WO2001012807A1 - ADN COMPLEMENTAIRE MODIFIE DU GENE bcl-xL DU RAT - Google Patents

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WO2001012807A1
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modified
cdna
protein
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Shigeo Ohta
Sadamitsu Asoh
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Japan Science And Technology Corporation
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
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    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention of this appearance relates to a modified cDNA and a modified protein of the rat bd-x gene. More specifically, the invention of this application relates to a modified protein Bcl- having higher apoptosis-suppressing activity and cell death-suppressing activity than the protein Bcl-xL expressed by the rat apoptosis-suppressing gene bcl-x.
  • the present invention relates to a novel cDNA expressing xL, a material for utilizing the cDNA in genetic engineering, and a modified protein Bcl-xL expressed by the cDNA. Background art
  • Apoptosis is a type of programmed cell death that results in a lack of contact with surrounding cells, cytoplasmic enrichment, chromatin condensation and nuclear condensation associated with endonuclease activity, and nuclear fragmentation.
  • Nucleosomal unit 180-200 bases long DNA fragmentation due to endogenous, membrane-encapsulated spheroids, phagocytosis of spherules by adjacent macrophages or epithelial cells, or end-nuclease activity This phenomenon has been discussed as a mechanism by which the final fragment of apoptotic bodies in which such a phenomenon is observed is phagocytosed by neighboring cells (eg, Immunology Today 7: 115-119, 1986; Science). 245: 301 -305, 1989).
  • genes that regulate this apoptosis include the bcl-2 gene (Science 226 (4678): 1097-1099, 1984; Pro), which is one of the oncogenes found in human follicular B cell tumors. Natl. Acad. Sci. USA 81 (22): 7166-7170, 1984) is known, and its gene structure and transcript analysis or cDNA clones have been reported (Pro. Natl. Acad. Sci. USA 83 (14): 5214-5218, 1986; Cell 47 (1): 19-28, 1886).
  • This bcl-2 gene is frequently expressed in the immune system and nervous cells, and the expression product of this gene suppresses apoptosis of these cells, resulting in the immune function of humans and the nervous system. It is thought to maintain the homeostasis of Noh. Since the bcl-2 gene is expressed particularly widely in the fetus, it is thought that it plays an important role in morphogenesis during ontogeny.
  • the present inventors also cloned the rat bcl-x gene as a homolog of the human bcl-x gene belonging to the bcl-2 family (Cell 74 (4): 597-608, 1993) ( ⁇ Biol. Chem. 271 (22): 13258-13265, 1996), and the three-dimensional structure of the protein Bcl-xL expressed by the rat bcl-x gene has been determined by X-ray analysis ( ⁇ Biol. Chem. 272 (44): 27886-27892, 1997).
  • the inventors of the present application studied amino acid substitution that could change the three-dimensional structure of rat Bcl-xL in order to further enhance the apoptosis-suppressing effect, and as a result, substituted a specific amino acid with another amino acid.
  • modifying the cDNA of the bcl-x gene in such a way that the modified cDNA was expressed in cells it was found that cell death including cell apoptosis was remarkably suppressed.
  • the invention of this application was made based on such novel findings by the inventors, and provided a modified cDNA capable of expressing the novel modified rat Bcl-xL protein in cells. The challenge is to do.
  • Another object of the present application is to provide a recombinant vector having the modified cDNA and a transformed cell using the recombinant vector.
  • the object of the present application is to provide a modified protein expressed by the modified cDNA. Disclosure of the invention
  • Figure 1 is a schematic diagram of the structure of wild-type rat Bcl-xL.
  • Figure 2 shows a Western plot of the expression of the modified Bcl-xLFNK in transformed cells. It is the result of the analysis.
  • Figure 3 shows the results of a test of the resistance of transformed cells to apoptosis induced by serum deprivation.
  • FIG. 4 shows the results of a resistance test of the transformed cells against an anti-Fas antibody (anti-Fas).
  • FIG. 5 shows the results of a test of the resistance of the transformed cells to staurosporine.
  • FIG. 6 shows the results of a test of the resistance of the transformed cells to TN-16.
  • FIG. 7 shows the results of a test on the resistance of transformed cells to camptodin.
  • FIG. 8 shows the results of a test on the resistance of the transformed cells to hydroxyreurea.
  • FIG. 9 shows the results of a test of the resistance of the transformed cells to trichostatin A.
  • FIG. 10 shows the results of a test of the resistance of the transformed cells to hydrogen peroxide.
  • FIG. 11 shows the results of a resistance test of transformed cells against paraquat.
  • FIG. 12 shows the results of a test on the resistance of the transformed cells to heat.
  • Figure 13 shows the results of the WST-1 Assay in which the transformed cells after heat treatment were examined for dehydrogenase activity.
  • Figure 14 shows the results of the WST-1 Assay for examining the dehydrogenase activity of the transformed cells after TN-16 treatment.
  • Figure 15 shows the results of the WST-1 Assay in which the transformed cells after staurosporine treatment were examined for dehydrogenase activity.
  • FIG. 16 shows the results of a test on the resistance of the transformed cells to apoptosis induced by removal of the site force in 1-3.
  • FIG. 17 is a micrograph showing the state of growth of the transformed CHO cells in a serum-free medium.
  • FIG. 18 is a micrograph showing the state in which the TAT-Bcl-xFNK protein has been incorporated into HeLa cells.
  • FIG. 19 is a photomicrograph of a cartilage tissue culture cell cultured for 5 days in a medium containing the TAT-Bcl-xFNK protein.
  • FIG. 20 is a micrograph of a cartilage tissue culture cell cultured for 9 days in a medium containing TAT-Bcl-xFNK protein.
  • Figure 21 shows cartilage tissue culture cells cultured for 5 days in a medium containing Bd-xFNK protein. It is a microscope picture.
  • FIG. 22 is a micrograph of cartilage tissue culture cells cultured in a medium containing Bcl-xFNK protein for 9 days.
  • Figure 23 is a micrograph of cartilage tissue culture cells cultured for 5 days in a medium containing a solvent (PBS).
  • Figure 24 is a micrograph of cartilage tissue culture cells cultured in a medium containing a solvent (PBS) for 9 days.
  • FIG. 25 is a micrograph of a liver section of a mouse to which dexamethasone was administered after systemic administration of the TAT-Bcl-xFNK protein.
  • FIG. 26 is a micrograph of a liver section of a mouse to which dexamethasone was administered after systemic administration of a solvent (PBS).
  • PBS solvent
  • FIG. 27 is a micrograph of a liver section of a mouse to which only the solvent (PBS) was systemically administered.
  • the 22nd Tyr codon (tac) is replaced with the Phe codon (ttt) in the cDNA sequence of the rat bcl-x gene whose nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 1. / ttc), 26th Gin (cag) to Asn codon (aat aac), 165th Arg codon (egg) to Lys codon (aaaZaag)
  • the modified cDNA of the present invention (1) has base substitution at all of the three sites described above.
  • the modified protein Bcl-xFNK whose amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 3 is expressed.
  • This modified protein, Bcl-xFNK has the same structure as that of wild-type rat Bcl-xL, whose structural schematic is shown in Figure 1, at the 22nd Tyr and 156th Asp; The hydrogen bond of each of the Arg and the 16th Pro has disappeared as a result of the amino acid substitution (Tyr22Phe: Gln26Asn: Arg165Lys) generated by the aforementioned base substitution.
  • This modified cDNA can be prepared by using the rat bd-x gene cDNA as a type II by a known method using a mutation kit or the like, or by the PCR method described in Examples below. Can be. Plasmid pEF1-BOSbcl-x (J. Biol. Chem. 271 (22): 13258-13265, 1996) can be used for the cDNA of the rat bcl-x gene. Alternatively, oligo nucleotides can be synthesized based on the nucleotide sequence of any part of SEQ ID NO: 1 and used as a probe to screen a rat cDNA library, or hybridized to both ends of the target cDNA fragment.
  • Oligonucleotides can be synthesized and used as a primer to prepare RNA isolated from rat cells by RT-PCR.
  • the inventions (2) and (3) of this application are DNA fragments (polynucleotides) in which an oligonucleotide encoding a cell membrane transit peptide is linked to the 5 ′ side of the modified cDNA of the invention (1). These DNA fragments can be used to prepare a modified protein Bcl-xL described below.
  • the recombinant vector of the invention (4) of the present application may be a cell to be introduced (e.g., prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as yeast, insect cells, mammalian cells, and plant cells).
  • the expression vector can be prepared by selecting an appropriate expression vector according to the above, and incorporating the modified cDNAs of the inventions (1) to (3). For example, when a microorganism such as Escherichia coli is targeted, the DNA cloning site of an expression vector having an origin, a promoter, a ribosome binding site, a terminator, and the like, which can be replicated in the microorganism, is described in (1) to (3) above.
  • the recombinant vector of the invention (4) is used using an eukaryotic cell expression vector having a promoter, a splicing region, and a poly (A) addition site. Can be created.
  • the transformed cell of the invention (5) of this application is a cell into which the recombinant vector of the invention (4) has been introduced and which expresses the modified protein Bcl-xL.
  • Examples include all cells that can be transformed by the recombinant vector (4), such as prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, and eukaryotic cells such as yeast, insect cells, mammalian cells, and plant cells.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis
  • eukaryotic cells such as yeast, insect cells, mammalian cells, and plant cells.
  • Known methods can be used to introduce the recombinant vector into cells.
  • an electroporation method a calcium phosphate method, a ribosome method, a DEAE dextran method, or the like can be used.
  • mammalian cells can be proliferated in a serum-free medium as shown in the examples described later. That is, in general, serum containing a growth factor (such as fetal bovine serum) must be added to the medium to allow the cultured cells to survive for a certain period of time. Growth factors can suppress cell apoptosis and prolong survival.
  • a growth factor such as fetal bovine serum
  • the medium does not contain impurities such as serum. This is because the cost and process for purifying the target substance are increased, and there is a risk that serum or other risk factors may be contaminated in the serum.
  • a serum-free and protein-free medium that does not use serum is used for the culture medium.
  • the growth of cells is low and many dead cells are present.
  • the transformed mammalian cell of the invention (5) can be cultured for a long period of time without apoptosis even in the absence of growth factors such as serum by expressing the modified protein Bcl-xL.
  • cell lines can be obtained due to such excellent proliferation ability.
  • the modified protein Bd-xL of the invention (6) is a protein expressed by the modified cDNA of the invention (1), and the 22nd Tyr in the Bd-xL having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is represented by Phe.
  • At least one of the following amino acid substitutions is selected from: an amino acid substitution that converts the 26th Gin to Asn, and an amino acid substitution that converts the 165th Arg to ys.
  • Bcl-xFNK comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 having all of these amino acid substitutions is the most preferred embodiment.
  • This modified protein can be isolated and purified by culturing the transformed cell of the invention (5) and combining the culture with a known separation operation.
