lyophilisiert. 62 g DCMBSu5 mit einem Substitutionsgrad mit Su-Gruppen von 0,15 ± 0,02 werden somit erhalten.
f) DCMBSu6
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l Reaktor dispergiert, der bei Raumtemperatur gehalten und mit einem Rührwerk versehen ist.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem 500 ml Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für 1 Stunde gerührt.
87,5 g (0,93 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/OH = 3) in einem 1 l Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehenen Reaktor eingeführt und die Mischung mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten auf 60°C gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur, unter Rühren, für 2 Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und verdünnt bis ein Volumen von 2,5 l erhalten wird. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol mit doppelt-destilliertem Wasser gereinigt, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 28 g/l. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert.
70 g (0,28 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit CM von 1,1 ± 0,10 werden erhalten.
Erste Benzylamidierung
Der pH der obigen Lösung wird auf 4,75 eingestellt. 130,5 g des Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM = 1). Wenn das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden 30,3 ml Benzylamin schnell hinzugegeben (Molverhältnis Benzylamin/CM = 0,9). Die Mischung wird danach für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wird dann bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol sukzessive mit 15 l Osmose-behandelten Wasserss auf pH 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Lösung wird auf ein Volumen von 2,5 l (∼28 g/l oder 0,1 Mol/l) konzentriert. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert. Der Substitutionsgrad mit CM und B beträgt 0,75 ± 0,06 bzw. 0,38 ± 0,04.
Zweite Benzylamidierung
Der pH der 2,5 l der obigen DCMB-Lösung wird erneut auf 4,75 eingestellt. Die Mischung wird auf 4°C gekühlt. 40 g des Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM = 0,5). Wenn das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden 10,3 ml Benzylamin hinzugegeben (Molverhältnis Benzylamin/CM = 0,5). Die Mischung wird danach für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wird dann bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol sukzessive mit 15 l Osmose-behandelten Wasser auf pH 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration dieser Lösung beträgt 21 g/l (3 l). 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert. Der Substitutionsgrad mit CM und B beträgt 0,65 ± 0,06 bzw. 0,54 ± 0,05.
Sulfatierung
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine Säule mit IR 120 H+-Kationenaustauschharz (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin auf einen pH nahe 7 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 65 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 65 g (0,365 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C für 5 Stunden getrocknet, zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material. Dieses Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden, der mit einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem versehen ist, in 1,7 l DMSO gelöst, das über einem Molekularsieb mit 4 Å vorgetrocknet war. 34,9 g (0,219 Mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,6) des SO₃-Pyridinkomplexes werden in 300 ml DMSO gelöst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 2 l doppelt-destillierten Wassers mit 4°C zur Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,5 bis 8 unter Verwendung einer 2 M NaOH-Lösung gebracht. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten wird, und mit einem konstanten Volumen mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und mit einem konstanten Volumen an der gleichen Membran sukzessive mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens konzentriert, eingefroren und lyophilisiert. 60 g DCMBSu6 mit einem Substitutionsgrad mit Su-Gruppen von 0,30 ± 0,03 werden somit erhalten.
g) DCMBSu7
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l Reaktor dispergiert, der bei Raumtemperatur gehalten und mit einem Rührwerk versehen ist.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem 500 ml Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für 1 Stunde gerührt.
72,9 g (0,77 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/OH = 2,5) in einem 1 l Becher gelöst. Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehen Reaktor eingeführt und die Mischung wird mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten auf 60°C gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur, unter Rühren, für 2 Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und verdünnt, bis ein Volumen von 2,5 l erhalten wird. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird gereinigt mit einem konstanten Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol, mit doppelt-destilliertem Wasser, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 28 g/l. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert.
70 g (0,284 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit CM von 1,05 werden erhalten.
Benzylamidierung
Der pH der obigen Lösung wird auf 4,75 eingestellt. 126,5 g des Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM = 0,8). Wenn das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden 32,6 ml Benzylamin schnell hinzugegeben (Molverhältnis Benzylamin/CM = 0,8). Die Mischung wird danach für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wird dann mit konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol sukzessiv mit 15 l Osmose-behandelten Wasser auf pH 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration dieser Lösung beträgt 21 g/l (3 l). 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert. Der Substitutionsgrad mit CM und B beträgt 0,74 ± 0,06 bzw. 0,33 ± 0,03.
Sulfatierung
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine Säule mit IR 120 H+-Kationenaustauschharz (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin auf einen pH nahe 7 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 65 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 65 g (0,38 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C für 5 Stunden getrocknet, zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material. Dieses Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden, der mit einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem versehen ist, in 1,7 l DMSO gelöst, das über Molekülsieben mit 4 Å vorgetrocknet war. 24,2 g (0,154 Mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,4) des SO₃-Pyridinkomplexes werden in 300 ml DMSO gelöst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 2 l doppelt-destillierten Wassers mit 4°C zur Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,8 bis 8 unter Verwendung einer 2 M NaOH-Lösung gebracht. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten wird und mit einem konstanten Volumen mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und mit konstantem Volumen an der gleichen Membran sukzessive mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens konzentriert, eingefroren und lyophilisiert. 60 g DCMBSu7 mit einem Substitutionsgrad mit Su-Gruppen von 0,16 ± 0,02 werden somit erhalten.
h) DCMBSu8
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l Reaktor dispergiert, der bei Raumtemperatur gehalten und mit einem Rührwerk versehen ist.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem 500 ml Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für 1 Stunde gerührt.
