WO2007024008A1 - 細胞死抑制活性強化タンパク質fnkまたはそれをコードする核酸を含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤 - Google Patents

Abstract

細胞死抑制活性強化タンパク質FNKまたはそれをコードする核酸を含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤の提供。Bcl-xLタンパク質の第22番目のTyrのPheへの置換、第26番目のGlnのAsnへの置換および165番目のArgのLysへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するFNKタンパク質またはそれをコードする核酸を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

Description

細胞死抑制活性強化タンパク質 FNKまたはそれ'をコードする核酸を含む抗癌治療 の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤 技術分野

本発明は、 細胞死抑制活性強化タンパク質 FNKまたはそれをコードする核酸を 含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤に関する。

明

細

背景技術 ■

正常細胞は細胞周期や細胞増殖に関する機能に変化を来すと不死化、 形態変化 などの悪性形質を獲得し、 癌化することが知られている。 このため、 この癌細胞 を除去するために、 化学療法及び放射線療法等を行うが、 癌細胞であっても悪性 形質以外は正常細胞と共通の性質を有するため、 癌細胞のみならず、 正常細胞に も毒性を示すことが多い。 この正常細胞に対する毒性がすなわち化学療法及び放 射線療法の副作用となつて現れてくる。 ' 副作用を受けやすい正常細胞は、 骨髄細胞、 毛母細胞、 口腔粘膜や腸管粘膜な どの消化管粘膜上皮細胞の幹細胞など活発に分裂 ·増殖する細胞である。 このた め、 抗癌治療を行ったときには、 骨髄抑制や、 脱毛、 消化管粘膜傷害を示す。 例 えば、 シスブラチン'など代表的な抗癌剤は重大な副作用として、 聴力障害が発生 し、 そのため抗癌剤の投与が継続できない場合が多々ある。 また、 ストレプトマ イシン、 ゲンタマィシン等の抗生物質またはアミノグリコシド系抗生物質でも副 作用で聴力障害が発生することが報告されている （非特許文献 1から 3を参照）。 このため、 抗癌剤による消化管粘膜障害や聴力障害等の副作用を防ぐごとが求め られてきた。

この副作用を軽減するための方法として、サイタリン依存性キナーゼ II阻害薬 を用いたり （特許文献 1等参照）、カスパーゼインヒビターを用いて正常細胞の細 胞死を抑制したり （特許文献 2等参照）、副作用が現れた時点で、抗癌治療を中止 するなどして副作用の軽減に努めてきた。 また、 聴力障害に対しては、 NOS (L- アルギニンを基質とする酵素） 阻害剤を腹腔内投与するなどして、 聴力障害を予 防及ぴ治療方法について検討されてきた。

しかし、 副作用によって抗癌治療を中止することは癌細胞の除去を断念するこ とを意味するため、 副作用の少ない抗癌治療が望まれている。

シスプラチン.やアミノグリコシド系抗生物質による聴力障害にはアポトーシス が関与すると報告されているが（非特許文献 1から 5を参照）、アポトーシス自体 をコント'ロールする試みは成されていない。 また、 モルモッ トモデルで誘導型一 酸化窒素合成酵素を抑制し、 聴力障害を軽減する報告は存在するが （非特許文献 6参照）、 その効果 十分でなかった。

特許文献 1 特表 2003- 502362号公報 ，

特許文献 2 特表 2003-511463号公報

非特許文献 1 Corbacel la E, et al. , Hear Res. 2004 Nov ; 197 (1—2)： 11 - 8 非特許文献 2 Dehne N, et al.， Hear Res. 2002 Jul； 169 (1-2)： 47- 55 非 特許 文 献 3 Lefebvre PP， et al.， Audiol Neurootol. 2002

非特許文献 4 Watanabe K. et al, Chemotherapy 2002 ; 48 : 82- 7 , ' 非特許文献 5 Watanabe K. et al. , Anticancer Drugs 2000； 11： 731-5 非特許文献 6 Watanabe K. et al. , Anticancer Drugs 2000；11：401 発明の開示 '

本発明は、 細胞死抑制活性強化タンパク質 FNKまたはそれをコードする核酸を 含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤の提供を目的とす る。 '

本発明者は、 先にアポトーシス抑制タンパク質である - を改変してその活 性を強化したタンパク質である FNKを開発した（特開 2001-120281号公報）。また、 本発明者等は細胞死抑制活性強化タンパク質である PTD-FNKが脱毛を防止するこ とを見出し、特願 2005 - 71501として既に出願している。 また、骨髄細胞の保存の ためにも本タンパク質が有用であることを見出し、特願 2005 - 71819として出願を している。 本発明者は、 FNK _;の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用に対する効果について 鋭意検討を行った。

FNK は、 従来用いられてきたアポトーシス抑制タンパク質では得られない程の 優れた効果を発揮する。 また、 FNK は、 アポトーシスのみでなく、 ネクローシス も含めた細胞死を抑制する (Zonal necrosis prevented by transduction of the artificial anti-death FNK protein. Asoh, S. et a丄.， Cell. Death Differ. 12, 384-394 (2005) )。従って、 FNKが抑制する細胞死はアポトーシスに限定されない。 FNKの改変元となった Bel- _XjJま様々な生物種に存在するが、 その配列は非常によ く似ている。 本件 は、 ラット由来の FNKを用いたが、 いずれも細胞死抑制効果 を有していることがわかり、 その他の生物種由来の FNKでも同じような効果が予 想される。 従って、 FNKを作製するにあたって、 その改変元となる Bel - ^の生物 種は限定されない。

通常、 タンパク質は細胞膜を通過できない。 従って、 細胞外から FNKを投与す るためには、 細胞膜を通過させるための手段が必要となる。 そのため、 . FNK の N 末端側に PTD (細胞膜通過ドメイン） を連結させた。 本件では、 TATを PTDとして 用いたが、 いずれも細胞死抑制効果を有していることがわかった。 従って、. この PTD は、 細胞膜通過機能を有していればよく、 特定の配列に限定されない。 さら に、 FNKをコードする核酸を細胞に導入する方法について検討を行った。

そして今回、 これらの細胞死抑制活性強化タンパク質である FNKが化学療法及 ぴ放射線療法による'副作用の軽減に繋がることを見出し、 本発明を完成させた。 すなわち、 本発明の態様は以下の通りである。

[ 1 ] Bel - x_Lタンパク質の第 22番目の Tyrの Pheへの置換、 第 26番目の Ginの

Asnへの置換おょぴ 165番目.の Argの Lysへの置換のうちの少なくとも 1つの置 換を有する FNKタンパク質を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副 作用の予防または治療剤。

[ 2 ] Bel- x_Lタンパク質がヒ ト由来 （配列番号 5 )、 マウス由来 （配列番号 6 )、 ラット由来（配列番号 7 )、 ブタ由来（配列番号 8 ) およびィヌ由来（配列番号 9 ) Bcl-x_Lタンパク質から選択される [ 1 ]の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予 防または治療剤。 [3] Bel- タンパク質がヒ ト由来 （配列番号 5)、 マウス由来 （配列番号 6)、 ラッ ト由来 （配列番号 7)、 ブタ由来 （配列番号 8) およびィヌ由来 （配列番号 9) Bel- タンパク質から選択され、 さらに第 22番目、 第 26番目おょぴ 165番目の アミノ酸以外のアミノ酸の 1個または数個のアミノ酸が欠失、 付加または置換し たアミノ酸配列を有するダンパク質であって、 FNK タンパク質活性を有するタン パク質である [ 1〕または [ 2 ]の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または 治療剤。 ' '

[4] 抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が抗癌治療による細胞死による副作用 である [1]〜[ 3]のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または 治療剤。 '

[5] 抗癌治療の効果を低下させない、 [1 ]〜[4]のいずれかの抗癌治療の細胞 毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

[6] FNK タンパク質の N末端側に細胞膜通過ペプチドが連結している、 [1]〜 [5]のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

[7] 細胞膜通過べプチドが、以下のぺプチド（i；)〜（xiii)のいずれかから選択さ れる [6]の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。 ， '

(i) 6〜 1 2個のアルギニンからなるペプチド、

(ii) 6〜 1 2個のリシンからなるペプチド、 ·

(iii) 6〜 1 5個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、

(iv) (i)から（iii)めいずれかのぺプチドにおいて、数個のアミノ酸がダリシンに 置換されたペプチド、

(V) 配列番号 1 1で表される（i)のペプチド、

(vi) 配列番号 1 3で表される（iii)のペプチド、

(vii) 配列番号 1 5で表される（iv)のペプチド、 '

(viii) 配列番号 1 7で表されるペプチド、

(viiii) 配列番号 1 8で表されるペプチド、

(X) 配列番号 1 9で表されるペプチド、

(xi) 配列番号 20で表されるペプチド、

(xii) 配列番号 2 1で表されるペプチド、 ならびに (xiii) 配列番号 2 2,で表されるペプチド

[8] Bel- タンパク質の第 22番目の Tyrの Pheへの置換、 第 26番目の Ginの Asnへの置換おょぴ 165番目の Argの Lysへの置換のうちの少なくとも 1つの置 換を有する FNKタンパク質をコードする核酸を有効成分として含む抗癌治療の細 胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。 ,

[9] Bel- _¾タンパク質がヒ ト由来 （配列番号 5)、 マウス由来 （配列番号 6)、 ラット由来（配列番号 7)、 プタ由来（配列番号 8 ) およぴィヌ由来（配列番号 9) Bcl-x_Lタンパク質から選択される [ 8 ]の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予 防または治療剤。 ，

[ 1 0] Bel - X,タンパク質がヒト由来（配列番夸 5)、マウス由来（配列番号 6)、 ラット由来（配列番号 7)、 ブタ由来（配列番号 8)およびィヌ由来（配列番号 9) Bel- タンパク質から選択され、 さらに第 22番目、 第 26番目および 165番目の アミノ酸以外のアミノ酸の 1個または数個のアミノ酸が欠失、 付加または置換し たアミノ酸配列を有するタンパク質であって、 FNK タンパク質活性を有するタン パク質である [ 8 ]または [ 9 ]の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または 治療剤。 · ' ' .

[ 1 1 ] 抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が抗癌治療による細胞死による副作 用である [ 8 ]〜 [ 1 0 ]のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防ま たは治療剤。

[ 1 2] 抗癌治療の効果を低下させない、 [ 8]〜[ 1 1 ]のいずれかの抗癌治療の 細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

[ 1 3 ] FNKタンパク質をコードする核酸の 5'側に細胞膜通過ぺプチドをコ一ド する核酸が連結している [ 8 ]〜 [ 1 2 ]のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく 副作用の予防または治療剤。

[ 1 4] 細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（i)〜（xiii)のいずれかから選択 される [ 1 3 ]の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

(i) 6〜 1 2個のアルギニンからなるペプチド、

(ii) 6〜 1 2個のリシンからなるペプチド、 (iii) 6〜 1 5個の,アルギニンおょぴリシンからなるペプチド、

(iv) (i)から（iii)のいずれかのぺプチドにおいて、数個のアミノ酸がダリシンに 置換されたペプチド、

(V) 配列番号 1 1で表される（i)のペプチド、

(vi) 配列番号 1 3で表される（iii)のペプチド、 .

