CZ20003433A3 - Terapeutické aplikace zralých FLINT (mFLINT) polypeptidů nebo OPG3, které jsou členy nadskupiny receptorů TNF - Google Patents

Description

Terapeutické aplikace zralých FLINT (mFLINT) polypeptidů nebo 0PG3, které jsou členy nadskupiny receptorů TNF

Oblast techniky

Vynález se týká terapeutické aplikace zralých FLINT (mFLINT) polypeptidů nebo OPG3, které jsou členy nadskupiny receptorů TNF. Zralý FLINT polypeptid (mFLINT) se váže na FasL a brání interakci FasL-Fas. mFLINT inhibuje apoptotickou a prozánštlivou aktivitu, způsobenou vazbou FasL-Fas, a proto je použitelný pro léčení nemocí, spojených s abnormální apoptózou a zánětem. Vynález také řeší sekvence aminokyselin a nukleotidů FLINT a zralých FLINT (dále též mFLINT) Je popsáno získání a ověření transgenních zvířat, která exprimují FLINT. Jsou také popsány terapeutické prostředky a způsoby léčení, využívající mFLINT.

Dosavadní stav techniky

FasL (též zvaná CD95L a AP01L) je exprimována na různých typech buněk a může představovat biologický činitel, odpovědný za proliferací, diferenciaci, imunoregulaci, zánětlivou reakci, cytotoxicitu a apoptózu. Je zajímavé, že mutace v FasL, ligand pro rodinu TNFR receptorů FAS/APO (Suda et al., 993, cell 75:1169-78), souvisejí s autoimunitou (Fisher et al., 1995, cell 1:935-46), zatímco nadprodukce FasL může být přítomna při žloutence vyvolané chemickou látkou. FasL je exprimována v imunitně-privilegovaných tkáních očí, varlat, mozku a v některých nádorech. Byla také zaznamenána v ledvinách a plicích a v aktivovaných thymocytech, splenocytech a T lymfocytech.

• · « · · · * ·

Apoptóza hraje ústřední roli jak při vývoji, tak při homeostáze. Smrt buněk apoptozou při vývoji embrya v průběhu morfogenéze nebo synaptogenéze a u dospělých zvířat v průběhu odumírání tkání nebo na konci imunitní reakce. Vzhledem k tomu, že fysiologická role apoptózy je rozhodující, může být aberace proces zhoubná. Tak například neočekávaná apoptóza určitých neuronů přispívá k pravděpodobnosti onemocnění chorobami jako je Alzheimerova Parkinsonova choroba, zatímco selhávání dělení buněk, které iniciuje apoptózu po přetrvávajícím závažném poškození DNA přispívá k možnosti onemocnění rakovinou.

Signály o přežívání, přicházející z prostředí buněk a vnitřní senzory pro buněčnou integritu normálně udržují apoptotický buněčný mechanismus pod kontrolou. V případě, že buňka ztratí kontakt se svým okolím nebo dojde k jejímu nevratnému poškození, tato buňka iniciuje apoptózu. Buňka, která simultánně dostává konfliktní signály, které zvyšují nebo potlačují její dělící cyklus také spouštějí apoptózu. Savci jsou kromě toho vybaveni ještě dalším mechanismem, který umožňuje organismu aktivně řídit samodestrukci jednotlivých buněk. Tento druh instruktivní apoptózy je zejména důležitý pro imunitní systém. Receptory smrti-buněčné povrchové receptory, které přenášejí apoptotické signály iniciované specifickými smrtnými ligandy - hrají v instruktivní apoptózy ústřední roli. Tyto receptory mohou po navázání ligandů aktivovat smrtící kaskády v průběhu sekund, a tím způsobit, že buňka apoptotický zahyne v průběhu hodin.

Smrtné receptory náleží k nadskupině receptorových genů faktoru nádorové nekrosy (tumor necrosis faktor, dále též TNF), která je definována jednoduchými, cysteinem-bohatými buněčnými doménami. Smrtné receptory obsahují kromě toho homologní cytoplasmové sekvence, zakončené smrtelnou doménou Smrtelné domény obvykle umožňují smrtným receptorům změnit apoptotický mechanismus buněk, ale v některých případech zprostředkují jiné funkce, než je apoptóza, nebo dokonce funkce protiapoptotické.

Fas (také zvaný CD95 nebo Apol) je dobře popsaný smrtný receptor. Fas a Fas ligand (FasL) hrají v apoptóze důležitou roli. Fas L je homotrimerní molekula. Bylo navrženo, že každý trimer FasL váže tři molekuly Fas. Vzhledem k tomu, že smrtné domény mají a sklon navzájem spolu asociovat, napojení Fas vede ke vzniku shluků těchto domén smrtných receptoru. Adaptační protein zvaný FADD (Fas-spojený se smrtnou doménou; nazývá se též Mortl) se pak váže přes vlastní smrtnou doménu na soustředěné domény smrtných receptoru. FADD také obsahuje smrtnou efektorovou doménu, která se váže na analogické domény, opakované v tandemu se zymogenovou formou kaspázy-8 (také zvané FLICE nebo MACH) . Poté co se na kaspázu-8 naváže FADD, kaspáza-8 podléhá oligomerizaci, což řídí její aktivaci ke samoštěpení. Kaspáza-8 pak aktivuje stejně efektorové kaspázy, které v tomto směru působí, a to tak, že kaspáza-9 má na starosti buněčnou apoptózu. Ashkenazi A., et al. v Death Receptors: Signaling and Modulation Science 281, 1305-1308 (August 1998).

Kromě toho, že FasL spouští apoptózu v T lymfocytech, je také prozánštlivá. Bylo prokázáno, že FasL stimuluje aktivaci neutrofilů, které se také nazývají leukocyty s polymorfním jádrem (dále též PMN od polymorphonuclear) . (Chen J. et al. Science 282: 1714-17 (1998)) Bylo zjištěno, že při klonálních vyraženích v autoreaktivních lymfocytech, v periferních lymfatických tkáních a při eliminacích autoreaktivních populací lymfocytů přispívá vazba FasL-Fas k zachování imunitního systému. Nicméně bylo zjištěno, že exprese FasL na trubicích nebo pankreatických ostrůvcích transgenní myši indukuje granulocytovou odezvu, která urychluje odmítnutí roubu (Allison J. et al., Proč. Nati. Acad. Sci, 94:3943-47 (Apríl 1997); Kang S-M. et al., Nátuře Medicien, Vol. 3, No. 7, 738-743 (July 1997)).

Minimálně jedním z poslání FasL-Fas vázaného receptoru je apoptóza, která je nutná pro homeostázu. Nicméně, někdy je rovnováha vazby ligand-receptor porušena v důsledku stresu, nemoci nebo zranění. Jeden z negativních účinků neregulovaného navazování FasL-Fas je vymizení nebo aberace apoptózy. Jiným účinkem uvedené vazby je destrukce zdravých buněk, způsobená neutrofily, které byly aktivovány vlivem FasL.

Například jedním z tragických výsledků poruchy apoptózy ve specifickém orgánu je akutní selhání jater. Akutní selhání jater se vyznačuje nadměrnou aktivací apoptotické cesty, při kterém dochází k masivní apoptóze hepatocytů a krvácivým změnám v játrech. Akutní jaterní selhání může být důsledkem virových infekcí, působících na játra, bakteriálních infekcí působících na játra, hepatitidy, poškození jaterních buněk a/nebo jiných stavů, kdy dochází k masivní hepatocytové apoptóze. Jeden příklad infekce, která vede k akutnímu selhání jater je bakteriálně indukovaná fulminantní hepatitida.

Podstata vynálezu

Vynález zahrnuje molekulu isolované nukleové kyseliny, která má sekvence, uvedené na obrázku 1, molekulu isolované nukleové kyseliny, která má sekvence, uvedené na obrázku 3, isolovaný polypeptid, který má sekvenci, uvedenou na obrázku 1, a isolovaný polypeptid, který má sekvenci, uvedenou • · · na obrázku 3. Vynález taká zahrnuje transgenní myš, která má transgen zahrnující sekvenci, uvedenou na obrázku 1.

Podle jednoho aspektu vynálezu se řeší mFLINT, kterou lze použít pro léčení následujících stavů: akutní selhání jater; zánět jater; abnormální apoptóza hepatocytů; sepse; porucha spjatá se zánětem; hepatitida; léčení abnormální apoptózy; poškození nebo porucha související s ischémií; poškození nebo porucha spojená s nadměrnou srážlivostí, přičemž lze použít v kombinaci s prostředkem, vybraným ze skupiny, tvořené trombolytickými a antitrombotickými prostředky, podobně aktivovaný protein C; poškození, které je spojeno s reperfúzí, nebo porucha, spojená s reperfúzí; poškození srdečního myocytu, které vede k abnormální myokardiální ischémií; Cukrovka Typu I; rakovina; poškození nezralé okolní tkáně, způsobené chemoterapeutickým činidlem nebo terapeutickým ozařováním, včetně kostní dřeně, střevního epitelu, epitelu ústní dutiny; poškození krvetvorných výchozích buněk, které byly vystaveny terapeutickému ozařování nebo chemoterapie; buněk, poškozených v důsledku terapeutického ozařování nebo chemoterapie včetně poškození buněk střevního epitelu, krvetvorných výchozích buněk a periferních krevních buněk; aplastických anemií; myelodysplastických syndromů a pancytopenních stavů.

Podle dalšího aspektu vynálezu se řeší mFLINT, která je použitelná pro podporu růstu nebo diferenciaci krvetvorných výchozích buněk a pro podporu růstu nebo diferenciaci buněk CD34+.

Mezi další aspekty vynálezu patří prostředky, které obsahují jako účinnou složku mFLINT, které jsou upraveny pro léčení následujících patologických stavů: akutní selhání jater; zánět jater; abnormální apoptóza hepatocytů; sepse; porucha spjatá se zánětem; hepatitida; léčení abnormální apoptózy; poškození nebo porucha související s ischémií; poškození nebo porucha spojená s nadměrnou přičemž lze použít v kombinaci s prostředkem, srážlivosti, vybraným ze skupiny, tvořené trombolytickými a antitrombotickými prostředky, podobně aktivovaný protein C; poškození, které je spojeno s reperfúzí, nebo porucha, spojená s reperfúzí; poškození srdečního myocytu, které vede k abnormální myokardiální ischémii; Cukrovka Typu I; rakovina; poškození nezralé okolní tkáně, způsobené chemoterapeutickým činidlem nebo terapeutickým ozařováním, včetně kostní dřeně, střevního epitelu, epitelu ústní dutiny; poškození krvetvorných výchozích buněk, které byly vystaveny terapeutickému ozařování nebo chemoterapie; buněk, poškozených v důsledku terapeutického ozařování nebo chemoterapie včetně poško.zení buněk střevního epitelu, krvetvorných výchozích buněk a periferních krevních buněk; aplastických anemií; myelodysplastických syndromů a pancytopenních stavů.

Podle ještě dalšího aspektu vynálezu jsou vyřešeny prostředky, které obsahujíc jako účinnou složku mFLINT, které jsou upraven pro podporu růstu nebo diferenciace krvetvorných výchozích buněk a pro podporu růstu nebo diferenciace buněk CD34+.

Ještě další provedení podle vynálezu zahrnuje použití mFLINTů k přípravě léčiv, která jsou použitelná pro léčení následujících stavů: akutní selhání jater; zánět jater; abnormální apoptóza hepatocytů; sepse; porucha spjatá se zánětem; hepatitida; léčení abnormální apoptózy; poškození nebo porucha související s ischémií; poškození nebo porucha spojená s nadměrnou srážlivosti, přičemž lze použít v kombinaci s prostředkem, vybraným ze skupiny, tvořené trombolytickými a antitrombotickými prostředky, podobně aktivovaný protein C; poškození, které je spojeno s reperfúzí, nebo porucha, spojená s reperfúzí; poškození srdečního myocytu, které vede k abnormální myokardiální ischémii; Cukrovka Typu I; rakovina; poškození nezralé okolní tkáně, způsobené chemoterapeutickým činidlem nebo terapeutickým ozařováním, včetně kostní dřeně, střevního epitelu, epitelu ústní dutiny; poškození krvetvorných výchozích buněk, které byly vystaveny terapeutickému ozařování nebo chemoterapie; buněk, poškozených v důsledku terapeutického ozařování nebo chemoterapie včetně poškození buněk střevního epitelu, krvetvorných výchozích buněk a periferních krevních buněk; aplastických anemii; myelodysplastických syndromů a pancytopenních stavů.

Podle ještě dalšího aspektu vynálezu je vyřešeno použití mFLINTů k přípravě farmaceutických prostředků, použitelných pro podporu růstu nebo diferenciace krvetvorných výchozích buněk a pro podporu růstu nebo diferenciace buněk CD34+.

Tento vynález zahrnuje způsob pro léčení jedince, trpícího abnormální hepatocytovou apoptózou, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu. Vynález také zahrnuje způsob léčení jedince, trpícího poruchou spojenou se zánětem, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu. Kromě toho, vynález zahrnuje způsob léčení jedince, trpícího abnormální apoptózou, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu.

Vynález dále zahrnuje použití mFLINTů k léčení řady chorob jater. V tomto směru vynález zahrnuje způsob léčení jedince, trpícího akutním selháním jater, které zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství mFLINT proteinů tomuto jedinci. Vynález také zahrnuje léčení jedince, trpícího zánětem jater, při kterém se uvedenému jedinci podává terapeuticky účinné množství mFLINT proteinů. Jiný prostředek podle vynálezu je vhodný pro léčení jedince, trpícího žloutenkou, při kterém se uvedenému jedinci podává terapeuticky účinné množství mFLINT proteinů.

Vynález také zahrnuje způsob léčení jedince, trpícího sepsí, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu.

Tento vynález také zahrnuje způsob pro léčení jedince, trpícího poškozením nebo poruchou spojenou s ischémií, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu. Takové poškození nebo porucha může mít spojitost s nadměrnou srážlivostí. V tomto směru vynález také zahrnuje léčení poruchy spojené s nadměrnou srážlivostí, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINTů v kombinaci s trombolytickým prostředkem nebo antitrombotickým prostředkem. Jedním z příkladů takového antitrombotického prostředku je aktivovaný protein C.

Vynález také zahrnuje způsob léčení jedince, trpícího poškozením nebo poruchou spojenou s reperfúzí, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu .

Vynález dále zahrnuje způsob prevence poškození srdečního myocytu u jedince, který trpí abnormální myokardovou ischémií, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu.

Dále je do vynálezu zahrnut způsob léčení jedince, trpícího cukrovkou Typu I, při které se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu. Ještě další způsob podle tohoto vynálezu zahrnuje způsob léčení jedince, trpícího rakovinou, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINT proteinu.

Vynález také zahrnuje způsob léčení poškození necílové okolní tkáně, která je vyvolaná chemoterapeutickým prostředkem nebo terapeutickým ozařováním, u jedince takto léčeného, při kterém se podává uvedenému jedinci terapeuticky účinné množství mFLINTů. Mezi takové tkáně patří kostní dřeň a střevní epitel a patří mezi ně i epitel ústní dutiny.

Vynález zahrnuje způsob pro léčení krvetvorných výchozích buněk, které byly vystaveny terapeutickému ozařování nebo chemoterapie, při kterém se podává mFLINT do uvedených buněk. Such způsob podporuje obnovu krvetvorných výchozích buněk po škodlivých vlivech terapeutického ozařování nebo chemoterapie. Vynález také zahrnuje způsob podpory růstu nebo diferenciace krvetvorných výchozích buněk, při kterém se podává mFLINT to uvedených buňka. Vynález dále zahrnuje způsob podpory růstu nebo diferenciaci CD34+ buňky, při kterém se podává mFLINT do uvedených buněk.

Vynález také zahrnuje způsob pro léčení rakoviny, zahrnující léčení buněk kostní dřeně in vitro pomocí mFLINT, a podávání uvedených buněk uvedeným pacientům, kde uvedených podávání se vyskytuje poté, co byl uvedený pacient léčen pomocí terapeutického ozařování nebo chemoterapie. Kostní dřeň ·· * · · · ·· buněk může být autologní, t.j. od léčeného pacienta, nebo heterologní, t.j. od jiného jedince než je pacient.

Vynález také zahrnuje způsob léčení poškození buňky ozarovan pacienta, který je terapeuticky chemoterapeuticky léčen, při kterém se kromě uvedeného ozařování nebo chemoterapie podává uvedenému pacientovi terapeuticky účinné množství mFLINTů. Poškozenou buňkou může být buňka střevního epitelu, krvetvorná výchozí buňka nebo buňka periferní krve.

nebo

Vynález také zahrnuje způsoby léčení aplastické anémie, myelodysplastického syndromu nebo a pancytopenních stavů, při kterém se pacientovi, trpícímu aplastickou anemií podává terapeuticky účinné množství mFLINTů.

Stručný popis přiložených obrázků

Obrázek 1 ukazuje kombinovanou aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci lidského FLINT:

Obrázek 2 ukazuje kombinovanou aminokyselinovou a nukleotidovou sekvenci lidského FLINT.

Obrázek 3 ukazuje kombinovanou aminokyselinu a nukleotidovou sekvenci lidského mFLINT.

Obrázek 4 ukazuje kombinovanou aminokyselinu a nukleotidovou sekvenci lidského mFLINT.

Obrázek 5 srovnává účinek mFLINTů s jinými prostředky pro léčení sepse u zvířecího modelu v různých časech od podání LPS.

Obrázek 6, levý panel, ukazuje experiment, při kterém se porovnává mFLINT s anti-TNF na zvířecím modelu sepse. Pravý panel srovnává a nižší dávku mFLINTů s anti-TNF, přičemž je použit stejný model.

Obrázek 7 ukazuje experiment porovnávající intravenózní a intraperitoneální podávání mFLINTů a anti-TNF u zvířecího modelu sepse.

Obrázek 8 ukazuje zmenšení objemu B16 melanomu jako odpověď na léčení pomocí mFLINT.

Obrázek 9 ukazuje, mFLINTem dosaženou obnovu kostní dřeně výchozích buněk po ozařování.

Obrázek 10 ukazuje mFLINTem dosaženou obnovu kostní dřeně progenitorových buněk po léčení 5-fluoruracilem.

Podrobný popis vynálezu

Použitím metod pro identifikaci sloučenin, které váží Fas ligand objevili přihlašovatelé, že lidské FLINT polypeptidy jsou schopny rozpojit interakci FasL-Fas receptor. Přihlašovatelé objevily způsoby modulace TNFR proteinů a jejich interakcí s příslušnými ligandy, přičemž takové interakce způsobují nebo zhoršují nemoci a způsoby prevence nebo léčení nemocí.

Jak je shora uvedeno, je velmi dobře zjištěno, že jedním ze souběžných účinků vazby FasL-Fas receptor je apoptóza. Při stavech, kdy se uplatňuje abnormální aktivace této cesty, je výsledkem nekontrolovaná apoptóza, která je faktorem • · · · · · · ······· ·· · ·· · přispívajícím k patologii řady chorob. Ještě další souběžný účinek vazby FasL-Fas receptor je aktivace neutrofilu, při které jsou buňky ničeny neutrofily, aktivovanými FasL.

V současné době bylo objeveno, že FasL vyvolává v peritoneálních exsudačních buňkách (PEC) proces uvolňování IL-Ιβ, který je odpovědný za infiltraci neutrofilu. Konkrétně, Miwa Κ., et al. Nátuře Medicíně, 4(11): 1287-1292 (Nov. 1998), zjistili, že inokulace nádorových buněk, exprimujících Fas ligand, do divokého typu myši vyvolává masivní infiltraci neutrofilu, která je, v kontrastu s tím, potlačena u myši, knokautované IL-Ιαβ. To naznačuje, že FasL hraje u zánětu určitou roli. Také to naznačuje, že apoptóza může jako taková vyvolat za určitých podmínek zánět. Dále je známo, že uvedená apoptotická řada následných dějů, vyvolaná Fas, může vyvolat určité zánětlivé faktory. Tudíž je pravděpodobné, že FasL působí patologicky dvěma, možná odlišnými ale příbuznými cestami.

Vynálezci objevili, že polypeptidy FLINT se váží na FasL nejméně stejnou, jestli ne větší, afinitou, než ne Fas receptor samotný. Výsledkem vazby na FasL je, že polypeptidy FLINT mohou rušit navazování FasL na Fas receptor a tím rušit děje, na této vazbě závislé. Pomocí různých in vitro a zvířecích modelů, uvedených dále v příkladech vynálezci prokázali, že schopnost polypeptidů FLINT zabránit nežádoucím účinkům, zprostředkovaných Fas. Z těchto výsledků je vidět, že FLINT může ovlivnit jak apoptotický, tak i prozánětlivý aspekt aktivity FasL, což implikuje jejich použití při léčení určitých chorob a nežádoucích stavech, které jsou diskutovány dále.

• · · · · ·

Výsledky uvedené dále ukazují, že mFLINT inhibuje apoptózu vyvolávající FasL aktivitu prozánětlivou aktivitu.

Antagonistickým účinkem vůči FasL mohou polypeptidy mFLINT modulovat destrukci zdravých buněk, způsobenou neutrofily, aktivovanými vlivem FasL a také mohou modulovat apoptotické poškození způsobené přímo interakcí FasL-Fas. V souladu s tím jsou tyto metody léčení, používající mFLINT jsou použitelné při léčení a prevenci poruch, spojených s přímým apoptotickým účinkem FasL a/nebo poškození, způsobená prozánětlivými účinky FasL, nezávisle na tom, zda tyto účinky jsou či nejsou vyvolány odlišnými fysiologickými cestami.

Tudíž, jak bylo obecně zjištěno, vynález řeší způsoby prevence nebo léčení stavů způsobených nebo abnormální apoptózou, konkrétně apoptózou navázáním Fas ligandu (FasL) na Fas receptor zhoršených vyvolanou (Fas) (také označovaným jako vazba FasL-Fas). Tento vynález také týká způsobů způsob prevence nebo léčení stavů pnozánět1ivou odpovědi/ konknétněji pnozánětiivou odpovědi

T VO /'si'·'» X> TM 7 » —i lz+- -ITT'^-·. X~7 Π Kl ZM i +· ·*·> 4 Ί 1°1 T TI 7ΤΤ/Λ 1 —S VS X~\ η 7 C T

Lpdowdiivd αχύχναυχ uddLxxxxxx vyvvxcmuu ιαοχι» působených

A 7 t óto nř-ÍblóooQ

V pj_ l o vu xxlu rs o rlro i lf O r-\ η kol oon z i' k v £-/ </ kU. Z-. X. y\-/u.

jpřshiodněni nesmál r> V>w+· n a

XX J J k_ jejich zaklade umele konstruováno omezení rozsahu vynalezu.

f i pí .eto přihlášce jsou používaný následující definice.

Tormi p ^M TT ΤλΤΦ^η • ' '_ALL_U AA ...... · a Ir -i o tt tomto H r\ lri imon Ή 1η

JX _J V t_<XALLL_</ ΧΧ\_Ζ Ji. LU.ALLX-. A A t_ LU.