72,9 g (0,77 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/OH = 2,5) in einem 1 l Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehen Reaktor eingeführt und die Mischung wird auf 60°C gebracht mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten. Die Mischung wird bei dieser Temperatur, unter Rühren, für 1 Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und verdünnt, bis ein Volumen von 2,5 l erhalten wird. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird mit konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol mit doppelt-destilliertem Wasser gereinigt, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 28 g/l. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert.
70 g (0,295 Mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit CM von 0,94 ± 0,10 werden erhalten.
Benzylamidierung
Der pH der obigen Lösung wird auf 4,75 eingestellt. Die Mischung wird auf 4°C gekühlt. 58,8 g Kopplungsreagens (CMC) werden schnell hinzugegeben (Molverhältnis CMC/CM = 0,5). Wenn das Kopplungsreagens vollständig in der Mischung gelöst ist, werden 15,2 ml Benzylamin schnell hinzugegeben (Molverhältnis Benzylamin/CM = 0,5). Die Lösung wird danach für 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Mischung wird dann mit konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol sukzessiv mit 15 l Osmose-behandelten Wasser auf pH 7, dann mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und schließlich mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration dieser Lösung betragt 21 g/l (3 l). 5 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert. Der Substitutionsgrad mit CM und B beträgt 0,75 ± 0,07 bzw. 0,22 ± 0,03.
Sulfatierung
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine Saute mit IR 120 H+-Kationenaustauschharz (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin auf einen pH nahe 7 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 65 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 65 g (0,4 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C für 5 Stunden getrocknet, zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material. Dieses Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden, der mit einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem versehen ist, in 1,7 l DMSO gelöst, das über Molekülsieben mit 4 Å vorgetrocknet war. 42,2 g (0,154 Mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,7) des SO₃-Pyridinkomplexes werden in 300 ml DMSO gelöst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 2 l doppelt-destillierten Wassers mit 4°C zur Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,5 bis 8 unter Verwendung einer 2 M NaOH-Lösung gebracht. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten wird, und bei konstantem Volumen mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/Mol ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und mit konstantem Volumen an der gleichen Membran sukzessive mit 10 l 0,05 M Karbonatpuffer pH 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens konzentriert, eingefroren und lyophilisiert. 60 g DCMBSu8 mit einem Substitutionsgrad mit Su-Gruppen von 0,35 ± 0,04 werden somit erhalten.
i) DCMSu
Carboxymethylierung
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l Reaktor und einem Rührwerk dispergiert.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem. 500 ml-Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4°C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für eine Stunden gerührt.
72,9 g (0,77 Mol) Monochloressigsäure werden in. 450 ml Isopropanol (Molverhältnis Säure/OH = 2,5) in einem 1 l-Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehenen Reaktor hinzugegeben und die Mischung auf 60°C mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur, unter Rühren, für zwei Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und verdünnt, bis ein Volumen von 2,5 l erhalten wird. Die solchermaßen erhaltene Lösung wird bei konstantem Volumen an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/mol mit doppelt-destilliertem Wasser gereinigt, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die Konzentration der Lösung beträgt 28 g/l. 20 ml dieser Lösung werden eingefroren und für die Analysen lyophilisiert.
70 g (0,289 mol) DCM mit einem Substitutionsgrad mit CM von 1,0 ± 0,1 werden erhalten.
Sulfatierung
Die oben erhaltene Lösung wird durch eine Säule mit IR 120 H+ Kationenaustauschharz (1,5 l) eluiert. Die solchermaßen angesäuerte Lösung wird mit Triethylamin auf einen pH nahe 7 neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wird konzentriert und lyophilisiert. Etwa 80 g Triethylammoniumsalz werden erhalten.
Die 80 g (0,466 Mol freies OH) des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40°C für fünf Stunden zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material getrocknet. Dieses Salz wird in einem Dreihalskolben mit rundem Boden und mit einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem in 1,7 l DMSO gelöst, das aber Molekülsiebe mit 4 Å vorgetrocknet war. 52 g (0,326 mol) (Molverhältnis Komplex/freies OH = 0,7) des SO₃-Pyridin-Komplexes werden in 300 ml DMSO gelöst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Lösung wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 2 l doppelt-destilliertem Wasser mit 4° C zur Mischung und der pH wird auf 7,5 bis 8 unter Verwendung von 2 M NaOH-Lösung gebracht. Die Lösung wird dann verdünnt, bis eine DMSO-Konzentration von 0,5 Vol.-% erhalten wird, und bei konstantem Volumen mit doppelt-destilliertem Wasser an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 g/mol ultrafiltriert. Die Lösung wird dann auf ein Volumen von 5 l konzentriert und bei konstantem Volumen an der gleichen Membran sukzessive mit 10 l 0,05 M Carbonatpuffer pH 9,6 und mit doppelt-destilliertem Wasser ultrafiltriert, bis die Leitfähigkeit des Filtrates zufriedenstellend ist. Die solchermaßen gereinigte Lösung wird auf ein Siebtel ihres Volumens konzentriert, eingefroren und lyophilisiert. 70 g DCMSu werden solchermaßen erhalten. Die Elementaranalyse des Schwefels ergibt einen ds von 0,37 ± 0,04.
BEISPIEL 3: Herstellen eines DCMBSuS.
Eine Suspension von 10 g DCMBSu, das gemäß Beispiel 2 erhalten wurde, wird in 350 ml wasserfreiem Dichlormethan hergestellt. 0,62 ml Chlorsulfonsäure werden zu 35 ml wasserfreiem Dichlormethan (Molverhältnis Chlorsulfonsäure/B-Einheiten = 1) hinzugegeben. Die Mischung wird unter Argon für eine Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wird durch einen Sintertrichter Nr. 4 filtriert und sukzessiv mit 200 ml Dichlormethan, 200 ml 50/50 (Vol/Vol) Dichlormethan/Dioxan und schließlich mit reinem Dioxan gewaschen.
Das DCMBSuS in Säureform wird sofort in 150 ml Wasser gellst und der pH der Lösung auf 9 mit 6 M NaOH eingestellt und bei diesem Wert für eine Stunden gehalten. Die Lösung wird dann mit 0,1 M HCl neutralisiert, eingefroren und lyophilisiert.
Die Menge des Sulfonats wird bestimmt durch die Differenz zwischen dem Schwefelgehalt des Ausgangs- und des Endproduktes nach Desulfatierung der zwei Produkte unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen.
BEISPIEL 4: Verfahrensvariante für die Herstellung eines DCMBSu.
a) Herstellen des Reagens N-Methylphenyl-2-chloracetamid
109,4 ml (1 Mol) Benzylamin werden mit 1 l Äther, der bevorzugterweise über Molekülsiebe mit 4 Å vorgetrocknet ist, in einem Dreihalskolben mit rundem Boden und einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem (inerte Atmosphäre) gemischt.
79,7 ml (1 Mol) Chloracetylchlorid werden tropfenweise (Einführzeit 30 Minuten) unter Verwendung eines Tropftrichters hinzugegeben. Nach der Zugabe wird der Kolben versiegelt und bei Raumtemperatur für eine Stunden gerührt.
Die Mischung wird dann sukzessive mit 1,5 l 0,5 M Zitronensäurelösung (220 g), 1,5 l doppelt-destilliertem Wasser mit 4° C, 1,5 l 0,5 M Natriumhydrogencarbonatlösung (63 g) und 1,5 l 1 M NaCl-Lösung (87,8 g) gewaschen.
Die Ätherphase wird wiedergewonnen und bis zur Trockne eingedampft.
Der trockene Rückstand wird gereinigt durch doppelte Umkristallisation aus Wasser:

