EP2475680A1 - Molecules capables d'induire la mort cellulaire en ciblant la mitochondrie et leurs applications - Google Patents

Molecules capables d'induire la mort cellulaire en ciblant la mitochondrie et leurs applications

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EP2475680A1
EP2475680A1 EP10760064A EP10760064A EP2475680A1 EP 2475680 A1 EP2475680 A1 EP 2475680A1 EP 10760064 A EP10760064 A EP 10760064A EP 10760064 A EP10760064 A EP 10760064A EP 2475680 A1 EP2475680 A1 EP 2475680A1
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EP
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bax
peptides
peptide
regions
cells
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Abdel Aouacheria
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
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Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL
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Definitions

  • the invention relates to the use of peptides isolated to induce cell death by targeting the mitochondria and their biological applications.
  • the mitochondrion performs essential functions in the control of apoptosis in vertebrates.
  • the mitochondrial pathway of apoptosis is defined by a major event: the permeabilization of the outer mitochondrial membrane, which leads to the release into the cytoplasm of toxic proteins (such as cytochrome c) normally contained in the intermembrane space.
  • toxic proteins such as cytochrome c
  • Bcl-2 family proteins The proteins of this family, which are either pro-apoptotic (like Bax and Bid) or anti-apoptotic (like Bcl-2 and Bcl-xL), form homo- and heterodimers, all of these protein-protein interactions. participating in the regulation of apoptosis.
  • Proteins homologous to Bcl-2 share a globular structure (reminiscent of certain bacterial membrane-forming bacterial toxins) with between 6 and 9 amphipathic alpha-helices.
  • a supersecondary (“helix-elbow-helix”) motif consisting of two anti-parallel "hairpin” alpha helices (alpha5- alpha6 in Bax), able to insert into the membranes biological and to form pores.
  • the 3D structure of Bax is given on the Figurel.
  • Each helix of the motif has a size of about 15-20 amino acids (order of magnitude for an alpha helix capable of crossing a lipid bilayer), separated by a bend formed of 3-4 residues.
  • the membrane insertion regions of the Bcl-2 family proteins have been evolutionarily selected to integrate specifically into the mitochondrial membranes of animal cells. It is important to test experimentally if these regions, apart from the global context of the proteins which contain them, are capable of reaching the mitochondria, of interfering with their structure (such as for example their membranes) and / or their function (for example their transmembrane potential) and cause a cell death. To date, the ability of peptides derived from this membrane insertion motif to trigger an apoptotic process by acting on mitochondria alone is not supported by any experimental evidence. Such peptides could represent an alternative to the artificial cationic peptides used to trigger cell death (Ellerby et al., Nat Med, 1999), which are not very active and therefore not conducive to industrial development.
  • the work of the inventors has focused on the study of peptides from these regions to determine whether they alone can target mitochondrial membranes and cause cell death by apoptosis.
  • poropeptides from the Greek word Poros ⁇ : hole or sea passage, figuratively: an effective way around a difficulty
  • a poropeptide designating a peptide having the ability to form pores in membranes lipids or destabilize biological membranes such as mitochondrial membranes.
  • Poropeptides designed from the membrane insertion regions of proteins of the Bcl-2 family, have thus been shown to be capable of inducing the apoptosis of harmful cells, for example tumor cells.
  • the purpose of the invention is therefore the use of peptides whose sequence derives from the membrane insertion regions of the Bcl-2 family proteins to induce cell death by targeting the mitochondria. It also aims to provide new peptide molecules developed from these regions.
  • the invention also aims to provide, with these different molecules, high efficiency means to restore an apoptosis process in cancer cells while minimizing the maximum impact on surrounding healthy cells.
  • This targeting step may for example be based on the vectorization of peptides by coupling to a domiciliation molecule ensuring their selective targeting at the tumor site, sparing healthy tissue. Since all living cells in the body (healthy or pathological) have mitochondria, poropeptides inducing the breakdown of mitochondrial permeability can be used to induce the death of many cell types. With advances in therapeutic targeting techniques, it may be possible to selectively eliminate certain cell populations that are harmful to the body.
  • the invention thus relates to the use of membrane insertion helix derivatives of Bcl-2 family proteins to induce cell death by targeting the mitochondria, characterized in that they are peptides corresponding to the a5 regions. and / or a6 of the Bax protein or equivalent regions present in the other proteins of the Bcl-2 family.
  • the invention further relates to derivatives, variants, mutants or fragments of the aforementioned peptides.
  • Synthetic peptides derived from those defined above comprise, for example, means allowing cell penetration or recognition of a particular cell type.
  • Advantageous means correspond to a transduction motif allowing their internalization in the targeted cell. It is in particular a polyarginine unit, advantageously comprising 8 arginine residues. Other modifications correspond to deletions and / or substitutions of one or more amino acids. Thus, one or more Cysteine residues of said regions may be replaced by Serine or Glycine motifs.
  • the invention also relates to conjugates that contain a peptide derived from those defined above and an addressing molecule, such as recognizing molecules. the endothelium, to target a particular tissue or cell type, such as certain tumor cells or angiogenic endothelial cells.
  • the invention also relates to functional equivalents of the peptides defined above, such as peptides comprising modifications resulting from post-translational processes such as glycosylation or chemical modifications such as coupling with lipids, sugars, nucleotide sequences or d amino acids since these modifications do not modify the proapoptotic activity of said peptides according to the tests given in the experimental part below.
  • Functional equivalents also include peptides of which one or more amino acids are D-conforming amino acids.
  • the invention also encompasses retro-peptides and retro-inverso-peptides.
  • the invention is directed in particular to the peptides derived from regions a5 and a6, for example, the peptide of sequence SEQ ID No. 1: NH 2 -NWGRVVALFYFASKLVLKALSTKVPELIR-COOH.
  • these "mitochondrial-toxic” compounds are able to trigger apoptosis by destabilizing the mitochondrial membranes, especially the outer mitochondrial membrane.
  • they induce the release of multiple toxic molecules contained in the inter-membrane space of mitochondria, in particular cytochrome c.
  • the invention relates to the use of the peptides defined above as medicaments.
  • compositions of the invention are characterized in that they comprise a therapeutically effective amount of at least one peptide as defined above in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising as active ingredient at least one peptide as defined previously associated in said composition with one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients.
  • compositions according to the invention can be carried out according to the techniques known to those skilled in the art by any of the accepted modes of administration for the therapeutic agents. These methods include systemic, topical, oral or central administration, for example by surgery or intraocular administration. We can also mention the subcutaneous implantation of biodegradable implants.
  • the dosage for administration of the peptides according to the invention is chosen according to many factors including the type, species, age, weight, sex and medical condition of the subject; the severity of the condition to be treated; the route of administration; the state of renal and hepatic function of the subject and the nature of the particular compound, or salt, used.
  • the normally experienced person skilled in the art will determine and prescribe the effective amount to prevent, hinder or halt the progress of the medical condition to be treated.
  • the above compounds are particularly advantageous for initiating an apoptotic process after internalization in tumor cells or neovascular tumor-irrigating cells.