-i a V\7Irrs 1 η ·

JUXJXJ JXX-Z _L. _L.

ΐΡΤ.ΤΚΤΤ ηοΊ λ rrsorsk- η Η ni no pou

Mo -7 Ί +- as Vrrtrók rs

Px*s Ί x A -i /“47 τ o Ί io f-\ /-Ί A 1 Izt 7 o o +~ ·ϊχ» n Si ττοΝ το 4 o Izttoo oo Ix· + o\ ν'·ο π o 4— ττο tt·r\ o v t xuy yxuc rx_y pca.uxx uwuux Αοθχσ LvvxSua.

S} s Tr^f^vs-k· n zS om o omÍnolozoo] -i r orní Ί — Q Ο οοΊ i ττο ζ-\γο t- η /-} π ITT TKPT¹ N/Trx-vCU.ALLX. i 1 X-/ ij O r X Xi C_U.A1.L-1_ ¹ x . / izkz ixzízi kzi iizij i >>>« - i*i, z.

— 9 0 ΟθΊ 1 7T->/-\YOt- Ί /~}π _L _U OCX J O XLUU

příklady FLINT patří jakýkoliv protein, který má sekvenci aminokyselin uvedenou na Obrázku 1, což je lidský FLINT, a na Obrázku 2, což je jiná varianta lidského FLINTu.

Termín mFLINT, jak je v tomto dokumentu používán, znamená zralý FLINT, t.j. peptid FLINT, který nemá úvodní (také známou jako signální sekvenci) peptide. Mezi příklady mFLINTů patří jakákoliv protein, který má amino acid sekvence, uvedená v Obrázek 3, což je protein podle obrázku 1 bez úvodního peptidu, a protein, který má aminokyselinovou sekvenci, uvedenou na Obrázku 4, což je protein podle Obrázku 2 bez aminokyselin 1-29. V souladu mFLINT gen znamená nukleovou kyselinu, polypeptid mFLINT. Příklady genů mFLINTů podle vynálezu jsou tyto nukleové kyseliny, uvedené na Obrázcích 3 a 4.

s tím termín která kóduje

V tomto dokumentu jsou užívány, při odkazech na expresi interakci FasL nebo Fas, nebo na jakoukoliv výslednou apoptózu, termíny nevhodný a abnormální, které by měly být pochopeny tak, že zahrnují jakoukoliv odchylku od normální exprese, interakce nebo hladin apoptozy. Mezi takovéto odchylky patří dočasné, kvantitativní i kvalitativní abnormality. Exprese FasL nebo Fas transkripci, translaci a s nimi spojené jakýkoliv proces, který má za důsledek zvýšení přístupnosti aktivní FasL nebo Fas, jako je dostupnost a přístupnost transportních povrchových buněk.

znamena nejen děje, ale také

Také Termín abnormální apoptózou, jak je zde používán, znamená nadměrnou a/nebo nevhodnou apoptózu. Typická abnormální apoptóza je pozorována u buněk těch tkání, které podstoupily fyzikální, chemický nebo biologický atak. Mezi takové ataky patří, mimo jiné, fyzikální poškození, virová • ·· · · ·«·· ·« ···· ·· · » · « • · · · · · · • · · · · · ·· ··· infekce, bakteriální infekce, ischémie, ozařování, chemoterapie, a podobně.

Termín fušovaný protein znamená a hybridní proteinovou molekulu, která se nenachází v přírodě, obsahující translační fusi nebo enzymatickou fusi, v kterém jsou na jeden polypeptidový řetězec kovalentně vázány dva nebo více různých proteinů nebo fragmentů.

Hostitelská buňka znamená jakoukoliv eukaryotickou nebo prokaryotickou buňku, která je vhodná pro propagaci a/nebo expresi klonovaného genu, obsahujícího vektor, zavedený do uvedené hostitelské buňky například transformací nebo transfekcí nebo podobně.

Isolovaná nukleová kyselina jako sloučenina znamená jakoukoliv RNA nebo DNA sekvenci, která je konstruovaná nebo syntetizovaná, a která je umístěna jinde, než na přírodním umístění.

Termín plasmid znamená extrachromozomální genetický prvek, Plasmidy, které jsou zde popsány, jsou komerčně dostupné, veřejně dostupná v basích, nebo se mohou konstruovat ze snadno dostupných plasmidů podle publikovaných postupů.

A primér je fragment nukleové kyseliny, který má funkci iniciačního základu pro enzymatické nebo syntetické prodlužování řetězce, například nukleové kyseliny.

Termín promotor znamená sekvenci nukleové kyseliny, která řídí transkripci, například DNA na RNA. Indukovatelný promotor je takový promotor, který je regulovatelný signály z prostředí, jako jsou například zdroje uhlíku, teplo nebo ionty • · J · · ···· ·· • · · · * · · ··· • · · · · · · • · · ·« · ·· ··· kovů. Konstitutivní promotor obecně funguje na konstantní úrovni a není regulovatelný.

Rekombinační DNA klonovací vektor, jak se zde tento termín užívá, znamená jakékoliv autonomně replikující činidlo, včetně, mimo jiné, plasmidů a fágů, obsahující molekulu DNA, do kterého se může inkorporovat jeden nebo více přídavných DNA segmentů nebo do kterého již byl alespoň jeden takový segment inkorporován.

Termín rekombinační DNA expresní vektor nebo expresní vektor, jak je zde používán, znamená jakýkoliv rekombinační DNA klonující vektor, například plasmid nebo fág, ve kterém je přítomen promotor a jiné regulační elementy, čímž je umožněna transkripce vložené DNA, která může kódovat polypeptid.

Termín selektivně vázající znamená schopnost FLINT polypeptidů vázat FasL, ale ne TNFoo.

V podstatě čistý, používáno ve vztahu k peptidu nebo proteinu znamená, že uvedený peptid nebo protein je separován od jiných buněčných a nebuněčných molekul, včetně jiných proteinových molekul. V podstatě čistý přípravek je takový, který je alespoň z 85 % čistý; výhodně alespoň asi 95 % čistý.

V podstatě čistý protein, jak je zde popsán, se dá připravit řadou technik, které jsou odborníkovi v oboru dobře známy, včetně například způsobu čištění proteinů IMAC.

Termín vektor, jak je zde používán, znamená nukleovou kyselinu, používanou pro zavádění exogenních nebo endogenních DNA do hostitelských buněk. Vektor zahrnuje nukleotidovou sekvenci, která může kódovat jednu nebo více proteinových molekul. Příklady obecně používaných vektorů jsou plasmidy, • »·* 00 0w · · • · · · «« « 0·· • · 0 · · » 0 0 « · > 0« 0 00 0 * kosmidy, viry a bakteriofágy, v přírodním stavu nebo podrobené rekombinační manipulaci.

Různé restrikční enzymy, které jsou zde zveřejněné a popsané, jsou komerčně dostupné a způsoby použití uvedených enzymů včetně reakčních podmínek, kofaktorů a jiných požadavků na aktivitu jsou odborníkovi v oboru dobře známé. Reakční podmínky pro určité enzymy byly prováděny podle doporučení výrobce.

II. FLINT váže FasL a LIGHT

FLINT je nově identifikovaný člen nadskupiny TNFR, Tato skupina receptorů zprostředkuje řadu biologických účinků TNF ligandů, včetně, mimo jiné, proliferace buněk, diferenciace buněk, regulace imunity, zánětlivých odpovědí, cytotoxicity a apoptózy,

Polypeptid FLINT podle tohoto vynálezu je rozpustný receptor, obsahující extrácelulární domény. Polypeptid FLINT neobsahuje žádné transmembránové domény a je proto rozpustný, FLINT se také nazývá OPG3 (osteoprotegrin 3) nebo TNFRsol. Má se za to, že FLINT je blízce příbuzný TNFR 6a a TNFR 6β, diskutovaným v WO 98/30694, který požívá prioritu z U.S.S.N. 60/035,496 a TR4, diskutovaného v EP 0861850 Al.

Data, která jsou uvedena dále, dokládají, že mFLINT se in vitro váže na FasL a na LIGHT. FasL, jak bylo poznamenáno, se uplatňuje ve spouštění zánětlivých odpovědí a ve vyvolání apoptózy. Biologická aktivita LIGHT zahrnuje, kromě jiného, proliferací buněk. LIGHT je člen nadskupiny transmembránových TNF proteinů type II s molekulovou hmotností 29kDa, produkovaných aktivovanými T buňkami. Mauři D.M., Immunity, • ·· ·· ···· ·· ···· · · · · · · • · » · · · · * · · « · · •»· «« » ·· ·

8:21 (1998). As s FasL, evidentně je LIGHT svázána s infiltrací neutrofily a s apoptózou. Zhai et al., J. Clin. Investig 102:1142-51, 1998. Tudíž se očekává, že inhibiční aktivita vůči LIGHT, kterou mají mFLINTy, bude terapeuticky použitelná, v podstatě jak je popsáno dále pro inhibici FasL, způsobenou mFLINTy, zejména při podpoře imunity a při léčení rakoviny.

III. FLINT - Terapeutické aplikace

Vynálezci objevili, že mFLINTy zabraňují in vitro apoptóze buněk Jurkat, indukované působením FasL. Tyto buňky jsou aktivovány protilátkami Anti-CD3 a tyto protilátky způsobují, expresi FasL a podstupují apoptózu. mFLINT také byl účinný jako inhibitor anti-CD3-vyvolané apoptózy buněk Jurkat in vitro způsobem, závislým na dávce.

Tento vynález je aplikovatelný na léčení a/nebo prevenci chorob, spojených s nežádoucí nebo abnormální interakcí FasL s Fas, protože mFLINT této interakci zabraňuje. Tato nežádoucí interakce může povstat například v důsledku zvýšené exprese nebo dostupnosti FasL a/nebo Fas. Jelikož je známo, že interakce FasL-Fas indukuje apoptózu, vynalezené způsoby se dále obecně aplikují na poruchy, pro které je charakteristická nežádoucí nebo abnormální apoptóza.

V jiném provedení se tento vynález týká způsobu prevence nebo léčení stavů, způsobených nebo zhoršených vazbou FasL-Fas včetně apoptózy způsobené FasL a/nebo prozánětlivé odpovědi, konkrétněji prozánětlivé odpovědi, způsobené aktivací neutrofilů, vyvolanou FasL.

• · · · · • · · · τ *······ toto ·

Například se mFLINT může použít při léčeni Downova syndromu. Podpořená apoptóza neuronových buněk může být implikována u Downova syndromu. V tomto směru, Seidi, et al., Neuroscience Lett. 260:9 (1999), hlásí zvýšené hladiny proteinu Fas v temporálním laloku a mozku dospělých pacientů s Downovým syndromem, což naznačuje, že spojení Fas s apoptozou může být významným znakem neurodegenerace u Downova syndromu. Je proto očekáváno, že může být účinné léčení Downova syndromu pomocí mFLINT. Konkrétně vynálezci ukázali, že mFLINT se váže na FasL, tím zabraňuje vazbě Fas-FasL, a inhibuje apoptózu. Podobně je apoptóza spojena s Alzheimerovou chorobou a jinými neurodegenerativními chorobami. Očekává se, že podávání mFLINTů snižuje zvýšenou apoptózu spojenou s Downovým syndromem, Alzheimerovou chorobou a jinými neurodegenerativními poruchami.

Vynálezci testovali mFLINT řadu modelových systémů, které jsou indikativní pro různé choroby a škodlivé stavy. Mezi několik exemplárních poruch patří, mimo jiné, cytotoxicita závislá na protilátce, infekce lidským virem imunodeficience, hemolytický uremický syndrom, alergie a bronchopulmonární dysplasie. Proto se v následující části diskutují choroby nežádoucí stavy v kontextu s příslušnými modelovými systémy.

Tento vynález také zahrnuje produkci transgenních zvířat, která obsahují transgen FLINT. Konkrétně vynálezci již získali transgenní myš, která produkuje měřitelné hladiny mFLINTů. Zvířata jako je tato myš jsou použitelná pro posouzení vlivů mFLINTů na řadu chorob, dále podrobně popsaných, jako je šok vyvolaný endotoxinem, mozková ischémie, srdeční reperfúze a poškození vyvolaná léčením rakoviny, jako terapeutickým ozařováním a chemoterapií.

A. Léčení poškození při zánětu jater pomocí mFLINT

FasL lze použít v případech akutního selhání jater včetně, mimo jiné, poškození způsobených na játrech při hepatitidě. U myšího modelu akutní hepatitidy podávání anti-FasL protilátky myši způsobuje selhání jater, vyvolané apoptózu v hepatocytech a zvířata umírají v průběhu hodin. Kondo et al, 1997 Nátuře Medicine 3(4):409-413. Viz také Galle et al, J. Exp. Med, November 1995, 182:1223-1230.

Tsuji et al. (1998), Infect. Immun. 65:1892-1898, popisuje modelový systém bakteriálně vyvolanou těžkou hepatitidu. Jak je podrobně popsáno dále, tento systém je schopen předpovědět vliv na řadu chorob jater a jiných tkání. Při způsobu podle Tsuji et al., bylo myším injekčně vstříknuto Propionibacterium acnes, a následně dostanou injekčně lipopolysacharid (LPS). U normální myši způsobuje první injekce tvorbu granulomu v játrech, zatímco druhá injekce vyvolá masivní apoptózu a následné poškození jater. Tsuji et al. použili tento způsob k stanovení vlivu TNFRpSS na tvorbu granulomu a TNFRp55 a Fas na apoptózu.

S použitím modifikované verze zvířecího modelu podle Tsuji et al. zjistili přihlašovatelé, že podávání mFLINTů dramaticky zlepšuje podíl přežívajících testovaných zvířat. Jak bylo zjištěno, mnoho chorob, které se podílejí na vzniku FasL-Fas etiology.je léčitelných a/nebo se jim dá předejít preventivně, látkami podle vynálezu. Proto cílové choroby obecně buď souvisejí s tkání, která nesprávně (např, dočasně, kvalitativně nebo kvantitativně) exprimuje Fas nebo při expresi Fas nevhodně přichází do kontaktu s FasL. Mnohé tyto choroby sledují obecný patologický model nežádoucí ztráty regulace Fas, s následujícím vyvoláním apoptózy působením

FasL. Nepatřičná exprese Fas (nebo FasL) může být vyvolaná například napadením zánětem, přičemž se mohou uplatňovat určité cytokiny, které jsou spojené se zánětlivou reakcí, a které normálně zmíněnou expresi vyvolávají.

Například je známo, že první fáze mononukleární infiltrace vede k sekreci řady cytokinů, která může mít za výsledek nepatřičnou expresi Fas a/nebo FasL. Je například známo, že IL-la, IL-Ιβ a TNF-α může vyvolat expresi Fas. Tato zvýšená exprese Fas může ve skutečnosti senzibilovat dotčenou tkáň k efektorovým buňkám, nesoucím FasL, jako přírodní zabíjecí buňky a cytotoxické T buňky. Kontakt efektorů, nesoucích FasL s cíly, které nesou Fas, vyvolává jejich apoptózu. Jinými slovy tento model hepatického poškození je in vivo napodobením určitých nemocí, pro které je charakteristické:

(a) napadení zánětem a/nebo (b) apoptóza a/nebo nekróza zprostředkovaná vazbou FasL-Fas.

V souladu s tímto modelem je patologie choroby roub versus hostitel (graft versus host desease, dále GVHD), která je velmi obecná, a projevuje se například při transplantaci autologní kostní dřeně. GVHD má za následek přítomnost T buněk reaktivních vůči hostitelskému organizmu, které ničí hostitelovy tkáně, alespoň částečně cestou apoptózy, zprostředkované FasL. V GVHD se obvykle rozlišují dvě fáze, nazývané aferentní fáze a eferentní fáze. Aferentní fázi lze charakterizovat rozpoznáním hostitelových antigenů a proliferaci donorových T buněk. V eferentní fázi se tkáně jako je kůže, játra a zažívací trakt, zaněcují a projevuje se charakteristická infiltrace jednojadernou buňkou a dochází k histopatologickému poškození. Experimenty, které používají FasL-defektní myš fakticky prokazují, že FasL hraje v GVHD klíčovou roli při vzniku a rozvoji hepatického, kožního • · · · • · a lymfoidního poškození orgánu. Odtud plyne, že GVHD sleduje paradigma o apoptóze zprostředkované vlivem Fas při napadení zánětem.

Hashimotova nemoc štítné žlázy (HT) tomuto paradigmatu také odpovídá. HT je důsledek autoimunitní odpovědi, namířené proti tyroidním folikulárním buňkám. Normální tvrocyty produkují FasL a exprimují zanedbatelné hladiny Fas. Nicméně při HT dochází výsledné k zánětu, který je důsledkem sekrece IL-Ιβ aktivovanými makrofágy, které pak ovlivňující tyrocyty, aby produkovaly Fas. Tento stav fatálního autokrinního cyklu FasL-Fas vede výsledně k apoptóze.

Jednoduše řečeno, oxidované nízkohustotní lipoproteiny (OxLDL), spojené s arteriosklerotickými lézemi, podporují chronickou zánětlivou reakci. Zatímco vaskulární endotel normálně exprimuje FasL i Fas, při nepřítomnosti ataku OxLDL nepodléhá apoptóze. Nicméně při léčení pomocí OxLDL se exprese FasL zvyšuje a endotelové buňky podléhají apoptóze.

Chronické ledvinové selhání je závislé na sekreci IL-Ια a TNF-α, které obě indukují expresi Fas v renálních tubulárních epitelových buňkách. Tato porucha je charakterizována poklesem počtu tubulárních epitelových buněk, k čemuž dochází cestou popsané FasL-Fas apoptózy. Kromě toho, stejná cytokinem-vyvolaná indukce exprese Fas tubulárních buňkách je pozorována na modelu endotoxického šoku (sepsi) akutního ledvinového selhání.

K akutnímu selhání jater může dojít onemocnění jater při virové infekci, bakteriální infekci, hepatitídě, poškození jaterních buněk a/nebo jiných stavech, kdy hepatocyty podléhají masivní apoptóze. Galle et al, (J. Exp. Med., • · · ·

Listopad 1995, 182:1223-1230), například zjistili, že při selhání jater u lidí se uplatňuje smrt buněk, vyvolaná vazbou FasL-Fas. Galle et al. věděli, že apoptóza způsobená vazbou FasL-Fas je mechanismem, který má za účel eliminovat stárnoucí hepatocyty. Například bylo zjištěno, že při regeneraci jater, v průběhu degenerace jater po přerušení léčení lipofilními sloučeninami (např. fenobarbitol) a v průběhu virové infekce. V průběhu experimentů tito autoři zjistili, že při virové hepatitidě byly hepatocyty napadány aktivovanými T buňkami. Fas je konstitutivně exprimována v hepatocytech. To znamená, že FasL byla exprimována v T buňkách při jejich aktivací. Z toho plyne, že aktivované T buňky by měly zabíjet hepatocyty hepatitidy B (HBV), exprimující antigen s cílem vyčistit játra od HBV.

Vynálezcům se podařilo pomocí modifikovaného modelu Tsujiho dále indikovat, že mFLINT je použitelný pro léčení a prevenci sepse. Pro sepsi je charakteristická přítomnost jednoho nebo více patogenních organismů nebo jejich toxinů v krvi nebo tkáních. Dále, sepse je charakteristická systémickou zánětlivou odpovědí na infekcí, která je spojena se zprostředkovanou aktivací řady obranných mechanismů hostitele včetně cytokinové sítě, leukocytů a komplementárních systémů koagulace/fibrinolýza. Viz Mesters, et al. Blood, 88:881 (1996).

Je známo, že endotoxin(y) indukuje(i) faktor nekrózy tkáně (TNF), který na druhé straně indukuje zánětlivou reakci a FasL, čímž urychluje selhání jater a smrt, Nicméně pokusy použít protilátky zaměřené na TNF-α při léčení sepse, všechny stejným způsobem. To je pravděpodobně způsobeno faktem, že selhaly nezávisle na účincích proti patologii sepse, ale proto, že TNF-α je spíše globální mediátor normální imunitní • · · · funkce. Kromě toho, jak je dále doloženo v příkladech, TNF inhibitory se ukazují být méně použitelné při léčení postinsultačni sepse, a spíše jsou použitelnější profylakticky.

Data, dále uvedená dále v příkladech potvrzují, že mFLINT je pro podporu přežití u zvířecího modelu sepse více účinný, než inhibitory TNF. Fakticky tato data ukazují, že zatímco TNF inhibitory jsou účinné pouze při použití při postupu předléčení (t.j. když se aplikují před podáním LPS/galaktosamin), mFLINT se může být použít při postupech pro následné léčení. Toto je klinicky signifikantní, protože pacient bude virtuálně vždy po expozici endotoxinem. Jinými slovy, tato data prokazují, že mFLINT je použitelný jak při preventivních, tak při ameliorativních léčebných metodách, což je značný rozdíl oproti inhibitorům TNF. Minimálně tato data indikují, že mFLINT může být podáván později, při rozvoji nemoci, než anti-TNF; tím se očekává eliminace problémů, které byly zjišťovány při klinické praxi s inhibitory TNF.

Kromě toho tato data demonstrují, že mFLINT má terapeutický efekt alespoň jedné ze dvou uvedených úrovních, Endotoxin, jak známo, indukuje TNF, který přímo indukuje zánětlivou odpověď a FasL. Data získaná Tsuji et al, uvedená shora, naznačují, že tyto oddělené cesty obě přispívají k selhání jater a smrti, Konkrétně data těchto autorů, která byla získána s použitím Fas-deficitní myši, silně naznačují, že rozsah poškození jejich modelu je způsoben cestou nezávislou na Fas a závislou na TNF. Data uvedená dále však prokazují, že mFLINT, inhibitor cesty závislé na Fas, může inhibovat veškerá poškození, vyvolaná u modelu, ať jsou závislí na Fas nebo ne. Tudíž dokonce i když mFLINT reprezentuje různé cesty, může inhibovat poškození, způsobená jak zánětlivou reakcí, tak i indukcí FasL.

« · · · · · ·

Kromě toho lze předpokládat, že mFLINT může být výhodně použit v kombinaci s jinými prostředky, které jsou použitelné pro léčení sepse. Například U.S. Patent 5 009 889 ukazuje, že aktivovaný protein C (aPC) je účinný při léčení sepse na opičím modelu. Takový model se může použít k determinaci vhodné kombinace léčebných postupů, například mFLINT + aPC. aPC může předejít sepsi spojené s roztroušenou intravaskulární koagulací a široce rozšířeným ukládáním fibrínu v mikrovaskulatuře, což jsou ranné projevy zhoršení stavu (sepse/septický šok).