– Der Rückstand wird in doppelt-destilliertem Wasser (1-2 Gew./Vol-%-Lösung), das bis zum Siedepunkt erhitzt ist, gelöst. Diese siedende Lösung wird unter Verwendung eines auf 100°C vorerhitzten Sintertrichters Nr. 4 filtriert. Die filtrierte Lösung wird abgekühlt und bei 4°C über Nacht gelagert. Das Reagens wird dann auf Wattman-Papier wiedergewonnen und in einem Ofen unter Vakuum bei etwa 50° C getrocknet.

b) Synthese von DCMB
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 400 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l-Reaktor mit einem Rührsystem dispergiert.
56,5 g (1,41 mol) NaOH werden in 225 ml in einem 500 ml-Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4° C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Die Mischung wird für eine Stunde gerührt.
84,9 g (0,46 Mol) des in a) erhaltenen N-Methylphenyl-2-chloracetamids werden in 675 ml Isopropanol in einem 1 l-Becher gelöst. 43,7 g (0,46 Mol) Monochloressigsäure werden in 200 ml Isopropanol in einem weiteren 500 ml-Becher gelöst.
Die N-Methylphenyl-2-chloracetamidlösung wird schnell in den mit einem Mantel versehenen Reaktor eingeführt und die Mischung wird mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten auf 60° C gebracht. Nach etwa 5 Minuten wird die Monochloressigsäurelösung schnell dazu hinzugegeben und die Mischung bei 60° C für zwei Stunden gerührt.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und gereinigt:

– entweder durch eine doppelte Präzipitation in 3 l Methanol; das solchermaßen erhaltene Präzipitat wird zweifach mit Methanol gewaschen und in einem Ofen unter Vakuum bei 40° C getrocknet.
– oder durch Tangentialfiltration über eine Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 Dalton; die gereinigte Lösung wird dann konzentriert und lyophilisiert.

