JP2022551169A - ロイシンリッチな抗癌ペプチドおよびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、癌治療に使用するための薬学的に許容される組成物に関し、その組成物がモチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有する一つまたは複数のペプチドを含み、ここでｘはアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）、および一つまたは複数の薬学的に許容される添加剤から独立に選択される。本発明はまた、薬学的に許容される組成物、薬学的に許容される組成物を含むキット、そのペプチドをコードするヌクレオチドおよびそのペプチドを発現するベクターに関する。

Description

本発明の分野
本発明は、癌治療に使用することができる抗癌ぺプチド（ＡＣＰｓ）ファミリーに関する。

本発明の背景
腫瘍は細胞レベルで異質であり、異なるサブタイプの癌細胞から構成されている。これらのサブタイプのうち、癌幹細胞（ＣＳＣｓ）は、現在の抗癌剤を使用した従来の薬物治療において大きな障害となることがますます認識されている。乳癌は世界で２番目に多い癌であり、およびそのほとんどが女性に発生する。いくつかの研究は、乳癌幹細胞は従来の抗癌剤に対して耐性を獲得し、生存、自己複製、分化、および再発することがあることを示している。^1-6ＣＳＣｓは抗癌剤に対して容易に耐性を獲得し、固形癌に対する化学療法は、典型的に患者さんにおける薬剤耐性ＣＳＣｓの割合を著しく増加させる結果となる。これは、再発および転移形成をもたらし得る。さらに、乳房の腫瘍は同じ患者内で異なることがあり、および従来の抗癌剤が効かないこともある。^7-9ドキソルビシンなどの一般的に使用される抗癌剤は、健康な組織に対する毒性が一般的に高く、肝臓、腎臓、および心臓などの臓器に急性障害をもたらすため、高用量での治療は困難である。^10-12それゆえ、癌細胞に対する選択性を向上させ、固形癌中の大部分の癌およびＣＳＣｓをすべて死滅させるのに十分な用量で、健康な組織を傷つけずに済む新しい抗癌剤の開発が急務であり、アンメットニーズである。

本発明の概要
本発明の第一の態様において、癌治療に使用するための薬学的に許容される組成物であって、モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有する一つまたは複数のペプチドを含む組成物が提供され、ここで各ｘはアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）、および一つまたは複数の薬学的に許容される添加剤から独立に選択される、

本発明の詳細な説明
本発明はこれから、以下の図を参照しながら実施例によってのみ詳細に説明されることになる。

図１は、コンビナトリアルロイシンリッチペプチドライブラリーの設計および、他のポア形成性および癌標的膜活性ペプチドとの比較である。Ａ）コンビナトリアルペプチドライブラリーの配列を、膜活性コンフォメーションと推定されるヘリカルホイールへのそれらの投影とともに示す。Ｂ）ライブラリーペプチドの等電点および疎水性を他のポア形成性および癌標的膜活性ペプチドと比較した。抗菌ペプチドデータベース（ＡＰＤ）、メリチンおよびそのアナログ（機能獲得型および機能喪失型アナログ）、ｐＨ依存性メリチン、および癌標的低ｐＨインサーションペプチド（ｐＨＬＩＰ）における２６個のアミノ酸を含むペプチドである。

図２は、癌組織および健常人組織の両方に由来する異なるヒト細胞株に対する３６個のコンビナトリアルペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６）からなる、現在同定されている配列のライブラリーのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性スクリーニングの結果を示す。また、選択されたＤ体ペプチド、ならびに臨床的に使用されている抗癌剤であるサリノマイシンおよびドキソルビシンに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性スクリーニングの結果も示す。細胞毒性は、Ａ）ＨＭＬＥＲ対ＭＣＦ－１０Ａ、Ｂ）ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ対ＭＣＦ－１０Ａ、Ｃ）ＨＭＬＥＲ対ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ、Ｄ）ＨＭＬＥＲ対ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｅ）ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ対ＨＥＫ２９３Ｔ、およびＦ）Ｕ２ＯＳ対ＨＥＫ２９３Ｔについて、異なるヒト細胞株で評価され、および半数最大阻害濃度（ＩＣ₅₀）を使用して定量化されている。

図３は、臨床的に使用されている２つの抗癌剤であるドキソルビシンおよびサリノマイシンと、２つの選択されたＤ体抗癌ペプチド（Ｄ体ＤＥＫ、およびＤ体ＥＥＫ）、および異なるヒト細胞株、例えば、ＨＭＬＥＲ（三角）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ひし形）、ＭＣＦ－１０Ａ（実線）、Ｕ２ＯＳ（四角）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（点線）に対する３６のロイシンリッチ抗癌ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性用量反応を示す。 図３は、臨床的に使用されている２つの抗癌剤であるドキソルビシンおよびサリノマイシンと、２つの選択されたＤ体抗癌ペプチド（Ｄ体ＤＥＫ、およびＤ体ＥＥＫ）、および異なるヒト細胞株、例えば、ＨＭＬＥＲ（三角）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ひし形）、ＭＣＦ－１０Ａ（実線）、Ｕ２ＯＳ（四角）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（点線）に対する３６のロイシンリッチ抗癌ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性用量反応を示す。 図３は、臨床的に使用されている２つの抗癌剤であるドキソルビシンおよびサリノマイシンと、２つの選択されたＤ体抗癌ペプチド（Ｄ体ＤＥＫ、およびＤ体ＥＥＫ）、および異なるヒト細胞株、例えば、ＨＭＬＥＲ（三角）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ひし形）、ＭＣＦ－１０Ａ（実線）、Ｕ２ＯＳ（四角）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（点線）に対する３６のロイシンリッチ抗癌ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性用量反応を示す。 図３は、臨床的に使用されている２つの抗癌剤であるドキソルビシンおよびサリノマイシンと、２つの選択されたＤ体抗癌ペプチド（Ｄ体ＤＥＫ、およびＤ体ＥＥＫ）、および異なるヒト細胞株、例えば、ＨＭＬＥＲ（三角）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ひし形）、ＭＣＦ－１０Ａ（実線）、Ｕ２ＯＳ（四角）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（点線）に対する３６のロイシンリッチ抗癌ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性用量反応を示す。 図３は、臨床的に使用されている２つの抗癌剤であるドキソルビシンおよびサリノマイシンと、２つの選択されたＤ体抗癌ペプチド（Ｄ体ＤＥＫ、およびＤ体ＥＥＫ）、および異なるヒト細胞株、例えば、ＨＭＬＥＲ（三角）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ひし形）、ＭＣＦ－１０Ａ（実線）、Ｕ２ＯＳ（四角）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（点線）に対する３６のロイシンリッチ抗癌ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性用量反応を示す。 図３は、臨床的に使用されている２つの抗癌剤であるドキソルビシンおよびサリノマイシンと、２つの選択されたＤ体抗癌ペプチド（Ｄ体ＤＥＫ、およびＤ体ＥＥＫ）、および異なるヒト細胞株、例えば、ＨＭＬＥＲ（三角）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ひし形）、ＭＣＦ－１０Ａ（実線）、Ｕ２ＯＳ（四角）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（点線）に対する３６のロイシンリッチ抗癌ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性用量反応を示す。 図３は、臨床的に使用されている２つの抗癌剤であるドキソルビシンおよびサリノマイシンと、２つの選択されたＤ体抗癌ペプチド（Ｄ体ＤＥＫ、およびＤ体ＥＥＫ）、および異なるヒト細胞株、例えば、ＨＭＬＥＲ（三角）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ひし形）、ＭＣＦ－１０Ａ（実線）、Ｕ２ＯＳ（四角）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（点線）に対する３６のロイシンリッチ抗癌ペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性用量反応を示す。