(vii) 配列番号 1 5で表される（iv)のペプチド、

(viii) 配列番号 1 7で表されるペプチド、

(viiii) 配列番号 1 8で表されるペプチド、

(X) 配列番号 1 9で表されるペプチド、 ，

(xi) 配列番号 20で表されるペプチド、 .

(xii) 配列番号 21で表されるペプチド、 ならびに '

(xiii) 配列番号 2 2で表されるペプチド

[1 5] 抗癌治療が X線照射である [1 ]〜[14]のいずれかの抗癌治療の細胞毒 性に基づく副作用の予防または治療剤。 '

[1 6] 抗癌治療が抗癌剤投与である [1]〜[1 4]のいずれかの抗癌治療の細胞 毒性に基づく副作用の予防または治療剤。 ' '

[1 7] 抗癌治療の細胞死に基づく副作用が、 造血組織障害、 消化管粘膜を含む 消化器の障害、 心臓障害、 肺障害、 腎障害、 神経障害、 口内炎、 聴力障害、 皮膚 障害からなる群から選択される [ 1 ]〜 [ 1 6 ]のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に 基づく副作用の予防または治療剤。

[1 8] X線照射による消化管粘膜障害を予防または治療し得る、 [1]〜[1 4] のいずれかの抗癌治療の細胞毒性基づく副作用の予防または治療剤。

[1 9] 抗癌剤投与による消化管粘膜を含む消化器の障害、 造血組織障害、 腎臓 障害およぴ聴覚障害からなる群から選択される副作用を予防または治療し得る、

[ 1 ]〜 [ 1 4：]のいずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療 剤。

[20] 抗癌剤投与による聴力障害を予防または治療し得る、 [1]〜[1 4]のい ずれかの抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

[2 1] 抗癌剤投与による消化管粘膜障害を予防または治療し得る、 [1]〜[1 4 ]のいずれかの抗率治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

[ 2 2 ] 抗癌剤が 5- FU (5 -フルォロウラシル）、 CPT-11 (イリノテカン） および CDDP (シスブラチン）からなる群から選択される； [ 1 6 ]〜[ 2 1 ]のいずれかの抗 癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-241685号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明

図 1は、 ヒト、 ラット、 マウス、 ブタおよびィヌ由来の Be卜^タンパク質のァ ミノ酸配列のアラインメントを示す図である。 .

図 2は、 PTD- FNK によるシスプラチンの致死作用の軽減効果 （生存率の上昇）' を示す図である。

図 3 Aは、 PTD- FNK投与がシスブラチンの抗癌活性（腫瘍体積縮小効果） を抑制 しな'いことを示す図である。 '

図 3 Bは、 PTD- FNK投与がシスブラチンの抗癌活性（腫瘍体積縮小効果） を抑制 しないことを示す （試験数を増やした場合） 図である。 ， ' 図 4は、担癌マウスを用いた、 イリノテカンと 5-フルォロウラシルの抗癌活性 に対する PTD- FNK投与の影響の検討の結果を示す図である。

図 5は、 PTD-FNK による X線照射による副作用 （腸粘膜障害） の軽減効果を示 す写真である。 写真中のバーの長さは 50 μ πιである。

図 6は、 PTD-FWUこよる 5- FU投与による副作用 （腸粘膜障害） の軽減効果を示 す図である。

図 7は、 PTD-FNKによる 5 - FU投与による副作用 （腸粘膜障害） の軽減効果を示 す写真である。 写真中のバーの長さは 50' Ai mである。 '

図 8は、 PTD-FNKによる 5 - FU投与による副作用 （脾臓障害） の軽減効果を示す 写真である。 写真中のバーの長さは 100 /z mである。

図 9は、 PTD-FNK による塩酸ィリノテカイン投与による副作用 （腸粘膜障害） の軽減効果を示す写真である。 写真中のバーの長さは 50 μ πιである。

図 1 0は、 PTD- FNK によるシスブラチン投与による副作用 （腎臓障害） の軽減 効果を示す写真であ,,る。.写真中のバーの長さは 50 ^ πιである。

図 1 1は、 PTD - FNKによる 5 - Fuおよび CPT- 11投与による副作用 （小腸炎症傷 害） の軽減効果を示す図である。

図 1 2 Aは、 担癌マウスにおける、 腫瘍の存在様式を示す図である。

図 1 2 Bは、 PTD-FNKが癌組織に取り込まれないことを示す写真である。'写真中 のバーの長さは 50 μ ηιである。

図 1 3は、 PTD-FNK が骨髄中 細胞に取り込まれることを示す写真である。 写 真中のバーの長さは _{50 /x} mである。

図 1 4は、 PTD-FNKと Z - VAD - fmkの副作用低減効果の比較を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 ' ― ' ' 本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の治療剤または予防剤が有効成分 として含む細胞死抑制活性強化タンパク質である FNK は、 がん原遺伝子である Bcl-2 遺伝子 (Science 226 (4678)： 1097- 1099， 1984； Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (22) : 7166- 7170， 1984； Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (14) : 5214- 5218， 1986; Gell47 (l) : 19-28, 1986) と類似の構造を有する Bel- 2ファミリーに属する.. Bel - ^ 遺伝子（Cell 74 (4) : 597-608, 1993)を改変することにより得られる。

FNKは、 Bel - X,タンパク質の第 22番目の Tyrの Pheへの置換、第 26番目の Gin の Asnへの置換および 165番目の. Argの Lysへの置換のうちのいずれか 1つ、 い ずれか 2つまたは 3'つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する。 好ましく は 3つが置換されている。 FNK をコードする遺伝子は、 Bel- 遺伝子のコード領 域において、 第 22番目の Tyrをコードするトリプレツ トコ ドン（tac)を Pheをコ ードするコドン （tttまたは ttc) に置換する塩基の置換、 第 26番目の Ginをコ ードするコドン（cag)を Asnをコードするコドン（aatまたは aac)に置換する塩基 の置換おょぴ第 1δ5番目の Argをコードするコドン（egg)を Lysをコードするコド ン（aaaまたは aag)に置換する塩基の置換のうちのいずれか 1つ、いずれか 2つま たは 3つの置換を有するように塩基配列を変異させることにより得られる。 FNK タンパク質をコードする DNA配列おょぴアミノ酸配列の一例として、 ラット由来 のものをそれぞれ配列番号 1および 2に、 ヒ ト由来のものをそれぞれ配列番号 3 および 4に示す。 ：

本発明で用いる FNKはいかなる動物種由来の Be 1-X,タンパク質を改変したもの でもよく、 例えばヒ ト、 マウス、 ラッ ト、 ブタ、 ィヌ由来の Bel- タンパク質が 挙げられる。 図 1にヒ ト、 マウス、 ラット、 ブタ、 ィヌ由来の Bel - タンパク質 のアラインメントを示す。 また、 ヒ ト、 マウス、 ラッ ト、 ブタおよびィヌ由来の Bel- xj^タンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 5〜 9に示す。 図 1におい て、 いず Lの動物種由来の Bcl- タンパク質のアミノ酸配列においても、 第.22 番目のアミノ酸は Tyrであり、 第 26番目のアミノ酸は Ginであり、 165番目のァ ミノ酸は Argである。 図 1に示されている動物種以外の動物種由来の 801 ₁₁タン パク質においても、 これら 3箇所のアミノ酸は保存されていると考えられ、 本発 明の FNKタンパク質は.由来動物種を問わず、 B'cl-x,タンパク質のアミノ酸配列に おいて、 第 22番目の Tyrの Pheへの置換、 第 26番目の Ginの Asnへの置換およ び 165番目の Argの Lysへの置換のうちのいずれか 1つ、 いずれか 2つまたは 3 つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。 また、 本発明の FNKタンパク質は、 各種動物由来の FNKタンパク質が有するアミノ酸配 列において、 第 22番目、 第 26番目および 165番目のアミノ酸以外のアミノ酸の

1個または数個のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、 FNKタンパク質活性を有するタンパク質、 または FNKタンパク質が有するアミノ 酸配列において、 1個または数個のアミノ酸が欠失または付加されたアミノ酸配 列を有するタンパク質であって、 FNK タンパク質活性を有するタンパク質も包含 する。 1個または数個のアミノ酸の欠失、 置換または付加は、 1〜 1 0個、 1〜

9個、. ：！〜 8個、 1〜7個、 1〜6個、 ：！〜 5個、 1〜4個、 1〜3個、 1もし くは 2個、 1個のアミノ酸の欠失、 置換または付加のいずれかである。 図 1に示 すように、 ヒ ト、 マウス、 ラット、 ブタおよぴィヌの間では 28番目、 40番目、 43番目、 45番目、 168番目、 193番目、 220番目のアミノ酸のいずれかが異なる。 このことは少なく ともこれらのアミノ酸が置換、 欠失等により変異しても FNKの 活性は保持されることを意味する。 例として、 28番目のアミノ酸のセリンおよび トレオニンの間の置換、 40番目のアミノ酸のグルタミン酸およぴグリシン間の置 換、 43番目のアミノ酸のセリン、 ァラニンおよびプロリン間の置換、 45番目のァ ミノ酸のメチォ二 >、 アルギニンおよびァラニン間の置換、 168 .番目のアミノ酸 のァラニン、 セリンおょぴトレオニン間の置換、 ならびに 193番目のアミノ酸の グルタミン酸およびァスパラギン酸間の置換、 'ならびに 220番目のアミノ酸のバ リンおよびロイシン間の置換が挙げられる。 このようなタンパク質は、 異種動物 の FNKタンパク質のハイブリッドタンパク質も包含する。 例え.ば、 FNKタンパク 質の N端側半分がヒ ト由来のアミノ酸配列を有し、 C端側半分が他種動物由来の アミノ酸配列を有する FNKタンパク質が包含される。. 一般に、 遺伝子には個体特 異的な遺伝的多型が知られている。 ヒ トの Bel- ^タンパク質においても、 F皿タ ンパク質活性に影響を与えない部位にアミノ酸置換 遺伝的多型） がある場合が あり、例えば、配列番号 5に表すヒ ト Bel - _¾タンパク質のアミノ酸配列において、 第 70番目の Glyが Alaに置換されているものが知られている。本発明の FNKタン パク質は、 このような個体特異的なアミノ酸置換であって、 FNK タンパク質活性 に大きな影響を与.えないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質 をも包含する。 '

本発明の FNKタンパク質は、 本明細書に記載の Bel- タンパク質もしくは FNK タンパク質のアミノ酸配列また Bel - ^遺伝子もしくは FNKタンパク質を,コード する DNAの塩基配列情報を基に、 得ることができる。 例えば、 特開 200卜 120281 号公報には、 ラッ ト由来の FNKタンパク質について記載されており、 該公報の記 載に従って本発明の FNKタンパク質を得ることができる。

