DE60023918T2

DE60023918T2 - MODIFIZIERTE CDNA DES bcl-x GENS DER RATTE UND MODIFIZIERTES PROTEIN

Info

Publication number: DE60023918T2
Application number: DE60023918T
Authority: DE
Inventors: Shigeo Machida-shi OHTA; Sadamitsu Kawasaki-shi ASOH
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1999-08-17
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2020-08-18
Also published as: EP1209230A1; WO2001012807A1; EP1209230B1; EP1209230A4; US20080312409A1; US7626003B2; US7253269B1; JP2001120281A; JP4544715B2; DE60023918D1; DK1209230T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine gentechnisch veränderte cDNA des bcl-x-Gens der Ratte und ein verbessertes Protein. Sie betrifft insbesondere eine neue cDNA, die ein verbessertes Protein Bcl-x_L exprimiert, welches eine höhere Apoptose-inhibierende Aktivität und eine höhere Zelltod-inhibierende Aktivität aufweist als das Protein Bcl-x_L, das vom Apoptose-inhibierenden Gen bcl-x der Ratte exprimiert wird. Die Erfindung betrifft weiterhin Materialien für die Verwendung dieser cDNA für gentechnische Zwecke und ein von der cDNA exprimiertes verbessertes Protein Bcl-x_L.
Stand der Technik
Apoptose stellt eine Art des programmierten Zelltods dar. Apoptose geht einher mit geringem Kontakt mit den umgebenden Zellen, einer Konzentrierung des Cytoplasmas, der Kondensation des Chromatins und mit Kernen, die Endonuklease-Aktivität aufweisen, einer Fragmentierung der Kerne, der Bildung membrangebundener apoptotischer Körper und der Phagozytose der apoptotischen Körper durch benachbarte Makrophagen oder epitheliale Zellen. Weiterhin wird das Phänomen der Spaltung chromosomaler DNA durch die Endonuklease-Aktivität in DNA-Fragmente mit einer Länge von 180 bis 200 Basen beobachtet. Solche Phänomene wurden als der Mechanismus diskutiert, der anzeigt, dass die apoptotischen Körper schließlich durch die benachbarten Zellen phagozytiert werden (beispielsweise Immunology Today 7: 115–119, 1986; Science 245: 301–305, 1989).
Das Gen bcl-2, welches ein in menschlichem Follikel-B-Zelllymphom vorkommendes Proto-Onkogen darstellt, ist beispielsweise als ein Gen bekannt, das die Apoptose kontrolliert (Science 226 (4678): 1097–1099, 1984; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (22): 7166–7170, 1984). Weiterhin liegen Berichte über die Analyse der Genstruktur und der Transkripte oder der cDNA-Klone vor (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (14): 5214–5218, 1986; Cell 47 (1): 19–28, 1986). Dieses bcl-2-Gen wird im Immun- und Nervensystem mit hoher Frequenz exprimiert. Man nimmt an, dass das Genprodukt durch Inhibierung der Apoptose von Zellen die Homöostase des menschlichen Immun- und Nervensystems aufrecht erhält. Darüber hinaus nimmt man an, dass das bcl-2-Gen auch eine wichtige Rolle bei der Morphogenese während der Entwicklung spielt, da es insbesondere im Fötus weitläufig exprimiert wird.
Homologe des Gens bcl-2 wurden weiterhin beim Rind, der Ratte, dem Huhn usw. gefunden und werden zusammen als die bcl-2-Familie bezeichnet.
Die Erfinder der vorliegenden Patentanmeldung klonierten das bcl-x-Gen der Ratte als Homologes des menschlichen bcl-x-Gens (Cell 74 (4): 597–608, 1993), das zur bcl-2-Familie gehört (J. Biol. Chem. 271 (22): 13258–13265, 1996). Sie bestimmten weiterhin durch Röntgenanalyse die dreidimensionale Struktur des Bcl-x_L-Proteins, das vom bcl-x-Gen der Ratte exprimiert wird (J. Biol. Chem. 272 (44): 27886–27892, 1997).
Chang et al. zeigten, dass Mutanten von humanem Bcl-x_L und Bcl-2 mit Deletionen in einer 60 Aminosäuren langen Schleife im Vergleich mit dem Protein in voller Länge eine erhöhte Fähigkeit zur Inhibierung der Apoptose aufweisen (EMBO, 16 (5): 968–977, 1997).
Die Erfinder der vorliegenden Patentanmeldung untersuchten die Substitutionen von Aminosäureresten, welche zu einer Konformationsänderung führen, um die anti-apoptotische Aktivität von Bcl-x_L der Ratte zu erhöhen. Um einen bestimmten Aminosäurerest durch einen anderen Aminosäurerest zu ersetzen, veränderten sie gentechnisch cDNA des bcl-x-Gens und erhielten schließlich die gentechnisch veränderte cDNA, deren Genprodukt Zelltod, an dem Apoptose beteiligt war, deutlich inhibierte.
Die der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegende Erfindung beruht vollständig auf diesen neuen Erkenntnissen der Erfinder. Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung gentechnisch veränderter cDNA, welche die Expression dieses neuen, verbesserten Bcl-x_L-Proteins der Ratte in Zellen ermöglicht.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines rekombinanten Vektors, der diese gentechnisch veränderte cDNA enthält, und einer Zelle, die den rekombinanten Vektor umfasst.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung des verbesserten Proteins, das von der oben beschriebenen gentechnisch veränderten cDNA exprimiert wird.
Offenbarung der Erfindung
Zur Lösung der oben beschriebenen Aufgaben werden durch die vorliegende Patentanmeldung folgende Erfindungen (1) bis (8) bereitgestellt.

