CN102671186B - 促造血的药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种促造血的药物组合物及其应用，所述药物组合物中包含有细胞因子LIGHT；本发明首次成功的应用细胞因子LIGHT促进体内造血，提供了细胞因子LIGHT的新用途，可用于开发能够促进造血同时又能够抑制肿瘤细胞增殖的新型细胞因子和药物，对于促进临床肿瘤放化疗患者造血功能恢复，提高肿瘤治愈率，降低感染发生率，肿瘤复发率和死亡率具有重大意义，实现本发明的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种促造血的药物组合物及其应用，特别涉及一种促进以粒系为主的造血细胞增殖分化，同时又能够抑制肿瘤细胞生长的促造血的药物组合物及其应用。
背景技术
肿瘤坏死因子超家族包括将近19个成员，例如APRIL、BAFF、CD27L、CD30L、CD40L、LIGHT、TNF-α和TRAIL等等；肿瘤坏死因子受体超家族包括27个成员。肿瘤坏死因子超家族成员的生物学作用主要包括：参与免疫系统的发育、功能调节和维持；参与炎症反应；参与造血调控及参与调节骨代谢。
细胞因子LIGHT基因于1995年被鉴定为肿瘤坏死因子超家族成员。1998年，LIGHT CDNA被成功克隆并且LIGHT蛋白被确认为肿瘤坏死因子受体超家族成员TR2/HVEM和LT-βR的配体。就其细胞学分布而言，LIGHT蛋白主要表达于激活的T细胞、不成熟树突状细胞、粒细胞、单核细胞、激活的NK细胞和血小板；HVEM主要表达于T细胞，B、NK、DC和髓系细胞也有HVEM表达；LT-βR广泛表达于肝细胞、胃肠道上皮细胞、淋巴组织基质细胞、单核细胞和树突状细胞，而成熟淋巴细胞缺乏LT-βR表达。就其组织学分布而言，LIGHT蛋白在脾脏高表达，在淋巴结、心脏、胎盘、肝脏、肺脏、阑尾和肾脏低表达；HVEM主要在肺脏、肝脏和肾脏表达，脑部有低表达。LT-βR在肺脏、肝脏和肾脏高表达，在淋巴结、心脏、脾脏和睾丸低表达。
目前，细胞因子LIGHT已知的生物学功能主要在于免疫调控作用，如诱导树突状细胞成熟及T细胞激活过程中的辅助刺激等。此外，细胞因子LIGHT可诱导某些类型的肿瘤细胞凋亡以及B型慢性淋巴细胞白血病细胞凋亡，并可通过增强免疫反应抑制肿瘤生长。细胞因子LIGHT亦是一种促炎因子，细胞因子LIGHT可诱导血管内皮细胞上表达粘附分子和趋化因子，并可促进血液中的单核细胞和树突状细胞迁移。
当前细胞因子LIGHT的研究主要集中在外周血终末分化成熟细胞，因而对其功能的了解也主要局限于与外周血终末分化成熟细胞相关的免疫调节和炎症反应，而有关细胞因子LIGHT对干细胞的调控作用以及与之相关的生物学功能却知之甚少。最近发现细胞因子LIGHT能够促进胚胎干细胞分化，然而，细胞因子LIGHT对成体干细胞，尤其是对造血干细胞的生物学作用尚不清楚，从而限制了该因子在临床医学中的应用。
肿瘤坏死因子(TNF-α)体外可以抑制造血干细胞向早幼红系祖细胞和粒系单核系祖细胞分化，体内可抑制晚期红系造血。TNF-α可以抑制多种生长因子刺激下的造血干、祖细胞的增殖，并抑制循环造血干细胞的稳定，毒副作用很大。从TNF-α和细胞因子LIGHT之间的关系分析，细胞因子LIGHT很可能也具有调控造血的作用。现有的实验认为，细胞因子LIGHT在体内体外均可以促进粒系为主的小鼠造血细胞的增殖和分化。
目前肿瘤发病率日益增高，临床上主要采用放疗、化疗治疗恶性肿瘤，但其伴有的严重副作用，如骨髓抑制或损伤，会造成造血功能低下，白细胞减少和免疫力下降，从而限制了放化疗剂量的提高和疗效；所以促进肿瘤患者造血功能恢复，对于提高肿瘤治愈率，降低感染发生率，肿瘤复发率和死亡率非常关键。临床上主要应用重组人粒系集落刺激因子(rhG-CSF)和/或重组人粒单系集落刺激因子(rhGM-CSF)促进造血功能的恢复，但是rhG-CSF和rhGM-CSF也可以刺激残余的肿瘤细胞增殖，增加肿瘤的复发率。
因此，特别需要能够促进造血同时又能够抑制肿瘤细胞增殖的新型细胞因子和药物，已解决上述现有存在的问题。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种促造血的药物组合物及其应用，促进以粒系为主的造血细胞增殖分化，而同时又能够抑制肿瘤细胞生长。
本发明的第二个目的在于提供一种通过上述促造血的药物组合物中促造血细胞因子进行促进粒单系祖细胞生长的方法。
