CN116406294A - 酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸作为调节蛋白酶体动力学的mTOR激动剂、其在治疗中的组成、方法及用途、以及抗药性的预后方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供选择性调节蛋白酶体动力学的数个mTOR激动剂、其数个组合物、数个方法及其用于调节压力诱导的蛋白酶体动力学及相关病理状态的数个用途。本发明特别提供了治疗与蛋白酶体的细胞质积累相关的疾病的治疗方法。本发明还提供用于检测及监测数个抗药性癌症的预后方法、以及用于筛选蛋白酶体动力学的数个调节剂的方法。
Description
技术领域
本发明涉及治疗及预后化合物、组合物及方法的领域,以及其在蛋白酶体动力学相关条件下的应用。更具体而言,本发明提供选择性调节蛋白酶体动力学的mTOR激动剂、其组合物、方法及其用于调节压力诱导的蛋白酶体动力学及相关病理条件的用途。本发明还提供了用于检测及监测抗药癌症的预后方法。
背景技术
被认为与当前公开的主题相关的参考文献如下:
文献1:Cohen Kaplan、V.,Livneh、I.,Avni,N.,Fabre,B.、Ziv,T.、Kwon,Y.T.及Ciechanover,A.(2016a)。p62及泛素依赖性压力诱导的哺乳动物26S蛋白酶体的自噬(p62-and ubiquitin-dependent stress-induced autophagy of the mammalian 26Sproteasome)。国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)113,E7490-99。
文献2:Marshall,R.S.、Li,F.、Gemperline,D.C.、Book,A.J.及Vierstra,R.D.(2015)。拟南芥中26S蛋白酶体的自噬降解由双重ATG8/泛素受体RPN10介导(AutophagicDegradation of the 26S Proteasome Is Mediated by the Dual ATG8/UbiquitinReceptor RPN10 in Arabidopsis)。分子细胞(Mol.Cell)58,1053-1066。
文献3:Waite,K.A.、De La Mota-Peynado,A.、Vontz,G.、Roelofs,J.、De LaMota-Peynado,A.、Vontz,G.及Roelofs(2015)。饥饿通过核心及调节颗粒的不同途径诱导蛋白酶体自噬(Starvation Induces Proteasome Autophagy with Different Pathwaysfor Core and Regulatory Particle)。生物化学期刊(J.Biol.Chem.)291,3239-3253。
文献4:Yasuda,S.、Tsuchiya,H.、Kaiho,A.、Guo,Q.、Ikeuchi,K.、Endo,A.、Arai,N.、Ohtake,F.、Murata,S.、Inada,T.等人(2020)。蛋白酶体的压力及泛素化依赖性相分离(Stress-and ubiquitylation-dependent phase separation of the proteasome)。自然(Nature)578,296-300。
文献5:Burcoglu J.等人,(2015)细胞(Cell)4,387-405。
文献6:Saxton,R.A.等人,(2017)细胞(Cell)168,960-976。
文献7:Wulschleger,S.等人,(2006)细胞(Cell)124,471-484。
文献8:Takahara,T.等人,(2020)生物医学科学杂志(J.Biomed.Sci.)27,1-16。
文献9:Zhao,J.等人,(2015)国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)112,15790-15797。
文献10:Rousseau,A.等人,(2016)自然(Nature)536,184-189。
文献11:Zhang Y.等人,(2014)自然(Nature)513,440-443。
文献12:Deng,K.等人,(2012)Plos one 7(11)e49434。
文献13:Christoph Giese等人,(2008)ChemMedChem,3,1449-1456。
文献14:WO15137383 A1。
文献15:US2005119256 AA。
文献16:WO2008081537A1。
文献17:Cohen-kaplan,V.、Livneh,I.、Avni,N.、Cohen-Rosenzweig,C.及Ciechanover,A.(2016)。泛素蛋白酶体系统及自噬:协调及独立的活动(The ubiquitin-proteasome system and autophagy:Coordinated and independent activities.)。国际生物化学杂志(Int.J.Biochem)。细胞生物学(Cell Biol.)79,403-418。
文献18:Dikic,I.(2017)蛋白酶及自噬降解系统(Proteasomal and AutophagicDegradation Systems)。生物化学版年刊(Annu.Rev.Biochem.)86,193-224。
文献19:Manasanch,E.E.及Orlowski,R.Z.(2017)。蛋白酶体抑制剂在癌症治疗中的应用(Proteasome inhibitors in cancer therapy)。国家临床修订版肿瘤学(Nat.Rev.Clin.Oncol.)14,417-433。
文献20:Slater,A.F.G.(1993)。氯喹:恶性疟原虫的药物作用及抗药性机制(Chloroquine:Mechanism of Drug Action and Resistance in Plasmodium FalciparUm.Pharmac.Ther)57,203-235。
文献21:Russell,S.J.、Steger,K.a.及Johnston,S.A.(1999)。酵母中26个S蛋白酶体亚基的亚细胞定位、化学计量及蛋白质水平(Subcellular localization,stoichiometry,and protein levels of 26S proteasome subunits in yeast)。生物化学期刊(J.Biol.Chem.)274,21943-21952。
文献22:Heitman,J.、Movva,N.R.及Hall,M.N.(1991)。酵母中免疫抑制剂雷帕霉素抑制细胞周期的靶点(Targets for cell cycle arrest by the immunosuppressantrapamycin in yeast)。科学(Science)(80-.).253905-909。
文献23:Sabatini,D.M.、Erdjument-Bromage,H.、Lui,M.、Tempst,P.及Snyder,S.H.(1994)。RAFT1:一种哺乳动物蛋白,以雷帕霉素依赖的方式与FKBP12结合,且与酵母TORs同源(RAFT1:A mammalian protein that binds to FKBP12 in a rapamycin-dependent fashion and is homologous to yeast TORs)。细胞(Cell)78,35-43。
文献24:Cohen Kaplan,V.、Livneh,I.、Avni,N.、Cohen-Rosenzweig,C.及Ciechanover,A.(2016b)。泛素蛋白酶体系统及自噬:协调及独立的活动(The ubiquitin-proteasome system and autophagy:Coordinated and independent activities)。国际生物化学杂志(Int.J.Biochem.)。细胞生物学(Cell Biol.)79。
文献25:Shabaneh,T.B.、Downey,S.L.、Goddard,A.L.、Screen,M.、Lucas,M.M.、Eastman,A.及Kisselev,A.F.(2013)。骨髓瘤细胞对硼替佐米临床相关药物治疗差异敏感性的分子基础(Molecular Basis of Differential Sensitivity of Myeloma Cells toClinically Relevant Bolus Treatment with Bortezomib)。PLoS One 8,e56132。
本文中对上述引用的确认不应被推断为意味着这些引用以任何方式与当前公开的主题的专利性相关。
蛋白酶体是泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)的催化臂,负责去除泛素化蛋白。研究26S蛋白酶体在压力下的命运,先前已经表示出,在长时间(约24小时)氨基酸饥饿后,它经历自噬(文献1-3)。虽然蛋白酶体调节的几个方面(例如组装、组成及转译后修饰)已经被揭开,但是其响应于环境线索的区室化及适应性集中的问题刚刚开始出现。举例而言,最近的一项研究表示出,无膜核灶(membraneless nuclear foci)的渗透压诱导产生(osmotic stress induces generation)含有高浓度蛋白酶体并作为蛋白水解中心(文献4)。在酵母中,蛋白酶体在葡萄糖缺乏的情况下显示在胞质颗粒中积累,但不是氨基酸的积累,并且所述机制显示出作为防止蛋白酶体降解的保护措施,而不是作为减轻压力的蛋白水解手段本身[5]。
氨基酸短缺的关键调节剂之一是雷帕霉素的标靶(target of rapamycin,TOR),其哺乳动物同源物称为机理TOR(mechanistic TOR,mTOR)。在缺乏营养素的情况下,mTOR无活性,导致了自噬的上调节,从而为细胞提供再循环的构建块(文献6、7)。通过其将不同氨基酸水平传递给mTOR的直接传感器的表征仍处于早期阶段,并且仅鉴定了少数此类蛋白质(文献8)。同样地,直到最近几年才描述了mTOR及UPS之间的联系:mTOR抑制被证明可以上调节UPS及蛋白酶体活性,同时伴随自噬(文献9),并刺激蛋白酶体组装(文献10)。两种途径之间的关系可能取决于病理生理条件,因为不同的矛盾研究表示出抑制mTOR会导致蛋白酶体蛋白水解活性的下调节(文献11)。
先前已经描述了芳香族氨基酸对癌细胞生长的影响。Deng等人(文献12)报导了胃癌发生早期胃液样品中酪氨酸、苯丙氨酸及色氨酸水平升高的检测结果。Deng等人进一步建议使用这些芳香族氨基酸作为早期检测胃癌的生物标志物。同样地,Giese等人(文献13)报导,色氨酸(Trp,W)、苯丙氨酸(Phe,F)或酪氨酸(Tyr,Y)的消耗显着地降低了乳腺癌细胞系MCF-7的生长。相反地,氟化芳香族氨基酸(特别是L-(4-F)Trp)的存在以不可逆的方式完全抑制了这些细胞的生长。Giese等人进一步指出,通过添加未修饰的L-Trp、L-(4-F)Trp的抑制活性仅略微降低,表示出L-(4-F)Trp的生长抑制作用不能轻易地补救。因此,此出版物建议使用氟化芳香族氨基酸,特别是有效的类似物L-(4-F)Trp作为细胞抑制剂及抗肿瘤剂。根据此出版物,氟化衍生物仅限于局部应用,因为L-(4-F)Trp的全身施用可能导致严重的副作用。
WO15137383 A1(文献14)公开了使用谷氨酰胺代谢抑制剂作为化疗佐剂。其中公开的谷氨酰胺代谢抑制剂是以45mM的高浓度施用的芳香族氨基酸,特别是L-苯丙氨酸。
US2005119256 AA[15]公开了芳香族氨基酸的各种衍生物及其作为L型氨基酸转运蛋白1(L-type amino acid transporter 1,LAT-1)的抑制剂的用途,L型氨基酸转运蛋白1是细胞内摄取必需氨基酸所需的癌症特异性膜蛋白。本出版物公开的特别有效的衍生物包括3,5-二氯-O-[(2-苯基)-苯并恶唑-1-7-基]甲基-1-酪氨酸甲酯盐酸盐(3,5-Dichloro-O-[(2-phenyl)-benzoxazo1-7-yl]methyl-L-tyrosine methyl esterhydrochloride)及3-(2-萘氧基)-1-苯丙氨酸(3-(2-naphthyloxy)-L-phenylalanine)。两种衍生物对LAT-1的抑制导致细胞内14C-亮氨酸的减少,人膀胱癌T24细胞系增殖的抑制及肿瘤生长的抑制。类似地,WO08081537A1(文献16)公开了芳香族氨基酸的各种衍生物及其作为L型氨基酸转运蛋白1(LAT-1)抑制剂的用途。
此外,“规范(canonical)”观点是,除了通过自噬去除蛋白酶体外,两个蛋白水解系统还发挥着不同的生理作用:而UPS负责细胞蛋白的特异性及定时降解,例如转录因子、细胞周期调节剂、突变及错误折迭的蛋白质,自噬是在压力下大量去除细胞器及机器的原因(文献17-18)。鉴于这两个系统广泛参与细胞过程,它们也可作为药物开发目标。举例而言,氯喹通过干扰溶酶体活性用于疟疾及自身免疫疾病,蛋白酶体抑制剂作为多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)及淀粉样变性的一线治疗。有趣的是,虽然两组药物都被广泛使用,但它们的确切作用机制仍然难以捉摸,抗药机制也是如此(文献19-20)。
目前,蛋白酶体抑制剂构成多发性骨髓瘤的一线治疗(其占所有恶性肿瘤的3%及血液恶性肿瘤的20%)。很大一部分患者对治疗没有反应,这需要宝贵的时间(及金钱),同时使患者暴露于不良副作用并推迟开始其他潜在的治疗方案。迄今为止,还没有可靠的预测工具来预测单个患者对药物充分反应的机会。此外,使用新药的临床试验在伦理上也可能与蛋白酶体抑制剂一起治疗,因为无法预测哪些患者不会从中受益。目前正在扩大使用蛋白酶体抑制剂的医学适应症,最近增加了几种肿瘤及炎性疾病,而另一些则在临床试验中。因此,需要用于治疗及诊断的强大的蛋白酶体动力学选择性调节剂。本公开解决了这些未满足的需求。
发明内容
本公开的第一方面涉及雷帕霉素的哺乳动物标靶的激动剂(mammalian targetof rapamycin,mTOR),或其任何载体、基质、纳米或微粒。在一些特定实施例中,本发明的mTOR激动剂可包含以下中的至少一者:
第一(a),至少一酪氨酸(Y)残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些实施例(b)中,mTOR激动剂可包含至少一色氨酸(W)残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基及/或mTOR激动性色氨酸的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物。在又一些进一步的实施例中,本发明的mTOR激动剂可包含(c)、至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动型苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些特定实施例中,本公开的mTOR激动剂可包含至少一酪氨酸(Y)残基、至少一色氨酸(W)残基、至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性模拟物、其盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。
在另一方面,本发明涉及包含作为活性成分的至少一mTOR激动剂的组合物,在一些实施例中,所述组合物可可选地进一步包含至少一药学上可接受的载体、赋形剂、助剂及/或稀释剂。在一些进一步的具体实施例中,本公开的组合物包含至少一酪氨酸(Y)残基、至少一色氨酸(W)残基及至少一苯丙氨酸(F)残基、其任何mTOR激动性模拟物、其盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物、及其任何剂量单位形式。在一些实施例中,本公开的mTOR激动剂以对选择性抑制蛋白酶体易位有效的量包含在所述组合物中。
本发明的另一方面涉及一种试剂盒,所述试剂盒包括以下至少两种:
首先(a),至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动剂酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、直接或间接调节酪氨酸残基的水平、稳定性及生物利用度中的至少一者的任何化合物、及其任何组合或混合物,可选地,以一第一剂型的形式。在一些实施例中,本发明的试剂盒可另外或替代地包括(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基及/或mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、任何直接或间接调节色氨酸残基的水平、稳定性及生物利用度中的至少一者的化合物、或其任何组合或混合物,可选地,以一第二剂型形式。在一些进一步的实施例中,本发明的试剂盒可另外或替代地(c)包含至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、直接或间接调节苯丙氨酸残基的水平、稳定性及生物利用度中的至少一者的任何化合物、及其任意组合或混合物,可选地,以一第三剂型形式,本公开的试剂盒包含所有三个芳香族氨基酸残基(特别是至少一酪氨酸(Y)残基、至少一色氨酸(W)残基及至少一苯丙氨酸(F)残基)、其任何mTOR激动剂模拟物、盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,以及其任何剂型单位形式。
本发明的另一方面涉及用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟与受试者中的胞质溶胶蛋白酶体定位及/或活性相关的至少一病症或至少一病理性疾病的进展的方法。更具体而言,所述方法包括向受试者施用至少一mTOR激动剂的有效量的步骤,所述至少一mTOR激动剂包含至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动模拟物,或其任何盐或酯,或所述至少一芳香族胺基酸残基及/或所述mTOR激动芳香族氨基酸残余模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或直接或间接调节所述至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中的至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,或其任何组合物或混合物,或任何载体、基体、纳米或微颗粒,或其任何剂型,或包含至少一mTOR激动剂的任何组合物或试剂盒。
本发明的另一方面涉及有效量的至少一mTOR激动剂,其用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟与受试者的胞质溶胶蛋白酶体定位及/或活性相关的至少一病症或至少一病理性疾病的进展的方法。
在其另一方面,本公开涉及用于调节与至少一细胞及/或受试者中的蛋白酶体动力学直接或间接相关的生物过程的方法。根据一些实施例,所述方法包括接触所述至少一细胞及/或向受试者施用至少一mTOR激动剂的治疗有效量的步骤,或所述至少一芳香族氨基酸残基及/或mTOR激动性芳香族氨基酸氨基酸残基模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或其纳米或微粒,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,或其任何剂型,或包含至少一mTOR激动剂的任何组合物或试剂盒。
本发明的另一方面涉及一种预测及评估患有病理性疾病的受试者对包括至少一泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin proteasome system,UPS)-调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案的反应性的预后方法,并且可选地用于监测疾病进展。更具体而言,在一些实施例中,本文提供的方法可以包括以下步骤。在第一步骤(a)中,确定受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位。第二步(b)涉及将受试者分类为:(i)对于治疗方案的一反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位在至少一样品的至少一细胞中主要是在细胞核。或者,受试者可被分类为(ii)一抗药受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位是在胞质溶胶。
本发明的另一方面涉及用于确定患有病理性疾病的受试者的个人化治疗方案的方法。更具体而言,本发明的方法可以包括以下步骤:首先,在步骤(a)中,确定蛋白酶体在受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或在细胞的任何部分中的亚细胞定位。下一步骤(b)涉及将所述受试者分类为:(i)对于至少一包含至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案的一反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位主要在细胞核;或(ii)一抗药性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位是在胞质溶胶。在一些实施例中,在至少一样品的至少一细胞中显示核及胞质溶胶蛋白酶体定位的受试者被分类为抗药或无反应者,如果所述样品的至少一细胞中只有50%或更少的蛋白酶体显示细胞核定位。下一步(c)涉及选择合适的治疗方案。具体地,在一些实施例中,向被分类为反应者的受试者施用至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的一有效量、其任何组合或包含其的任何组合物。
