CN108350046B

CN108350046B - Vdac1衍生肽的类似物

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Publication number: CN108350046B
Application number: CN201680064323.4A
Authority: CN
Inventors: 瓦尔达·肖尚-巴尔马茨
Original assignee: BG Negev Technologies and Applications Ltd; National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd
Current assignee: BG Negev Technologies and Applications Ltd; National Institute for Biotechnology in the Negev Ltd
Priority date: 2015-09-03
Filing date: 2016-09-01
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2036-09-01
Also published as: IL257803B; CA2997516C; AU2016314372A1; JP2018532709A; US10385104B2; US20180134760A1; US20190375808A1; EP3344649A1; IL257803A; US10829530B2; AU2016314372B2; US11634465B2; CA2997516A1; EP3344649A4; CN108350046A; WO2017037711A1; EP3344649B1; US20210079052A1; JP7085712B2

Abstract

本发明涉及包含VDAC1衍生肽的类似物的肽，所述肽与天然亲本肽相比具有改进的药代动力学特征，所述肽有效削弱细胞能量产生，有效诱导凋亡和细胞死亡、特别是癌性细胞的凋亡和细胞死亡，有效消除癌症干细胞并且有效减少与肝细胞中脂肪积累相关的症状、特别是与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关的症状和与其相关的症状。

Description

VDAC1衍生肽的类似物

发明领域

本发明涉及包含VDAC1衍生肽的类似物的肽，所述肽与天然亲本肽相比具有改进的药代动力学特征，所述肽有效削弱细胞能量产生，有效诱导凋亡细胞死亡、特别是癌性细胞的凋亡细胞死亡，有效消除癌症干细胞并且有效减少与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)相关的肝细胞中与脂肪变性相关的症状、炎症和纤维化。

发明背景

电压依赖性阴离子通道(VDAC；线粒体孔蛋白)存在于所有真核细胞的线粒体外膜中。VDAC为细胞能量代谢中的核心参与者，并且在线粒体介导的凋亡中具有关键作用，并且控制线粒体与胞质溶胶之间的离子和代谢物的通量。VDAC还提供经由其与多种配体和蛋白的缔合介导的多种细胞存活和死亡信号的收敛点。VDAC为线粒体介导的凋亡中的关键参与者，参与将线粒体促凋亡蛋白(例如细胞色素c、凋亡诱导因子(AIF)和第二线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂(Smac/DIABLO))释放至胞质溶胶中；并且与凋亡调节蛋白诸如Bcl-2、Bcl-xL和己糖激酶(HK)相互作用。

已知VDAC的三种哺乳动物同种型，VDAC1、VDAC2和VDAC3，其中VDAC1为在哺乳动物细胞中表达的主要同种型(De Pinto,V.,等2010.Biochim Biophys Acta 1797:1268-1275)。Blachly-Dysion等(Blachly-Dyson E等,1993.J Biol Chem.268(3):1835-41)公开了两种人类VDAC同种型VDAC1和VDAC2在酵母中的克隆和功能表达。美国专利第5,780,235号公开了两个VDAC序列，其被命名为HACH(人类电压依赖性阴离子通道)，随后被鉴定为VDAC2和VDAC3。该专利提供了基因工程化表达载体、包含所述载体的宿主细胞、用于产生HACH的方法和用于鉴定抑制HACH表达和活性的药物组合物的方法以及此类组合物用于治疗癌症和增殖性疾病的用途。

凋亡，也被称为程序性细胞死亡，除其他以外，在多细胞生物体的发育、免疫细胞调节和组织稳态中发挥核心作用。来自多种物种的遗传和分子分析表明，凋亡途径高度保守。除了为正常发育和维持所必需的以外，凋亡在防御病毒感染和预防癌症方面是重要的。线粒体在凋亡细胞死亡中发挥重要作用。促凋亡蛋白诸如细胞色素c从线粒体膜间间隙释放到细胞的细胞质中启动参与执行细胞死亡程序的半胱天冬酶激活的级联步骤。大量证据将VDAC1与凋亡联系起来，并且表明VDAC1为哺乳动物细胞中促凋亡蛋白从线粒体释放方面的关键参与者(Lemasters,J.J.,和Holmuhamedov,E.2006.Biochim.Biophys Acta 1762:181-190；Shoshan-Barmatz V等2010.Molecular Aspects of Medicine 31(3):227-286；Shoshan-Barmatz V和Ben-Hail D.2012.Mitochondrion 12(1):24-34；Shoshan-BarmatzV和Golan M.2012.Current Medicinal Chemistry 19(5):714-35；Shoshan-Barmatz,V等2015.Biochim Biophys Acta,1848(10Pt B):2547-75)。

先前已经表明，衍生自VDAC的肽能够诱导凋亡(Prezma T等2013.Cell Death和Disease 4:e809)。

本发明的发明人等的美国专利第8,119,601号和第8,648,045号公开了能够诱导细胞中的凋亡的分离的VDAC1衍生肽以及包含其的可用于治疗与异常凋亡相关的疾病特别是癌症的药物组合物。所述肽衍生自VDAC1的N-末端结构域以及VDAC1β-链14及其胞质溶胶β-环。

本发明的发明人等的国际专利申请公布第WO 2015/011711号公开了基于人类线粒体蛋白电压依赖性阴离子通道1(VDAC)的N-末端结构域的氨基酸序列的短肽及另外包含细胞通透性增强部分的肽缀合物。肽、肽缀合物和包含其的药物组合物可用于治疗以细胞过度增殖或耐受细胞死亡为特征的疾病特别是癌症。

Prezma等(Prezma T等,2013.Cell Death Dis.19(4):e809)表明基于VDAC1的肽(包括短肽)选择性诱导来自患有B慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的患者的外周单核细胞(PBMC)的细胞死亡，同时对来自健康供体的PBMC表现出较小的作用。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)通常为“沉默性”肝病，并且其特征在于非酒精使用者的肝实质细胞及其他肝细胞的细胞质中脂肪酸和甘油三酯的过度异常积累。NAFLD已显现为西方社会中重要的公共卫生问题，并且为异常肝功能的最常见原因。NAFLD为一系列慢性脂肪性肝病，范围为良性肝脂肪变性及其称为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的进展性形式。在NASH中，肝中的脂肪积累与炎症和不同程度的瘢痕(scarring)相关。NASH为携带进展为终末期肝病肝硬化和肝细胞癌(HCC)的重大风险的潜在的严重状况。发展为肝硬化的一些患者处于肝衰竭的风险，并且可能最终需要肝移植。

非酒精性脂肪性肝病被分类为孤立性脂肪肝(isolated fatty liver)(IFL)和NASH。在IFL和NASH两者中，肝细胞中存在异常量的脂肪；但另外，在NASH中，在肝中存在炎症，并且结果肝细胞受损，并且当肝细胞死亡时，它们被瘢痕组织取代，导致肝硬化。

NAFLD的原因复杂，并且尚未被完全弄清楚。因此，NAFLD被普遍认为是代谢综合征(MS)的肝表现，并且胰岛素耐受被认为是其关键的病理生理学标志。鉴于NAFLD与代谢综合征以及世界范围流行的肥胖的强相关性，NAFLD和NASH的患病率正在增加。NAFLD在患有预先存在的代谢状况的患者的组群中比在普通群体中更普遍。具体地，II型糖尿病(diabetesmellitus)和NAFLD具有特别密切的关系。对患有II型糖尿病的患者的研究报道了69％的超声检查NAFLD患病率。然而，糖尿病退行性并发症或血糖控制与NAFLD的存在之间无明显关系。肥胖个体中的单纯性脂肪变性的患病率范围为30％至37％，而在NAFLD中，范围为57％的出现在门诊诊所(attending out-patient clinics)超重个体至98％的非糖尿病肥胖患者。

当前尚不存在批准用于预防或治疗NAFLD或NASH的药物，并且因此当前的疗法依赖于生活方式改变以及与NAFLD相关的疾病的治疗。给予患有这种疾病的人最重要的建议包括减少体重(如果肥胖或超重)、遵循均衡且健康的饮食、增加体力活动、避免饮酒和不必要的药物以及在一些情况下的减肥手术(bariatric surgery)，其中主要目标为在诊断之后减少疾病症状。

线粒体可以在能量产生、脂质代谢、活性氧类(ROS)产生和解毒和促凋亡蛋白释放的水平影响细胞命运。多种研究表明，在肝脂肪变性(hepatosteatosis)发病机制中，线粒体在这些细胞器中具有突出的形态学作用。

肽的体内治疗用途的主要障碍为它们对蛋白水解降解的敏感性。反向-翻转肽(retro-inverso peptide)为其氨基酸序列被反向并且氨基酸亚单位的α中心手性也被翻转的肽。通常，这些类型的肽通过在反向序列中包含D-氨基酸来设计，以帮助维持与原始L-氨基酸肽的侧链拓扑结构类似的侧链拓扑结构并且使其更加耐受蛋白水解降解。在科学文献中这些肽的其他报道的同义词包括完全-D-反向肽(All-D-Retro Peptides)、反向-对映体肽(Retro-Enantio Peptides)、反向-翻转类似物(Retro-Inverso Analogs)、反向-翻转类似物(Retro-Inverso Analogues)、反向-翻转衍生物(Retro-Inverso Derivatives)、反向-翻转肽(Retro-Inverso peptides)和反向-翻转异构体(Retro-Inverso Isomers)。D-氨基酸代表生物系统中存在的天然蛋白中出现的天然L-氨基酸的构象镜像。还存在线性肽的部分修饰的反向-翻转类似物，其中仅一些肽键被反向，并且反向部分中氨基酸残基的手性被翻转。

包含D-氨基酸的肽通常对蛋白水解降解较不敏感，并且当被用作药物时具有更长的有效时间。如果设计得当，反向-翻转肽可以具有与L-肽类似的结合特征。通过设计模拟肽表位、蛋白-蛋白或蛋白-肽界面的形状的肽模拟物(peptidomimetics)，反向-翻转肽为用于研究蛋白-蛋白相互作用的有用的候选物。反向-翻转肽为作为药物使用的L-肽的有吸引力的替代物。这些肽已经被报道与L-肽相比引发较低的免疫原性反应。然而，尽管反向-翻转类似物表现出增加的代谢稳定性，它们的生物活性通常大大受损(Guichard G等,1994.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,91:9765-9769)。

对表现出改进的药代动力学特征同时至少保留其生物活性的基于VDAC1的肽存在未满足的需求，并且具有所述基于VDAC1的肽将是非常有利的。

发明概述

本发明通过提供具有优越药代动力学特征的基于VDAC1的肽的类似物来满足以上提及的需求。本发明提供了合成肽，所述合成肽包含VDAC1衍生肽的类似物，特别地反向且部分或完全翻转的类似物，其中形成本发明类似物的基础的VDAC1衍生肽已经被证明诱导癌性细胞中的凋亡。发现本发明的类似物与先前公开的天然肽相比具有改进的在药学上相容的溶剂中的溶解度和改进的稳定性，同时至少保持天然蛋白的活性，总之，使它们成为作为治疗剂的更好的候选物，用于治疗以细胞过度增殖或耐受细胞死亡为特征的疾病，特别地用于治疗癌症。出乎意料地，VDAC1衍生肽的类似物显示跨越血脑屏障(BBB)。本发明的合成肽通过消除癌症干细胞还有效治疗癌症。出乎意料地，本发明的肽还有效抑制非酒精性脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)病理学。本发明部分地基于出乎意料的发现，即包含侧翼为色氨酸拉链和运铁蛋白受体结合结构域的反向类似物的衍生自VDAC1β链14及其胞质溶胶β-环的肽的反向-翻转类似物的肽与包含呈其天然形式的相同组分的对应肽相比具有增加的在水性溶液(包括生理溶液)中的溶解度、增加的稳定性和增加的细胞死亡诱导活性。发现反向-翻转类似物在诱导癌性细胞的死亡方面高度有效，并且能够跨越BBB。此外，发现反向-翻转类似物在减少与脂肪肝相关的症状方面高度有效。

