JP2001523300A - デキストラン誘導体、その製造方法及び特異的な生物作用を有する医薬としてのその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、デキストラン誘導体、特異的な生物作用を有する薬剤としてのその用途及びその製造方法に関する。この誘導体は、高速立体排除クロマトグラフィーにおいて対称的なガウス型の溶離プロフィルで図示される鎖の均一なサイズ分布、及び低圧イオン交換クロマトグラフィーにおいて１つの対称的なピークを有する溶離プロフィルで図示される、電荷した化学基の均一な分布を有する一般式DMC_aB_bSu_cS_d［Dは多糖鎖を示し、好ましくはグルコシド単位の配列からなり、MCはメチルカルボキシレート基を示し、Bはカルボキシメチルベンジルアミド基を示し、Suはスルフェート基を示し、Sはスルホネート基を示し、a、b、c及びdは、MC、B、Su及びS基それぞれでの置換度(ds)を示し、aは０に等しいか又は≧0.3、bは０に等しいか又は≧0.1、cは０に等しいか又は≧0.1、かつdは０に等しいか又は≦0.15、但しdが０であるとき、a及び／又はbは０でない］に相当する。

Description

【発明の詳細な説明】 デキストラン誘導体、その製造方法及び 特異的な生物作用を有する医薬としてのその用途 本発明は、デキストラン誘導体、及び瘢痕形成作用、（血漿を代用する）抗補 体作用、増殖調節作用又は抗凝固作用、さらに詳細には抗血栓作用のような特異 的な生物作用を有する医薬としてのその用途、ならびにその製造方法に関する。 カルボキシレート及びスルホネート基を有する側鎖で置換される様々なデキス トランが、記載されている。特に、フランス特許2,461,724号及び同2,555,589号 は、該基で置換されたデキストランを記載しており、それぞれ抗凝固特性と抗凝 固かつ抗炎症特性を示している。ヨーロッパ特許0,462,194号は、このような置 換されたデキストランの細胞及び組織の再生特性を記載している。 また、このような置換されたデキストランは、該基での置換の程度によって他 の生物活性を有し得ることが示されている。特に、ヨーロッパ特許0,514,449号 は、カルボキシメチル(CM)と一般式D_XCM_YBS_Z［Xは、100の糖単位当たりの非置換 糖単位の平均数を示し、50未満か、50に等しく、Yは100の糖単位当たりのカルボ キシメチル基の平均数を示し、10〜90であり、Zは100の糖単位当たりのカルボキ シメチルベンジルアミドスルホネート基の平均数を示し、15〜35である］のカル ボキシメ チルベンジルアミドスルホネート(BS)で置換されるデキストラン(D)を記載して おり、これは腫瘍細胞の成長阻害剤となっている。 これらの様々な誘導体（構造は図１に要約）は、一般的に、３つの異なる基： カルボキシメチル(CM)、カルボキシメチルベンジルアミド(B)及びカルボキシメ チルベンジルアミドスルホネート(S)（クロロスルホン酸で芳香族環をスルホン 化）でデキストランをランダム置換して得られる。 より詳細には、 a)デキストランのカルボキシメチル化(CMDの生産)は、モノクロロ酢酸の作用で 、塩基性の水性媒体中で行なわれる。デキストランのグルコシド単位中の遊離の ヒドロキシル官能基数に対して示されるデキストランの置換度(ds)を0.7〜1.1に するには、３つの連続的なカルボキシメチル化反応が必要である。 b)カルボキシメチル基へのベンジルアミンのカップリング（CMDBの生成）は、カ ルボキシレート官能基の能力に基づくもので、第一級アミン官能基(R-NH₂)を有 する試薬と反応しうる不安定な混合無水物を形成する。２つの異なる方法又は活 性反応が、 -イソブチルクロロホルメート(IBC)の作用、又は -N-エトキシカルボニル-2-エトキシ-1,2-ジヒドロキノリン（EEDQ）の作用 混合無水物を形成するために用いられた。 両方の場合、反応は、それぞれ水／ジメチルホルムアミド又は水／エタノール の不均質な媒体中で行なわれる。 これらの２つのカップリング方法で、単一の工程で、約0.08〜0.12の同程度の 置換度(ds)が生じる。EEDQでのカップリングの場合、dsは、中間生成物が30〜40 ℃の温度で活性化されると、単一工程で0.25〜0.30に達することができる。 カルボキシメチル化では、ベンジルアミンに対するds値を高くするのに、様々 な試薬の濃度を上げることができない。したがって、反応収率を改善するために は、連続的なカップリングを行う必要がある。最初のカップリング後に沈殿、洗 浄、乾燥したCMDBは、最初のカップリングによる置換を考慮せずに、最初のカッ プリングと完全に同じ条件下で、第二及び／又は第三のカップリングに付す。 c)スルホン化又はスルフェート化は、無水有機媒体（例えば、ジクロロメタン） 及び不均質相中でのCMDBに対するモノクロロスルホン酸の作用で生じる（CMDBは 、ジクロロメタンに不溶性である）。このような不均質な媒体で、糖単位中のス ルフェートの分布は、不均等に生じる[Ricketts,C.R.，J.Chem.Soc.，1956，375 2-3756]。反応を過剰なモノクロロスルホン酸で行い、同時に多糖鎖の酸加水分 解を回避する必要がある。 CMDB類についての[HSO₃Cl]／［結合B単位］比とCMDについての[HSO₃Cl]／[遊 離OH]比は、0.8〜３の範囲である。 芳香族環(B単位)を確実にスルホン化するためには、モル比[HSO₃Cl]／［結合B 単位］は３に等しく、グルコシド単位で生じるヒドロキシル官能基をスルフェー ト化（スルフェート官能基を生産）するためには、モル比[HSO₃Cl]／[遊離OH]は 、ほ ぼ１である。いずれの場合にも、反応媒体中のクロロスルホン酸の濃度は、0.15 Mを越えるべきではない。これらの条件下、スルホネート官能基を有する単位の 割合は、ベンジルアミド基で置換される単位割合に依存する。最近の研究［Maig a-Revel 0.ら、Carbohydrates Polymers，1997，32，89-93］では、従来技術のC MDSu（カルボキシメチルデキストランスルフェート）及びCMDBS（カルボキシメ チルデキストランベンジルアミドスルホネート）のデキストラン誘導体の抗凝固 活性は、それらの硫黄含量によることが示されている。しかし、CMDBS類は、同 一の硫黄含量で、CMDSuを用いて得られるよりも良好な抗凝固活性を有する。 上記の条件下で得られるデキストラン誘導体は、化学基の不規則な分布と多糖 鎖の大きさに欠点を有し、特性を制御しがたい不均質な最終生成物を生じる。 本発明者らは、明確に定義した生成物の製造を良好に制御（制御可能な程度の 置換、最終生成物における電荷又は非電荷化学基の均一な分布及び多糖鎖の均一 な大きさ、所望の活性の選択と良好な再現性）できるデキストラン誘導体の新規 の製造方法を開発した。 本発明の対象は、高速立体排除クロマトグラフィーにおいて対称的なガウス型 の溶離プロフィルで図示される鎖の均一なサイズ分布、及び低圧イオン交換クロ マトグラフィーにおいて１つの対称的なピークとしての溶離プロフィルで図示さ れる、電荷した化学基の均一な分布を示す、一般式DMC_aB_bSU_cS_d ［Dは多糖鎖を示し、好ましくはグルコシド単位の鎖状体からなり、MCはメチル カルボキシレート基を示し、Bはカルボキシメチルベンジルアミド基を示し、Su はスルフェート基（グルコシド単位が有する遊離のヒドロキシル官能基のスルフ ェート化）を示し、Sはスルホネート基（芳香族環のスルホン化）を示し、a、b 、c及びdは、デキストラングルコシド単位中の遊離ヒドロキシル官能基数に対し て示される、MC、B、Su及びS基それぞれでの置換度(ds)を示し、aは０に等しい か又は≧0.3、bは０に等しいか又は≧0.１、cは０に等しいか又は≧0.1、かつd は０に等しいか又は≦0.15、但しdが０であるとき、a及び／又はbは０でない］ のデキストラン誘導体である。 これらの生成物は、仮想サブユニットR-OH及びR-OX［Xは、メチルカルボキシ レート(MC)、ベンジルアミド(B)、スルフェート(Su)又はスルホネート(S)基であ ってもよい］からなるコポリマーとして考えられ、置換されていないデキストラ ンの多糖鎖は、非置換グルコシド単位が３つの遊離のヒドロキシル基からなると いう事実に対して、100個のグルコシド単位の代わりに300個の仮想サブユニット R-OHからなるものと考えられる。それ故、メチルカルボキシレート基の置換度(d s)が1.2のデキストランメチルカルボキシレート(DMC)は、グルコシド単位当たり に、1.20の置換基(R-MC)と1.80の遊離ヒドロキシル基(R-OH)を含む。 このようにして、従来技術の不均質な生成物とは対照的に、生物活性の化学基 が特異的な順序で高分子鎖に沿って分布し、 高分子鎖に沿った該基の分布が異なる以外は、全体的な組成が同じ組成物（詳細 には、異なる製造物）では見出されない生物特性を与える、目的とする組成が均 質な生成物が、得られる。 言い換えれば、本発明のデキストラン誘導体では、化学基の分布により、特異 的な生物特性が最終生成物に付与される。このような分布の結果、各多糖鎖の化 学組成は、生成物の全体的な化学組成と同一となる。したがって、最大限の特異 的な生物活性に対して最適な化学組成があり、それ故、考慮される生物特性と生 成物の全体的な化学組成には、直接的な関係がある。 例えば、上記の一般式DMC_aB_bSu_cS_d［aは≧0.6、bは０でなく、cは０に等しい か又は≦0.5、かつd≦0.15又は０に等しい］のデキストラン誘導体は、好ましく は3000〜500,000g/molのモル質量を有する際に、本質的に瘢痕形成剤である。瘢 痕形成剤として好ましいデキストラン誘導体は、aが0.7〜0.9、c≦0.5かつd≦0. 15又は０に等しいものである。 上記の一般式DMC_aB_bSu_cS_d［a≧0.3、bは０でなく、cは０に等しいか又は≦0.4 、かつd≦0.15又は０に等しい］のデキストラン誘導体は、好ましくは10,000〜6 0,000g/molのモル質量を有する際に、本質的に抗補体活性と血漿置換性を有する 剤である。抗補体活性を有する血漿置換剤として好ましいデキストラン誘導体は 、aが0.40〜1.15、b≦0.4、c≦0.2かつd≦0.15又は０に等しいものである。 上記の一般式DMC_aB_bSu_cS_d［a≧0.5、bは０でなく、cは０に等しいか又は≦0.4 、かつd≦0.15］のデキストラン 誘導体は、好ましくは3,000〜100.000g/molのモル質量を有する際に、本質的に 細胞増殖改変剤である。細胞増殖調節剤として好ましいデキストラン誘導体は、 aが0.5〜1.2、bが0.2〜0.6、cが0.1〜0.4、かつd≦0.15又は０に等しいものであ る。 上記の一般式DMC_aB_bSu_cS_d［a≧0.4、c≧0.3、かつd≦0.15又は０に等しい］の デキストラン誘導体は、好ましくは3,000〜20,000g/molのモル質量を有し、bが ０でない値である際に、本質的に抗凝固剤である。 また、本発明の対象は、活性成分として上記のデキストラン誘導体を少なくと も１つ含み、任意に別の活性成分及び／又は少なくとも１つの医薬的に受容な賦 形剤及び／又は生理的に受容な支持体（好ましくは、リポソーム）と組合わさっ てなることを特徴とする医薬である。 組み合わされる活性成分は、デキストラン、成長因子(例えば、酸性の線維芽 細胞成長因子(FGF)又は塩基性FGF)、局部麻酔剤、抗感染剤、セリック(seric)タ ンパク質及びコラーゲンからなる群から選択される。 