Die Zusammensetzung des durch dieses Verfahren erhaltenen DCM ist wie folgt: CM = 0,90 ± 0,09 und B = 0,30 ± 0,03.
c) Synthese von DCMBSu
– Bildung des Tributylammonium (oder Triethylammonium)-Salzes
50 g (0,18 Mol) DCMB, erhalten in Schritt b), werden in 2 l doppelt-destilliertem Wasser gelost. Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule aus Kationenaustauschharz (Amberlite IR120 H+) eluiert. Das solchermaßen angesäuerte Produkt wird mit 10 % Tributylamin in Ethanol (oder Triethylamin) auf einen pH nahe 7 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird durch Tangentialfiltration an einer Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 Dalton konzentriert und lyophilisiert. Etwa 60 g des Tributylammonium (oder Triethylammonium)-Salzes werden erhalten.
– Sulfatierung des Tributylammonium (oder Triethylammonium)-DCMB
Die 60 g des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen unter Vakuum bei 40° C für 4 Stunden getrocknet, zusammen mit einem jeglichen benötigten Material. Das Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden und einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem in 2,7 l N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst, das über Molekülsieben mit 4 Å vorgetrocknet war (5,7 l für das Triethylammoniumsalz). 38,7 g (0,24 Mol) des SO₃-Pyridinkomplexes (46,6 g (0,29 Mol) im Falle des Triethylammoniumsalzes) werden in 30 ml DMF gelöst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von 3 l doppelt-destilliertem Wasser mit 4° C zur Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,5 bis 8 unter Verwendung von 2 M NaOH-Lösung gebracht. Die Lösung wird dann durch eine Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 Dalton ultrafiltriert, konzentriert und lyophilisiert.
BEISPIEL 5: Synthese von DCMSu.
a) Synthese von DCM
50 g (0,31 Mol) Dextran T40 mit einer Molmasse von etwa 40.000 werden in 612 ml Isopropanol in einem mit einem Mantel versehenen 2 l-Reaktor mit einem Rührwerk dispergiert.
67,9 g (1,7 Mol) NaOH werden in 188 ml in einem 500 ml-Becher gelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 4° C gekühlt und langsam zu der Mischung aus Dextran und Isopropanol hinzugegeben. Diese Mischung wird für eine Stunden geruht.
72,9 g (0,77 Mol) Monochloressigsäure werden in 450 ml Isopropanol in einem 1 l-Becher gelöst.
Die Monochloressigsäurelösung wird schnell in den mit einem Mantel versehenen Reaktor eingeführt und die Mischung wird auf 60° C mit Hilfe eines mit dem Reaktor verbundenen Thermostaten gebracht. Die Mischung wird bei dieser Temperatur, unter Rühren, für zwei Stunden gehalten.
Die wässrige Phase wird dann wiedergewonnen und gereinigt:

– entweder mittels einer Doppelpräzipitation in 3 l Methanol; das solchermaßen wiedergewonnene Präzipitat wird zweifach mit Methanol gewaschen und in einem Ofen unter Vakuum bei 40° C getrocknet,
– oder durch Tangentialfiltration über eine Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 Dalton; die gereinigte Lösung wird dann konzentriert und lyophilisiert.