Tudíž, na základě vyššího poměru přežívajících jedinců, které bylo pozorováno u zvířat léčených mFLINT vynálezci předpokládají, že pomocí mFLINTů může být léčena nejméně jedna nebo více následujících chorob: syndrom akutní respirační tísně (ARDS); struma; hepatocelulární poškození (virové, bakteriální, rakovinové, traumatické); mononukleóza; mukocitóza (zánět sliznice); pankreatitida; periodontální choroby/gingivitida; selhání ledvin; selhání přidruženého orgánu; syndrom systémické zánětlivé odpovědi (SIRS); chirurgie; vaskulární krvácení; syndrom vaskulární propustnosti; transplantace celých orgánů; dysfunkce více orgánů (MODS); implantace bypassu koronární artérie; odmítnutí celého štěpu; odmítnutí transplantátu; infekce (např, mikrobiální, pneumonie, tkáňová nekrotická infekce a virová infekce); úbytek kostí při revmatoidní artritidě; Hashimotova thyroiditida; viróza včetně hepatitidy C (HCV), hepatitidy B (HBV), viru Ebola (hemolytická horečka) a Epstein-Barr (EBVj; zánět kůže; psoriáza; zánětlivá střevní choroba; ulcerativní kolitida; Crohnova nemoc; arterioskleróza; koncové stádium nemoci ledvin a sepse.

c ·

Konkrétně vynález předpokládá vyřešení způsobů léčení chorob, které jsou spojeny se zánětem. Odborník v oboru rozpozná, že mezi tyto choroby patří, mimo jiné, GVHD, Hashimotova choroba štítné žlázy, ARDS, hepatocelulární poškození (virové, bakteriální, rakovinné, traumatické); mukocitóza (zánět sliznice); pankreatitida, periodontální choroba/gingivitida; selhání ledvin; selhání satelitního orgánu; syndrome systémické zánětlivé reakce (SIRS); transplantace celého orgánu; dysfunkce více orgánů (MODS); přirůstání bypassu koronární tepny; odmítnutí štěpu; odmítnutí transplantátu; infekce (např., mikrobiální, pneumonie, tkáňová nekrotická infekce, virové infekce); revmatoidní artritida; virové infekce včetně hepatitidy C (HCV), hepatitidy B (HBV), viru Ebola (hemolytická horečka) a Epstein-Barr (EBV); zánět kůže; zánětlivá střevní choroba; arterioskleróza a sepse.

B, Léčení ischemie a reperfúze pomocí mFLINT

Pro ischémii je charakteristické snížení průtoku krve do tkání, které má za následek akumulaci řady toxických metabolitů. Tyto metabolity přispívají ke smrti buněk, což vede k nekróze a/nebo apoptóze. Dosti překvapivě bylo zjištěno, že když je tkáň reperfúzována, apoptotické poškození se zvyšuje. To je nejspíš důsledek vzniku radikálů a jiných toxinů reakcí ischémií-vyvolaných metabolitů se složkami séra. Ve všech případech studie ukázaly, že apopototické poškození má za následek alespoň částečné spuštění Fas-zprostředkovaných cest. Experimenty uvedené dále ukazují, že mFLINT se může použít k blokování poškození ischémií/reperfúzí, převážně inhibici FasL.

Použitelnost prostředků na bázi mFLINTů při léčení nebo prevenci chorob, spojených s cerebrální ischémii, jako je mrtvice a trauma hlavy, je potvrzena dále uvedenými daty. V těchto datech je například použit jako model živý gerbil globální mrtvice. Cerebrální ischemie byla vyvolána dočasným zaškrcením krční tepny, po kterém následovalo léčení mFLINTů nebo samotným vehikulem pro kontrolu. Data ukazují, že gerbily léčené mFLINTy si uchovaly mnohem více žijících neuronů, než kontrolní skupina, léčená vehikulem.

Tato data jsou konzistentní se studiemi, porovnávajícími rozsah infarktu mozkových tkání u myši, které chybějí funkční Fas receptory po ataku mozkové ischemie, a u myši normální. U takto mutantních myší bylo zjištěno průkazně menší poškození, než u normálních, kontrolních myší, Rosenbaum, et al,, Annals of Neurology, 44(3), 441, 1998. Dá se také vyvodit, že mFLINT budou rušit normální signální proces Fas receptorů u pacienta, u něhož došlo k mozkové ischemické příhodě, čímž se bude mozková tkáň chránit před zničením.

Kromě toho, byla apoptóza způsobená Fas sledována ve spojitosti s ischémickým reperfúzním poškozením u modelu infarktu myokardu, viz Kajstura et al,, Laboratory investigation 74:86-107 (1996). Z těchto výsledků plyne, že shora uvedený gerbilový model je spíše vhodný pro předpověď možností testovaných látek na generalizovanou ischemické reperfúzní poškození. Na podporu toho provedli vynálezci test in vitro s použitím srdečních myocytů. Konkrétně se postupovalo tak, že byly za podmínek hypoxie inkubovány kardiomyocyty po dobu 8 hodin, následně byly 16 hodin kultivovány za normál Q2, čímž byly napodobeny hypoxické stavy, ke kterým dochází v ischemické srdeční tkáni. Experimentální výsledky ukázaly, že léčení kardiomyocytů pomocí mFLINT chrání tyto buňky před apoptózou, vyvolanou hypoxií. Konkrétně léčení s 10 gg/ml mFLINT vedlo k 90% inhibici apoptózy, vyvolané hypoxií. Apoptóza kardiomycytů vyvolaná FasL byla také léčením mFLINTy inhibována.

Na bázi předchozích pozorování a uvedených výsledků vynálezci předpokládají, že se dá pomocí mFLINT léčit jedna nebo více chorob, uvedených v následujícím přehledu: mrtvice; ischémie míchy; eklampsie/preeklampsie; reperfúzní poškození; infarkt myokardu, t.j. akutní, subakutní a chronické následky a související klinické příznaky, včetně, mimo jiné, souvisejícího srdečního selhání. Tudíž je FLINT použitelný pro podporu léčení myokardu a prevenci dekompenzační hypertrofie myokardu.

Reperfúzní poškození může být u řady tkání důsledkem mnoha škodlivých vlivů, přičemž může jít o poškození střeva, spáleniny, poškození mechanizmu srdečního bypassu, hepatické poškození (traumaticky vyvolané), hemolytickou horečku (Ebola), toxicitu u dětí (hyperoxie, ke které dochází v inkubátorech s vysokým obsahem 0₂), poškození plic v důsledku zlomeniny/ARDS, transplantace orgánu, několikanásobné trauma (např, při autonehodě), ochrana cévních obalů, porucha vaskulárního orgánu, která je obvykle přítomna při sepsi či jiných chorobách. Tato pozorování dále naznačují, že mFLINT je použitelný pro prevenci/zmírňování apoptozy srdečních myocytů, která následuje o akutním infarktu myokardu, a obecně pro prevenci poškození srdce a jiné tkáně, ke kterému došlo v důsledku hypoxie.

Pokud jde o ochranu orgánů při přípravě k jejich získání, je například použitelný mFLINT profylakticky, aby se předešlo apoptóze spojené s ischémií reperfúzního poranění orgánu, když je dárci odebrán. Obvyklý způsob sestává z předběžného podání účinného množství mFLINTů dárci před odebráním orgánu.

Alternativně nebo souběžně může být odebíraný orgán prokrven nebo koupán v roztoku, který obsahuje mFLINT. Tento způsob se může použít například u ledviny, srdce, plic a jiných orgánů a tkání.

V jiném příklad je mFLINT použitelný pro léčení ischémie při reperfúzním poškození, spojeném s tvorbou trombů nebo nadměrným srážením. V těchto případech může být mFLINT podáván (např. urokinázou a jako je aktivovaný 5 350 578 popisuje v souběhu s trombolytickými prostředky streptokinázou) a/nebo antitrombotiky, protein C (aPC). U.S. Patent antitrombotickou aktivitu aPC. Pro ujištění, jaké je při použití zde popsané kombinační terapie, vhodné dávkování, lze použít jako zvířecí model paviány. V tomto směru je očekáváno, že se mohou pomocí mFLINTů (v kombinaci nebo bez kombinace s aPC) léčit následující stavy: eklampsie a preeklampsie, pro které je charakteristická zvýšená koagulopatie;

HELLP (preeklampsie komplikovaná trombocytopenií, hemolýzou a porušenou funkcí jater), HITS (heparinem vyvolaná trombocytopenie); roztroušená intravaskuíární koagulace (DIC); spáleniny a tromboembolické pooperační komplikace.

Jak bylo shora uvedeno, testy ukazují, že velký podíl apoptotických poškození je vyvolán reperfúzí. Tato poškození se projevují alespoň zčásti jako důsledek oxidačních poškození, a lze je tudíž omezit antioxidanty. V souladu, s tím bylo zjištěno, že Vitamin E, jako antioxidant, který se může použít pro ochranu masa, by možná působil pozitivně při stejném typu poškození, který působí plíseň. Podávání vitaminu E prasatům několik dní před poražením ukázalo, že po něm roste skladovatelnost masa. Odtud plyne, že mFLINT je podobně použitelný pro ochranu tkání a orgánů. Tento efekt by • ·· ······ ·· · ···· · · · · · · · « · · · · · · ··· ·· · ·· · · mohl být zejména použitelný pro zvýšení doby skladovatelnosti orgánů a masa, určeného k lidské spotřebě.

C. Léčení poruch krvetvorby pomocí mFLINT

Jak bylo diskutováno v této přihlášce, mFLINT inhibuje interakci Fas/FasL, čímž zabraňuje apoptóze. Jak je diskutováno níže, bylo zjištěno, že interakce Fas/FasL se podílí na hematopoietickém procesu. Proto tato přihláška předpokládá použití terapeutický způsobů založených na mFLINTech pro zlepšení hematoiogických náprav škod, ke kterým dojde při léčení a při určitých chorobách. Mezi takové případy patří poškození kostní dřeně při transplantaci, poškození při chemoterapii, radioterapii, aplastické anemii a při myelodyspiastickém syndromu a poškození při pancytopenních stavech. Tento vynález také zahrnuje léčení veškerých klinických stavů, které vyžadují zmnožení zárodečných buněk kostní dřeně, založené na podávání mFLINTů, a to samostatně nebo v kombinaci s jinými hematologickými růstovými faktory.

Mezi takové růstové faktory patří, mimo jiné, erytropoietin (EPO), FLT-3 ligand, trombopoietin (TPO), kmenový buněčný faktor (SCF), faktor stimulující granulocytové kolonie (G-CSF), a faktor stimulující granulocyty-makrofágy (GM-CSF).

Autologní a heterologní transplantace kostní dřeně jsou obecně používány k léčení řady neoplastických chorob. Při autologní transplantaci buněk kostní dřeně se z těla pacienta, který se má léčit, odeberou buňky kostní dřeně, a tyto buňky se namnoží kultivací in vitro. Po chemoterapii a/nebo radiační terapii se buňky reintrodukuji do těla pacienta. Při heterologní transplantaci se používají buňky kostní dřeně jiného jedince. Chemoterapie nebo radioterapie, která se • ·· ·· ···· • · · · · · · používá k léčení uvedených chorob má za následek dramatickou myelosupresi, způsobenou poškozením kostní dřeně a oddělení střevního epitelu, což u pacienta způsobuje imunosupresi a náchylnost k invazi mikroorganizmů. Léčení transplantovaných buněk kostní dřeně krvetvornými cytokiny vede, podle dosud získaných výsledků, k lepšímu zotavování zárodečných krevních myeloidů a erytroidů, je však obvykle spojeno s toxicitou těchto cytokinů, a další nevýhodou je, že jeden cytokin obvykle nepodporuje zotavování veškerých typů zárodečných buněk. Viz Moore, M.A.S. Blood 78:1 (1991); Metcalf, D.

Science 254: 529 (1991).

Radiace nebo chemoterapie indukuje, jak bylo prokázáno, apoptózu buněk kostní dřeně a buněk střevního epitelu. Cesta Fas/FasL, jak je též známo, indukuje u vnímavých buněk apoptózu. Současné publikace popisují uplatnění Fas/FasL při hematopoiéze, Pro přehled o této situaci viz Niho, et al,; Current Opinion in Hematology, 5: 163 (1998) . Fas je exprimována na CD34+ výchozích buněk a tyto buňky jsou náchylné k apoptotickým efektům na základě Fas-stimulace. Nagafuji et al,, Blood, 86: 883-889 (1995), Sáto et al,, Br J Haematol, 97: 356 (1997). Yamane et al., Eur J Haematol, 58:289 (1997). Kromě toho, množení krvetvorných výchozích buněk in vitro za přítomnosti cytokinů působí, jak se ukázalo, funkční zvýšení exprese Fas a v současné době převládá mínění, že Fas může in vivo hrát roli při homeostáze krvetvorby jako negativní regulátor. Takenaka et al., Blood, 88: 2871 (1996),

Stahnke et al., Exp. Hematol. 26: 844 (1998).

1. mFLINT a záření a chemoterapie

Vynálezci ukázali, že mFLINT zlepšují zotavení kostní dřeně zárodečných množivých buněk, které byly vystaveny • ·· · · ···· ·· ···· ·· · · · · • · · · · · · ··· «· · ·· ··· záření. Konkrétně byly ozařovány myši a buňky jeřích kostní dřeně byly vyjmuty a kultivovány in vitro za přítomnosti cytokinů IL-6 a CSF. Přidání mFLINTů do kultivačního prostředí dramaticky zvýšilo zotavení uvedených buněk kostní dřeně, zejména progenitorů erytroidních buněk, granulocytovýchmakrofágových buněk a erythroidních monocytových megakaryocytových buněk. Vynálezci také ukázali, že mFLINT zlepšuje přežití buněk kostní dřeně, které byly odebrány myši, která byla ošetřována 5-fluorouracilem (5-FU). Anti-FasL protilátka zvyšovala také přežití buněk, které byly odebrány od myši, která byla podrobena působení 5-FU.

Tento vynález proto zahrnuje použití mFLINTů jako radioprotektivních a/nebo chemoprotektivních prostředků. mFLINT je použitelný pro podporu in vitro množení a zrání výchozích zárodečných buněk kostní dřeně před autologní nebo heterologní transplantací, mFLINT je také použitelný pro podporu množení a zrání výchozích zárodečných buněk po ošetření pacienta ozářením nebo chemoterapií. V tomto směru se od podávání mFLINTů pacientovi očekává podpora množení a zrání výchozích buněk, když je tento pacient již terapeuticky ošetřen proti rakovině (chemo- nebo radio-terapií) . Od mFLINTů se také očekává, že podpoří množení a zrání výchozích buněk u pacientů léčených protirakovinnou terapií a myelosupresivním prostředkem, což porušuje obnovu výchozích zárodečných buněk při této terapii.

Jak bylo shora poznamenáno, cytokiny jsou používány, in vitro a in vivo, k podpoře množení erytroidních a myeloidních buněčných typů u pacientů, kteří se podrobili terapii rakoviny. Vynálezci prokázali, že mFLINT podporuje množení buněk, které jsou ošetřovány cytokiny. V souladu s tím, tento vynález předpokládá použití mFLINTů v kombinaci s jedním nebo • ·· · · ···· ·· ···· ·· · ··· • e ··· ··· ······ ·· · · · ··· více cytokiny, k namnožení výchozích zárodečných buněk kostní dřeně, in vitro a in vivo. Ke zlepšení zotavování těchto buněk z myelosuprese, která je důsledkem chemo- a radio-terapie, lze použít faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů (GMCSF) . Podle toho tento vynález předpokládá použití kombinaci mFLINTů a GM-CSF, aby se zotavování z myelosuprese ještě urychlilo.

Vynálezci také prokázali, že anti-FasL protilátka také zlepšila zotavování buněk kostní dřeně z následků léčení 5-FU. V souladu s tím, tento vynález zahrnuje použití anti-FasL k podpoře obnovy buněk kostní dřeně po chemo- nebo radioterapii. Takováto protilátka může použita in vitro k namnožení buněk kostní dřeně pro heterologní nebo autologní transplantaci. Anti-FasL protilátka také může být podávána in νϊνο^ s cílem zlepšit zotavení buněk z myelosuprese,- která je výsledkem chemoterapie radiační terapie a/nebo podávání myelosupresivních prostředků.

Systémické podávání mFLINTů by mohlo být pro léčení pacientů vhodné. Termín podávání mFLINTů s chemoterapií nebo ozařováním, pokud je v této přihlášce používán, zahrnuje všechny následující způsoby podávání mFLINTů: (1) předběžné podávání mFLINTů, po kterém následuje ozařování nebo chemoterapie; (2) simultánní podávání mFLINTů a aplikace chemické nebo radiační terapie; (3) chemoterapie nebo ozařování se provádí napřed, načež následuje podávání mFLINTů; (4) předběžné podávání mFLINTů, následované chemickou nebo radiační terapií, po které následuje podávání mFLINTů. Vynález zahrnuje použití mFLINTů jedním nebo více následujícími způsoby léčení.

2. Léčeni periferních cytopenií

Tento vynález také řeší léčení periferních cytopenií, které jsou spojeny s poruchami krvetvorby, jako je aplastická anémie a myelodysplastický syndrom. Bylo ukázáno, že apoptóza vyvolaná vazbou Fas/FasL, snižuje lymfopoiézu. Viz Yasutomo, et al. J. frnmvnol. 157: 1981 (1996). Ve výchozích zárodečných buňkách od pacientů s aplastickou anémií byla pozorována zvýšená exprese Fas. Viz Young, N.S., Eur. J. Hematol. 60 (supp.): 55(1996). Zvýšená exprese také byla pozorována u výchozích zárodečných buněk od pacientů, trpících myelodysplastickým syndromem.

Dále, Maria, et al. publikovali, že Fas je silně pozitivně regulována u mladých erytroblastů a je exprimována ve vysokých hladinách v průběhu závěrečné fáze zrání. Viz Blood 93:796 (1999), Maria, et al. také publikovali, že nezralé krvinky jsou závislé na EPO a exprimují funkční molekulu Fas. Za přítomnosti zralých erytroblastů, produkujících FasL, dochází u nezralých buněk k apoptóze, pokud jsou vystaveny vysokým hladinám EPO, Maria, et al. navrhují, že systém Fas/FasL v kombinaci s EPO přispívají k erythropoietické homeostáze.

Pokud se nevážeme na žádnou konkrétní teorii, snížení hematopoiézy a výsledné cytopenie mohou být přímým důsledkem apoptózy, která může být na druhé straně způsobena pozitivní regulací Fas a Fas ligandu. Jak je popsáno na jiné místě v tomto dokumentu, mFLINT inhibuje vazbu Fas/FasL, inhibuje apoptózu a mFLINT také podporuje růst a zrání krvetvorných výchozích buněk. Proto se očekává použití mFLINTů k potlačení poruch krvetvorby a apoptózy, což vede k odstranění jednoho nebo více příznaků, spojených s těmito poruchami. Kromě toho, jelikož nezralé krvetvorné buňky jsou náchylné k FasL-vyvolané • · • · · · • · +- za «3» o i*\ v''/-s +- s'· ·-> za -A za zJ ί λα 3 +- v*r> π z·» ·» t\ o + □ + ]z zaw /4 3 PzA ν' ZA T~S Z3 z>TTO TÁ iV/aIa cd / Gl jýxvtvcc ύ,ιψχΑί lqLKcíu uxxxxcucu v dii_y dii fc/fc/ krvp +- πη vta 4tr>Ví huri^lř J-VLjUvVXiijCii d UHN« J> f tnV o r\ za z-ό lx· a τ τ-a a.za τάζαζΑ άύτά τά 4

Ca j> o d d d d j\u v d / i-> d yvduvuixjedincům odstraní toto defektní zrání tím, že potlačí apoptóz

T, nezralých krvetvorných buněk, vyvolanou Fas

T<x rapi ___ ί-ΛΖ) 4 ΪΑ <-»3^j

J.N-. J XXX11XU f νχρί'νχυΐΐ yVJ.UVUÚÚlA

SYVW.áHjO.ť

ΛΛ/^ Ώΐτ.ηη i m mTT. ΤΚΤΦΛ παο-Ήι. 7^nÁmii

Jd d dd V <x_4.XXU.XLL XllX J_I J-iX X U jd d d X -X- d ^XX^XlllZ λ 4“ t.tza νΊτ» 3 j o za mn %/za „u v V-Lxý j dd uidlX za/*4 4 n r> 4 nob/>

g XXdXX vitro k ošetření buněk kostní dřeně, které

A 4 X 4.™ »ΤΠΤ ΤΧΪΦΛ jJUUÓX l_J.ni litr llllNIU gi.zA wo Jz 4- a ά íí va I o η + n -j ή va za wí.za z-i λ Arrvn -A a zA -i ta za A dd yan. uLdiioy xd+i c la. j x utnuccucmj jduxucx·

TGxSpiG mFLINTy ϊϊΐϋζθ byt xozšixenn o podávnni EPO 3. jiných.

QXdČldO11J.11/ lz4 / x-i rxXz b-3

v.za-4-3 τη rvi ]->z\ f7 i zaK V j yiiVXXCH

JNC^X^ pUUpVX UL j X 1.UOL CL/ USIÁJ XXCLilX Ki. VC L V C L iiý CU

Ta 3 a ta z-llz· Tzj στη ρτγ<<\ t4-za lz 4 τα ί τ o + ·? τηη Ί n -ΐ 4 «jzn* a 4r •d ctii^z Λ * d d x iiCuiťsZ f x d i, y j\ j. iiy j ς, xxliiJ ±y j r r yp i.

lf ΓνΓ'^^^ ν'τΑ Vf^¹ TnjphA-TT-rib EnnAl· 17“ o/-\n 1 oXn o +- 4 m τη.τη£ΐΛσ hol/A hj-v^^voxixj^xx v J d χ Ad í~, _i_ d χ χ >-<υ.ιχ\_ ji « v uxz uíwkau d uxul^ v χ x d -a. d x uujxc

-ifT τκτπ-ιΛ

Zicnixiilij c puuZiti iS-OiiLUXlidšti iurxiixi u ct jccíiixiu iidijd vxlc cy c.'dis.±iiy va y* z—. va.za s-4 w z-x νΊ a v>u λ + ia a z-J π ·Γ.ζ> v- z\ va za i —> a z-χ zx z-ι Ta X rv τντ r.a Ta a a a a Ta T-x a i n za Iz· j 5 p-L-X^ P'.JUM'JJ-U. J.UJH.U a. ^lJ^ÍG_CK^i3.L,i; L_<^OHI_XJ '/y^izvirun υυ...^κ u.

jedí /4 4 ta a 3*i • · ild U i

C J_ jd X d J-d J4 .a Izz s-< H 0\ vs-s 1» a rn 3 η íi Jz Λ -i z~\ piiVA-dVCnU-L jVW Jd

Ή Ζ'Ζ'ΤπΚ a ζί τ4~ a ta a y*t πα a

CXdlU-dddJ PdptNiXC d míra 1 -az~?3 ?on 1 οο+ΐ alziz o 3 z ta ./-5 ta am xu j x vlx j u^/x uu i—Ldi\.jy ujxjatxvxn.