また、本発明の対象は、以下の工程からなることを特徴とする、上記の一般式 DMC_aB_bSu_cS_dのデキストラン誘導体の製造方法（方法１）である： a)(i)非置換デキストランを、少なくとも１時間撹拌下で塩基性の２相の水性ア ルコール液体媒体と接触させて活性化し、(ii)40〜90℃、好ましくは60℃の温度 で、得られた活性生成物に モノクロロ酢酸を加え（モノクロロ酢酸のモル数／OHのモル数に等しい比R_MCは0 .3〜2）、(iii)得られたデキストランメチルカルボキシレート(DMC)を単離し、 任意に精製することからなるカルボキシメチル化； b)(i)カップリング剤として1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノエチル)カルボジ イミドメタ-p-トルエンスルホネート(CMC)又は1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプ ロピル)カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)のような水溶性カルボジイミド の存在下、0〜30℃の温度で、a)で得られたDMCを第一級アミン（ベンジルアミン ）と酸性水性媒体中で少なくとも２時間接触させ(CMC/MCモル比は0.25〜２、ベ ンジルアミン/MCモル比は0.25〜２）、(ii)得られたデキストランメチルカルボ キシルベンジルアミド(DMCB)を単離し、任意にそれを精製することからなる、メ チルカルボキシレート基とのベンジルアミンのカップリング（ベンジルアミド化 ） 〔カップリング試薬として水溶性カルボジイミドの存在下、均質な媒体中で行う このような工程により、反応物、つまり最終生成物（高速立体排除クロマトグラ フィーにおいて対称的なガウス型の溶離プロフィルで図示される鎖の均一なサイ ズ分布、及び低圧イオン交換クロマトグラフィーにおいて１つの対称的なピーク としての溶離プロフィルで図示される電荷した化学基の均一な分布を示す）の製 造をより良く制御することができる〕； c)(i)b)で得られたDMCBのトリアルキルアンモニウム塩の形成、 (ii)無水極性溶媒、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はジメチルホルムアミド(DMF )のような一般的なルイス塩基（電子供与体）での得られた塩の可溶化、(iii)同 じ溶媒に溶解した硫黄三酸化物ベースの錯体(例えば、SO₃-ピリジン、SO₃-トリ エチルアミン又はSO₃-DMF)の、溶解した塩への70℃より低い温度での添加（硫黄 三酸化物ベースの錯体／遊離OHモル比は、0.25〜12)からなるスルフェート化； 及び任意の d)室温から用いた溶媒の沸点の間の温度で、無水溶媒中で懸濁液のDMCBSu誘導体 を、同じ溶媒に溶解したクロロスルホン酸と撹拌しながら混合することによる基 Bのスルホン化。 予期しなかったことに、本発明の方法は、従来技術の方法での工程数よりかな り少ない工程数で、デキストランの置換度を制御し、高速立体排除クロマトグラ フィーにおいて対称的なガウス型の溶離プロフィルならびに低圧イオン交換クロ マトグラフィーにおいて１つの対称的なピークとしての溶離プロフィル、及び所 望の生物活性を有する生成物を、従来技術より著しく高い収量で生じることがで きる。 さらに、本発明の方法により、選択される生物特性について所望の化学組成の 生成物を再現して合成することができる。したがって、生物活性は、生成物の所 定の化学組成に対応していることが好ましい。 例えば、工程a)により、水／tert−ブタノール又は水／イソプロパノール(15/ 85 v/v)混合媒体中で60℃で２時間撹拌して、 グルコシド単位当たりのMCが1.0±0.1のdsが、80％より高いか等しい収量で一工 程で生じ(R_MC値は0.85)；MC１のdsを有するDMC(CMC/MCモル比0.75、ベンジルア ミン/MCモル比1)を原料として、16時間室温で攪拌して、工程b)により、80％よ り高い収量でDMCB生成物（MCが0.70±0.05のdsと、Bが0.30±0.03のdsを有する ）が生じ；工程c)により、60％より高いか等しい収量が得られる。 この方法の１つの有利な具体例によれば、工程a)において、水／アルコール比 は10／90(v/v)〜25／75(v/v)で、15／85(v/v)が好ましい。 変形として、上記の一般式DMC_aB_bSu_cS_d［aは０か０でなく、bは０以外であり 、dは０］のデキストラン誘導体の製造方法（方法２）は、 a)ベンジルアミンをクロロアセチルクロライドと接触させ、次いで生成物を単離 し、精製することにより、N-メチルフェニル-2-クロロアセトアミドを製造し、 b)アルコール溶液中のモノクロロ酢酸の存在下、又は非存在下で、塩基性水性ア ルコール溶液に溶解したデキストランを、a)で得られたアルコール溶液中のN-メ チルフェニル-2-クロロアセトアミドと連続的に接触させ、40℃より高い温度、 好ましくは60℃で、得られた混合物を保持し、次いで得られたDB又はDMCBを単離 し、任意に精製し、かつ c)i)トリアルキルアンモニウム塩の形成、ii)無水極性溶媒、つまり一般的なル イス塩基(例えば、ジメチルスルホキシド(D MSO)又はジメチルホルムアミド(DMF))中での得られた塩の溶解、iii)同じ溶媒に 溶解した硫黄三酸化物ベースの錯体（例えば、SO₃-ピリジン、SO₃-トリエチルア ミン又はSO₃-DMF）の、溶解した塩への、70℃より低い温度での添加（硫黄三酸 化物ベースの錯体／遊離OHモル比は、0.25〜12）、及びiv)得られたDBSu又はDMC BSuの単離及び任意の精製からなる、b)で得られた生成物をスルフェート化する 工程からなる。 上記の工程b)及びc)により、上記の方法１で得られるのと同じく均質な最終生 成物を得ることができる。 上記の一般式DMC_aB_bSu_cS_d［aは０以外であり、bは０、dは０である(→DMCSu) ］のデキストラン誘導体を製造するための方法（方法３）は、工程： a)上記条件下での非置換デキストランのカルボキシメチル化、及び b)上記条件下のa)で得られたDMCのスルフェート化 からなることを特徴とする。 前記の記載とは別に、本発明は、本発明の対象である方法を行うための実施例 、ならびに添付図を参照して、以下の記載から明らかになるであろう他の組合せ も含む。 図１は、グルコシド単位に結合した様々な化学基で置換されたデキストランの 構造を図解している。グルコシドベース単位の様々な炭素上での置換基の位置は 、実施例により２に示す。 図２は、上記のデキストラン誘導体(DMCBSu)を用いて得られ た高速立体排除クロマトグラムを示す。 図３は、上記のデキストラン誘導体(DMCBSu)を用いて得られたイオン交換クロ マトグラムを示す しかしながら、これらの実施例は、本発明の対象の例示目的で記載されたにす ぎず、いずれかの方法で限定するものではないことは、明確に理解されるべきで ある。実施例１ ：得られた生成物の物理化学的特徴 ＊酸-塩基のアッセイ： 酸滴定アッセイにより、カルボキシメチル基のミリ当量数を推測し、最終生成 物の組成を調べる。 ＊方法： 滴定を校正して、標準（モノハイドロゲンフタレートカリウム）を用いて水酸 化ナトリウムのモル濃度を決定する。 精製した、非常に正確に計った乾燥（40℃の真空下）生成物15〜25mgは、溶液 の最終濃度が約0.25mg/mlとなるように、水／アセトン(50/50 v/v)混合物に溶解 する。 次いで、10％ HNO₃溶液を用いて、見かけのpH７〜８を2.8〜３に下げる。滴定 溶液は、全量５mlの精密自動マイクロビュレットで加える。各生成物について少 なくとも３回アッセイを行い、ポリマー1g当たりのカルボキシメチル官能基のミ リ当量として示した結果から、カルボキシメチル基での置換度を算出することが できる。この方法から、ベンジルアミド化の前後のカルボキシメチル官能基のミ リ当量数の差によって、B単位での置換度を推測することもできる。元素分析に よって、全生成 物の組成が調べられた。 ＊窒素、硫黄及び塩素の元素分析： 生成物100g当たりの元素g数として示す元素分析による窒素と硫黄のアッセイ で、ベンジルアミド(B)、スルホネート(S)及びスルフェート(Su)基での置換の割 合が、それぞれ測定できる。 塩素のアッセイで、サンプルの純度（塩(NaCl)の割合は、精製後に１〜２％を 越えない）を調べることができる。 ＊生成物の脱スルフェート化(DCMBSuS)： ナトリウム塩の形態の生成物(250mg、10ml)は、カチオン交換樹脂（アンバー ライトIR 120 H⁺、16〜45メッシュ、全交換能力:1.9meq/ml）３mlと室温でゆっ くり攪拌する。２時間後、酸性溶液をろ過し、ピリジン（１〜２ml）でpH6〜6.5 に中和し、蒸発乾固する。得られたピリジニウム塩は、無水メタノール10mlで３ 回採取し、蒸発乾固する。 残渣は、ジメチルスルホキシド(DMSO)、メタノール及びピリジンの90/9/1混合 物25mlに分散する。溶液を、72時間90℃に加熱した油槽中で攪拌する。反応は、 二回蒸留した冷水20mlを加えて停止し、次いで混合物を水性1M NaOH溶液を用い て中和する。脱スルフェート化生成物は、セファデクスG15カラムの低圧立体排 除クロマトグラフィーで精製し、次いで1000Daのカットオフ閾値を有するメンブ レンを備えたセルで透析ろ過(diafiltere)する。脱スルフェート化生成物160〜2 10mgが、得られる。 ＊モル質量の測定： 製造した生成物のモル質量は、高速立体排除クロマトグラフィー(HPSEC)で測 定する。３つのカラムシステムを用いた： -10⁶〜5000g/molの分画範囲をカバーする、連結した２つのカラム(Si300 diolと Hema Sec Bio 40)、 -ゾルバクス(Zorbax)GF450カラム(排除範囲：450,000〜20,000g/mol)、 -TSKゲルG2000カラム(排除範囲:40,000〜1000g/mol)。 それらは、プルラン(853,000〜5800g/mol);酵素デキストラン(オリゴ糖、1500 g/mol);メレチトース(三糖、522g/mol);シクロース(二糖、342g/mol);及びグル コース（単糖、180g/mol）のキットを用いて校正する。分析すべきサンプルを調 製し（2mg/mlで）、pH7.3に緩衝させた0.15M NaCl、0.05M Na₂HPO₄の溶液で溶出 する。多孔度0.2μmのフィルターでろ過後、サンプル100μlを注入し、流速をウ ォーターズモデル510ポンプで調整し、カラムの出入口で、示差屈折計により検 出する。GPCクロムスター(Chromstar)分析ソフトウェアで処理したクロマトグラ ムにより、クロマトグラフィーのモル質量(Mc)、重量平均モル質量(Mp)及び数平 均モル質量(Mn)ならびに生成物の多分散指数が測定できる。 ＊フーリエ変換赤外分光法(FTIR)： 分析すべき生成物１mgは、２回蒸留した水１ml中のKBr 150mg溶液と混合する 。混合物は、多孔度0.45μmのフィルターでろ過し、凍結し、凍結乾燥する。デ ィスクは、得られた粉末で 調製し、すぐにスペクトルを記録する。装置は、FTIR分光光度計(パーキンエル マーモデル1600)で、スペクトルは、IRDMソフトウェアを有するコンピューター （パーキンエルマー）で処理する。実施例２ ：bが０か、０でない様々なDMCBSuの製造 下記の表１は、最終生成物の分析後に測定した、得られた様々な誘導体とその 性質を示す。 SP=血漿置換剤、C=瘢痕形成剤 AC=抗凝固剤、PM=細胞増殖調節剤 a）DMCBSu 1カルボキシメチル化 ： モル質量約40,000のデキストランT40 50g(0.31mol)は、室温に維持し、攪拌系 を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散す る。