DE3486341T2

DE3486341T2 - Derivate von Dextran mit antikoagulierenden und antikomplementären Eigenschaften, ihre Herstellung und ihre biologischen Anwendungen.

Info

Publication number: DE3486341T2
Application number: DE3486341T
Authority: DE
Inventors: Jacqueline Jozefonvicz; Marcel Jozefonvicz; Monique Mauzac
Original assignee: JOZEFONVICZ GEB DORGEBRAY
Current assignee: JOZEFONVICZ GEB DORGEBRAY
Priority date: 1983-11-30
Filing date: 1984-11-30
Publication date: 1995-05-04
Anticipated expiration: 2004-12-01
Also published as: EP0146455B1; EP0146455A2; DE3485658D1; EP0428182A1; EP0146455A3; EP0428182B1; US4740594A; DE3486341D1; FR2555589A1; JPH0625202B2; CA1231334A; FR2555589B1; ATE74929T1; JPS60135401A; ATE110391T1

Description

Die Erfindung betrifft dotierte Dextranderivate, die insbesondere antikoagulierende und antikomplementäre Eigenschaften aufweisen, ihre Herstellung und ihre biologischen Anwendungen.
Es ist bekannt, daß Heparin wegen seiner erhöhten antikoagulierenden Eigenschaften in großem Umfange als Antithrombose- Arzneimittel verwendet wird.
Jüngere Arbeiten haben auch seine Wirkung gegenüber der Inaktivierung des Komplementärsystems, d. h. gegenüber der Gesamtheit der Plasmaproteine, gezeigt, die eine wesentliche Rolle bei der Immunabwehr des Organismus spielen.
Die Heterogenität seiner Ketten, insbesondere was ihre Zusammensetzung und ihre Länge angeht, macht es jedoch schwierig, die Strukturen zu untersuchen, die für diese Eigenschaften verantwortlich sind.
Es wurden bereits zahlreiche Arbeiten durchgeführt, um Produkte herzustellen, die mindestens einige der spezifischen Eigenschaften des Heparins aufweisen, jedoch eine gut definierte Struktur haben, so daß sie als Modell für die Untersuchung der dabei ablaufenden entsprechenden Mechanismen dienen können.
Einige der Miterfinder der vorliegenden Erfindung haben somit Produkte entwickelt und beschrieben (vgl. die französische Patentschrift 2 461 724 und die europäische Patentschrift 0 023 854), die antikoagulierende Eigenschaften aufweisen und aus Polymeren bestehen, welche die folgenden Gruppen enthalten:
-SO&sub3;R&sub1;, -R&sub3;SO&sub3;R&sub1;, -SO&sub2;R&sub2;, -R&sub3;-SO&sub2;-R&sub2; und -CH&sub2;-CO-NH-CHR-COOH-
worin bedeuten:
R&sub1; ein Wasserstoffatom oder ein physiologisch verträgliches Metallatom,
R&sub2; einen Aminosäurerest, der über die Aminfunktion an die Brücke -SO&sub2;- gebunden ist,
R&sub3; eine Gruppe -CH&sub2;-CO-NH-R&sub4;, in der R&sub4; einen Alkyl-, Aryl- oder Alkylaryl- oder
die substituiert oder unsubstituiert sind, darstellt, und
R die Seitenkette einer Aminosäure.
Die Arbeiten der Erfinder auf diesem Gebiet haben sie dazu geführt, ein bereits bekanntes Polysaccharid, nämlich das Dextran, zu untersuchen.
Das Dextran ist ein Polyglucosid mit einem Molekulargewicht von etwa 5.000 bis zu mehreren Millionen Dalton, das aufgebaut ist aus Glucosyl-Einheiten A, die im wesentlichen durch 1,6-Verknüpfungen miteinander verbunden sind, der Formel:
Für Anwendungen in der Therapeutik verwendet man Dextrane mit einem Molekulargewicht, das im allgemeinen unter 100.000 liegt.
Dieses Produkt wird insbesondere als Blutplasma-Ersatz oder mindestens als Plasma-Streckmittel oder als Volumenauffüllmittel verwendet. Diese Verwendungen können jedoch in bestimmten Fällen Immunschockzustände mit sich bringen.
Einige der Miterfinder der vorliegenden Erfindung haben gleichfalls vernetzte Dextrane entwickelt (Biomaterials, 1982, Bd. 3 Oktober, S. 221-224), die im wesentlichen Carboxymethyl-, Benzylsulfonat und α-Aminosäuregruppen tragen und eine antithrombotische Aktivität zeigen.
Die bei den als Plasmaersatz (lösliche Derivate) verwendeten Dextranen durchgeführten Arbeiten haben gezeigt, daß die gleichzeitige Anwesenheit bestimmter Substituentengruppen in vorgegebenen Mengenanteilen an Dextranketten, die frei von Aminosäuren sind, ihnen sehr vorteilhafte biologische Eigenschaften und eine erhöhte Verträglichkeit (Toleranz) verleihen.
Ziel der Erfindung ist es daher, Dextranderivate bereitzustellen, die mindestens einige der biologischen Eigenschaften des Heparins aufweisen und aufgrund ihrer erhöhten Toleranz (Verträglichkeit) als Biomaterialien verwendbar sind.
Ziel der Erfindung ist es außerdem, ein Verfahren zur Herstellung dieser Derivate anzugeben, das leicht durchgeführt werden kann.
Ziel der Erfindung ist es ferner, lösliche Biomaterialien und Arzneimittel oder Arzneimittelvektoren mit einer großen Wirksamkeit auf der Basis dieser Derivate bereitzustellen, die den Vorteil haben, daß sie auf synthetischem Wege hergestellt werden können.
Die erfindungsgemäßen Dextranderivate sind dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Molekulargewicht von mehr als 5.000 Dalton haben und daß sie in statistischer Verteilung enthalten:
- mindestens 35% und insbesondere 40% Struktureinheiten B, die aus glucosidischen Einheiten bestehen, die durch Reste substituiert sind, die eine Carboxylfunktion aufweisen und die Struktur -O-(CH&sub2;)n-R-COO haben, in der R eine einfache Bindung oder eine Gruppe
-CO-NH-(CH&sub2;)n'-, n eine Zahl von 1 bis 10 und n' eine Zahl von 1 bis 7 bedeuten, und die arm sind an Struktureinheiten D, d. h. Struktureinheiten, die bestehen aus glucosidischen Einheiten vom Typ A, die substituiert sind durch eine Kette, die eine Gruppe der Struktur enthält
worin R&sub1; eine Einfachbindung, eine Gruppe -CH&sub2;- oder eine Gruppe
R&sub2; ein Anion eines physiologisch verträglichen Mineralsalzes oder organischen Salzes, insbesondere eine Gruppe SO&sub3; bedeuten und n wie oben definiert ist.
Die Funktionalisierung des Dextran-Trägers mit Hilfe von Substituenten-Ketten, wie sie oben definiert sind, verleiht diesem in vorteilhafter Weise eine antikoagulierende Aktivität (Antikoagulans-Aktivität). Diese Aktivität ist für die biologischen Anwendungen dieser Derivate von großem Interesse (Vorteil), auch wenn sie geringer ist als diejenige von Heparin.
Diese Produkte scheinen außerdem eine antikomplementäre Aktivität der gleichen Größenordnung wie diejenige des Heparins aufzuweisen.
Es wurde festgestellt, daß diese vorteilhaften Effekte erhalten werden aufgrund der gleichzeitigen Anwesenheit von (1) Carboxylgruppen an den Struktureinheiten B und (2) Substituentenketten an den Struktureinheiten D, die Arylgruppen aufweisen, die substituiert sind durch ein Anion eines Mineralsalzes oder eines organischen Salzes und insbesondere durch Arylsulfonatgruppen und die über eine Verzweigung, die eine Amidgruppe enthält, an die Dextrankette gebunden sind.
Die Dextranderivate enthalten außerdem Struktureinheiten C, die durch Reste mit der Struktur
substituiert sind, in denen R&sub1; und n wie oben definiert sind.
Die Gesamtheit der nicht-substituierten Struktureinheiten A des Dextrans und der obengenannten Struktureinheiten C stellen höchstens 60% der Gesamtanzahl der Struktureinheiten dar.
Eine erfindungsgemäß bevorzugte Familie von Dextranderivaten enthält Struktureinheiten B, die durch eine Kette -O-CH&sub2;-COO&supmin; substituiert sind.
In einer anderen erfindungsgemäßen Familie sind die Struktureinheiten B substituiert durch Carboxyethyl-, Carboxypropyl- oder Carboxybutyl-Gruppen -O-(CH&sub2;)n-COO&supmin;, worin n jeweils die Zahl 2, 3 oder 4 bedeutet.