O -(2^3 TA .a T-T-A +- ZA v» Ά ,y-> 4 ZA

-i· 'Cldild v CL ddl_a.£JXd _dJ^.d xti'

ITT ΤΜΦ KoVA. mi i 44 a Vm^zt+“ ta

ZA1 3 Τ 1 + CUCÁ Ί id d d _L. XI d n o <m/M xxd v d xt •AVO-ní 4 DzsIzjt/} . d J_ d£Z -L. -U · A- dJXXtd qn m □ 4 4 h ran cnl onl· ΑΤΓ3+· V πτω+· zrr\ y^r^Á mrAh ζλγ7τ/~»}ί Hi i n Viz -í oH 4 r m* +· .a V

L-XJ J- χ.«_χχχχ^^ζ _l_«^xx l_Vfc/ v xa S_ JX-L- V «fc, V S_/J_XXN_ « j <z 1 i k> Xz X C1 X X^UXXXJkJ J -X- XX d J- f Xd/k

O rr Ί” ’ζ' ^Λ z> lr + ia A τ rr Ia ,a/4 ·ζ~> *'rm, +“· «· -~> r-, z—· rr z·» r·) ζ-.-τχ> —s X — lz Λ γ-,/’λ z-\ rá z-x X -}ίχ A rr> T KTJI rzi o td LranoxcKLu. j x v lidCny íll LrauOQcnciLL^ a. udru^t ac do^xxx iil£ ixxrxx^ui/

ΑΑΑ-ίζ-Ί VA O z4L·^ TT ]/ΑπΆ -! 3A O AA O jzypr v Λνιιχϋΐςι vC •A a N 3a 4 m jtřunxiu nebe n .6 o 1 o <4,i i-4 4 a 4

X X d X -U X- d UA -L- d _L lz-i 1 1 4“ 4

Vc

4- i z4- / X J xs

Xnn b-3 v Xb^ >1 <-y cd kiny« t-x?dxl Spi dxxt d j 1 y

/4 4

TakAv.ahn /τοηΛττ.6 hornnin -5 zr παπ 7 4 ná ri-ri vHa/4an4 rx<i4“ řtohnvAb

J.dJKXZVdXd 'JdXXdVd. XdJ- d^-z _u s_ _J ^Zddt-J-Xd X.XXd £S j- U- VJfcJ-dddXXJ- £Zd«~J-d.»fcZxxjx-xx rr 1 ·σ 4T· X ·»-\ z-v z-, X -1 1ζ· ν» z> τ ννσ i ·τ»σ 1σ m yj 1 z- Arr vxaúLnuoLX nj-cvlixui υιχιιχνσ.ιιι*

Γ) nnhr.on.o nAA4 1ntnj.Ab -.l/trs 1 m -4 r»Ή 4- V,6 τί 4 n/MTiAA 4 τηΤΤ TXFTvj

X · NZdXXJ-dXXd XXX d _i_ _i_ NZ V J XzXi d JXd J- X X _l_ dX X XJUdXXJ- £S X/Xtld d -i- llixxiiixd

Jc dobře cncinO/ ze mnoho buňky -poškozujících teispii./ j3ko η Λ /3Ηλτ»α4-^καλ4 a a 4-/ Jd XI IXiltV X d J_ CA£Z _L d CA XV vaza i ί +- 4 ./-» avo νΆττ.όηι r-Kvii·²?

-djddd' LXJIX Cz Í-. d X d V Uil-L f ^ZddX iT.om/Ab Ί./* I 4 xvuxiyxii j-i. rxxxiií rakoviny, způsobuje poškození a apoptózu tak zvaných necílových okolních tkání. Termín necílová okolní tkáň, jak je používán v tomto dokumentu, je tkáň, která není nemocná, a která je poškozována farmakologicky, radiačně nebo terapiemi s pomocí různých zařízení. Tyto tkáně zahrnují, kromě jiného, žaludeční epitel (včetně epitelu v ústní dutině, jícnu, žaludku a střevním traktu), plicního epitelu, krevních buněk (lymfocytů, monocytů, T buněk, B buněk, buněk kostní dřeně, krvetvorných výchozích buněk, neutrofilů, eosinofilů, buněk prsu, krevních destiček), ledvinový epitel a vlasové váčky. Mnohé tyto tkáně jsou typické rychlým růstem a/nebo zvrhnutím jejich buněk.

Termín buňku poškozující terapie zahrnuje, mimo jiné chemoterapii (např. cisplatinem, doxorubicinem, mitomycinem C, kamptotecinem a fluoruracilem a jinými nukleosidovými analogy), terapeutické ozařování, laserové léčení a podávání inhalovaných toxinů (jako je bleomycin). Fyzikální manipulace, které jsou spojeny s terapiemi pomocí přístroje, jako je fyzikální odstranění blokády z koronární tepny, také může způsobit poškození necílové okolní tkáně. Tyto buňkupoškozující terapie jsou použitelné proto, že poškozují a zabíjejí nemocnou tkáň, jak bylo shora poznamenáno. Mají nežádoucí vedlejší účinek, který spočívá v poškození a vyvolání apoptózy necílové okolní tkáně.

Jak je diskutováno na jiném místě v tomto dokumentu, mFLINT blokuje interakce Fas/FasL. Bylo zde také prokázáno, že mFLINT inhibuje apoptózu vyvolanou FasL in vitro, a že mFLINT zvýšil přežití buněk kostní dřeně, které následovalo po terapeutickém ozařování a chemoterapii. Proto je předmětem tohoto vynálezu odstranit poškození necílových okolních tkání, které je způsobeno terapií, která poškozuje buňky.

• ·· ·» »·«* ···· · * · « » · · · ♦ · · 1000000 ·· 0 ··

Léčení rakoviny, jako je ozařování a chemoterapie, vyvolává apoptózu v buňkách střevního epitelu. Je známo, že mnohé chemoterapeutické prostředky působí tak, že indukují apoptózu. Viz např., Micheau, et al. J. Nati. Can. Inst. 89:783 (1997). Tato, apoptóza, kombinovaná s myelosupresí, která je vyvolána ozařováním a chemoterapií, představuje masivní příležitost pro infekce. V současné době nejsou účinné terapie, odstraňující poškození střevních funkcí, které je spojeno s chemoterapií a terapeutickým ozařováním. Jak bylo shora poznamenáno, léčení cytokiny se ukázalo být použitelné pro zlepšení zotavení z myelosuprese, zatímco cytokiny mohou mít za důsledek nežádoucí toxicitu.

Z uvedených důvodů je možno očekávat, že mFLINTy budou potlačovat poškození střevního epitelu, které je vyvoláno ozářením a/nebo chemoterapií. Aniž bychom se chtěli vázat na jakoukoliv teorii, očekáváme, že mFLINTy budou potlačovat toto poškození inhibici apoptózy a/nebo zánětu střevního epitelu.

Interakce Fas/FasL byly zjištěny při chronické gastritidě.

Bylo prokázáno, že exprese Fas a FasL se zvyšuje u buněk žaludečního epitelu jedinců, trpících chronickou gastritidou.

Viz Rudi, et al. , J. Clin. Invest. 102:1506 (1998). Rudi také uvádí, že buňky žaludečního epitelu infikované bakterií Helicobacter zvýšily hladiny FasL (ligand CD95) a Fas (CD95 receptor), a že apoptóza, vyvolaná bakterií Helicobacter, byla snížena blokováním FasL pomocí protilátky anti-APO-1. Z těchto důvodů lze očekávat, že mFLINT může být účinný při inhibici (i) gastritidy, které je vyvolaná mikroorganizmem Helicobacter a, jak bylo zmíněno dříve, (ii) buněk poškozených terapiemi, jako je chemoterapie a ozařování.

• ·· ·* ···· ·· · • · « · « * » * · · · • ···· · · * * * · · · · 9·· ··♦· ·· Φ ·«

Dále, pacienti léčení chemoterapií s použitím vysokých dávek (HD-CT) jsou ohroženi závažnými chorobami sliznice, které jsou charakteristické apoptózou a zánětem žaludečního epitelu. Wymenga, et al., Br. J. Cancer 76:1062 (1997) studovali mukositidy v ústní dutině u pacientů s rakovinou prsu, léčených pomocí HD-CT. u pacientů, léčených pomocí HD-CT vzrostla procenta viditelných epitelových buněk, která se objevovala v ústním výplachu, což naznačovalo odlupování povrchové vrstvy ústní sliznice. Také byla u HD-CT pacientů zjištěna vyšší procenta nezralých buněk ve sliznici.

Z terapie pomocí mFLINTů mohou mít zisk i jiné necílové okolní tkáně. Například apoptózu vyvolaná interakcí Fas/FasL byla zjištěna při bleomycinem vyvolané apoptóze a fibróze v plicním epitelu. Viz Hagimoto, et al. Am. J. Respir. cell.

Mol. Biol. 16:91 (1997). Tato studie ukazuje, že v alveolárních epitelových buňkách, léčených bleomycinem, byla Fas mRNA deregulována a FasL mRNA byla infiltruj ícími lymfocyty ovlivněna kladně. Tudíž přihlašovatelé očekávají, že mFLINTová terapie může potlačit poškození plicní tkáně, jako je epitel, pokud je poškození vyvoláno terapiemi, které

poškozují buňku.
E. Léčení	rakoviny pomocí mFLINT
Tito	vynálezci zjistili, že podávání	mFLINTů	myši
způsobuje	zmenšení objemu nádoru, že jsou produkovány,	pokud
jsou myším injekčně podány melanomové buňky.	Tento	účinek

mFLINTů může být zprostředkována vazbou mFLINT/FasL a následnou inhibici apoptózu T-buněk, vyvolanou FasL, což umožní imunitní odpovědi T-buňce dosáhnout zničení nádorové buňky. V tomto směru je známo, že FasL je exprimována v melanomech, lidských rakovinách tlustého střeva a konečníku, hepatocelulárních rakovinách, astrocytomech a rakovině plic. Viz 0’Connelí, et al. Immunology Today insert*, Chappell, et al. Cancer Immunol. Immunother. 47:65 (1998). Je také publikováno, že kultivované linie buněk tlustého střeva exprimuji FasL a mohou zabít T buňky in vitro vyvoláním apoptózy vlivem FasL, viz 0’Connell. Proto mohou melanomové nádory, uváděné v tomto dokumentu, mohou exprimovat FasL, spouštět FasL-vyvolanou smrt infiltrujících T-buněk, které exprimují Fas. Nicméně za zmenšování nádoru může také být odpovědný jiný mechanismus, který byl v tomto dokumentu zmíněn.

Na základě dosažených úspěchů vynálezců se zmenšováním objemu nádorů při aplikaci mFLINT, je očekáváno, že pomocí mFLINT mohou být také úspěšně léčeny jiné typy rakoviny. Tyto rakoviny zahrnují, mimo jiné, astrocytomy, rakovinu střeva, rakovinu jícnu, rakovinu plic, melanomy a hepatocelulární rakovinu. Jiné rakoviny, které se mohou léčit pomocí mFLINT, jsou rakovina močového měchýře a rakovina vaječníku.

F. Léčení nemocí autoimunity pomocí mFLINT

Jak pro diabetes typu I (závislý na insulinu), tak i typu II (nezávislý na insulinu) je charakteristická hyperglykémie. Termín hyperglykémie, je zde používán ve smyslu, který je v oboru dostatečně znám, a popisuje stav charakterizovaný hladinou glukózy v krvi, která je vyšší, než se u vyskytuje u normálního člověka. Normální lidské hladiny glukózy v krvi při hladovění jsou menší než 110 mg/dl. Viz The Expert Committee on the Diagnosis a Classification of Diabetes Mellitus, Diabetes Care, 21 (Suppl. 1), S5-S19 (1992).

• · • · · ·

Diabetes typu I, závislý na insulinu (IDDM), je chronická porucha autoimunity, při které dochází k destrukci pankreatických (insulin-produkujících) (3 buněk cestou mechanizmu FasL-Fas. Je pravděpodobné, že tato destruktivní cesta je aktivována zánětlivým procesem. Normální β buňky neexprimují Fas, ale Fas je exprimován v těchto buněk v průběhu insulitidy. Proto je pravděpodobné, že spojení lymfocytu s FasL k této lokální destrukci Fas+ buněk přispívá cestou vyvolanou interakce FasL-Fas. Odtud lze vyvodit rozšíření aplikací mFLINTů na antagonizaci této cesty, a tím na prevenci nebo léčení IDDM (cukrovky, závislé na inzulínu).

Roztroušená skleróza (MS) je degenerativní zánětlivá demyelinační choroba. Fas byla nalezena mezi oligodendrocyty, lokalizovanými poblíž okraje lézí a v přilehlé bílé hmotě při akutní i chronické MS, zatímco normální tkáň vykazuje málo Fas nebo žádnou Fas. Je pravděpodobné, že tato abnormální exprese Fas je vyvolána cytokiny, uvolněnými v průběhu zánětlivých procesů. Navíc buňky, exprimující FasL jsou lokalizovány ve stejných místech s Fas-exprimujícími apoptotickými oligodendrocyty, což naznačuje možnost uplatnění této cesty v

patologii	této nemoci. Lupus, jiná	porucha autoimunity,	se
také může	pomocí mFLINT léčit.
G. Léčení	osteoporózy pomocí mFLINT
Data	uvedená dále v příkladech	indikují, že mFLINT	je

použitelný při prevenci nebo léčení poruch, při kterých dochází k úbytku kostí, jako je osteoporóza. mFLINT se také dá použít k inhibici kostní resorpce. Tato data jsou konzistentní s daty, která ukazují přírodně se vyskytující vylučovaný člen nadskupiny TNFR, o kterém bylo nyní publikováno, že hraje roli v regulaci resorpce kostí, (Simonet et al. cell 89:309(1997) • · (byl nazván osteoprotegrin (OPG); Tsuda et al. Biochem. and Biophys. Res. Comm. 234:137 (1997) (nazván inhibiční faktor osteoklastogenéze (OCIF))), fungující v podstatě jako inhibitor diferenciace kost-resorbujících osteoklastů. V souladu s touto představou o mechanizmu působení uvedené látky, studie přímo spojuje Fas s apoptozou osteoblastů. Jilka et al., 1998, J. Bone & Minerál Res. 13:793-802; Kawakami et al., 1997, J. Bone & Minerál Res. 12:1637-46.

IV. TERAPEUTICKÉ PROSTŘEDKY NA BÁZI mFLINT

Kompozice na bázi mFLINT polypeptidu se formuluje a dávkuje v podobě, která se v souladu s dobrou farmaceutickou a lékařskou praxí, přičemž se bere v úvahu klinický stav příslušného pacienta (zejména vedlejší účinky léčení pomocí mFLINT polypeptidu samotného), místo podávání mFLINT polypeptidové kompozice, způsob podávání, rozvrh podávání a další faktory, známé praktikům.

Účinné množství polypeptidu vede ke statisticky signifikantní úpravě biologické aktivity zvoleného ligandů TNFR typu, například FasL nebo LIGHT. Biologická aktivita FasL zahrnuje mimo jiné apoptózu. Biologická aktivita LIGHT zahrnuje mimo jiné buněčnou proliferaci. LIGHT je 29 kDa protein, který je členem transmembránové nadskupiny TNF typu II, produkovaným aktivovanými T buňkami. Viz Mauři d.M., Immunity, 8:21-30, Leden 1998.

Dále je třeba uvést,že účinné množství může také být stanoveno podle míry prevence nebo podle míry potlačení nežádoucích stavů nebo příznaků choroby či poškození nebo chorob, které se mají léčit. Terapeuticky účinné množství mFLINT polypeptidu je pro účely tohoto dokumentu definováno • · • · • · · · podle takových hledisek. Mělo by být poznamenáno, že mFLINT je imunomodulátor, a že obecné pozorování takovéto látky odpovídá křivce závislosti odpovědi na dávce ve tvaru zvonu. Tento fenomén je dobře známý známo v oboru a je mezi zkušenými klinickými lékaři brán v úvahu při upravování terapeuticky účinné dávky mFLINTů.

Obecně, celkové farmaceuticky účinné množství polypeptidu mFLINT, které se podává parenterálně v jedné dávce, se pohybuje v rozsahu 1 μρ/kg/den až 10 mg/kg/den pacientovy tělesné hmotnosti, konkrétněji 2-8 mg/kg, výhodně 2-4 mg/kg, nejvýhodněji 2,2 mg/kg až 3,3 mg/kg a finálně 2,5 mg/kg. Nicméně, jak bylo shora poznamenáno, toto dávkování bude předmětem terapeutických úvah. Výhodně je dávka nejméně 0,01 mg/kg/den.

Pokud se podává průběžně, je polypeptid mFLINT obvykle podáván v dávce asi 0,1 gg/kg/hod. až asi 50 μg/kg/hod. , a to buď v 1-4 injekcích denně nebo kontinuálně podkožními infúzemi, například s použitím a miničerpadla. Lze také použít roztok pro intravenózní koš. Doba léčení i stav po vyléčení vyžaduje pozorování změn a určitý čas k zjištění projevů změny stavu a požadovaných účinků.

Farmaceutické prostředky, obsahující mFLINT podle vynálezu se mohou podávat řadou způsobů, mezi které patří, mimo jiné, orální, rektální, intrakraniální, parenterální, intracisternální, intravaginální, intraperitoneální, transdermální (jako pomocí prášků, mastí, transdermální náplasti), nádobky nebo jako orální nebo nasální spreje. Termínem farmaceuticky přijatelný nosič je míněna netoxická pevná látka, polopevné nebo kapalné plnivo, diluent, enkapsulační materiál nebo pomocný prostředek jakéhokoliv povrchové, kapky nebo

Λ Λ Λ Λ • ·

typu. Termín parenterální, jak je zde používán, znamená způsob podávání, který zahrnuje, mimo jiné, intravenózní, intramuskulární, intraperitoneální, intrasternální, subkutánní a intraartikulární injekce a infúze. Také mohou být použity implantáty obsahující mFLINT.

Polypeptid mFLINT se také výhodně podává prostřednictvím systémů s dlouhodobým uvolňováním účinné látky. Vhodné příklady kompozic s dlouhodobým uvolňováním účinné látky jsou semipermeabilní polymerní matrice ve formě tvarovaných výrobků, např. filmů nebo mikrotobolek. Mezi matrice pro dlouhodobé uvolňování účinné látky patří polylaktidy (U.S. Pat. 3 773 919, EP 58 481), kopolymery L-glutamové kyseliny a gamma-ethyl-L-glutamát (Sidman, U. et al., Biopolymers 22:547556 (1983)), póly(2-hydroxyethylmetakrylát) (R.Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 (1981), a R. Langer, Chem. Tech. 12:98-105 (1982)), ethylenvinylacetát (R. Langer et al., Id.) nebo kyselina poly-D-(-)-3-hydroxymáselná (EP 133,988). Kompozice obsahující polypeptid mFLINT s dlouhodobým uvolňováním také obsahuje liposomálně zachycené polypeptidy mFLINT. Liposomy obsahující polypeptidy mFLINT se připravují způsoby, které jsou samy o sobe obecně známé: DE 3 218 121; Epstein et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 77:40304034 (1980); EP 52 322; EP 36 676; EP 88 046; EDP 143 949; EP 142 641; Japonská patentová přihláška 83-118008; U.S. Patenty č. 4 485 045 a 4 544 545; a EP 102 324. Běžně jsou lipozomy malé (asi 200-800 Ángstromů), jednolamelárního typu, a jejich obsah lipidů je větší než asi 30 molárních procent cholesterolu, přičemž zvolené poměry se upraví pro optimální terapii polypeptidem TNFR.

• · · · • ·

Pro parenterální podávání se v jednom provedení může polypeptid mFLINT formulovat obecně míšením do požadovaného stupně čistoty, v jednotkové dávkové injekční formě (roztok, suspenze nebo emulze) s farmaceuticky přijatelným nosičem, t.j. s takovým nosičem, který je netoxický k příjemci v použitých dávkách a koncentracích a je kompatibilní s ostatními přísadami kompozice prostředku. Například, výhodně neobsahuje oxidační činidla ani jiné sloučeniny, které jsou známy jako poškozující polypeptidy.

Obecně, prostředky obsahující polypeptid mFLINT se připravují jednotným a důkladným smísením těchto látek s kapalnými nosiči nebo finálně dělenými pevnými nosiči nebo s oběma. V tomto případě, pokud je to nutné, tvaruje na požadovaný prostředek. Výhodně parenterální nosič, výhodněji jde o roztok, je nosičem který je izotonický s krví prij emce.

^příklady takovýchto nosičů (vehikul) jsou voda, slaný roztok, Ringerův roztok a roztok dextróza. Nevodnými vehikuly jsou takové nosiče jako stabilizované oleje a ethyloleát použitelné liposomy.

jako vehikula jsou také

Nosič vhodně obsahuje minoritní množství přísad jako jsou látky, které podporují isotoničnost a chemickou stabilitu roztoku. Takovéto materiály jsou netoxické k příjemcům v dávkách a koncentracích, které jsou používány, a patří mezi ně také pufry jako je fosforečnan,- citronan, jantaran, kyselina octová další kyseliny nebo antioxidanty jako je kyselina askorbová; polypeptidy s nízkou molekulovou hmotností (menší než asi deset zbytků), např., polyarginin nebo tripeptidy; proteiny, jako je sérový albumin, želatina nebo imunoglobuliny; hydrofilní polymery jako je polyvinylpyrrolidon; aminokyseliny, jako je glycin, glutamová xanicke jejich soli;

• · kyselina, aspartová kyselina nebo arginin; monosacharidy, disacharidy a další sacharidy včetně celulózy nebo jejích derivátů, glukóza, manóza nebo dextriny; chelatační prostředky jako je EDTA; sacharidové alkoholy jako je manitol nebo sorbitol; vyrovnávací ionty jako je sodík; a/nebo neiontové surfaktanty jako jsou polysorbitany, poloxamery nebo PEG.

Polypeptid mFLINT se obvykle s těmito vehikuly formuluje na koncentraci asi 0,1 mg/ml až 100 mg/ml, výhodně 1-10 mg/ml, při pH asi 3 až 8. Je třeba rozumět, že použití určitých následujících excipientů, nosičů nebo stabilizátorů dochází ke vzniku solí mFLINT polypeptidů.

Polypeptidy FLINT, které se mají používat pro terapeutické podávání, musí být sterilní. Sterilita je snadno dosažitelná filtrací přes sterilní filtrační membrány (např. 0,2 μτη membrány). Terapeutické prostředky s obsahem polypeptidů mFLINT se obecně umístí do kontejneru, který má sterilně přístupný otvor, například sáček nebo ampulka pro intravenózní roztoky, přičemž příslušná nádobka má zábranu propíchnutelnou injekční jehlou.

Polypeptidy FLINT se skladují v obvyklých jednotkách nebo vícedávkových kontejnerech, například v uzavřených ampulích nebo lahvičkách, jako vodné roztoky nebo jako lyofilizované kompozice, které se rekonstituují. Jako příklad lyofilizovaného prostředku lze uvést prostředek plněný do lOml lahviček, kde je 5 ml sterilního filtrovaného 1 % (hmot./obj.) vodného roztoku mFLINT polypeptidů, a výsledná směs je lyofilizovaná. Infúzní roztok se připravuje rekonstitucí lyofilizovaného mFLINT polypeptidů pomocí bakteriostatické vody pro injekce.