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の２回蒸留した水188mlに溶解する。 得られた溶液は４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっく り加える。この混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸72.9g(0.77mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml （酸/OHモル比=2.5）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、１時間半攪拌しな がら、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5ｌの容量になるまで希釈する。このようにして得 られた溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留した水を用いて、5000 g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は 、28g/lである。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 1.0±0.1の置換度を有するDMC 70g(0.289mol)が、得られる。ベンジルアミド化 ： 上記溶液のpHを、4.75に調整する。混合物は４℃に冷却する。結合剤（CMC）6 2.3gは、迅速に混合物に加える(CMC/CMモル比=0.5)。いったん、結合剤を混合物 に十分に溶解したら、ベンジルアミン16mlを迅速に加える（ベンジルアミン/CM モル 比=0.5)。次いで、混合物を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、pH７に浸透した水15ｌ、0.05M、pH9 .6の炭酸緩衝液10ｌ、最後に２回蒸留水を連続的に用いて、5000g/molのカット オフ閾値を有するメンブレンで混合物を一定量に限外ろ過する。この溶液の濃度 は、21g/l(31)である。この濃縮溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。MC とBでの置換度は、それぞれ0.79±0.07、0.22±0.03である。スルフェート化 ： スルフェート化は、DMCBのトリエチルアンモニウム塩の調製を要する。 上記の得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5ｌ）のカラムで溶 出する。このようにして酸性化した溶液は、7.0に近いpHにトリエチルアミンで 中和する。 中和溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム塩約65gが、得ら れる。 得られた塩65g（遊離OH 0.39mol）は、いずれかの必要な材料とともに、５時 間40℃で真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り 付けた三ツ頸丸底フラスコ中で、４Åのモリキュラーシーブで予め乾燥したDMSO 1.7ｌに、この塩を溶解する。SO₃-ピリジン錯体24.5g(0.154mol)（錯体／遊離O Hモル比=0.4）は、DMSO 300mlに溶解し、DMCBのトリエチルアンモニウム塩の溶 液にゆっくり加える。混合物は、アルゴン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水２ｌを加えて停止し、2M NaOH溶液を用い て、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで、 溶液を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで、２回蒸留水 を用いて一定量に限外ろ過する。次いで、この溶液を５ｌ量に濃縮し、ろ液の伝 導性が十分になるまで、同じメンブレンで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、２ 回蒸留水を連続的に用いて一定量に限外ろ過する。このようにして精製した溶液 は、1/7の容量に濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。DMCBSu 1 60gは、このように して得られる。硫黄の元素分析で、dsが、0.15±0.02のスルフェート基を有する ことが分かる。 b）DMCBSu 2カルボキシメチル化 ： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、室温に維持し、攪拌 系を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散 する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の188mlに溶解する。得られた溶液は ４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。この 混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸87.5g(0.93mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml （酸/OHモル比=3）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃に する。混合物は、２時間拌しながら、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5ｌの容量になるまで希釈する。このようにして得 られた溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留水を用いて、5000g/mo lのカットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は、28g /lである。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 1.1±0.1の置換度を有するDMC 70g(0.28mol)が、得られる。ベンジルアミド化 ： 上記溶液のpHを、4.75に調整する。混合物は４℃に冷却する。結合剤（CMC）8 5.7gは、迅速に混合物に加える(CMC/CMモル比=0.7)。いったん、結合剤を混合物 に十分に溶解したら、ベンジルアミン22.2mlを迅速に加える（ベンジルアミン/C Mモル比=0.7）。次いで、混合物を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、pH７に浸透した水15ｌ、0.05M、pH9 .6の炭酸緩衝液10ｌ、最後に２回蒸留水を連続的に用いて、5000g/molのカット オフ閾値を有するメンブレンで混合物を一定量に限外ろ過する。この溶液の濃度 は、21g/l(31)である。この濃縮溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。MC とBでの置換度は、それぞれ0.85±0.07、0.27±0.03である。スルフェート化 ： 上記で得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5ｌ）カラムで溶出 する。このようにして酸性化した溶液は、 7.0に近いpHにトリエチルアミンで中和する。 中和溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム塩約65gが、得ら れる。 得られた塩65g(遊離OH 0.365mol)は、いずれかの必要な材料とともに、５時間 40℃で真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り付 けた三ツ頸丸底フラスコ中で、この塩を４Åのモリキュラーシーブで事前乾燥し たDMSO 1.7ｌに溶解する。SO₃-ピリジン錯体22.9g(0．144mol)（錯体／遊離OHモ ル比=0.4）は、DMSO 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物は 、アルゴン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水２ｌを加えて停止し、2M NaOH溶液を用い て、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで溶 液を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで、２回蒸留水を 用いて一定量に限外ろ過する。次いで、この溶液を５ｌ量に濃縮し、ろ液の伝導 性が十分になるまで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、２回蒸留水を連続的に用 いて、同じメンブレンで一定量に限外ろ過する。このようにして精製した溶液は 、1/7の容量に濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。0.15±0.02のSu基の置換度を有 するDMCBSu 2 60gは、このようにして得られる。 c）DMCBSu 3カルボキシメチル化 ： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、 室温に維持し、攪拌系を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパ ノール612mlに分散する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の188mlに溶解する。得られた溶液は ４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。この 混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸72.9g(0.77mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml （酸/OHモル比=2.5)に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、２時間拌しながら 、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、 -メタノール３ｌ中で二重沈殿(double precipitation)させる（このようにして 回収される沈殿物は、メタノールで２回洗浄し、40℃で真空下のオーブンで乾燥 する）か、又は -5000ダルトンのカットオフ閾値を有するメンブレンで接線ろ過(tangential fil tration)して精製する。 次いで、精製溶液を濃縮し、凍結乾燥する。MC 1.0±0.1の置換度を有するDMC 70g(0.289mol)が、得られる。DMC の再カルボキシメチル化 ： 得られたDMC 70g(0.289mol又は0.578molの遊離OH)は、室温に維持し、攪拌系 を取り付けたジャケット付きの３ｌ反応器中のイソプロパノール1035mlに分散す る。 NaOH 46.4g(1.16mol)は、500mlビーカー中の265mlに溶解 する。得られた溶液は４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物に ゆっくり加える。