DE69115270T2

DE69115270T2 - Protein mit fibroblasten-wachstumsfaktor-rezeptoraktivität.

Info

Publication number: DE69115270T2
Application number: DE69115270T
Authority: DE
Inventors: Koichi 66-3 Shimogamo-Miyazaki-Ch Kyoto 606 Igarashi; Masaharu B-212 744-1 Okayama-Shi Okayama 703 Senoo; Tatsuya 50-1 Osaka 565 Watanabe
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-04-27
Filing date: 1991-04-25
Publication date: 1996-06-13
Anticipated expiration: 2011-04-26
Also published as: CA2080008C; EP0529076B1; ATE131175T1; DE69115270D1; CA2080008A1; EP0529076A1; WO1991017183A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein wasserlösliches Mutein eines tierischen Proteins, das als Rezeptor für ein Fibroblastenwachstumsfaktor (im folgenden auch als FGF bezeichnet)-Protein wirkt, eine rekombinante DNA, die für das Mutein codiert, und eine Technik zur Herstellung des Muteins.

Hintergrund der Erfindung

FGFs umfassen saure Fibroblastenwachstumsfaktoren (im folgenden auch als AFGFs bezeichnet) mit einem Molekulargewicht von etwa 16 000 und einem isoelektrischen Punkt von 5 bis 7, die im Hypothalamus, im Gehirn und in der Retina lokalisiert sind, und basische Fibroblastenwachstumsfaktoren (im folgenden auch als bFGFs bezeichnet) mit einem Molekulargewicht von etwa 17 000 und einem isoelektrischen Punkt von 8 bis 10, die verbreitet in verschiedenen Geweben und Organen vorkommen. Sie sind beide durch eine starke Heparinbindungsfähigkeit gekennzeichnet und wurden zuerst als Faktoren isoliert, die eine starke wachstumsfördernde Wirkung auf Fibroblasten ausüben. Danach ist klar geworden, daß sie eine wachstumsfördernde Wirkung auffast alle vom Mesoderm abgeleiteten Zellen ausüben. Insbesondere sind sie allgemeine als wachstumsfördernde Faktoren oder angiogene Faktoren für Endothelzellen bekannt. Angeblich erzeugen die meisten Krebszellen bFGFs, die das Wachstum der Krebszellen selbst fördern.
Man geht davon aus, daß die Wechselwirkung zwischen FGFs und FGF-Rezeptoren, die auf der Oberfläche von Zellen vorkommen, für die Wirkung von FGFs auf verschiedene Zellen wesentlich ist. Weiterhin wird vorgeschlagen, daß das AFGF und das bFGF möglicherweise an einen gemeinsamen Rezeptor binden. Dies ist jedoch nicht in allen Fällen klar.
Wie oben beschrieben, spielen FGF-Rezeptoren zwar bei verschiedenen Zellen eine wichtige Rolle, die Tatsachen hinsichtlich der Eigenschaften von FGF-Rezeptoren als Proteine und ihren Genen sind jedoch unklar. Es gibt keinen bekannten Bericht über die Herstellung eines FGF-Rezeptors durch DNA-Rekombinationstechnik. Wenn die FGF-Rezeptoren mit Hilfe von DNA-Rekombinationstechnik in großen Mengen hergestellt werden können, können sie als Pharmaka, wie Antitumormittel, verwendet werden. Insbesondere ist es ein Ziel, ein Massenherstellungsverfahren für die Proteine zu entwickeln, die als Rezeptoren für Human-FGF wirken.
Im allgemeinen zeigen Proteine nahe verwandter Tiere eine hohe Homologie in ihren Aminosäuresequenzen, und die meisten der unterschiedlichen Aminosäureteile sind durch eine einzige Punktmutation in den Codons ihrer Gene voneinander abgeleitet. Die Erfinder zogen den Schluß, daß ein Teil der DNA-Sequenz eines Hühner-FGF-Rezeptor-Gens der DNA-Sequenz eines Gens, das für ein Protein codiert, das als Rezeptor für Human-FGF wirkt, sehr ähnlich sein würde. Auf der Grundlage dieser Vorstellung synthetisierten die Erfinder eine DNA mit derselben Nucleotidsequenz wie ein Teil des Hühner-FGF-Rezeptor-Gens als Sonde und klonierten mit Hilfe dieser DNA ein Gen, das für ein Protein codiert, das als Rezeptor für Human-FGF wirkt, aus einer menschlichen Zelle. Dann konstruierten die Erfinder eine rekombinante DNA, die das obige Gen enthält, und kultivierten eine Transformante, die mit der obigen rekombinanten DNA transformiert ist. Als Ergebnis entdeckten die Erfinder, daß ein Protein erzeugt wurde, das als Rezeptor für Human-FGF wirkt.
Weiterhin entdeckten die Erfinder, daß ein wasserlösliches Mutein des Tierproteins mit dieser Wirkung für das FGF-Protein das FGF-Protein mit Vorteil aufnahm.
Auf der Grundlage dieser Information stellten die Erfinder weitere Untersuchungen an und stellten in der Folge die vorliegende Erfindung fertig.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt bereit:
(1) ein wasserlösliches Mutein eines Tierproteins, das als Rezeptor für ein Fibroblasten-Wachstumsfaktor- (FGF) -Protein wirkt,
(2) eine rekombinante DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die für das wasserlösliche Mutein des obigen Punkts (1) codiert,
(3) einen Vektor, der die rekombinante DNA des obigen Punkts (2) enthält,
(4) eine Transformante, die mit dem Vektor des obigen Punkts (3) transformiert ist, und
(5) ein Verfahren zur Herstellung des wasserlöslichen Muteins des obigen Punkts (1), das das Kultivieren der Transformante des obigen Punkts (4) in einem Kulturmedium umfaßt.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt einen Teil einer Nucleotidsequenz einer cDNA, die für ein Protein cosiert, das als Rezeptor für Human-FGF wirkt, wobei das Protein in Beispiel 1 hergestellt wird, und eine davon abgeleitete Aminosäuresequenz;
Fig. 2 zeigt Restriktionsenzymkarten der cDNA eines FGF-Rezeptors, der in Beispiel 2 erhalten wird;
Fig. 3 zeigt eine Nucleotidsequenz der cDNA des in Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pTB1228 und eine zu codierende Aminosäuresequenz in der unteren Reihe;
Fig. 4 zeigt die Nucleotidsequenz der cDNA des in Beispiel 2 erhaltenen Plasmids pTB1229 und die zu codierende Aminosäuresequenz in der unteren Reihe;
Fig. 5 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pTB1283 zeigt;
Fig. 6 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pTB1284 zeigt;
Fig. 7 zeigt eine Nucleotidsequenz der cDNA des in Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pTB1284 und die zu codierende Aminosäuresequenz in der unteren Reihe;
Fig. 8 zeigt eine Nucleotidsequenz der cDNA des in Beispiel 3 erhaltenen Plasmids pTB1283 und die zu codierende Aminosäuresequenz in der unteren Reihe;
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pTB1289 zeigt;
Fig. 10 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pTB1290 zeigt;
Fig. 11 zeigt eine Nucleotidsequenz der cDNA des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pTB1289 und eine dadurch erzeugte Aminosäuresequenz einer extrazellulären Domäne eines FGF-Rezeptors;
Fig. 12 zeigt eine Nucleotidsequenz der cDNA des in Beispiel 4 erhaltenen Plasmids pTB1290 und eine dadurch erzeugte Aminosäuresequenz einer extrazellulären Domäne eines FGF-Rezeptors;
Fig. 13 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 3 (2) erhaltenen Plasmids pTB1313 zeigt;
Fig. 14 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des in Beispiel 4 (2) erhaltenen Plasmids pTB1315 zeigt; und
Fig. 15 ist eine Kurve, die die Reinigung einer in E. coli erzeugten extrazellulären Domäne eines FGF-Rezeptors durch eine Q-Sepharose-Säule zeigt.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