図４は、ドキソルビシン（塗りつぶし四角）、サリノマイシン（塗りつぶし三角）およびロイシンリッチ抗癌ペプチドＬ体ＥＥＥ（四角）、Ｌ体ＤＥＫ（丸）、Ｌ体ＥＥＫ（灰色の丸）およびＤ体ＥＥＫ（黒丸）の腫瘍スフェア（ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞）ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性および用量反応性を示す。Ａ）細胞生存率は、腫瘍細胞（ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ）マンモスフェアに対する抗癌剤の効力を定量化するために測定された。Ｂ）選択された抗癌剤化合物による処理後のマンモスフェア集団。破線は、処理無しで予想されるネガティブコントロールを示す。 Ｃ）各抗癌剤のＩＣ₅₀（灰色のバー）およびＩＣ₉₀（黒色のバー）の測定値および、特定の濃度でのマンモスフェアの光学顕微鏡画像。スケールバーは１００μｍである。

図５は、ドキソルビシン（塗りつぶし四角）、サリノマイシン（塗りつぶし三角）、およびロイシンリッチベースの抗癌ペプチドＬ体ＥＥＥ（四角）、Ｌ体ＤＥＫ（丸）、Ｌ体ＥＥＫ（灰色の丸）およびＤ体ＥＥＫ（黒丸）のマンモスフェア（ＭＣＡ－１０Ａ細胞）ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性および用量反応性を示す。細胞生存率は、健常ヒト乳房内皮細胞（ＭＣＡ－１０Ａ）マンモスフェアに対する抗癌剤の効力を定量化するために測定された。Ｂ）選択された抗癌剤化合物で処理した後のマンモスフェア集団。破線は、任意の処理無しのネガティブコントロールを示す。 Ｃ）各抗癌剤のＩＣ₅₀（実線バー）およびＩＣ₉₀（バー）の測定値および、特定濃度におけるマンモスフェアの光学顕微鏡画像。スケールバーは１００μｍである。

図６は、異なるヒト細胞株：ＨＭＬＥＲ（丸）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（灰色の塗りつぶし丸）、Ｕ２ＯＳ（四角）、ＭＣＦ－１０Ａ（黒の塗りつぶし丸）、およびＨＥＫ２９３Ｔ（三角）に対するドキソルビシン、サリノマイシン、Ｌ体ＥＥＫ、およびＤ体ＥＥＫのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性および用量反応性を示す。網掛け部分は、癌細胞株に対して細胞選択性を有し、正常細胞株（ＭＣＦ－１０Ａ、およびＨＥＫ２９３Ｔ）には影響が少ない理想的な化合物濃度を示す。

図７は、トリプトファン蛍光結合アッセイの結果を示す。単一脂質種ＰＯＰＣリポソーム（丸）、または混合脂質種ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧ（比率３：１、四角）リポソームのいずれかにペプチドの５０％が結合する脂質濃度を示す。簡単に説明すると、５０μＭのペプチドを固定し、リン酸緩衝生理食塩水（１Ｘ、ｐＨ７．４）中で０、１２．５、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、および５０００μＭの濃度の滴定ＰＯＰＣベシクル（黒）または３ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧベシクル（灰色）と共にインキュベートされた。５０％のペプチド結合を引き起こす脂質濃度をトリプトファン蛍光結合アッセイを使用して測定し、その値をペプチド当たりの脂質として示した。このデータは、本発明のペプチドが中性ベシクル（ＰＯＰＣ）および荷電ベシクル（ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ）を区別できることを示し、後者は癌細胞のモデルとして機能する（Ｗａｒｂｕｒｇ効果）。

図８は、リポソームからＡＮＴＳ／ＤＰＸ色素の５０％漏出を引き起こすペプチド濃度を示す。簡単に説明すると、０．５ｍＭ ＰＯＰＣベシクル（灰色）またはＰＯＰＣ：ＰＯＰＧベシクル（比率３：１、黒色）を、０、０．０２、０．０４、０．０８、０．１６、０．３２、０．６４、１．２５、２．５、５、１０、および２０μＭのペプチド濃度でインキュベートした。Ａ）塩酸調整リン酸緩衝食塩水（１Ｘ，ｐＨ４．８）および Ｂ）リン酸緩衝食塩水（１Ｘ，ｐＨ７．４）。ペプチドによる色素漏出の強さは、ペプチド当たりの脂質数で報告されている（高い値は、脂質膜を破壊するのにより強力なペプチドを意味する）。

図９は、ロイシンリッチＡＣＰｓの作用メカニズムを示す。Ａ）Ｌ体ＥＥＫ（黒三角形）およびＤ体ＥＥＫ（灰色の三角形）のヒト赤血球に対する溶血活性。Ｂ）滴定ペプチド濃度でＨｅＬａ細胞株へのペプチドによる高親和性核酸染色（ＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎ）の侵入：Ｌ体ＥＥＫ（黒三角形）、Ｄ体ＥＥＫ（灰色の三角形）、およびポジティブコントロールとしてメリチン（四角形）。Ｃ）ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ヒト乳腺内皮癌幹細胞）のＬ体ＥＥＫ（黒丸）およびＤ体ＥＥＫ（灰色丸）存在下で、ネクロスタチン（ネクロプトーシス阻害剤）およびＺＶＡＤ－ＦＭＫ（アポトーシス阻害剤）とともに共インキュベートしたときの細胞生存率。Ｄ）ドキソルビシン（丸）、およびドキソルビシンと５μＭのカパーゼ阻害剤ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫの併用（四角）、およびドキソルビシンと２０μＭのネクロスタチン－１の併用（三角）で処理したＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞の生存率。

図１０は、本発明のＡＣＰと銅系低分子抗癌剤とのコンジュゲーションの合成戦略を示す。

図１１は、ＡＣＰｓ膜のポア構造および膜の穿孔メカニズムを原子レベルで詳細に示す。分子動力学シミュレーションにより、ａ，ＡＣＰ膜の自発的吸着、ｂ，挿入、およびｃ，ポアの形成（大型で不均一、完全に水で満たされたＥＥＫポアを示す）、ｄ，ｅ結合ペプチドは２～１６のペプチド（上）の一過性のポアのアンサンブルを形成し、水（中）およびイオン（下）の両方を膜越しに伝導する。

発明者らは、驚くべきことに、請求項に記載の処方に準拠したペプチドファミリーは、癌細胞に対する選択性が向上し、固形腫瘍における大部分の癌およびＣＳＣｓをすべて死滅させるのに十分な用量で健常組織を無傷のまま残すことを発見した。従来の多くの抗癌剤とは異なり、本発明で開発されたポア形成性膜活性ペプチドは、癌細胞を殺すために細胞膜を標的とし、および破壊する。これは、細胞質内に薬剤を輸送しなければならないという煩雑さがなく、したがってそのペプチドは伝統的な化学療法薬と比較して腫瘍への浸透性が向上する。本特許請求の範囲に記載されたペプチドは、癌細胞の細胞膜に選択的に作用し、そこにポアを形成することにより、それらの電気化学的勾配を短絡させて癌細胞を死滅させるものである。理論にとらわれることを望まずに、癌細胞膜の脂質組成および化学的微小環境を直接標的にすることができると考えられる。その結果、ペプチドは、腫瘍細胞がそれらの脂質組成を修飾することが困難であるため、（細胞が洗剤に対して耐性を獲得することが困難であるのと同様に）耐性を誘発しそうになることがほとんどない^13-15。