この混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸54.6g(0.578mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml （酸／遊離OHモル比=1）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、２時間拌しながら 、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5ｌの容量になるまで希釈する。このようにして得 られた溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留水を用いて、5000g/mo lのカットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は、30g /lである。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 1.58±0.12の置換度を有するDMC 75g(0.26mol)が、得られる。ベンジルアミド化 ： 上記溶液のpHを、4.75に調整する。結合剤（CMC）169gは、迅速にそこに加え る(CMC/CMモル比=1)。いったん、結合剤を混合物に十分に溶解したら、ベンジル アミン43.7mlを迅速に加える（ベンジルアミン/CMモル比=1）。次いで、混合物 を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、pH７に浸透した水15ｌ、0.05M、pH9 .6の炭酸緩衝液10ｌ、最後に２回蒸留水を連続的に用いて、5000g/molのカット オフ閾値を有するメンブ レンで混合物を一定量に限外ろ過する。この溶液の濃度は、22g/l(31)である。 この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。MCとBでの置換度は、それぞれ1 .15±0.10、0.44±0.04である。スルフェート化 ： 上記で得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5ｌ）カラムで溶出 する。このようにして酸性化した溶液は、7.0に近いpHにトリエチルアミンで中 和する。 中和溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム塩約70gが、得ら れる。 得られた塩70g（遊離OH 0.24mol）は、いずれかの必要な材料とともに、５時 間40℃で真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り 付けた三ツ頸丸底フラスコ中で、この塩を４Åのモリキュラーシーブで事前乾燥 したDMSO 1.7ｌに溶解する。SO₃-ピリジン錯体30.7g(0.193mol)（錯体／遊離OH モル比=0.8）は、DMSO 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物 は、アルゴン気下で室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水２ｌを加えて停止し、2M NaOH溶液を用い て、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで溶 液を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで２回蒸留水を用 いて一定量に限外ろ過する。次いで、溶液を５ｌ量に濃縮し、ろ液の伝導性が十 分になるまで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、 ２回蒸留水を連続的に用いて、同じメンブレンで一定量に限外ろ過する。このよ うにして精製した溶液は1/7の容量に濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。0.40±0.0 4のスルフェート基の置換度を有するDMCBSu 3 65gは、このようにして得られる 。 d）DMCBSu 4カルボキシメチル化 ： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、室温に維持し、攪拌 系を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散 する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の水188mlに溶解する。得られた溶液 は４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。こ の混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸72.9g(0.77mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml （酸/OHモル比=2.5）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、２時間拌しながら 、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5ｌの容量になるまで希釈する。このようにして得 られた溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留水を用いて、5000g/mo lのカットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は、28g /lである。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 1.05±0.10の置換度を有するDMC 70g(0.284mol)が、得 られる。ベンジルアミド化 ： 上記溶液のpHを、4.75に調整する。結合剤（CMC）126.5gは、迅速にそこに加 える(CMC/CMモル比=0.8)。いったん、結合剤を混合物に十分に溶解したら、ベン ジルアミン32.6mlを迅速に加える（ベンジルアミン/CMモル比=0.8）。次いで、 混合物を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、pH７に浸透した水15ｌ、0.05M、pH9 .6の炭酸緩衝液10ｌ、最後に２回蒸留水を連続的に用いて、5000g/molのカット オフ閾値を有するメンブレンで混合物を一定量に限外ろ過する。この溶液の濃度 は、21g/l(31)である。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。MCとBで の置換度は、それぞれ0.74±0.06、0.33±0.03である。スルフェート化 ： 上記で得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5ｌ）カラムで溶出 する。このようにして酸性化した溶液は、7.0に近いpHにトリエチルアミンで中 和する。 中和溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム塩約65gが、得ら れる。 得られた塩65g（遊離OH 0.38mol）は、いずれかの必要な材料とともに、５時 間40℃で真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り 付けた三ツ頸丸底フラスコ中で、この塩を４Åのモリキュラーシーブで事前乾燥 したDMSO 1.7ｌに溶解する。SO₃-ピリジン錯体30.2g(0.154mol)（錯体／遊離OHモル比=0.5 ）は、DMSO 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物は、アルゴ ン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水２ｌを加えて停止し、2M NaOH溶液を用い て、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで溶 液を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで、２回蒸留水を 用いて一定量に限外ろ過する。次いで、この溶液を５ｌ量に濃縮し、ろ液の伝導 性が十分になるまで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、２回蒸留水を連続的に用 いて、同じメンブレンで一定量に限外ろ過する。このようにして精製した溶液は 1/7の容量に濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。0.25±0.03のSu基の置換度を有す るDMCBSu 4 60gは、このようにして得られる。 e）DMCBSu 5カルボキシメチル化 ： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.3lmol)は、室温に維持し、攪拌 系を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散 する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の188mlに溶解する。得られた溶液は ４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。この 混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸117.2g(1.24mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml （酸/OHモル比=4）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、２時間攪拌しなが ら、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5ｌ容量になるまで希釈する。このようにして得ら れた溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留水を用いて、5000g/mol のカットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は、28g/ lである。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 1.2±0.11の置換度を有するDMC 70g(0.271mol)が、得られる。ベンジルアミド化 ： 上記溶液のpHを、4.75に調整する。結合剤（CMC）124.1gは、迅速に混合物に 加える(CMC/CMモル比=0.9)。いったん結合 剤を混合物に十分に溶解したら、ベンジルアミン35.5mlを迅速に加える（ベンジ ルアミン/CMモル比=0.9）。次いで、混合物を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、5000g/molのカットオフ閾値を有す るメンブレンで、pH７に浸透した水15ｌ、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、最後 に２回蒸留水を連続的に用いて混合物を一定量に限外ろ過する。この溶液の濃度 は、21g/l(31)である。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。