(1) Eine gentechnisch veränderte cDNA des bcl-x-Gens der Ratte, mit Substitutionen, die im kodierenden Bereich der bcl-x-cDNA der Ratte gemäß SEQ ID NO: 1 den Rest 22 Tyr in Phe, den Rest 26 Gln in Asn und den Rest 165 Arg in Lys überführen.
(2) Die gentechnische veränderte cDNA der Erfindung (1), an deren 5'-Ende ein Oligonukleotid gebunden ist, das für ein Protein-Transduktions-Domäne-Peptid kodiert.
(3) Die gentechnische veränderte cDNA der Erfindung (2), wobei das Oligonukleotid für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder 13 kodiert.
(4) Ein rekombinanter Vektor, der die gentechnisch veränderte cDNA nach einer der Erfindungen (1) bis (3) trägt.
(5) Eine Zelle, in welche der rekombinante Vektor der Erfindung (4) eingeführt ist.
(6) Ein verbessertes Protein, hergestellt mit Hilfe der gentechnisch veränderten cDNA der Erfindung (1), welches in SEQ ID NO: 2 die folgenden Aminosäuresubstitutionen aufweist: Rest 22 Tyr zu Phe, Rest 26 Gln zu Asn und Rest 165 Arg zu Lys.
(7) Das verbesserte Protein der Erfindung (6), an dessen N-terminalem Ende ein Protein-Transduktions-Domäne-Peptid gebunden ist.
(8) Das verbesserte Protein der Erfindung (7), wobei das Protein-Transduktions-Domäne-Peptid ein Oligopeptid gemäß der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 12 oder 13 ist.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die dreidimensionale Struktur des Wildtyp-Bcl-x_L der Ratte.
2 zeigt die Ergebnisse der Western Blot-Analyse des Expressionsgrads des verbesserten Proteins Bcl-xLFNK in der transfizierten Zelle.
3 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegen Apoptose, die durch Serumentzug induziert ist.
4 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber anti-Fas-Antikörper.
5 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber Staurosporin.
6 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber TN-16.
7 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber Camptothecin.
8 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber Hydroxyharnstoff.
9 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber Trichostatin A.
10 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber Wasserstoffperoxid.
11 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber Paraquat.
12 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber Hitzebehandlung.
13 zeigt die Ergebnisse eines Tests gemäß WST-1-Assay auf Dehydrogenase-Aktivität in den transfizierten Zellen nach Hitzebehandlung.
14 zeigt die Ergebnisse eines Tests gemäß WST-1-Assay auf Dehydrogenase-Aktivität in den transfizierten Zellen nach Behandlung mit TN-16.
15 zeigt die Ergebnisse eines Tests gemäß WST-1-Assay auf Dehydrogenase-Aktivität in den transfizierten Zellen nach Behandlung mit Staurosporin.
16 zeigt die Ergebnisse eines Tests auf Resistenz der transfizierten Zellen gegenüber Apoptose, die durch Entzug des Cytokins IL-3 induziert ist.
17 ist eine mikroskopische Fotografie, welche die in einem serumfreien Medium wachsenden transfizierten CHO-Zellen zeigt.
18 ist eine mikroskopische Fotografie, welche den Zustand des Proteins TAT-Bcl-xFNK zeigt, das in die HeLa-Zellen eingebaut ist.
19 ist eine mikroskopische Fotografie von Chondrozyten in einem Knorpelschnitt, der in einem das Protein TAT-Bcl-xFNK enthaltenden Kulturmedium 5 Tage inkubiert wurde.
20 ist eine mikroskopische Fotografie von Chondrozyten in einem Knorpelschnitt, der in einem das Protein TAT-Bcl-xFNK enthaltenden Kulturmedium 9 Tage inkubiert wurde.
21 ist eine mikroskopische Fotografie von Chondrozyten in einem Knorpelschnitt, der in einem das Protein Bcl-xFNK enthaltenden Kulturmedium 5 Tage inkubiert wurde.
22 ist eine mikroskopische Fotografie von Chondrozyten in einem Knorpelschnitt, der in einem das Protein Bcl-xFNK enthaltenden Kulturmedium 9 Tage inkubiert wurde.
23 ist eine mikroskopische Fotografie von Chondrozyten in einem Knorpelschnitt, der 5 Tage in einem ein Lösungsmittel (PBS) enthaltenden Kulturmedium inkubiert wurde.
24 ist eine mikroskopische Fotografie von Chondrozyten in einem Knorpelschnitt, der 9 Tage in einem ein Lösungsmittel (PBS) enthaltenden Kulturmedium inkubiert wurde.
25 ist eine mikroskopische Fotografie, die den Leberschnitt einer Maus zeigt, der das Protein TAT-Bcl-xFNK systemisch und anschließend Dexamethason verabreicht wurde.
26 ist eine mikroskopische Fotografie, die einen Leberschnitt einer Maus zeigt, der ein Lösungsmittel (PBS) systemisch und anschließend Dexamethason verabreicht wurde.
27 ist eine mikroskopische Fotografie, die den Leberschnitt einer Maus zeigt, der nur ein Lösungsmittel (PBS) systemisch verabreicht wurde.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Die erfindungsgemäße gentechnisch veränderte cDNA gemäß der oben angegebenen Erfindung (1) ist dadurch gekennzeichnet, dass sie im kodierenden Bereich von bcl-x-cDNA der Ratte gemäß SEQ ID NO: 1 Substitutionen aufweist, die das Codon des Rests 22 Tyr (tac) in Codons von Phe (ttt/ttc) ändert, das Codon des Rests 26 Gln (cag) in Codons für Asn (aat/aag) und das Codon des Rests 165 Arg (cgg) in die Codons für Lys (aaa/aag) ändert. Die gentechnologisch veränderte cDNA mit den Nukleotid-Substitutionen an den drei Stellen erzeugt das in der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 gezeigte verbesserte Protein Bcl-xFNK. In diesem verbesserten Protein Bcl-xFNK sind als Folge der durch die oben beschriebenen Nukleotidsubstitutionen verursachten Aminosäureaustausche (Tyr22Phe; Gln26Asn; Arg165Lys) drei Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Tyr²² und Asp¹⁵⁶, zwischen Gln²⁶ und Ser¹⁶⁴ und zwischen Arg¹⁶⁵ und Pro¹¹⁶ gestört, die im Wildtyp-Bcl-x_L der Ratte gebildet werden, wie in der dreidimensionalen Struktur in 1 gezeigt ist.
Die gentechnisch veränderte cDNA kann unter Verwendung der bcl-x-cDNA der Ratte als Template mit einem Mutationskit oder über ein PCR-Verfahren wie in den Beispielen beschrieben nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Als cDNA von bcl-x der Ratte kann das Plasmid pEF1-BOSbcl-x (J. Biol. Chem. 271 (22): 13258–13265, 1996) verwendet werden. Ein alternatives Verfahren kann verwendet werden, bei dem ein Oligonukleotid beliebiger Teile der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 zur Verwendung als Sonde für das Screening einer Ratten-cDNA-Bibliothek synthetisiert wird. Es kann auch ein Oligonukleotid, das mit beiden Enden des als Ziel vorgesehenen cDNA-Fragments hybridisiert, synthetisiert und als Primer bei einem RT-PCR-Verfahren zur Herstellung der cDNA aus der von Rattenzellen isolierten mRNA verwendet werden.
Die Erfindungen (2) und (3) betreffen ein DNA-Fragment (Polynukleotid), bei dem ein für ein Protein-Transduktions-Domäne-Peptid kodierendes Oligonukleotid mit dem 5'-Ende der gentechnisch veränderten cDNA der oben genannten Erfindung (1) ligiert ist. Dieses DNA-Fragment kann zur Herstellung des verbesserten Proteins Bcl-x_L wie unten angegeben verwendet werden.
Der rekombinante Vektor in der Erfindung (4) der vorliegenden Patentanmeldung kann hergestellt werden, indem man in Abhängigkeit von der Art der Zelle, in die eingeführt werden soll (beispielsweise prokaryotische Zellen wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis; eukaryotische Zellen wie Hefen, Insektenzellen, Säugetierzellen oder Pflanzenzellen), einen geeigneten Expressionsvektor auswählt und darin die gentechnisch veränderte cDNA einer der Erfindungen (1) bis (3) einbaut. Wenn beispielsweise ein Mikroorganismus wie Escherichia coli verwendet wird, wird jede beliebige der gentechnisch veränderten cDNAs der oben genannten Erfindungen (1) bis (3) in die DNA-Klonierungsstelle eines Expressionsvektors eingebaut, der einen in einem Mikroorganismus funktionsfähigen Replikationsursprung, einen Promotor, eine Ribosomen-Bindungsstelle, einen Terminator etc. aufweist. Wenn eine eurkaryotische Zelle wie beispielsweise eine Säugetierzelle verwendet wird, kann ein rekombinanter Vektor gemäß der Erfindung (4) hergestellt werden unter Verwendung eines Expressionsvektors für eukaryotische Zellen, der einen Promotor, Spleißstellen, eine Poly(A)-Stelle, usw. aufweist.
Die Zelle der Erfindung (5) ist eine Zelle, in die der rekombinante Vektor gemäß der Erfindung (4) eingeführt ist und die das verbesserte Protein Bcl-x_L produziert. Es gibt keine Beschränkung für die zu verwendende Zellart. Der rekombinante Vektor gemäß Erfindung (4) kann in alle Zellen eingeführt werden, beispielsweise sind prokaryotische Zellen wie Escherichia coli oder Bacillus subtilis; eukaryotische Zellen wie Hefe, Insektenzellen, Säugetierzellen oder Pflanzenzellen umfasst. Die Einführung des rekombinanten Vektors in Zellen kann über ein bekanntes Verfahren erfolgen. Wenn beispielsweise der rekombinante Vektor in eine Säugetierzelle eingeführt wird, können Elektroporation, eine Kalziumphosphatmethode, eine Liposomenmethode, eine DEAE-Dextran-Methode und dergleichen verwendet werden.
Wie in den Daten der unten angegebenen Beispiele gezeigt ist, können unter den Zellen der Erfindung (5) insbesondere Säugetierzellen auch in einem serumfreien Medium vermehrt werden. Um eine kultivierte Zelle für einen bestimmten Zeitraum am Leben zu erhalten, ist es im Allgemeinen erforderlich, ein Wachstumsfaktoren enthaltendes Serum (z.B. fötales Rinderserum) dem Kulturmedium zuzugeben. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren kann die Apoptose der Zellen inhibieren, wodurch die Lebensdauer der Zellen verlängert wird. Wenn zelluläre Produkte wie beispielsweise physiologisch aktive Substanzen oder monoklonale Antikörper gewonnen und aus dem Kulturmedium, in dem Säugetierzellen kultiviert werden, aufgereinigt werden, ist es jedoch wünschenswert, dass das Kulturmedium keine Verunreinigungen wie Serum enthält. Der Grund dafür besteht darin, dass die Kosten ansteigen und Zusatzschritte für die Aufreinigung der Zielsubstanz erforderlich werden, und dass die Möglichkeit besteht, dass das Serum Risikofaktoren wie Viren enthält. Die Verwendung des serumfreien und proteinfreien Mediums, das kein Serum enthält, verringert jedoch in der Praxis den Grad des Zellwachstums und führt zu einer Zunahme toter Zellen, wenn serumfreie und proteinfreie Medien verwendet wurden. Zusätzlich besteht das Problem, dass eine solche gesteigerte Anzahl toter Zellen aufgrund des Ausströmens zellulären Inhalts aus den toten Zellen eine Verunreinigung des Kulturmediums mit den zellulären Inhalten verursachen könnte.
Andererseits gibt es ein alternatives Verfahren zur Vermehrung von Zellen ohne Verwendung irgendeines Wachstumsfaktors, bei dem die Zellen mit einem Proto-Onkogen transfiziert werden. Allerdings fand man heraus, dass bei diesem Verfahren die Apoptose durch die Expression mehrerer Proto-Onkogen-Produkte eher gesteigert wird.
Selbst bei Fehlen irgendeines Wachstumsfaktors, wie beispielsweise Serum, können die transfizierten Säugetierzellen gemäß der Erfindung (5) über einen langen Zeitraum ohne Apoptose als Begleiterscheinung kultiviert werden, da sie das verbesserte Protein Bcl-x_L exprimieren Aufgrund dieses ausgezeichneten Wachstumsvermögens ist es möglich, eine Zelllinie zu etablieren.
Das verbesserte Protein Bcl-x_L gemäß der Erfindung (6) wird von der gentechnisch veränderten cDNA gemäß der Erfindung (1) exprimiert. Das Protein ist dadurch gekennzeichnet, dass es in SEQ ID NO: 2 Aminosäuresubstitutionen von Tyr²² zu Phe, Gln²⁶ zu Asn und Arg¹⁶⁵ zu Lys aufweist. Bcl-xFNK hat die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3, welche alle der oben beschriebenen Aminosäuresubstitutionen aufweist.
Bei der Herstellung des verbesserten Proteins werden die Zellen gemäß der Erfindung (5) kultiviert, um Kulturmaterial zu erhalten, aus dem die verbesserten Proteine über kombinierte, bekannte Isolierungsverfahren isoliert und aufgereinigt werden können. Die bekannten Isolierungsverfahren umfassen beispielsweise Behandlung mit einem Denaturierungsmittel oder einem Oberflächenaktivator wie beispielsweise Harnstoff, Ultraschallbehandlung, Verdau mit einem Enzym, Aussalzen oder Ausfällen mit einem Lösungsmittel, Dialyse, Zentrifugation, Ultrafiltration, Gelfiltration, SDS-PAGE, isoelektrische Fokussierung, Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Affinitätschromatographie, Reversphasenchromatographie und dergleichen.
Die verbesserten Proteine können beispielsweise als aktive Bestandteile von Apoptoseinhibitoren oder deren Leitverbindungen verwendet werden. Darüber hinaus wird bevorzugt, ein Protein-Transduktions-Domäne-Peptid mit dem N-Terminus des verbesserten Proteins Bcl-x_L zu verbinden. Das verbesserte Protein Bcl-x_L mit dem Protein-Transduktions-Domäne-Peptid durchquert die Zellmembran und tritt in die Zelle ein, wo es vorübergehend die Funktion der Inhibierung der Apoptose und des Zelltods ausübt. Die verbesserten Proteine, welche die Fä higkeit zur Durchquerung von Zellmembranen erwerben, können somit beispielsweise für die folgenden Anwendungen verwendet werden.