開示されたペプチドのいくつかは、大部分の癌およびＣＳＣｓに対してナノモル活性を有し、サリノマイシンなどの現在承認されている抗癌剤に匹敵する。さらに、細胞を球状の塊に成長させることによって実際の固形腫瘍を模倣する、現在最も優れたｉｎ ｖｉｔｒｏ乳癌モデルの一つである、マンモスフェアモデルにおいて、本明細書に開示されたいくつかのペプチドは、正常で、健常な細胞に対する毒性を抑えながら、癌細胞に対しては優れた活性を示す。

ペプチドは、ＬおよびＤ体の両方のアミノ酸形態（後者はプロテアーゼ分解にするｉｎ ｖｉｖｏ安定性が主な利点である）で作用し、非常に低いマイクロモーラー、およびいくつかの例ではナノモーラーで、二次元的に増殖した癌細胞、ならびに三次元的に培養した癌細胞培養（スフェロイド）を選択的に排除する。ヒトの非癌性乳房および腎臓細胞に損傷を与えるには、３～２００倍以上の濃度が必要である。

ペプチドは安価かつ合成が簡便であり、修飾およびハイスループットスクリーニングが容易であり、および癌細胞を特異的に標的にするための化学および構造レパートリーを提示する。

本特許請求の範囲のペプチドは、現存のペプチドデータベースと比較することにより確認できるように、ｄｅ ｎｏｖｏで設計されたものであり、および天然のアナログは知られていない。このタイプの短いフレキシブルペプチドは低い免疫原性を有することになり、したがって薬学応用に適している。

本明細書で記載されるように、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合、すなわちペプチドイソスターにより互いに結合しているアミノ酸を含む任意のペプチドを指す。そのペプチドは一般的には天然に生じるアミノ酸を含むことになるが、翻訳後のプロセスなどの天然のプロセス、または当業者に周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾されたアミノ酸配列を含み得る。かかる修飾は基本的な教科書によく記載されている。修飾はペプチド骨格、アミノ酸側鎖およびそのアミノまたはカルボキシ末端を含む、ペプチドのどこにでも生じ得る。同じ種類の修飾が、所定のペプチドのいくつかの部位に、同じまたは様々な程度で存在し得ることを理解されることになる。また、所定のペプチドは多くの種類の修飾を含み得る。

好ましくは、そのペプチドは単離されたペプチドである。「単離された」という用語は、ペプチドがそのもともとの環境から取り除かれることを意味する。例えば、生存動物内に存在するペプチドは単離されていないが、自然界に共存する物質のいくつかまたは全てから分離した同じペプチド、またはかかるペプチドのフラグメントは、単離されている。かかるペプチドはベクターの一部であることができ、および／またはペプチドは組成物の一部であることができるが、かかるベクターまたは組成物の一部はその自然環境の一部ではないという点で依然として単離されている。

ペプチドを含む医薬組成物は、ヒトおよび獣医学において、ヒトまたは動物に使用するためのものであることができ、および一つまたは複数の適切な添加剤を典型的に含むことになる。治療用途のための許容される添加剤は、医薬業界で周知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)に記載されている。医薬添加剤の選択は、意図された投与経路および標準的な薬務を考慮して選択されることができる。医薬組成物は、添加剤として、またはそれに加えて、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁化剤、コーティング剤または可溶化剤を含んでもよい。

防腐剤、安定化剤および色素が医薬組成物において提供され得る。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステルを含む。酸化防止剤および懸濁化剤も使用され得る。

医薬組成物はまた、寛容促進アジュバント（tolerance-promoting adjuvants）および／または寛容促進細胞（tolerance promoting cells）も含み得る。寛容促進アジュバントには、ＩＬ－１０、リコンビナントコレラ毒素Ｂサブユニット（ｒＣＴＢ）、Ｔｏｌｌ様受容体２のリガンド、ならびに抗ＣＤ３および共刺激ブロッカーなどの免疫応答を調節する生物製剤およびモノクローナル抗体を含み、これらはペプチドと共投与され得る。寛容促進細胞には、未成熟樹状細胞および、ビタミンＤ３、（１α，２５－ジヒドロキシビタミンＤ３）またはそのアナログで処理した樹状細胞を含む。

癌が「治療」される場合、これは癌の一つまたは複数の臨床状態が改善していることを意味する。いくつかの方法においてはこれがそのケースとなることもあるが、癌の症状が完全に治療され、もはや患者に存在しないことを意味するものではない。「治療」は治療前よりも一つまたは複数の癌の症状が軽くなることをもたらす。例えば、腫瘍はサイズが減少するまたは完全に根絶し得る。

本発明の第二の態様は、癌治療のための医薬品製造に使用するための薬学的に許容される組成物、モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有する一つまたは複数のペプチドを含む組成物に関し、ここで各ｘはアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）および一つまたは複数の薬学的に許容される添加剤から独立に選択される。

一実施形態において、そのペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６のいずれか一つまたはその組み合わせから選択される配列を含み得る。さらなる実施形態において、そのペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６のいずれか一つの配列からなり得る。

一実施形態において、薬学的に許容される組成物は、モチーフＧＬＬｘＬＬＥＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有するペプチドを含み、ここでｘはアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）およびその組み合わせから選択される。本発明者らは驚くべきことに、本配列のペプチドがより優れた癌細胞選択性を有することを発見した。

一実施形態において、薬学的に許容される組成物は、モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有するペプチドを含み、ここでｘはアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）およびその組み合わせから選択されるが、ここでその配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含まない。

一実施形態において、薬学的に許容される組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびその組み合わせから選択される配列を含む。より好ましくは、薬学的に許容される組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびその組み合わせから選択される配列を含む。さらにより好ましくは、薬学的に許容される組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６から選択される配列を含む。本発明者らはこれらの配列が特に癌細胞に対する選択性を有することを発見した。

本発明の薬学的に許容される組成物は、皮膚癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、大腸癌、膀胱癌、リンパ腫、腎臓癌、膵臓癌または子宮体癌などの任意の種類の癌を治療するために使用することができる。しかしながら、本発明の特定の実施形態において、その癌は乳癌である。

一実施形態において、薬学的に許容される組成物はペプチドを含み、さらにそのモチーフのＣ末端にトリプトファン残基（Ｗ）を含む。これは正確な濃度測定および正確な投与に役立つ。

ペプチド配列またはモチーフのＮおよびＣ末端は、当業者に既知の任意の末端であってよく、および例えばＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺、ＣＯＯＨおよびＣＯＯ^-を含み得る。

一実施形態において、薬学的に許容される組成物はペプチドを含み、ここでそのペプチド配列はモチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧからなる。