在一些其他实施例中,被分类为抗药或无反应者的受试者将不会用至少一蛋白酶体抑制剂治疗。在一些进一步的实施例中,对于这种无反应者的受试者,可以提供包括至少一蛋白酶体易位选择性抑制剂的治疗方案。在一些实施例中,蛋白酶体易位的这种选择性抑制剂可包含至少一mTOR激动剂,如本公开进一步讨论的。
本发明的另一方面涉及一种用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟有需要的受试者中至少一增殖性疾病及至少一蛋白质错误折迭疾病中的至少一者的进展的方法。更具体而言,本发明的治疗方法可包括以下步骤:首先在步骤(a)中,确定蛋白酶体在受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或在细胞的任何部分中的亚细胞定位。在下一步骤(b)中,将受试者分类为:(i)对于包含至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案的一反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核;或(ii)一抗药受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位是在胞质溶胶。下一步骤(c)涉及基于反应性选择治疗方案,从而治疗所述受试者。在一些实施例中,所述步骤还包括将适当的治疗方案应用于受试者。在一些特定的实施例中,适当的治疗方案可以包括至少一蛋白酶体易位的选择性抑制剂,例如本文公开的至少一mTOR激动剂。
在其又一方面,本公开提供了一种试剂盒,包括:
第一组分(a)包括至少一用于确定至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中蛋白酶体亚细胞定位的装置及/或试剂。在一些实施例中,本发明的试剂盒可可选地进一步包括以下至少一者:(b)提供蛋白酶体亚细胞定位标准值的预定校准曲线;(c)至少一对照样品;及(d)使用说明。在又一些进一步的实施例中,试剂盒可进一步包含至少一蛋白酶体易位的选择性抑制剂,例如本文所公开的至少一mTOR激动剂。
本发明的另一方面涉及一种预后方法,用于预测及评估患有增殖性疾病的受试者对蛋白酶体易位的选择性抑制剂的反应性,并且可选地用于监测疾病的进展。在一些实施例中,所述方法包括以下步骤:(a)确定受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位;及(b)如果蛋白酶体亚细胞定位在所述至少一样品的至少一细胞中是在胞质溶胶或均匀分布,则将所述受试者分类为对于蛋白酶体易位的选择性抑制剂的一反应性候选受试者。所述方法可以可选地进一步包括以下步骤:(c)确定在步骤(b)中被分类为候选反应性受试者的受试者样品的至少一细胞中的蛋白酶体亚细胞定位,并且如果在与蛋白酶体选择性抑制剂接触的至少一细胞中蛋白酶体亚细细胞定位主要是在细胞核的易位则确认受试者的反应性。
另一方面涉及一种通过选择性抑制蛋白酶体易位到所述细胞胞质溶胶来选择性诱导癌症细胞凋亡的方法。所述方法包括使细胞与有效量的至少一蛋白酶体易位的选择性调节剂或包含所述选择性抑制剂的任何组合物接触。
本发明的另一个方面涉及一种通过选择性抑制蛋白酶体易位到所述受试者的癌症细胞胞质溶胶来治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延缓受试者癌症的进展的方法。所述方法包括向所述受试者施用至少一蛋白酶体易位选择性抑制剂的治疗有效量或含有所述选择性抑制剂的任何组合物的步骤。
本公开的另一方面涉及用于鉴定蛋白酶体易位的至少一选择性调节剂的筛选方法。在更具体的实施例中,所述方法包括以下步骤:
首先(a),确定在细胞压力状态下与候选化合物接触的至少一细胞中蛋白酶体亚细胞定位。在一些实施例中,这种压力状态可以是任何短期压力状态,例如饥饿或缺氧。
第二步骤(b)涉及确定在细胞压力状态下与候选化合物接触的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中至少一输出或输入对照蛋白的亚细胞定位。下一步骤(c)涉及确定候选化合物是:(i)蛋白酶体易位的一选择性抑制剂,如果如步骤(a)中所确定的蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核,并且步骤(b)的至少一输出对照蛋白的亚细胞定位在与所述候选化合物接触的至少一细胞中主要是在胞质溶胶或均匀分布;或(ii)蛋白酶体易位的一选择性增强剂,如果步骤(a)的蛋白酶体亚细胞定位主要是在胞质溶胶,并且步骤(b)的所述至少一输入对照蛋白的亚细胞定位在与所述候选化合物接触的至少一细胞中主要是在细胞核。
通过以下附图,本发明的这些及其他方面将变得明显。
附图说明
为了更好地理解本文公开的主题并举例说明如何在实践中进行,现在将参照附图仅通过非限制性示例来描述实施例,其中:
图1A-1J:26S蛋白酶体从细胞核到胞质溶胶的压力诱导的易位是活性及特异性的
图1A:在完全培养基(对照(control,Cont.))、不存在饥饿培养基(饥饿(starvation,St.)或存在细霉素B(St.+LMB)的情况下培育后,对所示蛋白酶体亚基进行免疫荧光。
图1B:来自如图1A中处理的细胞的细胞核部分的蛋白质印迹(Western blot)。
图1C:与图1A类似,但在用LMB(Cont.+LMB)或伊维菌素(Ivermectin)(Cont.+Iver.)处理后。
图1D:用完全培养基(对照(control,Cont.))或5%蔗糖溶液(St.)喂养果蝇后果蝇肠道的免疫荧光。
图1E:饥饿并在指定的时间内补充(Repl.)完整培养基后,从细胞中提取细胞核部分的蛋白质印迹。
图1F:在CHX存在下饥饿及补充完全培养基后的细胞的免疫荧光。
图1G:饥饿及补充指定时间后β4-Dendra2的实时成像。在t0处荧光从绿色转换为红色。
图1H:将细胞在21%(Cont.)或1%O 2(缺氧)下培育24小时。
图1I:将细胞在37℃(Cont.)或43℃(热休克)下培育8小时。
图1J:用2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG)、离子霉素(ionomycin,Iono.)或苯乙双胍(phenformin,Phen.)处理细胞:
图2A-2E:26S蛋白酶体从细胞核到胞质溶胶的压力诱导的易位是活性及特异性的
图2A:将U2OS细胞在完全培养基(Cont.)或缺乏氨基酸的培养基(St.)中培育8小时。观察α6蛋白酶体亚基(i)。从相应的细胞中分离细胞核部分(Nuclear fractions,Nuclear fr.),并通过SDS-PAGE分离蛋白质并用指定的抗体(ii)印迹。
图2B:将MDA-MB-231、HAP1及MCF10A细胞在完全培养基(Cont.)或缺乏氨基酸的培养基(St.)中培育8小时,并对α6蛋白酶体亚基成像。
图2C:将HeLa细胞在缺乏氨基酸(St.)的培养基中培育8小时,然后再用完全培养基替换4小时。对Rpn2及β4蛋白酶体亚基进行成像。值得注意的是,相同的细胞在整个实验中成像。
图2D:将过表达与光可转换荧光蛋白Dendra2融合的β4蛋白酶体亚基的HeLa细胞接种在盖玻片上,并将荧光从绿色转换为红色,从而能够进一步监测仅在转化前合成的蛋白质(参见图1G)。
图2E:将HeLa细胞在完全培养基(Cont.)或缺乏氨基酸的培养基(St.)中培育8小时。通过共聚焦显微镜观察β4蛋白酶体亚基,方法是堆迭来自多个Z平面的图像(i)。分析Z-堆迭以定量两个区室之间的基础及压力诱导的蛋白酶体分布(ii)。
图3A-3I:压力诱导的蛋白酶体易位通过新的非经典mTOR信号介导图3A:Torin1处理后细胞的免疫荧光。
图3B:指定处理后细胞核部分的蛋白质印迹。
图3C:沉默mTOR后细胞的免疫荧光。
图3D:与A相似,但在饥饿或添加所指示的氨基酸之后。
图3E:在指定的处理后测量自噬通量。
图3F:在指定的处理后,对细胞进行磷酸化及非磷酸化p70-S6K的蛋白质印迹。
图3G:在指定的处理后,对20及19S亚基的细胞进行蛋白质印迹。
图3H:在指定条件下沉默ATF4后细胞的免疫荧光。
图3I:ATF4诱导表达后细胞的免疫荧光。
图4A-4I:压力诱导的蛋白酶体易位通过新的非经典mTOR信号介导
图4A:用对照shRNA(shCont.)或靶向不带电荷的tRNA传感器GCN2(shGCN2#1-3)的shRNA感染HeLa细胞。在完全培养基(Cont.)或缺乏氨基酸的培养基(St.)中培育8小时后,从细胞中分离细胞核部分(Nuclear fr.)。通过SDS-PAGE分离蛋白质并用针对α6蛋白酶体亚基(α6proteasome subunit)、核纤层蛋白A/C(Lamin A/C)及微管蛋白(Tubulin)的抗体进行印迹。
图4B:将A中的细胞在完全培养基(8h;Cont.)或缺乏氨基酸的培养基中培养4小时(4h St.)及8小时(8h St.)。显示出蛋白酶体的β4亚基。
图4C:在指定条件下培育8小时后裂解A中的细胞。通过SDS-PAGE分离裂解物,并用针对所指示的蛋白酶体亚基的抗体以及自噬蛋白受体LC3(LC3-I可溶性LC3;LC3-II-自噬体结合脂化形式,或LC3-PE)印迹。
图4D:用靶向蛋白激酶PIK3CA(shPIK3CA#1-3)或对照shRNA(shCont.)的shRNA感染HeLa细胞。在完全培养基(Cont.)或缺乏氨基酸的培养基(St.)中培育8小时后,观察α6蛋白酶体亚基。
图4E:用靶向蛋白激酶AKT1(shAKT1#1-2)或对照shRNA(shCont.)的shRNA感染HeLa细胞。在完全培养基(Cont.)或缺乏氨基酸的培养基(St.)中培育8小时后,监测α6蛋白酶体亚基。
图4F:将HeLa细胞在缺乏氨基酸的培养基中培育8小时,并监测添加的单个氨基酸对蛋白酶体易位的影响。单个字(letters)表示氨基酸的单字代码。
图4G:在指定条件下培育HeLa细胞,并观察蛋白酶体的β4亚基以及作为CRM1底物的NF-κB的p65亚基。
图4H:在指定条件下培育HeLa细胞,并观察蛋白酶体的β4亚基以及CRM1底物APC(腺瘤性息肉病(adenomatous polyposis coli))。
图4I:将融合有细胞核输出信号(nuclear export signal,NES)的GFP感染的HeLa细胞在指定条件下培育8小时。对于GFP进行观察。
图5A-5L:通过刺激的蛋白水解介导的氨基酸补充需要蛋白酶体易位,并且对于细胞存活是必需的
图5A:用LMB培育的对照、饥饿及饥饿细胞中放射性标记蛋白降解的测量。
图5B:测量饥饿及对照细胞中细胞核及胞质溶胶部分中荧光蛋白酶体底物Suc-LLVY-AMC的降解。
图5C:细胞溶质蛋白酶体底物HMGCS1的细胞蛋白质印迹(如所示处理)。
图5D:在指定条件下处理并过表达胞质溶胶蛋白NES-GFP-CL1的细胞提取物的蛋白质印迹。
图5E:如所指示处理的细胞提取物的泛素加合物(ubiquitin adducts)的蛋白质印迹。呈现出相对于控制的强度。
图5F:在不同条件下细胞中蛋白酶体活性探针Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS的实时成像。
图5G:通过蛋白质组学分析确定在指定条件下单个细胞蛋白质水平的变化。
图5H:通过代谢组学分析确定在指定条件下培育的细胞中单个氨基酸水平的变化。
图5I:在指定条件下细胞存活的时间过程。
图5J:在指定条件下培育后,相对于对照的细胞存活率。
图5K:沉默NPC组分NUP93后,在指定条件下培育的细胞的免疫荧光。
图5L:如所示处理K中的细胞,并测量存活率。
图6A-6H:通过刺激的蛋白水解介导的氨基酸补充需要蛋白酶体易位,并且对于细胞存活是必需的
图6A:在CHX、MG132或氯喹(Chloroquine,Chq)存在下,将感染了编码NES-GFP-CL1的cDNA的HeLa细胞培育指定的时间。裂解细胞,通过SDS-PAGE分离,并用针对GFP的抗体印迹。
图6B:使用LMB抑制蛋白酶体输出影响最大的蛋白质(最高10%;图5G)根据其细胞分布进行分类:胞质溶胶、核蛋白及已知在两个区室之间共享的蛋白。
图6C:使用YWF抑制蛋白酶体输出影响最大的蛋白质(最高10%;图5G)根据其细胞分布进行分类。
图6D:使用基因本体论及KEGG途径对受蛋白酶体输出抑制影响最大的蛋白质(最高10%)进行分类。
图6E:使用基因本体论及KEGG途径对受蛋白酶体输出抑制影响最小的蛋白质(最低10%)进行分类。
图6F:在指定的处理下监测核糖体蛋白的稳定性。
图6G:在指定的处理后,RT4细胞相对于对照的存活率。
图6H:用靶向NPC组分NUP93的shRNA或对照shRNA感染MDA-MB-231细胞。用GFP-NLS进一步感染细胞,并使用共聚焦活显微镜观察GFP定位。
图7A-7C:压力诱导的蛋白酶体易位在不同器官及生物体中是保守的
图7A:在指定条件下离体灌注的大鼠心脏中蛋白酶体活性探针Me4BodipyF1-Ahx3Leu3VS的实时成像。
图7B:如图7A所示,但是在指定条件(上图及下图,分别为高倍及低倍)下培育的新生大鼠神经组织中。
图7C:在指定处理下培育后分化的C2小鼠肌原细胞的免疫荧光。
图8A-8B:蛋白酶体动力学及自噬是联合调节的
图8A:用Tet-On(Tet-On,TO)诱导系统感染HeLa细胞以表达空载体(emptyvector,V0)或TFEB S142211A。在不存在或存在多西环素(Doxycycline,Dox)的情况下培育24小时后裂解细胞。然后通过SDS-PAGE分离裂解物并用针对TFEB及自噬蛋白受体LC3(LC3-I-可溶性LC3;LC3-II-自噬体结合脂化形式,或LC3-PE)的抗体印迹。
图8B:将HeLa细胞在缺乏氨基酸的培养基中培育8小时,然后再添加蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Bortezomib,BTZ.)或环氧霉素(Epoxomycin,Epox.)2小时及4小时。对于蛋白酶体的β4亚基进行观察。
图9A-9G:蛋白酶体动力学及自噬是联合调节的
图9A:TFEB-S142211A诱导表达后细胞的免疫荧光(i)及细胞核部分的蛋白质印迹(ii)。
图9B:细胞的免疫荧光如下:(i)ZKSCAN3的诱导表达;(ii)在指定条件下培育。
图9C:饥饿后WT或ATG5-/-MEF细胞的免疫荧光。
图9D:用蛋白酶体抑制剂MG132(MG)处理后细胞核部分的蛋白质印迹。
图9E:在指定的处理后,细胞的免疫荧光(i)及细胞核部分(ii)的蛋白质印迹。DMSO-二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)(用作对照);BTZ-硼替佐米(Bortezomib);Lacta.-乳胞素(Lactacystin);Epox.-环氧霉素(Epoxomicin)。
图9F:在指定条件下培育的细胞的免疫荧光。
图9G:在指定的治疗后对β4-GFP蛋白酶体亚基进行实时成像。饥饿后将虚线矩形-MG132添加到细胞中,并在指定的时间进行实时成像。
图10A-10E:蛋白酶体的异常胞质溶胶优势赋予了多发性骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的抗性
图10A:在指定的处理后,在两个硼替佐米(Bortezomib)敏感的(NCI-H929及MM.1S)及两个硼替佐米抗药的(U266及RPMI-8226)MM细胞中蛋白酶体α6亚基的免疫荧光。在合并的小图中,注意在对照(control,Cont.)、饥饿(starvation,St.)及BTZ下的抗性细胞内可见的细胞核的蓝染色。相反地,敏感细胞的细胞核被蛋白酶体的红色染色所掩盖,蛋白酶体主要共定位于细胞核。在YWF处理后,蛋白酶体定位于所有细胞类型的细胞核。
图10B:在指定条件下培育的与图10A中相同细胞的细胞存活。
图10C:来自MM患者的骨髓活组织检查的免疫组织化学,针对α6蛋白酶体亚基及膜蛋白CD38(MM细胞的标记物)进行染色。
图10D:根据诊断时的蛋白酶体分布绘制MM患者对治疗的反应。
图10E:最初对蛋白酶体抑制剂治疗敏感的复发MM患者的示意图。呈现的是,从第一次诊断活组织检查及复发时采取的活组织检查对治疗及蛋白酶体细胞分布的反应。还显示出,上述活组织检查之间的间隔,以及每个患者组的平均间隔时间。
图11:蛋白酶体对胞质溶胶的异常胞质优势赋予了多发性骨髓瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的抗性
用蛋白酶体抑制剂作为第一线治疗的MM患者的示意图。提出的是在开始治疗之前进行的活组织检查中对药物及蛋白酶体细胞分布的反应。对于复发患者,复发时会提供相同的数据。
图12A-12D:蛋白酶体募集是体内压力肿瘤细胞的特征,其使用YWF的抑制具有细胞毒性
图12A及12B:指定治疗后异种移植肿瘤切片中蛋白酶体的免疫组织化学。外围及核心涉及肿瘤中的相应区域。
图12C:使用TUNEL染色检测细胞凋亡。
图12D:通过染色切割的半胱天冬酶3(Caspase3)检测细胞凋亡。
图13A-13C:蛋白酶体募集是体内压力肿瘤细胞的特征,其使用YWF的抑制具有细胞毒性
图13A及13B:指定治疗后异种移植肿瘤切片中蛋白酶体的免疫组织化学。外围及核心涉及肿瘤中的相应区域。
图13C:YWF处理后肿瘤核心切片的免疫组织化学,显示与核蛋白酶体染色区域重迭的坏死变化。
图14A-14G:肿瘤生长需要蛋白酶体募集
图14A:在指定的注射治疗后,源自MDA-MB-231细胞的肿瘤在方格纸上拍照以进行缩放。
图14B:在小鼠处死时绘制肿瘤重量(如图14A所示)。
图14C:在指定的注射治疗之后,源自RT4细胞的肿瘤在方格纸上按比例拍照。
图14D:在小鼠处死时绘制肿瘤重量(如图14C所示)。
图14E:在饮用水中施用指定的氨基酸后,源自RT4细胞的肿瘤(在方格纸上按比例拍照)。
图14F:在小鼠处死时绘制肿瘤重量(如图14E所示)。
图14G:在YWF(单个(single)、对(pairs)及三体(trio))及所有20个氨基酸的所有组合的饮用水中口服施用后肿瘤重量(相对于对照)的平均减少。
图15A-15F:肿瘤生长需要蛋白酶体募集
图15A:在指定的治疗之后,源自RT4细胞的肿瘤在方格纸上按比例拍照。最左列及最右列也在图14C下呈现。
图15B:绘制小鼠处死时的肿瘤重量。对照18d.(Cont.18d.)'及'YWF 18d'组也在图14D下呈现。
图15C:相对于对照,在不同时间组中肿瘤重量的平均减少。
图15D:绘制小鼠处死时的肿瘤重量。最左边的两组也在图14E下呈现。
图15E:相对于每种指定的治疗,用YWF治疗后肿瘤重量的平均减少。
图15F:通过饮用水在QLR或YWF管理下监测肿瘤体积及其发展。在最后一个时间点,平均体积的相对减少约为80%,p=3.139E-05。
图16:D-YWF及两种异构体L-YWF及D-YWF的混合物可防止压力诱导的蛋白酶体易位
在压力状态下培育不同时间点(上图)及YWF的L-异构体(L-YWF,1.6mM/每个)或YWF的D-异构体(D-YWF,1.6mM/每个,或3.2mM/每个)。下图显示了在压力状态下两种异构体(0.8mM/每个)的一混合物的用途。
图17A-17C:YWF治疗小鼠自发性内源性肿瘤显着地降低肿瘤负荷
图17A:未诱导的对照小鼠(未诱导的)的盲肠重量、由安慰剂(对照)处理的诱导小鼠(施用他莫昔芬(tamoxifen))的盲肠重量、或由YWF治疗的诱导小鼠的盲肠重量的绘图。
图17B:在安慰剂(对照)治疗的诱导小鼠或YWF治疗的诱导小鼠中,沿着肠道形成的不同肿瘤(腺瘤)的数量的绘图。
图17C:在安慰剂(对照)治疗的诱导小鼠或YWF治疗的诱导小鼠中,在单个动物中肠肿瘤肠腺瘤体积的绘图。
图18A-18B:YWF缩小了对于肿瘤的影响
此图显示出指定处理后肠组织切片的组织化学PROX1染色。
图18A:显示用YWF治疗的小鼠的肠组织。在左侧(i)中,几乎所有组织都是正常的。在右侧(ii)中,组织大部分正常,其中具有一小部分肿瘤细胞。
图18B:显示用安慰剂(对照)处理的小鼠的肠组织。在两个图(i,ii)上,肿瘤太大而不适合x4物镜的视野,其中具有小面积的正常肠组织。
图19:YWF治疗的小鼠中核蛋白酶体定位,与抑制肿瘤生长相关
图式显示出在指定的治疗(安慰剂(对照)或YWF)后蛋白酶体亚基α5的肠组织切片的免疫组织化学染色。在对照组(ii)中,由于细胞核中少量蛋白酶体,可见蓝色细胞核染色。在YWF治疗(i)后,蛋白酶体主要被隔离在细胞核内,使得蓝色通用染色(如对照组中那样进行)为不可见的。
图20:与45MmF或45MmW的非选择性作用相比,YWF选择性地影响压力癌细胞的活力
图式显示出用指定的治疗所治疗的压力(饥饿)或非压力癌细胞的细胞活力(%存活)。对照(control,Cont.)表示完全培养基,饥饿(starvation,St.)表示氨基酸剥夺培养基,Y(酪氨酸)、W(色氨酸)及F(苯丙氨酸)以指定浓度添加(Y、W、F各1.6mM))或以45Mm的F或W添加。
图21:与没有各种高浓度F的作用相比,YWF组合显着地抑制肿瘤生长
使用小鼠中的肿瘤模型在体内检查所示治疗的抗肿瘤发生作用。在肿瘤形成后,用指定的治疗(每组6mM的YWF及各种浓度的F)来治疗每组,并相对于对照组(QLR)比较肿瘤的大小。图式显示出小鼠处死时肿瘤重量的绘图。
具体实施方式