  • the invention also relates to the use of the aforementioned peptides as mitochondrial targeting molecules for delivering a compound or polypeptide to the mitochondrial membranes to induce apoptosis.
  • poropeptides are generally useful in situations with increased neovascularization, such as rheumatoid arthritis or obesity. Indeed, sustained angiogenesis characterizes severe forms of arthritis and the maintenance of adipose mass during obesity. Pathological angiogenesis is also found in psoriasis and some forms of diabetes. According to another advantageous embodiment of said poropeptides, they are used to counter certain other types of harmful cells, such as immune cells that recognize the self and cause autoimmune diseases.
  • the poropeptides as defined above have all the characteristics of antimicrobial peptides: amphipathic, cationic character, destabilization of lipid membranes.
  • the present invention therefore also relates to the use of the peptides as defined above for the preparation of a molecule with antibiotic properties capable of killing resistant bacteria.
  • therapeutic peptides are generally metabolized and eliminated more easily than conventional drugs, giving the patient a better chance of healing while minimizing the complications associated with standard therapies.
  • the poropeptides can be used, according to the invention, as adjuvants in addition to conventional drugs, thus reducing the doses and side effects of the latter.
  • the invention relates to cosmetic compositions containing in their active principle at least one peptide as defined above in combination with a vehicle acceptable in cosmetology.
  • the peptides of the invention have stabilizing properties for these compositions.
  • the invention is further directed to agronomic or agri-food compositions containing in their active ingredient at least one peptide as defined above, in combination with a vehicle acceptable in agronomy and in the food field.
  • Figures 1 to 11 represent, respectively, - Figure 1, A) the "channel" domain of colicin A; B) the 3D structure of Bax; C) the ⁇ -helical hairpin motif of Bcl-2 family proteins (alpha5-alpha6 in Bax);
  • FIG. 2 constructs coding for fusions between GFP (green fluorescent protein) and the various regions of anchoring or membrane insertion of the pro-apoptotic protein Bax;
  • FIG. 6 the apoptosis rate of wild-type embryonic fibroblasts (MEFs) or deficient in Bax and Bak (MEF-DKO);
  • FIG. 7 the mitochondrial transmembrane potential of cells expressing GFP or GFP fused with the peptides used according to the invention.
  • FIGS. 10 and 11 the effect of microinjection of peptide fragments of Bax on viability and embryonic (Fig. 9) and cellular morphology (Fig. 10);
  • FIG. 12 the proapoptotic effect of a poropeptide of the invention.
  • Plasmid constructs comprising inserts corresponding to the nucleic acids encoding one or more Bax regions fused to GFP: amino acids 1-192 (whole Bax protein: ⁇ ! - ⁇ 2- ⁇ 3- ⁇ 4- ⁇ 5- ⁇ 6- ⁇ 6'- ⁇ 7- ⁇ 8 - ⁇ 9), 20-37 (a1), 106-134 (a5), 130-150 (a6, 102-150 (a5-a6, 102-192 (a5-a6-a6'-a7-a8-a9 or a5 -a9, 169-192 (a9.
  • the nucleic acids coding for the various anchoring or membrane insertion regions present on the pro-apoptotic protein Bax were cloned into the pEGFP-C1 plasmid.
  • the inserted sequences are given in Figure 2.
  • a construct (GFP-KLAK) encoding a GFP-KLAKLAKKLAKLAK polypeptide was also made.
  • Artificial peptides enriched with KLA sequences are known to target the negatively charged bacterial membrane and exhibit antibiotic activity.
  • FIG. upper half corresponds to the Western Blot analysis, using an anti-GFP antibody, of HT 1080 fibrosarcoma cell lysates transfected transiently by the above plasmid constructs; the middle part gives the immunoblot obtained using an antibody recognizing the apoptotic cleavage fragment of PARP; the lower part gives the immunoblot obtained using an antibody recognizing the activated form of caspase-3.
  • the different constructs were transfected into human cells cultured in vitro (HT-1080 and SK-MEL-28), and the subcellular localization and cytotoxicity induced by GFP-fused Bax membrane insertion fragments was determined.
  • FIG 4 shows the subcellular localization of the complete GFP protein relative to that of inserts composed of Bax-fused membrane insertion fragments.
  • MEF-DKO cells were co-transfected with the pEGFP-C1 plasmids encoding the various Bax inserts and the MitoDsRed vector. It is observed that peptides corresponding to or comprising the membrane insertion helices of Bax and / or the TM domain are sufficient to address GFP (in green) to mitochondrial membranes (marked in red with the MitoDsRed protein, comprising the mitochondrial targeting CoxVIII). Similar results were obtained using an antibody directed against the mitochondrial protein Hsp70 (bottom inserts).
  • Figure 5 shows the cellular toxicity induced by the expression of the different constructs.
  • Figure 5A shows the death rate (apoptosis / necrosis) of HT-1080 cells expressing GFP alone or in fusion with different membrane insertion fragments of the Bax death protein. The cells were treated (+) or not (-) with the general caspase inhibitor zVAD.fmk ( ⁇ ). Cell death was quantified 24 h after transfection by counting the number of green cells (expressing GFP) under an epifluorescence microscope.
  • the type of cell death was determined by membrane permeability to propidium iodide (necrosis) and nuclear morphology (condensed or fragmented nuclei) after staining with Hoechst 33342 (apoptosis). Green cells negative for propidium iodide and having a pyknotic nucleus were counted as being in apoptosis. The results represent the mean values (with standard deviations) of three experiments.
  • the green cells (expressing the construction) presenting a pycnotic nucleus are apoptosis, those stained in red by propidium iodide are in necrosis.
  • apoptotic cell death is demonstrated by Annexin-V labeling, which specifically recognizes phosphatidylserines extemalized by apoptotic cells (Fig. 5B).
  • Annexin-V labeling specifically recognizes phosphatidylserines extemalized by apoptotic cells (Fig. 5B).
  • cell death was quantified using the Annexin V-Cyanine 3 assay by 24h flow cytometry after transient cell transfection with the plasmids of interest.
  • the GFP-Bax-a5 and GFP-Bax-a6 constructs are more effective at inducing apoptosis than the GFP-KLA construct.
  • FIG. 6 shows that the toxic proteins encoded by the inserts do not act via the endogenous Bax and Bak proapoptic proteins, since murine fibroblasts deficient in Bax and Bak (MEF-DKO) are not resistant to stress. induced by their expression (see also Fig.3).
  • the graph (FIG. 6A) corresponds to kinetics of cell death (quantified by flow cytometry using the Annexin V-Cy3 assay) of wild-type MEF versus MEF-DKO murine fibroblasts. It is observed that the fibroblasts deficient for Bax and Bak are as sensitive to the induction of apoptosis by the expression of the GFP-Bax-alpha5 protein as to wild murine fibroblasts.
  • FIG. 7 shows that cells (HT-1080) expressing the polypeptides comprising the Bax cc5 and / or cc6 helices undergo a significant fall in their mitochondrial transmembrane potential ( ⁇ ), unlike the cells expressing GFP alone, suggesting the implication of a mitochondria-dependent pathway in the induction of apoptosis.