Bei einer weiteren bevorzugten Familie sind die Struktureinheiten B substituiert durch Gruppen -O-(CH&sub2;)n-CO-NH-(CH&sub2;)n'- COO&supmin;.
Die Derivate, in denen n' die Zahl 4, 5 oder 7 bedeutet, enthalten einen Rest -NH-(CH&sub2;)n'-COO&supmin;, der jeweils entspricht einer Valeriansäure-, Aminocapronsäure- und Aminocaprylsäuregruppe.
Allgemein besetzen die Substituenten der Struktureinheiten B und C im wesentlichen die Position 2 der Basis-Glucosyl- Struktureinheit. Die Derivate, in denen diese Substituenten andere Positionen sowie gegebenenfalls auch die Position 2 besetzen, fallen jedoch ebenfalls in den Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft außerdem die Derivate, in denen ein Teil der OH-Gruppen der Glucosyle in der -OR&sub2;-Form vorliegt.
Durch Herstellung einer ganze Reihe von Derivaten konnten die Erfinder zeigen, daß die antikoagulierende Aktivität sehr gering wird, wenn der Gehalt an den Struktureinheiten B unter 35% liegt. Das gilt auch dann, wenn die Struktureinheiten D vollständig fehlen.
Für einen Gehalt an den Struktureinheiten B in der Größenordnung von 40 bis 50% beobachtet man allgemein eine Zunahme der antikoagulierenden Aktivität mit einer Zunahme der Anzahl der Struktureinheiten D und eine antikomplementäre Aktivität, die im wesentlichen gleich derjenigen des Heparins ist.
Derivate dieses Typs, die etwa 9 bis 12% Struktureinheiten D, vorzugsweise bis zu etwa 20% davon, enthalten, weisen so eine Antithrombose-Aktivität auf, die Werte in der Größenordnung von 300 bis 400 uT/mg erreichen kann. Entsprechende vorteilhafte Produkte haben erhöhte Molekulargewichte von mehr als 40.000 und sogar von 60.000 oder 80.000. In diesen Produkten kann der Gehalt an den Struktureinheiten C Null sein.
Bei den Derivaten, die einen geringeren Prozentsatz an Struktureinheiten D von etwa 4% enthalten, wobei der Gehalt an Struktureinheiten B 40 bis 50% beträgt, ist die Antithrombose-Aktivität geringer und liegt in der Größenordnung von 1 bis 5 uT/mg und die antikomplementäre Aktivität ist immer höher und liegt in der Größenordnung von 1 bis 10 ug/10&sup7; EAC 4b3bBbP. Bei diesen Derivaten ist das Molekulargewicht niedriger und beträgt etwa 10.000. Die Antithrombose-Aktivitäten und antikomplementären Aktivitäten werden nach den in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmt.
Eine besonders bevorzugte Kategorie von erfindungsgemäßen Derivaten umfaßt die Dextranderivate, welche die folgenden Struktureinheiten A, B und C
in den nachstehend angegebenen Mengenverhältnissen enthalten.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verbindung zur Herstellung der vorstehend definierten Dextranderivate.
Bei diesem Verfahren verwendet man eine Dextrankette, die aus unsubstituierten Struktureinheiten A besteht und man stellt nacheinander die Struktureinheiten B und C her, wobei diese Struktureinheiten jeweils hergestellt werden aus der vorher hergestellten in der genannten Reihenfolge.
Die Herstellung dieser verschiedenen Struktureinheiten an der Dextrankette umfaßt zweckmäßig die folgenden Stufen, nämlich:
- die Umsetzung eines Dextrans mit einem Derivat der Formel:
X (CH&sub2;)n-R-COOH
worin X eine reaktive Gruppe darstellt, die mit einer OH- Gruppe einer Glucosyl-Einheit eine Glucosylierungs-Bindung bilden kann, was zur Bildung der Struktureinheiten B führt;
- die Umsetzung des Dextrans, das die Struktureinheiten A und B enthält, mit einem Derivat der Formel
worin R&sub1; wie oben definiert ist, um die Fixierung der substituierten Arylgruppe über eine Amid-Brücke an dem Rest zu erzielen, der aus Substitutionsketten der Struktureinheiten B stammt, was die Einführung der Struktureinheiten C in die Kette erlaubt. Man erhält so nicht vernetzte Dextranderivate, die in statistischer Weise Struktureinheiten A, B und C enthalten, der Art wie oben angegeben, wobei die Einheiten B wenigstens 35% der Gesamteinheiten darstellen, wobei die Derivate arm an Struktureinheiten D und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie nach der Einführung anionischer Gruppen in die Arylgruppen der Struktureinheiten C, und gegebenenfalls der Fraktionierung der Dextranderivate, um Derivate mit einem Molekulargewicht unter 5.000 zu entfernen, lösliche Dextranderivate erzeugen, welche ein Molekulargewicht Mn über 5.000 Dalton besitzen und wenigstens 35% Struktureinheiten B und wenigstens 3% Struktureinheiten D umfassen.
Die Trennung der Dextrane kann zuerst durchgeführt werden, woran sich die vorstehend beschriebenen Stufen anschließen.
Jede der nachstehend angegebenen Stufen wird gegebenenfalls wiederholt bis zur Erzielung des gewünschten Gehaltes an Struktureinheiten an der Kette.
Zur Herstellung der Struktureinheiten B läßt man mit dem Dextran zweckmäßig reagieren ein reaktionsfähiges Derivat, wie z. B. ein Halogenid, insbesondere ein Chlorid aus Gründen der Verfügbarkeit.
Die Glucosylierungsreaktion wird in basischem Milieu unter Bedingungen durchgeführt, welche die Vermeidung des Abbaus der hydrolyseempfindlichen Dextrankette erlauben.
Diesbezüglich wird die das Dextran enthaltende basische Reaktionsmischung auf eine Temperatur in der Größenordnung von 0ºC oder tiefer, insbesondere von -4 bis +5ºC, gebracht.
Nach der Zugabe des reaktionsfähigen Derivats wird die Mischung auf eine Temperatur oberhalb Umgebungstemperatur gebracht, die etwa 70ºC erreichen kann.
Vorzugsweise wendet man einen Temperaturgradienten an, indem man die Temperatur von Umgebungstemperatur auf etwa 55ºC stufenförmig ansteigen läßt. Durch Regelung der Temperatur ist es möglich, die Substitutionsausbeute praktisch nach Belieben zu variieren. Es ist auf diese Weise möglich, Carboxylgehalte von 40 bis 60% sowie auch Gehalte, die 80% erreichen, in einer Stufe und praktisch 100% in zwei Stufen zu erzielen und diese sogar zu überschreiten.
Auf diese Weise ist eine ganze Reihe von Produkten zugänglich, welche die gewünschten Eigenschaften haben.
Diese Modulation weist einen Vorteil insofern auf, als dann, wenn man über Produkte verfügen möchte, die erhöhte antikoagulierende Eigenschaften besitzen, es bevorzugt ist, über einen höheren Gehalt an Struktureinheiten D zu verfügen, da dieser Gehalt höher sein muß, um die antikomplementäre Aktivität der Derivate zu erhöhen.
Das Verhältnis zwischen der Konzentration an reaktionsfähigem Derivat und der Konzentration an Dextran liegt zweckmäßig bei 1,5 bis 3,5.
Um die Gewinnung (Abtrennung) der Produkte durch Ausfällung zu ermöglichen, wird der pH-Wert bis auf einen neutralen Wert gesenkt.
Die Produkte werden mit Hilfe eines Lösungsmittels, insbesondere eines alkoholischen Lösungsmittels wie Methanol ausgefällt.
Wenn die Kette R in den Struktureinheiten B eine Gruppe -CO- NH-(CH&sub2;)n, darstellt, erhält man in vorteilhafter Weise die Produkte, indem man von Struktureinheiten B ausgeht, die durch eine Kette -O-(CH&sub2;)n-COO&supmin; substituiert sind, durch Umsetzung mit den entsprechenden Aminosäuren.
Die Stufe der Herstellung der Struktureinheiten C umfaßt die Kupplung der Derivate der Formel
mit der Substitutionskette der Struktureinheiten B. Man verwendet zweckmäßig ein Kupplungsmittel in einem sauren Milieu bei Umgebungstemperatur.