根据一个方面，本发明提供了一种合成肽，所述合成肽包含VDAC1衍生肽的类似物，所述VDAC1衍生肽能够诱导癌性细胞中的凋亡，并且由5-26个连续氨基酸组成，其中所述类似物相对于所述VDAC1衍生肽被反向修饰并且被部分或完全翻转修饰。

如本文使用的，术语“反向修饰”指由L-氨基酸构成的肽类似物，所述肽类似物中的氨基酸残基以相对于所述肽类似物从其被反向修饰的肽相反的方向被组装。

如本文使用的，术语“翻转修饰”指由D-氨基酸构成的肽类似物，所述肽类似物中的氨基酸残基以相对于所述肽类似物从其被翻转修饰的肽相同的方向被组装。部分翻转修饰的类似物指包含至少一个D-氨基酸的肽。完全翻转修饰的类似物指由D-氨基酸构成的肽。

根据某些实施方案，类似物被部分翻转修饰。

根据某些示例性实施方案，类似物被完全翻转修饰。

根据某些实施方案，能够诱导癌性细胞中的凋亡的VDAC1衍生肽被命名为LP4并且由SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列(KKLETAVNLAWTAGNSN)组成。根据这些实施方案，反向类似物的氨基酸序列如SEQ ID NO:2中所列(NSNGATWALNVATELKK)。

如本文使用的，术语“反向-翻转”类似物指由D-氨基酸构成的肽类似物，所述肽类似物中的氨基酸残基以相对于所述肽类似物从其被反向-翻转修饰的肽相反的方向被组装。

根据某些示例性实施方案，如SEQ ID NO:2中列出的反向类似物的所有氨基酸均处于D构型，形成SEQ ID NO:1的反向-翻转修饰的类似物，所述反向-翻转修饰的类似物具有序列D-Asn-D-Ser-D-Asn-D-Gly-D-Ala-D-Thr-D-Trp-D-Ala-D-Leu-D-Asn-D-Val-D-Ala-D-Thr-D-Glu-D-Leu-D-Lys-D-Lys(SEQ ID NO:3)。

根据某些实施方案，能够诱导癌性细胞中的凋亡的VDAC1衍生肽由SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列(MAVPPTYADLGKSARDVFTKGYGFGL)组成，其对应于天然VDAC1的N-末端的氨基酸1-26。根据这些实施方案，反向类似物的氨基酸序列如SEQ ID NO:5中所列(LGFGYGKTFVDRASKGLDAYTPPVAM)。

根据某些示例性实施方案，如SEQ ID NO:5中列出的反向类似物的所有氨基酸均处于D构型，形成SEQ ID NO:4的反向-翻转修饰的类似物，所述反向-翻转修饰的类似物具有序列D-Leu-D-Gly-D-Phe-D-Gly-D-Tyr-D-Gly-D-Lys-D-Thr-D-Phe-D-Val-D-Asp-D-Arg-D-Ala-D-Ser-D-Lys-D-Gly-D-Leu-D-Asp-D-Ala-D-Tyr-D-Thr-D-Pro-D-Pro-D-Val-D-Ala-D-Met(SEQ ID NO:6)。

根据某些实施方案，合成肽还包含细胞识别和/或定位部分。定位部分通常增强合成肽通过细胞膜的通透性。本领域已知的任何识别和/或定位部分可以根据本发明的教导被使用，并且其可以经由直接的键或经由间隔物或接头被连接至VDAC1衍生肽的类似物的任何位置。根据某些示例性实施方案，细胞识别和/或定位部分为肽。根据一些实施方案，定位部分为细胞内定位肽，也被称为细胞穿透肽(CPP)。

根据一些实施方案，识别和/或定位肽为完全L-立体异构肽。根据其他实施方案，识别和/或定位肽为完全D-立体异构肽。

根据一些实施方案，识别和/或定位肽包含运铁蛋白受体结合结构域(Tf)或其片段。根据某些示例性实施方案，运铁蛋白受体结合结构域包含SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列(HAIYPRH)。根据一些实施方案，Tf肽由SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列组成。根据某些示例性实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:7的反向修饰的类似物，所述反向修饰的类似物具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列(HRPYIAH)。又根据另外的示例性实施方案，包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的任何一个中列出的氨基酸序列的运铁蛋白受体结合结构域为完全L-立体异构肽。

根据其他实施方案，识别和/或定位肽被部分或完全翻转修饰。根据一些实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:7的完全翻转类似物。根据某些示例性实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:8的完全翻转修饰的类似物。

根据另外的某些实施方案，识别和/或定位肽为包含果蝇(Drosophila)触角足(antennapedia)(Antp)结构域或其片段的氨基酸序列。根据一些实施方案，Antp结构域包含SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列(RQIKIWFQNRRMKWKK)或其片段。根据其他实施方案，Antp结构域由SEQ ID NO:9组成。

根据其他实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:9或其部分的部分翻转修饰的类似物。根据另外的实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:9或其部分的完全翻转修饰的类似物。根据另外的实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:9的反向修饰的类似物，所述反向修饰的类似物具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列(KKWKMRRNQFWIKIQR)或其部分。又根据另外的实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:10的翻转类似物。

根据一些实施方案，识别和/或定位肽被直接或间接连接至VDAC1衍生肽的类似物的N-末端。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据某些示例性实施方案，识别和/或定位肽被直接或间接连接至VDAC1衍生肽的类似物的C-末端。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

大多数小肽在溶液中是柔性的，并且不采用相同序列在天然蛋白中采用的结构。根据VDAC1拓扑模型，一些VDAC1衍生肽以β-环的形式存在。因此，根据某些实施方案，本发明的合成肽包含各自独立地位于VDAC1衍生肽的类似物的C-末端或N-末端的氨基酸序列SWTWE(SEQ ID NO:11)和KWTWK(SEQ ID NO:12)(均为“色氨酸(Trp)拉链肽”)。根据一些实施方案，Trp拉链肽包含SEQ ID NO:11的反向类似物，所述反向类似物具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列(EWTWS)。又根据另外的实施方案，Trp拉链肽包含SEQ ID NO:11-13中任一个的部分或完全翻转肽。Trp拉链肽序列可以通过色氨酸-色氨酸交叉链对诱导稳定的β-发夹的形成。

根据某些示例性实施方案，本发明的合成肽包含能够诱导凋亡并且由5-26个连续氨基酸组成的VDAC1衍生肽的类似物，其中所述类似物相对于VDAC1衍生肽被反向修饰并且被部分或完全翻转修饰并且其中所述类似物侧翼为在其N-末端和C-末端的Trp拉链氨基酸。

根据某些示例性实施方案，本发明提供了一种合成肽，所述合成肽包含侧翼为在其N-末端的具有SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列和在其C-末端的具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列的Trp拉链的SEQ ID NO:1的反向-翻转类似物，所述合成肽还包含具有SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列的识别和/或定位肽的反向类似物。根据某些当前优选的示例性实施方案，合成肽包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列(D-Lys-D-Trp-D-Thr-D-Trp-D-Lys-D-Asn-D-Ser-D-Asn-D-Gly-D-Ala-D-Thr-D-Trp-D-Ala-D-Leu-D-Asn-D-Val-D-Ala-D-Thr-D-Glu-D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Glu-D-Trp-D-Thr-D-Trp-D-ser-His-Arg-Pro-Tyr-Ile-Ala-His。

根据一些实施方案，肽由SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列组成。

又根据另外的实施方案，本发明提供了一种合成肽，所述合成肽包含侧翼为在其N-末端的具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的识别和/或定位肽的反向类似物的SEQID NO:4的反向-翻转类似物。根据某些实施方案，合成肽包含SEQ ID NO:15中列出的氨基酸序列(Lys-Lys-Trp-Lys-Met-Arg-Arg-Asn-Gln-Phe-Trp-Ile-Lys-Ile-Gln-Arg-D-Leu-D-Gly-D-Phe-D-Gly-D-Tyr-D-Gly-D-Lys-D-Thr-D-Phe-D-Val-D-Asp-D-Arg-D-Ala-D-Ser-D-Lys-D-Gly-D-Leu-D-Asp-D-Ala-D-Tyr-D-Thr-D-Pro-D-Pro-D-Val-D-Ala-D-Met)。

根据一些实施方案，本发明提供了一种合成肽，所述合成肽包含侧翼为在其N-末端的具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的识别和/或定位肽的SEQ ID NO:4的反向-翻转类似物。根据这些实施方案，合成肽包含SEQ ID NO:16中列出的氨基酸序列(Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Arg-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys-D-Leu-D-Gly-D-Phe-D-Gly-D-Tyr-D-Gly-D-Lys-D-Thr-D-Phe-D-Val-D-Asp-D-Arg-D-Ala-D-Ser-D-Lys-D-Gly-D-Leu-D-Asp-D-Ala-D-Tyr-D-Thr-D-Pro-D-Pro-D-Val-D-Ala-D-Met)。

根据另外的方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种根据本发明的合成肽和任选地药学上可接受的载体、稀释剂、盐或赋形剂，所述肽包含VDAC1衍生肽的类似物，所述VDAC1衍生肽能够诱导癌性细胞中的凋亡，并且由5-26个连续氨基酸组成，其中所述类似物相对于所述VDAC1衍生肽被反向修饰并且被部分或完全翻转修饰。

根据某些示例性实施方案，所述药物组合物包含具有选自由SEQ ID NO:14、SEQID NO:15和SEQ ID NO:16组成的组的氨基酸序列的至少一种合成肽。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据某些示例性实施方案，药物组合物包含具有SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列的合成肽。

根据其他示例性实施方案，药物组合物包含由选自由SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16组成的组的氨基酸序列组成的至少一种合成肽。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据某些示例性实施方案，药物组合物包含由SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列组成的合成肽。

根据某些实施方案，包含根据本发明的包含VDAC1衍生肽的类似物的合成肽的药物组合物还包含至少一种屏蔽颗粒(shielding particle)。在某些实施方案中，屏蔽颗粒包含聚乙二醇(PEG)和/或脂质和/或聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)。

根据另外的实施方案，药物组合物包含包封的根据本发明的包含VDAC1衍生肽的类似物的合成肽。在某些实施方案中，合成肽被包封到囊泡中或者被包封到免疫脂质体中。

本发明的合成肽和包含本发明的合成肽的药物组合物有效诱导凋亡和/或细胞死亡。此外，如本文下文例示的，与具有正常代谢活性的细胞(包括对应的健康细胞)相比，本发明的合成肽在诱导表现出高代谢活性的细胞(包括癌细胞)的死亡方面更加有效。

根据另外的方面，本文描述的本发明的合成肽和包含本发明的合成肽的药物组合物用于在抑制有害细胞增殖中使用。根据某些实施方案，药物组合物用于在治疗与异常凋亡和/或细胞过度增殖相关的疾病中使用。

又根据另外的方面，本发明提供了一种用于抑制有害细胞增殖的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的合成肽或包含本发明的合成肽的药物组合物施用至有相应需要的受试者。