b) Synthese des DCMSu
– Bildung des Tributylammonium (oder Triethylammonium)-Salzes
50 g (0,18 Mol) DCM werden in 2 l doppelt-destilliertem Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch eine Säule aus Kationenaustauschharz (Amberlite IR 120 H⁺) eluiert. Das solchermaßen angesäuerte Produkt wird mit 10 % Tributylammonium [sic] in Ethanol (oder Triethylamin) auf einen pH nahe 7 neutralisiert.
Die neutralisierte Lösung wird durch Tangentialfiltration über eine Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 Dalton gereinigt, konzentriert und lyophilisiert. Etwa 60 g des Tributylammonium (oder Triethylammonium)-Salzes werden erhalten.
– Sulfatierung von Tributylammonium (oder Triethylammonium)-DCM
Die 60 g des erhaltenen Salzes werden in einem Ofen im Vakuum bei 40° C für 4 Stunden zusammen mit einem jeglichen erforderlichen Material getrocknet. Das Salz wird dann in einem Dreihalskolben mit rundem Boden und einem Rührwerk und einem Argonkreislaufsystem in 2,7 l N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst, das über einem Molekülsieb mit 4 Å vorgetrocknet ist. 44,8 g (0,28 Mol) des SO₃-Pyridinkomplexes (oder 55,8 g (0,35 Mol) im Falle des Triethylammoniumsalzes) werden in 300 ml DMSO gelöst und langsam zu der Polymerlösung hinzugegeben. Die Mischung wird für zwei Stunden bei Raumtemperatur unter Argon gerührt.
Die Reaktion wird abgestoppt durch Hinzugeben von drei Liter doppelt-destilliertem Wasser mit 4° C zur Mischung und der pH des Mediums wird auf 7,5 bis 8 gebracht unter Verwendung von 2 M NaOH-Lösung. Die Lösung wird dann durch eine Membran mit einer Ausschlussgröße von 5.000 Dalton ultrafiltriert, konzentriert und lyophilisiert.
Die Zusammensetzung eines erhaltenen DCMSo ist: CM = 1 ± 0,1, Su = 0,37 ± 0,04.
BEISPIEL 6: Anti-koagulierende und anti-komplementäre Aktivität der Produkte gemäß der Erfindung
a) Messen der anti-koagulierenden Wirkung
Die aktivierte Cephalinzeit ist ein exploratorischer Test, der empfindlich ist für alle Faktoren des endogenen Weges (Thrombin, V, VIII, IX, XI und XII) des Koagulationssystems ausgenommen den Plättchenfaktor III. Das verwendete Reagenz (APTT, Organon Teknika) enthält Kaninchenhirnphospholipide (Plättchenfaktor III) und einen speziellen Aktivator (mikronisiertes Silica oder Ellagsäure). Das angewandte Verfahren ist wie folgt:
100 μl plättchenarmes menschliches Plasma (PPP)
100 μl Owren-Koller-Puffer (OKB)
100 μl APTT-Reagenz
Inkubation für 3 min bei 37° C
100 μl 25 mM Calciumchlorid (CaCl₂)
Messen der Zeit bis zum Auftreten des Gerinnsels
Eine Kurve des Logarithmus der Koagulationszeit als eine Funktion der Polymerkonzentration wird aufgetragen. Die Steigung der Kurve erlaubt es, die spezifische anti-koagulierende Wirkung des Polysaccharides gemäß der Gleichung zu berechnen:
b) Messen der Inhibierung der Aktivierung von Komplement
Die Wirkung von Dextranderivaten mit verschiedener chemischer Zusammensetzung wurde in einem hämolytischen oder CH50-Test gemäß einem Verfahren getestet, bei dem das menschliche Serum mit einem der Dextranderivate der Erfindung für 30 Minuten bei 37° C inkubiert wird, bevor es mit Schaf-Erythrozyten aktiviert wird, die mit Kaninchen-Antikörpern gegen Schaf-Erythrozyten (EA) sensibilisiert sind. Per definitionem entspricht eine CH50-Einheit der Konzentration von Komplementproteinen (die in einem Milliliter Serum enthalten sind), die in der Lage sind, die Hämolyse von 50 % von 2 × 10⁷ aktivierten EAS in einem Reaktionsmedium zu induzieren, wobei das Volumen, die Temperatur und die Reaktionszeit konstant gehalten werden. Die Anzahl von hämolytischen Stellen pro Zelle wird berechnet.
Die Inhibierung von Komplementaktivierung wird ausgedrückt als Prozentsatz Inhibierung der Bildung von Konvertase verglichen mit dem Kontrollröhrchen, wo die Anzahl von hämolytischen Stellen bei Abwesenheit von Dextranderivat bestimmt wird.
Diese Aktivität A wird ausgedrückt als Produktgewicht (bei konstantem Volumen) (μg), das erforderlich ist für eine 50%-ige Inhibierung der Bildung von hämolytischen Stellen. Dieser Ausdruck der anti-komplementären Wirkung bedeutet, dass sie invers proportional zu dem Gewicht des Produktes ist. Mit anderen Worten, die anti-komplementäre Aktivität ist proportional höher je niedriger das Gewicht des Produktes ist.
Diese Aktivität variiert als Funktion der chemischen Gesamtzusammensetzung des Produktes.

Die mit 5 Derivaten gemäß der Erfindung erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II unten dargestellt, die ihre chemische Gesamtzusammensetzung und ihre spezifische anti-koagulierende Aktivität, a, ausgedrückt in internationalen Einheiten pro mg Produkt (relativ zu Heparin bei 173 UI/mg) angibt. TABELLE II

Referenzprobe	Chemische Zusammensetzung			Anti-komplementäre Wirkung	Anti-koagulierende Wirkung
	CM	B	Su	A μg	a UI/mg
Dextran	0	0	0	1250	0
Dextran-CM	1,0	0	0	570	0
DCMBSu1	0,75	0,20	0,15	150	0,02
DCMBSu2	0,80	0,25	0,15	150	0,04
DCMBSu3	1,10	0,40	0,40	35	4,0
DMCBSu4	0,70	0,30	0,25	125	0,08
DCMB1	0,80	0,10	0	300	0
Heparin	–	–	–	2700	173