本発明の一実施形態において、その組成物は化学療法薬と組み合わせて使用するためのものである。発明者らは、本特許請求の範囲のペプチドのポア形成特性のため、これが標準的な化学療法剤の標的癌細胞へのアクセスを容易にさせることを発見した。化学療法薬はシクロホスファミド、メトトレキサート、５－フルオロウラシル、ビノレルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン、プレドニゾロン、エトポシド、シスプラチン、エピルビシン、メトトレキサート、カペシタビン、ビノレルビン、葉酸、オキサリプラチンおよびその組み合わせから選択される。好ましくは、その化学療法薬はドキソルビシンである。化学療法薬と本ペプチドをコンジュゲートする手段の一例として、図１０が提供される。

選択される送達システムに依存して、医薬組成物に対する異なる組成物／処方要件があり得る。例として、本発明の医薬組成物は、例えば、静脈内、皮内、筋肉内、皮下または腹腔内経路により、送達のために、組成物が注射可能な形態で製剤化される非経口的に送達されるように製剤化され得る。非経口投与のためには、組成物は他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩または単糖類を含むことができる滅菌水性溶液の形態で使用することが最も良いことがある。皮内投与経路は、任意の皮内アクセス手段、例えばマイクロニードルをベースとした注射および注入システム（または皮内のスペースを正確に標的にするための他の手段）、皮内のスペース内への流体または粉末の針無しまたは針無し弾道注射（ballistic injection）、Ｍａｎｔｏｕｘタイプの皮内注射、マイクロデバイスにより促進されたイオントフォレーシス、および皮膚に組成物を付着させるためのパッチの使用を含む、皮膚への液体、固体または他の投与形態の直接的な付着、を含む。その組成物はまた、鼻腔内、経口または皮膚上を含む、経口または局所経路により投与されるように処方され得る。好ましくは、その組成物は静脈内経路により送達されるように処方される。

開示された抗癌ペプチドの投与される量または用量は、ｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞を効果的に標的とするために十分なものであるべきである。その用量は特定の製剤の有効性および対象における腫瘍の位置、ならびに治療される対象の体重により決定されることになる。

開示された抗癌ペプチドの用量は、特定の製剤の投与に付随することがある任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定されることになる。典型的には、医師は年齢、体重、一般的な健康状態、食事、性別、投与される化合物／製剤、投与経路、および治療される状態の重症度などの様々な要因を考慮して、個々の対象を治療するペプチドの投与量を決定することになる。おおよその投与量は当業者により決定され得る。非限定的な例として、本発明の抗癌ペプチドの総用量は、治療される対象の体重当たり約０．００１～約１０００ｍｇ／ｋｇ、体重当たり約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、および体重当たり約０．５ｍｇ～約５ｍｇ／ｋｇであり得る。別の実施形態において、ペプチドの総用量は、約１ｎＭ～約１０，０００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約５，０００ｎＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの濃度であり得る。

好ましい実施形態において、本発明のペプチドを含む組成物は、少なくとも１か月に１回、好ましくは各１～４週間に１回、４回投与される。

ペプチドは、Ｄ体またはＬ体のいずれかで存在し得る。一実施形態において、薬学的に許容される組成物は、Ｌ体のペプチドを含む。驚くべきことに、本明細書で示すペプチドがＬ体であるときに癌細胞により選択的であることが発明者らによって発見された。

一実施形態において、薬学的に許容される組成物は、アルファヘリックス集合体を形成するペプチドを含む。好ましくは、ペプチドは癌細胞膜にポアを形成する。そのペプチドは癌細胞膜の脂質組成物および化学的微小環境を直接的に標的として、そこにポアを形成して、それらの電気化学的勾配を短絡させることにより癌細胞が死滅すると信じられている。

本発明の第三の態様は、本発明の薬学的に許容される組成物が癌患者に投与される、癌治療方法に関する。一実施形態において、その癌は乳癌である。

本発明の第四の態様は、モチーフＧＬＬｘＬＬＥＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有するペプチドに関し、ここで各ｘはアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）から独立に選択される。

本発明の第五の態様は、モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有するペプチドに関し、ここでｘは、各ｘは、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）から独立に選択され、およびその配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含まない。

本発明の第六の態様は、本発明の薬学的に許容される組成物を含む癌を治療するためのキットに関する。好ましい実施形態において、そのキットは乳癌を治療するためのものである。そのキットは、化学療法薬をさらに含む。

本発明の第七の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６のいずれか一つの配列を含むペプチドをコードしたヌクレオチド配列に関する。

本発明の第八の態様は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３６のいずれか一つの配列およびその組み合わせを含むペプチドを発現するベクターに関する。

そのベクターは、ウイルスおよび非ウイルスベクターを含む、本発明のペプチドを発現させるための任意の適切なベクターであり得る。ウイルスベクターは、パルボウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスまたは単純ヘルペスウイルスを含む。パルボウイルスはアデノウイス関連ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。そのベクターは好ましくはリコンビナントアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターまたはレンチウイルスベクターである。より好ましくは、そのベクターはｒＡＡＶベクターである。

本発明によるベクターは、遺伝子送達ベクターであり得る。かかる遺伝子送達ベクターは、遺伝子送達ウイルスベクターまたは遺伝子送達非ウイルスベクターであり得る。

したがって、本発明は、本発明のペプチドを哺乳動物細胞に導入および／または発現させるためのベクターとして使用するための、動物パルボウイルス、特に感染性ヒトまたはサルＡＡＶなどのディペンドウイルス（dependovirus）に基づく遺伝子送達ベクターおよびその成分（例えば、動物パルボウイルスゲノム）を提供する。本明細書で使用される「パルボウイルス」という用語は、したがって、任意の種類のＡＡＶなどのディペンドウイルス（dependovirus）を包含する。

当業者は、本発明の全ての態様、それらが例えば薬学的に許容される組成物、ペプチド、その用途、または治療方法に関するものであろうと、本発明の全ての他の態様にも等価に適用できるものであることを理解することになる。特に、例えば薬学的に許容される組成物の態様は、本発明の他の態様、例えばそのペプチド自体よりもより詳細に記載されていることがある。しかしながら、当業者は、より詳細な情報が本発明の特定の態様について与えられた場合、本情報は本発明の他の態様に一般的には等価に適用できるということを理解することになる。

実施例１
材料および方法
ペプチド合成および精製
ペプチドは固相合成し、および９８％純度で精製した。ペプチドの純度および同一性は、ＨＰＬＣおよびＥＳＩ質量分析により確認した。Ｎ末端は遊離アミノ基であり、およびＣ末端は遊離カルボキシル基またはアミド化されたいずれかであった。

リポソーム作製
脂質、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１－パルミトイル－２－オレイル－ｓｎグリセロ－３－ホスホ－（１’－ｒａｃ－グリセロール）（ＰＯＰＧ）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入し、クロロホルム中に溶解した。ラージユニラメラベシクル（ＬＵＶｓ）はＡｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓから購入したエクストルーダーおよびフィルターを使用して１００ｎｍポアフィルターを通してエクストルージョンすることにより製造した。

細胞株および細胞培養条件
ＨＭＬＥＲ（ヒト乳腺内皮癌細胞）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ヒト乳腺内皮癌幹細胞）、およびＭＣＦ－１０Ａ（健常ヒト乳腺内皮）細胞は、サプリメントおよび成長因子：ウシ脳下垂体抽出物（ＢＰＥ）、ヒドロコルチゾン、ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、インスリン、およびゲンタマイシン／アムホテリシン－Ｂ）含有乳腺上皮細胞増殖培地（ＭＥＧＭ）中で維持した。ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚性腎臓細胞）、およびＵ２ＯＳ（ホモサピエンス骨肉腫）細胞は、最終濃度１０％のウシ胎児血清含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。細胞は３１０ＫのＴ７５フラスコで、５％ＣＯ₂を含む加湿雰囲気中で培養した。