Vynález také řeší farmaceutické balení nebo soupravu, obsahující jeden nebo více kontejnerů, naplněných jednou nebo více složkami farmaceutických kompozic podle vynálezu. Ve spojení s takovým kontejnerem(ry) může být dodáván příbalový leták ve formě, která je předepsána v příslušném státě vládou pro danou výrobu a pro používání nebo obchod s léky nebo biologickými produkty, přičemž tento leták obsahuje s souhlas příslušného orgánu s výrobou, používáním nebo prodejem pro podávání lidem. Dále se polypeptidy podle vynálezu mohou použít ve spojení s jinými terapeutickými sloučeninami .

V. Způsoby výroby polypeptidů

Jedno provedení podle vynálezu představuje v podstatě čistý polypeptid, kódovaný genem mFLINT nebo samotný gen mFLINT.

Odborník v oboru rozpozná, že polypeptidy podle tohoto vynálezu se dají syntetizovat řadou různých způsobů, jako jsou chemické způsoby, které jsou v oboru dostatečně známé, včetně syntézy peptidů v pevné fázi nebo rekombinačních způsobů. Oba typy způsobů jsou popsány v U.S. Patentu 4 617 149.

Principy chemické syntézy polypeptidů v pevné fázi jsou dobře známy v oboru a lze je nalézt v obecně známých textech v této oblasti. Například, viz H. Dugas a C. Penney, BIOORGANIC CHEMISTRY (1981) Springer-Verlag, New York, 54-92. Například, peptidy se mohou syntetizovat metodikou v pevné fázi s použitím syntetizátoru peptidů Applied Biosystems 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA) a syntetické cykly dodává firma Applied Biosystems.

Polypeptidy podle vynálezu se také mohou vyrábět technologií, využívající rekombinační DNA a klonovaný gen pro FLINT. Rekombinační způsoby jsou výhodné tehdy, jestliže se požaduje vysoký výtěžek. Exprese klonovaného genu se může zajistit řadou vhodných hostitelských buněk, což je odborníkům v oboru dobře známo. Za tímto účelem se gen pro FLINT zavede do hostitelské buňky jakýmkoliv vhodným způsobem, známým odborníkům v oboru. Chromosomální integrace klonovaných genů je v rámci rozsahu vynálezu a je výhodné, aby se gen klonoval do vhodného extra-chromozomálně udržovaného expresního vektoru tak, aby kódující region genu pro FLINT byl operativně napojen na konstitutivní nebo indukovatelný promotor.

Základní stupně při rekombinační produkci polypeptidu FLINT jsou

a) konstrukce a přírodní, syntetické nebo semisyntetické DNA, kódující polypeptid FLINT;

b) Integraci uvedené DNA do expresního vektoru způsobem, který je vhodný pro expresi polypeptidu FLINT, a to buď samotné nebo ve formě fúzního polypeptidu;

c) transformace nebo jiné zavedení uvedeného vektoru do vhodné eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky, čímž vznikne rekombinační hostitalská buňka;

d) kultivace uvedených rekombinačních hostitelských buněk takovým způsobem, aby exprimovaly polypeptid FLINT; a

e) oddělení v podstatě vyčištěného polypeptidu FLINT jakýmkoliv vhodným způsobem, který je odborníkovi v oboru známý.

• · » · · · · ······· «· · ··

1. Exprimace rekombinačního polypeptidu FLINT v prokaryotických a eukaryotických hostitelských buňkách

Pro výrobu rekombinačního polypeptidu FLINT dají použít prokaryota. Například kmen 294 Escherichia coli K12 (ATCC č. 31446) je konkrétně k prokaryotické expresi cizích polypeptidu použitelný. Pro klonování a expresi rekombinačních polypeptidu podle vynálezu se také mohou jako hostitelské buňky použít jiné kmeny E. coli, bacili jako je Bacillus subtilis, enterobakteriaceae jako je Salmonella typhimurium nebo Serratia marcescans, různé druhy Pseudomonas a jiné bakterie jako jsou Streptomyces,.

Promotorovou sekvencí, vhodnou pro řízení exprese genů v prokaryotech jsou například β-laktamáza [např. vektor pGX2907, ATCC 39344, obsahující replikon a gen β-laktamázy], laktózové systémy [Chang et al., Nátuře (London), !75:615 (1978); Goeddel et al., Nátuře (London), 281:544 (1979)], alkalická fosfatáza a tryptofanový (trp) promotorový systém [vektor pATHI (ATCC 37695)]. Tyto systémy lze navrhnout k dosažení exprese otevřeného čtecího rámu jako trpE fúzního polypeptidu, při řízení trp promotorem. Také jsou použitelné hybridní promotory, jako je tac promotor (izolovatelný z plasmidu pDR540, ATCC-37282). Napojení na DNA, kódující polypeptid podle vynálezu, lze dosáhnout i dalšími bakteriálními promotory, jejichž nukleotidové sekvence jsou obecně známy, přičemž se pro získání požadovaných restrikčních míst používá linkerů nebo adaptérů. Promotory pro použití v bakteriálních systémech také obsahují a Shine-Dalgarnovu sekvenci, operativně napojenou na DNA, kódující požadované polypeptidy. Tyto příklady jsou spíše uváděny pro ilustrativní účely než pro účely omezující.

• fc

Polypeptidy podle vynálezu mohou být syntetizovány buď přímou expresí nebo jako spojené polypeptidy, obsahující polypeptid, o jehož výrobu jde, jako translační část řetězce s jiným polypeptidem nebo peptidem, který může být enzymatickým nebo chemickým štěpením odstraněn. Při výrobě některých peptidů v rekombinačních systémech je často pozorováno, že exprese ve formě spojeného polypeptidu prodlužuje životnost, zvyšuje výtěžek požadovaného peptidu nebo umožňuje běžnými prostředky polypeptid vyčistit. To je zejména relevantní tehdy, když se exprimace savčích polypeptidů provádí v prokaryotických hostitelích. Je známo mnoho peptidáz (např. enterokináza a trombin) které štěpí polypeptid na specifických místech nebo digestují peptidy od amino- nebo karboxyzakončení (např. deaminopeptidáza) peptidového řetězce. Dále, určité chemikálie (např. bromkyan) štěpí polypeptidový řetězec na specifických místech. Odborník v oboru pozná, že jsou nutné modifikace pro aminokyselinové sekvence (a syntetické nebo semi-syntetické kódující sekvence se používají v případě, že jde o výrobu rekombinačními prostředky) pro vpravení místněspecifických štěpných míst. Například, viz P. Carter, Site Specific Proteolysis of Fusion Polypeptides, Chapter 13, v publikaci PROTEIN ČIŠTĚNÍ: FROM MOLECULAR MECHANISMS TO LARGE SCALE PROCESSES, American Chemical Society, Washington, D.C. (1990).

Kromě prokaryot lze použít řady expresních systémů obojživelníků, jako jsou žabí vajíčka a systémů savčích buněk. Volba konkrétní hostitelské buňky záleží do určité míry na konkrétním expresním vektoru, který je použit. Příklady savčích hostitelských buněk, které jsou vhodné pro použití podle tohoto vynálezu jsou HepG-2 (ATCC HB 8065), CV-1 (ATCC

CCL 70), LC-MK2 (ATCC CCL 7,1), 3T3 (ATCC CCL 92), CHO-K1 • » • · · * · * ' ···«··· ·· » *· (ATCC CCL 61), HeLa (ATCC CCL 2), RPMI8226 (ATCC CCL 155), H4IIEC3 (ATCC CCL 1600), C127I (ATCC CCL 1616), HS-Sultan (ATCC CCL 1484) a BHK-21 (ATCC CCL 10).

Pro transformaci savčích hostitelských buněk je vhodná řada vektorů. Například vektory typu pSV2 obsahují segmenty genomu opičího viru 40 (SV40), požadované pro transkripci a polyadenylaci. Již byl konstruován velký počet plasmidů vektorů typu pSV2, jako je pSV2-gpt, pSV2-neo, pSV2-dhfr, pSV2-hyg, a pSV2-£-globin, ve kterých SV40 promotor řídí transkripci vloženého genu. Tyto vektory jsou dobře dostupné ze zdroje americké sbírky mikroorganismů American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852 nebo od národního centra National Center for Agricultural Utilization Research, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604-39999.

Promotory, vhodné pro expresi v savčích buňkách, včetně SV40 pomalého promotoru, promotory z eukaryotických genů, jako je například estrogeninducibilní gen kuřecího vaječného albuminu, interferonové geny, glukokortikoidy-indukovatelný tyrosinový aminotransferázový gen, promotor genu thymidinkinázy a promotory genů rychlých a pomalých adenovirů.

Plasmid pRSVcat (ATCC 37152) obsahuje dlouhé terminální opakující se části viru Rousova sarkomu, což je virus, známý tím, že infikuje kuřecí a jiné hostitelské buňky. Tento dlouhý opakující se konec obsahuje promotor, který je vhodný pro použití ve vektorech podle vynálezu. H. Gorman et al., Proč. Nat. Acad. Sci. (USA), 79, 6777 (1982). Plasmid pMSVi (NRRL B15929) obsahuje dlouhé opakující se konce viru Murin Sarkomu, což je virus známý tím, že infikuje myší a jiné hostitelské buňky. Myší metalothioninový promotor byl také již • · · · · charakterizován jako vhodný pro použití v eukaryotické hostitelské buňce a je také vhodný pro použití pro účely tohoto vynálezu. Tento promotor je přítomen v plasmidu pdBPVMMTneo (ATCC 37224), který může sloužit jako výchozí látka pro konstrukci dalších plasmidů podle vynálezu.

Transfekce savčích buněk s vektory se může provádět řadou známých postupů včetně, mimo jiné, protoplastové fúze, společným srážením s fosforečnanem vápenatým, elektroforézou a podobně. Viz např. Maniatis et al., citovaní shora.

Některé viry také vyrábějí vhodné vektory. Příklady jsou adenoviry, adeno-asociované viry, virus vaccinia, viry herpes, baculoviry, virus sarkomu, jak je popsán v U.S. Patentu 4 775 624, který je zde vložen do popisu formou odkazu. Například baculovirus pFastBac-1 (GIBCO/BRL) se může použít k infekci vhodné hostitelské buňky, jako je SF9, za účelem produkce rekombinačního proteinu.

Eukaryotické mikroorganismy jako jsou kvasinky a jiné houby, jsou také vhodnými hostitelskými buňkami. Kvasinka Saccharomyces cerevisiae. je. výhodným eukaryotickým mikroorganismem. Jiné kvasinky jako je Kluyveromyces lactis a Pichia pastoris jsou také vhodné. Pro expresi v Saccharomyces, se může například použít plasmid YRp7 (ATCC-4QQ53),. Viz, např, L. Stinchcomb et al., Nátuře, 282, 39 (1979); J. Kingsman et al,, Gen, 7, 141 {1979); S. Tschemper et al,. Gen, IQ, 157 (1980) . Plasmid YP,p7 obsahuje TRPÍ gen, který poskytuje volitelný markér pro použití v trpí auxotrofním mutantovi.

Čištění rekombinačně produkovaného FLINT polypeptidů • · · pro uplatnění exprese Například, jestliže se

Expresní vektor, nesoucí klonovaný gen FLINT, se transformuje nebo transfektuje do vhodné hostitelské buňky pomocí standardních způsobů. Buňky, které obsahují vektor, se namnoží za podmínek, vhodných rekombinačního FLINT polypeptidu.

podaří rekombinační gen umístit tak, že je řízen indujkovatelným promotorem, bude součástí vhodných růstových podmínek inkorporace vhodného induktoru. Rekombinačně produkovaný polypeptid se může čistit od buněčných extraktů transformovaných buněk jakýmkoliv vhodným způsobem.

Ve výhodném provedení se polypeptid čistí tak, že FLINT gen se modifikuje na 5’ zakončení, aby se mohlo zavést několik histidinových zbytků na amino-zakončení FLINT polypeptidu. Tento histidinový přívěsek umožní čištění polypeptidu v jediném stupni způsobem, který je publikován jako afinitní chromatografie imobilizovaných kovových iontů (immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC)), popsaná v U.S. Patentu 4 569 794, který je zde včleněn do popisu formou odkazu. Tento způsob čištění IMAC umožňuje rychlou izolaci čistého rekombinačního FLINT polypeptidu z surového extraktu buněk, které exprimují v podstatě výchozího modifikovaný rekombinační polypeptid, jak je popsáno shora

Jiná provedení podle vynálezu zahrnují isolované nukleové kyseliny, které kódují podle obr 1, 2, 3 a 4. Jakákoliv z těchto nukleových kyselin může být získána chemickou syntézou. Syntéza nukleových kyselin je v oboru dobře známá. Viz, např., E.L. Brown, R. Belagaje, M.J. Ryan, a H.G. Khorana, Způsobů v Enzymology, 68:109-151 (1979). Fragmenty DNA sekvence, odpovídající FLINT nebo mFLINT genu se mohou generovat s použitím obvyklého zařízení pro syntézu DNA, jako je syntetizátor Model 380A nebo 380B DNA firmy Applied

Biosystems, lne. (850 Lincoln Center Drive, Foster City, CA 94404), s použitím fosforamiditové chemie a pak se tyto fragmenty ligují tak, aby se rekonstituoval celý gen. Alternativně se k syntéze nukleových kyselin, používaných v tomto vynálezu, může použít fosfotriesterové chemie. Viz, například, Gait, M.J., ed. OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, A PRACTICAL APPROACH (1984).

Při alternativní metodice, zejména PCR, mohou být DNA sekvence, které jsou zde popsány, například obsahující sekvenci podle obrázku 1 vyrobeny z celé řady výchozích látek. Například se může vyjít z cDNA preparátu (viz. knihovna cDNA) odvozených z tkáně, která exprimuje gen pro FLINT, dají se připravit vhodné oligonukleotidové priméry, komplementární k sekvenci obrázku 1 nebo k jakémukoliv jejímu subregionu, metodou popsanou v U.S. Patentu 4 889 818. Jiné vhodné postupy pro PCR jsou uvedeny v knize PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHOD AND APPLICATIONS, Ed. Michael A. Innis et al., Academie Press, lne. (1990).

Ribonukleové kyseliny podle vynálezu se dají připravit přes polynukleotidy syntetickou metodou, diskutovanou shora, nebo se dají připravit enzymaticky, například použitím RNA polymerázy k transkripci FLINT DNA šablona. Nejvýhodnější systémy pro přípravu ribonukleových kyselin podle vynálezu využívají RNA polymerázu z bakteriofága T7 nebo bakteriofága SP6. Tyto RNA polymerázy jsou vysoce specifické a aby se mohly transkribovat, vyžadují inserci bakteriofágově-specifické sekvence na 5’ zakončení. Viz Maniatis et al., viz shora. Tento vynález také poskytuje nukleové kyseliny, RNA nebo DNA, které jsou komplementární k sekvencím na obrázcích 1-4.

2. Vektory

Další aspekt podle vynálezu se týká vektorů a expresních vektorů, obsahující nukleové kyseliny podle vynálezu, klonujících rekombinační DNA.

Odborník v oboru rozumí, že volba nejvhodnějšího klonovacího vektoru nebo expresního vektoru závisí na řadě faktorů včetně přístupnosti míst restrikčních enzymů, typu hostitelské buňky do které je vektor transfektován nebo transformován, cíle transfekce nebo transformace (napři stabilní transformace jako extrachromozomální prvek, nebo integrace do hostitelova chromosomu), přítomnosti nebo absenci snadno testovatelných nebo volitelných markérů (např. antibiotická rezistence a metabolických markérů jednoho typu a jiné), a počtu kopií genu, který je od hostitelské buňky požadován.

Vektory vhodné k nesení nukleových kyselin podle vynálezu zahrnují RNA viry, DNA viry, lytické bakteriofágy, lyzogenní bakteriofágy, stabilní bakteriofágy, plasmidy, viroidy a podobně. Nejvýhodnějšími vektory jsou plasmidy.

Pokud se připravuje expresní vektor, odborník v oboru rozumí, že existují mnohé proměnné, které je třeba vzít v úvahu, například zda použít konstitutivní nebo indukovatelný promotor. Praktik také rozumí, že množství nukleové kyseliny nebo polypeptidu, které se má vyrábět, diktuje do značné míry volbu expresního systému. Co se týče promotorových sekvencí, indukovatelné promotory jsou výhodné, protože umožňují vysokou hladinu, regulovatelné exprese operativně připojeného genu. Odborník v oboru rozpozná řadu vhodných promotorů, které odpovídají za řadu indukčních činitelů, například zdroj uhlíku, kovové ionty a teplo. Dalšími relevantními fakty, které se týkají expresního vektoru, jsou, zda jsou obsaženy sekvence pro řízení lokalizace rekombinačního polypeptidu. Například sekvence, kódující signální peptid, předcházející kódujícímu regionu v genu je použitelná pro řízení extracelulární export získávaného polypeptidu.

Tento rekombinační polypeptidy, konstrukce exprimovat vynález také poskytuje způsob hostitelské buňky, schopné obsahující sekvence podle obrázků 1-4. Tento způsob zahrnuje transformaci nebo jiné vpravení vektoru rekombinační DNA, zahrnující isolované DNA sekvence, jak jsou popsány v kterémkoliv z obrázků 1 až 4, do hostitelské buňky.

Výhodnou hostitelskou buňkou je každá eukaryotická buňka, která může ovlivňovat vysokou hladinu exprese exogenně vpraveného genu nebo polypeptidu, a která inkorporuje uvedený polypeptid do své membránové struktury. Vektory pro expresi jsou takové, které obsahují jakoukoliv sekvenci podle obrázků 1-4. Transformovaná hostitelská buňka může být kultivována za podmínek, které jsou dobře známy odborníkovi v oboru, jako jsou takové, za kterých jsou exprimovány FLINT nebo mFLINT, čímž se produkuje rekombinační FLINT nebo mFLINT polypeptid v rekombinační buňce hostitele.

V následujících příkladech se tento vynález úplněji popisuje. Odborník v oboru rozpozná, že konkrétní prostředky, zařízení a postupy, které jsou popsány, představují toliko ilustraci a nejsou míněny tak, jako by měly tento vynález jakýmkoliv způsobem omezovat.

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD 1

RT-PCR zesílení FLINT genu z mRNA

A FLINT gen se izoluje reverzní transkriptézou PCR (RT-PCR) s použitím obvyklých postupů. Celá RNA z tkáně, která exprimuje gen FLINT, například z plic, se připraví s použitím standardních způsobů. Syntéza prvního vlákna FLINT cDNA se dá dosáhnout s použitím komerčně dostupného kitu (SuperScript™ System; Life Technologies) pomocí PCR ve spojení se specifickými priméry, řízenými na jakýkoliv vhodný region podle obrázků 1-4.

Zesílení se provádí tak, že se k prvními vláknu cDNA (sušenému pod vakuem), přidá: 8 μΐ 10X syntézního pufru (200 mM Tris-HCl, pH 8,4; 500 mM KCl, 25 mM MgCl₂, 1 μσ/μΐ BSA); 68 μΐ destilované vody; 1 μΐ každého z 10 μΜ roztoků jednotlivých primérů; a 1 μΐ Taq DNA polymerázy (2 až 5 U/μΙ). Reakční směs se zahřívá na 94 °C pod obu 5 minut, aby se denaturoval RNA/cDNA hybrid. Pak se provede 15 až 30 cyklů PCR zesílení s použitím jakéhokoliv vhodného zařízení pro cyklické zahřívání. Zesílený vzorek může být analyzován agarózovým gelem elektroforézou, při čemž se zkontroluje vhodná velikost fragmentu.

PŘÍKLAD 2

Výroba vektoru pro expresi FLINT v hostitelské buňce

Expresní vektor, vhodný pro expresi FLINT nebo jeho fragmentu v řadě prokaryotických hostitelských buněk, jako je E. coli, se vyrobí snadno. Vektor obsahuje vzorec replikace (Ori), gen rezistence proti ampicilinu (Amp), použitelný pro selekci buněk, který vektor vpravil následující transformační procedurou, a dále obsahuje T7 promotor a T7 koncové sekvence v operativním napojení na FLINT-kódující region. Plasmid pETllA (získaný od firmy Novogen, Madison WI) je vhodný rodičovský plasmid. pETHA je linearizován restrikcí endonukleázami Ndel a BamHI. Linearizovaná pETllA se liguje do DNA fragmentu, nesoucího Ndel a BamHI lepivé konce a obsahujícího kódující region genu FLINT jak je uveden na obrázcích 1-4.

FLINT-gen, který byl v této konstrukci použit, může být mírně upraven na 5’ zakončení (amino-zakončení kódovaného polypeptidů) za účelem zjednodušení čištění kódovaného polypeptidového produktu. K tomuto účelu se po ATG startovním kodonu insertuje oligonukleotid, kódující zbytky. Umístění histidinových zbytků do kódovaného polypeptidů slouží k umožnění polypeptide čištění (IMAC).

histidinové amino-zakončení j ednostupňového

PŘÍKLAD 3

Rekombinační exprese a čištění FLINT Polypeptidů

Expresní vektor, který nese otevřený čtecí rám (ORF), kódující FLINT nebo jeho fragment, a jehož ORF je operativně napojeno na expresní promotor, se transformuje do E. coli BL21 (DE3)(hsdSgalAcIts857índlSam7nin51acUV5T7-gen 1) s použitím standardních způsobů. Transformanty, vybrané podle rezistence na ampicilin, se vyberou s použitím namátkového testování na přítomnost vektoru pomocí agarózové gelové elektroforézy použitím rychlých plasmidových preparátů. Kolonie, které obsahují tento vektor, jsou ponechány růst v živné půdě L a polypeptidový produkt zakódovaný vektorem řízeným ORF, se čistí afinitní chromatografií s imobilizovaným kovovým iontem (IMAC), v podstatě jak je popsáno v US Patentu 4 569 794.

Stručně lze dále uvést, že kolona pro IMAC byla připravena následovně. Kovuprostá chelatační pryskyřice (např. Sepharose 6B IDA, Pharmacia), se promyje v destilované vodě, aby se odstranila ochranná substance a spojí se s iontem vhodného kovu [např. Ni(II), Co(II) nebo Cu(II)] přidáním 50 mM vodného roztoku chloridu nebo síranu příslušného kovu, až je asi 75 % volného prostoru mezi zrny v koloně nasyceno barevným iontem kovu. Kolona se pak připraví k získání surového buněčného extraktu, obsahujícího rekombinační polypeptidový produkt.

Po odstranění nenavázaných polypeptidů a jiných materiálů promytím kolony vhodným pufrem o pH 7,5, se navázaný polypeptid vymyje jakýmkoliv vhodným pufrem při pH 4,3, nebo výhodně pufrem s obsahem imidazolu při pH 7,5.