Man stellt fest, dass sich die anti-komplementäre Wirkung erhöht, wenn sich der ds mit CM und Su-Einheiten erhöht. Oberhalb einem ds mit CM-Einheiten von etwa 0,40 erhöht sich die anti-koagulierende Wirkung, im gleichen Umfang wie sich der ds mit Su-Einheiten erhöht.
Man beobachtet, dass bereits die Derivate mit niedrigen Werten für ds bezüglich Su-Einheiten eine hohe anti-komplementäre Wirkung aufweisen, wohingegen ihre anti-koagulierende Wirkung sehr niedrig ist. Schließlich wird festgestellt, dass die Anwesenheit von CM- und B-Einheiten alleine eine geringe anti-komplementäre Wirkung induziert, wohingegen sie keine anti-koagulierende Wirkung mit sich bringt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, Produkte zu erhalten, die eine hohe inhibitorische Aktivität auf die Aktivierung von Komplement und eine sehr niedrige spezifische anti-koagulierende Aktivität aufweisen.
BEISPIEL 7: Antiproliferative Aktivität der Verbindungen gemäß der Erfindung
Die DCMBSu-Verbindungen haben stimulierende oder inhibierende Wirkungen auf Zellwachstum, abhängig von der Art der Zellen. Beispielsweise weisen die Produkte somit im kardiovaskulären Bereich den Vorteil auf, dass sie das Wachstum von Endothelzellen stimulieren und das Wachstum von glatten Muskelzellen (SMC) inhibieren. Diese Eigenschaften sind in der Pharmakologie wichtig, wobei ihr Hauptvorteil in der Verhinderung von Restenose nach Angioplastie oder kardiovaskulärer chirurgischer Intervention ist.
Die antiproliferative Wirkung der DCMBSu wurde an glatten Muskelzellen (SMC) der Rattensorte studiert. 24 Stunden nach Inokulieren der Zellen in ein Medium, das 10 % fötales Kälberserum enthielt, wurden die Zellen für drei Tage Mangelbedingungen ausgesetzt (Medium mit 0,1 % FCS) (dies erlaubt, dass sich die Zellen synchronisieren, indem sie in der G0/G1-Phase des Zellzyklus arretiert werden). Die Zellen werden dann wieder mit Medium gefüttert, das 10 % FCS enthält, wobei auch unterschiedliche Konzentrationen des Testproduktes enthalten sind (von 0 bis 1 mg/ml). Eine Kontrolle wird unter den gleichen Bedingungen hergestellt, aber ohne die Zugabe des Produktes.
Nachdem sie für 5 Tage gewachsen sind, werden die Zellen gezählt (mittels eines automatischen Zählers oder durch Messen der Radioaktivität in Zählern pro Minute nach Einbau von mit Tritium markiertem Thymidin) und die Inhibierung wird wie folgt bestimmt, wobei die Abkürzung „nb" das Wort „Anzahl" angibt: I% = (1 – (nb von Zellen in Gegenwart des Produktes)/(nb von Zellen ohne Produkt)) × 100
Die anti-koagulierende Wirkung der verschiedenen Produkte wurde ebenfalls bestimmt.
Tabelle III unten fasst die für zwei DCMBSu ebenso wie für natives Dextran und Heparin erhaltenen Ergebnisse zusammen. TABELLE III

Produkt Zusammensetzung (ds) Anti-koagulierende Aktivität 1

CM B Su UI/mg (%)

Dextran 0 0 0 0 0

DCMBSu6 0,60 0,50 0,30 5,0 80

DCMBSu5 0,80 0,35 0,15 3,0 85

Heparin 173 80
Diese Ergebnisse zeigen, dass für DCMBSu6 und DCMBSu5 die Inhibierung (I) des Zellwachstums von glatten Muskelzellen vergleichbar oder sogar größer ist als von Heparin. Diese zwei Produkte weisen jedoch eine ausgeprägt geringere anti-koagulierende Wirkung auf als Heparin.
BEISPIEL 8: Potenzierung von Zellwachstum in Gegenwart des Fibroblastenwachstumsfaktors Fibroblast Growth Factor (FGF).
Die proliferative Wirkung der DCMBSus wurde an zwei Zelllinien evaluiert:
CCL39: chinesische Hamsterlungenfibroblastenlinie.
HUCVEC: Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene.
Die Wachstumstests werden durchgeführt durch Halten der Zellen unter Mangelbedingungen, d. h. in einem Kulturmedium, das 0 % oder 2 % fötales Kälberserum enthält, gefolgt vom Einbau des Testproduktes mit verschiedenen Konzentrationen.
Die Auszählungen werden durchgeführt unter Verwendung eines automatischen Zählers oder durch Messen der Radioaktivität, in Zählern pro Minute, nach Einbau von mit Tritium markiertem Thymidin.
Die Fähigkeit der Produkte, bestimmte Wachstumsfaktoren wie beispielsweise FGFs zu potenzieren und zu schützen, wird gemäß dem folgenden Verfahren evaluiert.
Die mitogene Aktivität der untersuchten FGFs wird mittels eines Tests für die biologische Aktivität gemessen (Dosisantworttest), um die ED₅₀ (Menge an Wachstumsfaktor, der erforderlich ist, um den halben maximalen Einbau von mit Tritium markiertem Thymidin in die Zellen zu bedingen) zu bestimmen.
Diese ED₅₀ beträgt 5 ng/ml für die CCL39-Zellen und 2 ng/ml für die HUCVEC-Zellen.
Diese ED 50-Werte werden für den Rest der Studien verwendet.
Für die HUCVEC-Zellen weist die Kombination aus FGF (2 ng/ml) mit 400 pg/ml DCMBSu5 die gleiche mitogene Leistung auf wie FGF alleine bei 20 ng/ml.
Für die CCL39-Zellen beträgt, in Abwesenheit von DCMBSu, die ED₅₀ etwa 5 ng/ml FGF. In Gegenwart von 1000 pg/ml DCMBSu1 fallt die ED₅₀ auf 0,8 ng/ml.
Diese Ergebnisse zeigen die potenzierende Wirkung der durch die DCMBSu adressierten Zellwachstumsfaktoren. Diese Wirkung ist mit der chemischen Gesamtzusammensetzung der Produkte verbunden. Die Tabelle unten gibt, beispielhaft, die chemische Gesamtzusammensetzung von besonders aktiven DCMBSu an.