In der vorliegenden Erfindung umfassen die FGF-Proteine saure FGFs, basische FGFs und Muteine davon. Insbesondere werden vorzugsweise die basischen FGFs und die Muteine davon verwendet.
Als FGFs werden vorzugsweise von Säugern abgeleitete FGFs verwendet. Beispiele für die Säuger sind Menschen, Affen, Schweine, Rinder, Schafe und Pferde.
Die Muteine der FGFs umfassen ein Mutein, bei dem wenigstens eine den FGF aufbauende Aminosäure aus dem FGF entfernt wurde, ein Mutein, bei dem wenigstens eine den FGF aufbauende Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde, sowie ein Mutein, bei dem wenigstens eine Aminosäure zu dem FGF hinzugefügt wurde, wobei jedes Mutein FGF-Wirkung besitzt.
Spezifische Beispiele für die FGF-Proteine sind Proteine, die in den Europäischen Patenten mit den Veröffentlichungsnummern 237 966, 281 822, 326 907 und 394 951 offenbart sind.
Die Wirkung als Rezeptor für die FGF-Proteine beinhaltet die Eigenschaft des Bindens der FGF-Proteine an die extrazellulären Domänen und bezieht sich auf die Aktiviening von Teilen in den intrazellulären Domänen, die Tyrosin-Phosphorylierungsenzymen entsprechen, durch eine Strukturänderung aufgrund der Bindung an die FGF-Proteine. Man geht allgemein davon aus, daß eine solche Wirkung der Tyrosin-Phosphorylierung eng mit der Zelldifferenzierung und der Zellvermehrung zusammenhängt.
Als Proteine, die spezifisch an FGF-Proteinmoleküle binden, können Anti-FGF-Antikörper gelten. Antikörpermoleküle besitzen jedoch keine Enzymwirkung und sind von der Zelldifferenzierung und Zellvermehrung unabhängig. Entsprechend sind die beanspruchten Proteine, die als Rezeptoren für die FGF-Proteine wirken, von Anti-FGF-Antikörpern wesentlich verschieden.
Zu den tierischen Proteinen, die als Rezeptoren für die FGF-Proteine wirken und die Ausgangsstoffe für die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung sind, gehören menschliche, Hühner-, Maus-, Frosch- und Fischproteine. Die tierischen Proteine werden im folgenden auch als reife FGF-Rezeptoren bezeichnet.
Zu den menschlichen reifen FGF-Rezeptoren gehören ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die durch fortlaufendes Verbinden der in Fig. 7 gezeigten Aminosäuresequenz gebildet wird, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die durch fortlaufendes Verbinden der in Fig. 8 gezeigten Aminosäuresequenz gebildet wird, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die in Nucleic Acids Research 18, 1906 (1990), beschrieben ist, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die als "flg" in The EMBO Journal 9, 2685 (1990), beschrieben ist, ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die als "bek" in Molecular and Cellular Biology 8, 5541-5544 (1988), und The EMBO Journal 9, 2685 (1990) beschrieben ist, und ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die als Protein, das das K-sam-Gen exprimiert, in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4378-4382 (1990), beschrieben ist
Zu den reifen Hühner-FGF-Rezeptoren gehört ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die in Science 245, 57-60 (1989), beschrieben ist.
Zu den reifen Maus-FGF-Rezeptoren gehört ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4378-4382 (1990), beschrieben ist.
Zu den wasserlöslichen Muteinen der vorliegenden Erfindung gehören Muteine, denen wenigstens eine Aminosäure von der C-terminalen Seite des reifen FGF-Rezeptors fehlt, und Muteine, denen Aminosäuresequenzen fehlen, die Transmembrandomänen des reifen FGF-Rezeptors entsprechen.
Zu den Muteinen, denen wenigstens eine Aminosäure von der C-terminalen Seite des reifen FGF-Rezeptors fehlt, gehören Muteine, denen Aminosäurereste vom C-Terminus bis zu den Transmembrandomänen, nämlich Teile, die extrazellulären Domänen entsprechen, fehlen.
Den extrazellulären Domänen können weiterhin 1 bis 38 Aminosäurereste von deren C-Terminus fehlen. Weiterhin können den extrazellulären Domänen bis zu 123 Aminosäurereste von deren C-Terminus fehlen.
Den Muteinen, denen Aminosäuresequenzen fehlen, die Transmembrandomänen des reifen FGF-Rezeptors entsprechen, können weiterhin 1 bis 11 Aminosäurereste von deren C-Terminus fehlen.
Den oben genannten Muteinen mit einer Deletion kann weiterhin gleichzeitig wenigstens eine Aminosäure vom N-Terminus fehlen.
Zu der Deletion vom N-Terminus gehört die Deletion von 1 bis 257 Aminosäureresten und vorzugsweise von 1 bis 131 Aminosäureresten vom N-Terminus. Die Nummer der Aminosäure soll dabei von einer Aminosäure direkt nach einer Signalsequenz des N-Terminus an gezählt werden.
Um die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung herzustellen, wird neben der herkömmlichen Gentechnik ortsspezifische Mutagenese eingesetzt. Diese wohlbekannte Mutagenese ist in R.F. Lather und J.P. Lecoq, Genetic Engineering, Academic Press, S. 31-50 (1983), beschrieben. Auf ein Oligonucleotid gerichtete Mutagenese ist in M. Smith und S. Gillam, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, Vol. 3, 5. 1-32 (1981), beschrieben. Ein Strukturgen, das für das Mutein der vorliegenden Erfindung codiert, wird zum Beispiel durch die folgenden Schritte hergestellt:
(a) Hybridisieren einer einzelsträngigen DNA, die einen Strang eines Strukturgens des reifen FGF-Rezeptors umfaßt, mit einem mutagenen Oligonucleotidprimer;
(b) Verlängern des Primers mit DNA-Polymerase unter Bildung eines mutationsbehafteten Heteroduplex; und
(c) Replizieren dieses mutationsbehafteten Heteroduplex.
Die Größe des Oligonucleotidprimers hängt von Bedingungen ab, die für die stabile Hybridisierung des Primers an einen Genbereich, wo eine Mutation eingeführt werden soll, erforderlich sind, und von Einschränkungen bei den zur Zeit verfügbaren Verfahren der Oligonucleotidsynthese. Die Faktoren (zum Beispiel die Gesamtgröße und die Größe eines fehlgepaarten Teils einer Mutationsstelle), die beim Entwurf des Oligonucleotids, das für die durch das Oligonucleotid geleitete Mutagenese verwendet wird, zu berücksichtigen sind, sind von M. Smith und S. Gillam in der obigen Literaturstelle beschrieben. Im allgemeinen ist die Gesamtlänge des Oligonucleotids so groß, daß eine stabile, eindeutige Hybridisierung an der Mutationsstelle optimiert wird und die Verlängerungen von der Mutationsstelle zum 5'- und zum 3'-Terminus hin in ihrer Größe so angepaßt sind, das diese ausreicht, um ein Beheben der Mutation ("Korrekturlesen") aufgrund der Exonucleasewirkung der DNA-Polymerase zu verhindern.
Der Expressionsvektor mit der DNA, die die Nucleotidsequenz enthält, die für den oben genannten reifen FGF-Rezeptor codiert, kann zum Beispiel durch die folgenden Schritte hergestellt werden:
(i) Isolieren von RNA, die für den reifen FGF-Rezeptor codiert;
(ii) Synthetisieren von einzelsträngiger komplementärer DNA (cDNA) ausgehend von der mRNA mit anschließender Synthese doppelsträngiger DNA;
(iii) Einführen der komplementären DNA in ein Plasmid;
(iv) Transformieren eines Wirtes mit dem so erhaltenen rekombinanten Plasmid;
(v) Kultivieren der so erhaltenen Transformante und dann Isolieren des Plasmids, das die gewünschte DNA enthält, aus der Transformanten durch ein geeignetes Verfahren, wie Koloniehybridisierung mit einer DNA-Sonde;
(vi) Herausschneiden der gewünschten klonierten DNA aus dem Plasmid; und
(vii) Ligasieren der klonierten DNA stromabwärts von einem Promotor in dem Träger.
Die oben erwähnte cDNA kann auch durch chemische Synthese hergestellt werden.
Die RNA, die für die reifen FGF-Rezeptoren codiert, kann aus verschiedenen FGF-Rezeptor-erzeugenden Zellen erhalten werden, wie Human-Endothel-abgeleiteten Zellen und Human-Fibroblasten. Zu den Human-Fibroblasten gehören WI38 (ATCC Nr. CCL-75) und IMR90 (ATCC Nr. CCL-186). Die obigen Zellen WI38 und IMR90 erscheinen im Catalogue of Cell Lines & Hybridomas, 5. Auflage (1985), veröffentlicht von The American Type Culture Collection.
Zu den Verfahren zur Herstellung der RNA aus den Zellen, die reifen FGF-Rezeptor erzeugen, gehört das Guanidinthiocyanatverfahren [J.M. Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)].
Unter Verwendung der so erhaltenen RNA als Matrize wird mit Hilfe von Reverser Transcriptase cDNA synthetisiert, zum Beispiel gemäß dem Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1982); ibid. 3, 280 (1983)]. Die so erhaltene cDNA wird in das Plasmid eingeführt.
Zu den Plasmiden, in die die cDNA eingeführt wird, gehören zum Beispiel pBR322 [Gene 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene 19, 259 (1982)], pUC13 [Gene 19, 259 (1982)], pUC118 und pUC119 [Methods in Enzymology 153, 3-11 (1987)], die jeweils von Escherichia coli abgeleitet sind, und pUB110, das von Bacillus subtilis abgeleitet ist [Biochemical and Biophysical Research Communication 112, 678 (1983)]. Es kann jedoch auch jedes andere Plasmid verwendet werden, solange es in dem Wirt replizierbar ist und aufrechterhalten wird.