PŘÍKLAD 4

Distribuce FLINT mRNA v tkáních

Přítomnost FLINT mRNA v řadě lidských tkání byl analyzován analýzou Northern. Úplná RNA z různých tkání nebo kultivovaných buněk byla izolována standardním guanidin chlorid/fenol - extrakčním způsobem, a poly-A⁺ RNA byla izolována s použitím oligo(dT)-celulózy typu 7 (Pharmacia). Elektroforéza RNA vzorků byla prováděna ve formaldehydu s následným přenesením kapilárou na nylonové membrány • · ·· ·«·· · · • · · » · · · · • · · · · ·

Zeta-Probe™ (Bio-Rad, Hercules, Calif.). Obrázek 1 představuje použitou šablonu pro generování sond s použitím soupravy MultiPrime™ random priming kit (Amersham, Axlington Heights, 111.). Účinnost vybarvovací reakce byla přibližně 4 x 1O¹⁰ cpm, vpravených na 1 pg šablony. Hybridizační pufr obsahoval· 0,5 M fosforečnanu sodného, 7 % SDS (hmot. /obj.), 1 % BSA (hmot./obj.) , a 1 mM EDTA. Prehybridizace byla prováděna v hybridizačním pufru při 65 °C po dobu 2 h, byla přidána ³²P-značená sonda a v inkubaci se pokračovalo přes noc. Filtry byly promyty pufru A (40 mM fosforečnan sodný pH 7,2, 5% SDS [hmot./obj.], 0,5 % BSA [hmot./obj, a 1 mM EDTA) při 65 °C po dobu 1 hodiny, a pak v pufru B (40 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 1 % SDS [hmot./obj.] , a 1 mM EDTA) při 65°C po dobu 20 minut. Filtry byly sušeny na vzduchu a vystaveny filmu Kodak X-OMAT AR při -80° C s intenzifikačním stínítkem.

Výsledky ukázaly, že FLINT mRNA byla v mnoha tkáních přítomna, včetně tkáně žaludku, míchy, lymfatických uzlin, průdušnice, sleziny, střeva a plic.

PŘÍKLAD 5

Produkce protilátky polypeptidu

V podstatě čistý polypeptid nebo jeho fragment se izoluje z transfektovaných nebo transformovaných buněk s použitím kteréhokoliv ze způsobů, dobře známých v oboru, nebo způsobem specificky zde popsaným. Koncentrace polypeptidu ve finálním přípravku se upraví, například filtrací přes filtrační zařízení Amicon, tak, aby koncentrace byla asi 1 až 5 gg/ml. Monoklonální nebo polyklonální protilátka se může připravit následovně.

• · · · ··»· ·* · ·· ·· · · · · · • · · · · · · ····· ··· · • · · · · · · ··· · ·· · ·· ···

Monoklonální protilátka se může připravit z murinových hybridomů podle způsobu, který popsali Kohler a Milstein [Nátuře, 256, 495, 1975), nebo modifikovaným způsobem. Stručně, myš se opakovaně, v období několika týdnů, inokuluje několika mikrogramy polypeptidů nebo jeho fragmentu nebo jeho fúzního peptidu. Myš se pak usmrtí a protilátku produkující buňky sleziny se izolují. Slezinné buňky se kontaktují za přítomnosti polyethylenglykolů s buňkami myšího myelomu. Takto spojené buňky produkují protilátku, která se identifikuje vhodným imunotestem, například ELISA, jak je popsán v publikaci E. Engvall, Meth. Enzymol., 70, 419, 1980.

Polyklonální antisérum se může připravit známými způsoby, jak jsou popsány například v publikaci J. Vaitukaitis et.al., Clin. Endocirnol. Metab. 33, 988 (1971), což umožňuje imunizaci vhodných zvířat polypeptidy, jejich fragmenty nebo jejich fúzními polypeptidy, které jsou zde popsány. Malé dávky (např., nanogramová množství) antigenu, podávané na více intradermálních místech, se ukazují být nejspolehlivějším způsobem.

PŘÍKLAD 6

Konstrukce savčího FLINT-Flag expresního vektoru

Aby se dosáhlo potvrzení exprese FLINT (bez použití protilátek), byl konstruován bicistronický expresní vektor (pIGl-FLINTF) insercí vnitřního ribosomového vstupního místa za podpory zeleného fluorescenčního polypeptidů (IRES/eGFP)

PCR fragmentu do savčího expresního vektoru pGTD (Gerlitz, B. et al., 1993, Biochemical Journal 295:131). Tento nový vektor, označený pIGl, obsahuje následující charakteristické znaky sekvence: Ela-odpovídající GBMT promotor (D. T. Berg et al., ♦ · ·* • · * · · · «·»·

1993 BioTechniques 14:972; D.T. Berg et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:5485); a unikátní Bell cDNA klonovací místo; IRES sekvenci viru encefalomyokarditidy s (EMCV); eGFP (Clontech) kódující sekvenci (Cormack, et al., 1996 Gen 173:33); SV40 malý t antigen spojovací místo/polyadenylační sekvence; SV40 rychlý promotor a replikační zdroj; murindihydrofolátreduktázovou (dhfr) kódující sekvenci; a pBR322 markér ampicilinové rezistence/replikační zdroj. Výsledný protein měl Flag sekvenci připojenou k C-terminálnímu konci, poskytující: [FLINT]-DYKDDDDK.

Podle lidské FLINT sekvence byly syntetizovány následující priméry:

5'-TAGGGCTGATCAAGGATGGGCTTCTGGACTTGGGCGGCCCCTCCGCAGGCGGACCGGGG-3'; a

5’-AGGGGGGCGGCCGCTGATCATCACTTGTCGTCGTCGTCCTTGTAGTCGTGCACAGGGAGGAAGCGC-3’.

Druhá z těchto sekvencí reverzního priméru obsahuje epitopové sekvence Flag (posice 24-47, dvojitě podtrženo) (Micele, R.M. et al., 1994 J. Immunol. Methods 167:279) . Tyto priméry byly pak použity k PCR zesílení FLINT cDNA. Výsledný 1,3 Kb PCR produkt pak byl digestován s Bell (restrikční místa vložena do primérů jsou na horním obrázku podtržena) a ligován do unikátního Bell místa pIGl, čímž byl získán plasmid pIGlFLINTF. Orientace lidské FLINT cDNA nukleotidové sekvence byly potvrzeny restrikční digescí a dvouvláknovým sekvencováním insertu.

• 9 « * • « • C • · • r * ···* ·· ····

PŘÍKLAD 7

Konstrukce savčího FLINT-non-Flag expresního vektoru

Za účelem získání non-Flag expresního vektoru (pIGl-FLINT) byla 24-členná DNA sekvence kódující osm aminokyselin FLAG epitopu z pIGI-FLINTF konstrukce odstraněna s použitím soupravy Quick Change mutagenesis kit (Stratagene). 35členný primér a jeho komplement s identitou do 19ti členů sekvence lemující FLAG sekvenci byl pak syntetizován a použit pro PCR zesílení s použitím pIGI-FLINTF plasmidu jako šablony. PCR reakční směs byla digestována pomocí DpnI restrikční endonukleázy, aby se eliminovala rodičovská DNA, a získaný PCR produkt byl transformován do Epikurejské XLI-modři buněk E. coli. Bylo vybráno šestnáct transformantů, rezistentních na ampicilin a plasmid DNA byl analyzován restrikční digescí. Deset ze 16 poskytlo výsledky kompatibilní s vypuštěním 24členné sekvence. Přesné odstranění 24členné sekvence bylo potvrzeno DNA sekvencováním pIGl-FLINT. Nukleotidová sekvence

FLINT v tomto plasmid je zobrazena na	obrázku	1.
PŘÍKLAD 8
Izolace vysoce-produkujícího FLINT transfektantů	klonu	z	AVI2 RGT18
Rekombinační plasmid, nesoucí	FLINT	gen	(pIGl-FLINT)

kóduje rezistenci vůči metotrexátu. Dále, konstrukce obsahuje gen, kódující fluorescenční polypeptid, GFP, se stejným transkriptem a bezprostředně 3' na FLINT gen. Jelikož vysoká exprese GFP vyžaduje vysoké hladiny exprese FLINT-GFP mRNA, mají silně fluorescenční klony větší pravděpodobnost produkce vysokých hladin FLINT. pIGl-FLINT a pIGI-FLINTF byly použity k transfekci buněk AV12 RGT18. Buňky rezistentní na 250nM metotrexát byly vybrány a shromážděny. Spojená kultura rezistentních klonů byla dělení buněk pomocí fluorescence (FACS) a buňky, která mají fluorescenční hodnoty spadající mezi horních 5 % populace byly zařazeny do nové skupiny jako jednotlivé buňky. Vysokofluorescenční skupiny byly podrobeny třem následným třídícím cyklům. Výběrové skupiny a individuální klony z druhého a třetího cykly byly analyzovány na produkci FLINT metodou SDS-PAGE. Spojené skupiny nebo klony, exprimující FLINT na nejvyšší úrovni, posouzené podle Coomassie vybarvování, byly použity k namnožení a vyčištění FLINT. Aminokyselinová sekvence zralého FLINT proteinu, která byla produkována s použitím tohoto plasmidu je zobrazena na obrázku 3, nazvaného mFLINT.

PŘÍKLAD 9

Čištění mFLINT polypeptidu ve velkém měřítku

Produkce mFLINTů ve velkém byla prováděna nejprve namnožením stabilního klonu pIGl-FLINT-obsahujícího buňky AV12 RGT 18 v několika 10ti litrových nádobách. Po dosažení homogenity byly buňky dále inkubovány 2-3 další dny, aby se vyloučilo maximum množství FLINT do prostředí. Prostředí obsahující mFLINT bylo upraveno na 0,1 % CHAPS a koncentrováno v tangenciálním filtračním systému Amicon ProFlux M12 na 350 ml. Zahuštěná směs byla odstředěna při 19 000 ot./min. (43 000 x g) po dobu 15 minut a nechala se projít kolonou SP-SPW TSK-GEL (21,5 mm x 15 cm; TosoHaas) při průtoku 8 ml/min. Kolona byla promyta pufrem A(20 mM MOPS, 0,1 % CHAPS, pH = 6,5), dokud se absorbance (280 nm) nevrátila na původní hodnotu, navázané polypeptidy byly vymyty s lineárním gradientem od 0,1 M do 0,3 M NaCl (v pufru A) s vyvíjením po dobu 85 minut. Frakce obsahující mFLINT byly spojeny a čištěny na koloně (7,5 mm x 7,5 cm) s náplní Heparin-SPW TSK-GEL vyrovnanou pufrem B (50 mM Tris, 0,1 % CHAPS, 0,3 M NaCl, pH 7,0). Navázaný polypeptid byl vymyt s použitím lineárního gradientu od 0,3 M do 1,0 M NaCl (v pufru B) po dobu 60 minut. Frakce, obsahující mFLINT byly spojeny a děleny na koloně 1 cm x 15 cm Vydac C4, vyrovnané 0,1 % TFA/H₂0. Navázaný mFLINT byl vymyt s použitím lineárního gradientu od 0 do 100 % CH₃CN/0,l% TFA. Frakce obsahující mFLINT byly analyzovány metodou SDS-PAGE, bylo zjištěno, že čistota je vyšší než 95 % a pak byly dialyzovány proti 8 mM NaP04, 0,5 M NaCl, 10 % glycerin, pH 7,4. U vyčištěného polypeptidu byla potvrzena N-koncová sekvence mFLINTů. Hmotnostní spektroskopií a F-Endogylkosidázovou digescí bylo zjištěno, že mFLINT je glykosylovaný.

PŘÍKLAD 10

A. Konstrukce FLINT-Flag a FLINT expresních vektorů

Flag-značené nativní verze lidského FLINT peptidu byly exprimovány v baculovirem infikovaných buňkách za účelem získání dostatečného množství rekombinačního proteinu pro testy. Lidská FLINT cDNA byla upravena pro expresi následovně. pIG3 (derivát pIGl; Gerlitz, B a Grinnell, B. W., nepublikované data) expresní vektor, obsahující cDNA kódující FLAG-značenou verzi FLINT, byl štěpen pomocí Xbal a doplněn vytvořením tupých konců. Tento vektor pak byl štěpen pomocí Sáli. Výsledný 918ti párový fragment, obsahující kódující region, byl gelově-čištěn a ligován do baculovirového vektoru pFastBac-1 (GIBCO/ BRL), který byl před tím digestován s BamHI, konce upraveny a subsekvenčně digestovány pomocí Sáli, generujícího plasmid pBacOPG3Flag. Tento konstrukt byl navržen tak, aby exprimovaly molekulu plné délky (včetně 29 Nezakončení aminokyselin, která obsahuje signální peptid) a značení FLAG proteinu na COOH-zakončení. Tato exprese byla řízena baculovirovým polyhedrinem jako promotorem.

Pro konstrukci vektoru s cílem exprimovat nativní verzi proteinu byl 920ti párový Xbal/ HindlII cDNA fragment, kódující plnou délku proteinu, předem subklonovaného do pCDNA3.1 (+/-) [získáno od firmy Invitrogen] pomocí Xbal a HindlII. Fragment byl gelové čištěn a ligován do baculovirového vektoru pFastBac-1 (GIBCO/ BRL), který byl před tím digestován pomocí Xbal a HindlII, a generoval plasmid pBacOPG3.

B. Generování baculovirů a produkce proteinu

Dva vektory, pBacOPG3Flag a pBacOPG3, byly odděleně použity pro získání dvou recombinačních baculovirů (vBacOPG3Flag a vBacOPG3) jako popsaná vendorem (GIBCO/ BRL) . Každý z těchto virů byl odděleně použit k infekci SF-9 buněk s cílem produkce proteinu. Rekombinační proteiny byly analyzovány v supernatantech, odebíraných z infikovaných SF-9 buněk pomocí analýzy Western-blot a Coomassie .

PŘÍKLAD 11

EXPERIMENTY NA VÁZÁNÍ FAS LIGANDU

Pro detekci mFLINT interakce s FasL byl proveden experiment Dot blot, při kterém se testovaly známé TNF ligandy, které jsou komerčně dostupné TRAIL a FasL for na interakci s mFLINT.

• «

TRAIL (RnD Systémy) a FasL (Kamiya Biomedical Company) byly natečkovány na nitrocelulózový papír a inkubovány s čištěným mFLINT-Flag. mFLINT byl vymyt a navázaný mFLINT byl detekován s použitím anti-Flag protilátky. Jak OPG2Fc, tak i mFLINT-Flag byly exprimovány v nadměrném množství a čištěny podle příkladů shora. Filtrační papír byl následně blokován po dobu 30 minut s použitím 5 % netučného mléka v PBS při pokojové teplotě. Nitrocelulózový papír byl následně smísen s buněčným lyzátem, obsahujícím FasL-Myc a dále inkubovány na rotačním zařízení po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Druhá a třetí inkubace byly provedeny s anti-myc protilátkou a antimyším IgG-HRP po dobu 1 hodiny a po dobu 30 minut. Polypeptid obsahující myc epitop byl detekován by chemoluminiscenčně na Rentgenovém filmu, který ukázal, že mFLINT se vázal na FasL specificky. Nebyla zjištěna žádná patrnější vazba s TNFa, TNFp, TRAIL, CD40L nebo TRANCE.

První a základní experiment byl proveden za účelem zjištění interakce Fas-FasLigand in vitro. Pokud není uvedeno jinak, všechny promývací stupně používaly TBST (Slaný pufr Tris s Tweenem 20 od firmy SIGMA) a byly prováděny 3 až 6 krát.

mrecFas (100 ng) byl adsorbován na destičku ELISA. Pyk byla destička blokována TBST plus 0,1% želatinou. Poté byl přidán hFasLigand (Flag-značený) v různých koncentracích s maximem koncentrace 300 ng a dále postupně dolů až na L ng na TBST plus 0,1% roztok, obsahující 1 pg/ml M2 Abs (antiflag protilátky získané od Scientific Imaging System division firmy Kodak). Po 6ti násobném promytí destičky byl do jamek přidán anti-myší-Abs-HRP (3000krát zředěný, Bio-Rad). Po trojím promytí byla provedena vizualizace enzymatické reakce s použitím ABTS jako substrátu. Pokud není uvedeno jinak, bylo • · · · · · ······· *· < · * používáno čtecí zařízení ELISA, prodávané firmou Molecular Devices Corp. (Menlo Park, California).

Byla získána následující data:

FasL, ng	OD, 405 nM
1	0,1
5	0,2
10	0,3
50	0,7
100	1,2
500	1,6

Vazba FLINT-Fas L může být potvrzena specifickými metodami stanovení vazby (např., měřením kinetiky, specifičnosti nějaké vlastnosti, afinity, kooperace, relativního typu vazby, koncentrace) s použitím biomolekulární analýzy interakce v reálném čase. Tato technologie umožňuje studovat biomolekulární interakce v reálném čase, bez značení jakékoliv z těchto interakcí. Konkrétně má výhodu, že využívá optického jevu povrchové plasmonové rezonance a detekce závisí na změnách v koncentraci hmoty makromolekul na biospecifickém rozhraní. Interakce po sobě následují v reálném čase, takže kinetická informace je snadno odvoditelná. V mnoha případech, výzkumu se může provést bez předchozího čištění složek.

Měření se provádí s použitím přístroje BiaCore 2000. Tento přístroj, příslušenství, imobilizace a udržovací souprava, a pufry byly získány od firmy Biacore AB, Rapsgatan 7, S-754 50 Uppsala, Sweden. FasL byl získán od Kamiya Biomedical Company, 910 Industry Drive, Seattle, WA 98188, Guanidinisothiokyanátový roztok od GibcoBRL, a mFLINT byl připraven jako v Příkladech 8 a 9.

• · • · ·

Experimenty s použitím zmobilizovaných FasL, navázaných z roztoku, obsahujícího mFLINT. V tomto experimentu byla K_D FasL-FLINT interakce byla 1,13 x IQ^-7, což je nižší, než FasL vazba na Fas, pro kterou byla nalezena konstanta 1,62 χ 10’⁷. Toto je vysvětleno faktem, že FasL je a trimer, a v tomto případě byl vázán FasL monomer. Dále experimenty používají vázané FLINT s FasL v roztoku, což umožňuje vznik trimeru. Výsledná resultant K_D pro FLINT-FasL v těchto experimentech byla o 2 řády lepší (t.j., K_D byla nižší o dva řády). Tato pozorování naznačují, že FLINT by měly efektivně konkurovat Fas v navazování na FasL, což nejspíše vysvětluje terapeutický zisk, pozorovaný v experimentech, jak jsou uvedeny podrobně dále.

FLINT zabraňuje interakci Fas-FasLigand

Jako v případě uvedeném shora, mrecFas (100 ng) byl adsorbován na destičce ELISA. Opět byla destička blokována TBST a 0,1% želatinou. Poté byl do každé jamky přidán hFasLigand (Fiag-značený, 30 ng na každý bod) za přítomnosti různých koncentrací mFLINT (Maximum koncentrace 300 ng až minimum 1 ng) na TBST plus 0,1% roztok, obsahující 1 gg/ml M2. Jako v předchozím případě, po omytí destičky byl ke každé jamce přidán anti-myší-Abs-HRP (3000násobné zředění, Bio-Rad). Po promytí byla provedena vizualizace enzymatickou reakcí s použitím ABTS jako podkladu. Data jsou uvedena v následující tabulce.

• ·

FLINT, n	OD, 405 nM
1	0,36
5	0,36
10	0,36
50	0,28
100	0,18
500	0, 06

FasLigand se váže na Fas a mFLINT s různými afinitami.

FLINT a Fas (100 ng každého) byly adsorbovány na destičku ELISA. hFasLiqand (Flag-značený) byl pak přidán v různých koncentracích do každé jamky přičemž maximum koncentrace bylo 300 ng a minimum 0,1 ng na TBST plus a 0,1% roztoku, obsahujícího 1 gg/ml M2 Abs. Po omytí destičky byl ke každé jamce přidán anti-myší-Abs-HRP (zředění 3:3000, Bio-Rad). Po promytí byla provedena vizualizace enzymatickou reakcí s použitím ABTS jako podkladu. Následující tabulka ukazuje získaná data.

FasL, ng	FLINT OD	Fas OD, 405nM
0,1	0	0
0,5	0	0
1,0	0, 02	0
5,0	0, 04	0,01
10	0,12	0,03
50	0,28	0,045
100	0,78	0,18

• · · · · * ,,, .... ·· · ··

PŘÍKLAD 12

Měření vlivu mFLINTů na anti-CD3 vyvolanou apoptózu Jurkat

Bez tkáně ošetřené 24 jamkové destičky (Decton Dickinson, Mansfield, MA) byly potaženy 0,5 ml 1 gg/ml anti-CD3 (Farmingen) v PBS po dobu 90 minut při 37 °C. Destička byla jednou promyta PBS. Pak byl do každé jamky naočkován 1 ml 1 x 106 buněk/ml s nebo bez následujícího ošetření: 10 μΜ DEVD-cmk, 1 μς OPG2-Fc, 1 nebo 2 μς mFLINT a 1 μς anti FasL Ab. mFLINT byl vyroben podle příkladů 8 a 9.

Buňky byly inkubovány přes noc při 37 °C v inkubátoru a pak byly vybarveny Annexinem V a PI barvivém. Apoptóza byla hodnocena průtokovým cytometrem (FACS). Buňka podstoupivší apoptózu byla rozpoznána podle pozitivního vybarvení Annexinem V.

Jurkat samostatně (kontrola)	6, 97
Jurkat + anti Fas	59,28
Jurkat + antiCD3	46,32
Jurkat + antiCD3 + DEVDcmk	30,80
Jurkat + antiCD3 + mFLINT (lu )	27,77
Jurkat + antiCD3 + OPG2-FC (lu )	45,78
Jurkat + antiCD3 + mFLINT (2u )	18,67
Jurkat + antiCD3 + antiFasL Ab	24,05

PŘÍKLAD 13

Měření vlivu mFLINTů na rekombinační FasL-vyvolanou apoptózu buněk Jurkat

Do každé jamky 24 jamkové destičky s tkáňovou kulturou byl přidán jeden mililitr směsi 1 x 106 buněk/ml a jamka byla ošetřena následujícími činidly: Rozpostná Fas L (200 ng), Fas L plus 1 gg mFLINT, Fas L plus 1 gg OPG2-Fc, Trail (200 ng) , Trail plus 1 pg mFLINT. Buňky byly inkubovány přes noc při 37 °C a pak bybarveny Annexinem V a PI. Apoptóza buněk byla stanovena jako v případě shora (FACS). mFLINT byl získán podle příkladů 8 a 9.