MCとBで の置換度は、それぞれ0.84±0.07、0.38±0.04である。スルフェート化 ： 上記で得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5ｌ）カラムで溶出 する。このようにして酸性化した溶液は、７に近いpHにトリエチルアミンで中和 する。 中和溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム塩約67gが、得ら れる。 得られた塩67g（遊離OH 0.33mol）は、いずれかの必要な材料とともに、５時 間40℃で真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り 付けた三ツ頸丸底フラスコ中で、この塩を４Åのモリキュラーシーブで事前乾燥 したDMSO 1.7ｌに溶解する。SO₃-ピリジン錯体21g(0.132mol)(錯体／遊離OHモル 比=0.4)はDMSO 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物は、ア ルゴン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水２ｌを加えて停止し、2M NaOH溶液を用い て、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで溶 液を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで、２回蒸留水を 用いて一定量に限外ろ過する。次いで、この溶液を５ｌ量に濃縮し、ろ液の伝導 性が十分になるまで、同じメンブレンで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、２回 蒸留水を連続的に用いて一定量に限外ろ過する。このようにして精製した溶液は 1/7の容量に濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。0.15±0.02のスルフェート基の置 換度を有するDMCBSu 5 62gは、このようにして得られる。 f）DMCBSu 6カルボキシメチル化 ： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、室温に維持し、攪拌 系を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散 する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の188mlに溶解する。得られた溶液は ４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。この 混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸87.5g(0.93mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml （酸/OHモル比=3）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、２時間拌しながら 、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5ｌ容量になるまで希釈する。このようにして得ら れた溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留水を用いて、5000g/mol のカットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は、28g/ lである。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 1.1±0.10の置換度を有するDMC 70g(0.28mol)が、得られる。１回目のベンジルアミド化 ： 上記溶液のpHを、4.75に調整する。結合剤（CMC）130.5gは、迅速にそこに加 える(CMC/CMモル比=1)。いったん結合剤を混合物に十分に溶解したら、ベンジル アミン30.3mlを迅速に加える（ベンジルアミン/CMモル比=0.9）。次いで、混合 物を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、5000g/molのカットオフ閾値を有す るメンブレンで、pH７に浸透した水15ｌ、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、最後 に２回蒸留水を連続的に用いて混合物を一定量に限外ろ過する。溶液は、2.5ｌ( 〜28g/l又は0.1mol/l)の容量に濃縮する。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結 乾燥する。MCとBでの置換度は、それぞれ0.75±0.06、0.38±0.04である。２回目のベンジルアミド化 ： 上記DMCB溶液2.5ｌのpHを、4.75に再調整する。混合物は、４℃に冷却する。 結合剤（CMC）40gは、迅速にそこに加える(CMC/CMモル比=0.5)。いったん結合剤 が混合物に十分に溶解 したら、ベンジルアミン10.3mlを迅速に加える（ベンジルアミン/CMモル比=0.5 ）。次いで、混合物を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、5000g/molのカットオフ閾値を有す るメンブレンで、pH７に浸透した水15ｌ、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、最後 に２回蒸留水を連続的に用いて混合物を一定量に限外ろ過する。この溶液濃度は 、21g/l(31)である。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。MCとBでの 置換度は、それぞれ0.65±0.06、0.54±0.05である。スルフェート化 ： 上記で得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5ｌ）カラムで溶出 する。このようにして酸性化した溶液は、７に近いpHにトリエチルアミンで中和 する。 中和溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム塩約65gが、得ら れる。 得られた塩65g(遊離OH 0.365mol)は、いずれかの必要な材料とともに、５時間 40℃で真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り付 けた三ツ頸丸底フラスコ中で、この塩を４Åのモリキュラーシーブで事前乾燥し たDMSO 1.71に溶解する。SO₃-ピリジン錯体34.9g(0.219mol)(錯体／遊離OHモル 比=0.6)は、DMSO 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物は、 アルゴン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水２ｌを加えて停止し、2M NaOH溶液を用い て、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで溶 液を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで、２回蒸留水を 用いて一定量に限外ろ過する。次いで、この溶液を5l量に濃縮し、ろ液の伝導性 が十分になるまで、同じメンブレンで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、２回蒸 留水を連続的に用いて一定量に限外ろ過する。このようにして精製した溶液は1/ 7の容量に濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。0.30±0.03のスルフェート基の置換 度を有するDMCBSu 6 60gは、このようにして得られる。 g）DMCBSu 7カルボキシメチル化 ： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、室温に維持し、攪拌 系を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散 する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の188mlに溶解する。得られた溶液は ４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。この 混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸72.9g(0.77mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml （酸/OHモル比=2.5）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、２時間拌しながら 、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5l容量になるまで希釈する。このようにして得られ た溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留水を用いて、5000g/molの カットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は、28g/l である。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 1.05の置換度を有するDMC 70g(0.284mol)が、得られる。ベンジルアミド化 ： 上記溶液のpHを、4.75に調整する。結合剤（CMC）126.5gは、迅速にそこに加 える(CMC/CMモル比=0.8）。いったん結合剤を混合物に十分に溶解したら、ベン ジルアミン32.6mlを迅速に加える（ベンジルアミン/CMモル比=0.8）。次いで、 混合物を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、5000g/molのカットオフ閾値を有す るメンブレンで、pH７に浸透した水15ｌ、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、最後 に２回蒸留水を連続的に用いて混合物を一定量に限外ろ過する。この溶液の濃度 は、21g/l(31)である。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。MCとBで の置換度は、それぞれ0.74±0.06、0.33±0.03である。スルフェート化 ： 上記で得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5ｌ）カラムで溶出 する。このようにして酸性化した溶液は、７に近いpHにトリエチルアミンで中和 する。 中和溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム 塩約65gが、得られる。 得られた塩65g（遊離OH 0.38mol）は、いずれかの必要な材料とともに、５時 間40℃で真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り 付けた三ツ頸丸底フラスコ中で、この塩を４Åのモリキュラーシーブで事前乾燥 したDMSO 1.7ｌに溶解する。