本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤に用いる FNK タンパク質の N末端側には、 細胞膜通過ドメイン（PTD)が連結していてもよい。 細胞膜通過ドメインはアルギニン、 リシンを含む塩基性アミノ酸を種に含む細 胞膜通過ペプチドからなり、アミノ酸の光学異性体（D体、 L体） に依存しない。 細胞膜通過ペプチドとしては種々のものが知られており、 本発明においてはいか なる細胞膜通過べプチドを用いることができる。

細胞膜通過べプチドとして、 6個から 1 2個、 好ましくは 7個から 11個、 さら に好ましくは 9個または 10 個のアルギニンのみまたはリシンのみからなるぺプ チド、 5個から 15個のアルギニンおょぴリシンからなるペプチド、 ならびに前記 アルギニンのみまたはリシンのみからなるぺプチドまたはアルギニンおよびリシ ンからなるペプチド ,において、 数個、 好ましくは 1個から 8個のアミノ酸がダリ シンに置換されたぺプチド等が挙げられる。 例としてアルギニン 9個からなるぺ プチド （R9、配列番号 1 0および 1 1 )、 アルギニン 7個およびリシン 個からな るペプチド （K2R7、配列番号 1 2および 1 3 )、 アルギニン 7個およびグリシン 6 個からなるペプチド （R7G6、 配列番号 1 ·4および 1 5 ) 等が挙げられる。 これら の細胞膜通過ペプチドを連結するとき、 FNK タンパク質のアミノ酸配列の第 1番 目のメチォニンは残しておいて よいし、 除去してもよい。 ' また、細胞膜通過べプチドとして、 HIV - 1 · ΤΑΤの細胞膜通過ドメイン （protein transduction domain) YGRKKRRQRRR (配列番号 1 6および 1 7 ) ゃショウジヨウ バエのホメォボックスタンパク質アンテナぺディァの細胞膜通過ドメイン RQIKIWFQNR腿 KWKK (配列番号 1 8 )が挙げられる。その他、 VP22の C末端（267- 300) ぺ プ チ ド DAATATRGRSAASRPRERPRAPARSASRPRRPVE ( 配列 番 号 1 9 ) 、 HIV-1/Rev (34- 50)ぺプチド TRQARRNRRRRWRERQR (配列番号 2 0 )、 FHV/coat (35-49) ぺプチド RRRRNRTRRNRRRVR (配列番号 2 1 )、 K- FGFの N末端（7-22)の疎水性領域 AAVALLPAVLLALLAP (配列番号 2 2 )等が挙げられる。 . また、 FNK タンパク質と細胞膜通過ペプチドの間にスぺーサー配列を有.してい てもよい。 スぺーサー配列はアミノ酸数個からなりその配列には限定はないが、 例えば、 1個から 5個、 好ましくは 1個から 3個、 さらに好ましくは 1個のダリ シンが挙げられる。

これらの細胞膜通過ぺプチドは、 それぞれの細胞膜通過べプチドをコードする DNAを FNKをコードする DNAと連結して融合 DNAを作製し、 この融合 DNAを遺伝 子工学の手法により大腸菌等の宿主細胞で発現させることによって、 N末端側に 細胞膜通過べプチドを連結した FNKタンパク質を作製することができる。 あるい はまた、 2価の架橋剤 （例えば、 EDCや ]3 -ァラニン等を介して、 FNKタンパク質 と細胞膜通過ぺプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ぺプチドを連結した FNKタンパク質を作製することができる。

細胞膜通過べプチドを連結した FNKタンパク質として、 ヒ ト FNKタンパク質に

K2R7ぺプチドを連結させたもの （DNA配列を配列番号 2 3に、 アミノ酸配列を配 列番号 2 4に示す）、 ヒ ト FNKタンパク質に R7G6ペプチドを連結させたもの（DNA 配列を配列番号 2 5；に、ァミノ酸配列を配列番号 2 6に示す）、 ヒト FNKタンパク 質に R9ぺプチドを連結させたもの （DNA配列を配列番号 2 7に、 ァミノ酸配列を 配列番号 2 8に示す）、 ヒ ト FNKダンパク質に 1個の Glyをスぺーサ一として Tat の細胞膜通過ドメインを連結させたもの （DNA配列を配列番号 2 9に、 アミノ酸 配列を配列番号.3 0に示す） およびラット FNKタンパク質に 1個の Glyをスぺー サ一として Tatの細胞通過ドメインを連結させたもの （DNA配列を配列番号 3 1 に、 アミノ酸配列を配列番号 3 2に示す） 等が挙げられる。

さらに、 本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤は、 上記 FNKタンパク霄をコードする DNA、 RNA等の核酸を含む予防または治療剤を含 む。 この場合、 FNKタンパク質は上記のすべての変異を有する FNKタンパク質が 包含される。 . + .

さらに、 本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤は、 FNKタンパク質をコードする核酸の 5 '側に上記の細胞膜通過べプチド（PTD)をコ ードする核酸を連結させた核酸を含む予防または治療剤を含む。 該核酸は、 上記 の FNKタンパク質の N末端側に細胞膜通過べプチドが連結しているタンパク質を コードする核酸である。 .. これらの FNKタンパク質をコードする核酸およぴ FNKタンパク質に細胞腠通過 ぺプチドを連結させたタンパク質をコードする核酸は、 本明細書に記載の Bcl-_¾ をコードする DNAもしくは FNKタンパク質をコードする DNA、 ならびに細胞膜通 過ペプチドのァミノ'酸配列から推定される塩基配列を基に得ることができる。 例 えば、 特開 2001- 120281号公報には、 ラット由来の FNKタンパク質をコードする

DNAについて記載されており、 該公報の記載に従って本発明の FNKタンパク質を 得ることができる。 例えば、 配列番号 1にヒト由来の FNKタンパク質をコードす る DNA、 配列番号 2にラット由来の FNKタンパク質をコードする DNA .が記載され ている。'本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤が含む

DNAの一例として、 配列番号 1もしくは 2に表される DNAまたは該 DNAに相補的 な DNAにストリンジヱントな条件でハイブリダィズする DNAが含まれる。 また、 配列番号 1もしくは 2に表される DNAに細胞膜通過ぺプチドが連結した DNAまた は該 DNAに相補的な DNAにストリンジェントな条件でハイブリダイズする DNAが 含まれる。 ここで、 ス トリンジェントな条件でハイブリダイズする DNAの一例と して、 DNAを固定したフィルターを用いて、 0. 7〜1· 0Mの NaCl存在下、 68°Cでハ イブリダィゼーシヨンを行った後、 0.：！〜 2倍濃度の SSC溶液 （1倍濃度の SSCと は 150mM NaCl、 15mM クェン酸ナトリウムからなる） を用い、 68°Cで洗浄するこ とにより同定す.ることができる条件をいう。 あるいは、 サザンブロッティング法 によりニトロセルロース.膜上に DNAを転写、 固定後、 ハイプリダイゼーシヨン緩 衝液 〔50% フオルムアミ ド、 4 X SSC、 50mM HEPES (pH7. 0)、 10 Xデンハル.ッ

(Denhardt' s) 溶液、 100 /z g/mlサケ精子 DNA〕 中で 42°Cでー晚反応させること によりハイブリッドを形成することができる DNAが挙げられる。

本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤に用いる FNK タンパク質は、 上記の細胞瞎通過べプチドを連結させる他に種々の方法で細胞に 導入することができる。 例えば、 目的タンパク質と非共有結合的相互作用によつ て複合体を形成し細胞内に導入するぺプチド性キヤリァー、 例えば Chariot (Active Motif 社， カルフォルニア， USA)を用いることができる。 また、 本発明の FNK タンパク質にポリアミノ基を結合させてもよい。 また、 リポソ一ムに本発明 の FNKタンパク質を封入し、 被治療動物に投与してもよい。 この場合、 リポソ^" ム表面に糖鎖を結合させることにより、 目的の細胞に導入することができる'。 さ らに、 公知の非ウィルスベクター、 例えばセンダイウィルスの細胞融合活性を担 う膜成分（エンベロープタンパク質）の活性を残したままウィルスの複製能を完全 に不活化した HVJ」Eベクター （石原産業株式社） を用いて導入することがで きる。 その他、 種々の公知のドラッグデリバリーシステムを用いてもよい。

本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤に用いる FNK タンパク質をコードする核酸および FNKタンパク質をコードする核酸に細胞膜通 過ぺプチドをコードする核酸を連結させた核酸は以下の方法により細胞に導入す ることができ、 細胞内で発現させ、 遺伝子治療を行うことができる。

核酸を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、 細胞への遺伝子導 入法としては、リポフヱクション法、遺伝子銃法、リン酸-カルシウム共沈法、 DEAE- デキストラン法、 微小ガラス管を用いた DNAの直接注入法などが挙げられる。 ま た、 非ウィルスベクターまたはウィルスベクターを用いることができる。 その調 製法、 投与法は例え,,ば、 別冊実験医学、 遺伝子治療の基礎技術、 羊土社、 1996 ; 別冊実験医学、 遺伝子導入 &発現解析実験法、 羊土社、 1997 ; 日本遺伝子治療学会 編、 遺伝子治療開発研究ハンドブック、 ェヌ ·ティー 'エス、 1999等に記載され ている。

非ウィルスベクターを用いる場合は、 公知の遺伝子発現べクターが組み込まれ た組換え発現ベクターを用いて、目的核酸を細胞に導入することができる。また、 内包型リボソーム（internal l iposome)による遺伝子導入法、静電気型リポソーム (electorostatic type 1 iposome)による遺伝子導入法、 HVJ -リボソーム法、 改良 型 HVJ-リポソ一ム¾ 0^：[ - AVEリポソーム法）、 HVJ - E (エンベロープ）ベクターを用 いた方法、 レセプター介在性遺伝子導入法、 パ ティクル銃で担体（金属粒子）と ともに DNA分子を細胞に移入する方法、 naked- DNAの直接導入法、 正電荷ポリマ 一による導入法等により、 組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可 能である。このうち HVJ-リボソームは、脂質二重膜で作られたリボソーム中に DNA を封入し、 さ ら にこ の リ ポソーム と 不活化 したセ ンダイ ウィ ルス (Hemagglut inat ing virus of Japan : HVJ)とを融合させたものである。 HVJ-リポ ソ ムの調製法については文献（実験医学別冊、 遺伝子治療の基礎技術、 羊土社、 1996 ； 遺伝子導入 &発現解析実験法、 羊土社、 1997 ； J. Cl in. Invest. 93， 1458-1464 (1994)； Am. J. Physiol. , 271, R1212- 1220 (1996) )などの記載に従えば よい。 HVJリボソーム法とは、例えば Molecular Medicine, 30, 1440-1448 (1993) ； 実験医学， 1， 1822 -' 1826 (1994) ；蛋白質 .核酸 .酵素， 42, 1806-1813 (1997)等 に記載の方法であり、 好ましくは Circulat ion, 92 (Suppl. II) , 479-482 (1995) に記載の方法が挙げられる。 HVJ- E (エンベロープ） ベクターは、 外来遺伝子を不 活化したセンダイウィルスエンベロープに導入したものであり、 W001/57204号国 際公開公報の記載に従い調製することが可能である。 用いる発現べグタ'一は、 生 体内で目的核酸を発現させることのできるベクターであればいかなるものも用い 得るが、 例えば pCAGGS (Gene 108， 193-200 (1991) ) や、 pBK - CMV、 pcDNA3、 1、 pZeoSV (インビトロゲン社、 ストラタジーン社）、 pVA l などの発現ベクターが挙 げられる。

ウィルスベクターとしては、 組換えアデノウイルス、 レトロウイルス等のウイ ルスベクター等を用 ることができる。 具体的には、 例えば、 無毒化したレトロ ゥイノレス、 アデノウイノレス、 アデノ随伴ウィルス、 ヘルぺスウィルス、 ワクシニ ァウィルス、 ボックスウィルス、 ポリ才ウイ/レス、 シンビスウイ/レス、 センダイ ウィルス、 SV40、免疫不全症ウィルス (HIV)等の DNAウィルスまたは RNAウィルス に目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウィルスを感染させることによって、 細胞内に遺伝子を導入することができる。 遺伝子治療剤の患者への導入は、 遺伝 子治療剤を直接体内に導入する in vivo法によってもよいし、 ヒトから細胞を取 り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、 その細胞を体内に戻す ex vivo 法によってもよい。 .