在此,鉴定了一种新的蛋白酶体调节层(a novel layer of proteasomalregulation),其中其区室化对于细胞应对压力的能力是必需的。在氨基酸饥饿4-8小时后,蛋白酶体从细胞核募集到胞质溶胶,这是通过新鉴定的雷帕霉素的哺乳动物标靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号传导途径介导的过程。这种募集对于细胞在压力下的存活至关重要,因为它为细胞提供了由胞质蛋白的刺激降解产生的氨基酸。
本发明人揭示了雷帕霉素的哺乳动物标靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)在调节细胞中蛋白酶体动力学中的作用。重要的是,本公开内容证明了蛋白酶体细胞定位所反应的蛋白酶体动力学的作用,例如,在短期压力情况(stress conditions)下,以及在需要蛋白酶体细胞溶质定位及/或细胞溶质中蛋白酶体活性增加的病理条件下。此外,本公开提供了mTOR调节剂,特别是调节细胞中蛋白酶体动力学的激动剂,从而提供了调节及影响与蛋白酶体动力学相关的条件及过程的有效工具。
因此,本发明的第一方面涉及mTOR激动剂,其包含至少两个芳香族氨基酸残基或至少两个芳香族氨基酸残基或其任何模拟物的组合、任何直接或间接调节至少一水平的化合物、至少一芳香族氨基酸残基的稳定性及生物利用度、其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒。在一些具体实施例中,本发明的mTOR激动剂可包含以下至少两种:
首先(a),至少一酪氨酸(Y)残基,任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、以及任何组合或其混合物。mTOR激动剂可以在一些实施例(b)中包含至少一色氨酸(W)残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式及/或mTOR激动性色氨酸模拟物或其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,本公开的mTOR激动剂可以包含(c):至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、任何多聚体及/或聚合物形式的苯丙氨酸残基及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物及其任何组合或混合物。
本发明人揭示了mTOR在调节蛋白酶体动力学中的作用(特别是在压力状况下),并进一步提供了有效的mTOR激动剂。雷帕霉素的哺乳动物标靶(mammalian target ofrapamycin,mTOR)(有时也称为雷帕霉素及FK506结合蛋白12雷帕霉素相关蛋白1(FK506-binding protein 12-rapamycin-associated protein 1,FRAP1)的机制靶标)是人类由mTOR基因编码的激酶(kinase)。mTOR是蛋白激酶的磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶家族(phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase family)的成员。mTOR与其他蛋白质连接,并作为调节不同细胞过程的两种不同蛋白质复合物(mTOR复合物1及mTOR复合物2)的核心组分。特别地,作为两种复合物的核心组分,mTOR作为丝氨酸(serine)/苏氨酸(threonine)蛋白激酶,用以调节细胞生长、细胞增殖、细胞运动性、细胞存活、蛋白质合成、自噬及转录。作为mTORC2的核心组分,mTOR还作为酪氨酸蛋白激酶,促进胰岛素受体及胰岛素样生长因子1受体的激活。mTOR还涉及肌动蛋白细胞骨架的控制及维持。
mTOR是两种结构不同的复合物的催化亚基:mTORC1及mTORC2。两种复合物均定位于不同的亚细胞区室,从而影响其活化及功能。在被Rheb激活后,mTORC1定位于溶酶体表面上的调节剂-Rag复合物(Regulator-Rag complex),mTORC1然后在调节剂-Rag复合物(Regulator-Rag complex)中并在足够的氨基酸存在下变得有活性。mTOR复合物1(mTORComplex 1,mTORC1)由mTOR、mTOR的调节相关蛋白(regulatory-associated protein ofmTOR,Raptor)、具有SEC13蛋白8的哺乳动物致死(mammalian lethal with SEC13 protein8,mLST8)以及非核心组分PRAS40及DEPTOR组成。所述复合物作为营养/能量/氧化还原传感器并控制蛋白质合成。mTORC1的活性受雷帕霉素、胰岛素、生长因子、磷脂酸、某些氨基酸及其衍生物(例如l-亮氨酸及β-羟基β-甲基丁酸(l-leucine andβ-hydroxyβ-methylbutyricacid))、机械刺激及氧化压力(oxidative stress)的调节。
mTOR复合物2(mTOR Complex 2,mTORC2)由MTOR、MTOR的雷帕霉素不敏感伙伴(rapamycin-insensitive companion of MTOR,RICTOR)、MLST8及哺乳动物压力激活蛋白激酶相互作用蛋白1(mammalian stress-activated protein kinase interactingprotein 1,mSIN1)组成。已显示,mTORC2通过刺激F-肌动蛋白压力纤维、paxillin、RhoA、Rac1、Cdc42及蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)来作为肌动蛋白细胞骨架的重要调节剂。mTORC2还使丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt/PKB磷酸化,从而影响代谢及存活。此外,mTORC2表现出酪氨酸蛋白激酶活性,并使胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growthfactor 1receptor,IGF-IR)及胰岛素受体(insulin receptor,InsR)磷酸化。
如上所述,本公开提供了mTOR激动剂。如本文所用,术语“激动剂(agonist)”涉及活化、刺激、增加、促进、增强活化、敏化或上调某种蛋白质(例如mTOR蛋白质)的活性以产生一生物反应的化合物、药剂或药物。根据一些实施例,其中所示的“增加(increasing)”或“增强(enhancing)”mTOR活性,如本文与本发明的mTOR激动剂结合使用,意味着这种增加或增强可以是约5%至100%(具体地为10%至100%)的mTOR活性的增加或增强。本文使用的术语“增加(increase)”,“增强(augmentation)”及“增强(enhancement)”涉及在尺寸、量、数量或强度上逐渐变大的作用。特别地,例如在不存在本发明调节剂的情况下激活mTOR,与合适的对照相比,增加了10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、200%、300%、400%、500%、600%、70%、800%、900%、1000%或更多的活性。
本公开的mTOR激动剂影响及调节蛋白酶体动力学,例如细胞蛋白酶体定位所反应的。如本文所用,蛋白酶体(proteasomes)是蛋白质复合物,其通过蛋白水解来降解不需要的或受损的蛋白质,其中蛋白水解是由蛋白酶介导的破坏肽键的化学反应。蛋白酶体是细胞调节特定蛋白质浓度及降解错误折迭蛋白质的主要机制的一部分。蛋白质被称为泛素(ubiquitin)的小蛋白质标记为降解。所述标记反应由称为泛素连接酶的酶催化。降解过程产生约7至8个氨基酸长的肽,然后可以将其进一步降解成较短的氨基酸序列并用于合成新蛋白质。在所有真核生物及古细菌以及一些细菌中都发现了蛋白酶体。在结构上,蛋白酶体是一个圆柱形复合物,所述圆柱形复合物包含四个堆迭环的“核心”,形成一个中心孔。每个环由七个单独的蛋白质组成。内部两个环由七个β亚基组成,其含有三至七个蛋白酶活性位点。这些位点位于环的内表面,因此靶蛋白必须在降解前进入中心孔。两个外环的每一者包含七个α亚基,其功能是维持一个“门”,蛋白质通过所述门进入桶(barrel)中。这些α亚基通过与“帽”结构或调节颗粒结合来控制,所述“帽”结构或调节颗粒识别附着于蛋白质底物的多聚泛素标签并启动降解过程。泛素化及蛋白酶体降解的整个系统称为泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin–proteasome system,UPS)。
蛋白酶体亚组分通常由其Svedberg沉降系数(表示为S)表示。最专门用于哺乳动物的蛋白酶体是胞质26S蛋白酶体,其为含有一个20S蛋白亚基(也称为核心蛋白酶体或CP)及两个19S调节帽亚基(也称为在此称为调节蛋白酶体或RP)的约2000千道尔顿(kDa)。核心是中空的并且提供封闭的空腔,蛋白质在其中被降解。核心两端的开口允许靶蛋白进入。核心颗粒的每个末端与19S调节亚基缔合,所述亚基包含多个ATPase活性位点(ATPaseactive sites)及泛素结合位点。所述结构识别多泛素化蛋白质并将其转移至催化核心。称为11S颗粒的另一种形式的调节亚基可以在外来肽的降解中起作用,并且可以与19S颗粒基本相同的方式与核心结合。蛋白酶体降解途径对于许多细胞过程(包括细胞周期、基因表达的调节及对氧化压力的反应)是必不可或缺的。
在一些实施例中,本发明的mTOR激动剂调节了蛋白酶体动力学,并因此调节了蛋白酶体在细胞核及胞质溶胶之间的易位(translocation)及穿梭(shuttling)。本文所用的蛋白酶体动力学是指蛋白酶体在胞质溶胶及细胞核之间的运输及穿梭。在一些实施例中,这种易位涉及解离成蛋白水解核心及调节复合物,并重新组装以形成组装的蛋白酶体。在一些实施例中,本公开的mTOR激动剂在选择性调节蛋白酶体的易位及穿梭中起作用,从而导致核或主要核酸酶定位(nuclear or predominant nuclease localization)。在一些实施例中,本公开的mTOR激动剂可以充当蛋白酶体从细胞核易位至胞质溶胶的选择性抑制剂。在一些替代或额外的实施例中,本公开的mTOR激动剂起到增强蛋白酶体募集到细胞核中的作用。
此外,本公开的mTOR激动剂起到保留、维持或甚至增强蛋白酶体的核或主要核定位的作用。如本文所用,选择性调节剂是指本公开的mTOR激动剂特异性地、主要、特别地及/或主要作用于蛋白酶体在细胞核及胞质溶胶之间的易位及/或穿梭,而不影响(或几乎不影响)易位、其他细胞元素的输出或输入(例如,输出蛋白(exportin)或输入蛋白(importin)的其他底物,如图4所示)。在一些实施例中,如本文所示的选择性及特异性调节剂意味着本公开的mTOR激动剂选择性地且特异性地作用于蛋白酶体超过10%到100%、或者可选地至少约2倍到至少约100倍或更多倍的对于其他细胞成分(例如蛋白质,核酸等)的细胞核-胞质溶胶之间易位的任何调节或影响。
如本公开所示,芳香族氨基酸残基的三联体充当mTOR激动剂,其在短期压力状态下调节蛋白酶体动力学,因此可用作营养传感器。芳香族氨基酸(aromatic amino acid,AAA)是包含疏水性侧链,特别是芳香环的氨基酸。更具体而言,具有共振键环的环状(环形)、平面(平坦)结构与具有相同原子组的其他几何或连接排列相比而具有增加的稳定性。芳香族官能团或其他取代基称为芳基。芳香族氨基酸吸收250nm以上波长的紫外光并产生荧光。在20种标准氨基酸中,以下是芳香族的:苯丙氨酸(phenylalanine)、色氨酸(tryptophan)及酪氨酸(tyrosine)。
本文所用的“芳香族氨基酸”包括天然氨基酸及非天然氨基酸。非天然芳香族氨基酸包含在其氨基酸侧链中包含吲哚部分的那些,其中吲哚环结构可以被一个或多个芳基取代基取代。芳香族氨基酸的其他实例包括但不限于1-萘丙氨酸(1-naphthylalanine)、联苯丙氨酸(biphenylalanine)、2-萘丙氨酸(2-napthylalananine)、五氟苯丙氨酸(pentafluorophenylalanine)、及4-吡啶丙氨酸(4-pyridylalanine)。更具体而言,如本文所用,术语“芳香族”是指单-、双-或其它多碳环、芳香族环系统。芳香族基团可以可选地与选自芳香族化合物、环烷基及杂环基的一个或多个环稠合。芳香族化合物可以具有5-14个环成员,例如5-10个环成员。一个或多个氢原子也可以选自酰基、酰氨基、酰氧基、烯基、烷氧基、烷基、炔基、氨基、芳香族、芳氧基(aryloxy)、迭氮基(azido)、氨基甲酰基(carbamoyl)、碳烷氧基、羧基、羧酰胺基、羧氨基、氰基、环烷基、二取代氨基、甲酰基、胍基、卤素、杂芳基、杂环基、羟基、亚氨基氨基、单取代氨基、硝基、氧代、膦酰氨基、亚磺酰基、磺氨基、磺酰基、硫代、硫代酰氨基、硫代脲基(thioureido)及脲基(ureido)。芳香族基团的非限制性实例包括苯基、萘基、吲哚基、联苯基、及蒽基。
如上所述,在一些特定实施例中,本公开提供的作为有效mTOR激动剂的芳香族氨基酸可以是酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸中的至少一者、或其任何组合。
因此,在一些具体实施例中,可以作为蛋白酶体易位的选择性抑制剂或作为本公开中的mTOR激动剂提供的芳香族氨基酸残基是酪氨酸(Tyrosine)。酪氨酸(Tyrosine)(符号Tyr或Y)或4-羟基苯丙氨酸(hydroxyphenylalanine)是具有一极性侧基的一非必需氨基酸,具有式C9H11NO3。L-酪氨酸具有以下化学结构,如式VII所示:
虽然酪氨酸通常被分类为疏水性氨基酸,但酪氨酸比苯丙氨酸更亲水。酪氨酸由信使RNA(messenger RNA,mRNA)中的密码子UAC及UAU编码。
哺乳动物从必需氨基酸苯丙氨酸合成酪氨酸。苯丙氨酸羟化酶催化phe向tyr的转化。在大脑中的多巴胺能细胞中,酪氨酸被酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)转化为左旋多巴(L-DOPA)。TH是参与神经递质多巴胺合成的限速酶(rate-limiting enzyme)。然后多巴胺可以转化为其他儿茶酚胺(catecholamines),如去甲肾上腺素(norepinephrine)(去甲肾上腺素(noradrenaline))及肾上腺素(epinephrine)(肾上腺素(adrenaline))。
甲状腺胶体中的甲状腺激素三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine,T3)及甲状腺素(thyroxine,T4)也来源于酪氨酸。
在一些其他具体实施例中,可以作为本公开中的mTOR激动剂提供的芳香族氨基酸残基是色氨酸(Tryptophan)。
色氨酸(Tryptophan)(符号Trp或W)是用于蛋白质生物合成的α-氨基酸,具有式C11H12N2O2。
L-色氨酸具有以下化学结构,如式VIII所示:
色氨酸含有α-氨基、α-羧酸基团及侧链吲哚,使其成为非极性芳香族氨基酸。色氨酸由密码子UGG编码。像其他氨基酸一样,色氨酸在生理pH下是两性离子,其中氨基被质子化(-NH3 +;pKa=9.39),羧酸被去质子化(-COO-;pKa=2.38)。
色氨酸作为以下化合物的生物化学前体:由色氨酸羟化酶合成的5-羟色胺(Serotonin)(神经递质);通过N-乙酰转移酶(N-acetyltransferase)及5-羟基吲哚-O-甲基转移酶(5-hydroxyindole-O-methyltransferase enzymes)由血清素合成的褪黑激素(神经激素);通过犬尿氨酸(kynurenine)及喹啉酸(quinolinic acids)由色氨酸合成的烟酸(Niacin)(也称为维生素B3);由色氨酸合成的生长素(植物激素)。色氨酸也是神经递质5-羟色胺、激素褪黑激素及维生素B3的前体。
更进一步,在一些具体实施例中,在本公开方法中可以作为mTOR激动剂提供的芳香族氨基酸是苯丙氨酸(Phenylalanine)。
苯丙氨酸(Phenylalanine)(符号Phe或F)是一种必需的α-氨基酸、分子式为C9H11NO2。苯丙氨酸可以看作是芐基取代了丙氨酸的甲基,或者是苯基取代了丙氨酸的末端氢。
L-苯丙氨酸具有以下化学结构,如式IX所示:
由于苄基侧链的惰性及疏水性,所述必需氨基酸被分类为中性及非极性。L-异构体用于生物化学形成由DNA编码的蛋白质。苯丙氨酸是酪氨酸、单胺神经递质多巴胺(monoamine neurotransmitters dopamine)、去甲肾上腺素(去甲肾上腺素)、及肾上腺素(norepinephrine)(肾上腺素(noradrenaline))、以及皮肤色素黑色素的前体。苯丙氨酸由密码子UUU及UUC编码。
应所注意的是,苯丙氨酸及色氨酸是必需氨基酸。必需氨基酸(例如苯丙氨酸及色氨酸)并非在人及其他动物中从头合成的氨基酸残基,因此必须由外部来源提供。
本公开的mTOR激动剂包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸中的至少一者,其在本文中可互换地称为“酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸”、“Tyr,Trp及/或Phe”、“Y、W及/或F”或“YWF”。应所注意的是,每个氨基酸(甘氨酸除外)可以两种异构体形式存在,因为可能在中心碳原子周围形成两种不同的对映体(立体异构体)。按照惯例,这些被称为L-及D-形式,类似于左手及右手配置。本发明激动剂中使用的氨基酸残基可以是D-构型或L-构型(本文称为D-或L-对映体)。在一些进一步的实施例中,本公开的mTOR激动剂的芳香族氨基酸可以包含D-形式的至少一氨基酸残基。如图16所示,YWF三联体的L型以及YWF的D型有效地抑制了蛋白酶体向胞质溶胶的转运。此外,YWF的D-异构体及YWF的L-异构体的外消旋混合物有效地抑制了蛋白酶体向胞质溶胶的募集。
更具体而言,如式VII、VIII及IX所示,上述芳香族氨基酸(即酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸)具有包含2-氨基丙酸(丙氨酸)核心结构的全部一般结构,其中所述结构的β碳被任选取代的芳基取代。在一些实施例中,本发明的激动剂必须显示至少一苯环及丙氨酸等价结构。
在一些实施例中,任选取代的芳基是酚基,其中核心结构的β碳相对于酚基的羟基在对位与所述基团连接。这种结构的具体实施例可以包含酪氨酸。
在一些其他实施例中,芳基是苯环。这种结构的具体实施例可以包含苯丙氨酸。
在一些其他实施例中,芳基是吲哚基,其通过吲哚取代基的C3与核心结构的β碳连接。这种结构的具体实施例可以包含色氨酸。
更进一步,本公开考虑使用通过蛋白酶体核定位测量的能够单独或组合激动mTOR的任何至少一Y模拟物、至少一W模拟物、或至少一F模拟物。如本文所用,“氨基酸模拟物”是指具有不同于氨基酸的一般化学结构但以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的结构的化合物。
如本文所用,“酪氨酸模拟物”及“Y模拟物”、“色氨酸模拟物”及“W模拟物”、及“苯丙氨酸模拟物”及“F模拟物”可互换地用于指模拟酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸对细胞中mTOR活化的生物学作用,例如通过响应于本公开的激动剂、或响应于直接或间接增加一细胞中的酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸中的至少一者的水平、及/或生物利用度及/或稳定性的任何药剂的蛋白酶体核定位所测量。Y、W及/或F模拟物可以是任何种类的药剂。示例性的Y、W及/或F模拟物包括但不限于小的有机或无机分子;L-酪氨酸、L-色氨酸及/或L-苯丙氨酸、D-酪氨酸、D-色氨酸、及/或D-苯丙氨酸或其任何组合、mTOR激动性酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸模拟物、醣类、寡醣、多醣、生物大分子(所述生物大分子可以是肽、非标准肽、多肽、非标准多肽、蛋白质、非标准蛋白质、富含L-酪氨酸、L-色氨酸及/或L-苯丙氨酸、及/或mTOR激动性酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸模拟物的肽类似物及衍生物、肽模拟物、核酸(如siRNA、shRNA、反义RNA、核酶)及直接或间接改变Y、W、F中至少一水平的适体中的至少一者);选自细菌、植物、真菌、动物细胞及动物组织的生物材料制成的提取物;天然存在的或合成的组合物;及其任何组合。
本公开进一步考虑鉴定酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸模拟物的方法,例如通过评估候选药剂模拟酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸对选择性抑制细胞中蛋白酶体易位或mTOR活化的生物学作用的能力,导致蛋白酶体的核定位增加。在一些实施例中,鉴定酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸模拟物的方法包括评估候选试剂模拟酪氨酸的生物学效应的能力,例如,当酪氨酸与色氨酸及苯丙氨酸组合用于模拟选择性抑制蛋白酶体易位或mTOR活化,从而蛋白酶体在细胞中的核定位。