Zusammensetzungen der DCMBSu (als ds)

CM B Su

DCMBSu1 0,75 0,20 0,15

DCMBSu5 0,80 0,35 0,15

DCMBSu3 1,10 0,40 0,40
Wie sich aus dem Vorstehenden ergibt, ist die Erfindung in keinster Weise auf ihre Verfahren zur Implementation, Herstellung oder Anwendung, wie sie gerade detaillierter beschrieben worden sind, beschränkt. Ganz im Gegenteil umfasst sie alle Varianten, die für einen Fachmann auf dem Gebiet offenkundig sind, ohne vom Kontext oder Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wobei D eine Polysaccharidkette darstellt, die vorzugsweise durch Verkettungen von Glucoseeinheiten gebildet ist, CM Carboxymethylgruppen darstellt, B Carboxymethylbenzylamidgruppen darstellt, Su Sulfatgruppen darstellt, S Sulfonatgruppen darstellt, a, b, c und d den Substitutionsgrad (ds) darstellen, ausgedrückt im Verhältnis zur Anzahl freier Hydroxylfunktionen in einer Glucoseeinheit des Dextrans in den Gruppierungen CM, B, Su bzw. S; wobei a ≥ 0,3, b = 0 oder ≥ 0,1, c = 0 oder ≥ 0,1 und d = 0 oder ≤ 0,15, unter der Bedingung, dass d = 0, a und b ≠ 0, welche Produkte aufweisen: – eine Gleichmäßigkeit der Verteilung der Kettengrößen, die sich durch ein symmetrisches Gauß'sches Eluierungsprofil in leistungsstarker sterischer Ausschlusschromatographie darstellt, und – eine Gleichmäßigkeit der Verteilung der geladenen chemischen Gruppen, die sich durch ein symmetrisches Eluierungsprofil mit einer einzigen Spitze in Niederdruckionenaustauschchromatographie darstellt.
Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a ≥ 0,6, b ≠ 0, c = 0 oder ≤ 0,5 und d ≤ 0,15 oder = 0, und dass ihre molare Masse 3.000 bis 500.000 g/Mol beträgt, für eine Verwendung im Wesentlichen als Wundheilungsmittel.
Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a ≥ 0,3, b ≠ 0, c = 0 oder ≤ 0,4 und d ≤ 0,15 oder = 0, und dass ihre molare Masse 10.000 bis 60.000 g/Mol beträgt, für eine Verwendung im Wesentlichen als Mittel mit antikomplementärer und Plasma ersetzender Wirkung.
Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a ≤ 0,5, b ≠ 0, c = 0 oder ≤ 0,4 und d ≤ 0,15 oder = 0, und dass ihre molare Masse 3.000 bis 100.000 g/Mol beträgt, für eine Verwendung im Wesentlichen als Modulatormittel für die Zellvermehrung.
Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass a ≥ 0,4, b ≠ 0, c ≥ 0,3 und d ≤ 0,15 oder = 0, und dass ihre molare Masse 3.000 bis 20.000 g/Mol beträgt, für eine Verwendung im Wesentlichen als Antikoagulans.
Medikamente, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff mindestens ein Dextranderivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 umfassen, das gegebenenfalls mit einem anderen Wirkstoff und/oder mit mindestens einem pharmazeutisch zugelassenen Arzneistoffträger und/oder einem physiologisch annehmbaren Träger, vorzugsweise einem Liposom, verbunden ist.
Herstellungsverfahren für Dextranderivate mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Carboxymethylierung, umfassend (i) die Aktivierung eines nicht substituierten Dextrans, indem dieses Dextran unter Rühren mindestens 1 Stunde lang mit einem flüssigen, zweiphasigen, basischen Wasser-/Alkoholmedium in Kontakt gebracht wird, (ii) Zugabe von Monochloressigsäure zum erhaltenen aktivierten Produkt, bei einer Temperatur von 40 bis 90°C, vorzugsweise 60°C, wobei das Verhältnis R_CM, das gleich der Molanzahl der Monochloressigsäure/Molanzahl von OH ist, 0,3 bis 2 beträgt, (iii) Isolierung und gegebenenfalls Reinigung des erhaltenen Carboxymethyldextrans (DCM). b) Binden des Benzylamins an die Carboxymethylgruppen, umfassend, (i) das in a) erhaltene DCM mindestens 2 Stunden lang und in saurem wässrigen Medium im Beisein eines wasserlöslichen Carbodiimids als Bindemittel bei einer Temperatur von 0°C bis 30°C mit Benzylamin in Kontakt zu bringen, wobei das Molverhältnis CMC/CM 0,25 bis 2 und das Molverhältnis Benzylamin/CM 0,25 