  • FIG. 7A The histograms (FIG. 7B) show the average values of three flow cell cytometry quantification experiments (expressing GFP) with Mitotracker incorporation defects (ie a weak ⁇ ).
  • the results presented show that the regions of the pro-apoptic protein Bax corresponding to amino acids 106-104 and 130-150 are capable of targeting mitochondrial membranes and of inducing apoptotic cell suicide. These regions are alpha helix structured within the complete Bax protein (Suzuki et al., 2000, Cell, 103, 645-654) and have an amphipatic character favorable to the destabilization of biological membranes.
  • Poropeptide of sequence SEQ ID No. 1 It is an amphipatic peptide (see FIG. 8), longer than the a5 helix deduced from the 3D structure of the Bax protein in solution (Suzuki et al., 2000). ). It contains a serine residue incorporated in position 126 in place of the natural cysteine residue in order to limit the formation of disulfide bridges. ⁇ Characterization of its mode of action by incubation with isolated mitochondria.
  • the peptide is incubated with the mitochondria for 5, 15, 30 or 60 min, and the mitochondrial release of cytochrome c in the supernatant (SN) is measured by Western Blot.
  • the mitochondrial fractions (Mito) are calibrated using an antibody directed against mitochondrial proteins HSP70 or ATPase (subunit 6).
  • the poropeptide-Bax (106-134)
  • the cytochrome c is released from the inter-membrane space of the mitochondria at 10 ⁇ and in 5 min of incubation. No release is observed when an artificial antimicrobial peptide (KLAK) of sequence SEQ ID No. 2 KLAKLAKKLAKLAK is used.
  • poropeptide-Bax [106-134], of sequence SEQ ID No. 1 has a strong ability to induce the permeabilization of mitochondrial membranes.
  • Poropeptide-Bax [106-134] was microinjected in vivo.
  • the zebrafîsh (Danio rerio) model was used because (i) the apoptosis machinery is conserved between human and fish cells; (ii) the egg corresponds to an integrated cellular system compared to isolated mitochondria; (ii) zebrafish eggs are easily injectable routinely.
  • A Zebrafis eggs were microinjected at stage 1-2 cell (s) with increasing concentrations of poropeptide-Bax [106-134], Bax-BH3 peptide or with ultracure water Cmock ' ).
  • a concentration of 100 ⁇ l inside the microinjection capillary corresponds to approximately 6 ⁇ 10 12 peptide molecules per egg.
  • the histograms represent the percentage of mortality 24 h after fertilization and the percentage of surviving embryos with severe malformations. The data presented are representative of 2 independent experiments giving the same results.
  • FIG. 1 A Photomicrographs showing SK-MEL-28 human melanoma cells injected with fluorescent tracer Dextran-FITC alone Cmock ') or mixed with Poropeptide-Bax [106-134]. The cells were photographed 12 h after microinjection. The micro-injected cells with the poropeptide-Bax [106-134] exhibit morphological manifestations characteristic of apoptosis (cytoplasmic budding, retraction and cell rounding). Magnification x 800.
  • FIG. 1 A Photomicrographs showing SK-MEL-28 human melanoma cells injected with fluorescent tracer Dextran-FITC alone Cmock ') or mixed with Poropeptide-Bax [106-134]. The cells were photographed 12 h after microinjection. The micro-injected cells with the poropeptide-Bax [106-134] exhibit morphological manifestations characteristic of apoptosis (cytoplasmic budding, retraction and cell rounding). Magnification x 800.
  • micro-injection of poropeptide-Bax [106-134] induces a substantial cell death, whereas micro-injected cells by Bax-BH3 or KLAK have no significant effect.
  • Micro-injected cells control peptide (R8) SEQ ID NO: 3 sequence RRRRRRRR (a polyarginine intracellular transduction pattern) have viability rates comparable to the control.
  • poropeptide-Bax [106-134] exerts dose-dependent cytotoxic effects after introduction into zebrafis eggs or tumor cells cultured in vitro, and is more effective in inducing cell death than in a pro-apoptotic peptide derived from the same protein (Bax-BH3) or other peptides known to be active at the membrane level (KLAK and R8).
  • a pro-apoptotic peptide derived from the same protein Bax-BH3
  • KLAK and R8 peptides known to be active at the membrane level
  • the R8-Scr-FITC peptide is a "scramble" sequence of the sequence present in the R8-Bax [106-134] -FITC peptide, that is to say a control sequence in which the amino acids (their order in the sequence) were mixed.
  • D Death rate (apoptosis / necrosis) of HeLa cells treated with poropeptide R8-Bax [106-134].
  • the type of cell death was determined 24 h after transfection by observation of cell permeability to propidium iodide (necrosis) or nuclear morphology after staining of DNA with Hoechst 33342 (apoptosis). Green cells (expressing GFP) were visualized by epifluorescence microscopy. About 300 cells were counted by experiment. The results are an average of three independent experiments ( ⁇ standard deviation is also shown).
  • the two peptides are rapidly internalized (in less than one hour) by HeLa cells in vitro culture (FIG. 12A).
  • the poropeptide R8-Bax [106-134] -FITC inhibits HeLa cell viability in a dose-dependent and incubation-time manner (Fig. 12B).
  • a pan-caspase inhibitor zVAD.fmk added in vitro, significantly inhibited R8-Bax [106-134] -FITC-induced cell death (Fig.
  • FIG. 12C Apoptosis rate of wild-type fibroblastic cells (MEFs) or deficient in death proteins Bax and Bak (MEF DKO) treated with FITC-R8-Bax poropeptide [106- 134] or FITC-R8-control peptide Bax [Scr].
  • Apoptosis was quantified using the Annexin V-Cyanine 3 test by flow cytometry 6h or 24h after treatment, in the presence or absence of the caspase inhibitor zVAD.fmk. The results correspond to the percentage of apoptotic cells having internalized the fluorescent peptide in each condition.

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Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation de dérivés des régions d'insertion membranaire des protéines de la famille Bcl-2 pour induire la mort cellulaire en ciblant la mitochondrie, caractérisée en ce qu'il s'agit de peptides correspondant auxrégions α5 et/ou α6 de la protéine Bax ou pour les régions équivalentes présentes dans les autres protéines de la famille Bcl-2.

Description

Molécules capables d'induire la mort cellulaire en ciblant la mitochondrie et leurs
applications
L'invention a pour objet l'utilisation de peptides isolés pour induire la mort cellulaire en ciblant la mitochondrie et leurs applications biologiques.
En plus de fournir l'énergie indispensable à la survie cellulaire, la mitochondrie exerce des fonctions essentielles dans le contrôle de l'apoptose chez les vertébrés.
La voie mitochondriale d'apoptose est définie par un événement majeur : la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe, qui conduit à la libération dans le cytoplasme de protéines toxiques (comme par exemple le cytochrome c) normalement contenues dans Γ espace intermembranaire .
L'intégrité de cette membrane est sous le contrôle des protéines de la famille Bcl-2. Les protéines de cette famille, qui sont soit pro-apoptotiques (comme Bax et Bid) soit anti- apoptotiques (comme Bcl-2 et Bcl-xL), forment des homo- et des hétérodimères, l'ensemble de ces interactions protéine-protéine participant à la régulation de l'apoptose.