如本文所用,术语“mTOR激动性酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸模拟物”是指酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的模拟物,当单独施用于受试者(以单一化合物的形式或作为非标准肽、非标准多肽或非标准蛋白质的一部分,其中富含这种模拟物)或与本公开中使用的其他组分结合使用时,会导致mTOR活性及蛋白酶体细胞定位的增加(与施用模拟物之前的mTOR活性相比),从而导致所述受试者的一个或多个细胞及/或组织或细胞中蛋白酶体核定位的增加。应所注意的是,可以使用任何方法及手段来确定蛋白酶体的细胞定位。在一些实施例中,本公开的关于本发明的其他方面公开的任何方法也适用于本方面。在一些实施例中,确定受试者在施用前缺乏酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸。在一些实施例中,mTOR激动性酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸模拟物引起mTOR活性的增加,并由此引起蛋白酶体核定位,其为通过施用等摩尔量的L-酪氨酸引起的增加50%至500%的L-色氨酸及/或L-苯丙氨酸及/或D-酪氨酸、D-色氨酸及/或D-苯丙氨酸及其任何组合。在一些实施例中,mTOR激动性酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸模拟物引起mTOR活性增加并由此引起蛋白酶体核定位,即通过施用等摩尔量的L-酪氨酸引起的增加80%至120%的色氨酸及/或苯丙氨酸。在一些实施例中,mTOR激动性酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸模拟物引起蛋白酶体易位的选择性抑制及/或mTOR活性的增加,从而导致蛋白酶体核定位,其等于或大于由施用等摩尔量的L-酪氨酸、L-色氨酸及/或L-苯丙氨酸。
在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物不是天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸。在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物不是酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的天然存在的来源。在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物不是酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的膳食来源。
在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸。如本文所用,“天然氨基酸”是指天然存在于蛋白质中的氨基酸的L-形式;因此,术语“天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸”是指L-酪氨酸、L-色氨酸及/或L-苯丙氨酸。在一些实施例中,分离及/或纯化天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸。在一些实施例中,氨基酸残基可以是D-构型或L-构型(在本文中称为D-或L-对映体)。
在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸(Y、W及/或F)。在一些实施例中,分离及/或纯化天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸。
在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包含包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸或天然及非天然YWF的任何混合物的多肽。在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包括包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸衍生物的多肽。在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包括包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸类似物的多肽。在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包括包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸;天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的衍生物;及/或的多肽的天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的类似物的一组合的一多肽。
在一些实施例中,本发明的mTOR激动剂中提供的芳香族氨基酸的多聚体及/或聚合物形式还包括任何肽、非标准肽、多肽、非标准多肽、蛋白质或非标准蛋白质,其中任何一种富含一个、两个或全部三个芳香族氨基酸残基或其模拟物,特别是Y、W及/或F(酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸)中的至少一者及/或其mTOR激动剂模拟物。
如本文所述,在一些实施例中,本发明的芳香族氨基酸残基可以多肽或多肽的形式提供。“多肽”是指通过肽键连接的氨基酸聚合物。蛋白质是包含一种或多种多肽的分子。肽是相对短的多肽,通常长度在约2至100个氨基酸(amino acids,aa)之间,例如在4至60aa之间;8至40aa之间;术语“蛋白质”、“多肽”及“肽”可以互换使用。通常,多肽可以仅含有标准氨基酸、或可以包含各种实施例中的一种或多种非标准氨基酸(其可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸)及/或氨基酸类似物。“标准氨基酸”是哺乳动物通常用于蛋白质合成并由遗传密码编码的20种1-氨基酸中的任何一者。“非标准氨基酸”是哺乳动物在蛋白质合成中不常用的氨基酸。非标准氨基酸包括天然存在的氨基酸(20种标准氨基酸除外)及非天然存在的氨基酸。在一些实施例中,在哺乳动物中发现非标准的天然存在的氨基酸。例如,鸟氨酸(ornithine)、瓜氨酸(citrulline)及高半胱氨酸(homocysteine)是天然存在的非标准氨基酸,其在哺乳动物代谢中具有重要作用。示例性的非标准氨基酸包括例如单卤代或多卤代(例如三氟化)氨基酸、D-氨基酸、同型氨基酸、N-烷基氨基酸(脯氨酸除外)、脱氢氨基酸、芳香族氨基酸(组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸除外)及α,α二取代氨基酸(α,αdisubstituted amino acids)、氨基酸(例如多肽中的一种或多种氨基酸,可以例如通过添加例如共价键来修饰部分,例如烷基、链烷酰基、碳水化合物基团、磷酸酯基团、脂质、多醣、卤素、缀合连接基、保护基等)。修饰可以发生在多肽中的任何位置,例如肽主链、氨基酸侧链及氨基或羧基末端。给定的多肽可含有许多类型的修饰。多肽可以是支链的,或者它们可以是环状的、具有或不具有支链。多肽可以与一聚合物或聚合物基质、树枝状聚合物、纳米、微粒、脂质体等缀合、包封或嵌入其中。修饰可以在氨基酸以各种实施例掺入多肽之前或之后发生。多肽可以例如从天然来源纯化,所述天然来源由使用重组DNA技术(例如,通过重组宿主细胞或在转基因动物或植物中)在合适的表达系统中体外或体内产生,通过化学方法如常规固相肽合成合成、及/或涉及化学连接合成肽的方法。本领域普通技术人员将理解,蛋白质可以由单个氨基酸链或共价或非共价结合的多个链组成。
更具体而言,包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸(及/或天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的类似物及/或衍生物)的多肽可以具有任何长度,具体地为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、4、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、250、500、1000或更多残留物。在一些实施例中,包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽完全由酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基组成。在一些实施例中,包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽是富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基的多肽。在一些实施例中,富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基的多肽相对于其它氨基酸残基包含至少10%含量的酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基。在一些实施例中,富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基的多肽包含至少12%、至少15%、至少22%、至少25%、至少31%、至少35%、至少40%、至少44%、至少47%、至少50%、至少53%、至少58%、至少61%、至少66%、至少70%、至少75%或更多的酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基含量。在一些实施例中,富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基的多肽包含至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基含量。在一些进一步的实施例中,也根据本公开内容充当mTOR激动剂的蛋白酶体穿梭,易位的选择性调节剂可以包含两种或更多种多肽,每种多肽富集至少一Y、W、F,如上所述。
在本文公开的某些示例性实施例中,公开了包含YWF残基的合成寡肽、肽或多肽。这种合成的YWF寡肽、肽及多肽可以是任何长度(例如,2-20个残基、20-100个残基、100-1000个残基、500-2000个残基、1000-10000个残基或更长)。包含这样的YWF寡肽、肽或多肽的残基可以任何方式排序,例如YWF、YFW、WFY、WYF、FYW、FWY。包含这样的YWF寡肽、肽或多肽的残基也可以构造成以任何方式排序的重复,例如YYY重复、WWW重复、FFF重复、YWF重复,在某些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少20%、30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%或更多、甚至100%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少10%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少15%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少20%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少25%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少30%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少35%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少40%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少45%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少50%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少55%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少60%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少65%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少70%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少75%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少80%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少85%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少90%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有至少95%的YWF含量。在一些实施例中,合成的YWF寡肽、肽及多肽含有100%的YWF含量。
在一些实施例中,包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸残基。在一些实施例中,富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽包含富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸重复序列的蛋白质或其片段。本领域技术人员将认识到,存在用于获得包含及/或富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽的多种方法(包括例如从富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的重复序列或片段中分离酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽)、合成途径、及重组方法(例如,包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸密码子UAU、UAC(Tyr)、UGG(Trp)、UUU、UUC(Phe)的核酸的体外转录及/或转译)。通过将包含编码肽的核酸的载体引入合适的宿主细胞中来产生肽的重组方法是本领域众所周知的,例如Sambrook等人,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2d Ed,1至8卷,冷泉港(Cold SpringHarbor),纽约(1989);M.W.Pennington及B.M.Dunn,Methods in Molecular Biology:Peptide Synthesis Protocols,Vol 35,Hurnana Press,Totawa,NJ。肽也可以使用本领域众所周知的方法进行化学合成。
在一些实施例中,包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸或富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽并非酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的膳食来源。如本文所用,“酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的膳食来源”是指酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的来源,其中在摄入、咀嚼或消化之前,发现酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸处于其天然状态,作为来源内完整多肽(例如肉类(例如鸡肉、牛肉等)、豆类、谷物、蔬菜、乳制品(如牛奶、奶酪)、鸡蛋、坚果、种子、海鲜等)。
在一些实施例中,包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸或富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽不包括除酪氨酸之外的任何非必需氨基酸。在一些实施例中,包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸或富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽不包括色氨酸及苯丙氨酸以外的任何必需氨基酸。在一些实施例中,包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸或富含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的多肽包括至少一非天然形式的氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸。
在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的衍生物。可预期的是,可以使用激活mTOR并导致蛋白酶体核定位的Y、W及/或F的任何衍生物。激活mTOR活化及导致蛋白酶体核定位的Y、W及/或F的任何衍生物可以由本领域技术人员根据本文公开的教导轻易地确定(例如,测定单独或与氨基酸酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸或酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸的模拟物组合增加蛋白酶体核定位的Y、W及/或F衍生物)。
在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含对Y、W及/或F的C-末端修饰。如本文所用,“C-末端修饰”是指通过氨基酸的羧酸基团与待添加至氨基酸的部分或取代基之间的连接来将氨基酸添加至部分或取代基。本公开考虑对Y、W及/或F的任何C-末端修饰,其中Y、W及/或F保留刺激mTOR活化的能力,从而导致蛋白酶体核定位,当单独使用时,或与通过蛋白酶体核定位测量的任何芳香族氨基酸酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸。在一些实施例中,对Y、W及/或F的C-末端修饰包含Y、W及/或F的羧基烷基。在一些实施例中,对Y、W及/或F包含Y、W及/或F的羧基烷基酯。在一些实施例中,对Y、W及/或F的C-末端修饰包含羧基烷基酯。如本文所用,术语“烷基”是指可以是直链或支链的饱及非芳香族烃链,其含有指定数量的碳原子(这些包括但不限于甲基、乙基、丙基、烯丙基或炔丙基),其可以可选地插入N、O、S、SS、S02、C(0)、C(0)0、OC(O)、C(0)N或NC(O)。例如,C i-Ce表示出所述基团中可具有1至6个(包含)碳原子。在一些实施例中,对L的C-末端修饰包含羧基烯基酯。如本文所用,术语“烯基”是指包含至少一双键的烷基。示例性烯基包括但不限于例如乙烯基,丙烯基,丁烯基,1-甲基-2-丁烯基-1-基等。在一些实施例中,对Y、W、F的C-末端修饰包含羧基炔基酯。如本文所用,术语“炔基”是指包含至少一三键的烷基。在一些实施例中,羧酸酯包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸羧基甲酯。在一些实施例中,羧酸酯包含酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸羧基乙酯。
在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含对Y、W及/或F的N-末端修饰。如本文所用,“N-末端修饰”是指通过氨基酸的α-氨基及待添加至氨基酸的部分或取代基之间的连接来将部分或取代基添加至氨基酸。本公开考量了对Y、W及/或F的任何N-末端修饰,其中N-末端修饰的Y、W及/或F保留刺激mTOR活化的能力,从而单独地刺激蛋白酶体核定位或组合地刺激通过蛋白酶体核定位所测量的氨基酸酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸。
在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含被氨基庞大取代基(amino bulkysubstituent group)修饰的Y、W及/或F。如本文所用,“氨基庞大取代基(amino bulkysubstituent group)”是指通过α-氨基与氨基酸连接的庞大取代基。本公开考量了使用包含氨基庞大取代基的任何Y、W及/或F衍生物,当单独使用或与氨基酸残基组合使用时,其保留其刺激mTOR活化的能力,从而在单独使用时刺激蛋白酶体核定位、或刺激通过蛋白酶体核定位所测量的氨基酸酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸。示例性的氨基庞大取代基是羧基苄基(carboxybenzyl,Cbz)保护基。因此,在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含被氨基羧基苄基(Cbz)保护基修饰的Y、W及/或F。其他合适的氨基庞大取代基对于本领域技术人员是显而易见的。