細胞毒性アッセイ
抗癌ペプチドおよび従来の抗癌剤の毒性を測定するために、比色法であるＭＴＴ（３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）アッセイを使用した。５ｘ１０³個の細胞を９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに播種した。細胞を一晩インキュベートした。高濃度の化合物（０、０．１、０．２、０．４、０．８、１．６、３．１、６．３、１２．５、２５、５０および１００μＭ）を添加して、総液量２００μＬで７２時間インキュベートした。化合物のストック溶液をＤＭＳＯ中で５ｍＭ溶液として調製し、培地または純水を使用して希釈した。各ウェルのＤＭＳＯの最終濃度は０．５％または０％のいずれかであり、この量は未処理コントロール中に存在した。７２時間後、ＰＢＳ中の４ｍｇ／ｍＬ ＭＴＴ溶液２０μＬを各ウェルに添加して、そのプレートをさらに４時間インキュベートした。ＭＥＧＭ／ＭＴＴ混合物を吸引し、１００μＬのＤＭＳＯを添加して、得られた紫色のホルマザリン結晶を溶解した。各ウェル中の溶液の吸光度を５５０ｎｍの波長で読み取った。吸光度の値はＤＭＳＯ含有またはＤＭＳＯ非含有のいずれかのコントロールウェルで正規化し、試験化合物の濃度対細胞生存率％としてプロットした。ＩＣ₅₀値は、得られた用量依存性曲線から補間した。報告されたＩＣ₅₀値は、各濃度レベルごとに６つの複製からなる、２つの独立した実験の平均値である（全体としてｎ＝１２）。３６のロイシンリッチベースのペプチドのＩＣ₅₀値は、２つの独立した実験の平均値であった（全体としてｎ＝２）。

腫瘍スフェア形成および生存率アッセイ
ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞（５ｘ１０³）を低吸着性９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種し、Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ、および４μｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＭＥＧＭ中で５日間インキュベートした。研究は抗癌ペプチド、ドキソルビシン、およびサリノマイシンの非存在下および存在下で実施した。抗癌ペプチド、ドキソルビシン、およびサリノマイシンで処理されたマンモスフェアは反転試薬（inverted based reagent）のＴＯＸ８（Ｓｉｇｍａ）を使用してカウントおよび画像化した。１６時間インキュベーション後、溶液の蛍光を５９０ｎｍ（λ_ex＝５６０ｎｍ）で読み取った。生存できるマンモスフェアは、酸化型ＴＯＸ８の量が減少し、同時に蛍光型ＴＯＸ８中間体の量が増加することから、試験化合物により引き起こされるマンモスフェア細胞毒性の程度が示された。蛍光値はＤＭＳＯ含有またはＤＭＳＯ非含有コントロールで正規化され、および試験化合物の濃度対マンモスフェア生存率％としてプロットされた。ＩＣ₅₀値は、得られた用量依存性曲線から補間した。報告されたＩＣ₅₀値は、各濃度レベルごとに２つの複製からなる、２つの独立した実験の平均値である（全体としてｎ＝４）。

トリプトファン蛍光結合アッセイ
ペプチド（５０μＭ）およびＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ ＬＵＶｓ（６００μＭ）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で調製した。その溶液をインキュベートし、６０分後に測定した。励起光を２８０ｎｍ（スリット９ｎｍ）に固定し、蛍光は３００～４５０ｎｍ（スリット９ｎｍ）で収集した。ＢｉｏＴｅｋのＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ ハイブリッドマルチモードリーダー（図３Ａ）およびＣｙｔａｔｉｏｎ^(商標)５ 細胞イメージングマルチモードリーダー（図２）を使用してスペクトルを記録し、３スキャンで平均化した。

リポソーム漏出アッセイ
５ｍＭのＡＮＴＳ（８－アミノナフタレン－１，３，６－トリスルホン酸、二ナトリウム塩）および１２．５ｍＭのＤＰＸ（ｐ－キシレン－ビスーピリジニウムブロミド）を直径０．１μｍで押し出された脂質含有ベシクルに封入した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ）を使用して、ゲルろ過クロマトグラフィーを封入物含有ＬＵＶｓから外部遊離ＡＮＴＳ／ＤＰＸを除去するために使用した。ＬＵＶｓを０．５ｍＭに希釈し、ペプチドのアリコートを添加して漏出活性の測定に使用した。漏出は３時間インキュベーションした後に測定した。１０％Ｔｒｉｔｏｎをポジティブコントロールとして使用して、ベシクルの最大漏出量を測定した。蛍光発光スペクトルは、ＢｉｏＴｅｋ Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ ハイブリッドマルチモードリーダーを使用して、ＡＮＴＳ／ＤＰＸの励起波長３５０ｎｍおよび蛍光波長５１０ｎｍを使用して記録した。

ホモライシスアッセイ
ペプチドは、１００μＭの濃度から開始してＰＢＳで連続的に希釈された。各ウェルのペプチドの最終容量は５０μＬであった。各ウェルに、２ｘ１０⁸細胞／ｍＬでＰＢＳ中のＲＢＣｓ５０μＬを添加した。ポジティブライシスコントロールとして、１％ｔｒｉｔｏｎを使用した。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、その後、１０００ｘ ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清１０μＬを新しい９６ウェルプレート中の９０μＬのＤＩ Ｈ₂Ｏに移した。４１０ｎｍでの放出ヘモグロビンの吸光度を記録し、１００％および０％ライシスコントロールに基づいて分数溶血（fractional hemolysis）を計算した。

Ｓｙｔｏｘ ＧｒｅｅｎアッセイによるＨｅｌａ細胞に対する細胞毒性測定
Ｈｅｌａ細胞は、完全ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ）中のＴ－７５フラスコでコンフルエントになるまで増殖させた。細胞毒性実験の前の日に、細胞をトリプシン処理し、フラスコから剥がして、１３００ｒｐｍでペレット化させた。トリプシンおよび使用済み培地を廃棄し、細胞を完全ＤＭＥＭに再懸濁させた。細胞数はセルカウンターを使用して得た。次に、この細胞を９６ウェル組織培養プレートに１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。翌日、別の９６ウェルプレートで、ペプチドを完全ＤＭＥＭ（ＦＢＳ添加１０％）および０．１％ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎで連続希釈し、１００μＭ（１番目）、６７μＭ（２番目）の濃度から始めて、続いて２：３連続希釈を行った。各ウェルのペプチドの最終容量は１００μＬであった。細胞毒性アッセイを行うために、培地をウェルから除去し、ペプチド／ＤＭＥＭ／ｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎ溶液に置き換えた。ネガティブコントロールとしてペプチド無し、ポジティブコントロールとして２０μＭのＭｅｌＰ５をそれぞれ使用した。励起波長５０４ｎｍおよび蛍光波長５２３ｎｍで、５分毎に１時間プレートの蛍光を読み取った。細胞毒性は、細胞壁の不安定化のために細胞内に入ったｓｙｔｏｘ ｇｒｅｅｎに基づいて、１００％および０％ライシスコントロールに基づいて計算した。