根据另外的方面，本发明提供了一种用于治疗罹患与异常凋亡和/或细胞过度增殖相关的疾病的受试者的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的合成肽或包含本发明的合成肽的药物组合物施用至受试者。

根据某些实施方案，与异常凋亡和/或细胞过度增殖相关的疾病为癌症。根据某些示例性实施方案，癌症选自由白血病(包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL))、肝癌、神经胶质瘤(包括成胶质细胞瘤)、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和黑素瘤组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

根据某些实施方案，癌症为白血病。根据其他实施方案，癌症为CLL。又根据另外的实施方案，癌症为成胶质细胞瘤。根据其他实施方案，癌症为肝癌。

出乎意料地，本发明的合成肽还被发现有效预防和治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，特别地非酒精性脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。

根据另外的方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或与NAFLD相关的症状的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的合成肽或包含本发明的合成肽的药物组合物施用至有相应需要的受试者。

又根据另外的方面，本文描述的本发明的合成肽和包含本发明的合成肽的药物组合物用于在治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或与NAFLD相关的症状中使用。

根据某些实施方案，NAFLD选自由非酒精性脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)组成的组。根据一些实施方案，与NAFLD相关的症状选自由脂肪滴积累、炎症、纤维化、肝实质细胞的细胞死亡及其任意组合组成的组。

应当理解，本文公开的方面和实施方案的每一个的任意组合均明确地包括在本发明的公开内容中。本发明的其他目的、特征和优点从以下描述和附图将变得清楚。

附图简述

图1示出了与反向-Tf-D-LP4(Retro-Tf-D-LP4)肽相比，由包含VDAC-1衍生肽LP4的合成肽(被命名为Tf-D-LP4)诱导的白血病细胞死亡。使用的细胞系为THP1-来源于急性单核细胞性白血病(AML)患者的人类单核细胞系。

图2示出了与反向-Tf-D-LP4肽相比，由包含VDAC-1衍生肽LP4的合成肽(被命名为Tf-D-LP4)诱导的肝癌细胞死亡。使用的细胞系为来源于通过用甲基胆蒽环氧化物(methylcholanthrene epoxide)转化的BNL CL.2的BNL1ME。

图3示出了由反向-Tf-D-LP4诱导的癌性胰腺细胞死亡。图3A示出了反向-Tf-D-LP4对从来自56岁高加索(Caucasian)男性导管起源的胰腺癌建立的人类PANC-1细胞和对从小鼠(C57BL/6)胰腺导管癌建立的小鼠PANC-2细胞的作用。图3B示出了未处理的PANC-2细胞(对照)、与5％DMSO孵育的PANC-2和与用2μM反向-Tf-D-LP4一起孵育的PANC-2细胞的吖啶橙、溴化乙锭染色。

图4示出了由反向-Tf-D-LP4肽诱导的小鼠来源的B16F10.0黑素瘤癌细胞的细胞死亡。

图5示出了与反向-Tf-D-LP4相比，由包含VDAC-1衍生肽LP4的合成肽(被命名为Tf-D-LP4)诱导的神经胶质瘤癌细胞系U-87MG的细胞死亡百分比。使用的细胞系为GL-261，一种小鼠神经胶质瘤细胞系。

图6示出了由包含VDAC-1衍生肽LP4的合成肽(Tf-D-LP4；(○))；包含VDAC-1N-末端序列的部分的合成肽(D-ΔN-Ter-Antp；(●))和反向-Tf-D-LP4；(Δ))诱导的成胶质细胞瘤肿瘤来源的U-87MG细胞系的细胞死亡百分比。

图7示出了与非癌性细胞相比，反向-Tf-D-LP4对人类成胶质细胞瘤癌细胞的不同作用；以及与癌症干细胞相比，反向-Tf-D-LP4对癌细胞的不同作用。图7A示出了反向-Tf-D-LP4对人类成胶质细胞瘤癌细胞(U-87MG；(○))和对非癌性MDCK细胞(●)的不同作用。图7B示出了使用特异性抗体的U-87MG和G7干细胞细胞系中干细胞标志物Klf4、Sox2、Musashi和Nestin表达的免疫印迹分析，并且图7C示出了免疫印迹的定量分析。图7D示出了使用PI染色和流式细胞术的反向-Tf-D-LP4有效诱导G7干细胞(●)和U-87MG细胞(○)的细胞死亡，并且图7E示出了使用FITC-膜联蛋白V/PI染色(FITC-Annexin V/PI staining)和FACS分析的反向-Tf-D-LP4对凋亡的作用。

图8示出了反向-Tf-D-LP4的稳定性。将肽Tf-D-LP4和反向-Tf-D-LP4(0.5mM，在5％DMSO中)在-20℃、4℃或25℃孵育指定的时间。然后使用PI染色和FACS分析测定肽(10μM)以确定其诱导A549死亡的能力。在未处理的细胞中，细胞死亡为3％，而在具有肽的情况下，细胞死亡超过90％(n＝2)。仅当被储存于-20℃时，Tf-D-LP4保持其全部活性并且当被储存于4℃或25℃时，Tf-D-LP4保持其活性的75％(图8A)，而反向-Tf-D-LP4在所检查的所有温度(包括4℃和室温)保持其全部活性(图8B)。

图9示出了反向-Tf-D-LP4相对于Tf-D-LP4的较高的溶解度。将肽溶解于100％DMSO中，然后稀释了约10倍以将DMSO降低至10％-11％，并且将肽降低至4.4mM或4mM，并且在离心以去除不溶性肽后分析上清液(SUP)中可溶性肽的量。示出了反向-Tf-D-LP4相对于Tf-D-LP4的较高的溶解度。

图10示出了由游离和PLGA包封的反向-Tf-D-LP4诱导的成胶质细胞瘤细胞系U-87MG的细胞死亡。图10A：聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)及其降解产物的结构。图10B示出了肽被包封于PLGA纳米颗粒中，如通过用PLGA包封的反向-Tf-D-LP4(沉淀物)而非上清液(sup)诱导的细胞死亡显示的。细胞死亡通过PI染色和FACS分析来分析。

图11示出了反向-Tf-D-LP4对肿瘤生长的体内作用。图11A示出了移植了U-87MG细胞之后32天，小鼠脑的MRI成像。图11B呈现了细胞移植25天(深灰色柱)和32天(浅灰色柱)之后计算的肿瘤体积。结果＝平均值±SE(n＝6)(*p<0.05；***p<0.001)。图11C：显示PBS/DMSO与反向-Tf-D-LP4处理的小鼠之间的存活曲线中的统计学显著差异的Kaplan-Meier存活曲线。对照小鼠(点线)、包封于PLGA纳米颗粒中的反向-Tf-D-LP4肽(10mg/kg)(黑线)或反向-Tf-D-LP4肽(10mg/Kg，间断线)的累积Kaplan-Meier存活曲线。

图12示出了由反向-Tf-D-LP4肽对如通过DEN的小鼠处理诱导(DEN-诱导的肝癌)的肝中的肿瘤发展的抑制。图12A示出了实验方案的示意图。图12B-C示出了来自对照(图12B)和反向-TF-D-LP4肽治疗的小鼠(图12C)的肝的MRI成像。图12D示出了来自DEN处理的对照小鼠(未治疗的)和反向-TF-D-LP4肽治疗组的肝的照片。图12E示出了对照和反向-TF-D-LP4肽治疗组的肝重量。结果＝平均值±SEM(n＝5)(p：***≤0.001)。

图13示出了反向-Tf-D-LP4介导的体内脂肪变性肝病理学的抑制。图13A：由高脂肪饮食(HFD)诱导的脂肪变性发展过程和反向-Tf-D-LP4肽治疗的启动过程的示意图。图13B：在第9周结束时小鼠被处死之后取出的肝的照片。图13C：图13B中呈现的肝的重量(ND：食物(chow)(正常)饮食)。结果＝平均值±SEM(n＝5)(p：*，0.05；**≤0.005)。

图14示出了接受食物饮食(ND)的小鼠、接受HFP-32饮食的小鼠和接受HFD-32并且用反向-Tf-D-LP4肽治疗的小鼠中的血糖水平。结果＝平均值±SEM(n＝5)(p：**≤0.003)。

图15示出了从接受食物饮食(ND)的小鼠、接受HFD并且用在HBSS缓冲液中的0.9％DMSO i.v.治疗的小鼠或接受HFD并且用反向-Tf-D-LP4(10mg/Kg，0.9％DMSO)i.v.治疗的小鼠获取的肝切片。代表性H&E染色(图15A)和油红染色(图15B)。在HFD中发展的脂肪变性在反向-Tf-D-LP4治疗后被预防。

图16示出了反向-Tf-D-LP4i.v.治疗对脂肪变性的抑制的积极作用。图16A：显示出气球样变(ballooning)的代表性H&E染色。图16B：显示出炎症(箭头)的代表性H&E染色。图16C：针对纤维化(箭头)的天狼星红染色。所有都在接受HFD-32的小鼠中显示，而在接受HFD-32并且用反向-Tf-D-LP4(10mg/Kg)治疗的小鼠或接受食物饮食(ND)的小鼠中则未显示。

图17示出了反向-Tf-D-LP4介导的体内NASH肝病理学的抑制。图17A：通过HFD-32饮食诱导的脂肪变性后NASH发展和肽治疗的起点的示意图。图17B：在第12周结束时小鼠被处死之后取出的肝的照片。图17C：图17B中呈现的肝的重量(p：*≤0.05，**≤0.01)。图17D：以下中的体脂肪重量：从接受HFD-32的小鼠以及从接受HFD-32并且用反向-Tf-D-LP4肽治疗的小鼠(n＝5)分离的附睾脂肪(epididymal fat)(附睾(epididymis))、肠系膜(mesenteric)(肠系膜(mesentay))脂肪。

图18示出了来自接受食物(ND)的小鼠的肝切片的代表性H&E染色(图18A)和来自罹患NASH的小鼠的显示脂肪变性(图18B)、气球样变(图18C)和炎症(环状)(图18D)的肝切片的代表性H&E染色，所述肝切片来自接受HFD、在HBSS缓冲液中的0.9％DMSO(i.v.)或10mg/Kg反向-Tf-D-LP4的小鼠的肝切片。

图19示出了来自通过HFD-32饮食诱导的脂肪变性后NASH以及来自用反向-Tf-D-LP4肽治疗的小鼠的小鼠肝切片的天狼星红染色。箭头指向纤维化(胶原)的存在。

图20示出了从在第12周的HFD-32-饲喂的小鼠和从反向-Tf-D-LP4(10mg/kg)治疗的小鼠获取的肝切片的代表性H&E染色。比例尺(Bar)＝100μm。肿瘤结节(nodule)用虚线标记出。

图21示出了反向-Tf-D-LP4预防DEN诱导的肝癌(HCC)中发展的脂肪变性和NASH。图21A：代表性H&E染色显示从被诱导DEN诱导的HCC的但未接受反向-Tf-D-LP4的(未治疗)小鼠获得的肝切片中的脂肪变性、炎症和气球样变，而在反向-Tf-D-LP4-治疗的小鼠(18mg/Kg i.v.)中未显示脂肪变性、炎症和气球样变。图21B示出了来自通过DEN诱导癌症并且用反向-Tf-D-LP4治疗或未治疗(对照)的小鼠的肝切片的天狼星红染色。箭头指向纤维化的存在。

发明详述

本发明提供了合成肽，所述合成肽包含衍生自VDAC1的肽的反向-翻转类似物，其与未修饰的肽相比保存并且甚至具有改进的活性以及新的活性。另外，反向-翻转类似物具有改进的溶解度和稳定性、能够跨越血脑屏障并且因此非常适于被用作治疗性肽。