On sait cependant que l'interaction des protéines de la famille Bcl-2 avec les membranes intracellulaires est cruciale pour leur fonction. Ainsi, à la fois les protéines pro- (comme Bax et Bid) et anti-apoptotiques (comme Bcl-2 et Bcl-xL) de la famille Bcl-2 peuvent former des pores in vitro dans des membranes artificielles. Des expériences indiquent également que des canaux composites formés au niveau de la membrane mitochondriale externe par des oligomères des protéines pro-apoptotiques Bax et Bak (seuls ou en association avec d'autres protéines) autoriseraient le passage de solutés comme le cytochrome c.
Les protéines homologues à Bcl-2 partagent une structure globulaire (rappelant celle de certaines toxines bactériennes formant des pores membranaires) comportant entre 6 et 9 hélice-alpha amphipathiques. Plusieurs études structurales ont montré que l'un des déterminants structuraux cruciaux pour la fonction de ces protéines était un motif supersecondaire (« hélice-coude-hélice ») composé de deux hélices-alpha anti-parallèles en « épingle à cheveux » (alpha5-alpha6 dans Bax), capables de s'insérer dans les membranes biologiques et de former des pores. La structure 3D de Bax est donnée sur la Figurel . Chaque hélice du motif présente une taille d'environ 15-20 acides aminés (ordre de grandeur pour une hélice-alpha susceptible de traverser une bicouche lipidique), séparés par un coude formé de 3-4 résidus. Si les études disponibles étayent l'importance de ce domaine pour l'insertion des protéines de la famille Bcl-2 dans des membranes artificielles et la formation de pores dans des systèmes membranaires modèles (voir pour revue Petros et al. Biochim. Biophys. Acta, 2004), elles ne renseignent pas sur le mécanisme d'action de ce motif au niveau mitochondrial. Ainsi, la contribution exacte de ce motif à la formation de pores in cellulo et in vivo par les protéines de la famille Bcl-2 est encore largement spéculative.
Il a été rapporté dans la littérature que des peptides correspondant aux hélices centrales d'insertion membranaire (alpha5 et alpha6) de Bax étaient capables d'induire à eux seuls la libération de molécules contenues dans des liposomes (Garcia-Saez et al, Biophys J, 2005 ; Garcia-Saez et al, FEBS J, 2006 ; Garcia-Saez et al, Biophys J, 2007). De plus, une étude structurale récente a montré qu'un peptide correspondant à l'hélice alpha5 de Bax formait un pore lipidique (Qian et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 2008). Bien que ces études apportent un éclairage sur les mécanismes fondamentaux de formation de pores dans des systèmes artificiels et acellulaires, on ne trouve aucune indication sur la faculté des peptides utilisés à induire une mort cellulaire, et leur effet sur des mitochondries n'a pas été exploré.
Une étude (Ishibashi et al. Biochem Biophys Res Commun, 1998) a indiqué que l'expression ectopique, par des bactéries ou par des cellules de mammifères, de constructions codant des fragments de Bax comprenant les hélices alpha5 et/ou alpha6 exerçait un effet toxique. Les auteurs de l'étude rapportent que les régions de Bax capables de tuer les cellules de mammifères sont les mêmes que celles induisant la mort des bactéries, qui sont dépourvues de mitochondries. Sur la base de cette étude, il n'est pas possible de déterminer le mécanisme d'action des fragments exprimés, et en particulier de savoir si l'activité cytotoxique observée avec les cellules de mammifères dépend d'une action au niveau mitochondrial. De façon notable, l'étude ne fait état que de l'utilisation de plasmides recombinants, l'effet de peptides correspondant aux régions alpha5 et/ou alpha6 de Bax n'ayant pas été testé.
Il est vraisemblable que les régions d'insertion membranaire des protéines de la famille Bcl-2 aient été sélectionnées par l'évolution pour s'intégrer de manière spécifique dans les membranes mitochondriales des cellules animales. Il est important de tester expérimentalement si ces régions, en dehors du contexte global des protéines qui les contiennent, sont capables d'atteindre les mitochondries, d'interférer avec leur structure (comme par exemple leurs membranes) et/ou leur fonction (comme par exemple leur potentiel transmembranaire) et de provoquer une mort cellulaire. A ce jour, la capacité de peptides dérivant de ce motif d'insertion membranaire à déclencher à eux seuls un processus apoptotique en agissant sur la mitochondrie n'est appuyée par aucune preuve expérimentale. De tels peptides pourraient représenter une alternative aux peptides cationiques artificiels utilisés pour déclencher la mort cellulaire (Ellerby et al. Nat Med, 1999), peu actifs et donc peu propices à un développement industriel.
Les travaux des inventeurs ont porté sur l'étude de peptides issus de ces régions afin de déterminer s'ils peuvent à eux seuls cibler les membranes mitochondriales et provoquer une mort cellulaire par apoptose.
Les résultats obtenus ont permis d'identifier des déterminants structuraux minimums régissant l'interaction des protéines de la famille Bcl-2 avec les membranes. De manière avantageuse, certaines régions se sont révélées d'un grand intérêt pour cibler la mitochondrie et déstabiliser les membranes mitochondriales. A partir de ces régions, des peptides bioactifs ont été développés ouvrant une voie d'accès à de nouvelles molécules utilisables en thérapeutique.
Ces nouvelles molécules ont été désignées par le terme « poropeptides » (du mot grec Poros ΠΟΡΟΣ: trou ou passage maritime; au figuré : moyen efficace de contourner une difficulté), un poropeptide désignant un peptide présentant la faculté de former des pores dans des membranes lipidiques ou de déstabiliser des membranes biologiques telles que les membranes mitochondriales.
Des poropeptides, conçus à partir des régions d'insertion membranaire des protéines de la famille Bcl-2, se sont ainsi révélés capables d'induire l'apoptose de cellules nuisibles, comme par exemple des cellules tumorales.
L'invention a donc pour but l'utilisation de peptides dont la séquence dérive des régions d'insertion membranaire des protéines de la famille Bcl-2 pour induire la mort cellulaire en ciblant la mitochondrie. Elle vise également à fournir de nouvelles molécules de peptides développés à partir de ces régions.
L'invention vise aussi à fournir, avec ces différentes molécules, des moyens de grande efficacité pour restaurer un processus d'apoptose dans les cellules cancéreuses tout en limitant au maximum les répercussions sur les cellules saines environnantes. Cette étape de ciblage pourra par exemple reposer sur la vectorisation des peptides par couplage à une molécule de domiciliation assurant leur adressage sélectif au niveau du site tumoral, en épargnant les tissus sains. Comme l'ensemble des cellules vivantes de l'organisme (saines ou pathologiques) sont dotées de mitochondries, les poropeptides induisant la rupture de la perméabilité mitochondriale peuvent être utilisés pour induire la mort de nombreux types cellulaires. Avec les progrès dans les techniques de ciblage thérapeutique, il pourra être envisagé de procéder à l'élimination sélective de certaines populations cellulaires nuisibles pour l'organisme. L'invention porte ainsi sur l'utilisation de dérivés des hélices d'insertion membranaire des protéines de la famille Bcl-2 pour induire la mort cellulaire en ciblant la mitochondrie, caractérisée en ce qu'il s'agit de peptides correspondant aux régions a5 et/ou a6 de la protéine Bax ou aux régions équivalentes présentes dans les autres protéines de la famille Bcl-2. L'invention porte en outre sur des dérivés, variantes, mutants ou fragments des peptides susmentionnés.