Jurkat samotné (kontrola)	3,23
Jurkat + FasL (200ng/ml)	67,39
Jurkat + FasL (200ng/ml)+ anti FasL Ab (1 gg)	3,3
Jurkat + FasL (200ng/ml) + mFLINT (1 gg)	3,32
Jurkat + FasL (200ng/ml) + mFLINT (1 gg.)	4,6
Jurkat + FasL (200nglml) + OPG2(lug)	70,58
Jurkat + FasL (200ng/ml) + OPG2(lug)	69,58
Jurkat + TRAIL (200ng/ml·)	17,47
Jurkat + TRAIL (200ng/ml)	17,43

PŘÍKLAD 14

Měření vlivu mFLINTů způsobem, umožňujícím hodnotit velikost dávky, na anti-CD3 vyvolanou apoptózu Jurkat

Byly provedeny stejné kroky potažení destičky a léčení buňky, jako je uvedeno v příkladu 13, s tím rozdílem, že do každé jamky bylo přidáno jiné množství mFLINTů. mFLINTy byly vyrobeny podle příkladů 8 a 9. Následující tabulka uvádí přidaná množství a s nimi dosažené výsledky:

Buňky Jurkat samotné(kontrola)	5,33
Buňky Jurkat + anti CD3	27,49
Buňky Jurkat + anti CD3 + anti FasL neutralizace Ab	12,74
Buňky Jurkat + anti CD3 + OPG2-Fc 4pg	26,24
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT/PG3 3000ng	14,68
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT 2000ng	17,02
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT lOOOng	24,29
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT 500ng	27,48
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT 250ng	28,93
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT 125ng	29, 4
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT 62,5ng	28,99
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT 31,25ng	28,21
Buňky Jurkat + anti CD3 + mFLINT 15,625ng	28,80

PŘÍKLAD 15

Měření vlivu lidského mFLINT na murinem Fasl-vyvolanou apoptózu s použitím myší T buňky hybridomu (LTT buňky) (Test na Annexin V)

FLINT byl vyroben podle příkladů 8 a 9. V testu na Annexin V viz Glasebrook, Eur.J.Immunol. 17: 1561-65 (1987) pak bylo použito LTT, 2, 14, 11 buněk (LTT buněk) . První den byla 96ti jamková destička povlečena s anti-CD3 (2C11) při postupné sérii různých zředění. Druhý den bylo do každé jamky přidáno 100 000 LTT buněk v 50 μΐ živného roztoku a současně bylo přidáno 50 μΐ živného roztoku do kontrolních jamek 50 μΐ živného roztoku, který obsahoval:

Skupina 1. rozpustnýFas (sFas)(FasFc, myší), s finální koncentrací 1 pg/ml

Skupina 2. mFLINT (lidský), s a finální koncentracíl pg/ml

Skupina 3. anti-FasL (myší), s finální koncentrací 1 pg/ml.

Tyto jamky pak byly inkubovány přes noc 37° C, v prostředí 5 % C0₂.

Další den (Den 3), byly buňky z každé jamky odebrány, promyty a vybarveny Annexinem V a PI, načež následovala cytometrická analýzy.

Anti CD3	Kontrola % Annexin V Pozitivní	SFas % Annexin V Pozitivní	FLINT % Annexin V Pozitivní	Anti-FasL % Annexin V Pozitivní
1	96,42	56, 66	34,41	53,46
0,33	94,48	47,28	35,89	39,21
0,11	91,27	41,08	33,24	32,54
0	19,74	23,14	26,47	17,54

PŘÍKLAD 16

Měření vlivu lidského mFLINT na murinovu Fasl-vyvolanou apoptózu pomocí myší T buňky hybridomové buňky (LTT buněk (Test cytotoxicity) • · · · · · ······· · · · · ·

Byly provedeny stejné kroky jako v příkladu 16 - den 1 a den 2. Den 3 bylo k buňkám přidáno 20 μΐ MTS roztoku (Promega) a buňky byly poté inkubovány při 37 °C po dobu 2 hodin. S použitím čtečky destiček byly vyhodnoceny absorbance při vlnové délce 490 nm.

Anti-CD3 konc. (pg/ml)	s-Fas (1 pg/ml))	FLINT (1 pg/ml)	Anti-FasL	Kontrola
0	1,774	1,691	2,01	1,534
0,0014	1,968	1, 923	2,134	1, 614
0, 004	1,929	1,982	2,147	1,653
0, 012	1,779	2,006	2,108	1,284
0,037	1,777	2,006	1,988	0,834
0,11	1,638	1,874	1,956	0,733
0,33	1,624	1,671	1,978	0,648
1,459	1,581	1,887	0,664

PŘÍKLAD 17

Experimenty na vazbu LIGHT

Pro dot blot potvrzení vazby LIGHT a mFLINT, bylo 293 buněk transientně transfektováno s LIGHT expresním konstruktem přes noc. Další den byly buňky přemístěny a inkubovány s mFLINT-Flag na ledu. Flag epitop byl pak následně detekován anti-Flag konjugátem s fluorochromem a populace, která ukazuje specifické vazby s mFLINT byla detekovíána cytometrem. Jako kontrolu jsme použili vektorem transfektovných buněk. Abychom se ujistili, že byla vazba specifická, byl ještě proveden kompetitivní test s 10ti násobným přebytkem neznačeného mFLINTů.

Konkrétně, 6 jamkovitých misek buněk bylo transfektováno metodou, uvedenou shora. Vektor i m-LIGHT exprimující buňky pak byly měřeny. Buňky byly přemístěny rychlým pipetováním pomocí Pipety P100. Pak byly buňky vystaveny v PBS/BSA, 0,1% jedné z následujících kombinací, uvedenách pod v a-d.

a. GST/flag, mFLINT/flag, nebo HVEM při koncentraci 20 nM;

b. FLINTIflag při koncentraci 20 nM + GST/flag nebo mFLINT nebo HVEM při koncentrací 200 nM;

c. FLINT/flag při koncentraci 20 nM + HVEM + anti-lidské FAS ligand při koncentraci 200 nM;

d. anti-lidské FAS ligand-biotin při koncentraci 1 pg/ml

Buňky byly inkubovány na ledu po dobu 30 minut a promyty PBS/BSA, 0,1 %. Pak byly vystaveny buď anti-lidskému

IgG-biotinu, 1 pg/ml (pro detekci HVEM), nebo M2-biotinu, 2 pg/ml (pro detekci flag konjugátů). Buňky byly inkubovány na ledu po dobu 30 minut a promyty PBS/BSA, 0,1 %. Potí byly buňky vystaveny streptavidinu Alexa 488 (SIGMA) při zředění 1:1000. Opět byly inkubovány na ledu 30 minut a promyty PBS/BSA, 0,1%. Buňky byly analyzovány s použitím a cytometru FACSORT (Decton Dickinson), čímž se stanovilo navázání.

Test navazování na buněčný povrch s použitím stejného typu cytometru potvrdil, že píky se posunuly jedině tehdy, když LIGHT exprimující buňky byly vybarveny po použití mFLINT-Flag (data nejsou znázorněna). Žádný posun nenastal u kontrolních buněk, kdy byly vybarveny s mFLINT-Flag. Posunuty pík se úplně vrátil an původní hodnotu, pokud byly buňky preinkubovány s 10ti násobným přebytkem neznačeného mFLINT, čímž byla napřed obsazena veškerá vazebná místa pro mFLINT-Flag.

·· · * «··· ·· • · » · · · · • · · · ♦ · · · · · · ' ······· ·· · *·

PŘÍKLAD 18

In vivo test na mFLINTy pro vhodnost k léčení poškození jater

S použitím myšího modelu bylo poškození jater vyvoláno s použitím upravených způsobů, uvedených v publikaci Tsuji H., et al, 1997, Infection a Immunity, 65(5):1892-1898. mFLINT byl vyroben podle příkladů 8 a 9.

Specificky byla aktivita polypeptidů podle vynálezu proti akutnímu zánětu a apoptóze stanovena s použitím následujícího postupu. Stručně, BALB/c myš (Harlan), každá experimentální skupina dostala intravenózní injekce (do laterální žíly) 6 mg D(+)-Galaktosaminu (Sigma, 39F-0539) v 100 pl PBS (GIBCO-BRL) a 3 pg Lipopolysacharidu Β E. coli 026:B6 (LPS) (Difco, 392025-2) v 100 pl PBS. LPS byl podán nitrožilní injekcí (dále též i.v.) 5 minut po galaktosaminu, který byl podán i.v. Po LPS projevu byly zvířatům injekčně intraperitoneálně podány mFLINT (200 pg), Hamster IgG (500 feg, Cappel, 30926), mAb proti murinu TNF, TN3-19,12 (500 pg, Sheehan K.C.F. et al J. Immunol. 1989. 142: 3884), a Anti-mouse Fas Ligand (500 pg,

PharMingen, M024301) při 0, 2, 4, 6 hod.- měřících bodech.

Podíl přeživších myší byl hodnocen 24 a 4 8 hodin po LPS injekci.

U myši, která dostala 3 pg LPS měla po IP injekco 200 pg mFLINT polypeptidů (FLINT) pozitivní vliv na poměr přeživších zvířat. Pokud byla mFLINT podány 2 hours po otravě, 100% zvířat přežilo; při podání 4 hodiny po otravě přežilo 73 % zvířat; při podání 6 hodin po otravě přežilo 60 % zvířat.

V kontrastu s tím, podávání anti-TNFoc 4 hours po otravě ochránilo zvířata pouze z 10 %.

• · * · « · ·· ' * · φ · · · » • * · · • »» · · · • · ·

Obrázek 5 srovnává účinky podávání 200 pg mFLINT, i. v., a před a po otravě LPS/GalN. Při podání 2 hodiny před aplikací LPS/GalN, mělo léčení pomocí anti-TNF i pomocí mFLINT za následek 100% přežití myší. 80 % myší ošetřených anti-FasL přežilo a asi 30% myší ošetřených IgG přežilo.

V kontrastu s tím, když bylo podáno anti-TNF 4 hodiny po aplikaci LPS/GalN, přežilo méně než 10 % zvířat, ale pokud bylo podáno po 48 hodinách, překvapivě přežilo 80 % zvířat, léčených podáváním mFLINTů při podání 4 hodiny po LPS/GalN. Podávání anti-FasL 4 hodiny po aplikaci LPS/GalN také resulted vedlo k 80% přežití. IgG nemělo v podstatě žádný vliv na přežití, pouze asi 2 % zvířat přežívalo. Z těchto důvodů je mFLINT účinný při léčení pozdního stádia choroby.

Obrázek 6 ukazuje, že když bylo podáno 400 pg mFLINTů i.p. myši, 2 hodiny před aplikací LPS a GalN, 100 % zvířat bylo živých 48 hodin po aplikaci LPS/GalN. Pokud bylo podáno 400 pg anti-TNF i.p. dvě hodiny před aplikací LPS/GalN, asi 95 % zvířat přežívalo do 48 hodin. V kontrastu s tím, pouze 20% těchto zvířat, neošetřených mFLINTy, přežívalo 48 hodin. Podávání IgG dvě hodiny před LPS/GalN zvýšilo poměr přežití na pouhých 30 %.

Obrázek 6 ukazuje, že snížení dávky mFLINTů na 50 pg ještě mělo ochranný účinek. 48 hodin po aplikaci LPS/GalN asi 70 % zvířat přežívalo do 48 hodin, ve srovnání s 0 % přežitím neléčených zvířat.

Obrázek 7 ukazuje, že účinek 100 pg mFLINT na přežití je stejný, pokud je podán i.p. nebo i.v., 12 nebo 2 hodin před aplikací LPS/GalN. Pokud je mFLINT podán 4 hodin po aplikaci LPS/GalN, i.v. podávání vede k 100% přežití, a i.p. podávání má za výsledek 80% přežití. Tento obrázek také ukazuje vztak dávka/odezva 4 hodiny po aplikaci LPS/GalN, i.v. podání 50 μς poskytlo 80% přežití, 10 μ9 poskytlo 40% přežití 5 gg poskytlo 20% přežití a 1 μg poskytl pouze asi 2% přežití.

PŘÍKLAD 19

Tento příklad demonstruje použití plných mFLINTů pro léčení of cerebrální ischemie, která je klinicky relevantní mrtvici, poranění hlavy a jiným podobným poruchám.

Dospělí samci gerbil (70 až 80 g tělesné hmotnosti, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) byli podrobeni anestézii i.p. injekcemi natrium pentobarbitalu (Nembutal) 40 mg/kg a dalšími i.p. injekcemi 10 mg/kg pokud bylo nutné udržovat chirurgický plán anestézie. Zvířata byla umístěna na termostaticky vyhřívané podušky, aby byla udržována tělesná teplota na 37°C. Ventrální povrch šíje byl vystaven nahoru, úplně oholen a kůže byla očištěna 2% jodovou tinkturou.

Po předoperační přípravě byl proveden středový řez a otevření kůže. Sternohyoidní svaly byly rozděleny a byly obnaženy a izolovány hlavní krční tepny (CCA), aby bylo umožněno její zaškrcení. Sterilizovaný aneurysmový klips (čelist 0,15 mm, síla stisku ~10 g) byl byl pak aplikován na levý i pravý CCA po dobu 5 minut. Pak byly klipsy odstraněny a znaky na tepnách byly vizuálně zkontrolovány. Krční otvor pak byl chirurgicky šitím uzavřen.

Ihned po takto vyvolané cerebrální dokud byly gerbily v bezvědomí, byl jim oholen zadní povrch hlavy a kůže očištěna 2% jodovou tinkturou. Pod chirurgickou anestézií byly hlavy gerbil upevněny ve stabilních pozicích pomocí stereotaxního přístroje (SA) a byl proveden středový řez, aby byla obnažena lebka. V pozici 1 mm laterálně a 1 mm posteriorně vzhledem k bregmě podle stupnice na přístroji SA, byla lebka ztenčena zubařskou vrtačkou vybavenou vrtákem o průměru 0,5 mm. Zeslabené oblast byla propíchnuta mikrojehlou, vybavenou 27-guage dutou jehlou, kterou bylo do 3 mm hloubky vstříknuto 5 μΐ (0, 63 mg/ml )mFLINTů ve fosfátovém slaném pufru (PBS). mFLINT byl vyroben podle příkladů 8 a 9.

Po injekci byla jehla vyměněna za kanylu [délky 3 mm] a bylo připojeno zařízení pro mozkové infúze s Alzetovou osmotickou pumpou (Alza Corp., Palo Alto, CA), jehož zásobník byl umístěn pod kůži na rameno gerbily. Infúzní kanyla byla zakotvena na povrchu lebky s použitím zubního cementu. Otvor byl uzavřen chirurgickým šitím. Alzetova osmotická pumpa, obsahující roztok mFLINT (0,63 mg/ml) nebo PBS dodávala roztok kontinuálně rychlostí 1 μΐ/h 3 dny. Gerbily byly ponechány přežívat 5 dní (den chirurgického zásahu byl označen jako den 0) .

Po pěti dnech přežití byly gerbily usmrceny v komoře 00₂. Thorakotomie byla provedena za účelem transkardiální perfúze solankou po dobu 3 minut a formaldehydem 2 minuty. Mozky byly odebrány pro histologické zpracování a následoval standardní postup upravený obecně v uvedených ohledech. Koronální řezy byly získány přibl. 1,7 mm posteriorně vůči bregmě vybarvení Kresolovou modří byly řezy prohlédnuty mikroskopem při zvětšení 40 x a byl vyhodnocen

Po pod počet neporušených buněk hipokampálních neuronů podél dorsálnlch CA1 regionů (délka 0,5 mm) obou hemisfér. Data byly zpracována Studentovým t-testem a Wilcoxonovým rozdělovacím testem.

Výsledky ukázaly, že mFLINT má průkazný účinek na přežití neuronů ve srovnání s vehikulem (p=0,0039 v t-test; p=0,0037 podle Wilcoxonových rozdělených sum) a tento výsledek byl průkazný oproti neošetřené kontrole.

PŘÍKLAD 20

LÉČENÉ SKUPINY: POČET ZVÍŘAT

KONTROLY 10

FLINT (50 pg/injekce)iv, dny 4-13 10

OPG2 (50 pg/injekce)iv, dny 4-13_10

CELKEM: 30 myší

Pro tento experiment byla připravena suspenze melanomových buněk B16 z nádoru dárce. Nádorové buňky (2 x 106) byly implantovány subkutánně do zadní končetiny samce C57B1 myši, získané z Taconic Farms, v den 0. Léčení bylo zahájeno 4. den, mFLINT nebo OPG2 byl podáván intravenózní injekcí do krční žíly denně ve dnech dne 4 až 13, takže bylo podáno celkem 10 injekcí. mFLINT byl vyroben podle příkladů 8 a 9. Přehledný protokolu je znázorněn shora.

Odpověď nádoru byla monitorována měřením jeho objemu, jak je stanoveno kaliperovým měřením dvou rozměrů nádorů ve dnech 4, 8, 11, 17, 21, 25, 30 a 34. Objem nádoru byl vypočten jako hemielipsoid. Zvířata byla ve stejném časovém rozvrhu, který je popsán shora, vážena.

Kontrolní nádory dosáhly objemu 500 mm³ v den 17,4 ± 0,3 a 1000 mm³ v den 21,1 ± 0,3. Nádory zvířat, ošetřených mFLINTy dosáhly objemu 500 mm³ v den 19,3 ± 0,3 a dosáhly 1000 mm3 v den 23,0 ± 0,4. Nádory zvířat, léčených OPG2 dosáhly objemu • 9 · • * · • · · * • · ·

500 mm³ v den 185,0 ± 0,4 a 1000 mm3 v den 22,2 ± 0,4. Z toho je vidět, že zpomalení růstu nádoru pomocí mFLINT bylo 1,8 dní a zpomalení vlivem OPG2 bylo 1,1 dní. Tato data jsou vynesena graficky na obrázku 8. Jak je znázorněno na obrázku 8, objem nádoru po 20 dnech byl přibližně 730 mm³ u myši léčené mFLINTem, zatímcom objem nádoru u kontrolní myši byl přibližně 1000 mm³. Nyvyskytly se žádné náznaky toxicity vlivem podávání mFLINTů nebo OPG2, jako například ztráta hmotnosti.

PŘÍKLAD 21

Třicet NOD myší starých 6 týdnů, bylo získáno od Jackson Laboratories (Bar Harbor, Maine). Myši byly umístěny do klecé po třech a byl jim poskytnut volný přístup k potravě (Purina 5001) a k vodě. Po týdenní aklimatizaci byla myším odebrána na krku krev a byla stanovena hladina glukózy v krvi a hladina insulinu v plazmě. Glukóza v krvi se měří krční sondou bez anestézie s použitím analyzátoru krevní glukózy Precision G (Medisense lne., Bedford, MA). Plasmový insulin se měří pomocí soupravy RIA kit (Lineo lne., St. Louis. MO.). Myši se pak náhodně rozdělí do tří skupin, kontrolní, léčené injekčnš mFLINT, a léčené injekčnš OPG2. Po rozdělení myší do skupin byla stanovena tělesná hmotnost a glukóza v krvi, což se dále kontroluje jednou týdně. Od začátků projevů cukrovky (glukóza v krvi > 20Omg %; 14 týdnů staré myši) dostávají myši denně intraperitoneálně buď mFLINT (50 pg/den) nebo OPG2 (50 pg/den) zředěný v PBS. Kontrolním myším se podívá injekčně stejný objem PBS. Po 2 týdnech injekcí se myši podrobí anestezii inhalací anestetika (oxid uhličitý) a odebere se jim krev punkcí do srdce, za účelem měření glukózy a insulinu. Kromě toho se odebere pankreas podle Animal Studies Support Team a fixuje se v zink-formalinu po dobu 24 hodin pro následné histochemické vyšetření integrity β buněk (hematoxolin a eosin) a imunohistochemické vybarvení na insulin (George Sanduskys laboratory). mFLINT byl vyroben podle příkladů 8 a

9.

PŘÍKLAD 22

Tento příklad demonstruje, že mFLINT inhibuje apoptózu u in vitro modelu, který simuluje ischemické reperfúzní poškození. Získaná data naznačují, že mFLINT je použitelný pro prevenci a léčení takovýchto poškození.

Ventrikulární kardiomyocyty byly izolovány ze srdce 1-3 dni starých novorozených krys trypsinovou digescí a nonmyocyty byly eliminovány předběžně následujícím postupem. Primární kultury byly umístěny ve speciálně povlečených 96ti jamkových destičkách v prostředí bez séra.

Hypoxie byla vyvolána inkubací kultur v bezglukózovém a bezkyslíkovém prostředí (5% CO2 a 95% N₂) po dobu 8 hodin. Reperfúze byla napodobována 16 hodin. Pak byla provedena inkubace v prostředí, obsahujícím glukózu a normální stav kyslíku. Po ukončení této inkubace byla měřena apoptóza kardiomyocytů cytoplasmovým nukleosomovým způsobem DNA ELIS. Testované vzorky byly inkubovány s mFLINT (2 pg/ml nebo 5 pg/ml) a kontrolní vzorky s Z-YVAD-fmk (50 μΜ), což je komerční inhibitor kaspázy. Opakované experimenty ukazujív podstatě úplnou inhibici hypoxií/reperfúzí-vyvolané apoptózy. mFLINT byl vyroben podle příkladů 8 a 9.

Pro potvrzení těchto dat bylo zkoumáno, zda pozorovaná inhibice byla způsobena Fas, byla inkubací vyvolána kardiomyocytová apoptóza inkubací s roztokem FasL a apoptóza byla měřena jako shora. V těchto experimentech byla apoptóza inhibována buď anti-Fas neutralizační protilátkou (1 gg/ml) nebo mFLINT (10 pg/ml). Tyto experimenty potvrdily, že mFLINT inhibuje apoptózu, a naznačuje, že tak není, a že se inhibice alespoň zčásti děje apoptotickou cestou FasL-Fas.

PŘÍKLAD 23

Murinový test osteoklastové diferenciace

Společná kultura při způsobu podle Takahashi et al. (Endocrinology 123:2600 1988) byla modifiekována, jak je popsáno v publikaci Galvin et al. [Endocrinology 137:2457 1996) a použita ke studiu účinků různých prostředků na osteoklastovou diferenciaci. mFLINT byl vyroben podle příkladů 8 a 9.

Samci myší Balb/C (4-8 týdnů staří) byly usmrceni účinkem CO₂, byly jim odebrány femury a z těchto femurů byla odebrána kostní dřeň a umístěna do živného prostředí. Kostní dřeň buněk byla peletována odstředěním při 500 x g po dobu 6 minut a resuspendována v živném prostředí (RPMI lb40 plus 5 % tepelně inaktivovaného fetálního hovězího séra a 1 % antibiotickýantimykotický roztok). Populace kostní dřeně (5 x 10⁴ buněk/cm²) byla naočkována do misek pro tkáňovou kulturu, ve kterém BALC buňky (stabilní buněčná linie odvozená z neonatálních myších kostí, 1,5 x 10⁴ buněk/cm²) byly na destičky umístěny 2 hodiny před přidáním kostní dřeně. Buňky byly kultivovány 7 dní ve zvlhčovaném inkubátoru při 37°C s 5 % CO2 s výměnou živného roztoku 3. a 5. den. Kultury byly ošetřeny nebo neošetřeny 10~⁸M 1,25-(OH)₂D₃ ve dnech 0, 3 a 5.