細胞膜通過ペプチドをコードする核酸を連結させた核酸の場合、 該核酸を導入 した細胞を体内に戻した場合、 細胞内で発現されたタンパク質は細胞膜通過ぺプ チドにより、 細胞外へ分泌され、 さらに他の細胞に入っていく。 また、 細胞膜通 過ぺプチドをコ一ドする核酸を連結させた核酸を導入した細胞を、 タンパク質は 通過させるが、 細胞は通過させないカプセルに入れて、 被治療動物に投与または 埋め込むこともできる。 この場合、 カプセル中で PTD- FNKが発現産生されカプセ ルから外に出て、体内に供給され、 FNKの治療効果を発揮する。 FNKによる治療が 必要なくなった場合、 前記カプセルを体内から取り出すことにより、 FNK の過剰 投与を防ぐことができる。 タンパク質を通過させるが、 細胞は通過させないカブ セルとしては、 多孔性の樹脂製カプセルを用いることができる。

本発明の FNKタンパク質もしくは PTDを連結した FNKタンパク質またはそれら をコードする核酸を含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療 剤が対象とする副作用として、 X線照射による副作用、 抗癌剤投与による副作用 が含まれる。 本発明において抗癌治療の細胞毒性とは、 抗癌治療に用いる放射線 や化学物質が正常細胞に障害を与えることをいい、 障害の種類として細胞死、 増 殖能、 DNA 合成能を含む細胞の各種機能の低下がある。 抗癌治療の細胞毒性に基 づく副作用として、 白血球減少、 血小板減少、 赤血球減少等の骨髄抑制あるいは 脾臓障害を含む造血組織障害、 腸管粘膜障害等の消化器障害、 心膜炎、 心筋炎症 候群等の心臓障害 （心毒性）、 間質性肺炎、 肺線維症等の肺障害 （肺毒性）、 尿細 管障害、 出血性膀胱炎等の腎臓障害 （腎毒性）、 末梢神経障害、 中枢神経障害等の 神経障害 （神経毒性)、 口内炎等の口腔粘膜障害、 脱毛、 聴力障害、 皮膚障害等が 挙げられる。 X線照射による副作用としては特に、 口腔粘膜を含む消化管粘膜の 障害などの消化器障害が挙げられる。 本発明において、 消化管粘膜障害とは、 口 腔から肛門に至る消化管の粘膜の障害をいい、 腸管粘膜障害や口腔粘膜障害等を 含む。 本発明の予防または治療剤が対象とする副作用をもたらす抗癌剤は、 限定 されず、 抗癌剤の細胞毒性に基づく副作用のすべてが治療または予防対象となり える。本発明が対象とする抗癌 として、二トロソゥレア剤、窒素マスタード（サ イク口フォスファミ ド等）、 ダカルバジン、 カルムスチン (BCNU)ヽ ブスルファン、 ィフォスフアミ ド、，塩酸二ムスチン、 口ムスチン （C.CNU)、 ラニムスチン （MCNU) 等のアルキル化剤 ； メ ト トレキセート、 アミノプテリ ン、 6 -メルカプトプリ ン、 5 -フルォロウラシル、 .カルモフール、 シタラビン、 ヒ ドロキシカルバミ ド、 ゲム シタビン等の代謝拮抗剤 ； ビンブラスチン、 ビンクリスチン、 パク リタキセル、 ドセタキセル、 CPT- 11 (イリノテカン）、 ェトポシド等の植物アル力ロイ ド剤；ダ クチノマイシン、 ァクチノマイシン D、 クロモマイシン、 了ドリァマイシン、 ダ ウノマイシン、 ブレオマイシン、 ぺプロマイシン、 ドノ ビシン、 ドキソ^^ビシ ン、 ェピルビシン、 マイ トマイシン C等の抗癌抗生物質；ホノレモン剤； レンチナ ン、 ピシバニール、 べスタチン等の生物機能修飾物質；プロカルバジン ； シスプ ラチン；カルボブラチンなどが例として挙げられる。

骨髄抑制は、上記のほとんどの抗癌剤治療の際の副作用であり、消化器障害は、 特にシスプラチン、 'ダカルバジン、 ダクチノマイシン、 窒素マスタード、 サイク 口フォスフアミ ド、 5 -フルォロウラシル、 CPT- 11 (イ リ ノテカン） 等の副作用で あり、 心毒性は特に、 アドリアマイシン、 タ"ウノマイシン、 サイク口フォスファ ミ ド、 シスブラチン、 5 -フルォロウラシル等の副作用であり、肺毒性は特にブレ ォマイシン、 力ノレムスチン、 マイ トマイシン D、 ブスノレファン、 メ ト トレキセー ト、 プロカルバジン、 サイクロフォスフアミ ド等の副作用である。 さらに、 腎毒 性は特にシスプラチン、 マイ トマイシン C、 メ ト トレキセート、 サイクロフォス フアミ ド、 ィフォスフアミ ド等の副作用であり、 神経毒性は特にビンク リスチン 等の植物アルカロイ ド剤、 シスプラチン、 メ ト トレキセート、 カルモフール等の 副作用であり、 口内炎は特にメ トトレキセート、 5-フルォロウラシル等の代謝拮 '抗剤、 植物アルカロイド剤等の副作用であり、 脱毛はすべての抗癌剤、 特にアド リアマイシン、 エトポシド等の副作用である。 さらに、 聴力障害は、 シスプラチ ン等の抗癌剤やアミノグリコシド系抗生物質投与の副作用である。

本発明の FNKタンパク質は、 正常組織の正常細胞にのみ取り込まれ、 腫瘍組織 のガン細胞には ¾ίり込まれず、 抗癌剤の治療効果を損なうことなく、 正常細胞の 抗癌治療による副作用を予防し、 または治療し得る。 また、 本発明の FNKタンパ ク質は骨髄中の細胞にも効率的に取りこまれ、 骨髄抑制等の抗癌治療による副作 用を予防し、 または治療し得る。.

本願発明の抗癌 療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤は、 特に 抗癌治療による副作用である聴力障害およぴ抗癌治療による副作用である腸管粘 膜障害や口内炎等の口腔粘膜障害 含む消化管粘膜障害の予防または治療に有効 である。 すなわち、 本発明は抗癌剤投与等の抗癌治療による細胞死に基づく聴力 障害または消化管粘膜障害の予防、 治療剤を包含する。

聴力障害は、 高音域に障害が現れ (高音障害型感音難聴）、 抗癌剤投与を中止し ても聴力は回復しない。 このため、 聴力障害は抗癌剤投与量を制限する要因にな つている。 抗癌剤投与量の増加に伴い聴力障害が出現しやすくなり、 特に;！日投 与量で 80mg/V以上、 総投与量で 300rag/ を超えると非常に出現しやすくなる。 アミノグリ コシド系抗生物質としては、 ス トレプトマイシン、 ゲンタマイシン、 ハべカシン、 カナマイシン、 アミカシン、 トブラマイシン、 ミクロノマイシン、 イセパシン、 アルべカシン等が挙げられる。

シスプラチンゃァミノダリコシド系抗生物質による内耳障害はアポトーシスが 関与していると考えられており、 アポトーシスが起きた時点での投与は障害の軽 減には寄与しないと考えられる。 従って、 本発明の治療剤は、 シスブラチンゃァ ミノグリコシド系抗生物質投与から早期の内耳障害に効果がある。 本願発明の抗 癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤は、 特にシスブラチンに よる障害に有効であり、 本願発明はシスブラチン難聴の予防または治療剤を包含 する。

本発明の FNKまたは PTDを連結した FNKを有効成分として含む抗癌治療の細胞 毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤は、種々の形態で投与することができ、 錠剤、 カプセル剤、 ，顆粒剤、 散剤、 シロップ剤、 飴、 トローチ、 口腔内崩壌錠、 口腔内粘膜への塗布若しくは添付剤などの口腔内に留まる剤形等による経口投与、 あるいは注射剤、 点滴剤、 座薬な.どによる静脈内、 筋肉内、 皮下および腹腔内の 注射または配薬を含む非経口投与を挙げることができる。 抗癌治療の細胞毒性に 基づく副作用の予防剤または治療剤は、 公知の方法によって製造され、 製剤分野 において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、 賦形剤と'しては、乳糖、ステアリン酸マグネシゥムなどが使用される。注射剤は、

FNKまたは PTDを連結した FNKを通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油 性液に溶解、 懸濁 たは乳化することによって調製する。 注射用の水性液として は、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、 適当 な溶解補助剤、 たとえばアルコール、 プロピレングリコールなどのポリアルコー ル、 非イオン界面活性剤などと併用してもよい。 油性液としては、 ゴマ油、 大豆 油などが使用され、 溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール などを併用してもよい。 FNK は、 そのタンパク質精製過程で 7 M Urea、 2 % SDS、 1 mM DTTで処理していながら活性は保持しているので、 一般的にタンパク質が変 性すると予想されるような添加物、 例えばィオン性界面活性剤、 非ィォン性界面 活性剤、 アルコール等を使用することができる。 また、 必要に応じて、 他の公知 の成分、 例えば、 希釈剤、 等張化剤、 担体、 PH安定剤、 抗酸化剤、 防腐剤、 着色 剤、安定化剤、溶解補助剤、粘度調整剤、香料等を加えてもよい。 その投与量は、 症状、 年齢、 体重および投与経路に依存するであろうから、 医師の判断及び各患 者の状況に応じて決定すべきである。 有効用量は、 in vitroにおける試験または in vivoの動物モデル試験系から導かれる。 一般的には l ng〜 5 mg/lkg体重の範 囲で投与されることが望ましい。 この 1回投与量を 1日 1回あるいは数回に分け て投与する。 '