Zu den Verfahren zur Einführung der cDNA in das Plasmid gehört zum Beispiel das in T. Maniatis et al., Molecularcloning, Cold Spring Laboratory, S. 239 (1982), beschriebene Verfahren.
Als Plasmid, in das die obige cDNA eingeführt wird, kann ein Plasmid verwendet werden, das unter Verwendung der cDNA-Bibliothek erhalten wird, bei der E. coli x1776, das durch Einführen von cDNA, die aus mRNA normaler menschlicher diploider Zellen synthetisiert wurde, in den pCD-Vektor hergestellt wird [H. Okayama et al., Molecular Cell Biology 3, 280 (1983)], als Wirt verwendet wird. Die obige cDNA-Bibliothek ist von Dr. Okayama, Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University, erhältlich.
Das so erhaltene Plasmid wird in geeignete Wirtszellen, wie Rscherichia und Bacillus, eingeführt.
Beispiele für das oben beschriebene Escherichia sind E. coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 160 (1968)], M103 Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics 39, 440 (1954)].
Beispiele für das oben beschriebene Bacillus sind Bacillus subtilis MI114 [Gene 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry 95, 87 (1984)].
Zu den Verfahren der Transformation gehören zum Beispiel das Calciumchloridverfahren und das Calciumchlorid/Rubidiumchlorid- Verfahren, die in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 249 (1982), beschrieben sind.
Die gewünschten Klone werden unter Verwendung bekannter Verfahren, wie des Koloniehybridisierungsverfahrens [Gene 10, 63 (1980)] und des DNA-Nucleotidsequenz-Bestimmungsverfahrens [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977)], aus den so erhaltenen Transformanten ausgewählt.
So erhält man die Mikroorganismen, von denen jeder den Vektor mit der DNA trägt, die die Nucleotidsequenz enthält, die für den klonierten reifen FGF-Rezeptor codiert.
Dann werden die Plasmide aus den Mikroorganismen isoliert.
Zu den Isolierungsverfahren gehören die Alkaliverfahren [H.C. Birmboim et al., Nucleic Acids Research 1, 1513 (1979)].
Das Plasmid mit der DNA, die die Nucleotidsequenz enthält, die für den klonierten reifen FGF-Rezeptor codiert, kann verwendet werden, wie es ist, oder die Sequenz kann, falls gewünscht, durch Digestion mit einem Restriktionsenzym herausgeschnitten werden.
Das klonierte Gen wird stromabwärts von dem Promotor in einen Träger (Vektor) ligasiert, der sich für die Expression eignet, wodurch der Expressionsvektor erhalten werden kann.
Zu den Vektoren gehören die obigen von E. coli abgeleiteten Plasmide (wie pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC118 und pUC119), von B. subtilis abgeleitete Plasmide (wie pUB110, pTP5 und pC194), von Hefe abgeleitete Plasmide (wie pSH19 und pSH15), Bakteriophagen, wie λ-Phage, und Tierviren, wie Retroviren und Vaccinia-Viren.
Das Gen enthält ATG als Translations-Startcodon an seinem 5'-Terminus und kann TAA, TGA oder TAG als Translations-Stopcodon am 3'-Terminus enthalten. Um das Gen zu exprimieren, wird weiterhin der Promotor stromaufwärts davon ligasiert. Als Promotor kann in der vorliegenden Erfindung jeder Promotor verwendet werden, solange er entsprechend dem für die Genexpression verwendeten Wirt für die Expression geeignet ist.
Wenn es sich bei dem für die Transformation verwendeten Wirt um Escherichia handelt, wird vorzugsweise ein T7-Promotor, ein trp- Promotor, ein lac-Promotor, ein recA-Promotor, ein λpL-Promotor, ein lpp-Promotor oder dergleichen verwendet. Wenn es sich bei dem Wirt um Bacillus handelt, wird vorzugsweise ein SP01-Promotor, ein SP02-Promotor, ein penP-Promotor oder dergleichen verwendet. Wenn es sich bei dem Wirt um Hefe handelt, wird vorzugsweise ein PH05-Promotor, ein PGK-Promotor, ein GAP-Promotor, ein ADH-Promotor oder dergleichen verwendet. Insbesondere handelt es sich bei dem Wirt vorzugsweise um Escherichia, und der Promotor ist der trp-Promotor oder der T7-Promotor.
Wenn es sich bei dem Wirt um eine tierische Zelle handelt, kann ein von SV40 abgeleiteter Promotor, ein retroviraler Promotor oder dergleichen verwendet werden.
Unter Verwendung eines so aufgebauten Vektors, der die DNA enthält, wird die Transformante hergestellt.
Beispiele für die Wirtszellen sind Escherichia, Bacillus, Hefe und tierische Zellen.
Spezifische Beispiele für die oben beschriebenen Escherichia und Bacillus sind die oben beschriebenen Stämme.
Beispiele für die oben beschriebene Hefe sind Saccharomyces cerevisiae AH22R, NA87-11A und DKD-5D.
Beispiele für die tierischen Zellen sind Affenzellen COS7, Vero, Eierstockzellen Chinesischer Hamster (CHO), Maus-L-Zellen und Human-FL-Zellen.
Die oben beschriebene Escherichia wird zum Beispiel nach den Verfahren transformiert, die in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), und dergleichen beschrieben sind.
Bacillus wird zum Beispiel nach den Verfahren transformiert, die in Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979), und dergleichen beschrieben sind.
Die Hefe wird zum Beispiel nach dem Verfahren transformiert, das in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978), beschrieben ist.
Die tierischen Zellen werden zum Beispiel nach dem Verfahren transformiert, das in Virology, 52, 456 (1973) beschrieben ist.
So wird die Transformante erhalten, die mit dem Vektor transformiert ist, der die DNA enthält.
Wenn die Escherichia- oder Bacillus-Transformante kultiviert wird, ist ein flüssiges Medium als Kulturmedium besonders geeignet. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere, die für das Wachstum der Transformanten notwendig sind, sind darin enthalten. Zu den Kohlenstoffquellen gehören zum Beispiel Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Saccharose. Zu den Stickstoffquellen gehören anorganische oder organische Stoffe, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Maisabkochung, Pepton, Casein, Fleischextrakte, Sojamehl und Kartoffelextraktlösung. Zu den anorganischen Verbindungen gehören zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid. Weiterhin können Hefe, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren usw. hinzugefügt werden.
Der pH-Wert des Mediums beträgt vorzugsweise etwa 6 bis 8.
Als Medium für die Kultur von Escherichia wird vorzugsweise zum Beispiel M9-Medium verwendet, das Glucose und Casamino Acids enthält (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Damit der Promotor effizient wirkt, kann, falls erforderlich, eine Verbindung wie 3β-Indolylacrylsäure hinzugefügt werden.
Wenn es sich bei dem Wirt um Escherichia handelt, wird die Kultur gewöhnlich etwa 3 bis 24 Stunden bei etwa 15 bis 43ºC durchgeführt, falls notwendig, unter Belüften oder Rühren.
Wenn es sich bei dem Wirt um Bacillus handelt, wird die Kultur gewöhnlich etwa 6 bis 24 Stunden bei etwa 30 bis 40ºC durchgeführt, falls notwendig, unter Belüften oder Rühren.
Wenn die Hefe-Transformante kultiviert wird, wird zum Beispiel Burkholder-Minimalmedium [K.L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)] als Kulturmedium verwendet. Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf etwa 5 bis 8 eingestellt. Die Kultur wird gewöhnlich etwa 24 bis 72 Stunden bei etwa 20 bis 35ºC durchgeführt, falls notwendig, unter Belüften oder Rühren
Wenn die Transformante in Form von tierischen Zellen kultiviert wird, sind bevorzugte Beispiele für die Kulturmedien MEM-Medium, das etwa 5 bis 20% Kälberfetusserum enthält [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8,396 (1959)], RPMI1640-Medium [Journal ofthe American Medical Association, 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proceeding ofthe Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)]. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise etwa 6 bis 8. Die Kultur wird gewöhnlich etwa 15 bis 60 Stunden bei etwa 30 bis 40ºC durchgeführt, falls notwendig, unter Belüften oder Rühren.
Das Mutein der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel nach dem folgenden Verfahren aus den oben beschriebenen Kulturen isoliert und gereinigt werden.
Wenn das Mutein der vorliegenden Erfindung aus den kultivierten Zellen extrahiert wird, werden die Zellen nach der Kultur nach Verfahren, die in der Technik bekannt sind, gewonnen. Dann werden die gewonnenen Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert, die ein proteindenaturierendes Mittel, wie Guanidin- Hydrochlond, enthält, um das gewünschte Mutein aus den Zellen zu extrahieren. Außerdem wird geeigneterweise das Verfahren verwendet, bei dem die Zellen durch Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Frieren/Tauen zerrissen werden, wobei anschließend zentrifugiert wird, um das Mutein der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Insbesondere wird das Verfahren bevorzugt, bei dem Lysozym in Verbindung mit einer Ultraschallbehandlung verwendet wird.