(a) Die Erhaltung von Zellen, die für eine Implantation verwendet werden sollen, in einem normalen Zustand über einen langen Zeitraum.
(b) Die Erhaltung von Organen, die für Organtransplantationen verwendet werden sollen, in einem normalen Zustand über einen langen Zeitraum.
(c) Die Erhaltung von Organen, die einer Hämostase unterworfen werden, in einem stabilen Zustand während eines chirurgischen Eingriffs.
(d) Die Verwendung als Therapeutikum gegen Zelltod, der durch zerebrale Ischämie im Zusammenhang mit zerebraler Thrombose usw. verursacht wird.
(e) Die Verwendung als Therapeutikum gegen fulminante Hepatitis.
(f) Die Verwendung als Vorbeugungsmittel gegen Zelltod, der durch übermäßige Verabreichung von Steroidhormonen bedingt ist.
(g) Die Verwendung als Therapeutikum gegen Krankheiten im Zusammenhang mit Muskelatrophie (z.B. Muskeldystrophie, Myasthenie, Myopathie, usw.), die durch den Tod von Myocyten verursacht ist.
(h) Die Verwendung als Vorbeugungsmittel gegen durch Verletzung oder Verbrennung verursachten Tod von Hautepithelzellen.

Als Protein-Transduktions-Domäne-Peptid kann ein Oligopeptid mit der in SEQ ID NO: 12 oder SEQ ID NO: 13 gezeigten Aminosäuresequenz verwendet werden. Das Oligopeptid gemäß SEQ ID NO: 12 ist die PTD (Proteintransduktionsdomäne) von HIV-1 TAT. Das Oligopeptid gemäß SEQ ID NO: 13 ist die PTD eines Homeobox-Proteins, Antennapedia, von Drosophila.
Im Zusammenhang mit diesen Protein-Transduktions-Domäne-Peptiden sind beispielsweise die Aminosäuresequenz und cDNA-Sequenz von HIV-1 TAT bekannt (Science, 285: 1569–1572, 1999; GenBank Zugangs-Nr. U39362 M96155). Das DNA-Fragment, das für die Region kodiert (47. bis 57. Aminosäuresequenz von HIV TAT), welche der PTD entspricht, ist mit der gentechnisch veränderten cDNA der Erfindung (1) ligiert, woraus sich ein fusioniertes DNA-Fragment (die Erfindung (3)) ergibt, das dann in einer Wirtszelle wie beispielsweise Escherichia coli exprimiert werden kann, um das verbesserte Protein Bcl-x_L mit dem PTD-Peptid am N-Terminus herzustellen. Antennapedia-PTD ist ebenfalls bekannt (z.B. GenBank Zugangs-Nr. AE001573) und kann in ähnlicher Weise verwendet werden, um PTD-fusioniertes verbessertes Protein herzustellen. Das verbesserte Protein Bcl-x_L ist alternativ unter Verwendung eines bivalenten vernetzenden Mittels (z.B. EDC oder β-Alanin) an ein PTD-Peptid gebunden, um das mit einem Protein-Transduktions-Domäne-Peptid verbundene verbesserte Protein Bcl-x_L herzustellen.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele dienen der besonderen, detaillierteren Veranschaulichung der Erfindung, sollen aber nicht deren Umfang beschränken.
Beispiel 1
Herstellung genetisch veränderter cDNA
Zwei DNA-Fragmente (bcl-xR165K, bcl-xY22F/Q26N) wurden durch zweistufige PCR unter Verwendung des cDNA-Klons von Bcl-x_L der Ratte, pEF1-BGSbcl-x (J. Biol. Chem. 271: 13258–13265, 1996) als Template hergestellt. Diese DNA-Fragmente wurden schließlich in den bewussten Bereichen verknüpft, wodurch eine gentechnisch veränderte cDNA von bcl-xFNK hergestellt wurde, die 3 Aminosäuresubstitutionen enthielt (Tyr22Phe; Gln26Asn; Arg165Lys).
Um das die Substitution Arg165Lys enthaltende bcl-xR165K zu konstruieren, wurden zunächst zwei DNA-Fragmente (A und B) über PCT synthetisiert. Für das DNA-Fragment (A) wurde der in SEQ ID NO: 4 gezeigte Primer 1 als 5'-Ende-Primer und der in SEQ ID NO: 5 gezeigte Primer 2 als 3'-Ende-Primer verwendet. Der Primer 1 besteht aus der Nukleotidsequenz des Vektors und der Nukleotidsequenz stromaufwärts vom kodierenden Bereich der bcl-x-cDNA. Er enthält weiterhin die Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamH I. Der Primer 2 ist eine Antisense-Sequenz von bcl-x-cDNA, bei dem das Codon für Arg¹⁶⁵ durch ein Codon für Lys ersetzt ist.
Für das DNA-Fragment (B) wurde der in SEQ ID NO: 6 gezeigte Primer 3 als der 5'-Ende-Primer und der in SEQ ID NO: 7 gezeigte Primer 4 als der 3'-Ende-Primer verwendet. Der Primer 3 ist eine Sense-Sequenz der bcl-x-cDNA, bei der das Codon für Arg¹⁶⁵ durch ein Codon für Lys ersetzt ist, und die Nukleotidsequenz der 5'-Ende-Hälfte ist komplementär zu der 5'-Ende-Hälfte des Primers 2. Der Primer 4 ist eine Antisense-Sequenz der bcl-x-cDNA, welche den Aminosäureresten 178 bis 184 des kodierenden Bereichs entspricht. Er enthält weiterhin eine Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamH I. Die PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.