分子動力学シミュレーションおよび解析
不偏の全原子ＭＤシミュレーションはＧＲＯＭＡＣＳ ２０１８．３(www.gromacs.org)、Ｈｉｐｐｏ ＢＥＴＡ(http://www.biowerkzeug.com)、およびＶＭＤ (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/)を使用して実施した。

拡張されたペプチド構造はＨｉｐｐｏ ＢＥＴＡを使用して生成した。これらの初期構造は２００ Ｍｏｎｔｅ Ｃａｒｌｏ ｓｔｅｐｓを介して緩和され、水はＧｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ Ｂｏｒｎ溶媒を使用して暗黙的に処理された。緩和後、ＣＨＡＲＭＭ－ＧＵＩ(http://www.charmm-gui.org/)を使用して、１００ｍＭのＫおよびＣｌイオン含有モデル膜を含む原子レベルのペプチド／脂質／水系にペプチドを配置した。タンパク質フォールディングシミュレーションは、ペプチドに位置拘束をかけながら１０ｎｓで平衡化した。ポア形成シミュレーションでは、単一ペプチドを二重膜上で６００ｎｓまで折り畳むことができた。一度安定な表面状態が得られた後、系をｘ、ｙ方向（ｚ方向は含まない）に４ｘ４倍し、１６個のペプチドからなる系とした。膜の両側のペプチドから始めると、初期構造は上部および下部のリーフレットに１つずつペプチドを有する。その後、３ｘ３の多重化により大きな系を構築し、１８個のペプチドからなるシミュレーションボックスを得た。ＭＤシミュレーションは、ＴＩＰ３Ｐ水モデルを併用し、ＣＨＡＲＭＭ３６力場を使用してＧＲＯＭＡＣＳ２０１８．３で実施した。静電相互作用はＰＭＥを使用して計算し、ファンデルワールス相互作用には１０オングストロームのカットオフを使用した。積分のタイムステップは２ｆｓで、近隣リストは５ステップごとに更新された。すべてのシミュレーションは任意の拘束またはバイアスポテンシャル無しに、ＮＰＴアンサンブルで実施した。水およびタンパク質は、速度再スケール温度カップリングを使用して、時定数τＴ＝０．５ｐｓで熱浴に別々に結合させた。大気圧１バールは、圧縮率κｚ＝κ_xy＝４．６・１０^-5ｂａｒ^-1、時定数τＰ＝１ｐｓの弱い半等方的圧力結合を用いて維持された。

オリゴマー集団解析
シミュレーション中に最も多く存在するポア集合体を明らかにするため、各軌道フレームについて、すべてのオリゴマーの完全なリストを作成した。ｎ個のオリゴマーは、重原子（Ｎ、Ｃ、Ｏ）の最小距離が＜３．５オングストロームと定義され、相互に接触しているｎ個のペプチドの集合とみなされた。しばしば、この定義では、オリゴマーのコアを構成する膜貫通型ペプチドに緩く結合しているだけの一過性の表面結合型（Ｓ状態）ペプチドが多数あるため、オリゴマー状態を過剰にカウントしている。これらのＳ－状態ペプチドは、頻繁に位置を変えたり、ポアの安定な部分から出たり入ったりする。より長寿命のＴＭポアの解析に焦点を当てるため、ペプチドの傾斜角τに７５°のカットオフ基準が導入された。τ≧７５°のペプチドはＳ状態とみなされ、オリゴマー解析から除外された。この戦略により、真の長寿命ポア構造に焦点を当てることで、オリゴマークラスタリングアルゴリズムのノイズを大幅に減少させることができた。次に、オリゴマーｎの占有率にそのペプチド数ｎを乗じたポピュレーションプロットを作成した。これにより、シミュレーション時間中に、どのオリゴマー状態にどの程度のペプチド質量が集中したかが明らかになった。

パーミュテーショナルクラスター解析
同じオーダーｎのすべてのオリゴマーは、バックボーンＲＭＳＤの類似性のカットオフ基準を４オングストロームとしたクラスタリングアルゴリズムを使用して、コンフォメーション的にクラスタリングされた。各オリゴマーは異なるペプチドで構成されていることがあり、また同じペプチドであっても順序が異なるため、あるオリゴマーと別のオリゴマーのペプチド配置の順列ｎ！を比較することでクラスタリングを実施した。並べ換えはＨｅａｐのアルゴリズムを使用して生成された。コンフォメーション類似性の最終的なＲＭＳＤ値は、ｎ！個の並べ替え比較から得られた最も低いＲＭＳＤ値とみなされた。クラスタリングの結果は一般的に平坦であり、構造が非常に儚く動的であることが示された。

膜透過流束
膜孔を通る水およびイオンの流束は、二層膜パッチ全体を通る瞬間的な流束の合計を測定することによって計算された。膜の法線に直交する２つの面をｚ＝－７オングストロームおよびｚ＝＋７オングストロームとみなし、その面を横切るすべての遷移事象をカウントした。次に、遷移回数を膜パッチの面積および各軌跡フレームの経過時間で割って流束を求めた。続いて、曲線は１０００フレームを平均することにより平滑化された。

実施例２
ペプチドの理論的根拠
下記の表１は本開示の範囲内に収まる３６のペプチドを含む。

界面結合自由エネルギーは、ペプチドが膜にどれだけ結合するかを示す尺度であり、疎水性モーメントは、疎水性残基がらせん、膜挿入型、コンフォメーションのペプチド表面の周りにどれだけ均一に分布しているかを示す尺度である。

ペプチド濃度を定量するために、Ｃ末端にさらなるトリプトファンを導入した。また、膜透過性をさらに高めるために、荷電カルボキシル基のＣ末端（－ＣＯ₂ ^-）を中性アミド基（－ＮＨ₂）に変更した。本ペプチドは、荷電した残基がらせん構造の同じ極性面に位置するように設計されている。それゆえ、電荷の分布は、ペプチドの疎水性モーメント、ｐＫａ、癌細胞膜への結合力、および最終的には癌細胞膜内でのペプチド集合体の構造に影響を及ぼし得る（図１Ａ）。癌を標的とした生物医学的な用途を有する多くのｐＨ依存性ペプチドは、ｐＫａが～４．０を有する。これは、癌細胞の微小環境がやや酸性に傾いていることに由来することがあり、Ｗａｒｂｕｒｇ効果によるものである。したがって、癌細胞膜は、本発明の負電荷アミノ酸をプロトン化し、ｐＨトリガー膜活性をもたらすことができると考えられる（図１Ｂおよび表１）^16-19。

すべての３６のロイシンリッチペプチド配列は、すべてＬ体として合成されたものである。ΔＧ_界面は、水と膜界面との間のペプチドパーテーションの結合自由エネルギーを表す。ΔＧ_界面および疎水性モーメントは、ＭＰＥｘソフトウェアを使用してＷｉｍｌｅｙ－Ｗｈｉｔｅ疎水性尺度を使用して推定した。結合自由エネルギーは、ペプチドが膜に結合する際に放出されるエネルギーである。０の時、ペプチドは水中５０％、膜上５０％、負は優先的に挿入され、正は水相を好む。疎水性モーメントは、疎水性残基がらせん状の輪の周りにどのように配置されているかを示す指標で、モーメントが大きいと全て片側に集まり、小さいと周りに均等に配置される。モーメントが大きいと表面結合に有利である（すなわち、疎水面は二重層に沈み、親水面は水面を向いている）。