Es handelt sich dabei um Kupplungsmittel, wie diejenigen, die in der Arbeit "Reactifs IBF, Practical Guide for Use in Affinity Chromatography", 1979, S. 34-37, genannt sind, insbesondere um das N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrocholin (EEDQ), das Carbodiimid oder das N-Isobutoxy-carbonyl-2-isobutoxy-1,2-dihydrochinolin (I.I.D.Q.).
Gemäß einer Variante, welche die Durchführung der Reaktion in einer erhöhten Ausbeute, d. h. in einer Substitutionsausbeute von mindestens etwa 10%, erlaubt, stellt man das gemischte Anhydrid des Dextrans her, indem man ein Alkylchloroformiat (insbesondere Ethyl- oder Isobutyl-chloroformiat) reagieren läßt mit einem Derivat, das mit der freigesetzten Chlorwasserstoffsäure ein Hydrochlorid bilden kann, wie das Triethylamin, das N-Methylmorpholin oder ein Analogon davon. Diese Aktivierungsstufe wird vorzugsweise bei einer Temperatur unter 0ºC und sogar bei -15ºC durchgeführt. Diese Reaktion läuft innerhalb weniger Minuten sehr schnell ab, dann führt man die Kupplung bei tiefer Temperatur durch.
Das Verhältnis zwischen der Konzentration an dem zu kuppelnden Derivat und derjenigen des substituierten Dextrans liegt zweckmäßig in der Größenordnung von 2 und die Konzentration an Chloroformiat, bezogen auf die Konzentration von Dextran, beträgt etwa 1.
Man läßt anschließend die gebildeten Dextranketten, welche die Struktureinheiten B enthalten, mit einem reaktionsfähigen Derivat reagieren, das R&sub2; enthält und die Fixierung von R&sub2; an dem Arylrest der Ketten von B erlaubt.
Die Substitution durch SO&sub3;&supmin;-Gruppen wird zweckmäßig durchgeführt mit Hilfe von Chlorsulfonsäure unter verdünnten Bedingungen, um den Abbau der Dextrankette zu vermeiden. Diese Stufe wird in einer heterogenen Phase durchgeführt und das abgetrennte (gewonnene) Produkt wird gewaschen und getrocknet.
Im Verlaufe dieser Stufe ist es möglich, bis zu der Hälfte der aromatischen Ringe der Struktureinheiten C zu substituieren.
Die Operation wird erforderlichenfalls erneut durchgeführt, bis der gewünschte Substitutionsgrad erreicht ist.
Im Hinblick auf seine biologischen Anwendungen wird das so erhaltene substituierte Dextran gewaschen und dann in lyophilisierter Form aufbewahrt.
Dank dieses Verfahrens ist es möglich, auf synthetischem Wege eine Reihe von Dextranderivaten herzustellen, die den Vorteil haben, daß sie löslich sind und sehr variable Mengenanteile an Substitutionseinheiten aufweisen, wobei diese Mengenanteile ausgewählt werden können als Funktion der gewünschten Eigenschaften.
Die biologische Aktivität der oben definierten Dextranderivate wurde auf unterschiedlichen Gebieten untersucht, insbesondere bei bestimmten Proteinen der Koagulation, insbesondere Thrombin und in dem Komplement-System.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität dieser Derivate gegenüber Thrombin vom Prozentsatz der Struktureinheiten B und D abhängt.
Diese Aktivität tritt auf bei einem Gehalt an Strukturelementen B von mehr als 35%, insbesondere von 40%, und sie nimmt zu mit dem Prozentsatz der Struktureinheiten D. Diese Aktivität scheint demnach zu resultieren aus einem Kooperationseffekt zwischen den Substitutionsketten von B und D.
Die Überprüfung der isomolekularen Fraktionen der erfindungsgemäßen Derivate hat eine sehr deutliche Zunahme der Thrombin-Inhibierungsaktivität mit dem Molekulargewicht gezeigt.
Die Untersuchung ihrer Wirkung auf die Plasmaproteine des Komplementär-Systems hat ein starkes Inhibierungsvermögen gegenüber der Wirkung der alternierenden C&sub3;-Konvertase, dem enzymatischen Komplex, der das C&sub3;-Protein auf alternierendem Wege aus dem Komplementärsystem entfernen kann, gezeigt.
In Gegenwart von Blut sind diese Produkte somit in der Lage, ebenso wie Heparin zu einer Verminderung der Hämolyse und zu einer Verminderung der inflammatorischen Reaktion des Organismus zu führen.
Der Vorteil dieser Derivate wird noch gesteigert aufgrund ihrer guten Verträglichkeit (Toleranz).
Mit Mäusen mit einem Gewicht von etwa 20 g wurden Toxizitätstests durchgeführt durch intravenöse Injektion von 0,5 ml einer Lösung von 40 mg/ml Dextran, das erfindungsgemäß modifiziert worden ist, in einer isotonischen NaCl-Lösung pro Maus. Diese Tests haben die vollständige Nicht-Toxizität der erfindungsgemäßen Produkte gezeigt: es wurde keine Reaktion festgestellt weder während der Injektion noch während der auf die Injektion folgenden 14 Tage.
Angesichts ihrer Eigenschaften sind diese Derivate besonders geeignet für die Verwendung als Blutplasma-Ersatzstoffe, insbesondere als Streckmittel, die gegenüber Dextranen den Vorteil bieten, daß sie die in bestimmten Fällen zu beobachtenden Hypersensibilitätsrisiken vermindern.
Die Erfindung betrifft außerdem Biomaterialien, die als Blutplasmaersatzstoffe und als Streckmittel verwendbar sind, auf der Basis der obengenannten Dextranderivate, in Form einer 5 bis 15%igen Lösung, insbesondere einer 10%igen Lösung in einem Kochsalzmilieu. Diese Streckmittel werden beispielsweise in einer Menge von 1,5 bis 2 l/Tag verwendet.
Wie in den Beispielen gezeigt, weisen die erfindungsgemäßen Dextranderivate, insbesondere diejenigen mit einem erhöhten Molekulargewicht von mehr als 40.000, eine antithrombische Aktivität a in der Größenordnung von 300 bis 400 uT/mg oder mehr auf.
Diese Produkte enthalten, wie oben angegeben, zweckmäßig etwa 40 bis 50% Struktureinheiten B und 9 bis 12 und sogar bis zu etwa 20% Struktureinheiten C. Bevorzugte Produkte weisen ein Molekulargewicht von mehr als 60.000 und sogar von mehr als 80.000 auf.
Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemäßen Dextranderivate enthalten, und sie betrifft insbesondere Zusammensetzungen mit einer antikoagulierenden Aktivität, die als aktives Prinzip (Wirkstoff) eine wirksame Menge mindestens eines Derivats, wie es oben definiert worden ist, in den angegebenen bevorzugten Mengenverhältnissen enthalten. Eine bevorzugte Zusammensetzung enthält die Dextranderivate des Beispiels 1 zweckmäßig in Mengenverhältnissen, wie sie weiter oben für die Struktureinheiten B und D angegeben sind, wobei der Gehalt an C Null sein kann.
Diese Zusammensetzungen enthalten ein pharmazeutisches Vehiculum, das für die Verabreichung auf oralem Wege oder auf rectalem Wege in Form von Salben oder in Form eines injizierbaren Präparats geeignet ist.
Injizierbare Lösungen enthalten 10 bis 50 mg Dextran pro Gabe. Die Injektion kann auf subcutanem oder intravenösem Wege oder durch Perfusion erfolgen und sie kann zwei- bis dreimal pro Tag wiederholt werden, je nach Zustand des Patienten und je nach den Ergebnissen der biologischen Versuche, wie sie bei den üblichen Heparinbehandlungen durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Derivate stellen auch Synthese-Zwischenprodukte für die Herstellung von Arzneimittel-Vektoren dar. Sie sind nämlich als Träger für den Transport von aktiven Substanzen verschiedener Typen verwendbar.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen anhand der Herstellung von Dextranderivaten und anhand der Untersuchung ihrer biologischen Aktivitäten näher erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von Dextranderivaten, welche die folgenden Struktureinheiten A, B, C und D enthalten