Um das Mutein der vorliegenden Erfindung aus einem Kulturüberstand zu reinigen, können geeignete Kombinationen an sich bekannter Trenn- und Reinigungsverfahren verwendet werden. Zu diesen bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren gehören Verfahren, die auf der Löslichkeit beruhen, wie Salzfällung und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die hauptsäcblich auf einem Unterschied im Molekulargewicht beruhen, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltrationschromatographie und SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese, Verfahren, die auf einem Unterschied in der elektrischen Ladung beruhen, wie Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Verfahren, die auf spezifischer Affinität beruhen, wie Affinitätschromatographie Verfahren, die auf einem Unterschied in der Hydrophobie beruhen, wie Umkehrphasen-HPLC und Verfahren, die auf einem Unterschied im isoelektrischen Punkt beruhen, wie Elektrophorese mit isoelektrischer Fokussierung.
Die so erhaltenen Muteine der vorliegenden Erfindung können auch unter Bildung getrockneter Pulver dialysiert und lyophilisiert werden. Wenn zu den Muteinen der vorliegenden Erfindung zur Lagerung Serumalbumin gegeben wird, werden die Muteine vorzugsweise daran gehindert, von Behältern adsorbiert zu werden.
So werden die im wesentlichen reinen wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung erhalten. Zu den im wesentlichen reinen wasserlöslichen Muteinen der vorliegenden Erfindung gehören Muteine mit einem Proteingehalt von 95 Gew.-% oder mehr und vorzugsweise Muteine mit einem Proteingehalt von 98 Gew.-% oder mehr.
Beispiele für die durch DNA-Rekombinationstechnik erhaltenen Muteine der vorliegenden Erfindung sind ein Protein, das ein Polypeptid enthält, das durch die in Fig. 11 gezeigte Aminosäuresequenz dargestellt wird, und ein Protein, das ein Polypeptid enthält, das durch die in Fig. 12 gezeigte Aminosäuresequenz dargestellt wird. Das obige Protein karin Met am N-Terminus aufweisen. An die C-Termini der wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung können Aminosäuresequenzen angefügt werden, die den Transmembrandomänen oder den intrazellulären Domänen entsprechen (das resultierende Polypeptid wird im folgenden auch als Aminosäureaddukte bezeichnet). Beispiele für solche Addukte sind ein Polypeptid, das die in Fig. 7 gezeigte Aminosäuresequenz enthält, und ein Polypeptid, das die in Fig. 8 gezeigte Aminosäuresequenz enthält. Die obigen Polypeptide können zum Beispiel durch Herstellen von cDNAs nach den oben beschriebenen Verfahren, Einführen der cDNAs in Plasmide, um Transformanten herzustellen, Kultivieren der Transformanten und Reinigen der Produkte hergestellt werden.
Die Aktivität der so erhaltenen wasserlöslichen Muteine oder Aminosäureaddukte der vorliegenden Erfindung kann anhand der Wirkung einer Bindung von FGFs an Zellen getestet werden.
Die mit der rekombinanten DNA der vorliegenden Erfindung transfizierten oder transformierten Zellen können eine große Menge der Muteine der vorliegenden Erfindung erzeugen, sogar in verschiedenen Zellen, die im wesentlichen nur eine kleine Menge der FGF-Rezeptoren oder überhaupt keine erzeugen.
Die Expressionsplasmide, die die Gene enthalten, die für die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung codieren, können verschiedene Zellen veranlassen, die Muteine der vorliegenden Erfindung zu erzeugen; dazu führt man die Plasmide in die Zellen ein, so daß die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung in großen Mengen hergestellt werden können.
An die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung können Zuckerketten angefügt werden. Bei den Zuckerketten kann es sich um irgendwelche handeln, die man in bekannten glycosylierten Proteinen findet. Beispiele dafür sind N-Acetylglycosamin, N-Acetylgalactosamin, Mannose, Galactose, Fucose und Sialinsäure. Die Anzahl der an die Muteine angefügten Zuckerketten beträgt wenigstens eins und vorzugsweise 10 bis 20.
Unter Verwendung der so erhaltenen wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung oder ihrer Aminosäureaddukte kann verhindert werden, daß die FGF-Moleküle an die auf den Zelloberflächen natürlich vorkommenden FGF-Rezeptoren binden. Durch diese vorbeugende Behandlung wird die von FGF abhängige Zellvermehrung gehemmt. Aus diesem Grund können sie als therapeutische Mittel für multiple endokrine Neoplasie, Prostatahypertrophie, diabetische Retinitis oder Krebs verwendet werden. Ihre Toxizität ist gering.
Die Muteine der vorliegenden Erfindung oder ihre Aminosäureaddukte können durch Transfizieren oder Transformieren verschiedener tierischer Zellen (wie Lymphocyten), die ursprünglich frei von FGF-Rezeptoren sind, mit den DNAs der vorliegenden Erfindung hergestellt werden. Diese Zellen können daher lange Zeit vermehrt werden, es können Subkulturen erhalten, Zellinien gewonnen oder in vitro kloniert werden, indem man sie in FGF-haltigen Kulturmedien kultiviert.
Die oben erwähnten tierischen Zellen, deren Vermehrung ermöglicht wird, indem man die DNAs der vorliegenden Erfindung verwendet, werden in großen Mengen kultiviert, wodurch verschiedene nützliche Substanzen, die im wesentlichen von diesen Zellen produziert werden, in großen Mengen erhalten werden können.
Außerdem kann durch Verwendung von Antikörpern, die gegen das von den DNAs der vorliegenden Erfindung codierte Protein und die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung oder deren Aminosäureaddukte hergestellt wurden, Krebs oder Prostatahypertrophie diagnostiziert werden, indem man die Menge der in den Zellen exprimierten FGF-Rezeptoren nachweist.
Wenn die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung oder ihre Aminosäureaddukte als pharmazeutische Präparate verwendet werden, können sie warmblütigen Saugetieren (wie Menschen, Mäusen, Ratten, Hamsterns, Kaninchen, Hunden und Katzen) parenteral oder oral in Pulverform, wie sie sind, oder als pharmazeutische Zusammensetzungen (wie Injektionen, Tabletten, Kapseln, Lösungen und Salben) mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Arzneimittelhilfsstoffen und Verdünnungsmitteln sicher verabreicht werden.
Die Injektionen werden nach herkömmlichen Verfahren hergestellt, wobei zum Beispiel physiologische Kochsalzlösung oder wäßrige, glucosehaltige Lösungen oder andere Hilfsmittel verwendet werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen wie Tabletten und Kapseln können ebenfalls gemäß herkömmlichen Verfahren hergestellt werden.
Wenn die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung oder ihre Aminosäureaddukte als die oben genannten pharmazeutischen Zusammensetzungen an Säuger verabreicht werden, beträgt die Dosierung zum Beispiel etwa 0,2 µg/kg bis 0,2 mg/kg pro Tag und vorzugsweise etwa 2 µg/kg bis 0,2 mg/kg.
Wenn weiterhin die Zellkultur der Zellen, in die die Gene eingeführt werden, die für die wasserlöslichen Muteine der vorliegenden Erfindung oder deren Aminosäureaddukte codieren, beschleunigt werden sollte, wird vorzugsweise soviel FGF zu dem Kulturmedium gegeben, daß es darin in einer Menge von etwa 0,01 bis 10 µg und vorzugsweise in einer Menge von etwa 0,1 bis 10 µg pro Liter Medium enthalten ist.
Wenn Nucleotide, Aminosäuren usw. in dieser Beschreibung und den Zeichnungen durch Abkürzungen wiedergegeben werden, werden die Abkürzungen verwendet, die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature angenommen wurden oder in der Technik gewöhnlich verwendet werden. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn es in bezug auf die Aminosäuren optische Isomere geben kann, ist die L-Form dargestellt, wenn nichts anderes angegeben ist.
DNA : Desoxyribonucleinsäure
cDNA : komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A : Adenin
T : Thymin
G : Guanin
C: Cytosin
RNA : Ribonucleinsäure
dATP : Desoxyadenosintriphosphat
dTTP : Desoxythymidintriphosphat
dGTP : Desoxyguanosintriphosphat
dCTP : Desoxycytidintriphosphat
ATP : Adenosintriphosphat
EDTA : Ethylendiamintetraessigsäure
SDS : Natriumdodecylsulfat
G oder Gly: Glycin
A oder Ala: Alanin
V oder Val: Valin
L oder Leu: Leucin
I oder Ile: Isoleucin
S oder Ser: Serin
T oder Thr: Threonin
C oder Cys: Cystein
M oder Met: Methionin
E oder Glu: Glutaminsäure
D oder Asp: Asparaginsäure
K oder Lys: Lysin
R oder Arg: Arginin
H oder His: Histidin
F oder Phe: Phenylalanin
Y oder Tyr: Tyrosin
W oder Trp: Tryptophan
P oder Pro: Prolin
N oder Asn: Asparagin
Q oder Gln: Glutamin
Die Zugriffsnummern und Hinterlegungsdaten der in den unten beschriebenen Beispielen erhaltenen Transformanten sind in Tabelle 1 gezeigt. In Tabelle 1 geben die IFO-Nummern die Hinterlegung beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO), die FERM-BP-Nummern die Hinterlegung beim Fermentation Research Institute, der Agency of Industrial Science and Technology, dem Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI), unter dem Budapester Abkommen an. Tabelle 1 Mikroorganismus E. coli July September April August December
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben. Selbstverständlich sollen diese Beispiele den Umfang der Erfindung nicht einschränken.