Des peptides synthétiques dérivés de ceux définis ci-dessus comportent par exemple des moyens permettant la pénétration cellulaire ou la reconnaissance d'un type cellulaire particulier.
Des moyens avantageux correspondent à un motif de transduction permettant leur internalisation dans la cellule ciblée. Il s'agit notamment d'un motif polyarginine, comportant avantageusement 8 résidus arginine. D'autres modifications, correspondent à des délétions et/ou des substitutions d'un ou plusieurs acides aminés. Ainsi un ou plusieurs résidus Cystéine des dites régions peuvent être remplacés par des motifs Serine ou Glycine.
L'invention concerne également des conjugués qui contiennent un peptide dérivé de ceux définis ci-dessus et une molécule d'adressage, comme des molécules reconnaissant l'endothélium, permettant de cibler un tissu ou un type cellulaire particulier, tel que certaines cellules tumorales ou des cellules endothéliales angiogéniques.
L'invention concerne aussi des équivalents fonctionnels des peptides définis ci-dessus, tels que des peptides comprenant des modifications issues de processus post-traductionnels comme la glycosylation ou de modifications chimiques telles que le couplage avec des lipides, sucres, séquences de nucléotides ou d'acides aminés dès lors que ces modifications ne modifient pas l'activité pro-apoptotique desdits peptides conformément aux tests donnés dans la partie expérimentale ci-après. Les équivalents fonctionnels comprennent aussi des peptides dont un ou plusieurs acides aminés sont des acides aminés de conformation D. L'invention couvre également les rétro- peptides et les rétro-inverso-peptides.
L'invention vise en particulier les peptides dérivés des régions a5 et a6, à titre d'exemple, le peptide de séquence SEQ ID N°l : NH2-NWGRVVALFYFASKLVLKALSTKVPELIR- COOH.
Après internalisation, ces composés « mitochondrio-toxiques » sont capables de déclencher l'apoptose en déstabilisant les membranes mitochondriales, notamment la membrane mitochondriale externe. De manière avantageuse, ils induisent le relargage de multiples molécules toxiques contenues dans l'espace inter-membranaire des mitochondries, notamment du cytochrome c.
Comme illustré par les exemples, leur activité cytotoxique a été démontrée in cellulo. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention vise l'utilisation des peptides définis ci-dessus comme médicaments.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont caractérisées en ce qu'elles comprennent une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un peptide tels que définis ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif au moins un peptide tel que défini précédemment associé dans ladite composition avec un ou plusieurs véhicules, diluants ou excipients pharmaceutiquement acceptable.
L'administration de composition pharmaceutique selon l'invention peut être réalisée selon les techniques connues par l'homme de métier par l'un quelconque des modes d'administration acceptés pour les agents thérapeutiques. Ces procédés comprennent l'administration systémique, topique, orale ou encore centrale, par exemple par voie chirurgicale ou encore par administration intra-oculaire. On peut citer aussi l'implantation sous- cutanée d'implants biodégradable.
La posologie pour l'administration des peptides selon l'invention est choisie en fonction de nombreux facteurs y compris le type, l'espèce, l'âge, le poids, le sexe et l'état médical du sujet; la gravité de l'état à traiter ; la voie d'administration ; l'état des fonctions rénale et hépatique du sujet et la nature du composé particulier, ou sel, employé. L'homme de métier normalement expérimenté déterminera et prescrira la quantité efficace pour prévenir, contrarier ou stopper le progrès de l'état médical à traiter.
Grâce à leur effet direct sur la perméabilité mitochondriale, les composés ci-dessus sont particulièrement avantageux pour déclencher un processus apoptotique après internalisation dans des cellules tumorales ou des cellules des néo-vaisseaux irriguant les tumeurs.
Du fait de leur capacité à cibler les mitochondries, l'invention a également pour objet l'utilisation des peptides susmentionnés comme molécules d'adressage mitochondrial permettant de délivrer un composé ou un polypeptide au niveau des membranes mitochondriales afin d'induire l'apoptose.
Ils sont utilisables de manière générale dans des situations avec une augmentation de la néo- vascularisation, comme l'arthrite rhumatoïde ou l'obésité. En effet, une angiogénèse soutenue caractérise les formes sévères d'arthrite et le maintien de la masse adipeuse au cours de l'obésité. Une angiogénèse pathologique est également retrouvée dans le psoriasis et certaines formes de diabète. Selon un autre mode de réalisation avantageux desdits poropeptides, ils sont utilisés pour contrer certains autres types de cellules nuisibles, comme les cellules immunitaires reconnaissant le soi et provoquant des maladies auto-immunes. Les poropeptides tels que définis ci-dessus présentent toutes les caractéristiques de peptides antimicrobiens: caractère amphipathique, cationique, déstabilisation des membranes lipidiques. La présente invention a donc également pour objet l'utilisation des peptides tels que définis ci-dessus pour la préparation d'une molécule aux propriétés antibiotiques capables de tuer des bactéries résistantes.
D'une manière générale, les peptides thérapeutiques sont généralement métabolisés et s'éliminent plus facilement que les drogues conventionnelles, permettant de donner au patient de meilleures chances de guérison tout en minimisant les complications associées aux thérapies standards.
De plus les poropeptides peuvent être utilisés, conformément à l'invention, comme adjuvants venant en complément des drogues conventionnelles, permettant ainsi de diminuer les doses et les effets secondaires de ces dernières. Selon un autre aspect, l'invention vise des compositions cosmétiques renfermant dans leur principe actif au moins un peptide tel que défini ci-dessus en association avec un véhicule acceptable en cosmétologie.
De manière avantageuse, les peptides de l'invention présentent des propriétés stabilisantes pour ces compositions.
Selon un autre aspect, l'invention vise en outre des compositions agronomiques ou agroalimentaires renfermant dans leur principe actif au moins un peptide tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule acceptable en agronomie et dans le domaine alimentaire.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 11 qui représentent, respectivement, - Figure 1, A) le domaine « canal » de la colicine A; B) la structure 3D de Bax ; C) le motif a- hélical en épingle à cheveux des protéines de la famille Bcl-2 (alpha5-alpha6 dans Bax) ;
- Figure 2, des constructions codant pour des fusions entre la GFP (protéine fluorescente verte) et les différentes régions d'ancrage ou d'insertion membranaire de la protéine pro-apoptotique Bax ;
- Figure 3, des résultats d'analyse de l'expression de régions de Bax par Western Blot ;
- Figure 4, la localisation cellulaire de la GFP par rapport aux dites régions ;
- Figure 5, le taux de mort de cellules exprimant la GFP ou la GFP fusionnée aux peptides utilisés selon l'invention ;
- Figure 6, le taux d'apoptose de fîbroblastes embryonnaires murins sauvages (MEF) ou déficients en Bax et Bak (MEF-DKO) ;
- Figure 7, le potentiel transmembranaire mitochondrial de cellules exprimant la GFP ou la GFP fusionnée aux peptides utilisés selon l'invention ;
- Figure 8, la projection en roue hélicoïdale d'un peptide de l'invention ;
- Figure 9, l'effet d'un poropeptide de l'invention sur des mitochondries isolées ;
- Figures 10 et 11, l'effet de la micro -injection de fragments peptidiques de Bax sur la viabilité et la morphologie embryonnaire (Fig.9) et cellulaire (Fig.10) ; et
-Figure 12, l'effet pro-apoptotique d'un poropeptide de l'invention.