Kromě toho byly buňky ošetřeny nebo neošetřeny vyloučeným mFLINT proteinem, čištěným od živného prostředí buněk • · · · · · • · · · • · · · · • · · · ······· · · transfektovaných mFLINT genem (Obrázek 1). Následujících 7 dní kultivace byly buňky v 24jamkových miskách fixovány formalinem (3,7 % po dobu 10 minut) a pak vybarveny na vinanově rezistentní kyselou fosfatázu (TRAP) s použitím modifikace způsobu, popsaného Gravesem, L a Jilkou RL, J. Cell Physiology 145:102 1990. Pak byl stanoven počet osteoklastů (TRAPpozitivních buněk, obsahujících 3 nebo více jader). Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka

FLINT (ng/ml)	Osteoklasty/jamka
0, 00	145,50 ± 7,33
0,01	40,50 ± 2,39*
0,10	65,50 ± 3,33*
1,00	97,50 t 3,10*
10,00	170,17 ± 8,26
100,00	335,00 ± 8,90*

a - Každá hodnota je průměrem se směrodatnou odchylkou, vypočtenou z 6ti jamek.

*p < 0,05 při porovnání s kontrolní skupinou

PŘÍKLAD 24

Test na diferenciaci prasečích osteoklastů

Novorozená prasata (věk 1-5 dní) byla usmrcena CO₂, přívěsky byly uveden do 70% ethanolu, měkké tkáně byly odstraněny a byly vyříznuty humeri, radii, ulnae, femora, tibiae a fibulae. Dlouhé kosti byly umístěny v ledem chlazeném Hankově rovnovážném slaném roztoku bez vápníku a bez hořčíku (CMF-HBSS, Gibco BRL) a očištěny od všech měkkých tkání. Kosti byly podélně rozštípány a endosteální povrchy byly oškrábány, aby se odstřranila dřeň a trámčina kosti. Suspenze částeček kostní trámčiny buněk dřeně byla živě míchána silným třepáním a ponechána projít přes 200 mm a pak 100 mm síto. Buňky byly odstředěny při 500 x g po dobu 10 minut při 4°C, peleta byla resuspendována v CMF-HBSS, a pak gradientově dělena na FicollPaque (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Jednojaderná buněčná frakce z gradientového dělení pak byla dvakrát promyta v CMF-HBSS a ponechána projít přes 35mm sít. Buňky byly suspendovány v růstovém médiu, sestávajícím z a-MEM (pH 7,2, který byl upraven, aby obsahoval 8,3 mM NaHCO₃ (Gibco BRL, Grand Island, NY) ), 10% teplem aktivované fetální hovězí sérum (FBS,

Hyclone, Logan, UT) a 2% antibiotický/antimykotický roztok (Gibco BRL, Grand Island, NY) a naočkovány do misek pro tkáňové kultury při hustotě 1 χ 10⁶ buněk/cm². Obvyklý výtěžek buněk kostní dřeně byl mezi 1-2 χ 10⁹ bunšk/zvíře, a měnil se podle velikosti zvířete. Buňky byly inkubovány při 37 °C ve vlhkém inkubátoru s 5 % CO₂. Po 24-48 h byly odebrány nepřilnuté buňky a naočkovány buď do 24-jamkových skupinových misek při hostotě 7,5 χ 10⁵ buněk/cm2 v růstovém prostředí, které obsahovalo nebo neobsahovalo 10-8 M 1,25-(OH)₂D₃ (Biomol, Plymouth Meeting, PA) a mFLINT protein (získaný jako v příkladech 8 a 9) . Buňky byly kultivovány až do 10 dnů při výměně živného roztoku každých 48-72 hodin za živný roztok, který obsahoval nebo neobsahoval 1,25-(OH)₂D₃ a mFLINT. Následujících 5 dní kultivace byly buňky fixovány formalinem (3,7 % po dobu 10 min) a vybarveny na vinan-resistentní kyselou fosfatázu (TRAP) jako v příkladu 6. Počet osteoklastů (TRAP-pozitivních buněk, obsahujících 3 nebo více jader) byl kvantifikován.

Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka

FLINT (ng/ml)	Os teoklasty/jamka3
0, 00	214,83 + 14,22
0,01	68,83 + 6,28*
0,10	176,17 + 23,01
1,00	228,50 + 17,26
10,00	228,50 + 29,29
100,00	382,33 + 26,59*

^a Každá hodnota představuje průměr a standardní chybu ze 6ti j ame k.

* p < 0,05 při porovnání s kontrolní skupinou

PŘÍKLAD 25 - Působení mFLINT in vitro

FLINT byl vyroben podle příkladů 8 a 9 a použit pro následující experimenty.

A -Kostní dřeň buněk z ozářené myši

Tento experiment byl navržen tak, aby informoval, zda mFLINT může zlepšit zotavování murinových krvetvorných výchozích buněk ze stavu po ozáření, podporou in vitro expanze za přítomnosti krvetvorných cytokinů. Myši byly podrobeny injekci 3 mg 5-floururacilu, i.p., a po čtyřech dnech jim byly odebrány femury a vypláchnuty za účelem izolace kostní dřeně (BM) buněk. 1 x 10⁶ BM buněk bylo naočkováno do každé jamky z 24-jamkové misky při použití třech opakování, v Iscovesově modifikovaném dulbeccos mediu (IMDM) + 10% FBS a byly • · · «> · · · ······· · ♦ · ·· * stimulovány 3 dny cytokiny stem buněčného faktoru (SCF) a IL-6, za přítomnosti nebo absenci mFLINTů (1 gg/ml). Po 3-dnu in vitro expansního intervalu bylo 5 x 103 buněk opět ve třech opakováních odebráno a místěno v CFU testu.

Kostní dřeň buněk inkubovaná mFLINTem měla signifikantně zvýšené množství CFU ve srovnání s buňkami, které nebyly ošetřeny mFLINTy. Obrázek 9 ukazuje CFU colonie/3 χ 10⁶ stimulovaných BM buněk. Tyto výsledky naznačují, že mFLINT chránil výchozí zárodečné buňky před apoptózou a zvýšil počet viditelných buněk, které byly schopny tvořit kolonie. Obrázek ukazuje výsledky u následující kolonie tvořící jednotky - erythroidních buněk (CFU-E) (kontrola - 15 000 kolonií; mFLINTem ošetřené - 33,000 kolonií)(p < 0,003) granulocytové makrofágové buňky (CFU-GM) (kontrola - 8,000;

mFLINTy-ošetřené - 15,000) (p < 0,039); a jednodušší granulocytové erythroidní monocytové megakaryocytové buňky (CFU-GEMM)(kontrola - 750: mFLINTem-ošetřené - 3,000) (p <

0,007). Čísla p informují o průkaznosti rozdílů, jak se počítá podle Studentova t-testu.

B- Kostní dřeň buněk od myší léčených chemoterapeutickým prostředkem

Tento experiment byl navržen tak, aby demonstroval, že mFLINT nebo anti-FasL protilátka může zlepšit murinové krvetvorné výchozí buňky, které byly vystaveny chemoterapeutickým prostředkům, následujících po in vitro expanzi krvetvorných cytokinů. 2 χ 10^δ buněk kostní dřeně z myší, ošetřených 5-FU, byly naočkovány do každé jamky z 24jamkové destičky s trojím opakováním v živném roztoku IMDM + 10 % FBS a byly 3 dny stimulovány SCF a IL-6, a jednou z následujících sloučenin:

• ·

1) mFLINT (1 pg/ml)

2) anti-FasL (1 pg/ml)

3) FasL (0,15 pg./ml)

4) Kontrola - žádná přísady

Po 3 dnu množení in vitro za přítomnosti cytokiny byly viditelné buňky spočítány a použity k nastavení CFU testu. Pokud mFLINT nebo anti-FasL protilátka chránila progenitorové (t.j. výchozí zárodečné) buňky před apoptózou, dá se očekávat vyšší počet kolonií v příslušných skupinách v CFU testu, výsledky jsou znázorněny na obrázku 10, který ukazuje počítání buněk kostní dřeně (xlOOO). Hodnoty byly: kontrolní buňky:

300; FasL-ošetřené buňky: 3 000; anti-FasL-ošetřené buňky:

200; mFLINT-ošetřené buňky: 4 900.

C— CD34 + buňky - Tento experiment je navržen pro zjištění, zda mFLINT nebo anti-FasL protilátka může zlepšit obnovu výchozích (progenotorových) buněk čisté linie lidských CD34 + progenitorových buněk. Čištěné lidské CD34+ buňky (1 x 10⁶/ml ) jsou stimulovány 100 U/ml lidského IL-6 a 100 ng/ml lidského SCF, s nebo bez mFLINT nebo anti-FasL protilátkou 3 dny in vitro s cílem namnožit progenitorové buňky. Po tomto namnožení a léčení se buňky spočítají a provede se CFU test.

PŘÍKLAD 26 - FLINT-TRANSGENNÍ MYŠ

A - Příprava transgenní myši

Tento příklad demonstruje konstrukci transgenní myši exprimující FLINT. Tato zvířata exprimují signifikantní hladiny FLINT, což dále demonstruje, že se neprojevují žádné vedlejší účinky, které by naznačovaly, že FLINT má nežádoucí toxicitu. Tato zvířata jsou také použitelná v dále rozvedených * · · léčebných postupech pro zlepšení stavů, které byly uvedeny shora.

Transgenní konstrukce. Primery pro polymerázové řetězové reakce (PCR) byly syntetizovány a použity k zesílení FLINTFLAG DNA sekvence z plasmidu pIGl-FLINTF, popsanému shora. 5’ primér, 5'-GAAGATCTTCTTTGATCAAGGATGGGCTTCTGGACTT-3', a BglII restrikční místo a the 3' primer, 5'-GGACTAGTCCTGATCATCACTTGTCGTCGTCGTCCTT-3’, obsahovaly Spěl restrikční enzymová místa. Tyto meziprodukty byly použity k zesílení celého FLINT a FLAG kódujícího regionu. Zesílený, 1,1 kb fragment byl ligován do více klonovacích míst plasmidu pMTmcsž a vytvořil se plasmid pMTmcs2-FLINT (6,7 kb). Viz Fox et al, Evr. J. Pharmacol. 308:195 (1996).

Genový fragment FLINT byl vystřihnut z pMTmcs2-FLINT digescí BglII a Spěl a gelovým čištěním. Tento fragment pak byl lemován Klenowovým enzymem a ligován do Klenowem lemovaného Mlul místa plasmidu pLIV.7, pomocí metody Johna Taylora z J. David Gladstone Institutu. Viz Fan et al., Proč. Naťl. Acad. Sci. 91:8724 (1994). V7sledn7 plasmid pLIV7-FLINT také obsahuje apo E genový promotor/5’ okrajový region hepatickou podpůrnou sekvenci zvanou hepatický kontrolní region (HCR). Pro mikroinjekci do embryí, a 7,0 kb DNA fragmentu zahrnujícího Apo E genový promotor-FLINT/FLAG-HCR fúzní gen byl vystřižen z plasmidu pLIV7-FLINT digescí Sáli a Spěl a čištěn gelovou elektroforézou a extrakcí skleněnými perličkami.

Vývoj transgenního zvířete. Transgenní myši byly vytvořeny s použitím popsaných technik, například podle publikace Hogan, B. et al. (1986) MÁNIPULATING THE MOUŠE EMBRYO: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring Harbor, ·· · · · · · · · · • · · * · · · • · · · · · • · · · « · ··· « · * ·· ·

NY) , jak byla upravena Foxem a Solterem, viz publikace Molec. Cell. Biol. 8:5470 (1988). Stručně, 7,0 kb DNA fragment zahrnující Apo E genový promotorový-FLINT-HCR fúzní gen byl mikroinjektován do samců pronukleových nově vyživopvaných jednobuněčných fází vývoje embryí (zygoty) FVB/N kmenu. Embryy byla kultivována in vitro přes noc, aby byl umožněn vývoj dvoubuněčné fáze. Dvoubuněčná embryy pak byly transplantována do oviduktů pseudogravidních myší plemene CD-I pro umožnění vývoje. Pro test transgenní přítomnosti nově narozené myši se každému zvířeti odebral malý kousek tkáně prstu, a tento vzorek byl digestován K proteinázou, aby se uvolnily nukleové kyseliny. Vzorek prstu byl následně podroben PCR analýze s použitím lidských FLINT-specifických primerů, aby se identifikovaly transgen-obsahující myši. U pěti potvrzených transgenních myší bylo identifikováno, že obsahující transgen FLINT a byly označeny jako myši 6494, 7262, 7353, 7653 a 7659. Každý z těchto nálezů byl schopen plodit a produkovat stabilní linie transgenních potomků.

Linie 6494 byla extenzivně charakterizována podle transgenní exprese a patologie. Rozsáhlá exprese v tkáni byla detekována u linie 6494, což bylo potvrzeno metodou Northern blot, RT-PCR (TaqMan), Western blot a imunohistochemickou analýzou a byla vyšší v játrech a ledvinách. Vysoké hodnoty FLINT proteinu byly zjištěny v krevním oběhu linie 6494 myši, což bylo stanoveno pomocí testu ELISA; úroveň nálezu = 490 ng/ml; hladiny progenů v rozmezí 285-1360 ng/ml (n=6) . Při těchto analýzách nebyly nalezeny žádné endogenní FLINTy. Nebyly zjištěny žádné signifikantní histopatologické projevy u 5 týdnů nebo 8 týdnů starých progenů 6494. Předběžná chemická analýza naznačuje, že hladiny triglyceridů mohou být n myši 6494 zvýšeny. Zvířata neměla žádné pozorovatelné abnormality.

• *··«>· ··· • · · <1 · · · ······· «· · ·· ·

B-Ochrana myši před zářením

Tento experiment je navržen tak, aby zhodnotil, zda FLINT transgenní myši jsou chráněny před škodlivými účinky radioaktivního záření. Letální ozáření 18 transgenních a 18 netransgenních myší 850 cGy. 8 z 18 myší v každé skupině nedostalo žádnou transplantovanou kostní dřeň. Těchto 8 myší bylo 5použitých jako kontrola pro ozářením vyvolanou smrt a 3 pro histologickíá vyšetření střevní sliznice a kostní dřeně, porovnávané 3 dny po ozáření.

Zbývajícím 10 myším na skupiny byl poskytnut transplantát 3 x 10⁴ buněk kostní dřeně od normálních, netransgenních dárců. Jelikož při ozáření nedochází k poškození jater, mohly by FLINT transgenní myši produkovat FLINT protein systemicky. Takováto dávka buněk kostní dřeně obvykle má za výsledek asi 50% přežití v 30. dnu u zvířat divokého typu, která byla ozářena, jak bylo popsáno shora. Získaných 50-100 μΐ krve po dílech v 7, 15, 21, a 30 dnu po transplaci bylo podrobeno hematologické analýze, aby se monitorovalo zotavování periferní krve (n = 10 myší na skupinu; celkem 20 myší) . Hematologická analýza zahrnuje počet bílých krvinek (WBC), červených krvinek (RBC), mikroskopii pro zjištění skvrn hematokritů a lymfocytů, neutrofilů, esinofilů, destiček, živných buněk a monocytů v krvi. Měření přežití a zotavení perifrních krevních buněk.

Je očekáváno, že vzhledem k tomu, že FLINT zabraňuje apoptóze a množí expandující progenitorové buňky a/nebo podporuje obnovu střevního epitelu po radiačně způsobeném poškození, budou v procentu přežití uvedených skupin, histologii epitelů a kostní dřeně a v obnově buněk periferní krve, mezi oběma skupinami rozdíly.

·· ···· ·· • · · * · · • · · · ·

C-Ochrana myši před chemoterapií

Tento experiment je navržen tak, aby ukazoval možnost podávání FLINT a GM-CSF pro podporu obnovy progenitorových buněk před myelosupresí, vyvolanou subletálním ozařováním a chemoterapií. Přesněji, tento experiment zkouší, zda se bílé krvinky lépe zotavují z kombinace chemoterapie a subletálního ozáření u FLINT transgenní myši. Například může jít o chemoterapii karboplatinem.

Aplikace 500 intraperitoneální transgenním a 15

Blood Cells 17: 193 (1991) 30 dnů a provede se cGY 4 hodinovým ozářením a jednou injekcí karboplatinu (1,2 mg/myš) 15 kontrolním myším. Tento postup vyvolá závažnou myelosupresí s prolongovanou trombocytopenií a těžkou anemií. Leonard et al., Blood, 83: 1499 (1994). Každý den po dobu 12 dnů, počínaje 24 hodin po ozáření, se injekčně vstříkne 10 pg/kg tělesné hmotnosti rekombinačního murinového rmGM-CSF i.p. pro podporu počtu bílých krvinek. Mayer et al., J. Inf. Deseases 163: 584 (1991), Gamba-Vitalo et al., 1991, . Krev se odebírá každých 7 dní do kompletní hematologická analýza.

Hematologická analýza zahrnuje počet bílých krvinek (WBC), červených krvinek (RBC), hematokritů a krevní mikroscopie na stanovení determine skvrn, počto lymfocytu, neutrofilů, eosinofilů, destiček, živných buněk a monocytů v krvi. 12. a 20. den se 3 myši z každé skupiny usmrtí. U těchto myší se analyzují buňky sleziny a kostní dřeně. Také kostní dřeň buněk se spojí a použije se k nastavení CFU testů, které mají za úkol stanovit výchozí zdrojové buňky (progenitorové buňky) .

Vliv D-FLINT na periferní mobilizaci progenitorových buněk.

• ·

Tento experiment ja navržen aby testoval periferní mobilizaci progenitorových buněk. K testování periferní mobilizace výchozích progenitorových buněk se ošetří FLINT transgenní a kontrolní myš 3 mg 5-FU i.p. a po 4 dnech se provedou buď CFU testy izolovaných buněk kostní dřeně, nebo se podává 100 ng GM-CSF i.p. každý den po dobu 3 dnů, načež se stanoví celularita kostní dřeně a obsah progenitoru pomocí testů CFU. Protokoly pro transplantaci jsou popsány shora v příkladu B. Aplikace genové terapie by mohla zlepšit zotavování progenitorových buněk po stimulaci s cytokiny buď in vivo nebo in vitro, pro transdukci retroviru, jak je posáno shora.

Claims (16)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY upravené

   1. Formulace upravená pro léčení poruchy jater, obsahující jako účinnou složku mFLINT, přičemž uvedená porucha je vybrána ze souboru, do kterého patří:

   a) akutní selhání jater;

   b) zánět jater;

   c) abnormální hepatocytová apoptóza; a

   d) hepatitida.
2. 2. Formulace upravená pro léčení poruchy, obsahující jako účinnou složku mFLINT, přičemž uvedená porucha je vybrána ze souboru, do kterého patří:

   a) ischemie spojená s poraněním;

   b) myokardová ischemie; a

   c) porucha, spojená s nadměrnou srážlivostí.
3. 3. Formulace podle nároku 2, dále obsahující přísadu, která je vybrána ze souboru, do kterého patří trombolytika a antitrombotika.
4. 4. Formulace podle nároku 3, kde přičemž uvedeným antitrombotikem je aktivovaný protein C.
5. 5. Formulace upravená pro léčení poruch, obsahujíc! jako účinnou složku mFLINT, přičemž uvedená porucha je vybrána ze souboru, do kterého patří:

   a) reperfúze spojená se zraněním;

   b) chemoterapeuticky nebo radiačně vyvolané krvácení necílové okolní tkáně.

   • · · · fc fcfc »» • · · · · • · *
6. 6. Formulace upravená pro léčené necílové okolní tkáně, podle nároku 5, přičemž uvedená tkáň je vybrána ze souboru, do kterého patří:

   a) kostní dřeň;

   b) střevní epitel;

   c) epitel ústní dutiny.
7. 7. Formulace obsahující jako účinnou složku mFLINT upravená pro použití, které je vybráno ze souboru, do kterého patří:

   a) podpora růstu nebo diferenciace krvetvorných progenitorových buněk;

   b) růstu nebo diferenciace a CD34 + buněk;

   c) léčení poškození buněk, způsobeného terapeutickým ozařováním nebo chemoterapií;

   d) léčení buněk střevního epitelu, poškozených terapeutickým ozařováním nebo chemoterapií;

   e) léčení krvetvorných progenitorových buněk, poškozených terapeutickým ozařováním nebo chemoterapií; a

   f) léčení buněk periferní krve, poškozených terapeutickým ozařováním nebo chemoterapií.
8. 8. Formulace upravená pro léčení chorob, obsahující jako účinnou látku mFLINT, přičemž uvedená choroba je vabrána ze souboru, do kterého patří:

   a) aplastická anemie; a

   b) pancytopenní stav.
9. 9. Použití mFLINT k přípravě farmaceutického prostředku pro léčení poruchy jater, přičemž uvedená porucha je vybrána ze souboru, do kterého patří:

   a) akutní selhání jater;

   b) zánět jater;

   • to to·*·

   c) abnormální hepatocytová apoptóza; a

   d) hepatitida.
10. 10. Použití mFLINT k přípravě farmaceutického prostředku pro léčení poruchy, přičemž uvedená porucha je vybrána ze souboru, do kterého patří:

    a) ischemie-spojená s poškozením nebo poruchou;

    b) myokardová ischemie; a

    c) porucha, spojená s nadměrnou srážlivostí.
11. 11. Použití podle nároku 10, přičemž uvedený prostředek dále obsahuje činidlo, které je vybráno ze souboru, do kterého patří trombolytika a antitrombotika.
12. 12. Použití podle nároku 11, přičemž uvedeným antitrombotikem aktivovaný protein C.
13. 13. Použití mFLINT k přípravě farmaceutického prostředku pro léčení poruchy, která je vybrána ze souboru, do kterého patří:

    a) reperfúze-spojená s poraněním nebo poruchou; a

    b) chemoterapeuticky nebo radiačně způsobené poškozenínecílové okolní tkáně.
14. 14. Použiti mFLINT podle nároku 13, přičemž uvedená necílová okolní tkáň je vybrána ze souboru, do kterého patří:

    a) kostní dřeň;

    b) střevní epitel; a

    c) epitel ústní dutiny.
15. 15. Použití mFLINT k přípravě farmaceutického prostředku pro účely, které jsou vybrány ze souboru, do kterého patří:

    ♦ · » · · · «I

    a) podpora růstu nebo diferenciace krvetvorných progenitorových buněk;

    b) růstu nebo diferenciace a CD34 + buněk;

    c) léčení poškození buněk, způsobeného terapeutickým ozařováním nebo chemoterapií;

    d) léčení buněk střevního epitelu, poškozených terapeutickým ozařováním nebo chemoterapie;

    e) léčení krvetvorných progenitorových buněk, poškozených terapeutickým ozařováním nebo chemoterapií; a

    f) léčení buněk periferní krve, poškozených terapeutickým ozařováním nebo chemoterapií.
16. 16. Použití mFLINT k přípravě farmaceutického prostředku pro léčení poruchy, která je vybrána ze souboru, do kterého patří

    a) aplastická anemie; a

    b) pancytopenní stav.