Man unterwirft eine Dextran-Probe mit einem Molekulargewicht von mehr als 8.000, die durch Flüssigchromatographie unter niedrigem Druck abgetrennt worden ist, den folgenden Stufen 1 bis 5:
1) Carboxymethylierung mit Monochloressigsäure -
2) Fixierung von Benzylamin durch Kuppeln dieses Derivats -
4) Waschen und Konditionieren.

Erste Stufe: Carboxylmethylierung von Dextranen

Diese Stufe wurde angeregt durch die Arbeiten von F. Antonini et al. ("Giorn. Biochi.", 14, 88, 1965).
In einem 1 l-Kolben, der mit einem Rührsystem ausgestattet ist und zu 2/3 in ein Bad (Eis plus Salz (-4ºC)) eingetaucht ist, löst man 48,6 g Dextran (0,30 Mol) in 400 ml 6 N Natronlauge (2,4 Mol). Man läßt 20 min lang unter Rühren bei -4ºC stehen.
In den Kolben führt man nach und nach (Einführungsdauer 10 min) 100 g ClCH&sub2;COOH (1,05 Mol) ein.
Man bringt die Temperatur auf 70ºC und man hält diese Temperatur unter Rühren 20 min lang aufrecht.
Man kühlt ab, indem man den Kolben zu 2/3 in ein Eisbad eintaucht.
Der pH-Wert, der einen Wert in der Nähe von 11 hat, wird durch Zugabe von Essigsäure auf 7 eingestellt.
Man fällt das Produkt mit 3 l Methanol aus, dann wäscht man es mit Methanol und trocknet es in einem Trockenschrank unter Vakuum bei etwa 40ºC.
Durch dieses Verfahren substituiert man etwa 30% der Dextranringe, ohne makromolekulare Ketten abzubauen. Bedeutendere Substitutionen werden erhalten, wenn man diese Operation entsprechend der nachstehenden Tabelle I mehrfach (n-fach) wiederholt.