SO₃-ピリジン錯体24.2g(0.154mol)（錯体／遊離OH モル比=0.4）は、DMSO 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物 は、アルゴン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水２ｌを加えて停止し、2M NaOH溶液を用い て、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで溶 液を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで、２回蒸留水を 用いて一定量に限外ろ過する。次いで、溶液を5l量に濃縮し、ろ液の伝導性が十 分になるまで、同じメンブレンで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、２回蒸留水 を連続的に用いて一定量に限外ろ過する。このようにして精製した溶液は1/7の 容量に濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。0.16±0.02のスルフェート基の置換度を 有するDMCBSu 7 60gは、このようにして得られる。 h）DMCBSu 8カルボキシメチル化 ： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、室温に維持し、攪拌 系を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散 する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の188mlに溶解する。得られた溶液は ４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。この 混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸72.9g(0.77mol)は、1lビーカー中のイソプロパノール450ml（ 酸/OHモル比=2.5）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、２時間拌しながら 、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5l容量になるまで希釈する。このようにして得られ た溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留した水を用いて、5000g/mo lのカットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は、28g /lである。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 0.94±0.10の置換度を有するDMC 70g(0.295mol)が、得られる。ベンジルアミド化 ： 上記溶液のpHを、4.75に調整する。混合物を４℃に冷却する。結合剤（CMC）5 8.8gは、迅速にそこに加える(CMC/CMモル比=0.5)。いったん結合剤を混合物に十 分に溶解したら、ベンジルアミン15.2mlを迅速に加える（ベンジルアミン/CMモ ル比=0.5）。次いで、混合物を室温で16時間攪拌する。 次いで、ろ液の伝導性が十分になるまで、5000g/molのカットオフ閾値を有す るメンブレンで、pH７に浸透した水15ｌ、0. 05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、最後に２回蒸留水を連続的に用いて混合物を一定 量に限外ろ過する。この溶液の濃度は、21g/l(31)である。この溶液５mlを凍結 し、分析用に凍結乾燥する。MCとBでの置換度は、それぞれ0.75±0.07、0.22±0 .03である。スルフェート化 ： 上記で得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5l）カラムで溶出す る。このようにして酸性化した溶液は、７に近いpHにトリエチルアミンで中和す る。 中和溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム塩約65gが、得ら れる。 得られた塩65g(遊離OH 0.4mol)は、いずれかの必要な材料とともに、５時間40 ℃の真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り付け た三ツ頸丸底フラスコ中で、この塩を４Åのモリキュラーシーブで事前乾燥した DMSO 1.7lに溶解する。SO₃-ピリジン錯体45.2g(0.154mol)（錯体／遊離OHモル比 =0.7）は、DMSO 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物は、ア ルゴン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水２ｌを加えて停止し、2M NaOH溶液を用い て、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで溶 液を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで、２回蒸留水を 用いて一定量に限外ろ過する。次いで、溶液を5l量に濃縮し、ろ液 の伝導性が十分になるまで、同じメンブレンで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ 、２回蒸留水を連続的に用いて一定量に限外ろ過する。このようにして精製した 溶液は1/7の容量に濃縮し、凍結し、凍結乾燥する。0.35±0.04のスルフェート 基の置換度を有するDMCBSu 8 60gは、このようにして得られる。 i）DMCSuカルボキシメチル化 ： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、室温に維持し、攪拌 系を取り付けたジャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散 する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の188mlに溶解する。得られた溶液は ４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。この 混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸72.9g(0.77mol)は、1lビーカー中のイソプロパノール450ml（ 酸/OHモル比=2.5）に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、その混合物を 、反応器に接続したサーモスタットで60℃にする。混合物は、２時間拌しながら 、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、2.5l容量になるまで希釈する。このようにして得られ た溶液は、ろ液の伝導性が十分になるまで、２回蒸留水を用いて、5000g/molの カットオフ閾値を有するメンブレンで一定量に精製する。溶液の濃度は、28g/l である。この溶液20mlを凍結し、分析用に凍結乾燥する。 MC 1.0±0.1の置換度を有するDMC 70g(0.289mol)が、得られる。スルフェート化 ： 上記で得られた溶液は、IR 120 H⁺カチオン-交換樹脂（1.5l）カラムで溶出す る。このようにして酸性化した溶液は、７に近いpHにトリエチルアミンで中和す る。 中和した溶液を濃縮し、凍結乾燥する。トリエチルアンモニウム塩約80gが、 得られる。 得られた塩80g(遊離OH 0.466mol)は、いずれかの必要な材料とともに、５時間 40℃で真空下のオーブンで乾燥する。次いで、攪拌系とアルゴン循環系を取り付 けた三ツ頸丸底フラスコ中で、この塩を４Åのモリキュラーシーブで事前乾燥し たDMSO 1.7lに溶解する。SO₃-ピリジン錯体52g(0.326mol)（錯体／遊離OHモル比 =0.7）は、DMSO 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物は、ア ルゴン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で２回蒸留水2lを加えて停止し、2M NaOH溶液を用いて 、媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、0.5容量％濃度のDMSOが得られるまで溶液 を希釈し、5000g/molのカットオフ閾値を有するメンブレンで、２回蒸留水を用 いて一定量に限外ろ過する。次いで、溶液を5l量に濃縮し、ろ液の伝導性が十分 になるまで、同じメンブレンで、0.05M、pH9.6の炭酸緩衝液10ｌ、２回蒸留水を 連続的に用いて一定量に限外ろ過する。このようにして精製した溶液は1/7の容 量に濃縮し、 凍結し、凍結乾燥する。DMCSu 70gは、このようにして得られる。硫黄の元素分 析によれば、dsは、0.37±0.04のスルフェート基を有する。実施例３ ：DMCBSuSの製造 無水ジクロロメタン350ml中のDMCBSu 10g（実施例２にしたがって得られる） の懸濁液を調製する。クロロスルホン酸0.62mlは、無水ジクロロメタン35mlに加 える（クロロスルホン酸／ユニットBモル比=1）。混合物は、室温で１時間アル ゴン気下で攪拌する。生成物は、No.４の半融ろうとでろ過し、ジクロロメタン2 00ml、50/50(v/v)ジクロロメタン/ジオキサン200ml、最後に純粋なジオキサンで 連続的に洗浄する。 酸の形態のDMCBSuSは、水150mlにすぐに溶解し、6M NaOHで溶液のpHを９に調 整し、１時間この温度で維持する。次いで、溶液を0.1M HClで中和し、凍結し、 凍結乾燥する。 スルホネート量は、実施例１で特定した条件下で、２つの生成物の脱スルフェ ート化後の最初と最終的な生成物の硫黄含量の違いで調べる。実施例４ ：DMCBSuの製造方法の変形 a）N-メチルフェニル-2-クロロアセトアミド試薬の製造： ベンジルアミン109.4ml(1mol)は、攪拌系とアルゴン循環系（不活性雰囲気） を備えた三ツ頸丸底フラスコ中で、４Åのモリキュラーシーブで予め乾燥したエ ーテル1lと混合する。 クロロアセチルクロライド79.7ml(1mol)は、滴下ろうとを用いて滴下する（導 入時間は、30分）。添加後、フラスコを密 閉し、１時間室温で攪拌する。 次いで、0.5Mクエン酸溶液1.5ｌ(220g)、４℃での２回蒸留水1.5ｌ、0.5M炭酸 水素ナトリウム溶液1.5ｌ(63g)及び1M NaCl溶液1.5ｌ(87.8g)を連続的に用いて 、混合物を洗浄する。 エーテル相は回収し、蒸発乾固する。 残留乾燥物は、水から２回再結晶させて精製する： 残留物は、沸点まで上げた２回蒸留水（１〜２w/v％溶液）で溶かす。この沸 騰溶液は、100℃にあらかじめ熱したNo.４の半融ろうとを用いてろ過する。ろ液 を冷却し、一晩４℃で放置する。次いで、ワットマン(Wattman)紙で試薬を回収 し、約50℃で真空下のオーブンで乾燥する。 b）DMCBの合成： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、攪拌系を取付けたジ ャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール400mlに分散する。 