  • a denaturant such as urea or a surfactant, sonication, enzymatic digestion, salting out / solvent precipitation, precipitation, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing Ion chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reversed-phase chromatography, and the like.
  • the modified protein can be used, for example, as an active ingredient of an apoptosis inhibitor or a lead compound thereof, and further, a peptide capable of passing a cell membrane is linked to the N-terminal side of the modified Bcl-xL. Is preferred.
  • the modified protein Bcl-xL is taken up into the cell through the cell membrane and can exhibit a function of temporarily suppressing apoptosis and cell death in the cell. And by having such a cell membrane crossing function, it can be used for the following applications, for example.
  • oligopeptide of SEQ ID NO: 12 is the PTD (protein transduction domain) of HIV-1 ⁇
  • the oligopeptide of SEQ ID NO: 13 is the PTD of the Drosophila homeobox protein antenna.
  • the amino acid sequence and the nucleotide sequence of the cDNA of these peptide transmembrane peptides are known (Science, 285: 1569-1572, 1999; GenBank Accession NO. U39362 96155). Then, a DNA fragment encoding a region corresponding to the PTD (amino acid sequence Nos. 47 to 57 of HIV-TAT) is ligated to the modified cDNA of the above invention (1) to produce a fusion DNA fragment (invention (3)).
  • a modified protein-translocating Bcl-xL in which a PTD peptide is linked to the N-terminal side can be prepared.
  • PTDs of anti-media are also known (for example, GenBank Accession No. AE001573), and modified proteins in which PTDs are fused can be prepared in the same manner.
  • a modified Bcl-xL in which a cell membrane transit peptide is linked by a method of binding the modified Bcl-xL to a PTD peptide via a divalent cross-linking agent e.g., EDC or alanine
  • Rat Bcl-xL cDNA clone pEF1 -B ⁇ Sbcl-x ( ⁇ Biol. Chem. 271: 13258-13265, 1996) was used as a template (type)) and two DNA fragments (bcl-xR165K Bcl-xY22F / Q26N), and finally by binding the predetermined regions of these DNA fragments, amino acid substitution at three sites (Tyr22Phe : Gln26Asn : Arg165Lys)
  • the modified cDNA bcl-xFNK into which was introduced was prepared.
  • DNA fragments A, B were synthesized by PCR in order to prepare a bet XR165K into which Arg165Lys substitution was introduced.
  • the primer 1 shown in SEQ ID NO: 4 was used as the 5 ′ primer
  • the primer 1 shown in SEQ ID NO: 5 was used as the 3 ′ primer.
  • Primer 1 contains a part of the base sequence of the vector upstream of the translation region of bcl-x cDNA. It also contains a restriction enzyme BamHI cleavage site.
  • Primer 2 replaced the Arg165 codon with Lys coding in the antisense sequence of the bcl-x cDNA.
  • Primer-3 is the sense sequence of the bcl-x cDNA, in which the codon of Arg165 has been base-substituted to encode Lys, and the 5 'half base sequence is complementary to the 5' half base sequence of primer 2. It is a target.
  • Primer 4 is the antisense sequence of the bci-x cDNA, which corresponds to amino acid residues 178 to 184 of its translated region. It also contains a cleavage site for the restriction enzyme BamHI.
  • Primer 1 and Primer 2 combination areaired primers: Primer 1 and Primer 2 combination, Primer 3 and Primer 4 combination (each primer 1 ⁇ )
  • Reaction condition 1 94 ° C / 10 minutes; (94 ° C / 30 seconds; 53 ° C / 30 seconds; 72 ° C / 1 minute) x 15
  • the two PCR products amplified by PCR were purified by polyacrylamide gel electrophoresis, two DNA fragments (6 ng each) were mixed, and the complementary strand was synthesized using AmpliTaqGOLD.
  • the conditions for the synthesis were the same as the above-mentioned reaction condition 2.
  • PCR reaction solution 75 ⁇ I containing Primer 1 and Primer 4 (final concentration: 1 ⁇ M each) and AmpliTaqGOLD (2.5 U) was added, and PCR was performed under reaction condition 1.
  • the 650 bp PCR product was purified by polyacrylamide gel electrophoresis and treated with the restriction enzyme BamHI.
  • pEF1-B ⁇ Sbcl-x was treated with BamHI to prepare two DNA fragments (5650 bp and 650 bp), and the PCR product was ligated to a long DNA fragment (5650 bp) in the forward direction.
  • a clone pEF1-BOSbcl-xQ26N having a Gln26Asn mutation was obtained.
  • —7 is the antisense sequence of the bcl-x cDNA in which the Tyr22 codon has been base-substituted to encode Phe.
  • Primer 18 is the sense sequence of bcl-x cDNA, in which the Tyr22 codon is base-substituted to encode Phe, and the 5 'half base sequence is the 5' half base of primer 7 Complementary to the sequence.
  • the two PCR products amplified by this PCR were purified by polyacrylamide gel electrophoresis, the two DNA fragments (6 ng each) were mixed, and the complementary strand was synthesized using AmpliTaqGOLD.
  • the synthesis conditions were the same as the above-mentioned reaction condition 2.
  • PCR was carried out under a PCR reaction solution (75 ⁇ I) containing Primer 1 and Primer 4 (final concentration: 1 M each) and AmpliTaqGOLD (2.5 U), and the aforementioned reaction conditions 1.
  • the 650 bp PCR product obtained by this PCR was purified by polyacrylamide gel electrophoresis, and treated with the restriction enzyme BamHI.
  • pEF1-BOSbcl-x was treated with BamHI to prepare two new DNA fragments (5650 bp and 650 bp), and the above PCR product was ligated to a long DNA fragment (5650 bp) in the forward direction.
  • pEF1-BOSbcl-xR165K and pEF1-BOSbcl-xY22F / Q26N were digested with two types of restriction enzymes (BglII and KpnI), respectively, and pEF1-BOSbcl-xx22F / Q26N Approximately 1000 bp Bglll / Kpn IDNA fragment (with Tyr22Phe and Gln26Asn mutations) and pEF1-BOSbcl-xR165K-derived 5300 bp CD Bglll / Kpn IDNA fragment (with Arg165Lys mutation) As a result, a recombinant vector pEF1-B ⁇ Sbcl-xY22F / Q26N / R165K of a modified cDNA encoding the modified protein Bcl-xFNK was obtained.
  • Example 2 Preparation of transformed cells
  • FDC-P1 Mouse promyeloblast cells, FDC-P1 were cultured in RPMM640 medium supplemented with fetal calf serum (10 ° /.) And cytokine IL-3 (WEHI cell culture supernatant). Human leukemia cells Jurkat cells were cultured by adding fetal calf serum (10%) to RPMI1640 medium. Culturing was carried out in C_ ⁇ 2 incubator base over data one (5 ° / .C_ ⁇ 2/95% air, 37 ° C).
  • the recombinant vector pEF1-BOSbcl-x ⁇ 22F / Q26N / R 165 K created in Example 1 It was amplified in the fungus DH5a MCR (G old CO BR) and prepared using the Qiagen Plasmid midi Kit (Qiagen). The DNA was cleaved with the restriction enzyme Sea I (single cleavage site) and opened to form a linear DNA, which was dissolved in 1 mM EDTA solution.
  • ⁇ phase cells FDC-P1 or Jurkat, ice cold K-PBS solution (30.8 mM NaCI, 120.7 mM KCI , 8.1 mM Na 2 HP0 4, 1.46 mM KH 2 P0 4) was washed three times with, 5 mM MgCl 2 was suspended at 10 7 cells Zml to including K-PBS (Mg-K- PBS) and.
  • the expression level of the modified Bd-xFNK expressed in the transformed cells prepared in Example 2 was analyzed by Western blotting.
  • Cells PBS pH7.4; NaCI 137 mM, Na 2 HP0 4 8.1 mM, KCI 2.68 mM, KH 2 P_ ⁇ 4 1 .47 mM
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • blotting was performed on a PVDF membrane (Amersham Pharmacia Biotec). The membrane was blocked with fetal calf serum (10%), and a TBS solution (Tris-Hcl) containing mouse monoclonal antibody 105-1 (0.5 ⁇ g / ml) recognizing the C-terminal region of rat Bcl-x pH 7.4 20 mM, NaCI 136 mM, Tween80 0.2%) and kept at 37 ° C for 1 hour. After thoroughly washing with TBS, HRP (Horseradish peroxidase) or AP (alkaline phosphatase) bound to a TBS solution containing a secondary antibody and incubated at 37 ° C for 1 hour.
  • TBS Tris-Hcl
  • HRP-conjugated secondary antibodies use a RENAISSANCE kit (NEN Life Science Product) for X-ray film, and for AP-conjugated secondary antibodies, use an ATTOPHOS kit (Boehringer) for fluoro image analyzer. Bcl-xL and Bcl-xFNK were visualized and quantified using FLA-2000 (Fujifilm).
  • the results are as shown in FIG.
  • the cells transfected with the recombinant vector pEF1-BOSbcl-xFNK have the same molecular weight as the cells transfected with the wild-type bcl-xL clone pEF1-B ⁇ Sbcl-xL.
  • the transformed cell Jurkatbcl-xFNK prepared in Example 2 was tested for resistance (insensitivity) to various apoptotic triggers. The results are shown in Figs. In these figures, open circles ( ⁇ ) indicate the transfectant Jurkatbcl-xFNK expressing modified Bcl-xFNK, and solid circles (see) indicate normal Bcl-xL expressing the same amount of protein. Transformant Jurkatbc x, open squares (mouth) indicate Jurkatvec into which only vector plasmid DNA has been introduced, and open diamonds ( ⁇ ) indicate the parent strain Jurkat used for gene transfer.
  • the cells were suspended in a serum-free medium RPMI1640 at 1 ⁇ 10 5 cells / ml. Incubated at C 0 2 incubator, was your go-between measure the day the number of cells not stained with trypan blue (live cells). Number of viable cells careful not exceed 5 X 1 0 5 ml, when exceeded likely was diluted medium twice. Every third day, half of the medium without serum was replaced with fresh one.
  • Each cell was suspended in RPMI 1640 medium at 1 ⁇ 10 5 cells / ml, and anti-Fas antibody (Clone CH-11: MBL) was added at 1, 10, 100, and 1000 ng / ml. Added at a concentration. After culturing for one day, the number of cells (viable cells) not stained with trypan blue was counted.
  • Each cell was suspended in RPMI 1640 medium at 1 x 10 5 cells / ml, and staurosporine (staurosporine: 20 nM) ⁇ - 16 (10 ⁇ ), camptothecin (camptothecin: 10 ⁇ ), chick Droxidurea (hydroxyurea: 1 mM), trichostatin A (trichostatin A: 0.25 ⁇ g / ml), hydrogen peroxide (hydrogen peroxide: 0.05 mM), and noracoat (paraquat: 1 mM) were added and cultured. The number of cells (viable cells) that did not stain with trypan blue was determined daily.