本发明的第三个目的在于提供一种应用MOFLO XDP系统从骨髓单个核细胞中分离造血干细胞、共同髓系祖细胞(CMP)和粒-单系祖细胞(GMP)的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一方面，提供了一种促造血的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含有细胞因子LIGHT。
在本发明的一个实施例中，细胞因子LIGHT通过结合造血干、祖细胞表面的LIGHT受体HVEM和LT-βR，上调髓系转录因子PU.1，促进GM-CSF和GM-CSFR表达。
本发明的第二方面，提供了一种通过上述促造血的药物组合物中促造血细胞因子进行促进粒单系祖细胞生长的方法，其特征在于，进行体外促进粒单系祖细胞生长的方法包括如下步骤：在适合粒单系祖细胞生长的甲基纤维素培养基中培养粒单系祖细胞，所述的培养基含有100ng/ml的细胞因子LIGHT。
在本发明的一个实施例中，进行体外促进粒单系祖细胞生长的方法包括如下步骤：注射包含细胞因子LIGHT的促造血的药物组合物。
在本发明的一个实施例中，细胞因子LIGHT溶解于0.1％的BSA溶液/盐水。
本发明的第三方面，提供了一种应用MOFLO XDP系统从骨髓单个核细胞中分离造血干细胞、共同髓系祖细胞(CMP)和粒-单系祖细胞(GMP)的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
步骤一、分离骨髓单个核细胞，并重悬于含2％FCS的PBS溶液中；
步骤二、加入适量FCS，冰浴封闭15分钟；
步骤三、取8只FALCON管，其中1只为同型对照染色管，6只为单染管，最后1只为分选细胞管，加入6种荧光标记的抗体：FITC-conjugated Lineage antibody Cocktail(BioLegend，San Diego，USA)；PerCP/Cy5.5-conjugated Sca-1 antibody(BioLegend，San Diego，USA)；APC-conjugated c-kit antibody(BioLegend，San Diego，USA)；PE/Cy7-conjugated IL-7Rαantibody(BioLegend，San Diego，USA)；V450-conjugated FcγR III/II antibody(BD HorizonTM)；Alexa 700-conjugated CD34 antibody(eBioscience，San Diego，USA)；同型对照染色管加入6种相对应的同型对照抗体，6只单染管分别加入其中一种荧光标记抗体和其余5种同型对照抗体，涡旋振荡器混匀，冰浴避光染色15分钟；
步骤四、用含有2mM EDTA的2％FCS/PBS溶液洗涤、离心、去上清，重悬于2％FCS/PBS溶液中，上Moflo XDP cell sorter分选，设定Lin-Sca-1+c-kit+细胞群为HSC，IL-7Rα-Lin-Sca-1-c-kit+CD34+FcγRlow细胞群为CMP，IL-7Rα-Lin-Sca-1-c-kit+CD34+FcγRhi细胞群为GMP。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明首次成功的应用细胞因子LIGHT促进体内造血，提供了细胞因子LIGHT的新用途，可用于开发能够促进造血同时又能够抑制肿瘤细胞增殖的新型细胞因子和药物，对于促进临床肿瘤放化疗患者造血功能恢复，提高肿瘤治愈率，降低感染发生率，肿瘤复发率和死亡率具有重大意义。
此外，本发明还首次成功的应用美国Beckman公司的新型MOFLO XDP系统从骨髓单个核细胞中一步法分离出造血干细胞、共同髓系祖细胞(CMP)和粒-单系祖细胞(GMP)；相较于之前应用免疫磁珠联合BD公司的流式细胞分选仪两步法分离造血干、祖细胞，大大节省了时间和试剂成本，提高了细胞的活性和得率，并且降低了细胞污染的风险。本发明的方法简便，成本低廉，可操作性强。
本发明的特点可参阅本案图式及以下较好实施方式的详细说明而获得清楚地了解。
附图说明
图1为小鼠造血干细胞表达LIGHT受体HVEM和LT-βR的示意图；
图2为LIGHT体外促进粒单系祖细胞集落(CFU-GM)生长的示意图；
图3为LIGHT促进BMMNC和造血干细胞表达GM-CSF和GM-CSFR的示意图；