Tabelle I

n (Anzahl der Carboxymethylierungen) % carboxymethylierte Dextran-Struktureinheiten
1 30-32
2 45-50
3 60-65
4 75-80
5 90-98

Zweite Stufe: Fixierung des Benzylamins

Diese Stufe ist inspiriert von den Arbeiten von P.V. Sundaram ("Biochem. Biophys. Res. Comm." 61, 717, 1974).
In einem 2 l-Kolben löst man unter Rühren bei Umgebungstemperatur 40 g Carboxymethyldextran mit 90% carboxymethylierten Dextran-Struktureinheiten (hergestellt in der ersten Stufe) in 290 ml Wasser.
Man stellt den pH-Wert auf etwa 3,5 ein durch Zugabe von 1 N Chlorwasserstoffsäure.
Man gießt 89 g (0,360 Mol) gelöstes N-Ethoxycarbonyl-2ethoxy- 1,2-dihydrochinolin (E.E.D.Q.) der Formel
in 710 ml absolutes Ethanol.
Man hält 1/2 Stunde lang unter Rühren.
Man gibt 40 ml Benzylamin (0,36 Mol) zu und läßt eine Nacht lang unter Rühren stehen.
Nach dem Eindampfen der Mischung fast bis zur Trockne fällt man das Dextran mit 2 l Methanol aus, wäscht mit Methanol und trocknet im Trockenschrank unter Vakuum bei 40ºC.

Beispiel 2

Variante der Durchführung der Stufe der Carboxymethylierung und Kupplung des Benzylamins

Carboxymethylierung

Als Variante arbeitet man wie folgt:
Man löst 30 g (0,185 Mol) Dextran mit einem Molekulargewicht von etwa 40 000 in 246 ml 6 N Sodalösung (soude) (1,48 Mol) und rührt 20 min lang bei dieser Temperatur.
Anschließend führt man in den Kolben 61,2 g ClCH&sub2;COOH (0,647 Mol) langsam ein, wobei man die Temperatur bei 20ºC hält.
Das System wird anschließend erwärmt, um am Ende von 20 min 55ºC zu erreichen.
Die Reaktion wird so für eine variable Zeitspanne t&sub2; (0 bis 60 min) aufrechterhalten, je nach dem gewünschten Substitutionsgrad (25 bis 85% Carboxymethyldextran).
Es ist auch möglich, die Ausbeute dieser Carboxymethylierung zu kontrollieren (zu steuern) durch Festlegen der Zeit t&sub2; auf 40 min und durch Variieren des Verhältnisses R&sub2; der Menge an Monochloressigsäure zur Menge an Dextranstruktureinheit entsprechend der Bedingung 1 ≤ R&sub2; ≤ 3,5.

Kupplung des Benzylamins

In einem Doppelmantel-Reaktor, der mit einem Kryostaten verbunden ist, löst man 1 g Carboxymethyldextran (6,17 mMol) mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 40.000 (98% CMD) in 8 ml Wasser und säuert das Milieu mit konzentrierter HCl auf etwa pH 3,5 an. Dann gibt man sehr langsam 16 ml Dimethylformamid zu, wobei man den pH-Wert bei etwa 3,5 hält.
Anschließend wird die Lösung auf -15ºC gebracht.
Man gibt danach ein Volumen V&sub1; (0,44 ml) N-Methylmorpholin und ein Volumen V&sub2; (0,52 ml) Isobutylchloroformiat zu.
1 min nach der letzten Zugabe führt man ein Volumen V&sub3; (0,49 ml) Benzylamin ein.
Die Reaktionsmischung wird für eine Zeitspanne t&sub1; (5 bis 60 min) bei -15ºC unter Rühren stehen gelassen, dann wird die Temperatur auf 20ºC gebracht und 1 h lang gerührt.
Das Produkt wird dann unter Vakuum abgezogen, dann in 500 ml Methanol ausgefällt, über eine Fritte filtriert, dann in Wasser wieder aufgenommen und danach durch eine geeichte Membran ultrafiltriert.
Auf diese Weise erhält man Gehalte an fixiertem Benzylamin, die zwischen 1 und 5% variieren, in einer Stufe.

Beispiel 3

Indem man wie in dem obigen Beispiel 1 oder 2 arbeitet, stellt man eine Reihe von Produkten, die in variierender Weise substituiert sind, her. Diese Produkte sind in der folgenden Tabelle 1 zusammen mit ihrer Zusammensetzung und ihrem zahlendurchschnittlichen Molekulargewicht angegeben. Tabelle 1 Referenz Mn Zusammensetzung theoretischer Wert gemessen durch Tonometrie Dextran

Beispiel 4

Untersuchung der Thrombin-Zeit, der Reptilase-Zeit und der antikoagulierenden Aktivität der erfindungsgemäßen Derivate