术语“VDAC1”和“hVDAC1”在本文可互换使用，并且指高度保守的线粒体孔蛋白家族的人类电压依赖性阴离子通道同种型1(hVDAC1)。迄今，已知由三个基因编码的四种VDAC同种型；如本文使用的，术语“VDAC1”和人类“hVDAC1”指283个氨基酸的蛋白(NP_003365)。

如本文使用的，术语“肽”意指包括天然的、非天然的和/或化学修饰的氨基酸残基，每一个残基的特征在于具有通过肽键或非肽键彼此连接的氨基末端和羧基末端。正如本领域通常已知的，氨基酸残基在整个说明书和权利要求中以一个或三个字母的代码表示。本发明的具体肽优选地以β-发夹形式被利用。

根据一个方面，本发明提供了一种合成肽，所述合成肽包含基于VDAC1的肽的类似物，所述基于VDAC1的肽能够诱导癌性细胞中的凋亡，并且由5-26个连续氨基酸组成，其中所述类似物相对于VDAC1衍生肽被反向修饰并且被部分或完全翻转修饰。

如本文使用的，术语“VDAC1衍生肽的类似物”或“基于VDAC1的肽的类似物”指能够至少模拟所述“VDAC1衍生肽的类似物”或“基于VDAC1的肽的类似物”相对于其被修饰的衍生自VDAC1的天然肽诱导癌性细胞死亡的合成肽分子。

如本文使用的，术语“翻转修饰”指由至少一个D-氨基酸构成的肽类似物，所述肽类似物中的氨基酸残基以相对于所述肽类似物从其被翻转修饰的肽相同的方向被组装。部分翻转修饰的类似物指包含至少一个D-氨基酸的肽。完全翻转修饰的类似物指由D-氨基酸构成的肽。

如本文使用的，术语“反向-翻转”修饰指由D-氨基酸构成的肽类似物，所述肽类似物中的氨基酸残基以相对于所述肽类似物从其被反向翻转修饰的肽相反的方向被组装。

根据某些实施方案，VDAC1衍生肽由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的任一个中列出的氨基酸序列组成。根据某些实施方案，VDAC1衍生肽由SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列组成。根据某些另外的实施方案，VDAC1衍生肽由SEQ ID NO:4中列出的氨基酸序列组成。

根据某些示例性实施方案，VDAC1衍生肽的类似物为相对于SEQ IDNO:1的反向-翻转类似物。根据这些实施方案，VDAC1衍生肽的类似物由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列组成，其中所有氨基酸均为D-氨基酸以形成SEQ ID NO:3。

根据某些另外的示例性实施方案，VDAC1衍生肽的类似物为相对于SEQ ID NO:4的反向-翻转类似物。根据这些实施方案，VDAC1衍生肽的类似物由SEQ ID NO:5中列出的氨基酸序列组成，其中所有氨基酸均为D-氨基酸以形成SEQ ID NO:6。

根据某些实施方案，合成肽还包含细胞识别和/或定位部分。根据一些实施方案，细胞定位部分增强合成肽的通透性。“通透性”指剂或物质穿透(penetrate)、渗透(pervade)或扩散通过屏障、膜或皮肤层的能力。“细胞通透性部分”或“细胞穿透部分(cell-penetration moiety)”或“细胞通透性增强部分”指本领域已知的能够促进或增强分子穿透通过膜的任何分子。非限制性实例包括：疏水性部分，诸如脂质、脂肪酸、类固醇和大的芳香族或脂肪族化合物；可以具有细胞膜受体或载体的部分，诸如类固醇、维生素和糖、天然和非天然氨基酸、转运蛋白肽；纳米颗粒和脂质体。

根据某些示例性实施方案，识别和/或定位部分为肽细胞穿透增强部分。通常被称为细胞穿透肽(Cell Penetrating Peptides)或细胞穿透肽(Cell PenetrationPeptides)(CPP)的此类肽由短肽序列组成，所述短肽序列以似乎不依赖于能量且有时不依赖于受体的方式将分子(包括大分子)快速易位至细胞内部。CPP具有低毒性和高递送产量。示例性CPP为Antp结构域(具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列)、HIV-1转录因子TAT、来自HSV-1的VP22。运铁蛋白受体(TfR)通过其与运铁蛋白的相互作用在细胞铁吸收中起作用。该受体为用于癌症靶向疗法的有吸引力的分子，因为它在许多癌症类型的表面被上调并且被有效地内化。Tf为被运铁蛋白受体所识别的肽序列，具有SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列。出乎意料地，本发明现在显示具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列的运铁蛋白受体结合结构域的反向类似物也可以被用作癌细胞识别和穿透部分。

根据某些示例性实施方案，识别和/或定位肽包含SEQ ID NO:7或其反向类似物，所述反向类似物具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列。根据另外的示例性实施方案，识别和/或定位肽由SEQ ID NO:7或其反向类似物组成，所述反向类似物由SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列组成。根据其他实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的部分翻转修饰的类似物。根据另外的实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8的完全翻转修饰的类似物。

根据某些另外的示例性实施方案，识别和/或定位肽包含SEQ ID NO:9或其反向类似物，所述反向类似物具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列。根据另外的示例性实施方案，识别和/或定位肽由SEQ ID NO:9或其反向类似物组成，所述反向类似物由SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列组成。根据其他实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:9或SEQID NO:10的部分翻转修饰的类似物。根据另外的实施方案，识别和/或定位肽为SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的完全翻转修饰的类似物。

根据某些实施方案，本发明的合成肽包含各自独立地位于VDAC1衍生肽的类似物的C-末端或N-末端的氨基酸序列SWTWE(SEQ ID NO:11)和KWTWK(SEQ ID NO:12)(均为“色氨酸(Trp)拉链肽”)或其反向类似物。

根据某些实施方案，Trp拉链肽或其反向类似物为完全L-立体异构肽。根据其他实施方案，Trp拉链肽或其反向类似物被部分翻转修饰。根据另外的实施方案，Trp拉链肽或其反向类似物被完全翻转修饰，仅包含D-氨基酸。根据一些实施方案，Trp拉链肽的反向类似物包含SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列(EWTWS)。又根据另外的实施方案，Trp拉链肽包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或其组合的反向-翻转类似物。

根据另外的示例性实施方案，本发明提供了一种合成肽，所述合成肽包含侧翼为在其N-末端的具有SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列和在其C-末端的具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列的Trp拉链的SEQ ID NO:1的逆转类似物，所述合成肽还包含具有SEQID NO:8中列出的氨基酸序列的识别和/或定位肽。根据一些实施方案，合成肽包含SEQ IDNO:19中列出的氨基酸序列(Lys-Trp-Thr-Trp-Lys-D-Asn-D-Ser-D-Asn-D-Gly-D-Ala-D-Thr-D-Trp-D-Ala-D-Leu-D-Asn-D-Val-D-Ala-D-Thr-D-Glu-D-Leu-D-Lys-D-Lys-Glu-Trp-Thr-Trp-Ser-His-Arg-Pro-Tyr-Ile-Ala-His)。根据某些示例性实施方案，该肽由SEQID NO:19组成。

本发明的合成肽的示例性序列从N-末端至C-末端包含：Trp拉链肽(其具有SEQ IDNO:12中列出的氨基酸序列，其中氨基酸为D-氨基酸)、随后是SEQ ID NO:1的反向-翻转类似物(其具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，其中氨基酸为D-氨基酸以形成SEQ ID NO:3)、随后是Trp拉链肽(其具有SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列，其中氨基酸为D-氨基酸)、随后是具有SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列的Tf识别和/或定位肽的反向类似物(该反向类似物具有SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列)。本文可互换地被称为反向-Tf-D-LP4、反向-翻转肽、反向-翻转Tf-D-LP4(retro-inversoTf-D-LP4)或反向-翻转Tf-D-LP4(retro-inverse Tf-D-LP4)的肽由氨基酸序列D-Lys-D-Trp-D-Thr-D-Trp-D-Lys-D-Asn-D-Ser-D-Asn-D-Gly-D-Ala-D-Thr-D-Trp-D-Ala-D-Leu-D-Asn-D-Val-D-Ala-D-Thr-D-Glu-D-Leu-D-Lys-D-Lys-D-Glu-D-Trp-D-Thr-D-Trp-D-ser-His-Arg-Pro-Tyr-Ile-Ala-His(SEQ IDNO:14)组成。

本发明的合成肽的另外的示例性序列从N-末端至C-末端包含：具有SEQ ID NO:9中列出的氨基酸序列的Antp细胞穿透肽的反向类似物(该反向类似物具有SEQ ID NO:10中列出的氨基酸序列)、随后是SEQ ID NO:4的反向-翻转类似物(其具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，其中氨基酸为D-氨基酸以形成SEQ ID NO:6)。在本文被称为“反向-翻转N-末端”或反向-D-N-Ter的肽由氨基酸序列Lys-Lys-Trp-Lys-Met-Arg-Arg-Asn-Gln-Phe-Trp-Ile-Lys-Ile-Gln-Arg-D-Leu-D-Gly-D-Phe-D-Gly-D-Tyr-D-Gly-D-Lys-D-Thr-D-Phe-D-Val-D-Asp-D-Arg-D-Ala-D-Ser-D-LyD-Gly-D-Leu-D-Asp-D-Ala-D-Tyr-D-Thr-D-Pro-D-Pro-D-Val-D-Ala-D-Met(SEQ ID NO:15)组成。

根据某些实施方案，本发明的肽的C-末端可以被酰胺化、酰化、还原或酯化。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

如本文使用的，术语“凋亡”或“凋亡细胞死亡”指程序性细胞死亡，其可以通过细胞皱缩、膜起泡和染色质凝缩、以细胞碎裂告终被表征。经历凋亡的细胞还表现出特征性的DNA裂解模式。可选地，凋亡可以通过凋亡途径的成员的活性或表达中的变化来间接表征，例如细胞色素c的增加的线粒体释放。本领域已知的凋亡诱导试剂的非限制性实例包括放线菌素D、抗生素A-23187、β-拉帕醌、喜树碱(Camptothecin)、神经酰胺、姜黄素、地塞米松、依托泊苷

金丝桃素(Hypericin)、前列腺素A2、S-亚硝基谷胱甘肽、星形孢菌素、舒林酸硫化物、舒林酸砜化物、紫杉醇

硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、15(S)-HPETE、4-羟基苯基视黄酰胺、桦木酸等。

如下文例示的，反向-Tf-D-LP4在诱导癌细胞死亡方面高度有活性。此外，如以人类原发性成胶质细胞瘤细胞系U-87(图5)例示的，与非恶性小猎犬肾上皮细胞(Madin-Darby Canine Kidney epithelial cells)相比，包含VDAC-1衍生肽LP4的反向-翻转类似物的合成肽在诱导癌细胞死亡方面有效得多。

反向-Tf-D-LP4肽包含运铁蛋白受体结合结构域的反向类似物。出乎意料地，本发明现在证明了该反向类似物具有与天然肽等同的识别和/或定位活性。

如本文下文进一步例示的，反向-Tf-D-LP4被证明有效抑制体内癌症的发展。使用了两种模型；一种显示了反向-TF-D-LP4对脑肿瘤颅内异种移植物发展的作用，并且另一种显示了该肽对二乙基亚硝胺(DEN)诱导的肝癌的作用。