在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含对Y、W及/或F的侧链修饰。如本文所用,“侧链修饰”是指通过侧链与待添加的部分或化学基团之间的键(例如共价键)将部分或取代基添加至氨基酸的侧链。本公开考量了允许侧链修饰的氨基酸的用途,用于在单独使用时或与通过蛋白酶体核定位所测量的其氨基酸酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸或其模拟物组合使用时保留其刺激mTOR活化的能力。示例性的侧链修饰是二氮杂萘修饰(diazirinemodification)。因此,在一些实施例中,Y、W及/或F衍生物包含具有二氮杂萘修饰的侧链的可光交联的Y、W及/或F。在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含非天然氨基酸。在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含Y、W及/或F的盐。在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含Y、W及/或F的硝酸盐。在一些实施例中,Y、W及/或F的衍生物包含Y、W及/或F的亚硝酸盐。在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包含天然氨基酸酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸的类似物。可预期的是,可以使用通过蛋白酶体核定位测量的当单独使用或与氨基酸色氨酸及苯丙氨酸组合使用时刺激mTOR活化的Y、W及/或F的任何类似物,且刺激mTOR活化的Y、W及/或F类似物可以由本领域技术人员根据本文公开的教导(例如,测定增加蛋白酶体核定位的Y、W及/或F类似物)轻易地确定。应理解的是,本公开内容还包括在其一些特定及非限制性实施例中,任何一种L-或D-酪氨酸、L-或D-苯丙氨酸的氘代、氟化、乙酰化或甲基化形式或L-或D-色氨酸。更具体而言,可用作本发明类似物的氘取代氨基酸(氘代氨基酸)可包括但不限于L-酪氨酸-(苯基-3,5-d2)、L-4-羟基苯基-2,3,5,6-d4-丙氨酸及L-色氨酸-(吲哚-d5)。甲基化芳香族氨基酸残基包括但不限于L-酪氨酸甲酯、O-甲基-L-酪氨酸、α-甲基-L-酪氨酸、α-甲基-DL-酪氨酸甲酯盐酸盐、α-甲基-L-酪氨酸、α-甲基-DL-酪氨酸、α-甲基-DL-色氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、N-甲基-苯乙胺、β-甲基苯乙胺、N,N-二甲基苯乙胺、3-甲基苯乙胺、(R)-(+)-β-甲基苯乙胺、N-甲基-N-(1-苯基乙基)胺、2-甲基苯乙胺、4-溴-N-甲基苄胺、3-溴-N-甲基苄胺、(S)-β-甲基苯乙胺、对氯-β-甲基苯乙胺盐酸盐、α-甲基DL-色氨酸、L-色氨酸甲酯盐酸盐、D-色氨酸甲酯盐酸盐、L-色氨酸乙酯盐酸盐、L-色氨酸苄酯、L-酪氨酸甲酯盐酸盐、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、DL-色氨酸甲酯、N-乙酰基-L-色氨酸甲酯。此外,氟化酪氨酸、苯丙氨酸或色氨酸还包括但不限于5-氟-L-色氨酸、5-氟-DL-色氨酸、4-氟-DL-色氨酸、6-氟-L-色氨酸、5-氟-L-色氨酸、5-氟-DL-色氨酸、5-溴-DL-色氨酸、7-氮色氨酸(7-Azatryptophan)、间氟-DL-酪氨酸(m-Fluoro-DL-tyrosine)、对氟-L-苯丙氨酸(p-Fluoro-L-phenylalanine)、邻氟-DL-苯丙氨酸(o-Fluoro-DL-phenylalanine)、对氟-DL-苯丙氨酸(p-Fluoro-DL-phenylalanine)、4-氯-DL-苯丙氨酸、间氟-L-苯丙氨酸(m-Fluoro-L-phenylalanine)、3-硝基-L-酪氨酸。在本公开的一些进一步实施例中,乙酰化芳香族氨基酸残基包括但不限于N-乙酰基-L-酪氨酸、N-乙酰基-L-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、N-乙酰基-D-苯丙氨酸、N-乙酰基-L-色氨酸。
可根据本公开适用的示例性酪氨酸及/或苯丙氨酸类似物包括但不限于(2R,3S)/(2S,3R)-外消旋Fmoc-β-羟基苯丙氨酸(hydroxyphenylalanine)、Boc-2-氰基-L-苯丙氨酸(phenylalanine)、Boc-L-甲状腺素(thyroxine)、Boc-O-甲基-L-酪氨酸、Fmoc-β-甲基-DL-苯丙氨酸、Fmoc-2-氰基-L-苯丙氨酸、Fmoc-3,4-二氯-L-苯丙氨酸、Fmoc-3,4-二氟-L-苯丙氨酸、Fmoc-3,4-二羟基-L-苯丙氨酸、Fmoc-3,4-二羟基-苯丙氨酸(乙酰胺保护)、Fmoc-3-氨基-L-酪氨酸、Fmoc-3-氯-L-酪氨酸、Fmoc-3-氟-DL-酪氨酸、Fmoc-3-硝基-L-酪氨酸、Fmoc-4-(Boc-氨基)-L-苯丙氨酸、Fmoc-4-(Boc-氨基甲基)-L-苯丙氨酸、Fmoc-4-(膦酰基甲基)-苯丙氨酸、Fmoc-4-(膦酰基甲基)-苯丙氨酸、Fmoc-4-苯甲酰基-D-苯丙氨酸。更进一步,在一些实施例中,可根据本公开内容应用的示例性色氨酸类似物包括但不限于Boc-4-甲基-DL-色氨酸、Boc-4-甲基-DL-色氨酸、Boc-6-氟-DL-色氨酸、Boc-6-甲基-DL-色氨酸、Boc-DL-7-氮杂色氨酸、Fmoc-(R)-7-氮杂色氨酸、Fmoc-5-苄氧基-DL-色氨酸、Fmoc-5-溴-DL-色氨酸、Fmoc-5-氯-DL-色氨酸、Fmoc-5-氟-DL-色氨酸、Fmoc-5-氟-DL-色氨酸、Fmoc-5-羟基-L-色氨酸、Fmoc-5-羟基-L-色氨酸、Fmoc-5-甲氧基-L-色氨酸、Fmoc-5-甲氧基-L-色氨酸、Fmoc-6-氯-L-色氨酸、Fmoc-6-甲基-DL-色氨酸、Fmoc-7-甲基-DL-色氨酸、Fmoc-DL-7-氮杂色氨酸(azatryptophan)中的任何一者。
在一些实施例中,Y、W及/或F模拟物包含天然氨基酸酪氨酸的代谢物。进一步考量了,可以使用单独地刺激mTOR或与氨基酸残基色氨酸及苯丙氨酸或其模拟物组合地刺激mTOR活化的任何酪氨酸代谢物,且Y、W及/或F衍生物刺激mTOR活化的可以由本领域技术人员根据本文公开的教导轻易地确定(例如,测定当单独使用或与色氨酸及苯丙氨酸或其模拟物组合使用时增加蛋白酶体核定位的Y、W及/或F的代谢物)。
应理解的是,本公开提供了芳香族氨基酸残基,特别是酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸及/或其任何血清门,其任何盐、碱、酯或酰胺、其任何对映异构体、立体异构体或二元异构体、或其任何组合或混合物。药学上可接受的盐包括存在于化合物中的酸性或碱性基团的盐,特别是本发明的芳香族氨基酸残基。药学上可接受的酸加成盐包括但不限于盐酸盐(hydrochloride)、氢溴酸盐(hydrobromide)、氢碘酸盐(hydroiodide)、硝酸盐(nitrate)、硫酸盐(sulfate)、硫酸氢盐(bisulfate)、磷酸盐(phosphate)、酸性磷酸盐(acid phosphate)、异烟酸盐(isonicotinate)、乙酸盐(acetate)、乳酸盐(lactate)、水杨酸盐(salicylate)、柠檬酸盐(citrate)、酒石酸盐(tartrate)、泛酸盐(pantothenate)、酒石酸盐(bitartrate)、抗坏血酸盐(ascorbate)、琥珀酸盐(succinate)、马来酸盐(maleate)、龙胆酸盐(gentisinate)、富马酸盐(fumarate)、葡萄糖酸盐(gluconate)、葡糖酸盐(glucaronate)、糖酸盐(saccharate)、甲酸盐(formate)、苯甲酸盐(benzoate)、谷氨酸盐(glutamate)、甲磺酸盐(methanesulfonate)、乙磺酸盐(ethanesulfonate)、苯磺酸盐(benzensulfonate)、对甲苯磺酸盐(p-toluenesulfonate)及双羟萘酸盐(pamoate)(即1,1'-亚甲基双-(2-羟基-3-萘甲酸酯)(1,1'-methylene-bis-(2-hydroxy-3-naphthoate))盐类。本公开的某些芳香族氨基酸残基可以形成药学上可接受的盐。合适的碱包括但不限于铝、钙、锂、镁、钾、钠、锌及二乙醇胺盐(diethanolamine salts)。
本公开提供了有效的mTOR激动剂,其可以包含一个芳香族氨基酸残基,例如酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸中的任何一者或多者或其任何模拟物、或至少两个酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸及/或其模拟物。因此,本公开进一步提供了数个组合,具体地为包含至少两种酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸、及/或任何模拟物或其衍生物的数个组合。在一些实施例中,本公开的组合中的有效量的至少一mTOR激动剂的足以调节至少一细胞中的蛋白酶体动力学。
在一些实施例中,根据本发明的蛋白酶体易位的选择性抑制剂及/或mTOR激动剂可以包含至少一酪氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯,其任何多聚体及/或聚合物形式、以及任何组合或其混合物、以及至少一色氨酸残基、任何模拟物、任何盐或酯、任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,根据本发明的mTOR激动剂可包含至少一酪氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物、以及至少一苯丙氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,根据本发明的mTOR激动剂可以包含至少一色氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物、以及至少一苯丙氨酸残基、任何模拟物,任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。
在一些特定实施例中,本公开的mTOR激动剂可包含以下三个组分:第一组分(a),包含至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、任何多聚体及/或酪氨酸残基、及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的聚合物形式、及其任何组合或混合物。本发明的mTOR激动剂还包含组分(b),至少一色氨酸残基、任何mTOR激动色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基及/或所述mTOR激动剂的任何多聚体及/或聚合物形式色氨酸模拟物、或其任何组合或混合物。本发明的mTOR激动剂还包括组分(c),苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。应当理解,本公开的mTOR激动剂的芳香族氨基酸残基或其任何模拟物可以任何合适的定量比以所有三种YWF的混合物呈现。使用的定量比例可以是例如1:1:1、1:2:3、1:10:100、1:10:100:1000等、或1-106:1-106:1-106中的任何一者。在一些实施例中,定量比例可以是1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:、1:1:5、1:1:6、1:1:7、1:1:8、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:6:1、1:7:1、1:8:1、1:9:1、1:10:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1、5:1:1、6:1:1、7:1:1、8:1:1、9:1:1、10:1:1或任何其他三种芳香族氨基酸残基的合适比例中的一者。
为了促进本文公开的mTOR激动剂及数个组合的治疗及非治疗用途,本公开进一步提供了包含mTOR激动剂及本发明组合的组合物。
在一些特定的及非限制性的实施例中,如本文所公开的,mTOR激动剂及其任何剂型包含如上所述的有效量的所有三个芳香族氨基酸残基Y、W、F。更具体而言,在一些实施例中,本发明的mTOR激动剂可以包含浓度范围为约0.01mM至约30mM或更高的芳香族氨基酸Y、W及F,其中每种芳香族氨基酸残基的浓度小于45mM,并且在一些进一步的实施例中,浓度不大于35mM,如关于本公开的其他方面所讨论的。在又一些进一步的实施例中,本文公开的mTOR激动剂可包含每个芳香族氨基酸残基Y、W、F的约5gr-7gr至约50gr-70gr的量。在又一些进一步的实施例中,本文公开的mTOR激动剂中使用的有效量可以在对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F的约0.1gr/天/kg至约0.9gr/天/kg之间,并且在一些实施例中,对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F而不超过0.99gr/天/kg。然而应理解的是,指示的每天有效剂量或本文讨论的剂量单位可以在24小时内的几个时间点以单次施用或两次或更多次施用。此外,施用及剂量由主治医师的良好医疗实践确定,并且可能取决于所需受试者的年龄、性别、体重及一般状况。
因此,本发明的另一方面涉及包含作为活性成分的组合物,所述组合物包含至少一芳香族氨基酸残基的至少一mTOR激动剂、直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度、其任何组合或混合物、任何媒介物、基质、可选地以至少一剂型或至少一剂型单位形式存在的纳米或微粒。在一些具体实施例中,本发明的组合物可以包含本发明的任何mTOR激动剂,具体地,本文公开的mTOR激动剂或其任何载体、基质、纳米或微粒。在一些实施例中,所述组合物可可选地进一步包含至少一药学上可接受的载体、赋形剂、助剂及/或稀释剂。
在一些更具体的实施例中,由本公开提供的组合物中包含的mTOR激动剂可包含至少一芳香族氨基酸残基、或至少两个芳香族氨基酸残基或其任何模拟物的组合、任何直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的化合物、其任何组合或混合物或其任何载体、基质、纳米或微粒。在一些具体实施例中,本文公开的组合物的mTOR激动剂可可选地以至少一剂型或至少一剂型单位形式包含至少两种以下组分。第一组分(a)包含至少一酪氨酸(Y)残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。mTOR激动剂可以在一些实施例中包含作为第二组分(b),至少一色氨酸(W)残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、及/或mTOR激动性色氨酸模拟物或其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,本发明的mTOR激动剂可以包含(c)至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、任何多聚体及/或聚合物形式的苯丙氨酸残基、及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物及其任何组合或混合物。
在一些实施例中,根据本发明组成的mTOR激动剂可包含至少一酪氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物、及至少一色氨酸残基、任何模拟物、任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,根据本发明组成的mTOR激动剂可包含至少一酪氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;及至少一苯丙氨酸残基、任何模拟物、任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,根据本发明组成的mTOR激动剂可以包含至少一色氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;及至少一苯丙氨酸残基、任何模拟物、任何盐或酯、任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。更进一步地,在一些具体实施例中,本公开的组合物的mTOR激动剂可以包含可选地以至少一剂型或至少一剂量单位形式或可选地以两种或三种剂量单位形式。更具体而言,所述组合物可包含:包含至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、任何酪氨酸残基的多聚体及/或聚合物形式、及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物及其任何组合或混合物,可选地以剂量单位形式存在。本发明的mTOR激动剂还包含组分(b),其包含至少一色氨酸残基、任何mTOR激动色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、及/或mTOR激动性色氨酸模拟物、或其任何组合或混合物,可选地以剂量单位形式存在。本公开组合物的mTOR激动剂还包含组分(c),其包含至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基的任何多聚体、及/或聚合物形式、及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、及其任何组合或混合物,可选地在至少一剂型或至少一剂型单位形式中。
在上文及本公开中指出的芳香族氨基酸残基为“第一”或“第一组分”、“第二”或“第二组分”、“第三”或“第三组分”。然而,应理解的是,本文仅出于简化目的使用第一、第二及第三的指示。此外,本发明的组合物可以仅包含第一及第二组分、第一及第三组分、第二及第三组分、所有三组分或其与任何其他组分的任何组合、或第一、第二或第三组分单独或以任何组合。
在一些实施例中,除了mTOR激动剂之外,本发明的组合物可以进一步包含一有效量的至少一UPS调节剂,特别是至少一蛋白酶体抑制剂及/或PROTAC及/或选择性调节剂,特别是蛋白酶体易位抑制剂及/或其他治疗剂。应理解的是,本文可以使用任何已知的UPS调节剂,例如任何已知的蛋白酶体抑制剂及/或PROTAC。在一些具体实施例中,本公开公开的任何UPS调节剂,例如与其他方面有关的蛋白酶体抑制剂也适用于本文提供的组合物。更进一步,在一些实施例中,组合物可以进一步包含蛋白酶体易位的任何选择性调节剂,特别是蛋白酶体易位的选择性抑制剂。在一些实施例中,组合物可以进一步包含至少一额外的治疗剂,例如至少一增强压力状态或过程(或者具体地,在一些实施例中,短期压力状态或病症,或者可选地,增强细胞溶质蛋白酶体定位及/或活性)的药剂。在更具体实施例中,短期压力状态或过程可以是诱导或参与细胞核-胞质溶胶蛋白酶体易位的任何压力状态。在更具体的实施例中,额外的治疗剂可以是导致、增强及/或加重缺氧的至少一药剂,例如抑制或减少血管生成的药剂。适用于本公开的抑制血管生成的特定药剂在本文中指出。此外,导致饥饿的任何药剂或程序,例如限制饮食,也可以在本文中用于进一步增强压力。
在又一些进一步的实施例中,本发明的组合物可以除至少一芳香族氨基酸残基或其任何模拟物之外或代替至少一芳香族氨基酸残基或其任何模拟物而包含任何直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中的至少一者,可选地以至少一剂量单位形式存在。这种化合物的非限制性实例包括可以增加酪氨酸及/或苯丙氨酸水平的尼替尼酮。
更进一步,应理解的是,本发明的任何mTOR激动剂,特别是本文公开的任何芳香族氨基酸残基(YWF的D-异构体,YWF的L-异构体或其任何混合物)或其任何模拟物,或包含本发明的至少一芳香族氨基酸残基或其任何模拟物的任何肽或蛋白质,在某些实施例中可以处于与至少一“增强”部分(moiety)相关联、结合或缀合。此类部分(moiety)可以是增加其mTOR激动作用的任何部分(moiety),并且具体地,通过促进细胞穿透、靶向特定细胞靶标及/或通过增加稳定性及减少其清除率来增强蛋白酶体核定位及/或活性来促进及/或增强蛋白酶体核定位。如本文所用,涉及半衰期增加部分(half-life increasing moiety)、细胞穿透部分(cell penetration moiety)、特定组织或器官指导部分(specific tissue ororgan-directing moiety)或特定细胞类型指导部分(specific cell type directingmoiety)的术语“与…相关联(associated with)”意味着所述部分(moiety)可以非共价连接、或共价结合、缀合、交联、掺入于例如包含本发明的至少一芳香族氨基酸残基或其任何模拟物的肽、多肽或蛋白质内的氨基酸序列),或以与至少一芳香族氨基酸残基(特别是Y、W及/或F)、其任何模拟物、包含至少一氨基酸残基的肽、包含本发明芳香族氨基酸残基的非标准肽、多肽、非标准多肽、蛋白质或非标准蛋白质的相同成分方式存在,其方式使得所述部分(moiety)能够发挥其功能。如本文所用,术语“细胞穿透部分(cell penetrationmoiety)”是指增强与其相关的肽、非标准肽、多肽、非标准多肽、蛋白质或非标准蛋白质穿透细胞膜的能力的部分。在一些实施例中,“细胞穿透部分(cell penetration moiety)”可以是包含本发明的至少一芳香族氨基酸残基的肽、非标准肽、多肽、非标准多肽、蛋白质或非标准蛋白质内或连接的氨基酸序列。细胞穿透序列的实例包括但不限于Arg-Gly-Asp(RGD)、Tat肽、寡精氨酸、MPG肽、Pep-1等。