  • Each cell was suspended in RPMI 1640 medium at 1 ⁇ 10 5 cells / ml and treated at 45 ° C. for 10 minutes.
  • the cells were suspended in an equal volume of fresh medium by centrifugation, and cultured at 37 ° C.
  • the number of cells (viable cells) not stained with trypan blue was measured according to the statement and shown in FIG.
  • the activity of dehydrogenase in the cells was examined using the Cell Counting Kit (Wonin Chemical) using WST-1 as a substrate (WST-1 Assay), and untreated with heat Fig. 13 shows the enzyme activity of these cells as 100%.
  • the transformed cells FDC-P1 bcl-xFNK prepared in Example 2 were tested for resistance to various apoptotic triggers. The results are shown in FIGS. In these figures, the open squares, ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ indicate the five cloned transfectants FDC-P1 bcl-xFNK- 1, -2, -3, -4, -5. Show. References indicate transfectant FDC-P1 bcl-x expressing normal Bd-xL of the same protein level, and ⁇ indicates FDC-P1 vec into which only vector plasmid DNA was introduced.
  • Nigoshi S to the medium so that the respective cells 2 X 10 5 cells Bruno ml, and cultured with TN-16 a (50 M) and Sutauro Suporin (10 nM).
  • TN-16 a 50 M
  • Sutauro Suporin 10 nM
  • the activity of dehydrogenase in the cells was examined using the Cell Counting Kit (Dojindo) using EST-1 as a substrate (WST-1 Assay).
  • the enzymatic activity was defined as 100% immediately before adding the drug.
  • the cells were suspended in a medium (containing serum) containing no IL-3 at a concentration of about 5 cells / ml, and the number of viable cells was measured using trypan blue. The number of viable cells was measured on the birch day after day, and the number of viable cells immediately after IL-3 was removed was set as 100% in FIG.
  • other cells except FDC-P1 vec were diluted 5-fold with a fresh medium containing no IL-3 in the third statement.
  • Example 6 Preparation of transformed CHO cells Chinese hamster ovary cell CHO was transformed with the recombinant vector recombinant vector pEF1-BOSbcl-xY22F / Q26N / R165K prepared in Example 1.
  • CHO cells 1 X10 5 pieces of culture DMEM / F-12 (GIBCO BRL, Inc.) (to this suspended with 10% fetal bovine serum, 60-mm and over ⁇ cultured in dishes.
  • SuperFect Transfection Reagent Kit (Qiagen, Inc.) Using linearized pEF1-B ⁇ Sbci-x Y22F / Q26N / R165K (10 g) and linearized pST-neoB (0.5 g) carrying the drug Geneticin resistance gene to CHO cells
  • the linear vectors PEF1-BOS and pEF1-B ⁇ Sbcl-x were also introduced into CHO cells together with linear pST-neoB. The cells were cultured overnight in a culture solution containing fetal serum, DMEM / F-12.
  • the three types of transformed cells CH ⁇ bcl-xFNK, CHObcl-x and CHOvec prepared in Example 6 were used at 10 ° / ° C.
  • the cells were cultured in culture medium DMEM / F-12 containing fetal calf serum. 1 ⁇ 10 3 cells in the growth phase were subcultured on a 100-mm dish, and cultured in a culture solution DMEM / F-12 containing 3% fetal bovine serum. Each day, 23 of the culture was replaced with a culture medium without fetal bovine serum DMEM / F-12, and from day 5, the culture was completely cultured with a culture medium without fetal bovine serum DMEM / F-12. Culture was continued for another 6 days.
  • a peptide transmembrane peptide (PTD: Protein Transduction Domain) of the TAT protein of HIV virus is encoded into the modified cDNA encoding Bcl-xFNK cDNA prepared in Example 1.
  • the cDNA was fused.
  • Recombinant vector pEF1 -BbSbcl-x / 22F / Q26N / R165K encoding Bcl-xFNKcDNA was type III, primer 9 (SEQ ID NO: 14) was used as the 5 'primer, and primer 10 was used as the 3' primer. (Sequence number 15) was used.
  • Primer 9 has a sense sequence at the 3 'end of TAT-PTD cDNA and a 5' end including the initiation codon of Bcl-xFNK cDNA.
  • Primer 10 is a 3'-end antisense sequence containing the termination codon of Bcl-xFNK cDNA and has a restriction enzyme HindIII cleavage site. The details of the PCR reaction are as follows.
  • the amplified DNA fragment was purified by polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the purified DNA fragment 25 ng was mixed with the primer 11 (SEQ ID NO: 16) in the above PCR reaction solution (25 ⁇ ), and the complementary strand was synthesized using AmpliTaqGOLD.
  • Primer 16 sandwiched the amino acid sequence of TAT-PTD shown in SEQ ID NO: 12, encoded Met (starting codon) -Gly at the 5 'end, Gly at the 3' end, and further encoded Bcl-xFNKcDNA. It contains the 5'-end sense sequence including the start codon.
  • the synthesis conditions were as follows.
  • Primer 12 is a sense sequence containing the N-terminal three amino acids of TAT-PTD following Met-Gly, and has a cleavage site for the restriction enzyme Nde I at the 5 'end.
  • the amplified DNA fragment was purified by polyacrylamide gel electrophoresis. After cutting at Nde I, Was cut with T4 DNA polymerase and cut with Hind III.
  • Escherichia coli expression vector pR (EX1 (Life Technologies) was cut with coI, the cut section was smoothed with nuclease S1, and then cut with HindIII. The two DNAs were ligated to obtain a recombinant vector pROEX1 -bd-x ⁇ 22F / Q26N / R165K encoding TAT-Bcl-xFNK in which the TAT protein transmembrane peptide was fused to the N-terminal.
  • EX1 Escherichia coli expression vector pR
  • TAT-Bcl-xFNK protein was prepared from the soluble fraction after cell disruption and the insoluble fraction (inclusion bodies), respectively.
  • the soluble fraction was prepared as follows. After harvesting, the cells were washed three times with PBS and suspended in 40 ml of buffer A (50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF), and Escherichia coli cells were ultrasonically disrupted. TAT-Bcl-xFNK from the supernatant after centrifugation.An antibody affinity chromatography using a column packed with a monoclonal antibody 35-32 that recognizes the N-terminal region of Bd-xL bound to a carrier.
  • TAT-Bcl-xFNK was eluted with an eluate (50 mM Glycine-Hcl, pH 2.7, 50 mM NaCI). After neutralization with a 2 M Tris-HCI (pH 9.0) solution, the mixture was concentrated with Centricon (Amicon). It was dialyzed against PBS to obtain a protein II product. Preparation from the insoluble fraction (inclusion body) was as follows.
  • TAT-Bcl-xFNK protein preparation Purity of 70 ⁇ -on SDS-polyacrylamide gel electrophoresis It was confirmed to be a TAT-Bcl-xFNK protein preparation and used in the following experiments.
  • Example 10 Uptake of TAT-Bcl-xFNK protein into cells
  • the cells were treated with a 1.5 ° / o FBS-PBS solution containing monoclonal antibody 35-32 (derived from mouse) against rat Bcl-xL for 30 min. After washing three times with PBS (5 minutes / time), the cells were treated with a 1.5% FBS-PBS solution containing an anti-mouse IgG antibody to which FC was bound for 30 minutes. After washing three times (5 min / time) with PBS, cells were encapsulated with a PBS solution and observed with a fluorescence microscope.
  • Example 11 1 Introduction of TAT-Bcl-xFNK into cultured cartilage tissue cells and confirmation of cell death inhibitory effect
  • Cartilage aseptically with single-edged razor from femoral head excised by head replacement surgery in patients with osteoarthritis The cartilage tissue above the lower bone was cut into slices (1 O 10 mm thickness 1-2 mm). Insert a 24-well plate, 20% FBS ( ⁇ shea fetal serum) 37 ° in DMEM / Ham F-12 mixed medium containing (by ife Technologies, Inc.) C, were cultured in C_ ⁇ 2 incubator.
  • FBS ⁇ shea fetal serum
  • TAT-Bcl-xL expression vector was prepared in the same manner as for TAT-Bcl-xFNK, and the TAT-Bcl-xL protein was partially purified from E. coli (the purity of the protein sample was the same).
  • TAT-Bcl-xFNK prepared from inclusion body
  • TA-Bcl-xL prepared from inclusion body
  • PBS the solvent used for the protein preparation
  • TAT-Bcl-xFNK inhibited chondrocyte death more than TAT-Bcl-x, and the difference was remarkable in cartilage tissue cultured for 9 days. It was shown that TAT-Bcl-xFNK protein in the medium was taken up by chondrocytes buried in cartilage tissue and exerted its strong cell death inhibitory activity.
  • Example 12 Administration of TAT-Bcl-xFNK to mice and confirmation of the effect of spheroid hormone on the suppression of liver cell death
  • mice Twenty g female C56BL female were divided into three groups (A, B, C).
  • the mice in group A were intraperitoneally administered a PBS solution (0.8 ml) containing 100 TAT-Bcl-xFNK proteins (prepared from the soluble fraction).
  • the mice in groups B and C (control) were similarly intraperitoneally administered a PBS solution (0.8 ml).
  • mice in groups A and B were intraperitoneally administered with 0.5 ml of a 25 ⁇ petanol / PBS solution in which 0.5 mg of steroid hormone (dexamethasone) was dissolved.
  • the mice in group C were intraperitoneally administered with 0.5 ml of a 25% ethanol / PBS solution.
  • liver was excised, frozen, sectioned with a cryostat, and assessed for parenchymal cell death by hematoxylin and eosin staining.
  • TAT-Bcl-xFNK protein administered intraperitoneally is taken up by parenchymal cells of the liver and strongly suppresses dexamethasone-induced cell death.
  • a modified rat Bcl-x protein having a further enhanced cell death-inhibiting action can be expressed in a cell.
  • the present invention provides a cDNA, a recombinant vector having the modified cDNA, and a cell transformed by the recombinant vector.
  • the transformed cells can be proliferated in a serum-free medium, and are useful, for example, as a cell culture system for efficiently producing useful substances such as physiologically active substances and monoclonal antibodies.
  • the invention of this application provides a modified rat Bd-xL protein having a further enhanced cell death suppressing effect.
  • This modified protein is incorporated into cells by providing a peptide that passes through the cell membrane, and temporarily exhibits apoptosis and cell death inhibitory effects in cells. It is effective as a therapeutic agent and as an ingredient of additives for stably maintaining transplanted cells and organs.