在脑原位肿瘤模型中，将成胶质细胞瘤U-87MG细胞移植到裸小鼠脑中。用游离的反向-Tf-D-LP4肽或用PLGA纳米颗粒包封的肽i.v.治疗的小鼠显示出显著较低的肿瘤体积(对于游离肽低了多达90％，图11)。这些结果表明，肽当呈游离形式时同样最有可能跨越BBB。不希望受任何特定的理论或作用机制所束缚，跨越BBB可能由与VDAC衍生的类似物连接的TfR识别序列介导，尽管Tf结构域如上文描述的也处于反向构型。

在DEN诱导的肝细胞癌(HCC)中，将小鼠静脉内注射反向-Tf-D-LP4肽或对照溶液(HBSS中的2％DMSO)。在未治疗的对照组中，小鼠肝显示出高数目的肿瘤结节(图12B、12D)，而在用该肽治疗的小鼠中未观察到肿瘤结节(图12C、12D)。与来自用反向-Tf-D-LP4肽治疗的小鼠的肝相比，在对照组中的肝的尺寸和重量是大的(图12E)。这些结果显示该肽抑制肿瘤发展。

出乎意料地，本发明的反向-翻转肽在预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)方面进一步表现出显著的活性。用于脂肪性肝炎/NASH的模型(STAM)基于HFD-32，其中脂肪性肝病被卡路里过量而诱导(如在患有NASH的大多数人中出现的)，显示人类NASH的所有生理学、代谢、组织学和临床终点。在HFD-32饲喂启动后，小鼠发展脂肪性肝炎，具有肝实质细胞中的脂肪滴积累、分散的炎性细胞浸润、气球样变和Mallory-Denk小体(Mallory-Denkbodies)、纤维化和最后的HCC结节(图13-20)。静脉内施用的基于VDAC1的肽，反向-Tf-D-LP4消除或高度减少所有这些肝病理学。来自肽治疗的小鼠的肝显示出非常低的脂肪沉积、炎性细胞浸润或胶原纤维(图13-20)。

根据另外的方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种合成肽和任选地药学上可接受的载体、稀释剂、盐或赋形剂，所述合成肽包含VDAC1衍生肽的类似物，所述VDAC1衍生肽能够诱导癌性细胞中的凋亡，并且由5-26个连续氨基酸组成，其中所述类似物相对于所述VDAC1衍生肽被反向修饰并且被部分或完全翻转修饰。

术语“药学上可接受的载体”指将活性组分递送至预期靶并且不会对人类或其他接受者生物体造成伤害的媒介物。如本文使用的，“药物”将被理解为包括人用药物和动物用药物两者。有用的载体包括，例如，水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1,3-二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯或矿物油。用于配制药物组合物的方法和组分是熟知的，并且可以见于，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro，编著，MackPublishing Co.Easton Pa.,1990中。

药物组合物还可以包含其他任选的材料，其可以根据载体和/或组合物的预期用途来选择。另外的组分包括，但不限于，抗氧化剂、螯合剂、乳液稳定剂(例如，卡波姆)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯)、芳香剂、湿润剂(例如，甘油)、防水剂(例如，PVP/二十碳烯共聚物(PVP/Eicosene Copolymer))、水溶性膜形成物(例如，羟丙基甲基纤维素)、油溶性膜形成物、阳离子或阴离子聚合物等。

除了其他考虑因素以外，本发明的新颖活性成分为肽、肽类似物或肽模拟物的事实决定了制剂适于递送这些类型的化合物。尽管通常肽由于易受胃酸或肠内酶的消化的影响而不太适于口服施用，由于观察到本发明稳定的反向-翻转肽的高活性，本发明的组合物可以口服施用。另外，使用新颖方法来设计和提供代谢稳定的且口服生物可利用的肽模拟物类似物。

本发明的药物组合物可以通过任何合适的手段(means)施用，诸如局部施用或肠胃外施用，包括鼻内、皮下、肌内、静脉内、动脉内、关节内或病灶内施用。

本发明的分子作为活性成分被溶解、分散或掺和于药学上可接受的并且与活性成分相容的稀释剂或赋形剂中，如熟知的。合适的赋形剂为，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、右旋糖(dextrose)、甘油、乙醇等及其组合。其他的合适的载体是本领域技术人员熟知的。(参见，例如，Ansel等，1990以及Gennaro,1990)。此外，如果期望，组合物可以包含少量辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂。

如本文例示的(图9)，本发明现在证明了包含VDAC1衍生肽的反向-翻转类似物的合成肽在生理上相容的溶液中为高度可溶的。这种溶解度为本发明的反向-翻转肽胜过迄今已知的衍生自VDAC1的肽的显著优点，使得所述肽与用于作为药物使用高度相容。

根据某些实施方案，与异常凋亡和/或细胞过度增殖相关的疾病为癌症。根据某些示例性实施方案，癌症选自由神经胶质瘤，包括成胶质细胞瘤；肝癌，包括肝细胞癌；白血病，包括慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；胰腺和乳腺癌以及黑素瘤组成的组。每一种可能性代表本发明的单独的实施方案。

如本文使用的，术语“治疗”意指补救性处理，并且包括术语“减少(reducing)”、“抑制(suppressing)”、“改善”和“抑制(inhibiting)”，其具有其通常被理解的以下含义：减少或阻止肿瘤生长和/或减少或阻止癌细胞增殖和/或减少癌症干细胞的致瘤性和/或减少或阻止NAFLD及与NAFLD相关的症状的发展。

根据某些实施方案，本发明的肽用于预防性使用，特别地用于预防和/或减少NAFLD，特别地非酒精性脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的进展。

如本文使用的，术语“治疗有效量”指当被施用于受试者时能够发挥抗癌活性和/或减少或阻止NAFLD及相关症状的药物组合物的量。又根据另外的方面，本文描述的本发明的合成肽和包含本发明的合成肽的药物组合物用于在治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或与NAFLD相关的症状中使用。

以下实施例被呈现以更充分地说明本发明的一些实施方案。然而，其绝不应以任何方式被解释为限制本发明的宽范围。本领域技术人员可以容易地设想本文公开的原理的许多变化形式和修改，而不偏离本发明的范围。

实施例

材料和方法

细胞培养

将THP-1、BNL1ME、GL-261、PANC-1、PANC-2、B16F10.0、MDCK、U-87MG、U-251MG、U-118MG、LN-18细胞系维持在37℃和5％CO₂在推荐的具有10％FCS、青霉素(100u/ml)和链霉素(100μg/ml)的培养基中。

用基于VDAC1的肽的细胞处理及细胞死亡分析

对悬浮液中的细胞进行计数(2×10⁶个/ml)并且在同一天进行处理，而对贴壁细胞进行计数并且接种(1.5-2×10⁵个/ml)于12孔板中16-24h，然后进行处理。将悬浮液中的细胞或贴壁细胞在无血清培养基(分别为200μl或500μl)中与不同浓度感兴趣的肽在37℃在5％CO₂的存在下一起孵育(分别为90min或6h)。收集细胞(贴壁细胞通过胰蛋白酶消化收集)、离心(1500×g,5min)、用PBS洗涤一次并且使用碘化丙啶(PI)染色和流式细胞仪(Beckton-Dickinson,San Jose,CA)以及BD CellQuest Pro软件分析死亡细胞。

肽

对照合成肽包含具有SEQ ID NO:1(被命名为LP4)中列出的氨基酸序列的VDAC1衍生肽，其中SEQ ID NO:1的氨基酸为D-氨基酸，侧翼为在其N-末端的具有SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列和在其C-末端的具有SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的Trp拉链(所述氨基酸处于D-构型)以及与SEQ ID NO:11的N-末端连接的具有SEQ ID NO:7中列出的氨基酸序列的Tf定位肽，以形成SEQ ID NO:17(His-Ala-Ile-Tyr-Pro-Arg-His-D-Ser-D-Trp-D-Thr-D-Trp-D-Glu-D-Lys-D-Lys-D-Leu-D-Glu-D-Thr-D-Ala-D-Val-D-Asn-D-Leu-D-Ala-D-Trp-D-Thr-D-Ala-D-Gly-D-Asn-D-Ser-D-Asn-D-Lys-D-Trp-D-Thr-D-Trp-D-Lys)。该肽被命名为Tf-D-LP4。

所检查的被命名为反向-Tf-D-LP4的合成肽包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列，SEQ ID NO:14的构成如上文描述。

通过GL Biochem(中国上海)分析肽为>95％纯。将肽如下溶解：将2mg的Tf-D-LP4或反向-Tf-D-LP4溶解于5μl的100％DMSO中以得到具有400mg/ml(97.36mM)的肽浓度的溶液，并且将该溶液在37℃水浴进一步孵育30分钟。然后，通过添加95μl蒸馏水同时混合将该溶液稀释至20mg/ml(4.86mM)的肽浓度，并且将所稀释的溶液在37℃水浴中孵育30分钟以允许进一步溶解直至溶液变澄清。然后，将肽溶液以15,000g离心5min，并且将各制备物(preparation)的上清液转移至具有低结合能力的新Eppendorf管中。获取所获得溶液的等分试样以进一步分析肽浓度。

碘化丙啶(PI)染色

将PI溶液用PBS稀释至0.5mg/ml的终浓度。将2.5μl的PI溶液添加至各个FACS管中，并且将管温和涡旋以使细胞悬浮液均质。在FACS通道FL3中测量细胞存活力，并且使用CellQuest Pro软件分析数据。

苏木精/伊红(H&E)，油红O；Masson三色和天狼星红染色

石蜡包埋的肝切片(5μm厚)的苏木精/伊红(H&E)染色使用标准方案来进行。

油红O染色是为了染色细胞中的脂质滴而进行的测定。将通过将新鲜肝样本包埋于O.C.T化合物(Scigen,USA)中制备的冷冻切片用60％异丙醇温和洗涤，并且用0.5g油红O(BDH chemicals,England)在60％异丙醇中的工作溶液染色15min。将染色的切片用蒸馏水洗涤若干次以去除未掺入的染料。然后，将样品用苏木精复染5min。使用光学显微镜检查结果。脂质滴显现出红色，并且核显现出蓝色。

Masson三色(Bio optica,Italy)染色如先前描述(Martinello T等2015.HistolHistopathol.30(8),963-969)来进行。通过这种染色，胶原显现出蓝色，肌纤维显现出红色，并且核显现出黑色/蓝色。

天狼星红(Sigma,USA)染色如先前描述(Zhang Y等2014.Hepatology 60,919-930)在石蜡包埋的肝切片上进行。简言之，将固定并且包埋于石蜡切片中的肝组织用0.1％天狼星红-苦味酸溶液染色。将切片用乙酸快速洗涤并且在光学显微镜下拍照。在浅黄色背景上胶原显现出红色。

异种移植物实验

对于颅内-原位异种移植物小鼠模型，使用立体定向装置将U-87MG细胞(8×10⁴个)移植到裸小鼠脑中。在手术之后48小时，将小鼠随机分为三组(6只动物/组)并且用DMSO(1.44％)、反向-Tf-D-LP4(10mg/Kg)或包封于PLGA纳米颗粒中的反向-Tf-D-LP4(10mg/Kg)每三天进行治疗。使小鼠经历MRI，并且然后处死。切离脑并且进行处理用于IHC。使用VivoQuant 2.10软件分析肿瘤体积。

肝癌的诱导

对于肝癌的诱导，使用二乙基亚硝胺(DEN)，也被称为N-亚硝基二乙胺。DEN在实验动物模型中被广泛用作致癌物(Shirakami Y等2012.Carcinogenesis 33,268–274；Tolba,R等2015.Lab Anim 49,59–69)。