如本文所用,术语“特定器官定向部分(specific organ directing moiety)”是指一部分(moiety),所述部分(moiety)增强了本发明芳香族氨基酸残基或其任何模拟物、肽、非标准肽、多肽、非标准多肽、蛋白质或其非标准蛋白质的能力,其中其与一特定器官相关联及靶向所述特定器官。在一些实施例中,“特定器官引导部分(specific organdirecting moiety)”是与特定器官中存在的细胞类型结合的氨基酸序列、小分子或抗体。在一些实施例中,“特定器官引导部分(specific organ directing moiety)”是与特定器官中特征性存在的受体或其他蛋白质结合的氨基酸序列、小分子或抗体。
如本文所用,术语“特定细胞类型定向部分”是指增强芳香族氨基酸驻留的能力的部分、或其任何肽、非标准肽、多肽、非标准多肽、蛋白质或非标准蛋白质,其中其与一特定细胞类型相关联及靶向所述特定细胞类型。在一些实施例中,“特定细胞类型引导部分(specific cell-type directing moiety)”是与一特定靶细胞类型的表面中或表面上特征性存在的特定受体或其他蛋白质结合的氨基酸序列、小分子或抗体。
本公开的mTOR激动剂,特别是酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸(Y、W及/或F)中的至少一者及其模拟物、任何剂型或其任何剂量单位形式,可以配制成药学上可接受的组合物或营养保健组合物。例如,这种组合物可以设计用于任何合适的施用模式,其可以适应任何期望的组织、器官或细胞。施用模式的非限制性实例包括但不限于肠胃外、肠内、肌内、直接脑内或口服施用。之后将讨论其他相关的管理模式。在更具体的方面,将mTOR激动剂中的至少一者或其任何剂型或剂量单位形式配制成一控制释放制剂。在这方面,本发明还包括植入物的用途,用于在植入部位保留活性剂量。活性剂可以配制成立即活性,或者可以替代地,或者可以配制成如本文所述的持续释放。
在另一更具体的方面,将至少一mTOR激动剂配制成组合物以促进从靶器官的特定部分的吸收。在更具体的实施例中,本公开的任何组合物可以配制成用于递送至特定器官或细胞类型(例如,脑、肌肉、成纤维细胞、骨、软骨、肝、肺、乳房、皮肤、膀胱、肾、心脏、平滑肌、肾上腺、垂体、胰腺、黑素细胞、血液、脂肪及肠)的药物组合物。将理解的是,用于递送至大脑的制剂需要活性组分穿过血脑屏障或直接施用于大脑或CNS的能力。
如上所述,本发明的组合物可以在一些实施例中包含至少一额外的治疗剂,特别是增强压力状态或过程的药剂。在更具体的实施例中,压力状态或过程可以是诱导或参与蛋白酶体细胞穿梭及易位的任何压力状态,例如细胞核-胞质溶胶或胞质溶胶核蛋白酶体易位。在某些实施例中,这样的压力状态或过程包括缺氧、氨基酸饥饿及/或未折迭蛋白反应(unfolded protein response,UPR)压力中的至少一者。在更具体的实施例中,额外的治疗剂可以是导致、增强及/或加重缺氧的至少一药剂。在一些具体实施例中,导致或引起缺氧的药剂可以是抑制或减少血管生成的药剂。更具体而言,本文所用的血管生成是涉及形成新血管的过程。血管生成是许多疾病中的特征现象,例如肿瘤形成、类风湿性关节炎、糖尿病性视网膜病及牛皮癣等等。这个过程涉及排列在血管内壁的内皮细胞的迁移、生长及分化。血管生成过程是由促进细胞增殖、管形成及内皮细胞迁移的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素(angiopoietins,Ang)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)等多种因素控制。这些分子用作阻断血管生长及/或干扰血管生长的各个步骤的血管生成抑制剂的靶标。根据报导,多种化合物通过各种分子途径表现出抗血管生成活性。除了拮抗性VEGF之外,例如通过使用特异性识别及结合VEGF的抗体,已经显示小分子例如vatalanib,tivozanib,cediranib及lenvatinib抑制受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)信号传导,从而影响血管生成。植物多酚、儿茶素、类黄酮、萜烯、单宁、生物碱及聚乙炔包含天然抗血管生成植物化学物质。根据报导,紫杉醇、喜树碱及考布他汀等化合物具有有效的抗血管生成特性。此外,已经报导了通过抑制VEGF信号传导的抗血管生成作用来自饮食功能性食品,例如来自大豆的染料木黄酮(genistein)、来自绿茶的表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)及来自红葡萄的白藜芦醇(resveratrol)。
如上所述,本公开的mTOR激动剂可与可针对VEGF(例如VEGF特异性抗体)或任何血管生成因子(例如,上述的任何因子)的至少一血管生成抑制剂组合或以组合的治疗方案与至少一血管生成抑制剂一起施用。在本公开的方法、组合物及试剂盒中有用的血管生成抑制剂的非限制性实例包括以下中的至少一者:VEGF抑制剂,例如抗VEGF抗体,例如贝伐单抗(Bevacizumab)及雷莫卢单抗(Ramucirumab)/>VEGF融合蛋白,例如Ziv-aflibercept/>激酶抑制剂,例如Vandetanib/>舒尼替尼(Sunitinib)/>索拉非尼(Sorafenib)/>瑞格非尼(Regorafenib)帕唑帕尼(Pazopanib)/>卡博替尼(Cabozantinib)阿昔替尼(Axitinib)/>及参与蛋白质降解的药物(例如,通过与E3连接酶的相互作用),例如沙利度胺(Thalidomide)(Synovir,/>)及相关药物,例如来那度胺(Lenalidomide)/>
更具体而言,小分子酪氨酸激酶抑制剂Axitinib被用作肾癌的治疗选择。贝伐单抗/>是一种重组人源化单克隆抗体,通过抑制VEGF-a阻断血管生成。Avastin用于治疗结直肠癌、肾癌及肺癌。Cabozantinib/>是酪氨酸激酶c-Met及VEGFR2的小分子抑制剂,也抑制AXL及RET。Cabozantinib用于治疗甲状腺髓样癌及肾癌。具有式C13H13N3O3的来那度胺(CC-5013;IMiD3;/>)是沙利度胺的类似物,沙利度胺是一种谷氨酸衍生物,由于其抗肿瘤坏死因子(TNF)α活性而具有抗血管生成特性及有效的抗炎作用而被归类为免疫调节药物(Imunomodulatory drug,IMiD)。来那度胺被用作多发性骨髓瘤及套细胞淋巴瘤的治疗选择,这是一种非霍奇金淋巴瘤。具有式C21H19ClN4O4的Lenvatinib甲磺酸盐(Lenvima)充当针对VEGFR1、VEGFR2及VEGFR3激酶的多重激酶抑制剂,并用于治疗某些类型的甲状腺癌。具有式C21H23N7O2S的Pazopanib/>是一种有效的多靶点受体酪氨酸激酶抑制剂,可抑制VEGFR、PDGFR、c-KIT及FGFR。帕唑帕尼(Pazopanib)用作肾癌及晚期软组织肉瘤的治疗选择。Ramucirumab/>是一种完全人源单克隆抗体(IgG1),以高亲及力结合VEGFR2的细胞外结构域并阻断天然VEGFR配体(VEGF-a、VEGF-C及VEGF-D)的结合。Ramucirumab用于治疗晚期胃癌;胃食管连接腺癌、结直肠癌;及非小细胞肺癌(NSCL)。具有式C21H15ClF4N4O3的Regorafenib/>是口服多激酶抑制剂,其对VEGFR2-TIE2显示双重抑制活性。Regorafenib被用作结直肠癌及胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors,GIST)的治疗选择。具有式C21H16ClF3N4O3的索拉非尼/>是各种蛋白激酶(包括VEGFR、PDGFR及RAF激酶)的蛋白激酶抑制剂。所述药用于治疗肾癌、肝癌及甲状腺癌。舒尼替尼/>是一种口服、小分子、多靶点受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)抑制剂,具有式C22H27FN4O2,可阻断KIT、PDGFR、VEGFR2及其他酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性。舒尼替尼被用作肾癌、PNET及GIST的治疗选择。沙利度胺(Synovir,/>)(α-N-邻苯二甲酰亚胺基-戊二酰亚胺)是谷氨酸的合成衍生物,已知在1950年代末及1960年代初用作妊娠止吐药时会引起先天缺陷。如上所述,沙利度胺及其类似物是IMID。这些药物结合CRBN(CRL4 E3连接酶的底物受体)以诱导IKZF1及IKZF3的泛素化及降解。沙利度胺用于治疗多发性骨髓瘤。具有式C22H24BrFN4O2的Vandetanib/>充当许多细胞受体(主要是VEGFR,EGFR及RET酪氨酸激酶)的激酶抑制剂。所述药用作甲状腺髓样癌的治疗选择。Ziv-aflibercept/>是一种重组融合蛋白,由人VEGF受体1及2的细胞外结构域的VEGF结合部分组成,其与人IgG1免疫球蛋白的Fc部分融合。所述药剂(药物)用于治疗湿性黄斑变性及转移性结直肠癌。应当理解,本文公开的任何抗血管生成剂都可用作本公开的任何方面的额外的治疗剂。
在一些实施例中,本文公开的组合物的至少一mTOR激动剂可以配制成口服剂型。在又一些其他实施例中,本文公开的组合物可以配制成口服剂量单位形式。在一些替代实施例中,至少一mTOR激动剂可以配制成可注射剂型。在一些其他实施例中,本文公开的组合物可以配制成可注射剂量单位形式。
在一些实施例中,口服剂型可以口服施用,例如作为溶液(例如糖浆),或作为粉末、片剂、胶囊等。在一些进一步的实施例中,口服剂型可以适于添加到固体、半固体或液态食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、医用食品、药物及/或药物组合物中的制剂提供。
在某些实施例中,本发明的组合物可以配制成适于添加到固体、半固体或液态食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、医用食品、植物药、药物及/或任何类型的药物化合物。
在一些实施例中,根据本发明的额外组合物可以配制成食品添加剂、食品补充剂或医用食品。在另一个实施例中,本发明的这种额外组合物可以进一步添加或与药物或任何类型的药物产品组合。如本文所用,术语“添加物(add-on)”是指本公开的至少一mTOR激动剂的组合物或剂量单位形式,其可以添加到现有化合物、组合物或材料(例如,食品或饮料)中,增强所需的性质。或者,将特定所需的性质添加到现有的化合物、组合物、食品或饮料中。
更具体而言,在某些实施例中,本公开的至少一mTOR激动剂或其任何剂型或组合物可以是食品补充剂的添加物,或者可以用作食品补充剂。食品补充剂(欧洲食品和饲料安全委员会(European Commission for Food and Feed Safety)创造的术语)、或膳食补充剂、FDA采用的类似术语,涉及任何具有营养或生理作用的天然或合成物质,其目的是补充正常或限制的饮食。从这个意义上说,这个术语也包括食品添加剂及膳食成分。此外,根据美国联邦法规于1994年膳食补充剂健康及教育法案(Dietary Supplement Health andEducation Act,DSHEA),膳食补充剂一词被定义为旨在补充含有或含有以下一种或多种膳食成分的饮食的产品:维生素、矿物质、草药或其他植物药,受试者通过增加总膳食摄入量或任何上述成分的浓缩物、代谢物、成分、提取物或组合来补充饮食的膳食物质。
食品或膳食补充剂以丸剂、胶囊剂、粉剂、饮料、能量棒及其他剂型的形式销售。然而,与药物不同,它们主要是不受管制的,即在没有有效性或安全性证据的情况下销售。因此,欧洲及美国的法律对膳食补充剂的监管与涵盖“常规”食品及药品的法规不同。据此,膳食补充剂必须贴上标签并用于摄入,不得作为常规食物或作为膳食或饮食的唯一物品使用。然而,可以将包含本文提供的至少一mTOR激动剂的额外剂型或组合物添加到受试者消耗的膳食或饮料中。
在一些进一步的实施例中,根据本公开内容,mTOR激动剂或其任何组合物可以是医疗食品的添加物或可以作为医疗食品消费。此外,在这方面应提及医用食品,这些食品是专门配制的食品,用于饮食管理具有独特营养需求的疾病,仅靠正常饮食无法满足。
孤儿药法(Orphan Drug Act)(21U.S.C.360ee(b)(3))第5(b)(3)条规定的医疗食品,是指在医生的监督下配制成肠内食用或管理的食物,旨在通过医学评估确定基于公认的科学原理的独特营养需求的疾病或病症的特定饮食管理。FDA认为医疗食品的法定定义严格限制符合此类食品的产品类型(21CFR 101.9(j)(8))。医疗食品与更广泛的特殊膳食食品类别区别在于要求医疗食品旨在满足疾病或病症的独特营养需求,在医疗监督下使用,用于疾病或病症的特定饮食管理。医疗食品不是医生简单推荐的作为整体饮食的一部分来控制症状或降低疾病或病症风险的食品。并非所有喂养患有疾病的患者的食物,包括需要饮食管理的疾病,都是医疗食品。相反地,医用食品是为需要使用所述产品作为疾病或病症特定饮食管理的主要组成部分的患者专门配制及加工的食品(而不是天然状态下使用的天然食品)。
它是一种特殊配方及加工产品(相对于天然状态下使用的天然食品),用于通过口服摄入或其他喂食方式(例如管或导管)部分或专门喂食患者。
与本上下文相关的还有任何类型的药物或治疗化合物,其可以作为(但不限于)溶液(例如茶)、粉末、片剂、胶囊剂、酏剂(elixir)、局部或注射剂获得。因此,在进一步的实施例中,至少一mTOR激动剂、任何剂型、剂量单位形式或其组成可以是通过吸入或通过口服、静脉内、皮内施用的任何类型的药物或治疗化合物的添加物直肠内。
在一些实施例中,至少一mTOR激动剂、任何剂型、剂量单位形式或其组成可以适用于添加食物及/或饮料。
在这种情况下,饮料是任何饮料,包括例如水果或水果风味饮料、调味水或苏打水、能量饮料、咖啡、茶、牛奶、巧克力奶及非酒精葡萄酒及啤酒。如本文所用,食物是向消耗的受试者提供营养及/或卡路里的任何干燥、半干燥或液体可食用物质。食物可以由天然或合成成分及其任何组合组成,并且可以提供碳水化合物、脂肪、纤维、维生素及其他营养素。示例性食品可以但不限于烘焙产品,例如面包、饼干、饼干、蛋糕、糕点等;糖果产品,如巧克力或素食或素食巧克力、糖果、软糖;日期产品(dates products);乳制品或乳制类(素食)产品,如酸奶、奶酪、冰淇淋;配方奶粉,如婴儿配方奶粉;花环,如蛋黄酱、番茄酱等;冷冻食品;蛋白质及能量棒;咸味小吃等等。然而,应理解的是,可以包含在如上所述的任何食品或食品添加剂内的mTOR激动剂以及本发明公开的任何组合物及制剂可以包含任何食品或食品添加剂,条件是具有YWF,特别是其任何剂型,不是天然存在的,或不能被认为是天然存在于这种食品或食品添加剂中。具体地,在一些实施例中,通过本发明将YWF或其任何组合物添加到这些食品或食品添加剂中。因此,在一些实施例中,本公开的YWF及任何剂型、剂型单位形式及/或其组合物不被认为是天然产物。
如上所述,关于本公开的mTOR激动剂,可以剂型或剂型单位形式提供每种芳香族氨基酸残基。如本文所用,剂型是药物产品,其形式为与活性成分(例如YWF及/或其任何模拟物)及可选地非活性组分(赋形剂)的一特定混合物(处于特定构型(例如胶囊壳)并分配成特定剂量)一起销售以供使用。在一些实施例中,术语剂型在一些实施例中还可以仅指药物产品的组成药物物质及所涉及的任何共混物的药物制剂。
如本文可互换使用的,“剂量单位”、“剂型”、“口服或注射剂量单位”、“剂量单位形式”、“口服或注射剂量单位形式”等均指本领域已知的固体剂型或液体剂型。剂型旨在经口使用,即被吞咽(摄入),甚至以任何其他方式注射或施用,由需要的受试者或由医生管理。本文可互换使用的术语“活性物质”或“活性成分”是指治疗或生理活性物质,特别是本文公开的mTOR激动剂,其为患者提供治疗/生理作用,并且还可以指其至少两个的一混合物。
在一些实施例中,本公开的任何mTOR激动剂以及任何制剂、剂型、剂量单位形式、组合物、试剂盒方法及其用途可以适用于或可以涉及至少一全身及/或至少一非全身施用。如本文所定义的术语“非系统性”是指局部施用途径,即不通过消化道而不是肠胃外施用的施用途径。在本公开的实施例中,非全身施用可以是任何施用模式,例如鞘内、鼻内、眼内、神经内、脑内、脑室内、脑室内、颅内及硬膜下施用。在本公开的一些进一步的实施例中、全身施用可以是任何施用模式,例如口服、静脉内、肌内、皮下、局部、肠内(例如胃肠道、特别是口服、直肠、舌下、阴唇下或口腔,通过注射、灌肠、导管、涂药器或任何口服或局部制剂中的任何一者)或肠胃外。
在一些进一步的实施例中,本公开的mTOR激动剂以及任何制剂、剂型、剂量单位形式、组合物、试剂盒方法及其用途可以配制成可注射制剂,其可以用于全身或用于非系统性或局部管理。在本公开的进一步实施例中,所述可注射制剂,特别是水性或液体制剂,被设计用于通过推注施用给所述受试者。在本公开的其他实施例中,所述水性可注射制剂被设计用于通过输注不少于1分钟且不超过24小时给予所述受试者。
因此,本公开进一步提供了用于向需要其的受试者非全身施用的可注射水性制剂,所述制剂包含本公开的至少一mTOR激动剂或其任何组合或制剂作为活性成分,其可以包含在一些实施例中,本公开的Y、W、F或其任何模拟物至约30mM或所述芳香族氨基酸Y、W、F或其任何模拟物中的每一者。在一些进一步的实施例中,每种芳香族氨基酸残基的浓度不超过35mM。
在所公开的治疗方法中,本文定义的注射制剂每天、每隔一天、一周、每两周、每三周一次、两次或更多次,或每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、或每八周一次、两次或更多次,或每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次或每六个月一次,甚至每一年两次或更多次。
在本公开公开的公开的mTOR激动剂以及任何制剂、剂型、剂量单位形式、组合物、试剂盒、用途及治疗方法中,本文公开的可注射制剂的施用速率使得每种芳香族氨基酸残基Y、W及F,每天每公斤体重不超过0.99克,在一些实施例中,每天每公斤体重小于1克。在具体实施例中,所述施用通过输注不少于1分钟且不超过24小时来进行。
如本文所述,本文公开的组合物或任何剂型或剂量单位形式可以可注射制剂提供。如本文所用,术语“注射”或“可注射”是指推注(bolus injection)(施用本文公开的至少一mTOR激动剂的离散量,用于提高其在体液中的浓度)、数分钟内缓慢推注、或延长输注、或以间隔间隔给予的几次连续注射/输注。每次单次施用的这种间隔注射在本文中也称为“每次施用注射”,或者换句话说,单次施用可以包括多次注射或延长输注。用于如本文所定义的需要其的受试者的非全身施用的可注射水性制剂可以使用药物-装置组合,例如机械或机电装置,更优选为机电输液泵。例如,机电泵由储存器、导管组成,所述储存器用于容纳药物,所述导管具有与泵连接的近端部分及适于将药物施用于所需部位的远端部分。
更进一步,可以提供及/或以一有效量使用本公开的组成以及本公开的mTOR激动剂的任何产品或用途,特别是本文公开的YWF。更具体而言,本发明的组合物可以包含本文公开的至少一本发明的mTOR激动剂及/或其任何载体、基质、纳米或微粒的一有效量。术语“有效量”涉及存在于组合物中的活性剂的量,具体地,如本文所述的本发明的mTOR激动剂,其需要在血流中或在个体的作用部位(例如,肿瘤的特定部位)提供所需水平的活性剂当施用这种组合物时,将其治疗以产生预期的生理反应。确切的量将取决于许多因子,例如活性剂、组合物的活性、所使用的递送装置、组合物的物理特性、预期的患者用途(即,每天施用的剂量的数量)、患者考虑等,并且可以容易地由本领域技术人员基于此处提供的信息确定。本发明的mTOR激动剂的“有效量”可以一次施用,或者通过多次施用,总量为有效量,优选在24小时内施用。可以使用标准临床确定适当的施用量及施用时间的程序。应理解的是,“有效量“可以是治疗医疗保健专业人员及/或个人的经验及/或个人化(个案)决定的结果。
根据本公开的mTOR激动剂(特别是包含至少两个芳香族氨基酸残基的mTOR激动剂,更具体而言,本公开中使用的所有三个氨基酸残基酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸(例如,在本文公开的mTOR激动剂、组合物、试剂盒及方法中),如本文所讨论的,可以对mTOR介导的活性的选择性及特异性激动活性有效的任何量呈现,特别是在调节细胞中的蛋白酶体动力学中。在一些进一步的实施例中,芳香族氨基酸残基的量对于特异性及选择性抑制蛋白酶体募集或从细胞核转移至胞质溶胶是有效的任何量。更进一步,在一些实施例中,有效量是对特异性及选择性地维持蛋白酶体在所需受试者的细胞中的核定位有效的量。在一些进一步的实施例中,有效量是对特异性及选择性地需要蛋白酶体进入细胞核并调节蛋白酶体动力学有效的量,使得蛋白酶体定位在治疗受试者的细胞中主要是在细胞核。
因此,在一些实施例中,本发明的组合物包含至少一酪氨酸(Y)残基、至少一色氨酸(W)残基及至少一苯丙氨酸(F)残基或其任何mTOR激动剂模拟物、盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物、及其任何剂型或剂量单位形式,在以mTOR激动剂治疗的至少一受试者的至少一细胞中的量,所述量对于选择性调节蛋白酶体定位(特别是选择性及特异性抑制蛋白酶体易位,特别是抑制蛋白酶体易位至胞质溶胶,以及可选地选择性及特异性增强蛋白酶体向细胞核的募集),以及本发明的组合物包含本文公开的剂型、剂型单位形式、组合物、试剂盒及方法。