NaOH 56.5g(1.41mol)は、500mlビーカー中の255mlに溶解する。得られた溶液 は４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。こ の混合物は、１時間攪拌する。 a)で得られたN-メチルフェニル-2-クロロアセトアミド84.9g(0.46mol)は、１ ｌビーカー中のイソプロパノール675mlに溶解する。モノクロロ酢酸43.7g(0.46m ol)は、別の500mlビーカー中のイソプロパノール200mlに溶解する。 N-メチルフェニル-2-クロロアセトアミド溶液は、ジャケット反応器に迅速に 導入し、反応器に接続したサーモスタットで混合物を60℃にする。約５分後、モ ノクロロ酢酸溶液をそこに迅速に加え、混合物を２時間60℃で攪拌する。 次いで、水相を回収し、 -メタノール３ｌ中で二重沈殿させる（このようにして回収される沈殿物は、メ タノールで２回洗浄し、40℃で真空下のオーブンで乾燥する）か、又は -5000ダルトンのカットオフ閾値を有するメンブレンで接線ろ過し、次いで、精 製した溶液を濃縮、凍結乾燥して精製する。 この方法で得られるDMCの組成は、MCが0.90±0.09、Bが0.30±0.03である。 c）DMCBSuの合成： -トリブチルアンモニウム（又はトリエチルアンモニウム）塩の形成： 工程b)で得られるDMCB 50g(0.18mol)は、２ｌの２回蒸留水に溶解する。得ら れる溶液は、カチオン交換樹脂（アンバーライトIR 120 H⁺）カラムで溶出する 。このようにして酸性化した生成物は、７に近いpHにエタノール中の10％トリブ チルアミン（又はトリエチルアミン）で中和する。 中和した溶液は、5000ダルトンのカットオフ閾値を有するメンブレンで接線ろ 過し、濃縮し、凍結乾燥して精製する。トリブチルアンモニウム（又はトリエチ ルアンモニウム）の塩約60gが得られる。 -トリブチルアンモニウム（又はトリエチルアンモニウム）DMCBのスルフェート 化： 得られた塩60gは、いずれかの必要な材料とともに、４時間40℃で真空下のオ ーブンで乾燥する。次いで、４Åのモリキュラーシーブで予め乾燥したN,N-ジメ チルホルムアミド(DMF)2.7ｌ（トリエチルアンモニウム塩については5.7ｆ）中 で、攪拌系とアルゴン循環系を備えた三ツ頸の丸底フラスコに塩を溶解する。SO₃ -ピリジン錯体38.7g(0.24mol)(トリエチルアンモニウム塩の場合には、46.6g(0 .29mol))はDMF 300mlに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物は、室 温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で３ｌの２回蒸留水を加えて停止し、2M NaOH溶液を用 いて媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、5000ダルトンのカットオフ閾値を有す るメンブレンで溶液を限外ろ過し、濃縮、凍結乾燥する。実施例５ ：DMCSuの合成 a）DMCの合成： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、攪拌系を取付けたジ ャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール612mlに分散する。 NaOH 67.9g(1.7mol)は、500mlビーカー中の188mlに溶解する。得られた溶液は ４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。この 混合物は、１時間攪拌する。 モノクロロ酢酸72.9g(0.77mol)は、１ｌビーカー中のイソプロパノール450ml に溶解する。 モノクロロ酢酸溶液は、ジャケット付き反応器に迅速に導入し、反応器に接続 したサーモスタットで混合物を60℃にする。混合物は、２時間攪拌しながら、こ の温度で維持する。 次いで、水相を回収し、 -メタノール３ｌ中で二重沈殿させる（このようにして回収した沈殿物は、メタ ノールで２回洗浄し、40℃で真空下のオーブンで乾燥する）か、又は -5000ダルトンのカットオフ閾値を有するメンブレンで接線ろ過し、次いで、精 製した溶液を濃縮して凍結乾燥することにより精製する。 b）DMCSuの合成： -トリブチルアンモニウム（又はトリエチルアンモニウム）塩の形成： DMC 50g(0.18mol)は、２ｌの２回蒸留水に溶解する。得られた溶液は、カチ オン交換樹脂（アンバーライトIR 120 H⁺）カラムで溶出する。このようにして 酸性化した生成物は、７に近いpHにエタノール中の10％トリブチルアンモニウム ［sic］（又はトリエチルアミン）で中和する。 中和した溶液は、5000ダルトンのカットオフ閾値を有するメンブレンで接線ろ 過し、濃縮し、凍結乾燥して精製する。トリブチルアンモニウム（又はトリエチ ルアンモニウム）の塩約60gが得られる。 -トリブチルアンモニウム（又はトリエチルアンモニウム）DMCのスルフェート化 ： 得られた塩60gは、いずれかの必要な材料とともに、４時間40℃で真空下のオ ーブンで乾燥する。次いで、４Åのモリキュラーシーブで予め乾燥したN,N-ジメ チルホルムアミド(DMF)2.7ｌ中で、攪拌系とアルゴン循環系を備えた三ツ頸の丸 底フラスコに塩を溶解する。SO₃-ピリジン錯体44.8g(0.28mol)(トリエチルアン モニウム塩の場合には、55.8g(0.35mol))はDMF 300mlに溶解し、ポリマー溶液に ゆっくり加える。混合物は、アルゴン気下の室温で２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で３ｌの２回蒸留水を加えて停止し、2M NaOH溶液を用 いて媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、5000ダルトンのカットオフ閾値を有す るメンブレンで溶液を限外ろ過し、濃縮し、凍結乾燥する。 得られたDMCSuの組成は、MCが１±0.1、Suが0.37±0.04である。実施例６ ：DBSuの合成 a）DBの合成： 約40,000のモル質量のデキストランT40 50g(0.31mol)は、攪拌系を取付けたジ ャケット付きの２ｌ反応器中のイソプロパノール400mlに分散する。 NaOH 56.5g(1.41mol)は、500mlビーカー中の225mlに溶解する。得られた溶液 は４℃に冷却し、デキストラン-イソプロパノール混合物にゆっくり加える。こ の混合物は、１時間攪拌 する。 N-メチルフェニル-2-クロロアセトアミド（実施例５参照）84.9g(0.46mol)は 、１ｌビーカー中のイソプロパノール875mlに溶解する。得られた溶液は、ジャ ケット付き反応器に迅速に導入し、反応器に接続したサーモスタットで混合物を 60℃にする。混合物は、２時間攪拌しながら、この温度で維持する。 次いで、水相を回収し、 -メタノール３ｌ中で二重沈殿させる（このようにして回収した沈殿物は、メタ ノールで２回洗浄し、40℃で真空下のオーブンで乾燥する）か、又は -5000ダルトンのカットオフ閾値を有するメンブレンで接線ろ過し、次いで、精 製した溶液を濃縮、凍結乾燥することにより、精製する。 約60gのDBが、得られる。生成物の組成は、B=0.3±0.003である。 b）DBSuの合成： 得られたDB 60gは、いずれかの必要な材料とともに、４時間40℃で真空下のオ ーブンで乾燥する。次いで、４Åのモリキュラーシーブで予め乾燥したN,N-ジメ チルホルムアミド(DMF)2.7ｌ中で、攪拌系とアルゴン循環系を備えた三ツ頸の丸 底フラスコに、生成物を分散する。SO₃-ピリジン錯体40.7g(0.26mol)はDMF 300m lに溶解し、ポリマー溶液にゆっくり加える。混合物は、アルゴン気下、室温で ２時間攪拌する。 反応は、混合物に４℃で３ｌの２回蒸留水を加えて停止し、 2M NaOH溶液を用いて媒体のpHを7.5〜８にする。次いで、5000ダルトンのカット オフ閾値を有するメンブレンで溶液を限外ろ過し、濃縮し、凍結乾燥する。 得られたDBSuの組成は、Bが0.3±0.03、Suが0.14±0.02である。実施例７ ：本発明による生成物の抗凝固活性及び抗補体活性 a)抗凝固活性の測定 活性化されたセファリン時間は、血小板第三因子を除く抗凝固系の内因性経路 の全因子(トロンビン、Ｖ、VIII、IX、XI及びXII)に感受性の探索試験である。 用いた試薬(APTT、オルガノンテクニカ[Organon Teknika])は、ウサギの脳のリ ン脂質（血小板第三因子）と微粒子活性化剤（微粉末シリカ又はエライジン酸） を含む。用いた方法は、以下のとおりである： 低血小板ヒト血漿（PPP） 100μl オーレンケラー(Owren Koller)緩衝液(OKB) 100μl APTT試薬 100μl 37℃で３分インキュベーション 25mM 塩化カルシウム(CaCl₂) 100μl 血餅発生までの時間測定 ポリマー濃度の関数として、凝固時間の対数を曲線にプロットする。曲線の勾 配から、等式： により多糖の特異的な抗凝固活性を算出することができる。 b)補体の活性阻害測定 化学組成が変化し得るデキストラン誘導体の作用は、ヒト血清が、ウサギ抗（ ヒツジ赤血球）抗体(EA)で感作されたヒツジ赤血球で活性化される前に、37℃で 30分間、本発明のデキストラン誘導体の１つとインキュベートされる方法にした がって、溶血又はCH50アッセイで研究した。定義によれば、１つのCH50ユニット は、容積、温度及び反応時間が一定に保持されている反応媒体で活性化された2x 10⁷個のEAの50％の溶血を誘導できる補体タンパク質（血清１mlに含まれる）の 濃度に相当する。細胞当たりの溶血部位数が、算出される。 補体活性阻害に関する活性は、コントロールチューブ（溶血部位数がデキスト ラン誘導体なしで測定される）に対するコンバーターゼ(convertase)の形成阻害 割合として示される。 この活性Aは、溶血部位形成の50％阻害に必要な（一定容量での）生成物の重 量(μg)として示す。抗補体活性のこの表現は、活性が生成物の重量に逆比例で あることを意味する。つまり、抗補体活性は、生成物の重量が小さくなるほど、 比例して高くなる。 この活性は、生成物の全体的な化学組成の関数として変化する。 本発明の５つの誘導体を用いて得られた結果は、下記の表IIに示す。これによ り、誘導体の全体的な化学組成、及び生成物１mg当たりの国際単位として示され る（173IU/mgのヘパリンに対する）特異的な抗凝固活性ａを示す。 MC及びSu単位を有するdsが増大するにつれて、抗補体活性が増すことが見出さ れた。MC単位が約0.40以上のdsでは、Su単位のdsが増すにつれて、抗凝固活性が 増す。 Su単位を有するds値が低い誘導体は、高い抗補体活性を有するが、抗凝固活性 は非常に低いことが、認められている。最終的に、MC及びB単位の存在は、わず かな抗補体活性を誘導するにすぎず、抗凝固作用を有しないことが、認められて いる。 これらの結果から、補体活性での阻害活性が高く、特異的な抗凝固活性が非常 に低い生成物の得られたことが、示された。実施例８ ：本発明の化合物の抗増殖活性 DMCBSu化合物は、細胞の性質によって、細胞成長に対して刺 激又は阻害作用を有する。したがって、例えば心血管の分野では、この生成物は 、内皮細胞の成長刺激と平滑筋細胞(SMC)の成長阻害の利点を有する。これらの 性質は薬理学的に重要で、それらの主要な利点は、血管形成や心血管の外科処置 後の再発狭窄症を妨げることにある。 DMCBSuの抗増殖活性は、ラット大動脈の平滑筋細胞(SMC)について研究した。 