将14天龄的C57BL/6小鼠(雄性)以20mg/kg体重注射(i.p)DEN(Sigma-Aldrich)，并且此后定期检查。通过随机处死2只小鼠来检查小鼠的肝肿瘤发展。肿瘤发展从30周时开始。在确认肿瘤发展之后，将小鼠如下分组：对照组小鼠(n＝12)，静脉内接受50μl的在HBSS缓冲液中的2％DMSO；治疗组(n＝12)，通过静脉内注射接受18mg/Kg反向-Tf-D-LP4。在前两周给予肽治疗，持续三次，然后每周两次多达43周。肿瘤尺寸通过MRI进行分析。在实验结束时，将小鼠处死；将肝拍照并且固定于在PBS中的4％甲醛中用于组织病理学分析。

非酒精性脂肪性肝炎-肝细胞癌(NASH-HCC)小鼠模型

雄性和雌性C57Bl/6小鼠从ENVIGO(Jerusalem,Israel)购得。将所有小鼠保持在无菌条件下在本-古里安大学(Beer-Sheva Israel)的动物设施中。脂肪变性-NASH–HCC如先前描述(Fujii M等Med Mol Morphol 46,141-152)获得。为了诱导脂肪变性-NASH，繁殖小鼠，并且将两天龄新生雄性小鼠皮下注射链脲佐菌素(STZ)(200μg/小鼠)，并且将其送回至乳母所在的笼中。

在4周龄时，使小鼠经历高脂肪饮食(HFD-32)。肝脂肪变性病理学在6周时开始发展且NASH在9周时开始发展。将小鼠分组为对照组(n＝10)和治疗组(n＝10)，并且对于脂肪变性研究在第7周至第9周开始治疗，以及对于NASH研究在第9周至第12周开始治疗。对照组接受50μl的在HBSS缓冲液中0.9％DMSO。治疗组-1(n＝10)接受10mg/kg反向-Tf-D-LP4(SEQID NO:14)，并且治疗组-2(n＝10)接受18mg/kg反向-Tf-D-LP4(SEQ ID NO:14)，所有都通过静脉内注射。肽治疗每周给予三次。在实验结束时，将小鼠用在PBS中的氯胺酮(100mg/kg)和Xylasine(10mg/kg)麻醉，并且获取血液样品。将胸部打开并且从心脏获得血液。然后，通过CO₂吸入处死小鼠。将肝取出、拍照并且称重。将部分肝固定、包埋于石蜡中、切片并且如以上描述经历苏木精/伊红(H&E)染色。对于油红染色，将部分肝在最佳切割温度化合物(O.C.T)中冷冻、包埋、切片并且如以上描述的使用油红O染色对脂肪内含物进行染色。

血糖水平使用Accu-

Performa血糖仪(Accu-

)来测量。

NASH-HCC模型小鼠的饮食干预

将四周龄的先前注射STZ的雄性小鼠与母亲分离并且在整个实验过程期间用高脂肪饮食(HFD-32)饲喂。HFD-32饲料包括5％蛋清粉(MM Ingredients；Wimborne,UK)；6.928％乳糖(PHARMA GRADE；Nelson,UK)；15.88％牛脂肪(饱和)粉末(包含80％牛脂肪)(MP Biomedical,LLC；Illkirch,France)；24.5％鲜奶级干酪素(milk casein)(ShaanxiFuheng(SF)Biotechnology；Xi'an,China)；20％红花油(高油酸型)(Bustan aBriut；Galil,Israel)；6.45％蔗糖(Sigma,St；Louis,MO)；0.36％酒石酸氢胆碱(cholinebitartrate)(BULK POWDERS,Colchester,UK)；5.5％结晶纤维素(Sigma,St；Louis,MO)；0.43％L-半胱氨酸(Source Naturals,Scotts Valley,USA)；8.25％麦芽糖糊精(BULKPOWDERS,Colchester,UK)；5％AIN93G-矿物质混合物(MP Biomedical,LLC；Illkirch,France)；1.4％AIN93VX-维生素混合物(MP Biomedical,LLC；Illkirch,France)和0.002％叔丁基对苯二酚(tertiary butyl hydroquinone)(MP Biomedical,LLC；Illkirch,France)。将对照C57Bl/6小鼠用标准食物饮食饲喂。

动物研究遵照机构动物护理和使用委员会(the Institutional Animal Careand Use Committee)(IACUC)、本-古里安大学的研究动物资源中心(RARC)(the ResearchAnimal Resource Center(RARC)of Ben-Gurion University)和国立卫生研究院(theNational Institutes of Health)(NIH)“对于实验室动物的护理和使用的指导(Guidefor the Care and Use of Laboratory Animals)”的所有适用政策、程序及法规要求来进行。

实施例1：白血病细胞中细胞死亡的诱导

在本实验中使用来源于急性单核细胞性白血病患者的人类单核细胞系细胞(THP-1细胞，400,000个细胞/孔)。如本文以上描述的，将对照(Tf-D-LP4)和测定反向-翻转(反向-Tf-D-LP4)肽的每一个以若干浓度添加至无血清培养基中，并且将细胞在37℃在5％CO₂的存在下在各肽类型的存在下孵育90min。

如图1中示出的，两种肽均诱导显著的细胞死亡。与对照肽(Tf-D-LP4)的8μM的EC₅₀相比，获得了通过反向-翻转肽(反向-Tf-D-LP4)的细胞死亡的4.5μM的EC₅₀。

实施例2：肝癌细胞中细胞死亡的诱导

图2示出了对照(Tf-D-LP4)和检查的反向-翻转肽(反向-Tf-D-LP4)对癌性肝小鼠BNL1ME细胞系的作用。将细胞在37℃在5％CO₂的存在下在无血清培养基中与各肽类型一起孵育6h。

与白血病细胞一样，两种肽均诱导大量细胞死亡，具有类似的EC₅₀(对于反向-Tf-D-LP4和Tf-D-LP4，EC₅₀分别为2.5μM和2.7μM)。然而，用反向-翻转肽获得更高的最大细胞死亡诱导(95％，与70％相比)。

实施例3：PANC-1或PANC2细胞中细胞死亡的诱导

在该测定中使用人类(PANC-1)和小鼠(PANC-2)癌性胰腺细胞。接种细胞(100,000个细胞/孔)并且在37℃在5％CO₂的存在下在无血清培养基中用反向-Tf-D-LP4肽处理6h。细胞死亡通过PI染色分析并且细胞死亡百分比通过流式细胞术测量。

如图3A中示出的，反向-翻转肽(反向-TF-D-LP4)诱导两种细胞系中的细胞死亡，具有约4μM的EC₅₀。

图3B示出了PANC-2细胞的吖啶橙、溴化乙锭染色，证明反向Tf-D-LP4诱导凋亡。

实施例4：黑素瘤细胞中细胞死亡的诱导

接种B16F10.0黑素瘤细胞(在12-孔板中150,000个细胞/孔)并且次日在37℃在5％CO₂的存在下在无血清培养基中与指定浓度的反向-Tf-D-LP4肽一起孵育6h。细胞死亡通过PI染色和FACS来分析。

如图4中示出的，反向-翻转肽(反向-TF-D-LP4)诱导浓度依赖性细胞死亡，具有7μM的EC₅₀。

实施例5：小鼠神经胶质瘤细胞中细胞死亡的诱导

将小鼠神经胶质瘤GL-261细胞在37℃在5％CO₂的存在下在无血清培养基中与若干浓度的对照Tf-D-LP4或反向-Tf-D-LP4肽一起孵育6h，并且细胞死亡通过PI染色和FACS来分析。

如图5中示出的，两种肽诱导显著的细胞死亡；然而与对照肽相比通过反向-翻转肽(反向-TF-D-LP4)诱导的细胞死亡显著更高，与对照肽的3.3μM的EC₅₀相比，具有2.2μM的EC₅₀。

实施例6：成胶质细胞瘤细胞中细胞死亡的诱导

将人类原发性成胶质细胞瘤肿瘤来源的细胞系(U-87MG)以6×10⁵个细胞/ml在37℃在5％CO₂的存在下在无血清培养基中与检查的若干浓度的肽一起孵育6h。在该实验中使用的肽为Tf-D-LP4、反向-Tf-D-LP4以及衍生自VDAC1的另外的肽，该另外的肽被命名为D-ΔN-Ter-Antp，包含氨基酸序列D-Arg-D-Asp-D-Val-D-Phe-D-Thr-D-Lys-D-Gly-D-Tyr-D-Gly-D-Phe-D-Gly-D-Leu-D-Arg-D-Gln-D-Ile-D-Lys-D-Ile-D-Trp-D-Phe-D-Gln-D-Asn-D-Arg-D-Arg-D-Met-D-Lys-D-Trp-D-Lys-D-Lys(SEQ ID NO:18)。然后将细胞用胰蛋白酶消化、离心(1500×g,5min)、用PBS洗涤并且使用PI染色和流式细胞仪(Beckton-Dickinson,San Jose,CA)以及BD CellQuest Pro软件分析死亡细胞。如图6中示出的，Tf-D-LP4和反向-Tf-D-LP4肽两者诱导类似的大量细胞死亡，分别具有1.5μM的EC₅₀和2.2μM的EC₅₀。

实施例7：癌症干细胞和癌性与非癌性细胞系的细胞死亡诱导

测试了与癌细胞相比，反向翻转肽反向-Tf-D-LP4诱导非癌性细胞中凋亡的能力以建立肽的癌症特异性。将U-87MG和MDCK(来自成年雌性可卡犬的肾组织的小猎犬肾上皮细胞)在无血清培养基中与若干浓度的反向翻转肽(反向-Tf-D-LP4)一起孵育6h。

图7A清楚地示出了反向-翻转肽(反向-Tf-D-LP4)区分癌性细胞和非癌性细胞，对癌性细胞具有特异性。虽然15μM反向-Tf-D-LP4肽诱导癌症细胞系中约80％的细胞死亡，相同浓度的该肽诱导非癌性细胞系MDCK中仅约30％的细胞死亡。

还使用来源于GBM患者的神经胶质瘤来源的干细胞(GSC)系G7检查反向-Tf-D-LP4对癌症干细胞的作用(Pollard S M等2009.Cell Stem Cell 4(6):568-580)。如先前描述的，使用特定的成胶质细胞瘤干细胞培养基使G7GSC细胞系生长(Pollard S M等2009.CellStem Cell.4(6):568-580)。

与包含约1％GSC的U-87MG细胞相比，GSC特异性标志物Sox2、Musashi和巢蛋白(Nestin)在G7中高度表达，因此证实了细胞的干细胞特性(图7B、7C)。Klf4在两种细胞系中均表达，其水平在G7中稍高。通过反向-Tf-D-LP4肽诱导的G7干细胞的细胞死亡与U-87MG细胞系的细胞死亡诱导类似(图7D)。对于U-87MG和G7细胞，诱导50％细胞死亡的浓度(EC₅₀,n＝3)分别为1.5±0.3μM和2.5±0.3μM。当使用膜联蛋白V/PI染色和FACS分析测定凋亡时获得了类似的结果(图7E)。

因此，结果清楚地表明GSC对VDAC1衍生肽的反向-翻转类似物敏感。

实施例8：反向-Tf-D-LP4的溶解度和稳定性

评价了包含VDAC衍生肽、对照Tf-D-LP4及反向-翻转肽反向Tf-D-LP4的合成肽的溶解度以评价肽在体内实验和治疗中用于静脉内施用至动物的相容性。如上文描述将肽溶解。检查的浓度为4mM；使用的溶剂为DDW/10％DMSO/150mM NaCl(稍后添加NaCl，终浓度为150mM)，作为用于药物施用的常见生理上相容性溶液。