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Description

明細 ラッ ト bcl-x遺伝子の改変型 cDNAと改変型タンパク質 技術分野
この出顔の発明は、 ラット bd-x遺伝子の改変型 cDNA と改変型タンパク質に関す るものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 ラッ トのアポトーシス抑制遺 伝子 bcl-xが発現するタンパク質 Bcl-xLよりもさらに高いアポト一シス抑制活性、 細 胞死抑制活性を有する改変型タンパク質 Bcl-xL を発現する新規な cDNA と、 この cDNAの遺伝子工学的利用のための材料、 さらにはこの cDNAが発現する改変型タン パク質 Bcl-xLに関するものである。 背景技術
アポトーシス （apoptosis) は、 プログラムされた細胞死の一種であり、 周囲の細 胞との接触の欠乏、 細胞質の濃縮化、 エンドヌクレアーゼの活性に関連したクロマ チンの凝縮および核凝縮、 核の靳片化、 膜被包性球状小体化、 隣接するマクロファ ージもしくは上皮細胞などによる球状小体の貪食、 またはェンドヌクレア一ゼ活性 によリ DNAのヌクレオソーム単位が 180~ 200塩基長の DNAに断片化するといった 現象が観察され、 このような現象が認められるアポトーシス小体の最終断片が隣接 する細胞により貪食される機構として論じられている （例えば、 Immunology Today 7:1 15-1 19, 1986； Science 245:301 -305, 1989) 。
このアポト一シスを制御する遺伝子としてしては、 例えば、 ヒ ト濾胞性 B細胞腫 から発見されたガン遺伝子のひとつである bcl-2 遺伝子 （Science 226(4678): 1097- 1099, 1984; Pro. Natl. Acad. Sci. USA 81 (22):7166-7170, 1984) カヽ'知られており、 その遺伝子構造や転写産物の解析あるいは cDNA クローンが報告されている （Pro. Natl. Acad. Sci. USA 83(14):5214-5218, 1986; Cell 47(1 ): 19-28, 1886) 。 この bcl-2 遺伝子は、 免疫系や神経性の細胞で高頻度に発現しており、 この遺伝子の発現産物 はこれら細胞のアポトーシスを抑制することによって、 ヒ 卜の免疫機能や神経系機 能の恒常性を維持していると考えられている。 また、 この bcl-2 遺伝子は、 胎児では 特に広範囲には発現していることから、 個体発生の際の形態形成にも重要な役割を 果たしていると考えられてもいる。
その後、 このヒ ト bd-2遺伝子のホモログがゥシ、 ラッ ト、 ニヮ トリ等で見いださ れ、 be卜 2ファミリーと総称されている。
この出穎の発明者らも、 bcl-2 フア ミ リーに属するヒ ト bcl-x 遺伝子 （ Cell 74(4):597-608, 1993) のホモログとしてラッ ト bcl-x 遺伝子をクローニングし （丄 Biol. Chem. 271 (22): 13258-13265, 1996) 、 またこのラッ ト bcl-x遺伝子が発現する タンパク質 Bcl-xL の立体構造を X線解析によ リ决定している （丄 Biol. Chem. 272(44):27886-27892, 1997) 。 この出願の発明者らは、 ラッ ト Bcl-xL のアポトーシス抑制効果をさらに増強する ことを目的として、 その立体構造を変化させうるアミノ酸置換について検討した結 果、 特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換するように bcl-x遺伝子の CDNAを改変さ せ、 この改変型 cDNA を細胞内で発現させると、 細胞アポト一シスを含む細胞死が 顕著に抑制されることを見出した。 この出願の発明は、 発明者らによるこのような新規な知見に基づいてなされたも のであり、 この新規な改変型ラッ ト Bcl-xL タンパク質を細胞内で発現することので きる改変型 cDNAを提供することを課題としている。
またこの出願は、 この改変型 cDNA を保有する組換えベクターと、 この組換えべ クタ一による形質転換細胞を提供することを課題としてもいる。
さらにこの出願は、 前記改変型 cDNA が発現する改変型タンパク質を提供するこ とを課題といている。 発明の開示
この出願は、 前記の課題を解決するため、 次の (1 )から（8)の発明を提供する。 (1 ) 配列番号 1 に塩基配列を示したラッ ト bcl-x遺伝子の cDNA配列において、 コ一 ド領域の第 22番目 Tyrを Pheに変換する塩基置換、 第 26番目 Ginを Asnに変換す る塩基置換および 165番目 Arg を Lysに変換する塩基置換のうち、 少なくとも一つ の塩基置換を有することを特徴とするラッ ト bd-x遺伝子の改変型 cDNA。
(2) 5 '側に、 細胞膜通過ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを連結している 前記発明（1 )の改変型 cDNA。
(3) オリゴヌクレオチドが、 配列番号 1 2または 1 3のアミノ酸配列をコードする オリゴヌクレオチドである前記発明 (2)の改変型 cDNA。
(4) 前記発明（1 )から（3)のいずれかの改変型 cDNAを保有する組換えベクター。
(5) 前記発明 (4)の組換えベクターが導入された形質転換細胞。
(6) 前記発明（1 )記載の改変型 cDNA が発現するタンパク質であって、 配列番号 2に おける第 22番目 Tyrを Pheに変換するァミノ酸置換、 第 26番目 Ginを Asnに変換 するアミノ酸置換、 および 165番目 Arg を Lys に変換するアミノ酸置換のうち、 少 なくとも一つのアミノ酸置換を有することを特徴とする改変型タンパク質。
(7) N末端側に細胞膜通過べプチドを連結している前記発明 (6)の改変型タンパク質。
(8) 細胞膜通過ペプチドが、 配列番号 1 2または配列番号 1 3のアミノ酸配列を有 するオリゴぺプチドである前記発明 (7)の改変型タンパク質。 図面の簡単な説明
図 1 は、 野生型ラッ ト Bcl-xLの構造摸式図である。
図 2は、 形質転換細胞における改変型 Bcl-xLFNK 発現量のウェスタンプロッ ト解 析の結果である。
図 3は、 血清除去によって誘導されるアポトーシスに対する形質転換細胞の抵抗 性試験の結果である。
図 4は、 抗 Fas抗体 （anti-Fas)に対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。 図 5は、 スタウロスポリンに対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。 図 6は、 TN-16に対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。
図 7は、 カンプト亍シンに対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。
図 8は、 ハイ ドロキシゥレアに対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。 図 9は、 トリコスタチン Aに対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。 図 1 0は、 過酸化水素に対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。
図 1 1は、 パラコートに対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。
図 1 2は、 熱に対する形質転換細胞の抵抗性試験の結果である。
図 1 3は、 熱処理後の形質転換細胞の脱水素酵素活性を調べた WST-1 Assayの結 果である。
図 1 4は、 TN-16 処理後の形質転換細胞の脱水素酵素活性を調べた WST-1 Assay の結果である。
図 1 5は、 スタウロスポリン処理後の形質転換細胞の脱水素酵素活性を調べた WST-1 Assayの結果である。
図 1 6は、 サイ ト力イン 1レ3 除去によリ誘導されるアポトーシスに対する形質転 換細胞の抵抗性試験の結果である。
図 1 7は、 形質転換 CHO細胞の無血清培地での増殖状態を示す顕微鏡写真である。 図 1 8は、 TAT-Bcl-xFNK タンパク質が HeLa細胞中に取り込まれた状態を示す顕 微鏡写真である。
図 1 9は、 TAT-Bcl-xFNK タンパク質を含む培地で 5日間培養した軟骨組織培養細 胞の顕微鏡写真である。
図 2 0は、 TAT-Bcl-xFNK タンパク質を含む培地で 9日間培養した軟骨組織培養細 胞の顕微鏡写真である。
図 2 1 は、 Bd-xFNK タンパク質を含む培地で 5日間培養した軟骨組織培養細胞の 顕微鏡写真である。
図 2 2は、 Bcl-xFNK タンパク質を含む培地で 9日間培養した軟骨組織培養細胞の 顕微鏡写真である。
図 2 3は、 溶媒 （PBS) を含む培地で 5日間培養した軟骨組織培養細胞の顕微鏡写 真である。
図 2 4は、 溶媒 （PBS) を含む培地で 9日間培養した軟骨組織培養細胞の顕微鏡写 真である。
図 2 5は、 TAT-Bcl-xFNK タンパク質を全身性投与した後、 デキサメタゾンを投与 したマウスの肝臓切片の顕微鏡写真である。
図 2 6は、 溶媒 （PBS) を全身性投与した後、 デキサメタゾンを投与したマウスの 肝臓切片の顕微鏡写真である。
図 2 7は、 溶媒 （PBS) のみを全身性投与したマウスの肝臓切片の顕微鏡写真であ る。 発明を実施するための最良の形態