4.1: Thrombin-Zeit und Reptilase-Zeit

Verfahren

Man mißt die Thrombin-Zeit (TT) und die Reptilase-Zeit (TR).
Die Thrombin-Zeit entspricht der Zeit der Bildung eines Gerinnsels nach der Zugabe von Thrombin in einer Plasmaprobe oder in einer Fibrinogen-Lösung.
Die Reptilase-Zeit erlaubt die Kontrolle, ob die Fähigkeit der Umwandlung des Fibrinogens in Fibrin durch die Anwesenheit des Dextranderivats nicht modifiziert worden ist.
Diese Messungen werden automatisch bei 37ºC mit Hilfe eines Koagulometers Dade KC1 durchgeführt, wobei man wie folgt arbeitet:
0,2 ml Plasma, das arm an Blutplättchen ist (PPP), oder Fibrinogen (6 g/l) werden zusammen mit 0,1 ml MichaelisPuffer, der eine geeignete Konzentration an gelöstem Dextranderivat enthält, bei 37ºC inkubiert.
Die Inkubationsdauer beträgt 5 min.
Man gibt 0,1 ml Thrombin-Lösung (in einem Michaelis-Puffer) oder Reptilase-Lösung (in destilliertem Wasser) zu und mißt die Zeit bis zum Auftreten des Gerinnsels (TT oder TR).
Die Vergleichszeit wird bestimmt mit einem Puffer-Volumen, das frei von einem Dextranderivat ist.
Die Entwicklung der TT in dem Plasma als Funktion der Konzentration des Polymers scheint parallel zu verlaufen zu derjenigen, die mit Heparin beobachtet wurde, wie die Fig. 1 zeigt. In dieser Figur ist die Änderung der TT als Funktion (1) eines Derivats, das 14% Struktureinheiten D und 45% Struktureinheiten B enthält (Kurve ), (2) eines Heparins (Kurve ) angegeben.
Das verwendete Heparin weist eine USP-Aktivität von 173 ui/mg und ein Molekulargewicht von 10.700 Dalton auf.

Ergebnisse

In der Tabelle 2 sind die Thrombin-Zeiten auf Plasma und Fibrinogen sowie die Reptilase-Zeit angegeben, die mit verschiedenen Dextranderivaten erhalten wurden (die Prozentsätze an Struktureinheiten B, C und D dieser Derivate sind in der Tabelle 1 angegeben). Tabelle 2 Thrombin-Zeit (TT) auf Plasma und Fibrinogen sowie Reptilase- Zeit (TR) von Dextranderivaten Referenz vgl. Tabelle 1 Anfangskonzentration des Polymers Thrombinzeit auf Plasma Thrombinanfangskonzentration auf Fibrinogen Reptilase-Zeit auf Plasma Heparin
Man stellt fest, daß die Reptilase-Zeiten in Gegenwart des Polymers nicht verlängert sind und somit das Fibrinogen nicht verändert ist. Diese Unveränderlichkeit der Reptilase-Zeiten läßt es zu, die Verlängerung der Thrombin-Zeiten auf Plasma mit einer antikoagulierenden Aktivität in Korrelation zu bringen.
Die Thrombin-Zeiten auf Fibrinogen liegen in der Größenordnung derjenigen der Vergleichswerte, wenn die Konzentrationen an Dextranderivaten gering sind.
Wenn dagegen diese Konzentrationen erhöht sind, stellt man eine leichte Verlängerung dieser Zeiten fest, was die Möglichkeit einer direkten Wirkung des Polymers auf das Thrombin anzeigen könnte. Diese Beobachtungen sind ein Anzeichen für die Beteiligung eines anderen Mechanismus, wie z. B. desjenigen von Antithrombin III, an diesem Mechanismus wie im Falle des Heparins.

4.2 Antikoaculierende Aktivität

Verfahren

Die antikoagulierende Aktivität (a) wird bestimmt aus den Thrombin-Zeiten des PPP in Gegenwart verschiedener Polymer- Konzentrationen.
Die Aktivität a ist definiert als die Anzahl der Thrombineinheiten, die pro mg Produkt inaktiviert werden (uTh/mg).
Diese inaktivierte Thrombinmenge wird ermittelt aus einer Eichkurve.
Unter den gleichen Bedingungen hat das handelsübliche Heparin einen Aktivitätskoeffizienten a von 4.000 uTh/mg.

Ergebnisse

In der folgenden Tabelle 3 sind die antikoagulierenden Aktivitäts-Werte a in uT/mg für die in der Tabelle 2 in Betracht gezogenen Derivate angegeben.

Tabelle 3

Referenz antikoagulierende Aktivität a (uT/mg)
1 (Dextran) 0
2 C.M. Dettran 0
3 C.M. Dettran 0
4 0
5 0

Änderung der antikoagulierenden Aktivität a als Funktion der jeweiligen Mengenanteile der Struktureinheiten B und D

Für die Produkte 1 bis 28 ist die Aktivität a in den Fig. 2a und 2b als Funktion des Gehaltes an Struktureinheiten B, die Carboxymethylgruppen tragen, oder des Gehaltes an sulfonierten Struktureinheiten D angegeben.
Die Fig. 2a entspricht der Änderung der Aktivität a der Ausgangs-Dextranderivate mit einem Molekulargewicht Mp von 10.500 als Funktion des Gehaltes an Struktureinheiten B mit einem Gehalt an Struktureinheiten D von 15 + 1 (Kurve ), von 11 ± 1 (Kurve ), von 6 ± 1 (Kurve ) und von 2 ± (Kurve ).
Die Fig. 2b entspricht der Änderung der Aktivität a der verwendeten Dextranderivate als Funktion des Gehaltes an Struktureinheiten D, wobei der Gehalt an Struktureinheiten B 47,5 ± 2,5% beträgt.
Die Überprüfung dieser Ergebnisse zeigt, daß man eine antithrombische Aktivität erhält, wenn die Produkte mindestens 35% Struktureinheiten B enthalten.
Es ist auch eine schnelle Zunahme des Wertes a über den Schwellenwert des Auftretens der Antithrombose-Aktivität hinaus festzustellen (Fig. 2a).
Diese Zunahme von a scheint um so stärker zu sein, je höher der Mengenanteil an Struktureinheiten des Dextran-Trägers ist, die Sulfonatgruppen tragen (Fig. 2b).