10％ウシ胎児血清(FCS)を含む培地に細胞を接種してから24時間後に、３日間 、細胞を欠失条件下(0.1％ FCS含有培地)に付す（これにより、細胞周期のG0/G 1期で細胞を停止させ、同期化することができる）。次いで、10％ FCSを含み、 また濃度が変化し得る試験生成物(0〜1mg/ml)を含む培地で、細胞を再度供給す る。コントロールは、生成物の添加がない以外は同じ条件下で調製する。 それらを５日間成長させた後、細胞を計測（自動カウンターを用いるか、又は トリチウム化チミジンの挿入後に、１分当たりの放射活性を測定して）し、阻害 を以下のように測定する。略語「nb」は、語「数」を示す： ％ I=(1-（生成物の存在下での細胞のnb）／（生成物がない細胞のnb))×100 様々な生成物の抗凝固活性も、測定した。 下記の表IIIは、２つのDMCBSuならびに天然のデキストラン 及びヘパリンについて得られた結果をまとめている。 これらの結果は、DMCBSu 6 とDMCBSu 5について、平滑筋細胞の細胞成長阻害( I)が、ヘパリンの細胞成長阻害に匹敵しているか、それよりも大きいことを示し ている。しかし、これらの２つの生成物は、ヘパリンよりも著しく低い抗凝固活 性を有する。実施例９ ：線維芽細胞成長因子(FGF)存在下での細胞成長の増強 DMCBSuの増殖活性は、２つのセルラインで評価した： CCL39 ：チャイニーズハムスター肺線維芽細胞ライン HUCVEC：ヒト臍帯静脈帯の内皮細胞 成長試験は、欠失条件下で細胞を維持して、つまり、０又は２％のウシ胎児血 清を含む培養培地に異なる濃度の試験生成物を加えて、行う。 計測は、自動カウンターを用いるか、又はトリチウム化チミジンの挿入後に１ 分当たりの放射活性を測定して行う。 ジンの挿入後に１分当たりの放射活性を測定して行う。 FGF類のような一定の成長因子の効果を増し、保護する生成物の能力は、以下 の方法で評価する。 研究されたFGF類のマイトジェン活性は、ED₅₀（細胞へのトリチウム化チミジ ンの最大挿入を半分にするのに要する成長因子の量）を測定するために、生物活 性試験（用量反応試験）で測定する。 このED₅₀は、CCL39細胞について5ng/mlで、HUCVEC細胞について2ng/mlである 。 これらのED₅₀値は、後の研究に用いる。 HUCVEC細胞については、400μg/mlのDMCBSu 5とのFGF（2ng/ml）の組合せで、 20ng/mlのFGFのみと同じマイトジェン力を有する。 CCL39細胞については、ED₅₀は、DMCBSuなしで約5ng/mlのFGFである。1000μg/ mlのDMCBSu 1の存在下、ED₅₀は、0.8ng/mlに減少する。 これらの結果は、DMCBSuによって考慮される細胞成長因子の強化作用を示す。 この作用は、生成物の全体的な化学組成に関連している。下記の表は、例えば、 特に活性なDMCBSuの全体的な化学組成を示している。 DMCBSuの組成（dsで示す） 前記の記載から明らかであるように、本発明は、いずれかの方法で、詳細に記 載しているにすぎない実施例、製造及び使用方法に限定するものではなく、逆に 、本発明の趣旨又は範囲から逸脱せずに、当業者が行い得る全ての変形を含むも のである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，Ｉ Ｌ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ダリ−コリーア ラティファ フランス国、サン―タマン―レ―ゾ エフ ―59230、ルート ドゥ リル 1184 (72)発明者 コリーア ジョゼ フランス国、サン―タマン―レ―ゾ エフ ―59230、ルート ドゥ リル 1184 (72)発明者 ジョゼフォヴィッツ マルセル フランス国、ラモルレ エフ―60260、ド ゥジェーム アベニュ、65 (72)発明者 ジョゼフォンヴィッツ ジャクリーン フランス国、ラモルレ エフ―60260、ド ゥジェーム アベニュ、65

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 高速立体排除クロマトグラフィーにおいて対称的なガウス型の溶離プロ フィルで図示される鎖の均一なサイズ分布、及び低圧イオン交換クロマトグラフ ィーにおいて１つの対称的なピークとしての溶離プロフィルで図示される、電荷 した化学基の均一な分布を示す、一般式DMC_aB_bSu_cS_d［Dは多糖鎖を示し、好まし くはグルコシド単位の鎖状体からなり、MCはメチルカルボキシレート基を示し、 Bはカルボキシメチルベンジルアミド基を示し、Suはスルフェート基を示し、Sは スルホネート基を示し、a、b、c及びdは、デキストラングルコシド単位中の遊離 ヒドロキシル官能基数に対して示される、MC、B、Su及びS基それぞれでの置換度 (ds)を示し、aは０に等しいか又は≧0.3、bは０に等しいか又は≧0.1、cは０に 等しいか又は≧0.1、かつdは０に等しいか又は≦0.15、但し、dが０であるとき 、a及び／又はbは０でない］のデキストラン誘導体。 ２． a≧0.6、bは０でなく、cは０に等しいか又は≦0.5、かつd≦0.15又は０ に等しく、そのモル質量が3000〜500,000g/molであることを特徴とする、本質的 に瘢痕形成剤として用いるための請求項１に記載の一般式DMC_aB_bSu_cS_dのデキス トラン誘導体。 ３． a≧0.3、bは０でなく、cは０に等しいか又は≦0.4、かつd≦0.15又は０ に等しく、そのモル質量が10,000〜60, 000g/molであることを特徴とする、本質的に抗補体活性を有する血漿置換剤とし て用いるための請求項１に記載の一般式DMC_aB_bSu_cS_dのデキストラン誘導体。 ４． a≧0.5、bは０でなく、cは０に等しいか又は≦0.4、かつd≦0.15又は０ に等しく、そのモル質量が3,000〜100,000g/molであることを特徴とする、本質 的に細胞増殖改変剤として用いるための請求項１に記載の一般式DMC_aB_bSu_cS_dの デキストラン誘導体。 ５． a≧0.4、bが０でなく、c≧0.3、かつd≦0.15又は０に等しく、そのモル 質量が3,000〜20,000g/molであることを特徴とする、本質的に抗凝固剤として用 いるための請求項１に記載の一般式DMC_aB_bSu_cS_dのデキストラン誘導体。 ６． 活性成分として請求項１〜５のいずれか１つに記載のデキストラン誘導 体を少なくとも１つ含み、任意に別の活性成分及び／又は少なくとも１つの医薬 的に受容な賦形剤及び／又は生理的に受容な支持体、好ましくはリポソームと組 合わさってなることを特徴とする医薬。 ７． 以下の工程： a)(i)非置換デキストランを、少なくとも１時間撹拌下で塩基性の２相の水性ア ルコール液体媒体と接触させて活性化し、(ii)40〜90℃、好ましくは60℃の温度 で、得られた活性生成物にモノクロロ酢酸を加え(モノクロロ酢酸のモル数／OH のモル数に等しい比R_MCは0.3〜2)、(iii)得られたデキストランメチルカルボキ シレート(DMC)を単離し、任意に精製することから なるカルボキシメチル化、 b)(i)カップリング剤として水溶性カルボジイミドの存在下、０〜30℃の温度で 、a)で得られたDMCをベンジルアミンと酸性水性媒体中で少なくとも２時間接触 させ(CMC/MCモル比は0.25〜2、ベンジルアミン/MCモル比は0.25〜2)、(ii)得ら れたデキストランメチルカルボキシルベンジルアミド(DMCB)を単離し、任意にそ れを精製することからなる、メチルカルボキシレート基とのベンジルアミンのカ ップリング、 c)(i)b)で得られたDMCBのトリアルキルアンモニウム塩の形成、(ii)無水極性溶 媒、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はジメチルホルムアミド(DMF)のような一般 的なルイス塩基中での得られた塩の可溶化、(iii)同じ溶媒に溶解した硫黄三酸 化物ベースの錯体(例えば、SO₃-ピリジン、SO₃-トリエチルアミン又はSO₃-DMF) の、溶解した塩への70℃より低い温度での添加（硫黄三酸化物ベースの錯体／遊 離OHモル比は、0.25〜12）からなるスルフェート化、及び任意に d)室温から用いた溶媒の沸点の間の温度で、無水溶媒中で懸濁液のDMCBSu誘導体 を、同じ溶媒に溶解したクロロスルホン酸と撹拌しながら混合することによる基 Bのスルホン化 からなることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１つに記載の一般式DMC_aB_b Su_cS_dのデキストラン誘導体の製造方法。 ８． 工程(a)において、二相液体水性アルコール媒体中のの水／アルコール 比が10／90(v/v)〜25／75(v/v)で、15／85 (v/v)が好ましいことを特徴とする、請求項７に記載の方法。 ９． 工程b)の水溶性カルボジイミドが、1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリノ エチル)カルボジイミドメタ-p-トルエンスルホネート(CMC)及び1-エチル-3-(3- ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミドハイドロクロライド(EDC)からなる群 から選択されることを特徴とする、請求項７又は請求項８に記載の方法。 １０． a)ベンジルアミンをクロロアセチルクロライドと接触させ、次いで生成 物を単離し、精製することにより、N-メチルフェニル-2-クロロアセトアミドを 製造し、 b)アルコール溶液中のモノクロロ酢酸の存在下、又は非存在下で、塩基性水性ア ルコール溶液に溶解したデキストランを、a)で得られたアルコール溶液中のN-メ チルフェニル-2-クロロアセトアミドと連続的に接触させ、40℃より高い温度、 好ましくは60℃で、得られた混合物を保持し、次いで得られたDB又はDMCBを単離 し、任意に精製し、かつ c)i)トリアルキルアンモニウム塩の形成、ii)無水極性溶媒、つまり一般的なル イス塩基(例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)又はジメチルホルムアミド(DMF) )中での得られた塩の溶解、iii)同じ溶媒に溶解した硫黄三酸化物ベースの錯体 （例えば、SO₃-ピリジン、SO₃-トリエチルアミン又はSO₃-DMF）の、溶解した塩 への、70℃より低い温度での添加（硫黄三酸化物ベースの錯体／遊離OHモル比は 、0.25〜12）、iv)得られたDBSu又はDMCBSuの単離及び任意の精製からなる、b) で得られた生成物を スルフェート化する 工程からなることを特徴とする、一般式DMC_aB_bSu_cS_d［aは０又は０でなく、bは ０以外であり、d=０］の請求項１〜５のいずれか１つに記載のデキストラン誘導 体の製造方法。 １１． a)請求項７に記載の条件下での非置換デキストラン誘導体のカルボキシ メチル化、及び b)請求項７に記載の条件下のa)で得られたDMCのスルフェート化 の工程からなることを特徴とする、請求項１に記載の一般式DMC_aB_bSu_cS_d［aは０ 以外であり、bは０、dは０である］ のデキストラン誘導体の製造方法。 １２． 請求項１に記載の一般式DMC_aB_bSu_cS_dのデキストラン誘導体の製造中間 生成物としての式DMC_aB_b［aは０でなく、bは０でない］のデキストランカルボキ シメチルベンジルアミド。 １３． 請求項１に記載の一般式DMC_aB_bSu_cS_dのデキストラン誘導体の製造中間 生成物としてのデキストランベンジルアミド(DB)。 １４． 抗補体活性剤として用いるための請求項１２に記載のデキストラン誘導 体。