Beispiel 1

(1) Herstellung einer cDNA-Bibliothek, die von der mRNA der Human-Krebszellinie Kato III abgeleitet ist

Unter Verwendung eines mRNA-Abtrennungs-Kit (Fast Track, Invitrogen, USA) wurde mRNA aus der Human-Krebszellinie Kate III extrahiert. Unter Verwendung dieser mRNA als Matrize wurde eine cDNA- Bibliothek hergestellt, wobei der λ-Phage-Vektor λgt10 [T.V. Huynh et al., DNAcloning, A Practical Approach, 5. 49, IRL Press, Oxford (1985)] nach dem Verfahren von Watson und Jackson [C. J. Watson und J.F. Jackson, DNAcloning, A Practical Approach, S. 79, IRL Press, Oxford (1985)] verwendet wurde. Ausgehend von 10 µg Poly(A)-RNA konnte eine cDNA-Bibliothek erhalten werden, deren Wirt E. coli C600, HflA ist (TV. Huynh et al., siehe oben) und die etwa 1,5 x 10&sup6; Klone enthält.

(2) Isolierung von Phage, der cDNA von Protein mit Human-bFGF- Rezeptorwirkung enthält und Bestimmung von deren Nucleotidsequenz

10 Agarplatten wurden jeweils mit der obigen Phage-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von E. coli C600, HflA als Wirt bis zu etwa 1 x 10&sup5; Klonen beimpft, und dann wurde die cDNA jeder Platte auf 2 Nitrocellulosefilter übertragen (Millipore, HATF-Filter). Dann wurde die Phage-DNA auf den Filtern der Denaturierung durch Lyse mit 0,5 N NaOH-Lösung ausgesetzt und zur Fixierung getrocknet [T. Maniatis et al., Molecularcloning, S. 320, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].
Andererseits wurde ein Oligonucleotid mit der folgenden Formel, das von einem Teil (Aminosäure Nr. 529 bis 541) der von P. Lee et al. [P. Lee et al., Science 7, 57 (1989)] beschriebenen Aminosäuresequenz des Hühner-bFGF-Rezeptors abgeleitet war, chemisch synthetisiert.
Dieses Nucleotid wurde in 50 µl einer Reaktionslösung [Oligonucleotid: 0,1 µg, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM Mercaptoethanol, 50 µCi [γ-³²p] -ATP (> 5000 Ci/mmol), 3 Einheiten T4-Polynucleotid-Kinase] 1 Stunde bei 37ºC mit T4-Polynucleotid- Kinase (Takara Shuzo) umgesetzt, um den 5'-Terminus des Oligonucleotids mit ³²P zu markieren.
Das nach dem oben beschriebenen Verfahren markierte Oligonucleotid wurde als Sonde mit jedem der Abklatschfilter, auf denen die DNA fixiert war, hybridisiert. Die Hybridisierungsreaktion wurde 16 Stunden bei 35ºC in 10 ml einer Lösung von 5 X SSPE [180 mM NaCl, 10 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 1 mM EDTA (pH 7,4)], 5 X Denhardts, 0,1% SDS und 100 µg/ml denaturierter Lachssamen-DNA durchgeführt. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Filter 3 mal 30 Minuten bei Raumtemperatur und weiter zweimal 30 Minuten bei 45º0 mit einer Lösung von 5 X SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat) und 0,1% SDS gewaschen [T. Maniatis et al., Molecularcloning, S. 309, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)].
Von den gewaschenen Filtern wurden Radioautogramme aufgenommen, und die Radioautogramme der Abklatschfilter wurden in Gruppen zu zwei Filtern in Schichten zusammengelegt, um nach den gegenüber der Sonde reaktiven Zellstämmen zu suchen.
Daraufhin wurden 3 cDNA-Klone erhalten, die gegenüber der Sonde reaktiv waren, und als λFRK1, λFRK2 bzw. λFRK3 bezeichnet. Ein Teil der Nucleotidsequenz jedes cDNA-Teils wurde nach dem Didesoxynucleotidsynthese-Kettenabbruchverfahren bestimmt [J. Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981)].
Als Ergebnis konnte die Aminosäuresequenz eines Teils des Proteins mit Human-PGF-Rezeptorwirkung bestimmt werden. Die Nucleotidsequenz und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz werden durch die in Fig. 1 gezeigten Sequenzen angegeben. Die Aminosäuresequenz ist sehr ähnlich der des beschriebenen Hühner- bFGF-Rezeptors, was zeigt, daß diese cDNA für das Protein mit Rezeptorwirkung in bezug auf die Human-FGF-Proteine codiert.
Es wird angenommen, daß dem hier erhaltenen Protein der Teil fehlt, der etwa 190 Aminosäureresten vom C-Terminus des Hühner- FGF-Rezeptors entspricht [science 7, 57 (1989)]. Es wird jedoch angenommen, daß das Protein wenigstens die Aminosäuresequenz enthält, die der zentralen Transmembransequenz bis zum N-Terminus entspricht.

Beispiel 2

Jeder der cDNA-Teile der 3 in Beispiel 1 erhaltenen cDNA-Klone λFRK1, λFRK2 und λFRK3 wurde in die Multiklonierungsstellen der Plasmide pUC118 und pUC119 (Takara Shuzo) eingesetzt, um E. coli MV1184 zu transformieren und dadurch jede der Transformanten E. coli MV1184/pTB1227, E. coli MV1184/pTB1228 (IFO 15071, FERM BP-3041) und E. coli MV1184/pTB1229 (IFO 15072, FERM BP-3042) zu erhalten.
Fig. 2 zeigt Restriktionsenzymkarten der cDNA-Teile der von diesen Transformanten erhaltenen Plasmide pTB1227, pTB1228 und pTB1229.
Die durch Digestion der cDNA-Teile von pTB1227, pTB1228 und pTB1229 mit Restriktionsenzymen erhaltenen Spaltungskarten sind gezeigt. Die verwendeten Restriktionsenzyme sind KpnI, NcoI, PvuI, SmaI und BalI.
Leere Quadrate in Fig. 2 zeigen nichtcodierende Bereiche, ausgefüllte Quadrate zeigen codierende Bereiche, und V zeigt einen entfernten Teil.
Weiterhin bewies die Bestimmung der Nucleotidsequenzen dieser cDNAs, daß die Nucleotidsequenz des cDNA-Klons pTB1229, die am längsten war, aus 1954 Nucleotiden bestand. Seine Nucleotidsequenz und die Aminosäuresequenz, für die sie codiert, werden durch die in Fig. 4 gezeigte Aminosäuresequenz angegeben. Die cDNA von pTB1228 ist durch die in Fig. 3 gezeigte Nucleotidsequenz angegeben. Dieser fehlen das 134. bis 478. Nucleotid sowie das 1309. bis 1314. Nucleotid der in Fig. 4 gezeigten Nucleotidsequenz. Infolgedessen fehlen der codierten Aminosäuresequenz E³&sup7; bis K¹&sup5;¹, V&sup4;²&sup9; und T&sup4;³&sup0;, und R¹&sup5;² ist zu G abgeändert. Weiterhin ist in pTB1228 das 1029. G der Nucleotidsequenz (Fig. 4) der cDNA von pTB1229 zu T abgeändert. Außerdem wurde gefunden, daß die cDNA von pTB1227 dem 1395. bis 1954. entspricht. Auch wenn die Nucleotidsequenzen dieser cDNAs in Aminosäuren translatiert werden, erscheinen keine Translations-Stopcodons. Aus diesem Grund glaubt man, daß der Carboxyterminus des Human-FGF- Rezeptors nicht erhalten werden kann, ohne die 3'-terminale Seite weiter zu klonieren. Wenn man die translatierten Aminosäuren mit denen des Hühner-FGF-Rezepüors vergleicht, findet man eine Homologie von 66%. Aufgrund dieses Vergleichs nimmt man an, daß das Signalpeptid aus 21 Aminosäuren M¹ bis A²¹ besteht. Ähnlich nimmt man an, daß die Transmembransequenz aus I³&sup7;&sup9; bis C³&sup9;¹ besteht.