Tf-D-LP的分子量＝4111.67g/mol。因此，使用分析天平称量1.4mg肽(Tf-D-LP4或反向-Tf-D-LP4)。将8.5μl 100％DMSO添加至肽以形成40mM的浓度，并且将溶液在37℃在水浴中孵育15min直至溶液变澄清。将所得溶液通过用DDW稀释约10倍，获得4.4mM(11.1％DMSO)的终浓度，在37℃在水浴中孵育15min，并且然后在4℃孵育过夜。在孵育之后，将溶液以15,000×g离心5min。将上清液转移至新的Lobind Eppendorf管中并且添加NaCl至0.15M的终浓度。将所得溶液在37℃在水浴中孵育15min，以15,000×g离心5min，并且将上清液转移至新的Lobind Eppendorf管中。分析每一个步骤中的肽浓度。

确定肽浓度

肽浓度在肽变性后由在280nm处的吸光度并且使用以下计算来确定：

重量/体积(mg/ml)浓度根据以下等式计算：

mg肽/ml＝(AU×DF×Mw)/[(TrypW#×5560)+(TyrY#×1200)]：

AU-测量的肽吸光度

DF-稀释因子

Mw-分子量

TrypW#-肽序列中色氨酸的数目

TyrY#-肽序列中酪氨酸的数目

图9呈现了Tf-D-LP4(白色条)和反向-Tf-D-LP4(黑色条)肽的溶解度之间的比较，作为总肽量中可溶性肽的百分比，如通过上文描述的280nm吸光度分析计算的。如图9中清楚地示出的，当DMSO浓度被降低至10％时，大部分反向-Tf-D-LP4被溶解，而在该条件下，仅约10％的Tf-D-LP4被溶解。

两种肽Tf-D-LP4和反向-Tf-D-LP4在100％DMSO中显示出高溶解度。出乎意料地，在10％DMSO，与Tf-D-LP4相比，反向-翻转反向-Tf-D-LP4肽显示出5-7倍更可溶。

反向-Tf-D-LP4的这一特征具有显著重要意义，因为它使得它的制剂能够用于药物用途。

实施例9：肽包封

使用肽作为治疗性药物用于治疗实体瘤，特别地用于治疗脑肿瘤的一个主要障碍为将治疗性肽递送至患病区域，并且在脑肿瘤的情况下跨越血脑屏障(BBB)。BBB为高度限制性的和选择性的，允许通过扩散或经由特定转运蛋白通过的仅非常小的分子(<600Da)或肽的通过。包封于纳米颗粒中的药物或与被细胞受体识别和输入的序列缀合的药物能够跨越BBB。本文，我们使用反向-Tf-D-LP4，假设它经由在BBB中高度表达的TfR(例如Bien-Ly N等2014.J Exp Med.211(2),233-244)并且使用由聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)(图10A)构成的纳米颗粒将会跨越BBB，允许货物的控释。

装载反向-Tf-D-LP4的PLGA复合物通过如先前报道的溶剂置换方法(Andrieu V等1989.Drug Des Deliv 4,295-302；Das J等2104.Toxicol Lett 225,454-466)(具有一些修改)来制备。将20毫克反向-Tf-D-LP4溶解于40μl的100％DMSO中，并且然后用无菌DDW稀释20倍以获得在5％DMSO终浓度中25mg/ml的浓度。将PLGA(50mg)溶解于丙酮(1ml)中。然后，将105μl肽添加至PLGA-丙酮溶液中。将所得肽-PLGA-丙酮混合物逐滴(0.5ml/min)添加到包含1％PVA(w/v)的10ml水性溶液中。将混合物在室温连续搅拌直至有机溶剂完全蒸发。将纳米颗粒以15,000g离心(4℃，持续20min)，并且将沉淀物重新悬浮于无菌DDW中并且洗涤两次。将所得沉淀物与HBSS溶液混合并且用于i.v.注射至小鼠。为了证明肽被包封于PLGA纳米颗粒内并且有活性，将颗粒离心，并且分析所得上清液和重悬的纳米颗粒的细胞死亡诱导活性(图10B)。结果清楚地表明，肽被包封于PLGA纳米颗粒中并且诱导U-87MG细胞中的细胞死亡。

实施例10：反向-Tf-D-LP4对肿瘤细胞死亡的体内作用

使用脑原位肿瘤模型检查反向-Tf-D-LP4的体内作用。原位模型当前提供了研究活的动物的背景中，特别地在具有独特生理和结构特性的部位，诸如脑的肿瘤特征的最佳方式。这些模型允许评价特征诸如新陈代谢、跨越BBB的药物递送和毒性。为了更好地模拟多形性成胶质细胞瘤(GBM)的临床情况，使用颅内原位异种移植物(Pierce AM和KeatingAK.2014.JVis Exp.91,52017)检查反向-Tf-D-LP4肽在抑制肿瘤生长中的有效性。

将U-87MG细胞(8×10⁴个)移植到裸小鼠脑中，并且将小鼠用在PBS中的DMSO(1.05％)、包封于PLGA纳米颗粒中的反向-Tf-D-LP4(10mg/Kg)或游离的反向-Tf-D-LP4肽(10mg/Kg)静脉内(i.v.)治疗。在25天和32天后，通过MRI监测肿瘤生长(图11A)。当小鼠用游离的反向-Tf-D-LP4肽(10mg/Kg静脉内治疗时，在治疗开始后25天和32天，获得原位异种移植物肿瘤体积减少80％和90％(图11B)。类似地，用PLGA-包封的(10mg/Kg)反向-Tf-D-LP4的治疗，在治疗开始后25天和32天，显示出原位异种移植物肿瘤体积分别减少45％和65％(图11B)。

使用Kaplan-Meier存活曲线的分析揭示PBS/DMSO与游离或PLGA-包封的反向-Tf-D-LP4-治疗的小鼠之间存活的统计学显著差异(图11C)。肽治疗分别延长了用游离的或PLGA-包封的反向-Tf-D-LP4治疗的小鼠的40％和50％的存活，超过对于未治疗的小鼠观察到的35天存活。

结果清楚地示出了静脉内施用的游离的和PLGA-包封的反向-Tf-D-LP4制备物两者可以跨越BBB，到达肿瘤细胞并且有效诱导肿瘤细胞死亡，其中游离的反向-Tf-D-LP4在减少肿瘤尺寸和小鼠存活方面更加有效。

实施例11：反向-Tf-D-LP4抑制DEN-诱导的癌症

基因毒性药物二乙基亚硝胺(DEN)为用于诱导小鼠中肝癌的最广泛使用的化学物质(chemical)。DEN通过细胞色素P450家族的酶在肝实质细胞中经历代谢激活，并且如果被注射到小于2周的雄性小鼠中，当肝实质细胞仍然活跃地增殖时，其用作完全致癌物(Bakiri L和Wagner F.2013.MolOncol 7,206-223)。DEN诱导的肝细胞癌(HCC)为一种进展性过程，在DEN处理后30-32周肿瘤可见。

小鼠中DEN诱导的HCC如以上描述进行(总结于图12A中)。肝通过MRI成像(图12B、12C)。将来自处死的小鼠的肝拍照用于宏观病理学观察(图12D)。在未治疗的对照组中，小鼠肝显示出高数目的肿瘤结节(图12B、12D)，而在用肽治疗的小鼠中未观察到肿瘤结节(图12C、12D)。与来自用反向-Tf-D-LP4肽治疗的小鼠的肝相比，在对照组中的肝的尺寸和重量是大的(图12E)。这些结果显示肽抑制肿瘤发展。

实施例12：反向-Tf-D-LP4抑制脂肪变性

形态学变化

为了研究肽对脂肪变性的作用，使小鼠经历持续5周的常规食物饮食(对照)或高脂肪饮食(HFD-32)(4-9周龄小鼠)，其中在最后2周期间，将小鼠用在HBSS中的2％DMSO治疗或用反向-Tf-D-LP4(10mg/kg)治疗。研究过程如图13A中示意地呈现。在第9周结束时，将小鼠处死，将肝拍照(图13B)并且称重(图13C)，并且然后固定或冷冻以进一步处理，用于组织病理学分析。与接受常规(食物)饲喂的小鼠的肝或用反向-Tf-D-LP4肽治疗的小鼠的肝相比，来自接受HFD-32的小鼠的肝显示出淡黄色(yellowish color)(图13B)。与常规(食物)饲喂的小鼠的肝的重量相比，来自用HFD-32饲喂的小鼠的肝的重量增加了约30％，而该增加在用反向-翻转肽治疗的HFD-32小鼠中被减弱(图13C)。这些结果指向HFD-32小鼠的肝组织中增加的脂肪和液体积累(炎症)，这可以通过反向-Tf-D-LP4治疗。

反向-Tf-D-LP4降低HFD-STAM小鼠中的血糖水平

与先前的发现一致，血糖水平在接受HFD-32饮食的小鼠中被高度增加，从在用常规(食物)食物饲喂的小鼠中的约150mg/dL至多达在用HFD-32饲喂的小鼠中的450mg/dL(图14)。该增加在用反向-Tf-D-LP4治疗的小鼠中被抑制，显示出与用常规食物饲喂的小鼠的血糖水平相当的血糖水平。

肝组织病理学变化

使用H&E染色评价固定的石蜡包埋的肝切片的形态学变化。来自HFD-32饲喂的小鼠的肝组织的代表性H&E染色切片显示脂肪变性征象，其特征在于肝实质细胞中显示脂肪滴积累、分散的炎性细胞浸润和纤维化(图15、16)。

来自HFD-32饲喂的小鼠的肝显示脂肪滴积累。相比之下，来自肽治疗的小鼠的肝显示脂肪滴的尺寸和数目两者的明显减少(图15A)。

为了更好地可视化脂肪滴，使肝切片经历油红染色。来自3只HFD-32饲喂的小鼠的肝切片显示脂肪滴的高红染色，占据肝，而在来自常规(食物)-食物饲喂的小鼠或用肽治疗的HFD-32饲喂的小鼠的肝切片中未观察到此类染色(图15B)。

脂肪变性的另一个特征为明显的气球样变肝实质细胞的细胞形态学，通常为相邻肝实质细胞尺寸的两至三倍，并且特征在于H&E染色切片上的束状(wispy)透明的细胞质。肝实质细胞气球样变性与肝实质细胞的细胞死亡相关(Yip W W和Burt A D.2006.SeminDiagn Pathol 23,149-160)。来自HFD-32饲喂的小鼠的肝显示出气球样变细胞的积累(图16A)。相比之下，来自用常规(ND，食物)食物饲喂的小鼠的肝未显示出气球样变细胞，且用HFD-32饲喂并且用肽治疗的小鼠显示出高度减少的气球样变细胞(图16A)。

肝实质细胞气球样变现象与炎症(脂肪性肝炎)相关(Liangpunsakul S和Chalasani N.2003.Curr Treat Options Gastroenterol 6,455-463)。事实上，H&E染色显示出用HFD-32饲喂的小鼠的肝中的炎性区域。在来源于肽治疗的小鼠的组织切片中，在肝组织切片中观察到高度减少的炎症(图16B)。在用天狼星红染色进行染色后，纤维化在用HFD-32饲喂的小鼠的肝中是可见的，但在用反向-翻转反向-Tf-D-LP4肽治疗的小鼠中纤维化高度减少(图16C)。