この出願の前記発明（1 )の改変型 CDNA は、 配列番号 1 に塩基配列を示したラッ ト bcl-x遺伝子の cDNA配列において、 第 22 番目の Tyr コ ドン （tac) を Phe コ ドン (ttt/ttc) に変換する塩基置換、 第 26 番目 Gin ( cag) を Asn コ ドン （aatノ aac) に変換する塩基置換、 165番目 Argコ ドン （egg) を Lysコ ドン （aaaZaag) に変換 する塩基置換のうち、 少なくとも一つの塩基置換を有する cDNA である。 そして、 この発明（1 )の改変型 cDNA においては、 以上の 3力所全ての塩基置換を有すること を好ましい態様としている。 3力所の塩基置換を有する改変型 cDNA の場合、 配列 番号 3にアミノ酸配列を示した改変型タンパク質 Bcl-xFNK を発現する。 この改変型 タンパク質 Bcl-xFNK は、 図 1 に構造模式図を示した野生型ラッ ト Bcl-xL における 第 22番目 Tyrと第 156番目 A sp、 第 26番目 Gin と第 164番目 S er、 第 165番目 Arg と第 1 16 番目 P ro のそれぞれの水素結合が、 前記の塩基置換によって生じるァ ミノ酸置換 （Tyr22Phe： Gln26Asn： Arg165Lys) の結果、 消失している。 この改変型 cDNA は、 ラッ ト bd-x 遺伝子 cDNA を錶型として、 ミュー亍一ショ ン ·キッ ト等を使用する公知の方法や、 あるいは後記の実施例に示した PCR 法など により作成することができる。 ラッ ト bcl-x 遺伝子の cDNA はプラスミツ ド pEF1- BOSbcl-x (J. Biol. Chem. 271 (22): 13258-13265, 1996) を使用することができる。 あるいはまた、 配列番号 1 の任意部分の塩基配列に基づいてォリゴヌクレオチドを 合成し、 これをプローブとして用いてラッ ト cDNA ライブラリーをスクリーニング する方法や、 目的とする cDNA 斷片の両末端にハイブリダィズするオリゴヌクレオ チドを合成し、 これをプライマ一として用いてラッ ト細胞から単離した mRNA から RT-PCR法によリ調製することもできる。 この出願の前記発明 (2)および (3)は、 前記発明（1 )の改変型 cDNA の 5 '側に細胞膜 通過べプチドをコ一ドするオリゴヌクレオチドを連結した DNA 断片 （ポリヌクレオ チド） であって、 これらの DNA断片は後述する改変型タンパク質 Bcl-xLを作成する ために使用することができる。 この出願の前記発明 (4)の組換えベクターは、 導入する細胞の種類 （例えば、 大腸 菌、 枯草菌等の原核細胞や、 酵母、 昆虫細胞、 哺乳動物細胞、 植物細胞等の真核細 胞など） に応じて適宜な発現ベクターを選択し、 これに発明（1)から（3)の改変型 cDNA を組み込むことによって作成することができる。 例えば、 大腸菌などの微生物 を対象とする場合には、 微生物中で複製可能なオリジン、 プロモーター、 リボソ一 厶結合部位、 ターミネータ一等を有する発現ベクターの DNA クローニング部位に前 記（1 )〜（3)のいずれかの改変型 cDNAを組み込むことによつて作成することができる。 また、 哺乳動物細胞等の真核細胞を対象とする場合には、 プロモーター、 スプライ シング領域、 ポリ（A)付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いて発明 (4)の 組換えベクターを作成することができる。 この出願の前記発明（5)の形質転換細胞は、 発明 (4)の組換えベクターが導入され、 改変型タンパク質 Bcl-xL を発現する細胞である。 細胞の種類は特に制限はなく、 例 えば、 大腸菌、 枯草菌等の原核細胞や、 酵母、 昆虫細胞、 哺乳動物細胞、 植物細胞 等の真核細胞など前記 (4)の組換えベクターによって形質転換可能な全ての細胞が含 まれる。 組換えべクタ一を細胞に導入するには公知の方法を用いることができる。 例えば、 哺乳動物細胞に組換えベクターを導入するには、 電気穿孔法、 リン酸カル シゥ厶法、 リボソーム法、 DEAEデキストラン法などを用いることができる。 なお、 この発明（5)の形質転換細胞のうち、 特に哺乳動物細胞は、 後記の実施例に データを示すように、 無血清培地でも増殖可能である。 すなわち、 一般に培養細胞 を一定の期間生存させるには、 増殖因子を含む血清 （ゥシ胎児血清など） を培地に 添加する必要がある。 増殖因子によって細胞のアポトーシスが抑制され、 生存期間 を延長することができるからである。 しかしながら、 例えば生理活性物質やモノク 口一ナル抗体などの細胞生成物を動物細胞から回収して精製する場合には、 培地中 に血清のような不純物が含まれていないことが望ましい。 目的の物質を精製するた めの費用や工程が増加することや、 血清中にウィルス等の危険因子が混入している 危険性も存在するからである。 そこで、 培養液に血清を用いない無血清無蛋白培地 が用いられてもいるが、 実際には無血清無蛋白培地では細胞の増殖の程度は低く、 死細胞も多い。 そして、 死細胞が多いと細胞の内容物が流出して培地を汚染すると いう問題も存在する。
一方、 増殖因子を使用することなく細胞を増殖させる方法として、 瘙遺伝子の導 入によって細胞を形質転換する方法も知られている。 しかしながら、 癌遺伝子産物 が多量に発現すると、 むしろアポトーシスが促進されることが明らかにされている。 発明 (5)の形質転換哺乳動物細胞は、 改変型タンパク質 Bcl-xL の発現によって、 血 清等の増殖因子が存在せずともアポトーシスを生じることなく、 長期間にわたって 培養することが可能である。 また、 このような優れた増殖能により、 セルライン化 が可能でもある。 発明 (6)の改変型タンパク賈 Bd-xLは、 発明（1 )の改変型 cDNAが発現するタンパク 質であり、 配列番号 2にアミノ酸配列を示した Bd-xLにおける第 22番目 Tyrを Phe に変換するアミノ酸置換、 第 26 番目 Gin を Asn に変換するアミノ酸置換、 および 165 番目 Arg を し ys に変換するアミノ酸置換のうち、 少なくとも一つのアミノ酸置 換を有することを特徴としている。 そして、 これらのアミノ酸置換の全てを有する 配列番号 3のアミノ酸配列からなる Bcl-xFNKを最も好ましい態様としている。 この改変型タンパク質は発明（5)の形質転換細胞を培養し、 その培養物から公知の 分離操作を組み合わることによって単離精製することができる。 例えば、 尿素など の変性剤や界面活性剤による処理、 超音波処理、 酵素消化、 塩析ゃ溶媒沈殿法、 透 析、 遠心分離、 限外濾過、 ゲル濾過、 SDS-PAGE、 等電点電気泳動、 イオン交換ク 口マトグラフィー、 疎水性クロマトグラフィー、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ 一、 逆相クロマトグラフィー等である。 この改変型タンパク質は、 例えば、 アポトーシス抑制剤の有効成分またはそのリ ード化合物等として使用することができるが、 さらには、 この改変型 Bcl-xL の N末 端側に細胞膜通過ペプチドを連結させることが好ましい。 この細胞膜通過ペプチド を備えることによって、 改変型タンパク質 Bcl-xL は細胞膜を通過して細胞内に取り 込まれ、 細胞内において一過性にアポトーシスや細胞死を抑制する機能を発揮する ことができる。 そして、 このような細胞膜通過機能を有することによって、 例えば 以下の用途に使用することができる。
(a) 組織移植において使用する細胞を長期間に渡って正常な状態に維持する。
(b) 臓器移植において使用する臓器を長期間に渡って正常な状態に維持する。
(c) 外科手術において、 止血状態の臓器を安定に維持する。
(d) 脳血栓等による脳虚血による細胞死の治療薬として使用する。
(e) 劇症肝炎の治療薬として使用する。
(f) ス亍ロイ ドホルモンの過剰投与による細胞死の防止薬として使用する。
(g) 筋細胞の死等により筋萎縮を呈する疾患 （例えば、 筋ジストロフィー、 筋無力 症、 w症等） の治療薬として使用する。 (h) 外傷、 火傷等による皮膚上皮細胞の細胞死の防止薬として使用する。 なお、 細胞膜通過ペプチドとしては、 配列番号 1 2や配列番号 1 3にアミノ酸配 列を示したオリゴペプチドを使用することができる。 配列番号 1 2のオリゴぺプチ ドは HIV-1 · ΤΑΤの PTD (protein transduction domain) であり、 配列番号 1 3のォ リゴペプチドはショウジヨウバエのホメォボックスタンパク質アンテナべディアの PTDである。
これらの細胞膜通過べプチドは、 例えば HIV-1 · TATの場合にはそのアミノ酸配列 およびその cDNA の塩基配列が公知であ り （Science, 285: 1569-1572, 1999; GenBank Accession NO. U39362 96155) 、 その PTDに相当する領域 （HIV■ TAT の 47~ 57番ァミノ酸配列） をコードする DNA断片を前記発明（1 )の改変型 cDNA と 連結して融合 DNA 断片 （発明 (3)) を作成し、 この融合 DNA 断片を大腸菌等の宿主 細胞で発現させることによって、 N末端側に PTD ペプチドを連結した改変型タンパ ク貫 Bcl-xLを作成することができる。 また、 アンテイべディアの PTD も公知であり (例えば、 GenBank Accession No. AE001573) 、 同様にして PTD を融合した改変 型タンパク質を作成することができる。 あるいはまた、 2価の架橋剤 （例えば、 EDC や ーァラニン等を介して、 改変型 Bcl-xL と PTD ペプチドを結合させる方法 によって細胞膜通過べプチドを連結した改変型 Bcl-xLを作成することもできる。 実施例
以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明する が、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。 実施例 1 ：改変型 cDNAの作成
ラッ ト Bcl-xLの cDNAクローン pEF1 -B〇Sbcl-x (丄 Biol. Chem. 271 : 13258-13265, 1996)をテンプレート （錶型） にして 2段階 PCR 法により 2つの DNA 断片 （bcl- xR165K、 bcl-x Y 22 F /Q 26 N ) を合成し、 最終的にこれらの DNA 断片の所定領域を 結合することにより、 3力所のアミノ酸置換 （Tyr22Phe : Gln26Asn : Arg165Lys ) を導入した改変型 cDNAbcl-xFNKを作成した。
先ず、 Arg165Lysの置換導入した be卜 X R 165 Kを作製するために、 2つの DNA断 片 （A、 B ) を PCR 合成した。 DNA 断片 （A ) は、 5 '側プライマーとして配列番 号 4に示したプライマー 1 を、 3 '側プライマーとして配列番号 5に示したプライマ 一 2を用いた。 プライマ一 1 は、 bcl-x cDNA の翻訳領域の上流で、 ベクターの塩基 配列を一部含む。 また制限酵素 Bam HI 切断部位を含んでいる。 プライマー 2は、 bcl-x cDNAのアンチセンス配列で、 Arg165のコ ドンを Lysをコ一ドするように置換 している。
DNA 断片 （B ) は、 5 '側プライマーとして配列番号 6に示したプライマ一 3を、 3 '側プライマーとして配列番号 7に示したプライマ一 4を用いた。 プライマ一 3は bcl-x cDNAのセンス配列で、 Arg165のコ ドンを Lysをコードするように塩基置換し ており、 5 '側半分の塩基配列はプライマー 2の 5 '側半分の塩基配列と相補的である。 プライマー 4は bci-x cDNAのアンチセンス配列で、 その翻訳領域アミノ酸残基 178 から 184に対応する。 また、 制限酵素 Bam HIの切断部位を含んでいる。
PCR反応の詳細は以下のとおりである。
• 反応溶液（溶液量 100 i)： 10 mM Tris-HCI, pH8.3, 50 mM KCI, 1.5 mM MgCI2,
0.001 % gelatin, dATP, dCTP, dTTP, dGTP 各 0.2 mM
• AmpliTaqGOLD： 2.5 U
. —対のプライマー ： プライマ一 1 とプライマー 2の組み合わせ、 プライマー 3と プライマー 4の組み合わせ （各プライマー 1 μ Μ)
• テンプレート DNA： 50 ng
• 反応条件 1 ： 94°C/10分； （94°C/30秒； 53°C/30秒 ； 72°C/1分） x 15