Einfluß des Molekulargewichtes

Mit dem Ziel, die Korrelationen zwischen dem Molekulargewicht und der antikoagulierenden Aktivität zu untersuchen, wurde ein sehr polydisperses Derivat (MW = 15.600, Mn = 7.400, MW/Mn = 2,1) mit mittlerer Dextran-Aktivität (a = 8 UT/mg) wie folgt fraktioniert:
Füllung der Säule: man verwendet ein Gel, das vorher gewaschen und in bidestilliertem Wasser bei 20ºC etwa 10 h lang zum Aufquellen gebracht worden ist, bevor es in eine Glassäule (LKB) mit einer Länge von 1 m und einem Innendurchmesser von 2,5 cm eingefüllt wird.
Eluierungsmittel: wäßrige 0,2 M NaCl-Lösung, die mit 25 ml/h durch eine Transportpumpe "Vario Perpex" (LKB) transportiert wird.
Beschickung: 100 mg Produkt in 5 ml Eluat
Gesammelte Volumina: 8 ml
Bestimmung der Konzentration der eluierten Lösung: durch UV- Spektroskopie (280 nm)
Nach dem Passieren dieser Säule wird das Produkt nach seinem Molekulargewicht in 5 Fraktionen fraktioniert. (Durch chemische Dosierung wurde bestätigt, daß die Trennung nur als Funktion der Masse erfolgte).
Die Masse jeder Fraktion wurde durch Ausschluß-Flüssigchromatographie unter hohem Druck (90 bar) an einer Säule "Merck Lichrospher" 100 diol. in einem wäßrigen 0,2 M NaCl-Milieu und nach dem Eichen der Säule, bestimmt.
Die antikoagulierende Aktivität a jeder Fraktion ist in der nachstehenden Tabelle 4a zusammengefaßt. Tabelle 4a Fraktion Masse Aktivität
Eine identische Arbeitsweise, durchgeführt mit einem Dextran mit einem Molekulargewicht in der Größenordnung von 40.000, mit einer 5 cm/40 cm-Säule, mit einem Gel Sephadex S 300 Superfine R unter Verwendung einer Beschickung vom 500 mg in 20 ml erlaubt die Herstellung von fünf identischen Faktionen wie in der folgenden Tabelle 4b angegeben: Tabelle 4b Fraktion Masse Aktivität
Auf dem Gebiet der in Betracht gezogenen Molekulargewichte stellt man fest, daß die antikoagulierende Aktivität mit der Molekülmasse zunimmt.

Beispiel 5

Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäßen Derivate auf die Proteine der Kontaktphase der Koagulation

Die relevanten Proteine der Kontaktphase sind diejenigen, die im Kontakt mit einer anderen Oberfläche als dem Endothelium aktiviert werden und mindestens zum Teil verantwortlich sind für die Aktivierung der anderen Faktoren der Koagulation.
Das Kallikrein, ein Enzym, das aus der Aktivierung der Kontaktphase stammt, verstärkt die Aktivierung dieses Systems.
Nachstehend sind die mit erfindungsgemäßen Dextranderivaten erhaltenen Ergebnisse in bezug auf ihre Wirkung auf die Proteine der Kontaktphase angegeben.

Verfahren

Der Test, der die Aktivierung der Kontaktphase zeigt, besteht darin, die enzymatische Aktivität des Kallikreins zu bestimmen. Diese wird nachgewiesen durch Amidolyse eines spezifischen chromogenen Substrats des Enzyms (Substrat S2302, im Handel vertrieben von der Firma Kabi). Die Geschwindigkeit der Freisetzung eines der Hydrolyseprodukte, des p-Nitroanilins (pNA) wird durch Spektrophotometrie bei 405 nm verfolgt.
Die Zunahme der optischen Dichte pro Zeiteinheit bei 405 nm ist proportional zur enzymatischen Aktivität des Kallikreins.
Die Reaktion dieses Tests ist global, da sie nicht die getrennte Analyse der unterschiedlichen Stufen der Aktivierung der Kontaktphase erlaubt.
Die Aktivierung durch die Dextranderivate wurde analysiert als Funktion ihrer Konzentration und andererseits als Funktion ihrer Art und ihrer Zusammensetzung beim Ersatz derselben.
Nach den erhaltenen Ergebnissen scheint die Amplitude der Aktivierung des Systemkontakts eine zunehmende Funktion der Konzentration an aktivem Dextranderivat zu sein.
Das Aktivierungsvermögen der Polymeren gegenüber der Kontaktphase scheint sich zu entwickeln als Funktion der Art und der Zusammensetzung an Substituenten analog zu ihrer antikoagulierenden Aktivität: es tritt eine Zunahme der Aktivität jenseits eines bestimmten Gehaltes an Struktureinheiten B auf und sie scheint um so ausgeprägter zu sein, je höher der Gehalt an den Struktureinheiten D ist.

Beispiel 6

Untersuchung der Wirkung der erfindungsgemäßen Dextranderivate auf das Komplementärsystem

Es wurde die Wirkung von Dextranderivaten mit variablen chemischen Zusammensetzungen auf die alternierende C&sub3;-Konvertase, einen enzymatischen Komplex, der das Protein C&sub3;, ein Protein des alternierenden Weges des Komplementärsystems, spalten kann, untersucht.
In Gegenwart oder in Abwesenheit von spezifischen Antikörpern nimmt das Komplementär-System an den Mechanismen der Erkennung oder Abwehr des Wirts gegenüber infektiösen Agentien oder fremden Zellenteil.

Verfahren

Die Erythrozyten, welche die Fragmente C&sub3;b (ein kleines Fragment, das durch die Spaltung von C&sub3; freigesetzt wird) tragen und genauer als EA C4b 3b bezeichnet werden, werden abgetrennt aus sensibilisierten Schaf-Erythrozyten (FA) nach dem von M.D. Kazatchkine et al. in "J. Cli. Invest.", 67, 223, 1981, beschriebenen Protokoll.
Die Erythrozyten werden anschließend mit solchen Mengen an Proteinen und Stabilisierungsmittel B, D, P zusammengebracht, die ausreichen, um ein Zentrum "C&sub3;-Konvertase-Verstärker" pro Zelle zu erhalten, das bezeichnet wird mit FA C4b 3b Bb P. Diese Zentren aktivieren die Verstärker-Wirkung des Komplements, das die Plasma-Proteine C&sub5;-C&sub6;-C&sub7;-C&sub8;-C&sub9; enthält und rufen eine Hämolyse der Erythrozyten hervor, die das Hämoglobin aussalzen.
Fraktionen von 0,1 ml dieser Suspension werden entnommen und zugegeben zu 0,1 ml Puffer DGVB&spplus;&spplus; (Puffer Veronal + 0,1% Gelatine, enthaltend 0,15 mM Ca&spplus;&spplus; und 0,5 mg Mg&spplus;&spplus;, verdünnt auf 1/2 mit einer 5%igen Dextroselösung, die 0,15 mM Ca&spplus;&spplus; und 0,5 mM Mg&spplus;&spplus; enthält) allein oder zu einem solchen, der geeignete Mengen an erfindungsgemäß modifiziertem Dextran enthält.
Die Mischung wird 30 min lang bei 30ºC unter Rühren inkubiert.
Man gibt 0,3 ml Rattenserum zu, das in dem Puffer GVB-EDTA (Puffer Veronal + 0,1% Gelatine, enthaltend 0,04 MEDTA) im Verhältnis 1 : 20 verdünnt worden ist.
Die gebildeten C&sub3;-Konvertase-Zentren werden nachgewiesen durch 60-minütige Inkubation bei 37ºC unter Rühren.
Man stoppt die Reaktion ab durch Zugabe von 1,6 ml 0,15 M NaCl.
Die Reagensgläser werden zentrifugiert und die Intensität der Lysis wird bestimmt durch Ablesen der überstehenden Flüssigkeit bei 412 nm durch spektrophotometrische Analyse.
Die Anzahl der hämolytischen Zentren pro Zelle wird errechnet.