图4为LIGHT上调BMMNC和造血干细胞表达PU.1的示意图；
图5为应用MOFLO XDP系统从小鼠骨髓单个核细胞中一步法分离出共同髓系祖细胞(CMP)和粒单系祖细胞(GMP)的示意图；
图6为共同髓系祖细胞(CMP)和粒单系祖细胞(GMP)表达HVEM的示意图；
图7为共同髓系祖细胞(CMP)和粒单系祖细胞(GMP)表达LT-βR的示意图；
图8为LIGHT轻度抑制共同髓系祖细胞(CMP)和粒单系祖细胞(GMP)终末髓细分化的示意图；
图9为LIGHT促进小鼠体内粒单系祖细胞集落(CFU-GM)生长并上调血清中GM-CSF水平的示意图；
图10为LIGHT抑制SDF1诱导的造血干细胞迁移的示意图；
图11为LIGHT促进CMP表达GM-CSF和PU.1的示意图；
图12为LIGHT抑制GMP表达GM-CSF并轻度上调GM-CSFR和PU.1表达的示意图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。
本发明的第一方面，提供了一种促造血的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中包含有细胞因子LIGHT。
在本发明中，细胞因子LIGHT通过结合造血干、祖细胞表面的LIGHT受体HVEM和LT-βR，上调髓系转录因子PU.1，促进GM-CSF和GM-CSFR表达。
本发明的第二方面，提供了一种通过上述促造血的药物组合物中促造血细胞因子进行促进粒单系祖细胞生长的方法，其特征在于，进行体外促进粒单系祖细胞生长的方法包括如下步骤：在适合粒单系祖细胞生长的甲基纤维素培养基中培养粒单系祖细胞，所述的培养基含有100ng/ml的细胞因子LIGHT。
在本发明中，进行体外促进粒单系祖细胞生长的方法包括如下步骤：注射包含细胞因子LIGHT的促造血的药物组合物。
在本发明中，细胞因子LIGHT溶解于0.1％的BSA溶液/盐水。
本发明的第三方面，提供了一种应用MOFLO XDP系统从骨髓单个核细胞中分离造血干细胞、共同髓系祖细胞(CMP)和粒-单系祖细胞(GMP)的方法，其特征在于，它包括如下步骤：
步骤一、分离骨髓单个核细胞，并重悬于含2％FCS的PBS溶液中；
步骤二、加入适量FCS，冰浴封闭15分钟；
步骤三、取8只FALCON管，其中1只为同型对照染色管，6只为单染管，最后1只为分选细胞管，加入6种荧光标记的抗体：FITC-conjugated Lineage antibody Cocktail(BioLegend，San Diego，USA)；PerCP/Cy5.5-conjugated Sca-1 antibody(BioLegend，San Diego，USA)；APC-conugated c-kit antibody(BioLegend，San Diego，USA)；PE/Cy7-conjugated IL-7Rαantibody(BioLegend，San Diego，USA)；V450-conjugated FcγR III/II antibody(BD HorizonTM)；Alexa 700-conjugated CD34antibody(eBioscience，San Diego，USA)；同型对照染色管加入6种相对应的同型对照抗体，6只单染管分别加入其中一种荧光标记抗体和其余5种同型对照抗体，涡旋振荡器混匀，冰浴避光染色15分钟；
步骤四、用含有2mM EDTA的2％FCS/PBS溶液洗涤、离心、去上清，重悬于2％FCS/PBS溶液中，上Moflo XDP cell sorter分选，设定Lin-Sca-1+c-kit+细胞群为HSC，IL-7Rα-Lin-Sca-1-c-kit+CD34+FcγRlow细胞群为CMP，IL-7Rα-Lin-Sca-1-c-kit+CD34+FcγRhi细胞群为GMP。
实施例1
细胞因子LIGHT对正常小鼠造血系统的作用
步骤一、将6周雄性BALB/c小鼠分为实验组(3只)和对照组(3只)，分别予以每天一次尾静脉注射1mg/kg细胞因子LIGHT(溶解于0.1％BSA溶液/盐水)，或相同剂量的0.1％BSA溶液/盐水，连续注射12天；
步骤二、最后一次注射完毕72小时后，用眼眶取血法收集每只小鼠外周血约1ml于含有肝素的抗凝管中，取0.5ml作血细胞计数，剩余0.5ml于室温静置1个小时，3000RPM 5分钟，收集300微升上清(即血清)，-80度冻存备用，以待用GM-CSF ELISA试剂盒(Biolegend)检测血清GM-CSF水平；