なお、 本発明の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤の投 与は、 予防のために抗癌剤の投与等の抗癌治療の前、 同時、 後のいつでもよい。 特に、 抗癌治療数時間後、 1 日後および 2日後の 3回投与するのが望ましい。 ま た、 抗癌治療により出現した細胞毒性に基づく副作用の治療にも用いることがで きる。 すなわち、 本発明は抗癌剤投与等の抗癌治療後に初回投与し、 その後 2日 間にわたって 1日 1回投与されることを特徴とする抗癌治療の細胞毒性に基づく 副作用の予防剤または治療剤を包含する。

FNKタンパク質または PTDを連結した FNKタンパク質をコードする捧酸を有効 成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤も上記 の FNKタンパク質または PTDを連結した FNKタンパク質を有効成分として含む抗 癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療剤と同様の形態で投与する ことができる。遺伝子治療を行 場合の核酸の有効用量は in vitroにおける試験 または in vivoの動物モデル試験系から導かれるが、 一般的には核酸として約 1 μ g〜約 50m_gの範囲、好ましくは約 10 μ g〜約 5 mg、 より好ましくは約 50 g〜約 5 mgの範囲である。 投与回数等は、 FNKタンパク質または PTDを連結した FNKタ ンパク質を有効成分として含む抗¾治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤また は治療剤と同様である。

また、 本発明の聴力障害予防剤または治療剤により抗癌剤投与による聴力障害 を改善することができる。 すなわち、' 本発明の聴力障害予防剤または治療剤は、 抗癌剤投与により障害を受けた聴力の改善剤でもある。

本発明は、 FNKもしくは PTDを連結した FNKまたはそれらをコードする核酸を 投与して、 抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用を治療または予防する方法を包含 する。 本発明は、 さらに抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防剤または治療 剤の製造のための FNKもしくは PTDを連結した FNKまたはそれらをコードする核 酸の使用をも包含ずる。

本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例 によって限定されるものではない。 .

実施例 1 抗癌剤投与による聴力障害の予防

シスブラチン（CDDP)による内耳障害モデル '

以下の検討において、 ラット FNKタンパク質に 1個の Glyをスぺーサ一として

Tatの細胞膜通過ドメインを連結させたタンパク質（DNA配列を配列番号 3 1にァ ミノ酸配列を配列番号 3 2に示す） を大腸菌で発現させ精製し、 PTD- FNK として 用いた。 この発現及び精製に関しては、 既に報告されている方法を用いて行った

(Asoh, S. et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99， 17107—17112. (2002) )。 マウス（C57BL/6Cr 系、 4週齢、 メス）をシスプラチン投与群（n=20)、 シスプラ チン単回 +PTD- FNK (2. 5mg/kg, 1. 25mg/kg) 3回投与群（それぞれ n= 5 )、 およびシ スプラチン +Vehicle (25mM Tris/0. 2M glycinee/0. 1% SDS)投与群に分け実験を行 つた。 シスブラチン（ブリス トル .マイヤーズ株式会社、 東京） は 17mg/kg腹腔内 投与した。 シスプラチン単回 +PTD- FNK (2. 5mg/kg, 1. 25mg/kg) 3回投与群ではシス プラチン投与の 3時間前、 1 日後および 2日後に PTD- FNK (2. 5， 1. 25mg/kg)を皮 下に投与した。 各群で投与前および 7日後にケタラール （筋肉注射） で麻酔し、 聰性脳幹反応（ABR)検查を Bio- Logic System Corp. ¾ (Mundekein, IL, USA)の Traveler Expressを用いて防音室内で行った。 両耳後部および頭頂部に針電極を 揷入した。音刺激はクリックを用い、音圧（dBSPL)を lOOdBSPLより 5dBステップ で減少させた。 信号を.200回加算し、 再現性の得られる最小音圧を聴力閾値とし た。 聴力閾値が 30dB以下のマウスを実験に使用した。

1週間後の生存率はシスプラチン投与群 （図 2，CDDP)、 およびシスブラチン +Vehicle 投与群 （図 2，VEH) で 40 %であったのに対し、 シスプラチン単回 +PTD- FNK3回投与群 （図 2，FNK 2. 5mg/kg， FNK 1. 25mg/kg) ) では 100%であった。. 表 Ίは、 PTD- FNK投与によるシスブラチン誘導聴力障害の軽減効果を示す奔であ る。 CDDPはシスプラチンのみを投与した場合、 および VEHはシスプラチンおょぴ Vehicle ( 3回投与） を投与した場合の結果を示す。 FNK 2. 5mg/kg は、 シスプラ チンおよび PTD-FNK (2. 5mg/kgを 3 IK投与） を投与した場合、 FNK 1. 25mg/kgは、 シスプラチンおよび PTD-FNK (1. 25mg/kgを 3回投与）を投与した場合の結果を示 す。 値は聴力レベル（dB)を平均値で表し、 その標準偏差を +/-で示した。 （ ）内の n は調べたマウスの個体数を示す。 生き残ったマウスについて、 シスプラチン投 与群では 1週間後聴力の有意な閾値上昇を認めた（n=8, unpaired t test, p<0. 01, vs. CDDP投与前、 FNK 2. 5mg/kg と 1. 25mg/kg の投与 1週間後） （表 1、 CDDP)。 シスプラチン +Vehicle 投与群（n= 2 )でも聴力閾値の上昇を認めた （表 1， VEH)。 シスプラチン +PTD-FNK 3回投与群では、 いずれも聴力に変化は認められなかった

(表 1 , FNK 2. 5mg/kgおよび FNK 1. 25mg/kg) )。

表 1 ΡΙΜ ΚΙ るシ; =α^ «^ ^燥 (IM¾3 聴力 L^JLdB)

投锢 ¾¾媚

ODOP 28.2+/- 25 35 +A7.6

(n=l (n=8)

VEH 26.0+/-Z7 425 +/- 10.6 ;±1

(n=5) (n=¾

ENK25ni1¾ 27.0 +I-2 26.3 +/-25 ί

(n=4)

F K1.25nqg¾ 23.0 +/-Z7 24.0 +/- 4,2

実施例 2 担癌マウスを用いた、 'シスプラチン （CDDP) の抗癌剤活性にたいする PTD-FNK投与の影響の検討

ヒト肺上皮ガン細胞 A549 ( 1 xl0⁷cells)をヌードマウス BALB/c - nu/nu Sic (メ ス、 8週齢） の皮下に移植して担癌マウスを作製した。 腫瘍の大きさ （体積） は 麻酔下 （ネンプター^^) に精密ノギスで長径と短径を測定し、 常法に従い （長径）

X (短径）²÷2 の計算式で求めた。 100〜200mm³の大きさの腫瘍を持つ担癌マウス に PTD— FNK(1.25mg/kg， 140 μ 1)あるいは vehicle (25mM Tris/0.2M glycine/0.1% SDS, 140 μ 1)を皮下注射した。 3時間後、 シスプラチン（CDDP; 1.5mg/kg, 25mg/ml 濃度のシスプラチン注射液 60 1 に生理食塩水 0.5ml を加えた。 参考文献： Sirotnak FM, et al. Clinical Cancer Research 6, 4885-4892 (2000)の実験条 件） を腹腔内に注射した（Day0)。 CDDP の腫瘍体積縮小効果を判定するために、 vehicle 皮下投与した担癌マウスに生理食塩水（0.5ml)だけを腹腔内に投与した。 CDDP 投与後、 1日目、 2日目と連続して PTD - FNK(1.25mg/kg， 140^ 1)あるいは vehicle (140 1)をそれぞれ皮下注射した。 3日目（Day3)と 7日目（Day7)に腫瘍の 大きさを測定した。 ，シスブラチン投与時 （Day 0)の腫瘍体積を 100%として、 腫 瘍体積の増加率として図 3 Aに示した。 図 3 Bは、 マウスの試験数 （n) を増やし たものである。 ' . ' なお、 用いた FNKタンパク質は実施例 1と同様であった。

CDDP を投与しないと、 腫瘍体積は 2倍（Day3)、 3倍（Day7)に,増加し、 vehicle には腫瘍体積縮小効果がないことが判った。（コントロールのマウスのうち一匹が Day3の麻酔で死亡してしまったため、 Day 7については 2匹のデータである） .

CDDP投与群では、 PTD- FNK投与しても vehicle投与と同じで、 Day3で増加率 0 , Day7で 1. 5倍となり,、CDDPの腫瘍体積縮小効果に PTD- FNKは影響を与えなかった。 CDDP投与群と非投与群では統計的有意差 （AN0VAによる解析で、 Day3も Day7も pく 0. 005)があり、 CDDP投与群の中で、 FM投与群と非投与群との間には統計的有 意差はなかった。

すなわち、 PTD - FNKは担癌マウスに投与しても、 抗癌剤の効果は抑制せず、 抗 癌剤による聴力障害を抑制することが確認できた。 参考例 担癌マウスを用いた、イリノテカンと 5-フルォロウラシルの抗癌活性に 対する PTD - FNK投与の影響の検討

ヒ ト大腸癌細胞 HT29 ( 5 X 10⁶ cells)をヌードマウス BALB/c - hu/nu Sic (メス、

5週齢） の皮下に移植して担癌マウスを作製した。 腫瘍の大きさ （体積） は麻酔 下 （ネンプタール） 'に精密ノギスで長径と短径を測定し、 常法に従い （長径） X

(短径） ² ÷ 2の計算式で求めた。 100mm³以上の大きさの腫瘍を持つ担癌マウスに

PTD - FNK (1. 25mg/kg, 140 // 1)、あるいは vehicle (25mM Tr is/0. 2Mglycine/0. 1% SDS

140 i)を皮下注射した（Day 0)。 3時間後、 CPT - 11投与群では塩酸イリノテカン

(CPT-11 ; トポテシン注、第一製薬株式会社） を 30mg/kgの投与量で腹腔内に注射 し、 5-FU投与群では 5-フルォロゥラシル（5 - FU， シグマ Cat. # F6627- 10G，投与量

30mg/kg)と leucovorin (Fol inic acid, シグマ Cat. # F - 7878， 投与量 50mg/kg) の混合液を腹腔内に注射した。 CPT- 11および 5-FUの腫瘍体積縮小効果を判定す るために、 vehicle投与した担癌マウスに生理食塩水（大塚薬品） を腹腔内に注射 した。 Day 3， 7， 10に DayOと同様に、 PTD-FNKあるは vehicleを投与し、 3時間 '後に CPT- 11あるい 5- FU混合液を投与した。 腫瘍体積は Day 7と Day 14に測定 したが、 Day 7では各種薬剤を投与する前に測定した。 Day 0の腫瘍体積を 100% として、 腫瘍体積の増加率を図 4 Bに示した。

結果を図 4に示す。 CPT- 11あるいは 5 - FUを投与しないと腫瘍体積は 2. 5倍 (Day 7)、 4倍（Day 10)に増加した。 CPT - 11あるいは · 5- FUを投与することで腫瘍 体積の増加は半分以下に抑えられ、 PTD-FNK を投与してもこの抗癌剤の腫褒体積 縮小効果は抑制されなかった。 図 4には AN0VA解析による統計的有意差の群を示 した （*, Pく 0. 01 ; **， Pく 0. 001)。 また、 矢印で示したマウスは一回目の腫瘍体積 測定中に死亡したマウスである。 実施例 3 X線照射による消化管粘膜障害に対する PTD-FNKの軽減効果