実施例３
細胞毒性および有効性
ペプチドは、いくつかの異なるヒト細胞株に対してスクリーニングされ、それらの細胞毒性を測定した。利用した細胞株は、ＭＣＦ－１０Ａ（ヒト乳房上皮細胞）、ＨＭＬＥＲ（ヒト乳癌バルク細胞）、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ（ヒト乳癌幹細胞）、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚性腎細胞）、およびＵ２ＯＳ（ヒト骨肉腫）を含む。ペプチドは従来の抗癌剤と同じくらい強力であり、低マイクロモル濃度で癌細胞を消失させることができること、および多くが癌細胞株に対する高い選択性を有することが明らかになった（図２および表１）。ドキソルビシンおよびサリノマイシンの両方はまた、健常ＭＣＦ－１０Ａ細胞よりも癌化したＨＭＬＥＲに対して選択性を有するものの、それらは両方ともＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対してより顕著な毒性を有する。さらに両薬剤とも、現在固形腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏモデルとしてはるかに正確であると考えられている三次元マンモスフェアとして増殖させた癌細胞を除去する効率ははるかに低かった。二次元のＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄに対するドキソルビシンおよびサリノマイシンの半数最大阻害濃度（ＩＣ₅₀）はそれぞれ２．５±０．３ｎＭおよび３７０±０．５ｎＭであるが、ｉｎ ｖｉｖｏ条件にはるかに近い、よりリアルな三次元細胞培養モデルのマンモスフェアではこの値はそれぞれ４３±６μＭおよび２２±５μＭに下がり、ドキソルビシンの活性が１７００倍、サリノマイシンは６３倍に低下している。以下の表２および図３を参照。対照的に、ＥＥＫ（ＧＬＬＥＬＬＬＫＡＡＧＷ）、およびそのＤ体ペプチドは、ＨＭＬＥＲ、ＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ、およびＵ２ＯＳ細胞の二次元培養に対してナノから低マイクロモル活性、マンモスフェアに対して７～１３μＭの活性を示し、二次元および三次元マンモスフェア腫瘍モデルの両方に有効である。図４から図６を参照。

すべてのデータポイントは、２回実施された。選択されたＤ体ペプチド、従来の抗癌剤、ＥＥＫペプチドおよび２５Ｂ２ペプチドは６回繰り返された。†Ｎ末端は遊離、Ｃ末端：－ＷＮＨ２である。

実施例４
トリプトファン結合アッセイおよびリポソーム漏出アッセイ
本開示のペプチドはほとんど中性またはアニオン性であり、配列中に正電荷を多くは含まない（表１）。本発明者らは癌細胞株へ高選択性であり、ＭＣＦ－１０Ａ（ＩＣ₅₀≧１００μＭ）に対してごくわずかな影響を有し、およびＨＥＫ２９３Ｔに対する細胞毒性が比較的低い、６つの配列：ＥＥＥ、ＫＥＥ、ＥＨＥ、ＥＥＨ、ＤＥＫ、およびＥＥＫを同定した（図２および表２）。それらの正味電荷は－２～０間でｐＫａは３．８５～７．９６であり、それらの配列は一つの正電荷（正電荷のＮ末端）または２つの正電荷（一つの正電荷のＮ末端および４または１１番目に一つのリシン）のいずれかを含む。いくつかの研究は、癌細胞膜は負に帯電している膜表面を有し得ることを示した。^20,21 Ｉｓｈｉｋａｗａらは、ＨＭＬＥＲと同様に、乳癌細胞株ＭＣＦ－７が、膜表面に負に帯電したシアル酸を少量含むことを発見した。²⁰ これは、本ロイシンリッチなペプチドの抗癌活性および細胞選択性は、静電的相互作用のみでは説明することができず、癌細胞の微小環境におけるＷａｒｂｕｒｇ効果による電荷分布が関与し得ることを示唆する。この仮説を確かめるために、本発明者らは、２つの異なる脂質モデルベシクル（双性イオン性ＰＯＰＣおよびアニオン性３ＰＯＰＣ／１ＰＯＰＧ混合物）をそれぞれｐＨ７．４（生理的条件）およびｐＨ４．８（弱酸性）でトリプトファン結合アッセイ（下記表３および図７参照）およびＡＮＴＳ／ＤＰＸリポソーム漏出アッセイ（下記表４および図８参照）を実施した。

表３は、リポソームへの脂質濃度による５０％ペプチド結合を示す。５０μMペプチドが固定され、リン酸緩衝生理食塩水（１Ｘ、ｐＨ７．４）中０、１２．５、２５、５０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、および５０００μＭの濃度の滴定脂質（ＰＯＰＣベシクルまたは３ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧベシクル）とインキュベートした。５０％のペプチド結合を引き起こす脂質濃度は、トリプトファン蛍光結合アッセイを使用して測定し、その値はペプチド当たりの脂質として示した。†Ｎ末端は遊離、Ｃ末端：－Ｗ－ＮＨ₂である。

表４は、ペプチド濃度による５０％ＡＮＴＳ／ＤＰＸリポソームの漏出を示したものである。０．５ｍＭのＰＯＰＣおよび３ＰＯＰＣ／１ＰＯＰＧベシクルを固定し、リン酸緩衝生理食塩水（１Ｘ、ｐＨ７．４）および塩酸調整リン酸緩衝生理食塩水（１Ｘ、ｐＨ４．８）中で滴定ペプチドの濃度（０、０．０２、０．０４、０．０８、０．１６、０．３２、０．６４、１．２５、２．５、５、１０および２０μＭ）でインキュベートした。その値はペプチド当たりの脂質で示した。†Ｎ末端は遊離、Ｃ末端：－Ｗ－ＮＨ₂である。

その結果は、細胞選択性ペプチドは、中性ｐＨにおいて双性イオン性およびアニオン性ベシクル間で任意の有意な結合選択性およびペプチドに起因するリポソーム漏出性を有さないが、６つの膜選択性ペプチドのうち４つ（ＥＨＥ、ＥＥＨ、ＤＥＫ、およびＥＥＫ）はｐＨ４．８においてアニオン性ベシクルから比較的高いリポソーム漏出活性を有することを示した。これは、これらの４つのペプチドは脂質組成とｐＨ条件の両方に依存する環境トリガー型の膜活性ペプチドであると示唆される；しかしながら、他の２つの膜選択性ペプチド（ＥＥＥおよびＫＥＥ）のメカニズムは不明なままである。

実施例５
ロイシンリッチなペプチドの作用メカニズム
図９は、ＥＥＫのＬ体が９０μＭ未満の濃度で最小限の溶解を引き起こし、治療濃度～１０μＭを大きく下回っていることを示している。Ｄ体ＥＥＫは、より溶解性がある。高親和性核酸染色剤であるＳＹＴＯＸ ｇｒｅｅｎのＨｅＬａ細胞への濃度依存的な導入を比較すると、Ｌ体およびＤ体ＥＥＫは、強力なポア形成ペプチドであるメリチンと同様の挙動を示すことが示された。これらの結果をまとめると、作用メカニズムとしての癌細胞－細胞膜の選択的なポア形成を実証する。