步骤三、颈椎脱臼法处死小鼠，分别分离每只小鼠的骨髓单个核细胞，洗涤，离心，并重悬于含2％FCS的IMDM中，调整细胞浓度为2×105/ml；
步骤四、取100微升上述2×105/ml细胞悬液和1ml添加了多种重组细胞因子的甲基纤维素培养基(MethoCult 3434；StemCellTechnologies，Vancouver，BC)混匀，接种至6孔培养板中，每只小鼠的单个核细胞接种2个复孔；
步骤五、37℃5％CO2培养箱中培养12天以后于倒置显微镜下计数造血集落。
实施例2
细胞因子LIGHT的体外促造血活性
步骤一、颈椎脱臼法处死C57小鼠，分离每只小鼠的骨髓单个核细胞，洗涤，离心，并重悬于含2％FCS的IMDM中，调整细胞浓度为2×105/ml；
步骤二、在6孔板孔底部预先加入1000×工作浓度的细胞因子LIGHT(溶解于0.1％BSA/PBS溶液)，即2微克/毫升的细胞因子LIGHT、20微克/毫升的细胞因子LIGHT和100微克/毫升的细胞因子LIGHT，或相同体积的0.1％BSA/PBS溶液，取100微升上述2×105/ml骨髓单个核细胞悬液和1ml添加了多种重组细胞因子的甲基纤维素培养基(MethoCult 3434；StemCell Technologies，Vancouver，BC)混匀，接种至6孔培养板中，每个处理组接种2个复孔；
步骤三、37℃5％CO2培养箱中培养12天以后于倒置显微镜下计数造血集落。
实施例3
应用MOFLO XDP从小鼠骨髓单个核细胞中分离造血干细胞、共同髓系祖细(CMP)和粒-单系祖细胞(GMP)
步骤一、颈椎脱臼法处死6-12周雄性C57小鼠一只，分离骨髓单个核细胞，洗涤，离心，可得到大约1×108单个核细胞，并重悬于1毫升含2％FCS的PBS溶液中；
步骤二、加入100微升FCS，涡旋振荡器混匀，冰浴封闭15分钟；
步骤三、取8只FALCON管，其中1只为同型对照染色管，6只为单染管，每管中分别加入2×105单个核细胞，体积调整为100微升。剩余细胞全部放入最后1只分选细胞管，体积调整为1毫升，分别加入6种荧光标记的抗体：FITC-conjugated Lineage antibodyCocktail(BioLegend，San Diego，USA)200微升；PerCP/Cy5.5-conjugated Sca-1 antibody(BioLegend，San Diego，USA)10微升；APC-conjugated c-kit antibody(BioLegend，San Diego，USA)50微升；PE/Cy7-conjugated IL-7Rαantibody(BioLegend，San Diego，USA)50微升；V450-conjugated FcγR III/II antibody(BD HorizonTM)50微升；Alexa700-conjugated CD34 antibody(eBioscience，SanDiego，USA)50微升；同型对照染色管加入6种相对应的同型对照抗体，6只单染管分别加入其中一种荧光标记抗体和其余5种同型对照抗体，涡旋振荡器混匀，冰浴避光染色15分钟；
步骤四、用含有2mM EDTA的2％FCS/PBS溶液洗涤，离心，去上清，重悬于2％FCS/PBS中，上三色激光(405-nm，488-nm，and633-nm laser)Moflo XDP cell sorter(Beckman Coulter Inc，Brea，USA)分选，先用同型对照染色管和6只单染管设定补偿，设门，设定Lin-Sca-1+c-kit+细胞群为HSC，IL-7Rα-Lin-Sca-1-c-kit+CD34+FcγRlow细胞群为CMP，IL-7Rα-Lin-Sca-1-c-kit+CD34+FcγRhi细胞群为GMP。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (1)
1.一种体外促进粒单系祖细胞生长的方法，其特征在于，包括如下步骤：在适合粒单系祖细胞生长的甲基纤维素培养基中培养粒单系祖细胞，所述的培养基含有100ng/ml的细胞因子LIGHT；细胞因子LIGHT溶解于0.1%的BSA溶液/盐水。
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