Beispiel 3

(1) cDNA wurde synthetisiert, wobei die in dem oben beschriebenen Beispiel 1 erhaltene mRNA und ein cDNA-Synthese-Kit (cDNA synthesis system, Plus, Amersham, U.K.) verwendet wurden.
Ein Primer 5'-TCAGAGATGGAGATGATGAAG-3' (21-mer) wurde auf der Grundlage der in dem oben beschriebenen Beispiel 2 erhaltenen cDNA-Nucleotidsequenz (1618-1638) synthetisiert, und der Teil, der für den C-Terminus des FGF-Rezeptors codiert, wurde nach dem PCR-Verfahren (polymerase cham reaction) zusammen mit Oligo(dT)&sub1;&sub2;&submin;&sub1;&sub8; (Amersham, U.K.) zu der oben erhaltenen cDNA amplifiziert. Das amplifizierte DNA-Fragment wurde in die SmaI- Stelle des Plasmidvektors pUC118 (Takara Shuzo) einkloniert, um E. coli MV1184 zu transformieren, wodurch man die Tramsformante E. coli MV1184/pTB1281 erhielt.
Die DNA-Sequenz des aus dieser Transformante erhaltenen Plasmids pTB1281 wurde mit Restriktionsenzym BamHI und KpnI digestiert. Die Länge der resultierenden cDNA war etwa 1 kbp.
Weiterhin wurde die Nucleotidsequenz dieser cDNA analysiert. Als Ergebnis wurde bestätigt, daß diese Sequenz einen Teil, der für V&sup5;³³ bis zum Carboxyterminus des FGF-Rezeptors codiert, und einen nichttranslatierten Bereich auf der 3'-terminalen Seite enthält.
Diese cDNA-Nucleotidsequenz überlappt mit dem Nucleotid Nr. 1618 und den darauffolgenden Nucleotiden der in Fig. 3 gezeigten Sequenz. Unter Verwendung der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms SmaI, der in diesem Teil vorkommt, wurden das Plasmid pTB1283 (Fig. 5) und das Plasmid pTB1284 (Fig. 6) mit cDNA, die für den vollständigen FOF-Rezeptor codiert, aufgebaut. Mit Hilfe dieser Plasmid-DNA wurde E. ccli MV1184 transformiert, wobei man zwei Arten von Transformanten erhielt, E. ccli MV1184/pTB1283 (IFO 15089, FERM BP-3214) und E. coli MV1184/pTB1284 (IFO 15090, FERM BP-3215)
Die cDNA-Nucleotidsequenz des Plasmids pTB1284 wird durch die in Fig. 7 gezeigte Nucleotidsequenz angegeben. Die cDNA-Nucleotidsequenz des Plasmids pTB1283 wird durch die in Fig. 8 gezeigte Nucleotidsequenz angegeben. Dieser fehlen das 134. bis 478. Nucleotid und das 1309. bis 1314. Nucleotid der in Fig. 7 gezeigten Nucleotidsequenz. Infolgedessen fehlen der codierten Aminosäuresequenz E³&sup7; bis K¹&sup5;¹, V&sup4;²&sup9; und T&sup4;³&sup0;, und R¹&sup5;² ist zu G abgeändert. Weiterhin ist das 1029. G dieser cDNA zu T abgeändert.

(2) Expression von FGF-Rezeptoren in tierischen Zellen

(a) Aufbau der Plasmide pTB1313 und pTB1314 für die Expression von FGF-Rezeptoren

Zwei Arten von Plasmiden, pTB1284 und pTB1283, die oben in Punkt (1) erhalten wurden und die jeweils den gesamten Strukturbereich des FGF-Rezeptors enthalten, wurden mit Restriktionsenzym Kpni-Bsmi gespalten. Nach der Reaktion mit T4-Polymerase wurden BAMHI-Linker [CGGATCCG] an beide Termini ligasiert, und ein 2,6-kb- oder 2,2-kb-DNA-Fragment wurde isoliert
Andererseits wurde ein Vektor pTB1308 für tierische Zellen erhalten, indem man das Plasmid pTB399 (Cell Struct. Funct. 12, 205-217 (1987)) mit EcoRI spaltete, um den IL-2-cDNA-Bereich daraus zu entfernen, nach der Reaktion mit einem Klenow-Fragment einen BglII-Linker [CAGATCTG] daran ligasierte, anschließend mit BglII spaltete und das resultierende DNA-Fragment von etwa 3,8 kb unter Verwendung von T4-Ligase cyclisierte. Das obige 2,6-kb- oder 2,2-kb-Fragment der FGF-Rezeptor-cDNA wurde in die BglII- Spaltstelle von pTB1308 eingesetzt, und ein Expressionsplasmid pTB1309 oder pTB1310, das die FGF-Rezeptor-cDNA in einer tierischen Zelle unter der Kontrolle von Abelson-Maus-Leukämievirus- LTR (MULV-LTR) exprimieren kann, wurde aufgebaut. Jedes dieser Plasmide wurde mit SalI-HindIII weiter gespalten, und ein Teil mit einer Expressionseinheit (Promotorgen-Poly(A)-Signal) wurde stromaufwärts vom SV40-Promotor des Plasmids pTB348 zur Expression von Hamster-Dihydrofolat-Reduktase (DHFR) [Cell Struct. Funct. 12, 205 (1987)] unter Aufbau der beiden Plasmide pTB1313 und pTB 1314 in den Sall-Hindill-Bereich eingesetzt. Fig. 13 zeigt den Aufbau des Plasmids pTB1313.

(b) Expression in tierischen Zellen

Affen-COS7-Zellen wurden in einer Schale für die Gewebekultur mit einem Durchmesser von 6 cm in DMEM-Medium, das 10% Kälberfetusserum enthielt, eingeimpft, und am nächsten Tag wurde das Medium gegen dasselbe Medium ausgetauscht. Nach 4 Stunden wurden die Zellen nach dem Calciumphosphatverfahren [Graham et al., Virology 52, 456 (1973)] mit 10 µg DNA des Plasmids pTB1313 oder pTB1314 transfiziert. Am nächsten Tag wurden die transfizierten Zellen in DMEM-Medium gegeben, das 0,5% Kälberfetusserum enthielt, und die Kultur wurde fortgesetzt. Nach 48 Stunden wurden die Kulturlösung und die Zellen gewonnen. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und dann in PBS suspendiert. Die Suspension wurde kurze Zeit mit Ultraschall behandelt, danach wurde 15 Minuten mit 15 000 U/min zentrifugiert, um den Überstand von dem Zellrückstand zu trennen. Diese Kulturlösungen (0,5 ml, Fällung mit 5% Trichloressigsäure), Zellextrakte und Zellrückstände wurden nach SDS-PAGE nach dem Western-Blotting-Verfahren analysiert. Als primärer Antikörper wurde polyklonaler Kaninchen- Antikörper verwendet, der unter Verwendung eines synthetischen Peptids (LVEDTTLEPE) als Antigen erhalten wurde, wobei das Peptid der 27. bis 36. der Aminosäuresequenz des von der FGF-Rezeptor- DNA abgeleiteten FGF-Rezeptors entsprach.
Als Ergebnis des Western-Blottings wurde im Rückstand der pTB1313-infizierten COS7-Zellen ein Produkt von etwa 140 bis 150 kD nachgewiesen, und im Rückstand der pTB1314-infizierten COS7-Zellen wurde ein Produkt von etwa 100 kD nachgewiesen.