如本公开所示,本发明的三个芳香族氨基酸残基,特别是酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸(YWF),有效且选择性地抑制蛋白酶体易位至细胞中的胞质溶胶,而且在一些实施例中维持并将蛋白酶体募集到细胞核中。当本发明的芳香族氨基酸局部施用于肿瘤或全身施用时,这已通过本公开内容在体外及体内证明。最重要的是,当通过注射或口服组合物全身提供时,三连体YWF协同抑制肿瘤细胞生长,以及肿瘤质量及肿瘤体积(图14、15及17-19)。这些协同有效量的所有三个芳香族氨基酸残基Y、W、F已被转化并适用于哺乳动物受试者,特别是人类受试者。如本文所示,具体地在实施例16中,使用每种芳香族氨基酸残基YWF的浓度为约0.01至30mM。具体而言,0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0,19、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1mM或更多,更具体地为1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9.、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、或30mM或更多。在一些实施例中,每种芳香族氨基酸残基Y、W、F或其模拟物在剂型中的浓度可以在约0.01mM至约30mM或更高的范围内,其中每种芳香族氨基酸残基小于45mM。在一些进一步的实施例中,本文公开的剂型或组合物中的每个氨基酸残基的浓度不超过35mM。在一些进一步的实施例中,本发明的所有三个芳香族氨基酸残基的总浓度小于45mM。此外,在一些特定的及非限制性的实施例中,蛋白酶体易位及/或mTOR激动剂的选择性抑制剂或任何组合物、试剂盒、剂型及方法中的Y、W及F残基中的每一者的浓度可以是各1.6mM。在又一些进一步的实施例中,每个浓度可以是6mM。因此,在一些特定的及非限制性的实施例中,在本发明的组合物中,每种芳香族氨基酸残基酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸(YWF)可以约1mg至约100gr或更高的量存在或以本文公开的任何剂型或剂量单位形式,具体地,在约0.001gr至约100gr之间,更具体而言,介于约0.01gr至约100gr之间,约0.1gr至约100gr之间,约1gr至约100gr之间,约2gr至约100gr之间,3gr至约100gr之间,4gr至约100gr之间,5gr至约100gr之间,6gr至约100gr之间,7gr至约100gr之间,8gr至约100gr之间,9gr至约100gr之间,10gr至约100gr之间,具体地,在约10gr至约95gr之间,10gr至约90gr之间,10gr至约85gr之间,10gr至约80gr之间,10gr至约750gr之间,10gr至约65gr之间,10gr至约60gr之间,10gr至约55gr之间,10gr至约45gr之间,10gr至约40gr之间,10gr至约35gr之间,10gr至约30gr之间,10gr至约25gr之间,10gr至约20gr之间,10gr至约15gr之间。在一些具体实施例中,在本发明的组合物中,每种芳香族氨基酸残基酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸(YWF)可以约10gr至约20gr的量存在。此外,本文公开的剂型、剂型单位形式或任何组合物及试剂盒可包含约5gr-7gr至约50gr-70gr的每种芳香族氨基酸残基Y、W、F(如对于体重在约50至70kg之间的成年人计算)。在一些进一步的实施例中,提供给受试者的有效量可以在每天约0.01gr至约10gr/kg体重之间。在一些其他实施例中,对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F,本文公开的剂型、制剂、组合物、试剂盒及方法中使用的有效量可以在每天约0.1gr/kg至每天约0.9gr/kg之间。在一些其他实施例中,对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F,本文公开的剂型、制剂、组合物、试剂盒及方法不超过0.99gr/每天/每kg。在更具体的实施例中,从约0.01gr、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.11.0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2、0.21、0.22、0.23、0.24、0.5、0.26、0.27、0.28、0.29、0.3、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.4、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.5gr/kg/天或更多、至约1gr每天/每kg或更少。在更具体的实施例中,每个芳香族氨基酸残基酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸(YWF)可以约0.1至约0.9gr/天/kg的量存在。更具体而言,对于每种芳香族氨基酸残基Y、W、F约0.1gr/天/kg,或约0.1至约0.2gr/天/kg,或约0.2gr/天/kg或约0.2至约0.3gr/天/kg,或约0.3gr/天/kg或约0.3至约0.4gr/天/kg,或约0.4gr/天/kg或约0.4至约0.5gr/天/kg,或约0.5gr/天/kg或约0.5至约0.6gr/天/kg,或约0.6gr/天/kg或约0.6至约0.7gr/天/kg之间,或约0.7gr/天/kg或约0.7至约gr/天/kg,或约0.8gr/天/kg或约0.8至约0.9gr/天/kg,或约0.9gr/天/kg或在约0.9至约但不超过0.99gr/天/kg,并且在一些实施例中,对于每种芳香族氨基酸残基Y、W、F而言,小于1gr/天/kg。然而,应理解的是,所示的每天有效剂量或本文讨论的剂量单位可以在24小时内的几个时间点以单次施用或两次或更多次施用给予。此外,施用及剂量由主治医师的良好医疗实践确定,并且可能取决于所需受试者的年龄、性别、体重及一般状况。
应当理解,本文讨论的有效量适用于本公开的每个方面及每个方面的每个实施例,具体地,适用于任何mTOR激动剂、其任何剂型、其剂量单位形式、组合物、试剂盒、用途及方法。
本发明的药物组合物可以根据良好的医学实践,通过本发明的方法全身施用,例如通过肠胃外,例如胸腺内、进入骨髓、腹膜或腹膜内,特别是给予任何腹膜腔、以及任何直接给予任何腔或器官,特别是胸膜腔(间皮瘤、侵入肺部)膀胱及大脑。然而,应所注意的是,本发明可以进一步包括任何额外的施用模式。在其他实施例中,药物组合物可以通过任何合适的途径引入部位,包括皮下、经皮、局部、肌内、关节内、结膜下、或粘膜、静脉内,例如口服、鼻内、眼内施用或肿瘤内。
更进一步地,可以通过例如在手术期间通过局部输注,或使用任何永久或临时输注装置、局部施用、直接注射到特定器官等来实现对需要治疗的区域的局部施用。更具体而言,本文公开的组合物,其也用于本发明的任何方法中,与本公开的其他方面有关的描述可以适用于通过肠胃外、腹膜内、透皮、口服(包括口腔或舌下)、直肠、局部(包括口腔或舌下)、阴道、鼻内及任何其他适当途径施用。这样的制剂可以通过药学领域已知的任何方法制备,例如通过使活性成分与载体或赋形剂缔合。在一些任选的实施例中,本发明的激动剂及其任何制剂可以直接施用于中枢神经系统(CNS)。直接施用到CNS中的实例包括鞘内施用及直接施用到脑中,例如脑内、脑室内(intra-ventricular)、脑室内(intra-cerebroventricular)、颅内或硬膜下施用途径。这种施用途径可能对涉及或需要胞质蛋白酶体积累及/或胞质溶胶中蛋白酶体活性增加的疾病特别有益,其可能在一些实施例中影响中枢神经系统(例如任何神经元或脑组织的良性或恶性肿瘤)。
在一些进一步的实施例中,本发明的组合物可以可选地进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂、添加剂、稀释剂及佐剂中的至少一者。
更具体而言,可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备用于治疗根据本发明需要治疗的受试者的药物组合物,其可以方便地以单位剂型呈现。这些技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常,通过均匀且紧密地将活性成分,特别是本发明的mTOR激动剂与液体载体或精细分开的固体载体或两者结合,然后在必要时使产品成形来制备制剂。组合物可以配制成许多可能的剂型中的任何一者,例如但不限于片剂、胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂及灌肠剂。本发明的组合物也可以配制成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可进一步含有增加悬浮液粘度的物质,包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇及/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。本发明的药物组合物还包括但不限于含有乳剂及脂质体的制剂,或包含任何其它纳米或微粒的制剂或包含本文公开的至少一mTOR激动剂的任何基质。
应理解的是,除了上面特别提到的成分之外,制剂还可以包括本领域常规的关于所述制剂类型的其它试剂。
如上所述,药物制剂是包含存在于药学上可接受的载体中的一种或多种mTOR激动剂的组合物。“药学上可接受的载体”可以是由联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出的用于任何生物体,特别是任何脊椎动物生物体,例如任何哺乳动物如人的载体。术语“载体”是指配制本发明化合物用于给予哺乳动物的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。这种药物载体可以是脂质,例如脂质体,例如脂质体树枝状大分子;液体,如水及油,包括石油、动物、蔬菜或合成来源的液体,如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等,如盐水、阿拉伯胶、明胶、淀粉糊、滑石粉、角蛋白、胶体二氧化硅、尿素等。另外,可以使用辅助的、稳定的、增稠的、润滑的及着色的试剂。药物组合物可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂,例如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体及气溶胶。因此,本发明的mTOR激动剂的施用可以本发明公开的任何各种方式实现。
如上所述,本发明涉及使用不同的活性成分,特别是本公开的mTOR激动剂,例如酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸,以及可选地至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂及/或任何可增强压力状态或过程的其他治疗化合物,可以通过不同途径、剂量及组合施用。更具体而言,与至少一短期压力状况相关的病症以及与其相关联的任何病症与活性成分的组合的治疗可涉及单独施用每种活性成分。因此,使用本发明的mTOR激动剂(特别是治疗所需的至少一芳香族氨基酸残基酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸)为组合治疗提供便利的模块化形式的试剂盒,将允许所需或优选的灵活性在上述参数中。因此,本发明的另一方面涉及包含以下至少两种或至少两种的组合的试剂盒:
首先(a),至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,可选地以第一剂型的形式。在一些实施例中,本发明的试剂盒可以另外或可选地包含(b),至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、任何盐或酯、色氨酸残基及/或mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物,可选地以第二剂型的形式。在一些其他实施例中,本发明的试剂盒可另外或可替代地(c)包含,至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,可选地以第三剂型的形式。
在一些实施例中,根据本发明试剂盒的mTOR激动剂可包含至少一酪氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;及至少一色氨酸残基、任何模拟物、任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,根据本发明试剂盒的mTOR激动剂可包含至少一酪氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;及至少一苯丙氨酸残基、任何模拟物、任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,根据本发明试剂盒的mTOR激动剂可包含至少一色氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;及至少一苯丙氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。更进一步,在一些具体实施例中,本公开的试剂盒提供的mTOR激动剂可包含如上所述的所有三个芳香族氨基酸残基,或三个芳香族氨基酸残基或其任何模拟物的组合,或任何直接或间接调节至少一水平的化合物,或至少一芳香族氨基酸残基,或其任何组合或混合物或其任何载体、基质、纳米或微粒的稳定性及生物利用度。在更具体的实施例中,本公开的试剂盒的mTOR激动剂可以包含以下三种组分的组合:第一组分(a)包含至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、任何盐或其酯、酪氨酸残基、及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。本发明的mTOR激动剂还包含组分(b),至少一色氨酸残基、任何mTOR激动色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、及/或mTOR激动性色氨酸模拟物、或其任何组合或混合物。本公开的试剂盒的mTOR激动剂还包含组分(c),至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物及其任何组合或混合物。
更进一步,在一些实施例中,本发明的试剂盒可以除了或代替至少一芳香族氨基酸残基或其任何模拟物,包含直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物。这种化合物的非限制性实例包括可以增加酪氨酸及/或苯丙氨酸水平的尼替尼酮。在一些额外的具体实施例中,本发明的试剂盒可以可选地或另外地包含增加本发明的mTOR激动剂的mTOR激动作用的至少一部分,并且具体地促进及/或增强蛋白酶体核定位,通过促进细胞穿透、靶向特定细胞靶标或增加稳定性并减少其清除。
在一些实施例中,本发明的试剂盒可以可选地以第四剂型包含至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂或本发明公开的任何调节剂。
在一些实施例中,试剂盒可以进一步包含至少一额外的治疗剂,例如至少一增强短期压力状态或过程的药剂。例如,导致、增强及/或加重缺氧的药剂。在一些具体实施例中,这些药剂可以抑制或减少血管生成。在本公开的方法、组合物及试剂盒中有用的血管生成抑制剂的非限制性实例包括以下中的至少一者:VEGF抑制剂,例如抗VEGF抗体或VEGF融合蛋白、激酶抑制剂及涉及蛋白质降解的试剂。在一些实施例中,本文公开的试剂盒的至少两个芳香族氨基酸残基中的至少一者可以剂量单位形式配制。
在一些实施例中,本文公开的试剂盒中的至少一者mTOR激动剂可以配制成口服剂型。在一些替代实施例中,至少一mTOR激动剂可以配制成可注射剂型。
在一些实施例中,由本发明试剂盒提供的口服剂型可以口服,例如作为溶液(例如糖浆)、粉末、片剂、胶囊等。在一些进一步的实施例中,口服剂型可以适于添加到固体、半固体或液态食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、医用食品、药物及/或药物组合物中的制剂提供。
在一些特定及非限制性实施例中,本文公开的试剂盒以如上所述的有效量包含所有三个芳香族氨基酸残基Y、W、F。更具体而言,在一些实施例中,本发明的试剂盒可以包含浓度在约0.01mM至约30mM或更高范围内的芳香族氨基酸Y、W及F,其中每个芳香族氨基酸残基的浓度为小于45mM,并且在一些进一步的实施例中,浓度不超过35mM,如关于本公开的其他方面所讨论的。在又一些进一步的实施例中,本文公开的试剂盒可包含每个芳香族氨基酸残基Y、W、F的约5gr-7gr至约50gr-70gr的量。在一些进一步的实施例中,有效对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F,并且在一些实施例中,对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F不超过0.99gr/天/kg。
应理解的是,本公开公开的任何试剂盒可以适用并用于本发明公开的任何方法。
如以下实施例所示,本发明的mTOR激动剂显着调节治疗受试者细胞中的蛋白酶体动力学,因此显示出明显的临床应用。
因此,本发明的另一方面涉及用于在一受试者中治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟至少一病症或至少一涉及或与细胞溶质蛋白酶体定位及/或细胞溶质蛋白酶体定位及活性相关联的病理病症的进展的方法。更具体而言,所述方法可以包括向受试者施用至少一mTOR激动剂的有效量(或在一些实施例中的治疗有效量),所述至少一mTOR激动剂包含至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动剂模拟物,或任何盐或其酯,或至少一芳香族氨基酸残基及/或mTOR激动性芳香族氨基酸残基模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,或包含其的任何剂型、剂型单位形式、组合物或试剂盒。
本公开提供了适用于需要、与蛋白酶体的胞质定位、积累及/或活性相关联或以其特征为特征的任何病症或病理病症的治疗及预防方法。更具体而言,本文讨论的方法适用于以主要的蛋白酶体-胞质溶胶定位或蛋白酶体在胞质溶胶中的积累及/或蛋白酶体在胞质溶胶中的活性增加为特征或由其定义的任何疾病或病症,具体而言,与健康受试者或未患有所示病症的受试者的细胞相比。在一些实施例中,本文讨论的病症可以是以蛋白酶体功能疾病为特征的任何病症,其可以在一些实施例中指增加的活性。如本文所述,蛋白酶体在受试者细胞的胞质溶胶中的量及/或活性的增加对于提供细胞对能量来源、氨基酸及/或所需的再循环构建块的未满足需求或需求是必需的。细胞存活及活动。更进一步,如本文所述,蛋白酶体活性是指各种胞质溶胶及核蛋白的蛋白水解降解。可以通过任何已知方法测量蛋白酶体活性,所述方法可以包括例如使用荧光标记的蛋白酶体亚基及使用基于活性的蛋白酶体探针。结合本发明的其他方面,本文讨论了用于确定蛋白酶体定位的方法。在肌肉萎缩性疾病、缺血性疾病或涉及任何分解代谢过程、高分解代谢及/或高代谢病症的任何病症或病症中测量增加的蛋白酶体降解。更具体而言,如本文所用,与参考水平相比,患有所示病症的受试者的细胞的胞质溶胶中蛋白酶体的量或活性增加意味着至少约10%或更多的增加或增强的蛋白酶体细胞溶质定位及/或未患有所示病症的受试者的细胞中的活性。例如增加至少约20%,或至少约30%,或至少约40%,或至少约50%,或至少约60%,或至少约70%,或至少约80%,或至少约90%或最多并包括100%增加,或至少约2倍,或至少约3倍,或至少约4倍,或至少约5倍或至少约10倍的增长,或与蛋白酶体胞质定位及/或活性与参考水平(例如,在未患有所公开疾病的受试者中)相比增加2倍至10倍或更多。
更进一步,在一些实施例中,本公开的治疗方法可以在一些实施例中适用于与细胞压力相关的病症。在一些特定实施例中,这种压力可以是任何短期或长期压力,或至少一短期或长期细胞状况或过程,其可以是诱导细胞核-胞质溶胶蛋白酶体易位的任何压力状况,或在一些非限制性实施例中,蛋白酶体的胞质定位增加。更进一步,在一些实施例中,这样的病症可以是其中细胞存活需要足够的胞质溶胶定位及/或蛋白酶体活性的病症或过程。因此,在一些实施例中,这样的病症可以在胞质溶胶中显示平均或正常的蛋白酶体量,但是其特征在于依赖性及胞质蛋白酶体对细胞存活的需求。在一些实施例中,这样的压力状态包括氨基酸饥饿、缺氧及未折迭蛋白反应(unfolded protein response,UPR)介导的蛋白酶体易位中的至少一者。