マウス （C57BL/6 N, 7週齢、 雄） に PTD- FNK ( 5 mg/kg) を腹腔内に投与した (n= 3 )。 対照として同じ容量の溶媒 （25mM Tris/O. 2M グリシン Ζθ· 1%SDS ： Vehicle) を腹腔内に投与した （n= 4')。 3時間後にこれらのマウスを一つの紙箱 (W210mm, D 175mm, H35mm)に入れ、 X線外部照射用 LINAC (直線加速器） EXL-6SP (三菱電機株式会社）で 20Gyの X線を照射した。マウスを飼育ケージ内にもどじ、 毎日 PTD- FNK (5mg/kg) あるいは溶媒を皮下に注入した。 X線照射後 5日自に、 マウスから腸を摘出し、 4 %パラホルムアルデヒ ド /0. 1Mリン酸緩衝液 （pH7. 4) に浸漬して固定した。 パラフィン切片作製後、 へマトキシリン 'ェォシン染色で 小腸 （空腸） 粘膜組織を病理組織学的に評価した。

結果を図 5に示す。 図 5 Aは、 PTD- FNKを投与したマウスの腸粘膜を示し、 図 5 Bは非投与マゥスの腸粘膜を示す。

対照群では、 X線照射に伴う腸粘膜 （腸絨毛） 構造の破壊が顕著であり 粘膜 固有層に位置する多数の毛細血管の拡張そして鬱血が認められた。 PTD-FNK投与 群では、 対照群に比べて腸粘膜 （腸絨毛） 構造が維持され、 粘膜固有層に位置す る毛細血管の拡張そして鬱血が認められず、 明らかに X線照射に伴う腸粘膜傷害 を軽減した。 実施例 4 5-FU投与による消化管粘膜障害の軽減 5 _フルォロウラ「ンル （5 - FU) は骨髄などの造血組織および消化管に顕著な毒 性を発揮する。 5- FUの大量投与による消化管毒性は小腸粘膜を破壌し、 高度な下 痢を引き起こす （参考文献： Zhao, J. et al. Clinical Cancer Research 10, 2851 - 2859 (2004) )。 また、 ヒ トとは違いマウスでは脾臓は造血組織のひとつであ る。' 5- FUによる小腸と脾臓に対する副作用 (毒性) の PTD-FNKによる軽減効果を 検討した。

C57BL/6Cr ( 5 W, メス） に PTD- FNK (1. 25mg/kg, . 0. 15ml) を皮下に注射した (DayO)。対照（コント口ール）マウスには実施例 3と同じように Vehicle (0. 15ml) を皮下に注射した。 . 3時間後に 5- FU 200mg/kgを PTD- FNK投与群及び対照群のマ ウスの皮下に注入した。 5- FU注射液は 5- FU (Sigma Cat. No. F6627-10G) を生理食 塩水 （大塚製薬 大塚生食注） で 解し、 lOmg/ml になるように調製した。 翌日 (Dayl) 及び翌々日 （Day2)、 DayO と同じように PTD- FNKと Vehicleをそれぞれ のマウスに皮下注し、 3時間後に 5 - FUを皮下注し、連続 2日投与群 （n= 3 ) と連 続 3日投与群 （n= 3 ) のマウスを作製した。 5- FUの最後の投与から 2日後にマウ スを灌流固定し、 脾臓ならびに小腸 （空腸） のパラフィン切片を作製し、 へマト キシリン &ェォシン染色し、 病理組織学的に評価した。 ， ' また、 3日間連続投与群に関しては、 5-FU最終投与の翌日 （Day 3 ; 各群マウ ス数 n=3) および翌々日 （Day 4 ; 各群マウス数 n=3)にマウスを灌流固定し、 小腸 (空腸） のパラフィン切片を作製し、 へマトキシリン &ェォシン染色した。 デジ タルカメラで低倍率 （対物 10倍） で染色像の imageを各マウス （各切片） にっき 3枚とり、 各群合計 9枚の image像の粘膜の厚さ （粘膜筋板から腸絨毛先端まで の長さ） を解析した。 140から 158個の絨毛について計測し、 その平均値と標準 偏差値を図に示した。図 6では 5-FUも PTD-FNKあるいは Vehicleも投与していな い正常マウスの小腸 （空腸） （調べた絨毛数 113) についての解析結果も合わせて 示した。

結果を図 6に示す。 図 6に示すように、 FNK投与で粘膜構造の破壌による粘膜 の厚さの減少が抑制された。

図 7に PTD- FNK/5- FU の腸管への影響を示す （へマトキシリン &ェォシン染色 像）。 図 7 Aおよび Bは、 2日連続投与した場合であり、 図 7 Aは PTD- FNKを投与 したマウスの腸粘 ^を示し、 図 7 Bは非投与マウスの腸粘膜を示す。 また、 図 7 C および Dは、 3日連続投与した場合であり、 図 7 Cは PTD-FNKを投与したマウス の腸粘膜を示し、 図 7 Dは非投与マウスの腸粘膜を示す。

PTD-FNK 非投与群 （対照群） では、 小腸の粘膜上皮の丈が非常に短縮し、 結果 として粘膜固有層が萎縮している。 また、 粘膜上皮細胞と腸腺の変性破壊が見ら れる。 さらに平滑筋層では、 非常に多数の空胞形性が観察されるが、 いずれの症 状も' PTD-FNK投与によって、 改善が認められる。

図 8に PTD- FNK/5- FUの脾臓への影響を示す。 図 8 Aおよび Bは、 2日連続投与 した場合であり、同 8 Aは PTD- FNKを投与したマウスの脾臓を示し、図 8 Bは非投 与マウスの脾臓を示す。 また、図 8 Cおよび Dは、 3日連続投与した場合であり、 図 8 Cは PTD-FNKを投与したマウスの脾臓を示し、図 8 Dは非投与マウスの脾臓を 示す。

何れの群でも脾臓自体の大きさの顕著な萎縮が見られる。 特に白脾髄は染色性 が失われ、 著しい縮小が観察される。 これはリンパ球形成の低下が原因と考えら れる。 同一倍率で撮影しているため 3日間連続投与の写真をみるとその変化は明 ら'かである。 ,, これに対して、 PTD- FNK投与群では脾臓自体の大きさの萎縮は Vehicle投与群 と顕著な差は認められなかったが、 白脾髄の染色性が維持され、 その縮小が抑制 されているのが確認できる。 · 実施例 5 CPT-11投与による消化管粘膜障害の軽減

CPT-11 (塩酸イリノテカン） は白血球 （好中球） 減少と消化管に顕著な毒性を 発揮する。 CPT-11は生体内で carboxyl esteraseにより活性代謝体 SN- 38に変換 され、 DNA—本鎖の切断の過程における DNA—トポイソメラーゼ I複合体に結合し て、 複合体の安定化をもたらす。 その結果、 細胞周期が妨げられ、 細胞死が起き る。 SN- 38 は肝臓でグルクロン酸抱合酵素によってグルクロン酸に抱合された形 で胆汁中に排泄される。 胆汁中に排泄された SN - 38/グルクロン酸抱合体は、 腸 内細菌叢の脱グルクロン酸抱合を受けて SN - 38に再び変換され、 腸管より再吸収 される。 この結果、 SN- 38が肝臓の解毒酵素 CYP3A4や CYP3A5で活性のない誘導 体に変換されない限り、 SN-38は腸肝循環する。 この SN- 38の腸肝循環が遅発性 の下痢 （腸管粘膜障害） の原因のひとつと考えられている （典拠：巿川 度、 消 化器セミナー， p 32— 34、 田村和夫編、 ヘルス出版）。 CPT-11 による遅発性下痢 は致死的になるほどの激しいものである （参考文献： Zhao, J. et al. Clinical Cancer Research 10, 2851 - 2859 (2004) )。 CPT- 11 による小腸粘膜に対する副作 用 （毒性） に対する PTD- FNKの軽減効果を検討した。

C57BL/6Cr ( 5 W, メス） に PTD- FNK (1. 25mg/kg, 0. 15ml) (n二 3 ) を皮下に注 射した（Day0)。対照マウス（n= 3 )には、実施例 3と同じように Vehicle (0. 15ml) を皮下に注射した。， 3時間後に CPT- 11 (トポテシン注 （塩酸イリノテカン注） 第 一製薬株式会社） 200mg/kg) を PTD- FNK投与群及び対照投与群のマウスの腹腔内 に注入した。 翌日 （Dayl) 及び翌々日 （Day2) ; 同じように PTD- FNK と Vehicle をそれぞれのマウスに皮下注し、 3時間後に GPT- 11 を腹腔内に注入した。 Day3 は PTD- FNKあるレ、は Vehicleだけを皮下注した。 Day5にマウスを灌流固定し、 小 腸 （空腸） のパラフィン切片を作製し、 ベマトキシリン &ェォシン染色し、 病理 組織学的に評価した。

その結果を図 9に示す。 図 9 Aは PTD- FNKを投与したマウスの腸粘膜を示し、 図 9 Bは非投与マゥスの腸粘膜を示す。

対照群では小腸の絨毛 （粘膜上皮の丈） が非常に短縮し、 各絨毛のおおくの粘 膜上皮細胞が細胞質空胞変性して、 至る所に細胞質空胞が形成されている。 さら に、 残存している粘膜上皮細胞の核は著しく核濃縮をおこしている。 これに対し て、 PTD— FNK投与群では、 絨毛は vehicle投与群と同じ程度に短縮しているが、 粘膜上皮細胞に顕著な改善効果が認められた。 具体的には、 粘膜上皮細胞の空胞 変性が著しく抑制され、 粘膜構造が良く維持されている。 実施例 6 シスブラチン投与による腎毒性の軽減

シスブラチンの毒性は、 腎毒性と聴覚障害に代表される神経障害である。 腎障 害は腎尿細管の Ca²⁺代謝障害、 重炭酸イオン等の塩類 · グルコース · アミノ酸の 能動輸送傷害、 細胞内ミ トコンドリアの呼吸増大などが原因とされている。

マウス （C57BL/6 Cr系、 5週齢、 メス） に PTD- FNK (1. 25mg/kg) (n= 6 ) を皮 下に投与した。 実施 f列 1と同じように対照として等量の vehicleを皮下に投与し た (n=15)。 3時間後にシスプラチン (プリプラチン注、 ブリストル.マイヤーズ 株式会社） 17mg/kg腹腔内投与した (DayO) ₀ Dayl , Day2 に PTD- FNK と vehicle をそれぞれに皮下投与した。 翌日 （Day3) に生存したマウス （PTD-FNK投与群 6 匹 （生存率 100%)、 対照群 8匹 （生存率 53. 3%) から血液を採取した後、 灌流固 定し、 腎臓のパラフィン切片を作製した。 へマトキシリン 'ェォシン染色して、 腎臓組織を病理組織学的に評価した。 採取した血液から血清を調製し、 血清中に 存在する尿素窒素（BUN)とクレアチニンをそれぞれ尿素窒素 B -テス トヮコー（和 光純薬工業株式会ネ土） とクレアチニン一テストヮコ一 (和光純薬工業株式会社) を用いて測定した。 測定方法はキットに添付されてきた説明書に従って、 尿素窒 素の測定では 1/10のスケールに、 クレアチニンの測定では 1/50のスケールにそ れぞれ使用する'血清量と添加する試薬量を減じて行つた。 シスプラチン未投与の 正常マウス（n=12)についても血清中に存在する尿素窒素（BUN)とクレアチュンを 測定した。 .