図９Ｃは、ＬまたはＤ体ＥＥＫで処理したＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞の細胞生存率は、ネクロプト－シス阻害剤ネクロスタチンとの共インキュベーション、およびアポトーシス阻害剤ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫとの共インキュベーションのいずれでも改善できないことから、ＡＣＰｓが細胞膜にポアを形成してネクローシスを引き起こすことが示唆されることを示す。一方、図９Ｄは、ドキソルビシンで処理したＨＭＬＥＲ－ｓｈＥｃａｄ細胞の細胞生存率が、ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫまたはネクロスタチンのいずれかとの共インキュベーションによって劇的に改善できることを示す。

これらの結果をまとめると、ＡＣＰの抗癌作用は、癌細胞の細胞膜に選択的にポアを形成し、その結果、ネクローシスを引き起こすことが主なメカニズムであると示唆される。

実施例６
ＡＰＣポアの構造および機能
膜貫通ペプチドは典型的には一過性のポアを形成するため、現在の技術では実験的に決定することができない。膜穿ポアを支える分子メカニズムを明らかにするために、我々はＥＥＫのフォールディング－パーティショニングおよびポアの形成について、偏りのない長い時間スケールの原子詳細分子動力学シミュレーションを使用して研究した。ＡＣＰｓは急速に膜界面に吸収され、折り畳まれる（図１４ａ）。その後、数十μｓの時間スケールで、ＡＰＣｓは脂質二重層を協調的に挿入および移動し、両方の膜界面を埋め尽くし（図１４ｂ）、ポアのアンサンブルを形成する（図１４ｄ）。構造解析の結果、ポアの構造は非常に不均一であり、大部分は６～１０個のペプチドで構成され、膜内で絶えず形成と分解を繰り返していることが明らかになった（図１４ｅ）。ポアは水とイオンの両方を伝導し（図１４ｄ）、および漏出は極性および荷電側鎖で並べられた大きな水性チャネルを形成する１０～１２個のペプチドからなるより大きな安定なポアによって支配されている（図１４ｃ）。

参考文献
本明細書で引用されたすべての特許および科学文献はそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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16. Andreev, O. A.; Engelman, D. M.; Reshetnyak, Y. K., pH-sensitive membrane peptides (pHLIPs) as a novel class of delivery agents. Mol Membr Biol 2010, 27 (7), 341-52.
17. Andreev, O. A.; Karabadzhak, A. G.; Weerakkody, D.; Andreev, G. O.; Engelman, D. M.; Reshetnyak, Y. K., pH (low) insertion peptide (pHLIP) inserts across a lipid bilayer as a helix and exits by a different path. Proc Natl Acad Sci U S A 2010, 107 (9), 4081-6.
18. An, M.; Wijesinghe, D.; Andreev, O. A.; Reshetnyak, Y. K.; Engelman, D. M., pH-(low)-insertion-peptide (pHLIP) translocation of membrane impermeable phalloidin toxin inhibits cancer cell proliferation. Proc Natl Acad Sci U S A 2010, 107 (47), 20246-50.
19. Wyatt, L. C.; Moshnikova, A.; Crawford, T.; Engelman, D. M.; Andreev, O. A.; Reshetnyak, Y. K., Peptides of pHLIP family for targeted intracellular and extracellular delivery of cargo molecules to tumors. Proc Natl Acad Sci U S A 2018, 115 (12), E2811-E2818.
20. Ishikawa, K.; Medina, S. H.; Schneider, J. P.; Klar, A. J. S., Glycan Alteration Imparts Cellular Resistance to a Membrane-Lytic Anticancer Peptide. Cell Chem Biol 2017, 24 (2), 149-158.
21. Freire, J. M.; Gaspar, D.; Veiga, A. S.; Castanho, M. A., Shifting gear in antimicrobial and anticancer peptides biophysical studies: from vesicles to cells. J Pept Sci 2015, 21 (3), 178-85.

Claims (32)

1. 癌治療に使用するための薬学的に許容される組成物であって、前記組成物がモチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有する一つまたは複数のペプチドを含み、ここで各ｘはアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）、および一つまたは複数の薬学的に許容される添加剤から独立に選択される、癌治療に使用するための薬学的に許容される組成物。
2. 癌治療のための医薬品製造に使用するための薬学的に許容される組成物であって、前記組成物がモチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有する一つまたは複数のペプチドを含み、ここで各ｘはアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）、および一つまたは複数の薬学的に許容される添加剤から独立に選択される、癌治療のための医薬品製造に使用するための薬学的に許容される組成物。
3. 前記モチーフがＧＬＬｘＬＬＥＬＬＬｘＡＡＧである、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
4. 前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含まない、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
5. 前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱＩＤＮＯ：２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびその組み合わせから選択される配列を含む、請求項１または請求項２に記載の薬学的に許容される組成物。
6. 前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびその組み合わせから選択される配列を含む、請求項３に記載の薬学的に許容される組成物。
7. 前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６から選択される配列を含む、請求項３に記載の薬学的に許容される組成物。
8. 前記癌が乳癌である、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
9. 前記モチーフがＣ末端にトリプトファン残基（Ｗ）をさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
10. 前記ペプチド配列がモチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧからなる、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
11. 前記組成物が化学療法薬と組み合わせて使用するためのものである、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
12. 前記組成物が静脈内投与のためのものである、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
13. 前記組成物が、１ｎＭ～約１０，０００ｎＭ、好ましくは約１０ｎＭ～約５，０００ｎＭ、より好ましくは約１００ｎＭ～約５００ｎＭの範囲の投与量で投与するためのものである、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
14. 前記ペプチドが、Ｌ体である、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
15. 前記ペプチドがアルファらせん集合体を形成する、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
16. 前記ペプチドが癌細胞膜にポアを形成する、前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
17. 前記請求項のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物を癌患者に投与する癌治療方法であって、ここで好ましくは前記癌が乳癌である、癌治療方法。
18. 各ｘがアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）から独立に選択される、モチーフＧＬＬｘＬＬＥＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有するペプチド。
19. 各ｘがアルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、リシン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）またはグルタミン酸（Ｅ）から独立に選択され、および前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３を含まない、モチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧを含む配列を有するペプチド。
20. 前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびその組み合わせから選択される配列を含む、請求項１９に記載のペプチド。
21. 前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６およびその組み合わせから選択される配列を含む、請求項１８に記載のペプチド。
22. 前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６から選択される配列を含む、請求項２１に記載のペプチド。
23. 前記モチーフがＣ末端にトリプトファン残基（Ｗ）をさらに含む、請求項１８から２２のいずれか一項に記載のペプチド。
24. 前記ペプチド配列がモチーフＧＬＬｘＬＬｘＬＬＬｘＡＡＧからなる、請求項１８から２３のいずれか一項に記載のペプチド。
25. 前記ペプチドがＬ体である、請求項１８から２４のいずれか一項に記載のペプチド。
26. 前記ペプチドがアルファらせん集合体を形成する、請求項１８から２５のいずれか一項に記載のペプチド。
27. 前記ペプチドが癌細胞膜にポアを形成する、請求項１８から２６のいずれか一項に記載のペプチド。
28. 請求項１から１６のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物を含む癌治療または予防のためのキット。
29. 前記癌が乳癌である、請求項２８に記載のキット。
30. 化学療法薬をさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載のキット。
31. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から３６のいずれか一つの配列を含むペプチドをコードするヌクレオチド配列。
32. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１から３６およびその組み合わせのいずれか一つの配列を含むペプチドを発現するベクター。

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