Constructions plasmidiques comportant des inserts correspondant aux acides nucléiques codant pour une ou plusieurs régions de Bax fusionnées à la GFP : aminoacides 1-192 (protéine Bax entière : α!-α2-α3-α4-α5-α6-α6'-α7-α8-α9), 20-37 (al), 106-134 (a5), 130-150 (a6 , 102-150 (a5-a6 , 102-192 (a5-a6-a6'-a7-a8-a9 ou a5-a9 , 169-192 (a9 .
Les acides nucléiques codant pour les différentes régions d'ancrage ou d'insertion membranaire présentes sur la protéine pro-apoptotique Bax ont été clonés dans le plasmide pEGFP-Cl . Les séquences insérées sont données sur la Figure 2. Une construction (GFP- KLAK) codant un polypeptide GFP-KLAKLAKKLAKLAK a également été fabriquée. Les peptides artificiels enrichis en séquences KLA sont connus pour cibler la membrane bactérienne chargée négativement et présenter une activité antibiotique.
Les plasmides recombinants ont été vérifiés par séquençage moléculaire. L'analyse de l'expression des inserts de Bax effectuée par Western Blot est rapportée sur la Figure 3 : la partie supérieure correspond à l'analyse par Western Blot, en utilisant un anticorps anti-GFP, de lysats de cellules de fibrosarcome HT 1080 transfectées de manière transitoire par les constructions plasmidiques ci-dessus ; la partie médiane donne l'immuno-empreinte obtenue à l'aide d'un anticorps reconnaissant le fragment de clivage apoptotique de PARP ; la partie inférieure donne l'immuno-empreinte obtenue à l'aide d'un anticorps reconnaissant la forme activée de la caspase-3.
Les différentes constructions ont été transfectées dans des cellules humaines cultivées in vitro (HT- 1080 et SK-MEL-28), puis la localisation subcellulaire et la cytotoxicité induite par les fragments d'insertion membranaire de Bax fusionnés à la GFP ont été déterminées.
La Figure 4 montre la localisation subcellulaire de la protéine GFP complète par rapport à celle des inserts composés de fragments d'insertion membranaire de Bax fusionnés à la GFP. Des cellules MEF-DKO ont été co-transfectées avec les plasmides pEGFP-Cl codant les différents inserts de Bax et le vecteur MitoDsRed. On observe que des peptides correspondant ou comprenant les hélices d'insertion membranaire de Bax et/ou le domaine TM sont suffisants pour adresser la GFP (en vert) aux membranes mitochondriales (marquées en rouge grâce à la protéine MitoDsRed, comportant la séquence d'adressage mitochondrial CoxVIII). Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant un anticorps dirigé contre la protéine mitochondriale Hsp70 (encarts du bas). Ces résultats de microscopie confocale indiquent que de courts fragments de la protéine Bax (en particulier les régions correspondant aux acides aminés 106-134, 130-150 et 169-172) contiennent les déterminants nécessaires à leur adressage spécifique à la mitochondrie. La Figure 5 montre la toxicité cellulaire induite par l'expression des différentes constructions. La figure 5 A donne le taux de mort (apoptose/nécrose) de cellules HT- 1080 exprimant la GFP seule ou en fusion avec différents fragments d'insertion membranaire de la protéine de mort Bax. Les cellules ont été traitées (+) ou non (-) avec l'inhibiteur général de caspases zVAD.fmk (ΙΟΟμΜ). La mort cellulaire a été quantifiée 24 h après transfection en comptant le nombre de cellules vertes (exprimant la GFP) au microscope à épifluorescence. Le type de mort cellulaire (apoptose et nécrose) a été déterminé par la perméabilité membranaire à l'iodure de propidium (nécrose) et la morphologie nucléaire (noyaux condensés ou fragmentés) après coloration au Hoechst 33342 (apoptose). Les cellules vertes négatives pour l'iodure de propidium et présentant un noyau pycnotique ont été comptées comme étant en apoptose. Les résultats représentent les valeurs moyennes (avec les écart-types) de trois expériences.
Dans le test utilisé, les cellules vertes (exprimant la construction) présentant un noyau pycnotique sont apoptose, celles colorées en rouge par l'iodure de propidium sont en nécrose.
On observe que les constructions codant les hélices centrales de Bax (GFP-Bax-a5a6, GFP- Bax-a5 et GFP-Bax-a6) sont fortement cytotoxique et induisent une mort cellulaire principalement de type apoptotique. Le caractère apoptotique de la mort cellulaire provoquée par l'expression des fragments d'insertion membranaire de Bax est confirmé par le clivage de la protéine PARP et l'activation de la caspase-3, mises en évidence par la technique du western blot (Fig.3) à l'aide d'anticorps spécifiques, et par blocage de l'apoptose par un inhibiteur de caspases à large spectre(zVAD.fmk) (Fig.5A). En outre, le déclenchement d'une mort cellulaire de type apoptotique est démontré par le marquage à l'Annexine-V, qui reconnaît spécifiquement les phosphatidylsérines extemalisées par les cellules en apoptose (Fig.5B). Dans cette expérience, la mort cellulaire a été quantifiée à l'aide du test Annexine V-Cyanine 3 par cytométrie de flux 24h après transfection transitoire des cellules par les plasmides d'intérêts. Il est à noter que les constructions GFP-Bax-a5 et GFP-Bax-a6 sont plus efficaces pour induire l'apoptose que la construction GFP-KLA .