• Reaktionslösung (Volumen 100 μl): 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 0,2 mM jeweils dATP, dCTP, dTTP, dGTP,
• AmpliTagGOLD: 2,5U
• ein Primerpaar: eine Kombination aus Primer 1 und Primer 2, und eine Kombination aus Primer 3 und Primer 4 (jeder Primer: 1 μM)
• Template-DNA: 50 ng
• Reaktionsbedingung 1: 94°C/10 min; (94°C/30 sec; 53°C/30 sec; 72°C/1 min) × 15 Zyklen

Nach der Reaktion wurden die zwei amplifizierten DNA-Fragmente (A und B) über Polyacrylamidgelelektrophorese aufgereinigt. Dann wurden die DNA-Fragmente A und B (jeweils 6 ng) zu der oben beschriebenen PCR-Reaktionslösung (25 μl) gegeben, um die jeweiligen komplementären Stränge unter Verwendung von AmpliTagGOLD zu synthetisieren. Für die Synthese wurde die folgende Reaktionsbedingung 2 verwendet.

• Reaktionsbedingung 2: 94°C/10 min; (94°C/30 sec; 41°C bis 47°C/30 sec; 72°C/1 min) × 4 Zyklen.

Nach der Reaktion wurden eine die Primer 1, Primer 4 (Endkonzentration: jeweils 1 μM) enthaltende PCR-Reaktionslösung (75 μl) und AmpliTagGOLD (2,5U) zugegeben, und die PCR wurde gemäß der oben genannten Reaktionsbedingung 1 durchgeführt. Das 650-bp PCR-Produkt wurde über Polyacrylamidgelelektrophorese aufgereinigt und dann mit den Restriktionsenzym BamH I behandelt. Demgegenüber wurde pEF1-BOSbcl-x (das zwei BamH I-Schnittstellen aufweist) mit BamH I behandelt, wodurch zwei DNA-Fragmente (5650 bp und 650 bp) erhalten wurden. Das längere DNA-Fragment (5650 bp) wurde mit dem oben genannten PCR-Produkt in der richtigen Orientierung ligiert, wodurch der Klon pEF1-BOSbcl-xR165K erhalten wurde, der eine Aminosäuresubstitution Arg165Lys aufweist.
Für die Konstruktion von bcl-xY22F/Q26N wurde zunächst Gln²⁶ durch Asn und anschließend die Aminosäure Tyr²² durch Phe ersetzt. Die PCR wurde unter Verwendung von pEF1-BOSbcl-x (50 ng) als Template und eines Paares des oben genannten Primers 1 und von Primer 5 (SEQ ID NO: 8) durchgeführt. Eine weitere PCR wurde unter Verwendung von pEF1-BOSbcl-x (50 ng) als Template und eines Paares des oben angegebenen Primers 4 und von Primer 6 (SEQ ID NO: 9) durchgeführt. Die Bestandteile der Reaktionslösung (100 μl) waren die gleichen wie oben, und die Reaktionen wurden unter der oben beschriebenen Bedingung 1 durchgeführt. Primer 5 ist die Antisense-Sequenz der bcl-x-cDNA und enthält die Nukleotidsubstitutionen für die Umwandlung des Codons von Gln²⁶ in ein Codon für Asn. Primer 6 ist die Sense-Sequenz der bcl-x-cDNA und enthält die Nukleotidsubstitutionen für die Umwandlung des Codons von Gln²⁶ in ein Codon für Asn. Die Nukleotidsequenz der 5'-Ende-Hälfte von Primer 6 ist komplementär zu derjenigen der 5'-Ende-Hälfte von Primer 5. Zwei über PCR-amplifizierte PCR-Produkte wurden über Polyacrylamidgelelektrophorese aufgereinigt und zwei DNA-Fragmente (jeweils 6 ng) wurden gemischt, um den jeweiligen komplementären Strang unter Verwendung von AmpliTagGOLD zu synthetisieren. Die Synthesebedingung war dieselbe wie in der oben genannten Reaktionsbedingung 2. Nach der Reaktion wurden eine PCR-Reaktionslösung (75 μl), welche Primer 1, Primer 4 (Endkonzentration: jeweils 1 μM) enthielt, und AmpliTagGOLD (2,5U) zugegeben und die PCR gemäß der oben genannten Reaktionsbedingung 1 durchgeführt. Das PCR-Produkt mit 650 bp wurde über Polyacrylamidgelelektrophorese aufgereinigt und dann mit dem Restriktionsenzym BamH I behandelt. Demgegenüber wurde pEF1-BOSbcl-x mit BamH I behandelt, wodurch zwei DNA-Fragmente erhalten wurden (5650 bp und 650 bp). Das längere DNA-Fragmente (5650 bp) wurde mit dem oben genannten PCR-Produkt in einer richtigen Orientierung ligiert, wodurch der Klon pEF1-BOSbcl-xQ26N mit einer Aminosäuresubstitution Gln26Asn erhalten wurde.
Danach wurden zwei PCR-Reaktionen unter Verwendung von pEF1-BOSbcl-xQ26N als Template unabhängig voneinander durchgeführt. Eine PCR enthielt ein Paar des oben genannten Primers 1 und des Primers 7 (SEQ ID NO: 10), und eine weitere PCR enthielt ein Paar des oben genannten Primers 4 und des Primers 8 (SEQ ID NO: 11). Die Bestandteile der Reaktionslösung (100 μl) waren dieselben wie oben, und die Reaktionen wurden gemäß der oben beschriebenen Bedingung 1 durchgeführt. Primer 7 ist die Antisense-Sequenz der bcl-x-cDNA und enthält die Nukleotidsubstitution für die Umwandlung des Codons von Tyr²² in das für Phe kodierende Codon. Primer 8 ist die Sense-Sequenz der bcl-x-cDNA und enthält die Nukleotidsubstitution für die Umwandlung des Codons von Tyr²² in das für Phe kodierende Codon. Die Nukleotidsequenz der 5'-Ende-Hälfte von Primer 8 ist komplementär zu derjenigen der 5'-Ende-Hälfte von Primer 7. Die zwei über PCR amplifizierten PCR-Produkte wurden über Polyacrylamidgelelektrophorese aufgereinigt und die zwei DNA-Fragmente (jeweils 6 ng) wurden gemischt, um den jeweiligen komplementären Strang unter Verwendung von AmpliTagGOLD zu synthetisieren. Die Synthesebedingung war die gleiche wie in der oben genannten Reaktionsbedingung 2. Nach der Reaktion wurden mit einer PCR-Reaktionslösung (75 μl), die Primer 1, Primer 4 (Endkonzentration: jeweils 1 μM) enthielt, und AmpliTagGOLD (2,5U) eine PCR gemäß der oben genannten Reaktionsbedingung 1 durchgeführt. Das PCR-Produkt mit 650 bp wurde über Polyacrylamidgelelektrophorese aufgereinigt und danach mit dem Restriktionsenzym BamH I behandelt. Demgegenüber wurde pEF1-BOSbcl-x mit BamH I behandelt, wodurch zwei DNA-Fragmente (5650 bp und 650 bp) erhalten wurden. Das längere DNA-Fragment (5650 bp) wurde mit dem oben genannten PCR-Produkt in einer richtigen Orientierung ligiert, wodurch man den Klon pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N mit zwei Aminosäuresubstitutionen Tyr22Phe und Gln26Asn erhielt.
Schließlich wurden pEF1-BOSbcl-xR165K bzw. pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N mit Restriktionsenzymen geschnitten (Bgl II und Kpn I). Dann wurde das Bgl II/Kpn I-DNA-Fragment mit 1000 bp, das die Aminosäuresubstitutionen Tyr22Phe und Gln26Asn aufweist, die von pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N stammen, mit dem Bgl II/Kpn I-DNA-Fragment mit 5300 bp ligiert, das die von pEF1-BOSbcl-xR165K stammende Aminosäuresubstitution Arg165Lys aufweist, wodurch der für das verbesserte Protein Bcl-xFNK kodierende rekombinante Vektor pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N/R165K der gentechnisch veränderten cDNA erhalten wurde.
Beispiel 2
Herstellung transfizierter Zellen
Die prämyeloide Zelllinie FDC-P1 der Maus wurde in RPMI1640-Medium kultiviert, das fötales Rinderserum (10%) und das Cytokin IL-3 (der Überstand eines WEHI-Zellkultur- Mediums) enthielt. Die menschliche Leukämiezelllinie Jurkat wurde in RPMI1640-Medium kultiviert, das fötales Rinderserum (10%) enthielt. Die Zellen wurden in einem CO₂-Inkubator inkubiert (5% CO₂/95% Luft, 37°C).
In Beispiel 1 hergestellter rekombinanter Vektor pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N/R165K wurde in Escherichia coli DH5αMCR (GIBCO BRL) amplifiziert und unter Verwendung des Qiagen Plasmid midi-Kits (Qiagen) gewonnen. Der rekombinante Vektor wurde mit Scal (eine Schnittstelle) geschnitten und die erhaltene lineare DNA in 1 mM EDTA-Lösung gelöst.