Inhibierende Aktivität

Die inhibierende Aktivität des untersuchten Produkts ist ausgedrückt als Prozentsatz der Inhibierung der Bildung der Konvertase, bezogen auf ein Vergleichsreagensglas, in dem die Konvertase in Abwesenheit von erfindungsgemäß modifiziertem Dextran gebildet worden ist.
Diese Aktivität ist ausgedrückt durch das Gewicht des Produkts (bei konstantem Volumen), das erforderlich ist für eine 50%ige Inhibierung der Bildung der Konvertase.
Diese Aktivität variiert als Funktion der Struktureinheiten.
In der Tabelle 4 sind die mit den in den obigen Tabellen 1 und 2 angegebenen Derivaten erhaltenen Ergebnisse zusammengefaßt, in der auch die chemische Zusammensetzung der Produkte und ihre antikoagulierende Aktivität a angegeben sind. Tabelle 4 Referenz Nr. Der Probe der Tabelle 1 Chemische Zusammensetzung antikomplementäre Aktivität antikoaguliernde Aktivität Dextrat Heparin
Die Überprüfung dieser Ergebnisse zeigt, daß die antikomplementären Aktivitäten der Dextranderivate Werte erreichen, die in der gleichen Größenordnung liegen wie diejenige von Heparin und für bestimmte Derivate sogar darüber liegen.
In der Fig. 3 ist die Entwicklung der antikomplementären Aktivität der Dextranderivate als Funktion ihrer chemischen Zusammensetzung für Gehalte an Struktureinheiten B,
die von 10 bis 90% variieren, und für Gehalte an Struktureinheiten D angegeben, die betragen:
9-12%: Kurve u
4-4%: Kurve v
2-3%: Kurve w
0%: 0
Man stellt fest, daß die inhibierende Aktivität gleichzeitig zunimmt wie die Erhöhung des Gehaltes an Struktureinheiten D für einen Gehalt an Struktureinheiten B von 40 bis 50%, wobei die Erhöhung des Gehaltes an Struktureinheiten B über diesen Wert hinaus keine Verbesserung mit sich bringt. Es ist auch darauf hinzuweisen, daß die Entwicklung der antikomplementären Aktivität als Funktion der Struktureinheiten B und D sehr nahe liegt bei derjenigen der antikoagulierenden Aktivität a.
Es ist festzustellen, daß die Derivate mit geringen Gehalten an Struktureinheiten D schon eine bedeutende antikomplementäre Aktivität aufweisen, während ihre antikoagulierende Aktivität sehr gering ist.
Es ist außerdem festzustellen, daß die alleinige Anwesenheit von Struktureinheiten C eine leichte antikomplementäre Aktivität induziert, während sie keinen antikoagulierenden Effekt mit sich bringt.
In der Fig. 4 ist die Kurve angegeben, die erhalten wird, wenn man die Korrelation zwischen der antikomplementären Aktivität und der antikoagulierenden Aktivität der obengenannten Derivate mit den Symbolen , , und untersucht, die jeweils Dextranen entsprechen, die 9 bis 12%, 4 bis 5%, 0% und 2 bis 3% Struktureinheiten D enthalten.
Diese Figur zeigt die Möglichkeit, Produkte herzustellen, die eine starke antikomplementäre Aktivität und eine geringe antikoagulierende Aktivität aufweisen.

Claims

1. Nicht vernetzte Dextranderivate, die statistisch verteilt Einheiten A, B und C umfassen, wobei

- die Einheiten A Dextranosideinheiten sind,

- die Einheiten B, die für mindestens 35% der Gesamtzahl der Einheiten stehen, aus osidischen Einheiten A aufgebaut sind, die durch Reste substituiert sind, die eine der Struktur -O-(CH&sub2;)n-R-COO&supmin; entsprechende Carboxylfunktion besitzen, in der R für eine Einfachbindung oder eine Gruppe -CO-NH-(CH&sub2;)n'- steht, n eine Zahl von 1 bis 10 und n' eine Zahl von 1 bis 7 ist, und die arm sind an Struktureinheiten D, d. h. Struktureinheiten, und

- die Einheiten C aus osidischen Einheiten A aufgebaut sind, die durch Reste der Struktur

in der R&sub1; für eine Einfachbindung, eine Gruppe -CH&sub2;- oder eine Gruppe

steht und n wie oben definiert ist, substituiert sind,

wobei die Derivate keine Einheiten D aufweisen, d. h. Einheiten, die aus osidischen Einheiten vom Typ A, die durch eine Kette substituiert sind, die eine Gruppe der Struktur

trägt, in der

- R&sub1; für eine Einfachbindung, eine Gruppe -CH&sub2;- oder eine Gruppe

steht, R&sub2; für ein Anion eines organischen Salzes oder ein physiologisch verträgliches organisches Anion, insbesondere für eine SO&sub3;&supmin;- Gruppe steht und n wie oben definiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach Einführung anionischer Gruppen in die Arylgruppen der Einheiten C und nach der etwaigen Fraktionierung der Dextranderivate zur Abtrennung der Derivate, die ein Moleulatgewicht Mn unter 5.000 besitzen, lösliche Dextranderivate bilden, die ein Molekulargewicht Mn über 5.000 Dalton besitzen und mindestens 35% an Einheiten B und mindestens 3% an Einheiten D enthalten.

2. Dextranderivate nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie die folgenden Einheiten A, B und C

umfassen.

3. Verfahren zur Herstellung der Dextranderivate nach Anspruch 1 oder nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Stufen umfaßt:

- Reaktion eines Dextrans mit einem Derivat der Formel:

X(CH&sub2;)n-R-COOH

in der X für eine reaktive Gruppe steht, die eine glykosidische Bindung mit einer OH-Gruppe einer Glukosyleinheit bilden kann, was zur Bildung von Einheiten B führt;

- Reaktion eines Dextrans, das die Einheiten A und B umfaßt, mit einem Derivat der Formel

in der R&sub1; so wie oben definiert ist, was die Einführung der Einheiten C in die Kette gestattet,

- etwaige Fraktionierung der Dextranderivate, um die Derivate abzutrennen, die ein Molekulargewicht Mn unter 5.000 besitzen.