反応後、 増幅された 2つの DNA 断片 （A、 B ) はポリアクリルアミ ドゲル電気泳 動で精製した。 次いで、 上記 PCR反応溶液 （25 μ I ) に DNA 断片 Α、 Β (それぞれ 6ng) を混合し、 AmpHTaqGOLD を使って各々の相補鎖を合成した。 合成条件は以下 の反応条件 2のとおりとした。
' 反応条件 2 ： 94°C/10分； （94°C/30秒 ； 41 °C一 47°C/30秒； 72°C/1分） x 4
反応後、 プライマ一 1 とプライマー 4 (最終濃度各 1 / M ) と AmpliTaqGOLD (2.5 U) を含む PCR反応溶液 75 Iを加え、 前記の反応条件 1 により PCRを実行し た。 650 bp の PCR 産物をポリアク リルアミ ドゲル電気泳動で精製し、 制限酵素 Bam HIで処理した。 一方、 pEF1-B〇Sbcl-x ( 2ケ所の Bam HI部位をもつ） を Bam HI で処理して 2本の DNA 断片 （5650 bp と 650 bp) を調製し、 長い DNA 断片 (5650 bp) に前記 PCR 産物を順方向に結合させ、 Arg165Lys の変異を有するクロ ーン pEF1-BOSbcl-x R 165 Kを得た。
bcl-x Y 22 F / Q 26 Nは、 先ず Gln26Asn のアミ ノ酸置換を導入し、 次いで Tyr22Phe のアミノ酸置換を付加した。 PCR は、 pEF1-B〇Sbcl-x ( 50 ng) をテンプ レートとして、 前記プライマ一 1 およびプライマー 5 (配列番号 8 ) の組み合わせ と、 前記プライマ一 4およびプライマー 6 (配列番号 9 ) の組み合わせでふたつの PCR を別々に行った。 反応溶液 （100 μ \) の組成は前記と同様であり、 反応条件は 前記の条件 1 とした。 なお、 プライマー 5は bcl-xcDNAのアンチセンス配列であり、 Gln26 のコ ドンを Asn をコードするように塩基置換してある。 また、 プライマー 6 は bcl-xcDNA のセンス配列で、 Gln26のコ ドンを Asn をコードするように塩基置換 しておリ、 5 '側半分の塩基配列はプライマー 5の 5 '側半分の塩基配列と相補的であ る。
PCRで増幅されたふたつの PCR産物をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で精製し、 2つの DNA 断片（それぞれ 6ng) を混合し、 AmpliTaqGOLD を使って相補鎖を合成 した。 合成の条件は前記反応条件 2と同一とした。
'反応後、 プライマー 1 とプライマー 4 (最終濃度各 1 Αί Μ ) と AmpliTaqGOLD (2.5 U) を含む PCR反応溶液 （75 μ I) を加え、 反応条件 1 により PCRを行った。
650 bpの PCR産物をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で精製し、 制限酵素 Bam HI で処理した。 一方、 pEF1 -B〇Sbcl-x を Bam HI で処理して 2本の DNA 断片 （5650 bpと 650 bp) を調製し、 長い DNA断片 （5650 bp) に前記 PCR産物を順方向に結 合させ、 Gln26Asnの変異を有するクローン pEF1-BOSbcl-x Q 26 Nを得た。
次に、 この pEF1 -B〇Sbcl-x Q 26 Nをテンプレートとして、 前記プライマ一 1 およ びプライマー 7 (配列番号 10) の組み合わせと、 前記プライマー 4およびプライマ - 8 (配列番号 1 1 ) の組み合わせでふたつの PCR を別々に行った。 反応溶液 （100 μ I) の組成は前記と同様であり、 反応条件は前記の条件 1 とした。 なお、 プライマ
—7は bcl-x cDNAのアンチセンス配列で、 Tyr22のコ ドンを Pheをコ一ドするよう に塩基置換されている。 また、 プライマ一 8は bcl-x cDNA のセンス配列で、 Tyr22 のコ ドンを Phe をコードするように塩基置換されており、 5'側半分の塩基配列はプ ライマー 7の 5'側半分の塩基配列と相補的である。
この PCR で増幅された 2つの PCR 産物をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で精 製し、 2つの DNA 断片（それぞれ 6ng) を混合し、 AmpliTaqGOLD を使って相補鎖 を合成した。 合成条件は前記の反応条件 2と同一とした。 反応後、 プライマ一 1 と プライマー 4 (最終濃度各 1 M) と AmpliTaqGOLD (2.5 U) を含む PCR 反応溶 液 （75 μ I) 、 前記の反応条件 1 により PCRを行った。
この PCRにより得られた 650 bpの PCR産物をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 で精製し、 制限酵素 Bam HIで処理した。 一方、 pEF1-BOSbcl-xを Bam HIで処理し て 2本の DNA新片 （5650 bpと 650 bp) を調製し、 長い DNA断片 （5650 bp) に前 記 PCR 産物を順方向に結合させ、 Tyr22Phe および Gln26Asn の変異を有するクロ ーン pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26Nを得た。
最後に、 pEF1-BOSbcl-xR165Kと pEF1-BOSbcl-x Y 22 F /Q 26 Nをそれぞれ 2種 類の制限酵素 （Bgl II と Kpn I) で切断し、 pEF1-BOSbcl-x Υ 22 F/Q26N由来の約 1000 bpの Bgl ll/Kpn IDNA断片 （Tyr22Pheと Gln26Asnの変異を持つ） と、 pEF1- BOSbcl-xR165K由来の約 5300 bp CD Bgl ll/Kpn IDNA断片 （Arg165Lysの変異を持 つ） を結合させて改変型タンパク質 Bcl-xFNKをコードする改変型 cDNAの組換えべ クタ一 pEF1-B〇Sbcl-xY22F/Q26N/R165Kを得た。 実施例 2 ： 形質転換細胞の作成
マウス前骨髄芽球細胞 FDC-P1 を、 RPMM640培地に牛胎児血清（10°/。）とサイ トカ イン IL-3(WEHI細胞培養液上清） を添加して培養した。 ヒ ト白血病細胞 Jurkat細胞 は、 RPMI1640培地に牛胎児血清（10%)を添加して培養した。 培養は C〇2インキュべ ータ一 （5°/。C〇2/95%空気、 37°C) で行った。
実施例 1 で作成した組換えベクター pEF1-BOSbcl-x丫 22F/Q26N/R 165 Kは大腸 菌 DH5 a MCR(G旧 CO BRし 社） 内で増幅させ、 Qiagen Plasmid midi Kit ( Qiagen 社） で調製した。 制限酵素 Sea I (切斷部位は 1 つ） で切断し、 開環して直鎖状にな つた DNAを 1 mM EDTA溶液に溶かした。
增殖期の細胞 （FDC-P1 ,あるいは Jurkat)を氷冷 K-PBS 溶液 （30.8 mM NaCI, 120.7 mM KCI, 8.1 mM Na2HP04, 1.46 mM KH2P04)で 3回洗浄し、 5 mM MgCI2を含 む K-PBS(Mg-K-PBS)に 107細胞 Zml になるように懸濁した。 氷冷したキュベッ ト (Electroporation Cuvettes Plus, 4 mm Gap, BTX, A Division of Genetronics)に細胞 濁液 0.4 mlと Mg-K-PBS溶液 0.4 mlを混合し、 導入する直鎖状 pEF1-BOSbcl-x Y 22 F /Q 26 N /R 165 K ( 10 μ g) と薬剤 geneticin 耐性遺伝子を持つ直鎖状 DNA pST- neoB (0.5 μ g) を加えた。 DNA 添加による体積の変化は 1 %以下とした。 10 分間 氷冷した後、 Gene Pulser (BioRad社） を用いて 250 μ F, 330 Vの条件でエレク ト 口ポレーシヨンを行い、 組換えベクターを導入した。 10 分間氷冷した後、 100-mm ディシュの中で 39 mlの培地に穏やかに懸濁し、 C〇2ィンキュベ一ターで培養した。 1 日後、 細胞を 96穴プレー卜に分注した。 FDC-P1細胞では geneticin(G旧 CO BRL) を 200 ju g/ml加え、 また Jurkat細胞では geneticinを 1 mg/ml加え、 geneticin酎性 細胞を選別した。 実施例 3 ：改変型 Bcl-xFNK発現量の解析
実施例 2で作成した形質転換細胞が発現している改変型 Bd-xFNK の発現量をゥェ スタンブロッ トにより解析した。 細胞を PBS(pH7.4; NaCI 137 mM, Na2HP04 8.1 mM, KCI 2.68 mM, KH2P〇4 1 .47 mM)で 1 回洗浄後、 2 % SDS ( sodium dodecyl sulfate)水溶液を加え超音波によって全タンパク質を可溶化した。 BCA Protein Assay (PIERCE社） で蛋白質定量を行い、 20 のタンパク質を SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （レムリの系） で分画した。 泳動後、 PVDF メンブレン （Amersham Pharmacia Biotec 社）にブロッテイングした。 メンブレンを牛胎児血清 （10% ) でブ ロッキングし、 ラッ ト Bcl-xし の C末端の領域を認識するマウス由来モノクローナル 抗体 105-1 (0.5 μ g/ml) を含む TBS溶液 （Tris-Hcl pH7.4 20 mM, NaCI 136 mM, Tween80 0.2%)に浸け、 37°Cで 1 時間保温した。 TBS で十分に洗浄したのち、 HRP (西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ） あるいは AP (アルカリフォスファターゼ） が結合し た 2次抗体を含む TBS 溶液に浸けて 37°Cで 1 時間保温した。 HRP が結合した 2次 抗体では RENAISSANCEキッ ト（NEN Life Science Product社） を用いて X線フィル ムに、 AP が結合した 2次抗体では ATTOPHOS キッ ト （ベーリンガー社） を用いて フルォロイメージアナライザ一 FLA-2000 ( Fujifilm社） で Bcl-xLおよび Bcl-xFNKを 可視化して定量した。
結果は図 2に示したとおりである。 組換えベクター pEF1-BOSbcl-xFNK を導入し た細胞は、 野生型 bcl-x Lのクローン pEF1 -B〇Sbcl-x Lを導入した細胞と同一分子量
(約 30kDa) のタンパク質を発現していることが確認された。 実施例 4 ： 形質転換細胞 Jurkatbcl-xFNKの細胞死に対する抵抗性の確認
実施例 2で作成した形質転換細胞 Jurkatbcl-xFNK について、 各種のアポト一シス 誘因に対する抵抗性 （非感受性） を試験した。 結果は図 3〜図 13 に示す。 これらの 図において、 白抜き丸印 （〇） は改変型 Bcl-xFNK を発現しているトランスフエクタ ント Jurkatbcl-xFNK、 黒丸印 （參） は同程度の蛋白量の正常 Bcl-xL を発現している トランスフエクタント Jurkatbc卜 x、 白抜き四角印 （口） はベクタープラスミ ツ ド DNAのみを導入した Jurkatvec、 白抜き菱印 （◊) は遺伝子導入に用いた親株 Jurkat を示す。