Die Zellen (FDC-P1 oder Jurkat) wurden dreimal mit einer eiskalten K-PBS-Lösung (30,8 mM NaCl, 120,7 mM KCl, 8,1 mM Na₂HPO₄, 1,46 mM KH₂PO₄) gewaschen und in 5 mM MgCl₂ enthaltendem (Mg-K-PBS) K-PBS mit einer Zelldichte von 10⁷ Zellen/ml suspendiert. Die Zellsuspension (0,4 ml) wurde mit Mg-K-PBS-Lösung (0,4 ml) in einer eiskalten Küvette (Electroporation Cuvettes Plus, 4-mm-Spalt, BTX, A Division of Genetronics) vermischt. Dann wurden das linearisierte pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N/R165K (10 μg) und die linearisierte DNA pST-neoB (0,5 μg), die ein Resistenzgen gegen den Wirkstoff Geneticin enthält, zugegeben. Die Volumenänderung durch Zugabe der DNA wurde auf maximal 1% begrenzt. Nach zehnminütiger Inkubation auf Eis wurde zur Einführung des rekombinanten Vektors in die Zellen unter Verwendung des Gene Pulser eine Elektroporation durchgeführt (250 μF und 330 V, BioRad). Nach zehnminütiger Inkubation auf Eis wurden die Zellen vorsichtig in 39 ml frischem Kulturmedium in einer 100-mm-Schale suspendiert und in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Nach einem Tag wurden die Zellen aufgetrennt und in eine 96-Well-Platte gegeben. Zur Selektion der Geneticinresistenten Zellen wurden Geneticin (GIBCO BRL) in einer Konzentration von 200 μg/ml für FDC-P1-Zellen und 1 mg/ml für Jurkat gegeben.
Beispiel 3
Analyse des Expressionsgrades des verbesserten Bcl-xFNK
Der Expressionsgrad des verbesserten Proteins Bcl-xFNK in den in Beispiel 2 hergestellten transfizierten Zellen wurde durch Western Blots untersucht. Die Zellen wurden einmal mit PBS (pH 7,4; NaCl 137 nM, Na₂HPO₄ 8,1 nM, KCl 2,68 nM, KH₂PO₄ 1,47 nM) gewaschen. Nach Zugabe von 2% SDS-Lösung (Natriumdodecylsulfatlösung) wurden die Zellen durch Sonifizierung aufgebrochen, um alle Proteine zu solubilisieren. Die Proteine wurden quantitativ über den BCA-Proteinassay (PIERCE) analysiert, und 20 μg Protein wurden durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese fraktioniert (Laemli's System). Nach der Elektrophorese wurde das Protein auf eine PVDF-Membran geblottet (Amersham Pharmacia Biotec). Die Membran wurde in eine fötales Rinderserum (10%) enthaltende Blockierungslösung und dann in eine TBS-Lösung (Tris-HCl pH 7,4 20 nM, NaCl 136 nM, Tween 80 0,2%) gelegt, die den monoklonalen Antikörper 105-1 (0,5 μg/ml) enthielt, der mit dem C-Terminus von Bcl-x_L der Ratte reagiert. Nach einstündiger Inkubation bei 37°C wurde die Membran ausgiebig mit TBS ge waschen, dann in eine TBS-Lösung gelegt, die einen HRP-bindenden (Meerrettichperoxidasebindenden) oder AP-konjugierten (alkalische Phosphatase-konjugierten) sekundären Antikörper enthielt, und eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die an Bcl-x_L und Bcl-xFNK bindenden HRP-konjugierten sekundären Antikörper wurden unter Verwendung des RENAISSANCE Kits (NEN Life Science Product) auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht. Die an Bcl-x_L und Bcl-xFNK bindenden AP-konjugierten Antikörper wurden mit dem Fluoreszenzbild-Analysegerät FLA-2000 (Fuji Film) unter Verwendung des ATTOPHOS Kits (Boehringer) sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse sind in 2 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass mit dem rekombinanten Vektor pEF1-BOSbcl-xFNK transfizierte Zellen ein Protein exprimieren, welches das gleiche Molekulargewicht (etwa 30 kDa) aufweist wie das Protein, das in Zellen exprimiert wird, die mit dem Klon pEF1-BOSbcl-x des Wildtyp-Bcl-x_L transfiziert sind.
Beispiel 4
Bestätigung der Resistenz der Jurkatbcl-xFNK-Transfektante gegen Tod
Die in Beispiel 2 hergestellten transfizierten Jurkatbcl-x-FNK-Zellen wurden auf ihre Resistenz (Nicht-Sensitivität) gegenüber einer Reihe Apoptose induzierender Reize untersucht. Die Ergebnisse sind in 3 bis 13 gezeigt. In diesen Figuren steht der leere Kreis (O) für die das verbesserte Bcl-x-FNK exprimierende Transfektante Jurkatbcl-x-FNK. Der ausgefüllte Kreis (
) steht für die das Wildtyp-Bcl-xL mit gleichem Expressionsgrad exprimierende Transfektante Jurkatbcl-x. Das leere Quadrat (☐) steht für mit leerer Vektorplasmid-DNA transfizierte Jurkatvec-Zellen. Die leere Raute (♢) steht für die in den Transfektionsexperimenten verwendete Jurkat-Ausgangszelllinie.
(a) Resistenz gegen durch Serumentzug induzierte Apoptose
Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit einer Zelldichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml in serumfreiem RPMI1640-Medium suspendiert. Die Zellen wurden in einem CO₂-Inkubator inkubiert und die überlebenden Zellen durch Trypanblau-Ausschluss gezählt. Es wurde sorgfältig überwacht, dass die Anzahl der Zellen unter 5 × 10⁵ Zellen/ml blieb. Wenn zu erwarten war, dass die Zellanzahl den Grenzwert überschreiten würde, wurde das Kulturmedium zweifach verdünnt. Alle drei Tage wurde die Hälfte des serumfreien Mediums durch frisches Medium ersetzt.
Wie in 3 gezeigt, waren transfizierte Zellen, die Wildtyp-Bcl-x_L exprimierten, gegen den Serumentzug resistent und überlebten länger als die Kontrollausgangszellen und die vektortransfizierten Zellen. Die das verbesserte Bcl-xFNK exprimierenden transfizierten Zellen überlebten über einen längeren Zeitraum als die Wildtyp-Bcl-x_L exprimierenden Zellen, wodurch ein ausgezeichneter Apoptose inhibierender Effekt von Bcl-xFNK bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde bestätigt, dass die transfizierten Zellen in serumfreiem Medium kultiviert werden konnten.
(b) Resistenz gegenüber anti-Fas-Antikörper
Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml in RPMI1640-Medium suspendiert, dem anschließend anti-Fas-Antikörper (Klon CH-11; MBL) in einer Konzentration von 1, 10, 100 bzw. 1000 ng/ml zugegeben wurde. Nach eintägiger Inkubation wurden die überlebenden Zellen durch Trypanblau-Ausschluss gezählt.
Die Ergebnisse sind in 4 gezeigt, wobei die Anzahl der ohne den Antikörper inkubierten Zellen mit 100% gleichgesetzt wurde. Wie klar aus 4 hervorgeht, wiesen die das verbesserte Bcl-xFNK exprimierenden Transfektanten eine hohe Resistenz gegenüber dem hochkonzentrierten anti-Fas-Antikörper auf.
(c) Resistenz gegenüber einer Reihe cytotoxischer Wirkstoffe einschließlich Antikrebsmittel
Zellen wurden mit einer Zelldichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml in RPMI1640-Medium suspendiert, dem anschließend Staurosporin (20 nM), TN-16 (10 μM), Camptothecin (10 μM), Hydroxyharnstoff (1 nM), Trichostatin A (0,25 μg/ml), Wasserstoffperoxid (0,05 nM) oder Paraquat (1 mM) zugegeben wurde. Die Zellen wurden inkubiert. Die überlebenden Zellen wurden täglich durch Trypanblau-Ausschluss gezählt.
Wie aus den in 5 bis 11 gezeigten Ergebnissen hervorgeht, zeigte die das verbesserte Bcl-xFNK exprimierende Transfektante eine hohe Resistenz gegenüber allen getesteten cytotoxischen Wirkstoffen.