bis 2 beträgt; (ii) Isolierung und gegebenenfalls Reinigung des erhaltenen Benzylamidmethylcarboxyldextrans (DCMB), c) Sulfatierung, umfassend, (i) Bildung eines Trialkylammoniumsalzes des in b) erhaltenen DCMBs, (ii) Löslichmachen des erhaltenen Salzes in einem wasserfreien polaren Lösungsmittel, im Allgemeinen einer Lewis-Base wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF), und (iii) Zugabe zu dem in Lösung befindlichen Salz eines Komplexes auf der Basis von Schwefeltrioxid, wie SO₃-Pyridin, SO₃-Triethylamin oder SO₃-DMF in Lösung im selben Lösungsmittel, bei einer Temperatur unter 70°C, wobei das Molverhältnis des Komplexes auf der Basis von Schwefeltrioxid/freies OH 0,25 bis 12 beträgt, und gegebenenfalls d) Sulfonierung der B-Gruppen durch Mischen unter Rühren eines DCMBSu-Derivats, das sich in Suspension in einem wasserfreien Lösungsmittel befindet, mit Chlorsulfonsäure, die im selben Lösungsmittel gelöst ist, bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und der Siedetemperatur des verwendeten Lösungsmittels.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass beim Schritt a) das Verhältnis Wasser: Alkohol des flüssigen zweiphasigen Wasser-/Alkoholmediums 10 : 90 (v/v) bis 25 : 75 (v/v), und vorzugsweise 15 : 85 (v/v) beträgt.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserlösliche Carbodiimid des Schritts b) aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimidmeta-p-toluolsulfonat (CMC) und dem Chlorhydrat von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (EDC) besteht.
Herstellungsverfahren für Dextranderivate nach einem der Ansprüche 1 bis 5 mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wobei a ≠ 0, b ≠ 0 und d = 0, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Zubereiten von N-Methylphenyl-2-chloracetamin, indem Benzylamin mit Chloracetylchlorid in Kontakt gebracht wird, dann Isolierung und Reinigung des Produkts, b) das in basischer Wasser-/Alkohollösung befindliche Dextran nacheinander mit dem bei a) erhaltenen, in Alkohollösung befindlichen N-Methylphenyl-2-chloracetamin im Beisein von in Alkohollösung befindlicher Monochloressigsäure in Kontakt zu bringen, das erhaltene Gemisch auf einer Temperatur über 40°C, vorzugsweise auf 60°C zu halten, dann Isolierung und gegebenenfalls Reinigung des erhaltenen DCMBs, und c) Sulfatierung des bei b) erhaltenen Produkts, umfassend (i) Bildung eines Trialkylammoniumsalzes, (ii) Löslichmachen des erhaltenen Salzes in einem wasserfreien polaren Lösungsmittel, im Allgemeinen einer Lewis-Base wie Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Dimethylformamid (DMF), und (iii) Zugabe zu dem in Lösung befindlichen Salz eines Komplexes auf der Basis von Schwefeltrioxid, wie SO₃-Pyridin, SO₃-Triethylamin oder SO₃-DMF in Losung im selben Lösungsmittel, bei einer Temperatur unter 70°C, wobei das Molverhältnis des Komplexes auf der Basis von Schwefeltrioxid/freies OH 0,25 bis 12 beträgt, und (iv) Isolierung und gegebenenfalls Reinigung des erhaltenen DCMBSu.
Herstellungsverfahren für Dextranderivate nach Anspruch 1 mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d, wobei a ≠ 0, b = 0 und d = 0, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Carboxymethylierung eines nicht substituierten Dextrans unter den in Anspruch 7 dargelegten Bedingungen, und b) Sulfatierung des in a) erhaltenen DCM unter den in Anspruch 7 dargelegten Bedingungen.
Carboxymethylbenzylamiddextran mit der Formel DCM_aB_b, bei dem a ≠ 0 und b ≠ 0, als Zwischenprodukt für die Herstellung eines Dextranderivats mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d nach Anspruch 1.
Benzylamiddextran (DB) als Zwischenprodukt für die Herstellung eines Dextranderivats mit der allgemeinen Formel DCM_aB_bSu_cS_d nach Anspruch 1.
Dextranderivat nach Anspruch 12, für eine Verwendung als Mittel mit antikomplementärer Wirkung.