図 1 0にへマトキシリン 'ェォシン染色組織像を示す。 図 1 O Aは PTD FNKを 投与したマウスの腎臓を示.し、 図' 1 0 B は正常マウスの腎臓を示し、 図 I P C は PTD-FNK非投与マウスの腎臓を示す。

シスプラチンの投与により、 実施例 1にも示したように PTD- FNKでは生存率が 100%であったにも関わらず、対照群 は生存率が 53. 3%に過ぎなかった。更に、 シスブラチンによる'近位尿細管の機能低下で尿細管に硝子円柱が形成され、 さら には多くの尿細管が変性壌死してその構造がこわれている。 広範囲にわたり、 近 位尿細管および遠位尿細管の上皮細胞において、 刷子縁の喪失、 核濃縮、 核喪失 が起こり変性壊死していることが判る （図 1 0 C)。

これに対し、 PTD- FNK投与群では、 近位尿細管および遠位尿細管の上皮細胞の 形態が保たれており、広範囲に渡って尿細管構造が良く維持されている。さらに、 尿細管の硝子円柱の形成が著しく抑制されている（図 1 0 A)。

• 表 2に血清中に存在する尿素窒素量とクレアチニン量の平均値と標準偏差を +/ -で示した。 （ ）内の nは測定したマウスの個体数を示す。

表 2 血清尿素窒泰 (mg/dl) 血清クレアチニン (mg/di)

シスブラチン投与

P D-FNK非投与群 163 +/-138 1.8 +/-1.2

(n=8)

シスブラチン投与

PTD-FN 投与群 75 十 35 0.9 +/-0.2

<n=6)

正常マウス

27 +/-3 0.85 +/-0.07

(n=12)

血清尿素窒素値と血清クレアチニン値はともに腎機能障害の生化学的指標であ る。 腎機能が低下するとこれらの値が上昇する。 PTD- FNK を投与しな,いシスプラ チン投与群では血清尿素窒素値と麻清クレアチュン値がともに正常値にくらべ著 しく上昇したが、 PTD-FNK の投与によってこれらの上昇が有意に抑制された {p<0. 05, One-way ANOVA and Post hoc tests)。

以上のように PTD-FNKはシスブラチンによる腎組織変性およぴ腎機能障害を軽 減した。

以上のように、 PTD - FNKを投与することによって、 X線、 抗癌剤 （5 - FU、 塩酸 イリノテカン、 シスブラチン） 等によって、 消化管粘膜への障害、 腎毒性（ 脾臓 への毒性なの各種の副作用が明らかに軽減されることがわかった。 実施例 7 5- Fuおよび CPT- 11による小腸炎症傷害の生化学的定量（TNF aの定量） 抗癌剤の消化管毒性は小腸粘膜を破壊し、腸管の透過性の上昇、白血球の浸潤、 および炎症性サイ トカインの産生を引き起こす （Boushey RP et al. Cancer Research 61, 687-693， 2001)。 PTD- FNK投与で5-FUぉょぴCPT-l lにょる炎症性 サイ トカイン TNFひ の産.生上昇を抑制できるのかを Jingsong, Z. et al. (Clinical Cancer Reaseach 10, 28⁵1- ²⁸⁵⁹， 200⁴)の方法に従って検討した。

C57BL/6Cr (5W, メス） に PTD- FNK (1. 25mg/kg， 0. 15ml)を皮下に注射した（Day 0)。 対照 （コントロール） マウスには実施例 4および実施例 5と同じように Vehicle (0. 15ml)を皮下に注射した。 3時間後に 5- FU 200m_g/kg (皮下注射）、 あるいは CPT-11 200mg/kg (トポテシン注 （塩酸イリノテカン注） 第一製薬株式会社） （腹 腔内注射） を PTD- F;NK投与群及び対照群のマウスに注入した。 5- FU 注 I†液は 5 - FU (Sigma Cat. No. F6627- 10G)を生理食塩水 （大塚製薬 大塚生食注） で溶解 し、 10m_g/mlになるように調製した。 さらに、 5-FUおよび CPT - 11による TNFひの 産生上昇を確認するために、 Vehicle 投与したマウスに生理食塩水を同体積注射 した生理食塩水投与群を甩意した。 翌日（Day 1)及ぴ翌々日（Day2)に、 Day 0と同 じょうに PTP- FNK と Vehicle をそれぞれマウスに皮下注し、 3時間後に 5 - FU、 CPT- 11および生理食塩水を皮下注した。 薬剤最終投与 2日目の Day 4 (各群 n=3) に、 マウスを痲酔下に解咅 'Jし、 PBS (phosphate-buffered saline; , NaCl 8g/L, Na₂HP0₄ 1.14g/L, KC1 0.2g/L, KH₂P0₄ 0.2g/L))で灌流して血液を除き、 小腸の一 部である空腸 (mid -: jejunum) 2cm を切り取った。， さらに、 切り取った腸管の内容 物を除くために、長軸方向に外科用チイフで 3回切断し、生理食塩水と培地（RPMI 1640, 10% FCS (Ultra low IgG))で洗浄して、 1mlの培地内で 12時間 C0₂インキ ュベータ一 （37°C)で培養した。 RPMI1640 と FCS (Ultra low IgG)は Invitrogen Corporation (GIBC0)社の製品を使用した。 培養後、 培地を卓上遠心機で遠心 (15, 000 rpm, 5分） し、 その上清を小分注して - 80°Cで保存した。 培地中の TNF aを Amersham Biosciences社のマウス TNFa ELISAシステム（コード番号 RP¾J2718) キットを用いて測定した。 測定手順はキットに添付されてきたマニュアルに従つ た。 各培地上清につき 6回 ELISA (100/ 1/回） の測定を行い、 その平均値を各マ ウス空腸の TNFa産生量 （pg/ml -培地） とした。 図 1 1には各群 （使用したマウ ス数 n=3) の平均値'と標準偏差値を示した。

結果を図 1 1に示す。 PTD- FNK投与で、 Day4における 5- Fuおよび CPT- 11によ る炎症性サイトカイン TNFaの産生を著しく抑制した。 実施例 8 PTD-FNKが癌組織に取り込まれないこ.との証明 ，

実施例 2と同じようにヒ ト肺上皮ガン細胞 A549をヌードマウス BALBん- nu/nu

(メス、 8週齢）の皮下に移植して担癌マウスを作製した。腫瘍体積が 100〜200賺 ³. の大きさを持つ担癌マウスに PTD- myc- FNK (l.²5mg/kg， 140μ 1) (参考文献 Asoh，

S. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 17107 - 17112， （2002))を皮下に 注射した。 1, 3, 6, 9時間後にマウスを灌流固定した。 灌流はノボ ·へパリン （50 単位/ ml : アベンテイス ファーマ株式会社） を含む PBS溶液を用い.、固定液は 4 % PFA (パラホルムアルデヒド） を含む PBSで行った。 灌流固定したマウスの腫瘍部 位と隣接正常組織 (皮膚と筋組織） を一緒に取り出した（図 1 2 A)。 常法に従い パラフィン切片 （5 /z m厚） を作製し、 免疫組織化学染色を行った。 一次抗体は Rabbit polyclonal anil - Myc Tag anti oody (Upstate Biotechnology Incorporated, Lake Placid, NY, USA)を希釈倍率 100で用いて、 4 °Cでー晚反応させた。 二次抗 体おょぴペルォキシダーゼ反応による呈色反応は Vectastain ABC Eli te kit (Vector Laboratories, Burl ingame, CA, USA)を用 ヽて、 キット ίこ添付されたマ 二アルに従って行った。 染色後、 20 Χ対物レンズにてイメージ像を撮影した。 結果を図 1 2 Βに示す。 一般に増殖が活発な細胞 （例えばガン細胞） は Mycを発 現していて、 核に局在していることがわかつ Tいる。 すべての写真で、 腫瘍組織 (右側）にぴ漫性点状の茶色に染色された陽性像は核内に存在する内因性 Mycによ るものである。一方、 TAT-myc- F皿を皮下投与した群では、投与後 3時間で腫瘍組 織に隣接した骨格筋層 （左側） の細胞質にぴ漫性の陽性像 （茶色） の増加が認め られ、その後経時的に減少した。 このような細胞質の染色像.は TAT- myc-FNK非投与 群 （未処理 （NT)および Vehicle投与（V) ) のマウスでは認められなかった。 以上の 結果は、 TAT- FNKが正常組織には効率良く取り込まれるが、腫瘍組織のガン細胞に は取り込まれないことを示している。 ' 実施例 9 PTD-FNK 'が骨髄中の細胞に取り込まれることの証明

上記実施例で作製した PTD-myc-FNKを投与した担癌マウスを灌流固定 (灌流はノ ポ 'へパリン （50単位/ ml : アベンテイス ファーマ株式会.社） を含む PBS溶液を用 レ、、固定液は 4 %PFA (パラホルムアルデヒ ド） を含む PBS)後に背骨を摘出した。

5 %蟻酸で脱灰し、 常法に従いパラフィン切片 （5 μ πι厚） を作製し、 免疫組織化 学染色を行った。 一次 f几体は Rabbi t polyclonal ant i-Myc Tag antibody (Upstate

Biotechnology Incorporated, Lake Plac id, NY, USA)を希釈倍率 100で用いて 4 °C . でー晚反応させた。 二次抗体およびペルォキシダーゼ反応による呈色反応は

Vectastain ABC Eli te kit (Vector Laboratories, Burl ingame, CA, USA)を用レヽ て、 キットに添付されたマ二アルに従って行った。 染色後、 イメージ像を撮影し た。

結果を図 1 3に示す。 骨髄中には赤血球、 白血球、 血小板の形成にあずかる各 種幹細胞が存在し、内因性 Mycを発現している。 TAT-myc - FNK非投与群（未処理 (NT) および Vehicle投与（V) ) で認められる染色像はび漫性点状の茶色に染色された陽 性像で、 これは核内に存在する内因性 Mycによるものである。 方、 TAT - rayc-FNK を皮下投与した群では、投与後 1時間で骨髄の細胞-特に巨大核細胞（血小板の前 駆細胞） -の細胞質にぴ漫性の暘性像 （茶色） が認められた。 投与後 3時間まで陽 性像が増加し、その後経時的に減少した。 このような染色像は TAT- myc- FNK非投与 群では認められな った。以上の結果は、皮下投与した TAT- FNKが骨髄中の細胞に まで運搬されることを示している。 . 比較例 他のアポトーシス阻害剤との効果の比較： カスパーゼ阻害剤 Z- VAD- fmk によるシスブラチン致死作用への効果の検討