(d) Resistenz gegen Hitzebehandlung
Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 1 × 10⁵/ml in RPMI1640-Medium suspendiert und 10 Minuten bei 45°C inkubiert. Die Zellen wurden über Zentrifugation geerntet, dann in einer gleichen Menge frischen Kulturmediums suspendiert und bei 37°C inkubiert. Die überlebenden Zellen, deren Ergebnisse in 12 gezeigt sind, wurden täglich über Trypanblau-Ausschluss gezählt. Zusätzlich wurden am ersten Tag die Dehydrogenase-Aktivitäten der Zellen (100 μl des Kulturmediums) unter Verwendung des Cell Counting Kit (Dojin Chemical) und von WST-1 als Substrat (WST-1-Assay) bestimmt. Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt, wobei die Enzymaktivität der Zellen ohne Hitzebehandlung als 100% angenommen wurde.
Wie aus den oben genannten Ergebnissen hervorgeht, wurde bestätigt, dass die das verbesserte Bcl-xFNK exprimierende Transfektante eine hohe Resistenz gegenüber Hitzebehandlung aufwies und die Dehydrogenase-Aktivität selbst nach Hitzebehandlung auf einem hohen Niveau aufrecht erhalten wurde.
Beispiel 5
Bestätigung der Resistenz der FDC-P1bcl-xFNK-Transfektanten gegen Zelltod
Die Resistenz der in Beispiel 2 hergestellten FDC-P1bcl-xFNK-Transfektantenzellen gegenüber einer Reihe von Apoptose induzierenden Reizen wurde untersucht. Die Ergebnisse sind in 14 bis 16 gezeigt. In diesen Figuren stehen die leeren Symbole ♢, ☐, Δ, ∇ and O für 5 unabhängige Transfektanten, FDC-P1bcl-xFNK -1, -2, -3, -4 bzw. -5. Das Symbol
steht für die das Wildtyp-Bcl-x_L auf gleichem Expressionsniveau exprimierende Transfektante FDC-P1bcl-x. Das Symbol
steht für FDC-P1vec, in welche die leere Vektorplasmid-DNA eingeführt worden war.
(a) Resistenz gegenüber TN-16 und Staurosporin
Die Zellen wurden mit einer Zelldichte von 2 × 10⁵ Zellen/ml in Kulturmedium suspendiert, dem anschließend TN-16 (50 μM) und Staurosporin (10 nM) zugegeben wurde. Die Dehydrogenase-Aktivität der Zellen (100 μl des Kulturmediums) wurde täglich unter Verwendung des Cell Counting Kit (Dojin Chemical) und von WST-1 als Substrat (WST-1-Assay) bestimmt. Unmittelbar vor Zugabe der Wirkstoffe wurde die Enzymaktivität als 100% angenommen.
Die Ergebnisse sind in 14 und 15 gezeigt. Es wurde bestätigt, dass alle das verbesserte Bcl-xFNK exprimierenden unabhängigen Transfektanten eine hohe Resistenz gegen Behandlung mit TN-16 und Staurosporin aufwiesen, und dass die Dehydrogenase-Aktivität auf einem hohen Niveau blieb.
(b) Resistenz gegenüber durch Entzug des Cytokins IL-3 induzierter Apoptose
Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit einer Zelldichte von etwa 5 × 10⁴ Zellen/ml in Kulturmedium suspendiert, das kein IL-3 enthielt (aber Serum enthielt), und die überlebenden Zellen wurden täglich durch Trypanblau-Ausschluss gezählt. Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt, wobei die Zahl der überlebenden Zellen unmittelbar nach Entzug von IL-3 mit 100% gleichgesetzt wurde. Bei diesem Experiment wurden Zellen mit Ausnahme von FDC-P1vec jeden dritten Tag fünffach mit IL-3-freiem frischem Medium verdünnt.
Wie klar aus 16 hervorgeht, wurde bestätigt, dass die das verbesserte Bcl-xFNK exprimierenden Transfektanten gegen durch Entzug von IL-3 induzierte Apoptose eine höhere Resistenz aufwiesen als Wildtyp-Bcl-x_L exprimierende Transfektanten, und dass sie sogar bei Fehlen von IL-3 wachsen konnten.
Beispiel 6
Herstellung von CHO-Transfektanten
Ovarzellen des chinesischen Hamsters, CHO, wurden mit dem in Beispiel 1 hergestellten rekombinanten Vektor pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N/R165K transfiziert.
Die CHO-Zellen (1 × 10⁵ Zellen) wurden in 10% fötales Rinderserum enthaltendem Kulturmedium DMEM/F-12 (GIBCO BRL) suspendiert und über Nacht in einer 60-mm-Schale inkubiert. Unter Verwendung von des SuperFect Transfection Reagent Kit (Qiagen) wurden linearisiertes pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N/R165K (10 μg) und linearisiertes pST-neoB (0,5 μg), das ein Resistenzgen gegen den Wirkstoff Geniticin trägt, in die CHO-Zellen eingeführt. Als Kontrolle wurden der linearisierte, leere Vektor pEF1-BOS oder das linearisierte pEF1-BOSbcl-x zusammen mit dem linearisierten pST-neoB in die CHO-Zellen eingeführt. Nach der Transfektion wur den die Zellen über Nacht in 10% fötales Rinderserum enthaltendem Kulturmedium DMEM/F-12 inkubiert. Geneticin (700 μg/ml) wurde zugegeben und die Inkubation wurde fortgesetzt, wodurch die transfizierten Zellen erhalten wurden. Transfektanten, die das verbesserte Protein Bcl-xFNK oder Wildtyp-Bcl-x_L stark und auf gleichem Niveau exprimierten, wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 3 selektiert. Auf diese Weise wurden CHObcl-x, CHObcl-xFNK und CHOvec (mit dem leeren Vektor transfiziert) erhalten.
Beispiel 7
Inkubation der CHO-Transfektanten in serumfreiem Medium
Die drei in Beispiel 6 hergestellten Transfektanten CHObcl-x, CHObcl-xFNK und CHOvec wurden in Kulturmedium DMEM/F-12 inkubiert, das 10% fötales Rinderserum enthielt. Die Zellen (1 × 10³-Zellen) wurden in einer 100-mm-Schale ausplattiert, die das 3% fötales Rinderserum enthaltende Medium DMEM/F-12 enthielt. Über 5 aufeinanderfolgende Tage wurden zwei Drittel des Kulturmediums mit DMEM/F-12 ohne fötales Rinderserum ersetzt. Ab dem Tag 6 wurden die Zellen in serumfreiem Medium inkubiert. Die Inkubation wurde weitere 6 Tage fortgesetzt.
Die Ergebnisse sind auf dem Foto der 17 gezeigt. CHObcl-xFNK, die das verbesserte Bcl-xFNK exprimierten (17C), wuchsen deutlich besser als CHOvec (17B), in die der leere Vektor eingeführt worden war. Zusätzlich waren im Vergleich mit Kolonien von CHObcl-x, die Bcl-x_L exprimierten (17A), bei Kolonien von CHObcl-xFNK weniger Zellen sterbend oder tot, und die Zellen lagen ohne Zwischenräume in festerem Zellkontakt miteinander vor.
Durch die oben genannten Ergebnisse wurde bestätigt, dass die erfindungsgemäßen transfizierten Zellen selbst in serumfreiem Medium normal wachsen konnten.
Beispiel 8
Konstruktion eines rekombinanten Vektors, der das TAT-Bcl-xFNK-Protein exprimiert
Die in Beispiel 1 hergestellte gentechnisch veränderte cDNA, die für Bcl-xFNK kodiert, wurde mit der für die Proteintransduktionsdomäne des Proteins TAT des HIV-Virus kodierenden cDNA über zweistufige PCR fusioniert. Die PCR wurde unter Verwendung des Primers 9 (SEQ ID NO: 14) als Primer für das 5'-Ende, des Primers 10 (SEQ ID NO: 15) als Primer für das 3'-Ende und des die cDNA von Bcl-xFNK tragenden rekombinanten Vektors pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N/R165K als Template durchgeführt. Primer 9 ist die Sense-Sequenz, die aus dem 3'-Ende der cDNA von TAT-PTD und dem (das Initiations-Codon enthaltenden) 5'-Ende der Bcl-xFNK-cDNA besteht. Primer 10 ist die Antisense-Sequenz, die aus dem (ein Terminations-Codon enthaltenden) 3'-Ende der BCL-xFNK-cDNA und der Schnittstelle für das Restriktionsenzym Hind III besteht. Die genauen Angaben für die PCR-Reaktion sind wie folgt:

• Reaktionslösung (Volumen 100 μl): 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 nM MgCl₂, 0,001% Gelatine, 0,2 mM jeweils dATP, dCTP, dTTP, dGTP, AmpliTagGOLD: 2,5U
• Primer: eine Kombination aus Primer 9 und Primer 10 (jeder Primer: 1 μM)
• Template-DNA: 50 ng
• Reaktionsbedingung 3: 94°C/10 min, (94°C/30 sec; 49°C/30 sec; 72°C/1 min) × 15 Zyklen

Nach der Reaktion wurde das amplifizierte DNA-Fragment über Polyacrylamidgelelektrophorese aufgereinigt. Der oben beschriebenen PCR-Reaktionslösung (25 μl) wurden das aufgereinigte DNA-Fragment (25 ng) und Primer 11 (SEQ ID NO: 16) zugegeben, um unter Verwendung von AmpliTagGOLD den komplementären Strang zu synthetisieren. Primer 16 ist die für das 5'-Ende kodierende Sense-Sequenz für die Aminosäuresequenz von TAT-PTD, flankiert von Met(Initiationscodon)-Gly am 5'-Ende und Gly, dem Initiationscodon der Bcl-xFNK-cDNA am 3'-Ende, wie in SEQ ID NO: 12 gezeigt ist. Die Bedingungen für die Synthese sind wie folgt.

• Reaktionsbedingung 4: 94°C/10 min, (94°C/30 sec; 53°C bis 59°C/30 sec; 72°C/1 min) × 5 Zyklen