反向Tf-D-LP4肽抑制/逆转NASH

组织学上，NASH的特征在于大泡性脂肪变性(macrovesicular steatosis)，其中脂肪球的尺寸从非常小至几乎充满肝实质细胞变化，并且特征在于肝实质细胞的气球样变性，伴有或不伴有Mallory小体，具有纤维化(Kleiner D等2005.Hepatology 41,1313-1321)。

在本研究中，使小鼠经历持续8周的常规食物饮食(对照)或HFD-32饲喂(4-12周龄小鼠)，其中在最后3周期间，将小鼠用在HBSS中的0.9％DMSO治疗或用反向-Tf-D-LP4(10mg/kg)治疗(图17A)。在第12周结束时，将小鼠处死，将肝拍照(图17B)、称重(图17C)，并且然后固定或冷冻以进一步处理，用于组织病理学、免疫印迹、或qPCR分析。与接受常规(食物)饲喂的小鼠或用反向-Tf-D-LP4肽治疗的接受HFD-32饮食的小鼠相比，来自接受HFD-32饮食的小鼠的肝显示出黄色(图17B)。与常规(食物)饲喂(ND)的小鼠的肝相比，来自HFD-32饲喂的小鼠的肝的重量增加了约1.8倍，而该增加在用HFD-32饲喂并且用反向-翻转肽治疗的小鼠中仅为1.4倍(图17C)。

脂肪可在内脏器官，如肝或身体中积累，大部分在腹腔中积累(内脏脂肪或腹部脂肪)。因此，从HFD-32饲喂的小鼠和从用反向-Tf-D-LP4肽治疗的HFD-32饲喂的小鼠收集附睾脂肪(附睾)和肠系膜脂肪(肠系膜)。与未治疗的小鼠相比，后者显示出约40％更少的脂肪(图17D)。

如以上针对脂肪变性显示的，代表性H&E染色的来自HFD-32饲喂的小鼠的NASH肝组织的切片显示，具有大泡(macro-vesicles)和微小泡(micro-vesicles)的脂肪滴积累在肽治疗的组中被高度减少(图18B)。在来自HFD-32饲喂的小鼠的肝切片中，清楚地观察到气球样变肝实质细胞形态学(图18C)和炎症(图18D)。相比之下，来自用常规(食物)饲喂的小鼠的肝未显示气球样变细胞或炎症征象(图18A)，并且用反向-Tf-D-LP4肽治疗的HFD-32饲喂的小鼠几乎未显示气球样变和炎症的征象(图18B-D)。

肝纤维化为肝对持续性损伤的异常响应，具有胶原胞外基质过度积累。肝纤维化受肝刺激中的慢性炎症刺激(Czaja,A J.2014.World J Gastroenterol 20,2515-2532)。纤维化标志物胶原的Masson三色和天狼星红染色显示HFD-32饲喂的小鼠的肝组织中在中央静脉和门管区(portal area)周围高水平的胶原纤维以及窦周纤维化(perisinusoidalfibrosis)的明显征象，而用反向-Tf-D-LP4肽治疗的HFD-32饲喂的小鼠的肝组织几乎未显示出胶原染色，表明该肽治疗预防炎症和纤维化(图19)。

HFD-32饮食可以导致肝细胞癌(HCC)(Scorletti E等2014.Hepatology 60,1211-1221)。因此，我们寻找在NASH阶段的用HFD-32饮食饲喂的小鼠中的微小肿瘤。清楚观察到与致瘤性相关的组织切片结节(图20)。在用肽治疗的HFD-32饲喂的小鼠的肝切片中未观察到这些结节，表明反向-Tf-D-LP4肽也预防肿瘤形成。

Tf-D-LP4预防DEN诱导的HCC中发展的脂肪变性和NASH

制备DEN诱导的HCC小鼠模型并且在肿瘤在肝中是可见的之后用肽进行治疗，如上文描述的。来自DEN诱导的HCC的肝的H&E染色清楚地显示沿着致瘤过程发展了肝病理学，包括脂肪变性、气球样变性、炎症和纤维化(图21A、21B)。当用反向-Tf-D-LP4肽(18mg/Kg)治疗小鼠时，未观察到此类肝病理学(图21A、B)。这些结果证明，该肽预防HCC发展以及肝相关病理学。

以上具体实施方案的描述将如此完全地揭示本发明的一般性质，使得其他人可以通过应用现有的知识，容易地为各种应用修改和/或调整此类具体实施方案而不需要过度实验且不背离一般概念，并因此，此类调整和修改应当并且预期被包含在本公开的实施方案的等同物的含义和范围内。应当理解，本文采用的措辞或术语是为了描述而非限制的目的。用于进行各种本公开的功能的工具、材料和步骤可采取多种替代形式而不背离本发明。

序列表

<110> 在本-古里安大学的B.G.内盖夫科技与应用有限公司,

内盖夫生物技术国家研究所有限公司

<120> VDAC1衍生肽的类似物

<130> NIBN/002 PCT

<150> 62/213667

<151> 2015-09-03

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<400> 1

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1 5 10 15

Asn

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<400> 2

Asn Ser Asn Gly Ala Thr Trp Ala Leu Asn Val Ala Thr Glu Leu Lys

1 5 10 15

Lys

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<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(17)

<223> D-氨基酸

<400> 3

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1 5 10 15

Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

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<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<400> 5

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Leu Asp Ala Tyr Thr Pro Pro Val Ala Met

20 25

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(26)

<223> D-氨基酸

<400> 6

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<223> 合成肽

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<223> 合成肽

<400> 13

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1 5

<210> 14

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(27)

<223> D-氨基酸

<400> 14

Lys Trp Thr Trp Lys Asn Ser Asn Gly Ala Thr Trp Ala Leu Asn Val

1 5 10 15

Ala Thr Glu Leu Lys Lys Glu Trp Thr Trp Ser His Arg Pro Tyr Ile

20 25 30

Ala His

<210> 15

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(42)

<223> D-氨基酸

<400> 15

Lys Lys Trp Lys Met Arg Arg Asn Gln Phe Trp Ile Lys Ile Gln Arg

1 5 10 15

Leu Gly Phe Gly Tyr Gly Lys Thr Phe Val Asp Arg Ala Ser Lys Gly

20 25 30

Leu Asp Ala Tyr Thr Pro Pro Val Ala Met

35 40

<210> 16

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (17)..(42)

<223> D-氨基酸

<400> 16

Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

Leu Gly Phe Gly Tyr Gly Lys Thr Phe Val Asp Arg Ala Ser Lys Gly

20 25 30

Leu Asp Ala Tyr Thr Pro Pro Val Ala Met

35 40

<210> 17

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(34)

<223> D-氨基酸

<400> 17

His Ala Ile Tyr Pro Arg His Ser Trp Thr Trp Glu Lys Lys Leu Glu

1 5 10 15

Thr Ala Val Asn Leu Ala Trp Thr Ala Gly Asn Ser Asn Lys Trp Thr

20 25 30

Trp Lys

<210> 18

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(28)

<223> D-氨基酸

<400> 18

Arg Asp Val Phe Thr Lys Gly Tyr Gly Phe Gly Leu Arg Gln Ile Lys

1 5 10 15

Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

20 25

<210> 19

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 合成肽

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(22)

<223> D-氨基酸

<400> 19

Lys Trp Thr Trp Lys Asn Ser Asn Gly Ala Thr Trp Ala Leu Asn Val

1 5 10 15

Ala Thr Glu Leu Lys Lys Glu Trp Thr Trp Ser His Arg Pro Tyr Ile

20 25 30

Ala His

Claims

1.一种合成肽，所述合成肽包含(i)VDAC1衍生肽的类似物，其中所述类似物由SEQ IDNO:2中列出的氨基酸序列组成并且被完全翻转修饰；和(ii)识别和/或定位肽，所述识别和/或定位肽由SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的合成肽，其中所述识别和/或定位肽选自完全L-立体异构肽和完全D-立体异构肽。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的合成肽，其中所述识别和/或定位肽经由接头序列被连接至所述VDAC1衍生肽的类似物的N-末端或C-末端。

4.根据权利要求3所述的合成肽，其中所述接头序列包含SEQ ID NO:11中列出的氨基酸序列和SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列，各自独立地位于所述VDAC1衍生肽的类似物的C-末端或N-末端。

5.根据权利要求3所述的合成肽，其中所述接头序列包含SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列和SEQ ID NO:13中列出的氨基酸序列，各自独立地位于所述VDAC1衍生肽的类似物的C-末端或N-末端。

6.根据权利要求5所述的合成肽，其中SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的任一个中列出的氨基酸为D-氨基酸。

7.根据权利要求6所述的合成肽，其中所述合成肽包含SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列。

8.根据权利要求7所述的合成肽，其中所述合成肽由SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列组成。

9.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的合成肽，还包含药学上可接受的载体。

10.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的合成肽，还包含稀释剂。

11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的合成肽，还包含盐。

12.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的合成肽，还包含赋形剂。

13.根据权利要求9-12中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物包含具有SEQ IDNO:14中列出的氨基酸序列的合成肽。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中所述合成肽由SEQ ID NO:14中列出的氨基酸序列组成。

15.根据权利要求9-14中任一项所述的药物组合物，用于在抑制有害细胞增殖中使用。

16.根据权利要求9-14中任一项所述的药物组合物，用于在治疗与异常凋亡和/或细胞过度增殖相关的疾病中使用。

17.根据权利要求16所述的药物组合物，其中所述疾病为癌性疾病。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述癌性疾病选自由神经胶质瘤、肝癌、白血病、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和黑素瘤组成的组。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述神经胶质瘤为成胶质细胞瘤。

20.根据权利要求9-14中任一项所述的药物组合物，用于在预防和/或治疗非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或与NAFLD相关的症状中使用。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述NAFLD选自由非酒精性脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)组成的组。

22.根据权利要求20-21中任一项所述的药物组合物，其中所述与NAFLD相关的症状选自由脂肪滴积累、炎症、纤维化、肝实质细胞的细胞死亡及其任意组合组成的组。

23.根据权利要求9-14中任一项所述的药物组合物在制备用于抑制有害细胞增殖的药物中的用途，其中，当所述药物被使用时，包括以下步骤：将治疗有效量的所述药物施用至有相应需要的受试者，从而抑制有害细胞增殖。

24.根据权利要求9-14中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗与异常凋亡和/或细胞过度增殖相关的疾病的药物中的用途，其中，当所述药物被使用时，包括以下步骤：将治疗有效量的所述药物施用至有相应需要的受试者，从而治疗所述与异常凋亡和/或细胞过度增殖相关的疾病。

25.根据权利要求24所述的用途，其中所述疾病为癌性疾病。

26.根据权利要求24-25中任一项所述的用途，其中过度增殖的细胞为癌症干细胞。

27.根据权利要求25所述的用途，其中所述癌性疾病选自由神经胶质瘤、肝癌、白血病、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和黑素瘤组成的组。

28.根据权利要求27所述的用途，其中所述神经胶质瘤为成胶质细胞瘤。

29.根据权利要求9-14中任一项所述的药物组合物在制备治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或与NAFLD相关的症状的药物中的用途，其中，当所述药物被使用时，包括以下步骤：将治疗有效量的所述药物施用至有相应需要的受试者，从而治疗和/或预防非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和/或与其相关的症状。

30.根据权利要求29所述的用途，其中所述NAFLD选自由非酒精性脂肪变性和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)组成的组。

31.根据权利要求29-30中任一项所述的用途，其中所述与NAFLD相关的症状选自由脂肪滴积累、炎症、纤维化、肝实质细胞的细胞死亡及其任意组合组成的组。