(a) 血清除去によって誘導されるアポトーシスに対する抵抗性
各細胞を PBSで 3回洗浄した後、 1 X 1 05個/ mlになるように血清を含まない培地 RPMI1640 に懸濁した。 C 0 2インキュベーターで保温し、 トリパンブルーで染色さ れない細胞 （生細胞） の数を日をおつて測定した。 生細胞数が 5 X 1 0 5 ml を超え ないように注意し、 超えそうな時は培地を 2倍に希釈した。 3日目ごとに血清を含 まない培地の半分を新鮮なものと入れ替えた。
結果は図 3に示したとおりであり、 コントロールの親株やベクター導入細胞に比 較して、 野生型 Bcl-xL を発現する形質転換細胞は血清除去に対して抵抗性を示し、 長期間にわたって生存した。 そして、 改変型 Bcl-xFNK を発現する形質転換細胞は、 野生型 Bcl-xL 発現細胞よりもさらに長期間にわたって生存することから、 その優れ たアポトーシス抑制効果が確認された。 また、 この形質転換細胞は、 無血清培地で も培養可能であることが確認された。
(b) 抗 Fas抗体 （anti-Fas)に対する抵抗性
各細胞を 1 X 1 05個/ ml になるように培地 RPMI 1640 に懸濁し、 抗 F as 抗体（クロ ーン CH-1 1 ： MBL社） を 1 、 10、 100、 1000 ng/ml の濃度で加えた。 1 日培養した のち、 トリパンブルーで染色されない細胞 （生細胞） の数を測定した。
結果は、 抗 Fas 抗体未処理の生細胞数を 100%として図 4に示した。 この図 4か ら明らかなように、 改変型 Bcl-xFNKを発現する形質転換細胞は高濃度の抗 Fas抗体 に対して高い抵抗性を示した。
(c) 抗癌剤を含む各種の細胞毒性因子に対する抵抗性
各細胞を 1 x 105個/ ml になるように培地 RPMI 1640 に懸濁し、 スタウロスポリン (staurosporine： 20 nM) 丁 Ν-16(10 μ Μ)、 カンプトテシン（camptothecin： 10 μ Μ), ヒ ドロキシゥレア（hydroxyurea： 1 mM)、 トリコスタチン A (trichostatin A： 0.25 μ g/ml)、 過酸化水素 (hydrogen peroxide： 0.05 mM)、 ノ ラコート (paraquat : 1 mM)を 加え、 培養した。 トリパンブル一で染色されない細胞 （生細胞） の数を日をおつて 測定した。
結果は図 5〜1 1 に示したとおりであり、 改変型 Bcl-xFNK を発現する形質転換細 胞は、 試験した全ての細胞毒性因子に対して高い抵抗性を示した。
(d) 熱に対する抵抗性
各細胞を 1 X 1 05個/ ml になるように培地 RPMI 1640 に懸濁し、 45°Cで 10 分間処 理した。 遠心して等量の新鮮な培地に細胞を懸 ;¾し、 37°Cで培養した。 トリパンブ ルーで染色されない細胞 （生細胞） の数を曰をおつて測定し、 図 12に示した。 また、 培養 1 日目で WST-1 を基質にした Cell Counting Kit (同仁化学） で細胞 （培養液 100 ； u I)が持つ脱水素酵素の活性を調べ （WST-1 Assay) , 加熱未処理の細胞が持つ酵素 活性を 100%として図 13に示した。
これらの結果から明らかなように、 改変型 Bcl-xFNK を発現する形質転換細胞は熱 に対して高い抵抗性を示すとともに、 熱処理によっても脱水素酵素活性を高いレべ ルで維持することが確認された。 実施例 5 ： 形質転換細胞 FDC-P1 bcl-xFNKの細胞死に対する抵抗性の確認
実施例 2で作成した形質転換細胞 FDC-P1 bcl-xFNK について、 各種のアポト一シ ス誘因に対する抵抗性を試験した。 結果は図 14〜図 16に示す。 これらの図において， 白抜きの◊、 口、 厶、 ▽、 〇は、 クローン化された 5種類のトランスフエクタント FDC-P1 bcl-xFNK- 1 , - 2、 - 3、 - 4、 - 5を示す。 また、 參は、 同程度の蛋白量の正 常 Bd-xL を発現しているトランスフエクタント FDC-P1 bcl-x を、 鬭はベクターブラ スミツ ド DNAだけを導入した FDC-P1 vecを示す。
(a) T N -16とスタウロスポリン（staurosporine)に対する抵抗性
各細胞を 2 X 105個ノ ml になるように培地に S濁し、 TN-16(50 M)とスタウロ スポリン（10 nM)を加えて培養した。 日をおつて EST-1 を基質にした Cell Counting Kit (同仁化学） で細胞 （培養液 100 μ I)が持つ脱水素酵素の活性を調べた （WST-1 Assay)。 酵素活性は薬剤を加える直前の活性を 100%とした。
結果は図 14および 15に示すとおリである。 改変型 Bcl-xFNKを発現する形質転換 細胞のクローンはいずれも、 TN-16 およびスタウロスポリン処理に対して、 脱水素 酵素活性を高いレベルで維持することが確認された。
(b) サイ トカイン Iし- 3除去により誘導されるアポト一シスに対する抵抗性
各細胞を 3回 PBS で洗浄後、 IL-3 を含まない培地 （血清は含む） に約 5 個 /ml になるように懸濁し、 トリパンブルーで生細胞数を測定した。 日をおつて同樺に 生細胞数を測定し、 IL-3 を除去した直後の生細胞数を 100%として図 16に示した。 なお、 FDC-P1 vec を除いた他の細胞について 3曰目に IL-3 を含まない新鮮な培地で 5倍希釈した。
図 16 から明らかなように、 改変型 Bcl-xFNK を発現する形質転換細胞のクローン はいずれも、 Iし 3 除去によって誘導されるアポトーシスに対して、 野生型 Bd-xL 発 現細胞よりも高い抵抗性を示し、 IL-3 非存在下でも細胞が増殖することが確認され た。 実施例 6 ： 形質転換 CHO細胞の作成 チャイニーズハムスター卵巣細胞 CHO を、 実施例 1 で作成した組換えベクター組 換えべクター pEF1-BOSbcl-xY22F/Q26N/R 165Kによって形質転換した。
CHO 細胞 1 X105個を 10%牛胎児血清を含む培養液 DMEM/F-12 (GIBCO BRL 社） （こ懸濁し、 60-mmディッシュでー晚培養した。 SuperFect Transfection Reagent キッ ト （Qiagen 社） を用いて直鎖状 pEF1-B〇Sbci-x Y 22 F /Q 26N /R 165K (10 g) と薬剤 Geneticin耐性遺伝子を持つ直鎖状 pST-neoB (0.5 g) を CHO細胞にコ トランスフエクシヨンした。 コントロールとして、 直鎖状ベクター PEF1-BOS およ び直鎖状 pEF1-B〇Sbcl-x もそれぞれ直鎖状 pST-neoB とともに CHO細胞に導入し た。 遺伝子導入処理後、 10%牛胎児血清を含む培養液 DMEM/F-12 で一晩培養した。
Geneticin (700μ g/ml) を加えて培養し、 形質転換細胞を得た。 それぞれの形質転換 細胞について、 実施例 3と同様にして、 改変型タンパク質 Bcl-xFNK と野生型 Bcl-xL を多量かつ同程度に発現している細胞を選択し、 CH〇bcl-x、 CHObcl-xFNK, および ベクターのみが導入された CHOvecを得た。 実施例 7 ： 形質転換 CHO細胞の無血清培地での培養
実施例 6で作成した 3種類の形質転換細胞 CH〇bcl-xFNK、 CHObcl-x および CHOvec を 10°/。牛胎児血清を含む培養液 DMEM/F-12 で培養した。 増殖期の細胞 1 x103個を 100-mmディッシュに植え継ぎ、 3%牛胎児血清を含む培養液 DMEM/F-12 で培養した。 1 日ごとに培養液の 2 3を牛胎児血清を含まない培養液 DMEM/F-12 で入れ替え、 5日目からは完全に牛胎児血清を含まない培養液 DMEM/F-12で培養し、 さらに 6日間培養した。
結果は図 17の写真に示したとおりである。 改変型 Bcl-xFNK を発現する CHObcl- xFNK (図 17C) は、 ベクターのみを導入した CHOvec (図 17B) よりもはるかに良 好に増殖した。 また、 Bcl-xL 発現細胞 （図 17A) に比べて死細胞が少なく、 かつ細 胞間の接触が維持されているコロニーを形成した。
以上の結果から、 この発明の形質転換細胞は、 無血清培地でも正常な形態で良好 に増殖することが確認された。 実施例 8 ： TAT-Bcl-xFNKタンパク質発現べクタ一の構築
実施例 1 で作成された Bcl-xFN KcDNAをコードする改変型 cDNAに 2段階 PCR法 で H IV ウ ィ ルスの TAT タ ンパク 質の細胞膜通過ペプチ ド（PTD: Protein Transduction Domain)をコ一ドする cDNAを融合させた。 Bcl-xFNKcDNAをコードす る組み換えベクター pEF1 -B〇Sbcl-x丫 22F/Q26N/R165K を錶型にして、 5'側プライマ 一としてプライマー 9 (配列番号 14) を、 3'側プライマーとしてプライマー 10 (配 列番号 15) を使用した。 プライマ一 9は TAT-PTDcDNAの 3'端と Bcl-xFNKcDNAの 開始コ ドンを含む 5'端のセンス配列を持っている。 プライマー 10 は Bcl-xFNKcDNA の終始コ ドンを含む 3'端のアンチセンス配列で制限酵素 H ind I I Iの切断部位を持って いる。 PCR反応の詳細は以下のとおりである。
■ 反応溶液（溶液量 100 ml): 10 mM Tris-HCI, pH 8.3, 50 mMKCI, 1.5 mM MgCI2,0.001 % gelatin, dATP, dCTP, dTTP, dGTP 各 0.2 mM, AmpliTaqGOLD: 2.5 U
• プライマー：プライマー 9とプライマ一 10の組合せ （各プライマー 1 /i M)
· テンプレート DNA: 50 ng
• 反応条件 3 ； 94°C/ 10分； (94°C/ 30秒； 49°C/ 30秒； 72°C/ 1分） χ 15
反応後、 増幅された DNA 断片をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で精製した。 上 記 PCR 反応液 (25 μ Ι)に精製された DNA 断片 (25 ng)とプライマー 1 1 (配列番号 16) を混合し、 AmpliTaqGOLD を使って相補鎖の合成を行った。 プライマー 16 は配 列番号 12 に示された TAT-PTD のアミノ酸配列をはさんで、 5'端に Met (開始コ ド ン) -Glyを、 3'端に Glyをコードし、 さらに Bcl-xFNKcDNAの開始コ ドンを含む 5'端 のセンス配列を含む。 合成条件は以下のようにした。
• 反応条件 4 ； 94°C/10分； (94°C/30 秒； 53°C— 59°C/30秒； 72°C/1分） 5