La Figure 6 montre que les protéines toxiques codées par les inserts n'agissent pas par l'intermédiaire des protéines pro-apoptiques Bax et Bak endogènes, car des fïbroblastes murins déficients en Bax et Bak (MEF-DKO) ne sont pas résistants au stress induit par leur expression (voir également Fig.3). Le graphe (Fig.6A) correspond à une cinétique de mort cellulaire (quantifiée par cytométrie de flux grâce au test Annexin V- Cy3) de fïbroblastes murins sauvages MEF versus MEF-DKO. On observe que les fïbroblastes déficients pour Bax et Bak sont autant sensibles à l'induction de l'apoptose par l'expression de la protéine GFP- Bax-alpha5 que des fïbroblastes murins sauvages. Dans le même temps, les cellules MEF DKO sont résistantes à l'apoptose induite par la staurosporine (Fig.6B). Ces résultats indiquent que la région Bax-alpha5 est capable de tuer par apoptose les cellules MEF-DKO, décrites comme étant résistantes à un grand nombre de stimuli apoptotiques (Wei et al. Science, 2001). La Figure 7 montre que des cellules (HT- 1080) exprimant les polypeptides comportant les hélices cc5 et/ou cc6 de Bax subissent une chute importante de leur potentiel transmembranaire mitochondrial (ΔΨιη), contrairement aux cellules exprimant la GFP seule, suggérant l'implication d'une voie dépendante de la mitochondrie dans l'induction de l'apoptose. Les cellules ont été colorées avec du Mitotracker 24h après transfection et analysées par cytométrie de flux (Fig.7A). Les histogrammes (Fig.7B) présentent les valeurs moyennes de trois expériences de quantification par cytométrie de flux des cellules vertes (exprimant la GFP) présentant des défauts d'incorporation du Mitotracker (c'est-à-dire un ΔΨιη faible). Les résultats présentés montrent que les régions de la protéine pro-apoptique Bax correspondant aux acides aminés 106-104 et 130-150 sont capables de cibler les membranes mitochondriales er d'induire le suicide cellulaire par apoptose. Ces régions sont structurées en hélices-alpha au sein de la protéine Bax complète (Suzuki et al. 2000, Cell, 103, 645-654) et présentent un caractère amphipatique favorable à la déstabilisation des membranes biologiques.
Poropeptide de séquence SEQ ID N° 1 II s'agit d'un peptide amphipatique (voir Fig.8), plus long que l'hélice a5 déduite à partir de la structure 3D de la protéine Bax en solution (Suzuki et al. 2000). Il comporte un résidu Sérine incorporé en position 126 en lieu et place du résidu naturel Cystéine afin de limiter la formation de ponts disulfure. · Caractérisation de son mode d'action par incubation avec des mitochondries isolées.
L'activité ex cellulo du poropeptide-Bax (106-134) a été testée en déterminant sa capacité à promouvoir la libération de cytochrome c de l'espace inter-membranaire de mitochondries isolées. Les résultats obtenus sont illustrés par la Figure 9 (A).
Le peptide est incubé avec les mitochondries pendant 5,15, 30 ou 60 min, et la libération mitochondriale de cytochrome c dans le surnageant (SN) est mesurée par Western Blot. Les fractions mitochondriales (Mito) sont calibrées à l'aide d'un anticorps dirigé contre les protéines mitochondriales HSP70 ou ATPase (sous-unité 6). Avec le poropeptide-Bax (106- 134), le cytochrome c est libéré de l'espace inter-membranaire de la mitochondrie à 10 μΜ et en 5 min d'incubation. Aucun re largage n'est observé lorsqu'un peptide antimicrobien artificiel (KLAK) de séquence SEQ ID N°2 KLAKLAKKLAKLAK est utilisé.
A 10 μΜ, ce qui correspond à la concentration minimale pour laquelle un re largage est observé avec le poropeptide-Bax (106-134), aucune libération n'est observée pour le peptide Bax-BH3 (domaine de mort BH3 de Bax correspondant à l'hélice a2, située une trentaine de résidus an amont de l'hélice a5). Le cytochrome c est libéré de l'espace inter-membranaire mitochondrial à partir de 25μΜ en utilisant des mitochondries isolées de cellules HEK293T et n'est jamais libéré avec des cellules SK-MEL-28. Le poropeptide-Bax (106-134) est donc plus actif que le Bax-BH3 pour libérer le cytochrome c de l'espace inter-membranaire de la mitochondrie. De plus, il est plus efficace, puisqu'il permet une libération dès les 5 premières minutes, alors qu'il faut attendre 30 min pour le peptide BH3 dans les cellules HEK293T.
Ces expériences montrent que le poropeptide-Bax [106-134], de séquence SEQ ID N°l, possède une forte capacité à induire la perméabilisation des membranes mitochondriales.
La Figure 9B montre en outre que le poropeptide-Bax (106-134) altère profondément la physiologie de l'organite, en provoquant un processus physique de gonflement (panel de gauche) et de dépolarisation (droite). Le poropeptide-Bax (106-134) induit le gonflement des mitochondries (DD50 = 1.68 ± 0.39 μΜ) et la chute de leur potentiel transmembranaire (SD50 = 3.98 ± 0.57 μΜ). Ces deux paramètres ont été mesurés en utilisant des mitochondries isolées de foie de rat incubées en présence de différentes concentrations de poropeptide-Bax (106-134) (NT = non-traité).
Ces résultats obtenus in vitro confortent l'implication d'une voie dépendante de la mitochondrie dans l'induction de l'apoptose par la région cc5 de Bax. · mesures de cytotoxicité induite
- Administration de manière endogène du peptide (par micro -injection). Le poropeptide-Bax [106-134] a été micro-injecté in vivo. Le modèle du zebrafîsh (Danio rerio) a été utilisé car (i) la machinerie d'apoptose est conservée entre les cellules humaines et de poissons ; (ii) l'œuf correspond à un système cellulaire intégré par rapport aux mitochondries isolées ; (ii) les œufs de poisson-zèbre sont facilement injectables en routine.
Les résultats obtenus sont illustrés sur la Figure 10 :
(A) Des œufs de zebrafîsh ont été micro -injectés au stade 1-2 cellule(s) avec des concentrations croissantes de poropeptide-Bax [106-134], de peptide Bax-BH3 ou avec de l'eau ultra pure Cmock'). Une concentration de 100 μΜ à l'intérieur du capillaire de microinjection correspond environ à 6xl012 molécules de peptide par œuf. Les histogrammes représentent le pourcentage de mortalité 24 h après fertilisation et le pourcentage d'embryons survivants présentant de sévères malformations. Les données présentées sont représentatives de 2 expériences indépendantes donnant les mêmes résultats.
(B) Morphologie embryonnaire 24 h après micro -injection (100 μΜ de peptide). De sévères malformations sont observables dans le groupe de poissons injectés avec le poropeptide-Bax [106-134] par rapport au groupe injecté avec le peptide BH3. Le poropeptide-Bax [106-134] a ensuite été mélangé à une solution de dextran-fluorescéine (pour permettre sa visualisation en microscopie à épifluorescence), puis micro-injecté à l'intérieur de cellules de mélanome humain SK-MEL-28. La viabilité cellulaire a ensuite été suivie et quantifiée 12 heures après micro-injection. La Figure 11 donne les résultats obtenus :
(A) Microphotographies montrant des cellules humaines de mélanome SK-MEL-28 injectées avec du traceur fluorescent Dextran-FITC seul Cmock') ou mélangé au poropeptide-Bax [106-134]. Les cellules ont été photographiées 12 h après micro-injection. Les cellules micro- injectées avec le poropeptide- Bax [106-134] présentent des manifestations morphologiques caractéristiques de l'apoptose (bourgeonnement cytoplasmique, rétractation et arrondissement cellulaire). Grossissement x 800. (B) Viabilité cellulaire après micro -injection de poropeptide- Bax [106-134] ou de peptide Bax-BH3, KLAK ou R8. Les cellules micro-injectées ont été visualisées à l'aide du traceur Dextran-FITC. La mort cellulaire a été estimée 12h après micro -injection en comptant le nombre de cellules micro -injectées par du peptide présentant des manifestations morphologiques typiques de l'apoptose, par rapport au contrôle (micro -injection d'eau ultrapure additionnée de dextran-fluorescéine). Les données présentées sont représentatives de 2 expériences indépendantes donnant les mêmes résultats.