アポトーシスを阻害することによつて抗癌剤の副作用を軽減する新規薬剤の開 発において、 新規カスパーゼ阻害剤について報告されている （特表 2003 - 511463 号公報）。該公報に記載の新規カスパーゼ阻害剤を合成あるいは入手するこ,とが困 難であるために、特表 2003-511463号公報の実施例 1で使用された Z- VD - fmkに酷 似した Z—VAD— fmk (製品名 Caspase inhibitor I， Calbiochem社、 Cat#627610)を 比較試験のために用いた。 Z-VAD- fmkはカスパーゼ阻害剤として in vitroおよび in vivo の実験に広く使用されている。 投与量については、 上述の特許公報のハ ムスターを用いた実施例の項目以降に記載されている腹腔内投与量 20mg/kgを用 いた。. ここで、 Wannerらは 0. 25mg (約 10mg/kg)の Z- VAD_fmkをマウスに静脈内投 与することで抗 Fas抗体によって誘導される急性肝障害を軽減し、 その死亡率を 減少でき た こ と を報告 してい る （Wanner, G. A. et al. , 'FASEB J. 1999 ; 13 : 1239-1248)。 従って、 本実施例で使用する Z- VAD-fmk の投与量 20 mg/kg は十分その効果を発揮することのできる量である。

本実施例は PTD- FNKとカスパーゼ阻害剤 Z - VAD - fmkとのシスプラチン致死作用 に対する効果の比較検討である。 従って、 実施例 1と同様に Z - VAD - fmkを投与し た。マウス（C57BL/6Cr系、 4週齢、メス）をシスプラチン単回 +Z- VAD_fmk (20mg/kg) 3回投与群とシスプ,ラチン単回 +Vehicle 3回投与群 （それぞれ n=5)に分けた。 シ スフ。ラチン （ブリス トル · マイヤー株式会社） は mg/kg腹腔内投与した。 シス プラチン単回 +Z- VAD- f mk 3回投与群では、 Z- VAD- f mk をジメチルス フキシド (DMS0、和光純薬株式会社）に溶かして lOmg/mlの濃度とし、さらに Z-VAD - fmk/DMSO 溶液 28. 4 μ 1に.121. 6 // 1の生理食塩水 （大塚生食注、大塚製薬株式会社） を加え て 0. 15mlとして、シスプラチン投与の 3時間前、 1日後および 2日後に皮下に投 与した。 シスプラチン単回 +Vehicle 3回投与群では、. DMS0溶液 28. 4 μ 1に 121. 6 z lの生理食塩水を加えて 0. 15mlとし、 シスプラチン投与の 3時間前、 1日後お ょぴ 2日後に皮下に投与した。 シスブラチン投与後 1週間の生存率を調べ、 図 2 の結果と同時に記載した。 ,

結果を図 1 4に示す。. カスパーゼ阻害剤 Z-VAD- fmkを投与群の一週間後の生存 率は非投与群 （Vehicle)と同じ 40%であった。 Z- VAD- fmkにはシスプラチンによ る致死作用を軽減する効果はなかった。 これは、 抗癌剤副作用の軽減効果につい て PTD- FNKの優位性を示すものである。 ' 産業上の利用可能性 ， 実施例に示すように、 X線照射や抗癌剤投与により抗癌治療を行った際の副作 用により種々の障害を表すようになつた被験体に本発明の FNKまたは PTDを連結 した FNKを投与することにより'、 抗癌治療による副作用を、 抗癌治療の効果を妨 げることなく、 抑制することができる。 さらに、 FM をコードする核酸を投与し た場合も、 同様の効果を持続させることができる。

本明細書で引用した全ての刊行物、 特許おょぴ特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲

1 . Bel- x_Lタンパク質の第 22番目の Tyrの Pheへの置換、 第 26番目の Ginの Asnへの置換および 165番目の Argの Lysへの置換のうちの少なく とも 1つの置 換を有する FNK.タンパク質を有効成分として含む抗癌治療の細胞毒性に基づく副 作用の予防または治療剤。

2 . Bcl-x_Lタンパク質がヒ ト由来 （配列番号 5 )、 マウス由来 （配列番号 6 ).、 ラット由来 （配列番号 7 )、 ブタ由来 （配列番号 8 ) およびィヌ由来 （配列番号 9 ) Bcl-x_Lタンパク質から選択される請求項 1記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副 作用の予防または治療剤。 .

3 . Bel- X,ダンパク質がヒ ト由来 （配列番号 5 )、 マウス由来 （配列番号 6 )、· ラット由来 （配列番号 7 )、 ブタ由来 （配列番号 8 ) およぴィヌ由来 （配列番号 9 ) Bel - _X[ ^タンパク質から選択され、 さらに第 22番目、 第 26番目おょぴ 165番目の アミノ酸以外のアミノ酸の 1個または数個のアミノ酸が欠失、 付加または置換し たアミノ酸配列を有するタンパク質であって、 FNK タンパク質活性を有するタン パク質である請求項 1または 2に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予 防または治療剤。

4 . 抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が抗癌治療による細胞死による副作用 である請求項 1〜 3のいずれか 1項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用 の予防または治療剤。

5 . 抗癌治療の効果を低下させない、 請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の抗 癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。 .

6 . FNK タンパク質の N末端側に細胞膜通過ペプチドが連結している、 請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の抗癌治;^の細胞毒性に基づく副作用の予防または 治療剤。

7 . 細胞膜通過べプチドが、以下のぺプチド（i)〜（xi ii)のいずれかから選択さ れる請求項 6記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

(i) 6〜 1 2個のアルギニンからなるペプチド、

(i i) 6〜 1 2個のリシンからなるペプチド、 (iii) 6〜 1 5個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、 .

(iv) (i)か.ら（iii)のいずれかのぺプチドにおいて、数個のアミノ酸がダリシンに 置換されたペプチド、 . . (V) 配列番号 1 1で表される（i)のペプチド、

(vi) 配列番号 1 3で表される（iii)のペプチド、

(vii) 配列番号 1 5で表される（iv)のペプチド、

(viii) 配列番号 1 7で表されるペプチド、

(viiii) 配列番号 1 8で表されるペプチド、

(X) 配列番号 1 9 表されるペプチド、

(xi) 配列番号 2 0で表されるぺプチド、 ，

(xii) 配列番号 2 1で表されるペプチド、 ならびに , '

(xiii) 配列番号 2 2で表されるペプチド

8. Bel- ^タンパク質の第 22番目の Tyrの Pheへの置換、 第 26番目の Ginの Asnへの置換および 165番目の Argの Lysへの置換のうちの少なくとも 1つの置 換を有する FNKタンパク質をコードする核酸を有効成分として含む抗癌治療の細 胞毒性に基づく副作用の予防また'は治療剤。 ..

9. Bel - タンパク質がヒ ト由来 （配列番号 5)、 マウス由来 （配列番号 6)、 ラット由来（配列番号 7 )、ブタ由来（配列番号 8 ) およびィヌ由来（配列番号 9 ) Bcl-x_Lタンパク質から選択される請求項 8記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副 作用の予防または治療剤。

1 0. Bel - タンパク質がヒト由来（配列番号 5)、マウス由来（配列番号 6)、 ラット由来（配列番号 7)、ブタ由来（配列番号 8) およびィヌ由来（配列番号 9) Bel- タンパク質から選択され、 さらに第 22番目、 第 26番目および 165番目の アミノ酸以外のアミノ酸の 1個または数個のアミノ酸が欠失、 付加または置換し たアミノ酸配列を有するタンパク質であって、 FNK タンパク質活性を有するタン パク質である請求項 8または 9に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予 防または治療剤。 ·

1 1. 抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が抗癌治療による細胞死による副作 用である請求項 8〜 1 0のいずれか 1項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副 作用の予防または^療剤。

1 2 . 抗癌治療の効果を低下させない、 請求項 8〜1 1のいずれか 1項に記載 の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

1 3 . FNKタンパク質をコードする核酸の 5 '側に細胞膜通過べプチドをコ一ド する核酸が連結している請求項 8〜 1 2のいずれか 1項に記載^)抗癌治療の細胞 毒性に基づ.く副作用の予防または治療剤。

1 4 . 細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（i)〜（xiii)のいずれかから選択 される請求項 1 3記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

(i) 6〜 1 2個のアルギェンからなるペプチド、

(ii) 6〜 1 2個のリシンからなるペプチド、

(ii i) 6〜 1 5個のァノレギニンおょぴリシンからなるペプチド、 ,

(iv) (i)から（i i i)のいずれかのぺプチドにおいて、数個のアミノ酸がダリシンに 置換されたペプチド、'

(V) 配列番号 1 1で表される（i )のペプチド、

(vi) 配列番号 1 3で表される（iii)のぺプチド、 ·

(vii) 配列番号 1 5で表される（iv)のペプチド、 ， '

(vi ii) 配列番号 1 7で表されるペプチド、

(viiii) 配列番号 1 8で表されるペプチド、

(X) 配列番号 1 9で表されるペプチド、

(xi) 配列番号 2 0で表されるペプチド、

(xii) 配列番号 2 1で表されるペプチド、 ならびに

(xii i) 配列番号 2 2で表されるペプチド

1 5 . 抗癌治療が X線照射である請汆項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の抗癌 治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。 . .

1 6 . 抗癌治療が抗癌剤投与である請求項 1〜1 4のいずれか 1項に記載の抗 癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

1 7 . 抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用が、 造血組織障害、 消化管粘膜を含 む消化器の障害、 心臓障害、 肺障害、 腎障害、 神経障害、 口内炎、 聴力障害、 皮 膚障害からなる群から選択される請求項 1〜 1 6のいずれか 1項に記載の抗癌治 療の細胞毒性に基づ,く副作用の予防または治療剤。

1 8 . X線照射による消化管粘膜障害を予防または治療し得る、 請求項 1〜1 4のいずれか 1項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療 剤。

1 9 . 抗癌剤投与による消化管粘膜を含む消化器の障害、 造血組織障害、 腎臓 障害および聴覚障害からなる群から選択される副作用を予防または治療し得る、 請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予 防または治療剤。

2 0 . 抗癌剤投 による聴力障害を予防または治療し得る、 請求項 1〜 1 4の いずれか 1項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。

2 1 . 抗癌剤投与による消化管粘膜障害を予^または治療し得る、 請求項 1〜 1 4のいずれか 1項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づぐ副作用の予防または治 療剤。

2 2 . 抗癌剤が 5- FU (⁵-フルォロウラシル）、 CPT-11 (イリノテカン） および CDDP (シスプラチン）からなる群から選択される、 請求項 1 6〜2 1のいずれか 1 項に記載の抗癌治療の細胞毒性に基づく副作用の予防または治療剤。 . '