Beispiel 4

(1) Aufbau eines Systems für die Expression von löslichem Rezeptor in E. coli

Jede der in dem oben beschriebenen Beispiel 2 erhaltenen Transformanten E. coli MV1184/pTB1228 und E. coli MV1184/pTB1229 wurde mit Helfer-Phage KQ7 infiziert, und eine einzelsträngige DNA wurde aus dem Kulturmedium hergestellt. Unter Verwendung dieser einzelsträngigen DNA als Matrize wurde ortsspezifische Mutagenese mit Hilfe zweier synthetischer Primer,
(1) 5'-AATGGCTGGATCCAGTTAGTCTGGGG-3' (26-mer) und
(2) 5'-GAAGGAGGGCCGCATATGGGACAAGGTTGC-3' (30-mer), durchgeführt.
Diese Mutagenese wurde unter Verwendung eines in-vitro-Mutagenesesystems (Amershaml U.K.) durchgeführt. Als Ergebnis wurden die Plasmide pTB1285 und pTB1286 erhalten, in denen jeweils das 1152. Nucleotid der Nucleotidsequenz von Fig. 7 durch Primer (1) zu A mutageneriert war, ein Translations-Stopcodon anstelle von Y³&sup7;&sup6; eingeführt war und weiterhin der Erkennungsbereich des Restriktionsenzyms NdeI in das 1155. bis 1160. Nucleotid eingeführt war. Dann wurden die Plasmide pTB1287 und pTB1288 erhalten, in denen jeweils das 83. bis 87. Nucleotid durch ATATG ersetzt war, das Codon für A²¹ zu dem Codon für M abgeändert war und weiterhin der Erkennungsbereich des Restriktionsenzyms NdeI in diesen Teil eingeführt war.
Ein Fragment von 0,7 kbp oder 1 kbp, das mit NdeI bzw. BamHI aus der DNA jeder Mutante herausgeschnitten worden war, wurde stromabwärts des T7-Promotors des Plasmids pET3c eingeführt, wobei man Plasmid pTB1289 bzw. pTB1290 erhielt. Fig. 9 zeigt den Aufbau des Plasmids pTB1289, und Fig. 10 zeigt den Aufbau des Plasmids pTB1290. E. coli MM294 (DE3)/pLysS wurde mit Hilfe dieser Plasmide transformiert, wobei die Transformanten E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1289 (IFO 15091, FERM BP-3216) und E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1290 (IFO 15092, FERM BP-3217) erhalten wurden, die eine extrazelluläre Domäne des FGF-Rezeptors exprimierten.

(2) Expression extrazellulärer Domänen von FGF-Rezeptoren in E. coli

E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1289 und E. ccli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1290 wurden jeweils in LB-Medium kultiviert, und die Expression wurde mit Isopropyl-β-D-thiogalactosid induziert. Dann wurden alle Proteine der Zellen mit SDS-PAGE untersucht. Als Ergebnis wurden Banden, die für die jeweiligen Transformanten spezifische waren, durch Anfärben mit Coomassie-Blau bestätigt. Anhand der relativen Lagen in bezug auf Molekulargewichtsmarker wurde festgestellt, daß diese Banden mit dem geschätzten Molekulargewicht der in den cDNAs codierten Proteine übereinstimmten, und die Erzeugung der extrazellulären Domänen der FGF-Rezeptoren in E. coli wurde bestätigt. Was die Aminosäuresequenzen der extrazellulären Domänen der resultierenden FGF-Rezeptoren betrifft, wird die Aminosäuresequenz des von E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1289 exprimierten Proteins durch die in Fig. 11 gezeigte Sequenz angegeben, und die Aminosäuresequenz des von E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1290 exprimierten Proteins wird durch die in Fig. 12 gezeigte Sequenz angegeben.

(3) Expression extrazellulärer Domänen von FGF-Rezeptoren in tierischen Zellen

(a) Aufbau der Expressionsplasmide pTB1315 und pTB1316

Zwei Arten von Plasmiden, pTB1286 und pTB1285, die oben in (1) erhalten wurden und die jeweils cDNA enthalten, die für die extrazelluläre Domäne der FGF-Rezeptoren codiertl wurden mit den Restriktionsenzymen BstEII-BamHI gespalten, wobei man 1,1-kb- und 0,75-kb-DNA-Fragmente erhielt. Andererseits wurde das in dem oben beschriebenen Beispiel 3 (2) aufgebaute Plasmid pTB1309 für die Expression der FGF-Rezeptoren mit denselben Restriktionsenzymen gespalten und unter Aufbau der Expressionsplasmide pTB1311 bzw. pTB1312 jeweils mit dem oben genannten 1,1-kb- bzw. 0,75-kb- Fragment ergänzt.
Ptb1311 und pTB1312 sind Plasmide, die die Zelldomänen der beiden Arten von FGF-Rezeptoren unter der Kontrolle von MuLV-LTR exprimieren können.
Weiterhin wurde jedes dieser Plasmide mit Sall-Hindill gespalten, wobei man einen Teil mit einer Expressionseinheit erhielt, der zur Expression von DHFR in das Plasmid pTB348 eingesetzt wurde, wobei ähnlich wie in dem oben beschriebenen Beispiel 3 (2) das SalI-HindIII-Fragment verwendet wurde, wodurch die Plasmide pTB1315 und pTB1316 aufgebaut wurden. Fig. 14 zeigt den Aufbau des Plasmids pTB1315.

(b) Expression in tierischen Zellen

Affen-COS7-Zellen wurden ähnlich wie in dem oben beschriebenen Beispiel 3 (2) mit dem Plasmid pTB1313 oder pTB1314 transfiziert. Die infizierten Zellen wurden in Form der Kulturüberstände, Zellextrakte und Zellrückstände durch Western-Blotting analysiert. Als Ergebnis wurden in den mit pTB1315 infizierten und den mit pTB1316 infizierten COS7-Zellkulturlösungen Produkte von etwa 50 bis 60 kD bzw. etwa 35 bis 50 kD nachgewiesen.
Die wasserlöslichen Muteine der tierischen Proteine mit FGF- Protein-Rezeptorwirkung eignen sich als therapeutische Mittel oder zur Verstärkung der Zellvermehrungsaktivität, indem sie Zellen, die nicht FGF-abhängig sind, Reaktivität mit den FGFs verleihen.

Beispiel 5

Reinigung der in E. coli erzeugten extrazellulären Domäne des FGF-Rezeptors

E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1289 wurde bei 37ºC in einem Medium kultiviert, das 35 µg/ml Ampicillin und 10 µg/ml Chloramphenicol enthielt. Als die Trübung Klett 120 erreichte, wurde Isopropyl-β- D-thiogalactosid bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM hinzugefügt, und die Kultur wurde noch 2 Stunden fortgesetzt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die mit Eis gekühlt war, gewaschen. Dann wurden die Zellen wiederum gewonnen und bis zur Verwendung bei -20ºC aufbewahrt.
Die E.-coli-Zellen, die aus 1 Liter der Kultur gewonnen wurden, wurden in 25 ml einer eisgekühlten Lösung [7 M Harnstoff, 0,1 M Tris-HCl (pH 8) und 10 mM Dithiothreitol (DTT)] suspendiert und 1 Stunde in Eis stehen gelassen.
Nachdem diese Lösung 1 Stunde mit 17 000 U/min zentrifugiert worden war, wurde der resultierende Überstand durch eine Q-Sepharose-Säule (2,5 cm Durchmesser mal 5 cm) geleitet, die mit einem Puffer (7 M Harnstoff, 0,1 M Tris-HCl (pH 8) und 1 mM DTT) äquilibriert war. Nach dem Waschen mit dem Puffer, der zum Äquilibrieren der Säule verwendet worden warf wurde die Säule 300 Minuten mit einem linearen Gradienten von 0 bis 1 M NaCl mit einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Minute eluiert, und alle 8 Minuten wurde eine Fraktion aufgefangen (Fig. 15). Jede Fraktion wurde nach dem Western-Blotting-Verfahren analysiert. Als Ergebnis wurde beobachtet, daß die extrazelluläre Domäne des FGF-Rezeptors BFR-2ex in den Fraktionen Nr. 10 und 11 eluiert wurde (ihre Aminosäuresequenz ist in Fig. 11 gezeigt)
Diese eluierten Fraktionen der Q-Sepharose-Säule wurden weiterhin durch eine Sephacryl-S-200-Säule (2,5 cm Durchmesser mal 100 cm) geleitet, die mit einem Puffer (7 M Harnstoff, 0,1 M Tris-HCl (pH 8), 0,3 M NaCl und 2 mM DTT) äquilibriert war, wobei eine Gelfiltration mit einer Fließgeschwindigkeit von 40 ml/Stunde durchgeführt wurde. Die so erhaltenen Ergebnisse zeigten, daß die extrazelluläre Domäne des FGF-Rezeptors BFR-2ex an der Stelle eluiert wurde, die einem Molekulargewicht von etwa 32 000 entsprach. Die resultierende Fraktion zeigte bei der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese beim Anfärben mit Coomassie-Blau eine einzelne Bande.