Les résultats montrent que la micro-injection du poropeptide-Bax [106-134] induit une mort cellulaire substantielle, alors que les cellules micro-injectées par Bax-BH3 ou KLAK n'ont pas d'effet significatif Les cellules micro-injectées par du peptide témoin (R8) de séquence SEQ ID N°3 RRRRRRRR (un motif polyarginine de transduction intracellulaire) présentent des taux de viabilité comparables au contrôle. Ces données démontrent que le poropeptide- Bax [106-134] exerce des effets cytotoxiques dépendant de la dose après introduction dans des œufs de zebrafïsh ou dans des cellules tumorales cultivées in vitro, et qu'il est plus efficace pour induire la mort cellulaire qu'un peptide pro-apoptotique issu de la même protéine (Bax-BH3) ou que d'autres peptides connus pour être actif au niveau membranaire (KLAK et R8). - Administration de manière exogène (par couplage avec peptide transducteur de type polyarginine).
Le poropeptide de séquence SEQ ID N° 1 , comportant une extension N-terminale polyarginine (R8) séparée par un résidu glycine, a été utilisé. Un groupement isothiocyanate de fluorescéine (FITC) a été ajouté en position C-terminale de manière à permettre sa visualisation par microscopie à épifluorescence. Le peptide R8-Scr-FITC est une séquence « scramble » de la séquence présente dans le peptide R8- Bax [106-134]- FITC, c'est-à-dire une séquence contrôle dans laquelle les acides aminés (leur ordre dans la séquence) ont été mélangés.
La figure 12 montre les résultats obtenus :
(A) Des cellules HeLa ont été incubées pendant 6 h en présence de 10 μΜ de poropeptide FITC-R8-Bax [106-134] ou de peptide contrôle R8-Bax [Scr] (version « scramble » du poropeptide), puis observées au microscope à épifluorescence. Les cellules incubées en présence des peptides fluorescents présentent un fort marquage cytoplasmique (visible dès lh d'incubation). Echelle 10 μιη.
(B) Le poropeptide R8-Bax [106-134] induit une perte de viabilité cellulaire dépendante de la dose et du temps d'incubation. Des cellules HeLa ont été traitées avec des concentrations croissantes (5, 10, 25 et 50 μΜ) de peptide R8-Bax [106-134] ou R8-Bax [106-134]. La cytotoxicité a été déterminée en mesurant la libération cellulaire de lactate déshydrogénase (LDH) après 3, 6 ou 24 h d'incubation (n=4). Le peptide R8-Bax [Scr] n'induit pas de fuite significative de LDH aux concentrations testées. Les résultats sont donnés en moyennes et écart-types.
(C) L'inhibiteur général de caspases zVAD.fmk réduit la mort cellulaire induite par poropeptide R8-Bax [106-134] (25μΜ). La cytotoxicité a été déterminée en mesurant la libération cellulaire de lactate déshydrogénase (LDH) après 3, 6 ou 24 h d'incubation en présence de 100 μΜ de zVAD.fmk ou de tampon seul ( 'DMSO' ). Les résultats sont donnés en moyennes et écart-types.
(D) Taux de mort (apoptose/nécrose) de cellules HeLa traitées avec le poropeptide R8-Bax [106-134]. Le type de mort cellulaire a été déterminé 24 h après transfection par observation de la perméabilité cellulaire à l'iodure de propidium (nécrose) ou de la morphologie nucléaire après coloration de l'ADN par le Hoechst 33342 (apoptose). Les cellules vertes (exprimant la GFP) ont été visualisées par microscopie à épifluorescence. Environ 300 cellules ont été dénombrées par expérience. Les résultats sont une moyenne de trois expériences indépendantes (Γ écart-type est également représenté).
Ainsi les deux peptides (poropeptide FITC-R8-Bax [106-134] et peptide contrôle « scramble » R8-Bax [Scr]) sont rapidement internalisés (en moins d'une heure) par des cellules HeLa en culture in vitro (Fig. 12A). A la différence du peptide contrôle, le poropeptide R8-Bax [106-134]-FITC inhibe la viabilité des cellules HeLa de manière dépendante de la dose et du temps d'incubation (Fig. l2B). Un inhibiteur pan-caspase, le zVAD.fmk, ajouté in vitro inhibe significativement la mort cellulaire induite par R8-Bax [106-134]-FITC (Fig. l2C), indiquant la participation des caspases dans son activité pro- apoptotique (Fig. l2D). (E) Taux d'apoptose de cellules fïbroblastiques murines sauvages (MEF) ou déficientes en protéines de mort Bax et Bak (MEF DKO) traitées avec le poropeptide FITC-R8-Bax [106- 134] ou le peptide contrôle FITC-R8-Bax [Scr]. L'apoptose a été quantifiée à l'aide du test Annexine V-Cyanine 3 par cytométrie en flux 6h ou 24h après traitement, en présence ou non de l'inhibiteur de général de caspases zVAD.fmk. Les résultats correspondent au pourcentage de cellules apoptotiques ayant internalisé le peptide fluorescent dans chaque condition.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Utilisation de dérivés des hélices d'insertion membranaire des protéines de la famille Bcl-
2 pour induire la mort cellulaire en ciblant la mitochondrie, caractérisée en ce qu'il s'agit de peptides correspondant aux régions a5 et/ou a6 de la protéine Bax ou aux régions équivalentes présentes dans les autres protéines de la famille Bcl-2.
2 - Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que lesdits peptides sont développés à partir des régions correspondant aux acides aminés en position 106-134, 130-150 et 102-150 de la protéine Bax.
3 - Peptides dérivés des régions a5 et/ou a6 de la protéine Bax ou des régions équivalentes présentes dans d'autres protéines de la famille Bcl-2.
4 - Peptides selon la revendication 5, caractérisés en ce qu'ils comportent des moyens permettant la pénétration cellulaire ou la reconnaissance d'un type cellulaire particulier.
5 - Peptides selon la revendication 6, caractérisés en ce que lesdits moyens correspondent à un domaine de transduction tel qu'un motif polyarginine.
6 - Peptides selon l'une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisés en ce qu'un ou plusieurs acides aminés sont délétés ou substitués par un autre.
7 - Peptides selon la revendication 8, caractérisés en ce qu'un ou plusieurs résidus Cystéine sont remplacés par des résidus Sérine ou Glycine.
8 - Peptide de séquence SEQ ID N°l : NH2-NWGRVVALFYFASKLVLKALSTKVPELIR- COOH.
9 - Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 8, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. 10 - Compositions cosmétiques, caractérisées en ce qu'elles renferment dans leur principe actif au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 8, en association avec un véhicule acceptable en cosmétologie. 11 - Compositions agroalimentaires ou agronomiques comprenant dans leur principe actif au moins un peptide tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 8, en association avec un véhicule acceptable en agronomie et dans le domaine alimentaire.
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