Nach der Reaktion wurden die Primer 12 (SEQ ID NO: 17), Primer 10 (Endkonzentration: jeweils 1 μM) enthaltende PCR-Lösung (75 μl) und AmpliTagGOLD (2,5U) zugegeben und die Reaktion gemäß der oben angegebenen Reaktionsbedingung 3 durchgeführt. Primer 12 ist eine Sense-Sequenz, die für Met-Gly und die nachfolgenden N-terminalen drei Aminosäurereste von TAT-PTD kodiert und eine Schnittstelle des Restriktionsenzyms Nde I am 5'-Ende aufweist. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde über Polyacrylamidgelelektrophorese aufgereinigt. Nach Spaltung mit Nde I wurde das gespaltene Ende mit T4DNA-Polymerase stumpf gemacht und anschließend mit Hind III verdaut. Der Escherichia coli-Expressionsvektor pROEX1 (Life Technologies) wurde mit Nco I gespalten, dann mit Nuklease S1 stumpf gemacht und anschließend mit Hind III verdaut. Die zwei DNAs wurden miteinander ligiert, wodurch der rekombinante Vektor pROEX1- -bc/-xY22F/Q26N/R165K erhalten wurde, der für TAT-Bcl-xFNK kodiert, in dem ein Protein-Transduktions-Domäne-Peptid des Proteins TAT am N-Terminus fusioniert ist.
Beispiel 9
Herstellung des Proteins TAT-BCl-xFNK
Das Protein TAT-Bcl-xFNK wurde in Escherichia coli exprimiert und wie unten beschrieben teilweise aufgereinigt. pROEX1-bcl-xY22F/Q26N/R165K tragende Escherichia coli DH5αMCR wurden in 1000 ml flüssigem LB-Medium (5 g Hefeextrakt, 10 g Bactotrypton und 5 g NaCl), das Ampicillin enthielt (50 μg/mg), unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Als die Zellen die logarithmische Wachstumsphase erreichten (O.D.600 = 0,5), wurde IPTG (Isopropyl-1-thio-β-galactosid; Endkonzentration 1 nM) zugegeben und die Inkubation 2 Stunden fortge setzt. Das Protein TAT-Bcl-xFNK wurde nach Aufbrechen der Zellen aus einer löslichen Fraktion und einer unlöslichen Fraktion (Einschlusskörper) gewonnen. Das Protein wurde aus der löslichen Fraktion folgendermaßen gewonnen: Die geernteten Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, dann in 40 ml Puffer A (50 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 nM PMSF) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Nach Zentrifugation wurde TAT-Bcl-xFNK aus dem Überstand durch Antikörper-Affinitätschromatoraphie aufgereinigt, wobei eine Säule verwendet wurde, die mit Trägern gefüllt war, an die der monoklonale Antikörper 35–32 gebunden war, der aus der Maus stammt und den N-terminalen Bereich von Bcl-x_L der Ratte erkennt. TAT-Bcl-xFNK band an den Antikörper, wurde gewaschen und dann in einem Eluat (50 mM Glycin-HCl pH 2,7, 50 mM NaCl) eluiert. Das Eluat wurde mit 2 M Tris-HCl (pH 9,0) neutralisiert und über Centricon (Amicon) konzentriert. Eine TAT-Bcl-xFNK-Präparation zur Verwendung in dem nachfolgenden Experiment wurde durch Dialyse gegen PBS erhalten. TAT-Bcl-xFNK wurde aus der unlöslichen Fraktion (Einschlusskörper) folgendermaßen gewonnen. Die geernteten Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen, dann in 36 ml Puffer A (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) gewaschen, der DTT an Stelle von PMSF enthielt, und über Ultraschallbehandlung aufgebrochen. Triton X-100 (Endkonzentration 1%) wurde zugegeben und die Mischung 10 Minuten auf Eis gestellt. Die TAT-Bcl-xFNK enthaltenden Einschlusskörper wurden durch Zentrifugation gefällt und zweimal mit Triton X-100 enthaltendem Puffer A gewaschen. Schließlich wurden die Einschlusskörper in 7 M Harnstoff und 1 mM DTT enthaltendem PBS solubilisiert. Durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese wurde bestätigt, dass diese Präparation das Protein TAT-Bcl-xFNK in einer Reinheit von 70% enthielt, und die Präparation wurde in dem nachfolgenden Experiment verwendet.
Beispiel 10
Einbau des Proteins TAT-Bcl-xFNK in Zellen
Das Protein TAT-Bcl-xFNK (1 μM) wurde zu 10% FBS (fötales Rinderserum) enthaltendem DMEM/F12 (Life Technologies) gegeben, einem Medium für in einer Slide Chamber (LabTek) kultivierte HeLa-Zellen, und die Zellen wurden 24 Stunden in einem CO₂-Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden anschließend zweimal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit in PBS gelöstem Paraformaldehyd (4%) 45 min bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen (5 Minuten/Runde) und 20 min in 10% FBS enthaltendem PBS inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen (5 Minuten/Runde) und 30 min mit 1,5% FBS-PBS-Lösung behandelt, die den anti-Ratte Bcl-x_L-monoklonalen Antikörper 35–32 (der Maus) enthielt. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen (5 Minuten/Runde) und 30 min mit einer 1,5% FBS-PBS-Lösung behandelt, die einen anti-Maus-IgG-Antikörper enthielt, der mit FITC konjugiert war. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen (5 Minuten/Runde), in PBS eingedeckelt und für die Beobachtung unter einem Fluoreszenz-Mikroskop versiegelt.
Die Ergebnisse sind in 18 gezeigt. Bei den Zellen wurde die für FITC charakteristische punktförmige Fluoreszenz beobachtet. Dieses Fluoreszenzsignal konnte nicht bei Zellen beobachtet werden, die ohne das Protein TAT-Bcl-xFNK inkubiert worden waren. Darüber hinaus wurde kein Signal beobachtet, wenn die Zellen nicht mit dem primären Antikörper (35–32) behandelt worden waren, selbst wenn das Protein TAT-Bcl-xFNK zugegeben worden war. Diese Ergebnisse zeigen, dass das dem Kulturmedium zugegebene Protein TAT-Bcl-xFNK durch die Zellmembran hindurchtrat und in die Zellen eingebaut wurde.
Beispiel 11
Einführung von TAT-Bcl-xFNK in Chondrozyten einer Knorpelschnittkultur und Bestätigung der Zelltod-inhibierenden Aktivität
Knorpel wurde aus den Köpfen von Oberschenkelknochen von Osteoarthritis-Patienten gewonnen, bei denen eine totale Hüftarthroplastik durchgeführt wurde. Das Knorpelgewebe über dem subchondralen Knochen (10 × 10 mm; 1,2 mm dick) wurde unter Verwendung eines Rasiermessers mit einer einzigen Schnittkante aseptisch geschnitten. Der Knorpelschnitt wurde in eine 24-Well-Platte gelegt und bei 37°C in einem CO₂-Inkubator mit einem Mischmedium aus DMEM-Ham F-12 (Life Technologies) inkubiert, das 20% FBS (fötales Rinderserum) enthielt. Für ein Vergleichsexperiment wurde der Expressionsvektor von TAT-Bcl-x_L auf die gleiche Weise wie TAT-Bcl-xFNK konstruiert und das Protein TAT-Bcl-x_L wurde aus Escherichia coli teilweise aufgereinigt (die Präparation von TAT-Bcl-x_L hatte den gleichen Reinheitsgrad). TAT-Bcl-xFNK (aufgereinigt aus Einschlusskörpern) oder TAT-Bcl-x_L (aufgereinigt aus Einschlusskörpern) wurden dem Kulturmedium in einer Konzentration von 0,2 μM zugegeben. Als Kontrolle wurde eine gleiche Menge PBS (ein Lösungsmittel, das zur Solubilisierung der Proteine verwendet wurde) zugegeben, das 7 M Harnstoff und 1 mM DTT enthielt. Das Kulturmedium, welches das Protein enthielt, wurde am Tag 4 und Tag 7 gewechselt. Nach viertägiger und neuntägiger Inkubation wurde der Knorpelschnitt eingefroren, um unter Verwendung eines Cryostats Gefrierschnitte herzustellen. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um den Tod der Chrondrozyten zu beurteilen. Wie in 19 bis 24 dargestellt, zeigen die Ergebnisse, dass TAT-Bcl-xFNK den Tod von Chondrozyten stärker als TAT-Bcl-x_L inhibiert und dass der bestehende Unterschied am Tag 9 ausgeprägter ist. Es wurde gezeigt, dass das in dem Kulturmedium enthaltene Protein TAT-Bcl-xFNK in die Chondrozyten eingebaut wurde, die im Knorpelgewebe eingebettet waren, wobei dessen starke Zelltod-inhibierende Aktivität entfaltet wurde.
Beispiel 12
Verabreichung von TAT-Bcl-xFNK an Mäuse und Bestätigung der Inhibierung des durch Steroidhormon verursachten Tods von Hepatozyten
Drei 8 Wochen alte Mäuse (C56BL, 20 g Körpergewicht, weiblich) wurden in drei Gruppen (A, B und C) aufgeteilt. Der Maus der Gruppe A wurde intraperitoneal PBS-Lösung (0,8 ml) verabreicht, die 100 μg des (aus der löslichen Fraktion gewonnenen) Proteins TAT-Bcl-xFNK enthielt. Den Mäusen der Gruppe B und der Gruppe C (Kontrolle) wurde intraperitoneal PBS (0,8 ml) auf die gleiche Weise verabreicht. Die Mäuse wurden in ihre Käfige zurückgesetzt und nach 3 Stunden wurden 0,5 ml einer 0,5 mg eines Steroidhormons (Dexamethason) enthaltenden 25% Ethanol/PBS-Lösung den Mäusen der Gruppe A und der Gruppe B intraperitoneal verabreicht. Der Maus der Gruppe C wurden intraperitoneal 0,5 ml einer 25% Ethanol/PBS-Lösung verabreicht. Die Mäuse wurden in ihre Käfige zurückgesetzt und nach 3 Stunden getötet. Die Leber der Mäuse wurde entnommen und zur Herstellung von Gefrierschnitten mit einem Cryostat eingefroren. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um den Tod von Hepatozyten zu bestimmen. Die in 26 gezeigte, durch Dexamethason verursachte Degeneration des Lebergewebes und der durch Dexamethason verursachte Zelltod in Gruppe B wurde durch Vorverabreichung von TAT-Bcl-xFNK (Gruppe A; 25) deutlich inhibiert. Es konnte gezeigt werden, dass der Inhibierungsgrad besser war als derjenige der Kontrolle (Gruppe C; 27).
Die oben angegebenen Ergebnisse zeigen, dass intraperitoneal verabreichtes Protein TAT-Bcl-xFNK in die Leberzellen transportiert wird, wo es durch Dexamethason verursachten Zelltod stark inhibiert.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben detailliert beschrieben, stellt die der vorliegenden Patentanmeldung zugrunde liegende Erfindung eine gentechnisch veränderte cDNA bereit, welche ein verbessertes Protein Bcl-x_L der Ratte herstellt, welches eine verstärkte Zelltod-inhibierende Aktivität zeigt, einen rekombinanten Vektor, der die gentechnisch veränderte cDNA trägt, und Zellen, die mit den rekombinanten Vektoren transfiziert sind. Die transfizierten Zellen können in einem serumfreien Medium vermehrt werden und sind beispielsweise brauchbar für Zellkultursysteme zur effizienten Herstellung nützlicher Substanzen, beispielsweise physiologisch aktiver Substanzen, monoklonaler Antikörper und dergleichen. Darüber hinaus stellt die der vorliegenden Patentanmeldung zugrunde liegende Erfindung ein verbessertes Protein Bcl-x_L der Ratte bereit, das eine weiter verstärkte Zelltod-inhibierende Aktivität aufweist. Wenn das verbesserte Protein ein Protein-Transduktions-Domäne-Peptid aufweist, wird es in Zellen eingebaut und liegt vorübergehend in den Zellen vor, wobei es Apoptose/Zelltod inhibiert. Dementsprechend ist das Protein beispielsweise brauchbar als Bestandteil von Heilmitteln gegen verschiedene, mit Zelltod einhergehende Krankheiten, oder für Zusatzstoffe für den stabilen Erhalt transplantierter Zellen oder Organe.

Claims

Gentechnisch veränderte cDNA des bcl-x-Gens der Ratte mit Substitutionen, die im kodierenden Bereich der bcl-x-cDNA der Ratte gemäß SEQ ID NO: 1 den Rest 22 Tyr in Phe, den Rest 26 Gln in Asn und den Rest 165 Arg in Lys überführen.
Gentechnisch veränderte cDNA nach Anspruch 1, an deren 5'-Ende ein Oligonukleotid gebunden ist, das für ein Protein-Transduktions-Domäne-Peptid kodiert.
Gentechnisch veränderte cDNA nach Anspruch 2, wobei das Oligonukleotid für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder 13 kodiert.
Rekombinanter Vektor, der die gentechnisch veränderte cDNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3 trägt.
Zelle, in welche der rekombinante Vektor nach Anspruch 4 eingeführt ist.
Verbessertes Protein, hergestellt mit Hilfe der gentechnisch veränderten cDNA nach Anspruch 1, welches in SEQ ID NO: 2 die folgenden Aminosäuresubstitutionen aufweist: Rest 22 Tyr zu Phe, Rest 26 Gln zu Asn und Rest 165 Arg zu Lys.
Verbessertes Protein nach Anspruch 6, an dessen N-terminalem Ende ein Protein-Transduktions-Domäne-Peptid gebunden ist.
Verbessertes Protein nach Anspruch 7, wobei das Protein-Transduktions-Domäne-Peptid ein Oligopeptid mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder 13 ist.