Beispiel 6

Aufstellung von CHO-Zellstämmen, die extrazelluläre Domänen von FGF-Rezeptoren erzeugen

Die in Beispiel 4 (3) (a) beschriebenen Expressionsplasmide pTB131S und pTB1316 wurden jeweils nach dem Calciumphosphatverfahren [Graham et al., Virology 52, 456 (1973)] in CHO-dhfr&supmin;- Zellen [Urlanb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)] eingeführt.
Nach zwei Tagen wurde das Medium durch ein Selektionsmedium (DMEM, das 10% dialysiertes Kälberfetusserum und 35 µg/ml Prolin enthielt) ausgetauscht, und die Kultur wurde fortgesetzt, um Transformanten zu erhalten, die sich als dhfr&spplus; vermehrten.
Diese CHO-dhfr&spplus;-Zellen wurden nach dem Verfahren der einschränkenden Verdünnung kloniert, und für die jeweiligen CHO-Zellen, die durch Transfizieren der jeweiligen Plasmide erhalten wurden, wurden 24 Klone aufgestellt.
Dann wurde jeder CHO-dhfr&spplus;-Klon zuerst in DMEM (das 5% Kälberfetusserum und 35 µg/ml Prolin enthielt), das 0,1 µM Methotrexat (MTX) enthielt, kultiviert, und Zellen, die durch Genamplifikation eine MTX-Resistenz erwarben, wurden herausselektiert.
Danach wurden der Reihe nach 1 µM MTX-resistente Zellen und 10 µM MTX-resistente Zellen selektiert.
Bei den jeweiligen so erhaltenen CHO-dhfr&spplus;-Zellklonen und deren MTX-resistenten Zellstämmen wurden extrazelluläre Domänen von FGF-Rezeptoren, die in die Kulturlösungen sezerniert wurden, unter Verwendung des Western-Blotting-Verfahrens nachgewiesen, wodurch die erzeugten Zellstämme durchmustert wurden. Jeder Zellstamm, der sich auf einer Platte mit 24 Vertiefungen zu einer Konfluenz von 80% vermehrte, wurde 3 Tage in DMEM/Ham-Medium (1:1) kultiviert, das 0,5% Kälberfetusserum und 10 µg/ml Insulin enthielt. Nach einer SDS-PAGE wurden 0,5 ml dieser Kulturlösung [Fällung mit 5% Trichloressigsäure (TCA)] dem Western-Blotting- Verfahren unterzogenl wobei der in Beispiel 3 (b) beschriebene polyklonale Kaninchen-Antikörper als primärer Antikörper verwendet wurde.
Die Ergebnisse zeigten, daß die Zellen CHO 1315-115, CHO 1315-123 und CHO 1315-1023 (IFO 50326, FERM BP-3362), die durch Transfizieren von pTB131S als 1 µM oder 10 µM MTX-resistente Zellen erhalten wurden, FGF-Rezeptor-Zelldomänen (BFR-lex) von 60 bis 70 kD (deren Aminosäuresequenz in Fig. 12 gezeigt ist) erzeugten und sezernierten. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die Zellen CHO 1316-161, CHO 1316-172 (IFO 50327, FERM BP-3363) und CHO 1316-1053, die durch Transfizieren von pTB1316 als 1 µM oder 10 µM MTX-resistente Zellen erhalten wurden, extrazelluläre Domänen von FGF-Rezeptoren (BFR-2ex) von 40 bis 50 kD erzeugten und sezernierten.
Die CHO-Zellinie, die BFR-lex oder BFR-2ex erzeugte, wurde in Anwesenheit oder Abwesenheit von Tunicamycin (5 µg/ml) kultiviert, wobei ³&sup5;S-Methionin (1000 Ci/mmol, 50 µCi/ml) hinzugefügt wurde, und das ³&sup5;S-Methionin-markierte Protein in der Kulturlösung wurde einer Immunfällung unterworfen, wobei der oben erwähnte polyklonale Kaninchen-Antikörper verwendet wurde, und anschließend wurde mit SDS-PAGE analysiert. Als Ergebnis wurde nahegelegt, daß das 46-kD-Protein für BFR-lex, das von diesen transformanten CHO-Zellen erzeugt wurde, zu einem 70-kD-Protein glycosyliert wurde und daß das 35-kD-Protein für BFR-2ex zu einem 45-kD-Protein glycosyliert wurde.
Auf die folgenden Literaturstellen, auf die an verschiedenen Stellen dieser Anmeldung wegen ihrer Offenbarungen verwiesen wird, wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 237 966
Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 281 822
Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 326 907
Europäisches Patent Veröffentlichungs-Nr. 394 951
Nucleic Acids Research 18, 1906 (1990)
The EMBO Journal 9, 2685 (1990)
Molecular and Cellular Biology 8, 5541-5544 (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4378-4382 (1990)
Science 245, 57-60 (1989)
Genetic Engineering, Academic Press, p.31-50 (1983)
Genetic Engineering: Principles and Methcds, Plenum Press, vol. 3, p.1-32 (1981)
Catalogue of Cell Lines & Hybridomas, 5th edition (1985), published by ATCC Biochemistry 18, 5294 (1979)
Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1982)
Molecular and Cellular Biology 3, 280 (1983)
Gene 2, 95 (1977)
Gene 4, 121 (1978)
Gene 19, 259 (1982)
Methods in Enzymology 153, 3-11 (1987)
Biochemical and Biophysical Research Ccmmunication 112, 676 (1983)
Molecular Cloning, Cold Spring Laboratory, p.239 (1982)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60, 160 (1968)
Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)
Journal of Molecular Biology 120, 517, (1978)
Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)
Genetics 39, 440 (1954)
Gene 24, 255 (1983)
Journal of Biochemistry 95, 87 (1984)
Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, p.249 (1982).
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 560 (1977)
Nucleic Acids Research 1, 1513 (1979)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)
Gene, 17, 107 (1982)
Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)
Virology, 52, 456 (1973)
Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)
Science, 122, 501 (1952)
Virology, 8, 396 (1959)
Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)
Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)
DNA Cloning, A Practical Approach, p.49, IRL Press, Oxford (1985)
DNA Cloning, A Practical Approach, p.79, IRL Press, Oxford (1985)
Molecular Cloning, p.320, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)
Science 7, 57 (1989)
Molecular Cloning, p.309, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)
Cell Struct. Funct. 12, 205-217 (1987)

Claims

1. Wasserlösliches Mutein des Rezeptors für den Fibroblasten- Wachstumsfaktor (FGF), wobei dem Mutein entweder (1) eine Aminosäuresequenz, die der Transmembrandomäne des reifen FGF-Rezeptors entspricht, oder (2) Aminosäurereste vom C-Terminus der Transmembrandomäne des reifen FGF-Rezeptors fehlen.

2. Wasserlösliches Mutein gemäß Anspruch 11 das die in Fig. 11 gezeigte Aminosäuresequenz enthält.

3. Wasserlösliches Mutein gemäß Anspruch 1, das die in Fig. 12 gezeigte Aminosäuresequenz enthält.

4. Rekombinante DNA, die eine Nucleotidsequenz aufweist, die für das wasserlösliche Mutein gemäß einem der Ansprüche 1-3 codiert.

5. Vektor, der die rekombinante DNA gemäß Anspruch 4 enthält.

6. Transformante, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 5 transformiert ist.

7. Transformante gemäß Anspruch 6, die die Merkmale von E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1289 aufweist.

8. Transformante gemäß Anspruch 6, die die Merkmale von E. coli MM294 (DE3)/pLysS, pTB1290 aufweist.

9. Verfahren zur Herstellung des wasserlöslichen Muteins gemäß Anspruch 1, das das Kultivieren der Transformante gemäß Anspruch 6 in einem Kulturmedium umfaßt.