反応後、 塩基配列プライマ一 12 (配列番号 17) とプライマー 10(最終濃度各 1 β Μ)と AmpNTaqG〇LD(2.5 U)を含む PCR反応溶液 75 ml を加え、 前記の反応条件 3 によリ PCRを実行した。 プライマー 12は Met-Glyに続き TAT-PTDの N末端の 3個 のアミノ酸を含むセンス配列で、 5'端には制限酵素 Nde I の切断部位を持つ。 増幅さ れた DNA 断片をポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で精製した。 Nde I で切断後、 そ の切断面を T4DNA ポリメラーゼで平滑化し、 さらに Hind III で切断処理を行った。 大腸菌発現べクタ一 pR〇EX1 (Life Technologies社）を co Iで切断し、 ヌクレアーゼ S1 でその切断断面を平滑化した後、 Hind II I で切断処理をした。 ふたつの DNA を結 合させて、 TAT タンパク質の細胞膜通過ペプチドが N 末に融合した TAT-Bcl-xFNK をコードする組換えベクター pROEX1 -bd-x丫 22F/Q26N/R165Kを得た。 実施例 9 ： TAT-Bcl-xFNKタンパク質の調製
丁 AT-Bcl-xFNKタンパク質は以下に示すように大腸菌内で発現させ、 部分精製した。 すなわち、 pR〇EX1 -bcl-xY22F/Q26N/R165Kを保持した大腸菌 DH5 a MCR株をアン ピシリン (50 g/ml)を含む LB液体培地 1000 ml (酵母エキス 5 g， バク ト トリブト ン 10 g, NaCI 5 g)で振とう培養 (37°C)した。 対数増殖期 (O. D.600=0.5)に達したとこ ろで IPTG (イソプロピル- 1-チォ - /8 -ガラク トシド ； 最終濃度 1 mM)を加え、 2時間 培養を続けた。 TAT-Bcl-xFNK タンパク質は細胞破壊後の可溶性画分と不溶性画分 (封入体)からそれぞれ調製した。 可溶性画分からは次のように調製した。 集菌後、 PBSで 3回洗浄し緩衝液 A(50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) 40 mlに縣渴し、 大腸菌細胞を超音波破壊した。 遠心後の上清から TAT- Bcl-xFNKをラッ ト Bd-xLの N末端領域を認識するマウス由来のモノクローナル抗体 35-32 を担体に結合させて充填したカラムを使った抗体ァフィ二ティークロマトグラ フィ一で精製した。 TAT-Bcl-xFNK を抗体に結合させて、 洗浄した後、 溶出液 （50 mM Glycine-Hcl, pH 2.7, 50 mMNaCI)で TAT-Bcl-xFNKを溶出させた。 2 M Tris-HCI (pH 9.0)溶液で中和した後、 セントリコン (Amicon社）で濃縮した。 PBSで透析して、 タンパク質摞品とした。 不溶性画分 (封入体)からの調製は次のようにした。 集菌後、 PBSで 3回洗浄し、 PMSFのかわりに DTTを含む緩衝液 A(50 mM Tris-HCI, pH 8.0, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 0.1 mM DTT) 36 mlに縣濁し、 超音波にて大腸菌細胞を 破壊した。 トリ トン X-100 (最終濃度 1 %)を加えて、 10 分氷上に置いた。 遠心にて TAT-Bcl-xFNK蛋白を含む封入体 （inclusion body)を沈殿させた。 トリ トン X-100を 含む緩衝液 Aで封入体を 2回洗浄した。 最後に封入体を 7M Ureaと 1 mM DTTを含 む PBS に可溶化した。 SDS-ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動にての純度 70 <½の TAT-Bcl-xFNKタンパク質標品であることを確認し、 以下の実験に用いた。 実施例 1 0 ： TAT-Bcl-xFNKタンパク質の細胞内への取り込み
Slide Chamber (Lab-Tek社)上で培養されている HeLa細胞の培地 10%FBS (牛胎 児血清） を含む DMEM/F-12 ( Life Technologies 社） に TAT-Bcl-xFNK タンパク質 ( 1 μ Μ) を加え、 24時間 C02インキュベタ一内で細胞を培養した。 PBSで 2回洗 浄した。 細胞を PBS に溶かしたパラホルムアルデヒ ド (4%)で 45 分間、 室温で固定 した。 PBSで 3回（5分/回）洗浄し、 10%FBSを含む PBSで 20分ブロッキングした。 PBS で 3回（5分/回）洗浄し，ラッ ト Bcl-xLに対するモノクローナル抗体 35-32 (マウ ス由来） を含む 1.5°/o FBS-PBS溶液で 30分間細胞を処理した。 PBSで 3回 (5分/回） 洗浄し、 F Cが結合している抗マウス IgG抗体を含む 1.5% FBS-PBS溶液で 30分 間細胞を処理した。 PBS で 3回 (5 分/回）洗浄し後、 PBS 溶液で細胞を封入し、 蛍光 顕微鏡で観察した。
結果は図 18 に示したとおりであり、 細胞内に点状に FITC 特有の蛍光が認められ た。 この蛍光シグナルは TAT-Bcl-xFNK タンパク質未添加の細胞には認められず、 TAT-Bcl-xFNK 蛋白を加えても一次抗体 （35-32) で処理しない細胞には認められな つかた。 このことは、 培地に加えられた TAT-Bcl-xFNKタンパク質が細胞質膜を通過 して細胞内に取り込まれたことを示している。 実施例 1 1 ： TAT-Bcl-xFNKの軟骨組織培養細胞への導入と細胞死抑制効果の確認 変形性股関節症患者の骨頭置換手術で摘出された大腿骨頭から無菌的に片刃かみ そりにて軟骨下骨の上にある軟骨組織をスライス状 (1 O 10mm 厚さ 1 -2mm)に切り取 つた。 24穴プレート内に挿入し、 20%FBS (ゥシ胎児血清）を含む DMEM/Ham F-12 混合培地 (し ife Technologies社） にて 37°C , C〇2インキュベーター内で培養した。 比 較検討のために TAT-Bcl-xFNKと同じ方法で、 TAT-Bcl-xLの発現べクタ一を作成し、 TAT-Bcl-xL タンパク質を大腸菌よリ部分精製した（タンパク質標品の純度は同じ）。 TAT-Bcl-xFNK (封入体より調製）と TA丁- Bcl-xL (封入体より調製）をそれぞれを 0.2 A< M となるように培地に添加した。 コントロールとして、 7 M Ureaと 1 mM DTTを含む PBS (タンパク質標品に用いた溶媒）を同量加えた。 培地および添加したタンパク質標 品は 4 日目と 7 日目に交換した。 4日および 9 日間培養した軟骨組織を凍結し、 順 次クリオスタツ トにて薄切しへマトキシリン ' ェォシン染色にて軟骨細胞死の評価 を行った。 結果は図 19〜24に示したように、 TAT-Bcl-xFNKは TAT-Bcl-xしより軟骨 細胞死を抑制し、 その差は 9 日間培養の軟骨組織で顕著であった。 培地中の TAT- Bcl-xFNK タンパク質が軟骨組織の中に埋もれている軟骨細胞に取リ込まれてその強 力な細胞死抑制活性が発揮されることが示された。 実施例 12： TAT-Bcl-xFNK のマウスへの投与とス亍ロイ ドホルモンによる肝臓細胞 死抑制効果の確認
8週令のマウス（体重 20 gの C56BL種のメス） 3匹を 3群 (A,B,C)に分けた。 A群の マウスには 100 の TAT-Bcl-xFNKタンパク質 (可溶性画分から調製)が溶けている PBS溶液 (0.8ml)を腹腔内に投与した。 B群と C群（コントロール)のマウスには PBS 溶液 (0.8 ml)を同じように腹腔内に投与した。 ゲージに戻して 3時間後に A群と B群 のマウスにステロイ ドホルモン （デキサメタゾン） 0.5 mgが溶けている 25<½ェタノ ール /PBS溶液 0.5 ml を腹腔内に投与した。 C群のマウスには 25%エタノール/ PBS 溶液 0.5 ml を腹腔内に投与した。 ゲージに戻して 3時間後に屠殺し、 肝臓を摘出し て凍結し、 クリオスタツ トにて薄切しへマトキシリン · ェォシン染色にて実質細胞 死を評価した。 図 26に示したような B群におけるデキサメタゾンによる肝臟組織の 変性と細胞死、 TAT-Bcl-xFNKの前投与によって著しく抑制され （A群： 図 25) 、 そ の程度はコントロール （C群： 図 27) より良いことが確認された。
以上の結果は、 腹腔内に投与された TAT-Bcl-xFNKタンパク質が肝臓の実質細胞に 取り込まれ、 デキサメタゾンによる細胞死を強力に抑制していることを示すもので
産業上の利用可能性
以上詳し〈説明したとおり、 この出願の発明によって、 細胞死抑制作用がさらに 増強された改変型ラッ ト Bcl-xし タンパク質を細胞内で発現することのできる改変型 cDNAと、 この改変型 cDNAを保有する組換えベクター、 この組換えべクタ一による 形質転換細胞が提供される。 この形質転換細胞は、 無血清培地でも増殖可能であり、 例えば、 生理活性物質やモノクローナル抗体等の有用物質を効率よく生産するため の細胞培養系等として有用である。 さらに、 この出願の発明によって細胞死抑制作 用がさらに増強された改変型ラッ ト Bd-xL タンパク質が提供される。 この改変型タ ンパク質は、 細胞膜通過ペプチドを備えることによって、 細胞内に取り込まれ、 細 胞内で一過性にアポトーシス ·細胞死抑制作用を発揮するため、 たとえば各種の細 胞死による疾患の治療薬や、 移植細胞 ·臓器等を安定に維持するための添加剤等の 成分として有効である。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号 1 に塩基配列を示したラッ ト bcl-x遺伝子の cDNA配列において、 コ 一ド領域の第 22番目 Tyrを Pheに変換する塩基置換、 第 26番目 Ginを Asnに変換 する塩基置換および 165番目 Arg を Lysに変換する塩基置換のうち、 少なくとも一 つの塩基置換を有することを特徴とするラッ ト bd-x遺伝子の改変型 cDNA。
2 . 5 '側に、 細胞膜通過ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドを連結してい る請求項 1 の改変型 cDNA。
3 . オリゴヌクレオチドが、 配列番号 1 2または 1 3のアミノ酸配列をコードす るオリゴヌクレオチドである請求項 2の改変型 CDNA。
4 . 請求項 1から 3のいずれかの改変型 cDNAを保有する組換えベクター。
5 . 請求項 4の組換えベクターが導入された形質転換細胞。
6 . 請求項 1 記載の改変型 cDNA が発現するタンパク質であって、 配列番号 2に おける第 22番目 Tyrを Pheに変換するアミノ酸置換、 第 26番目 Ginを Asnに変換 するアミノ酸置換、 および 165番目 Arg を Lys に変換するアミノ酸置換のうち、 少 なくとも一つのアミノ酸置換を有することを特徴とする改変型タンパク質。
7 . N末端側に細胞膜通過べプチドを連結している請求項 6の改変型タンパク質。
8 . 細胞膜通過ペプチドが、 配列番号 1 2または配列番号 1 3のアミノ酸配列を 有するオリゴぺプチドである請求項 7の改変型タンパク質。
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