更具体而言,如本文所用的氨基酸饥饿涉及但不限于营养缺乏,特别是氨基酸,并且由几种独特的生理标志物标记,包括eIF2a磷酸化的诱导及许多压力反应的增加的转录。氨基酸饥饿反应(amino acid starvation response,AAS)是一种广泛的细胞反应,可以通过饥饿来触发或诱导20种氨基酸中的许多氨基酸,包括但不限于脯氨酸及必需氨基酸,如苯丙氨酸、色氨酸、缬氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸等。氨基酸应答途径由任何必需氨基酸的缺乏引发,并导致活化转录因子ATF4的增加,其反过来通过sundry途径影响许多过程以限制或增加其他蛋白质的产生。在低浓度的氨基酸下,由于未改变的tRNA分子的水平增加,GCN2被激活。活化的GCN2使自身及elF2+磷酸化,它通过影响生物体中氨基酸的利用,获得及动员来触发转录及翻译反应以恢复氨基酸稳态。必需氨基酸对于维持生物体内的稳态至关重要。然而,应理解的是,本文所用的氨基酸饥饿除了以氨基酸消耗或退化为特征的条件外,还包括细胞对能量来源,氨基酸及/或所需的再循环结构单元的需求增加的条件。细胞存活尚未得到满足。与这种饥饿相关的病理状况(由消耗或增加的未满足需求引起)包括但不限于增殖性疾病,例如癌症、缺血性病症以及与代谢亢进及/或高分解代谢病症(例如肌肉萎缩疾病或病症)相关的任何病症。
在一些进一步的实施例中,与本公开的方法相关的压力状态或在一些实施例中,短期压力状态可以是缺氧(hypoxia)。缺氧是身体或身体部位在组织水平上缺乏足够氧气供应的状况。缺氧可分为全身性影响全身或局部影响身体部位。虽然缺氧通常是一种病理状态,但动脉氧浓度的变化可能是正常生理的一部分,例如在换气不足训练或剧烈体育锻炼期间。缺氧(hypoxia)与低氧血症(hypoxemia)及低氧血症(anoxemia)的不同之处在于,缺氧(hypoxia)是指氧供应不足的状态,而低氧血症(hypoxemia)及低氧血症(anoxemia)是指动脉氧供应低或零的状态。完全剥夺氧气供应的缺氧被称为缺氧。与缺氧相关的病理状况包括但不限于增殖性疾病,例如癌症或缺血性病症。
此外,适用于本公开的短期压力状况可能是UPR。更具体而言,未折迭蛋白反应(Unfolded Protein Response,UPR)是与内质网(endoplasmic reticulum,ER)压力相关的细胞压力反应。已经发现它在所有哺乳动物物种以及酵母及蠕虫生物之间是保守的。UPR响应于内质网腔中未折迭或错误折迭的蛋白质的积累而被激活。在这种情况下,UPR有三个目标:首先通过停止蛋白质转译、降解错误折迭的蛋白质及激活导致增加参与蛋白质折迭的分子伴侣产生的信号传导途径来恢复细胞的正常功能。如果这些目标不能在一定的时间内实现或中断时间延长,UPR则指向凋亡。
有趣的是,UPR的持续过度激活与病毒疾病以及其他几种神经退行性疾病有关,抑制UPR可能成为这些疾病的治疗方法。适合UPR抑制的疾病包括克雅氏病(Creutzfeldt–Jakob disease)、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)、帕金森氏病及亨廷顿氏病(Huntington's disease)。
在一些具体实施例中,本发明方法使用的至少一mTOR激动剂可包含以下中的至少一者:(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的酪氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任选的任何组合或混合物,在一些实施例中,本发明方法使用的mTOR激动剂可另外或可选地包含(b),至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述mTOR激动性色氨酸模拟物的所述色氨酸残基的任何多聚体及/或及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物,可选地以第二剂型的形式。在一些进一步的实施例中,本公开方法使用的mTOR激动剂可以另外或可选地包含(c),至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的苯丙氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,可选地以第三剂型的形式。在一些实施例中,本发明方法使用的mTOR激动剂可以包含至少一酪氨酸残基、任何模拟物、任何盐或酯、任何多聚体及/或其聚合物形式、及其任何组合或混合物,以及至少一色氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,本发明方法使用的mTOR激动剂可包含至少一酪氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,及至少一苯丙氨酸残基、任何模拟物、任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些进一步的实施例中,本发明方法使用的mTOR激动剂可包含至少一色氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,及至少一苯丙氨酸残基、任何模拟物、其任何盐或酯、其任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些实施例中,本发明方法使用的mTOR激动剂包含所有三个芳香族氨基酸残基,具体地,(a),至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的酪氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式,以及可选地在第一剂型的形式;(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、任何盐或酯、所述mTOR激动性色氨酸模拟物的色氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物,可选地以第二剂型的形式;(c)至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的苯丙氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、及其组合或混合物,可选地以第三剂型的形式。应理解的是,在一些实施例中,所有三个芳香族氨基酸残基可以单一剂型配制。在一些进一步的实施例中,本公开方法使用的三个芳香族氨基酸残基可以配制成一个、两个或三个剂型。
应当注意,如果受试者用包含本发明的至少两种mTOR激动剂的组合治疗、及/或在所述治疗进一步与其他药物例如至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂或直接或间接调节至少一水平的任何其他化合物治疗、稳定性及生物利用度在本文中用作mTOR激动剂的至少一芳香族氨基酸残基中,各种治疗化合物可以单一组合物或施用模式一起施用,或者以单独的组合物及/或不同的施用模式施用。
如本文所讨论的,为了治疗与短期压力过程相关的病症,给受试者施用至少一芳香族氨基酸残基,特别是酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸中的至少一者、或其任何模拟物、或任何其他mTOR激动剂。在一些实施例中,这些方法导致在摄入氨基酸的饮食来源之后,使酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸水平中的至少一者增加超过细胞中可用的这种氨基酸的内源水平。在一些实施例中,酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸中的至少一者的水平在摄入所述氨基酸的膳食来源后比细胞中可用的内源水平增加了至少1.1倍到至少10倍或更多倍,具体地为与摄入所述氨基酸的膳食来源后细胞中可用的内源水平相比至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0倍或更多、至少3.0倍或更多、至少4.0倍或更多、至少5.0倍或更多、至少6.0倍或更多、至少7.0倍或更多、至少8.0倍或更多、至少9.0倍或更多、至少10倍或更多。在一些实施例中,其中将mTOR激动性色氨酸模拟物、mTOR激动性酪氨酸模拟物及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物递送至细胞,酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸水平的总和、及/或相应的mTOR氨基酸模拟物在摄入所述氨基酸的饮食来源后比细胞中可用的内源性水平至少1.1到至少10倍或更多倍,具体地为与至少一在摄入所述氨基酸的饮食来源后细胞中可用的酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸相比的至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2.0或更多倍、至少3.0或更多倍、至少4.0或更多倍、至少5.0或更多倍、至少6.0或更多倍、至少7.0或更多倍、至少8.0或更多倍、至少9.0或更多倍、至少10倍或更多倍。应当理解,为了达到上述水平的至少一酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或其相应的mTOR激动剂模拟物,这些激动剂可以一种或多种单一氨基酸或其mTOR模拟物或一种或多种肽、非标准肽、多肽、非标准多肽,如前所述,富含一种或多种那些氨基酸或mTOR模拟物,或其任何剂型或其组成的蛋白质或非标准蛋白质。
在一些实施例中,本发明的治疗方法可以进一步适用于在施用至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂之前、之后及/或同时施用至少一mTOR激动剂。因此,根据一些实施例,本发明的方法可以进一步包括在施用至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂及/或PROTAC之前、之后及/或同时施用至少一mTOR激动剂。在一些实施例中,受试者可以进一步施用至少一额外的治疗剂,例如至少一增强压力状态或过程或胞质蛋白酶体定位及/或活性的药剂。例如,导致、增强及/或加重缺氧的药剂。在一些具体实施例中,这些药剂可以抑制或减少血管生成。在本公开的方法、组合物及试剂盒中有用的血管生成抑制剂的非限制性实例包括以下中的至少一者:VEGF抑制剂(例如抗VEGF抗体或VEGF融合蛋白)、激酶抑制剂、及涉及蛋白质降解的试剂。更进一步,在一些替代及非限制性实施例中,治疗的受试者可以进一步进行限制性饮食。在一些实施例中,本公开方法使用的至少一mTOR激动剂可以配制成任何合适的剂量单位形式。在一些实施例中,本公开方法使用的至少一mTOR激动剂可以配制在一些替代实施例中,本文公开的方法中的至少一者mTOR激动剂可以配制成可注射剂型。
在一些进一步的实施例中,口服剂型可以通过本公开的方法口服施用,例如作为溶液(例如糖浆),作为粉末、片剂、胶囊等。在一些进一步的实施例中,口服剂型可以适于添加到固体、半固体或液态食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、医疗食品、药物及/或药物组合物如本文之前关于本发明的其他方面所讨论的。如此,口服剂型可以是提供给治疗受试者的膳食或饮料的一部分。
因此,在一些实施例中,本文公开的方法涉及口服施用,其中至少一mTOR激动剂口服给予治疗的受试者。更进一步,应理解的是,本公开的方法可以使用任何系统的及非系统的或局部的施用模式,以及适用于本公开的任何施用模式的任何制剂及组合物如关于本发明的其他方面所讨论的。
在一些实施例中,通过本公开处理的受试者是及/或经受氨基酸的饮食限制,其也可以在本文中称为氨基酸饥饿状况。如本文所用,对至少一氨基酸的饮食限制是指向治疗的受试者提供受控饮食方案,其不包括蛋白质来源或非常低的蛋白质含量。在一些实施例中,氨基酸的饮食限制涉及提供饮食方案,其特征在于消耗或限制所有20个氨基酸或至少必需氨基酸,例如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸及组氨酸中的至少一者。更进一步,成年人的均衡饮食需要以蛋白质的形式消耗至少10%的每日卡路里。饮食方案中的低蛋白质含量或无蛋白质含量是指提供通过本公开方法治疗的受试者的任何饮食,其小于所需蛋白质量,例如约0至约5%所需的蛋白质量,具体地为所需蛋白质量的0%、0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.009%、0.010%、0.011%、0.012%、0.013%、0.014%、0.015%、0.016%、0.017%、0.018%、0.019%、0.020%、0.021%、0.022%、0.023%、0.024%、0.025%、0.026%、0.027%、0.028%、0.029%、0.030%、0.031%、0.032%、0.033%、0.034%、0.035%、0.036%、0.037%、0.038%、0.039%、0.040%、0.041%、0.042%、0.043%、0.044%、0.045%、0.046%、0.047%、0.048%、0.049%、0.050%、0.051%、0.052%、0.053%、0.054%、0.055%、0.056%、0.057%、0.058%、0.059%、0.060%、0.061%、0.062%、0.063%、0.064%、0.065%、0.066%、0.067%、0.068%、0.069%、0.070%、0.071%、0.072%、0.073%、0.074%、0.075%、0.076%、0.077%、0.078%、0.079%、0.080%、0.081%、0.082%、0.083%、0.084%、0.085%、0.086%、0.087%、0.088%、0.089%、0.090%、0.091%、0.092%、0.093%、0.094%、0.095%、0.096%、0.097%、0.098%、0.099%、0.100%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%、2%、3%、4%、或5%。
应理解的是,在一些实施例中,本公开的方法可以包括使受试者经受如上所述的氨基酸饥饿、消耗、退化或限制的另一步骤。所述步骤可以根据一些实施例在施用本发明的mTOR激动剂或其任何剂型或组合物或包含其的任何膳食或饮料之前、之中或之后进行。在一些特定的及非限制性的实施例中,本文公开的方法包括以如上文关于本发明的其他方面公开的有效量施用所有三个芳香族氨基酸残基Y、W、F。更具体而言,在一些实施例中,本文公开的方法包括以约0.01mM至约30mM或更高的浓度施用芳香族氨基酸Y、W及F,其中每个芳香族氨基酸残基的浓度为小于45mM,并且在一些进一步的实施例中,浓度不超过35mM,如关于本公开的其他方面所讨论的。在又一些进一步的实施例中,本文公开的方法包括将约5gr-7gr至约50gr-70gr的每个芳香族氨基酸残基Y、W、F施用。在一些进一步的实施例中,通过本文公开的方法使用及施用的有效量可以在对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F的约0.1gr/天/kg至约0.9gr/天/kg之间,并且在一些实施例中,对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F不超过0.99gr/天/kg。然而,应理解的是,指示的每天有效剂量或本文讨论的剂量单位可以在24小时内的几个时间点以单次施用或两次或更多次施用给予。此外,施用及剂量由主治医师的良好医疗实践确定,并且可能取决于有需要的受试者的年龄、性别、体重及一般状况。
在一些实施例中,本发明的方法可适用于与胞质蛋白酶体定位及/或活性相关的病理性病症、及/或涉及至少一短期细胞压力病症/过程的病症是增殖性病症及/或至少一蛋白质错误折迭病症或沉积病症。
在更具体的实施例中,增殖性疾病可以是至少一良性或恶性实体及非实体瘤。在一些进一步的实施例中,蛋白质错误折迭病症是淀粉样变性及任何相关病症。
更进一步地,本公开的mTOR激动剂、组合物及试剂盒可适用于任何增殖性病症,在一些实施方案中可以是任何肿瘤性疾病,更具体地,任何异常组织块,在本文中也称为肿瘤,其由于不受控制或异常的细胞生长导致细胞数量增加而形成。本公开的方法在一些实施例中可适用于任何肿瘤,良性肿瘤、原位肿瘤或恶性肿瘤。
在一些实施例中,本发明的方法可适用于治疗腺瘤。更具体而言,腺瘤是具有腺体起源、腺体特征或两者的上皮组织的良性肿瘤。腺瘤可以从许多腺体器官生长,包括肾上腺、垂体、甲状腺、前列腺等。尽管腺瘤是良性的,但应将其视为癌前病变。随着时间的推移,腺瘤可能会转变为恶性肿瘤,此时它们被称为腺癌。应当理解,本发明还适用于任何公开的增殖性疾病的任何转移组织,器官或腔。如本文用于描述本发明的,“增殖性疾病”、“癌症”、“肿瘤”及“恶性肿瘤”均等同于组织或器官的增生。如果组织是淋巴或免疫系统的一部分,则恶性细胞可包括循环细胞的非实体瘤。其他组织或器官的恶性肿瘤可能产生实体瘤。通常,本发明的方法、组合物及试剂盒可适用于患有任何一种非实体瘤及实体瘤的患者。
如本发明所考虑的,恶性肿瘤可以是癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤及肉瘤中的任何一者。因此,在一些实施例中,本文公开的任何本发明方法(具体地,治疗、预后及非治疗方法)、试剂盒及组合物可适用于本公开公开公开的任何恶性肿瘤。
更具体而言,本文所用的癌是指由转化的上皮细胞组成的侵袭性恶性肿瘤。或者,它是指由未知组织发生的转化细胞组成的恶性肿瘤,但其具有与上皮细胞相关的特定分子或组织学特征,例如细胞角蛋白或细胞间桥的产生。
本文使用的黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤。黑素细胞是产生黑色的色素(darkpigment)、黑色素(melanin)(负责皮肤的颜色)的细胞。它们主要存在于皮肤中,但也存在于身体的其他部位,包括肠道及眼睛。黑色素瘤可发生在含有黑素细胞的身体任何部位。
白血病是指血液形成器官的进行性恶性疾病,其特征通常在于血液及骨髓中白细胞及其前体的增殖及发育扭曲。白血病通常根据(1)急性或慢性疾病的持续时间及特征进行临床分类;(2)涉及的细胞类型;骨髓(myeloid)(骨髓(myelogenous))、淋巴(lymphoid)(淋巴(lymphogenous))或单核细胞;(3)血液白血病或白血病(亚白血病)中异常细胞数量增加或不增加。
肉瘤(sarcoma)是由转化的结缔组织细胞引起的癌症。这些细胞起源于胚胎中胚层或中间层,形成骨骼、软骨及脂肪组织。这与起源于上皮的癌形成对比。上皮细胞遍布整个身体的结构表面,是乳腺癌、结肠癌及胰腺癌的起源。
本文所述的骨髓瘤是浆细胞癌,浆细胞是一种通常负责产生抗体的白细胞。异常细胞的集合聚集在骨骼中,引起骨骼损伤,并在骨髓中干扰正常血细胞的产生。大多数骨髓瘤病例还表现为副蛋白的产生,副蛋白是一种异常抗体,可引起肾脏问题并干扰导致免疫缺陷的正常抗体的产生。经常遇到高钙血症(高钙水平)。
淋巴瘤是免疫系统淋巴细胞中的癌症。通常,淋巴瘤作为淋巴细胞的实体瘤存在。这些恶性细胞通常起源于淋巴结,表现为淋巴结(肿瘤)的扩大。它也可以影响其他器官,在这种情况下,它被称为结外淋巴瘤。淋巴瘤的非限制性实例包括霍奇金病(Hodgkin'sdisease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphomas)及伯基特淋巴瘤(Burkitt'slymphoma)。
在一些实施例中,本公开的方法可适用于任何实体瘤。在更具体的实施例中,本文公开的方法可适用于可能影响任何体腔中的任何器官或组织的任何恶性肿瘤(例如腹膜腔(例如脂肪肉瘤)、胸膜腔(例如间皮瘤(mesothelioma)、侵入肺(invading lung)))、不同器官中的任何肿瘤(例如膀胱癌、卵巢癌及脑膜肿瘤)。适用于本公开的方法、组合物及试剂盒的肿瘤的具体及非限制性实施例可包括但不限于卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、脑肿瘤及任何相关病症、以及任何转移病症、组织或器官。
在一些其他实施例中,本发明的方法、组合物及试剂盒适用于结肠直肠癌或可能影响腹膜腔中所有器官的任何恶性肿瘤,例如脂肪肉瘤。在一些进一步的实施例中,本发明的方法可能与存在于胸膜腔(间皮瘤、侵入肺),膀胱及脑膜肿瘤中的肿瘤有关。
在一些特定的实施例中,本发明的方法、组合物及试剂盒可适用于卵巢癌。应进一步理解的是,本发明还包括阻止卵巢转移的任何组织、器官或腔、以及涉及卵巢组织转移的任何癌症状况。如本文所用,术语“卵巢癌”在本文中可与术语“输卵管癌”或“原发性腹膜癌”互换使用,所述术语是指从卵巢组织、输卵管组织或腹膜衬里组织发展而来的癌症。早期症状可能包括腹胀、腹部盆腔疼痛及侧面疼痛。卵巢癌最典型的症状包括腹胀、腹部或盆腔疼痛或不适、背痛、月经不调或绝经后阴道出血、性交后或性交过程中疼痛或出血、进食困难、食欲不振、疲劳、腹泻、消化不良、胃灼热、便秘、恶心、早饱、以及可能的泌尿系统症状(包括频繁排尿及紧急排尿)。通常,这些症状是由压迫其他腹盆腔器官或转移引起的。
上皮性卵巢癌是最常见的卵巢癌类型,占病例的95%以上。据信,这些肿瘤始于覆盖卵巢的细胞,并且大部分可能在输卵管末端形成。较少见的卵巢癌类型包括生殖细胞肿瘤及性索间质瘤。卵巢癌根据其结构的微观外观(组织学或组织病理学)进行分类。
表面上皮间质瘤,也称为卵巢上皮癌,是最常见的卵巢癌类型,约占卵巢癌的90%。其包括浆液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、透明细胞瘤及粘液性囊腺癌。不太常见的肿瘤是恶性Brenner肿瘤及卵巢移行细胞癌。低度浆液性癌的侵袭性不如高度浆液性癌,尽管它通常对化学疗法或激素治疗反应不佳。
小细胞卵巢癌罕见且具有侵袭性,主要有两种亚型:高钙血症及肺。高钙血症的小细胞卵巢癌绝大多数影响20多岁的人,导致高血钙水平,并影响一个卵巢。肺小细胞卵巢癌通常影响老年妇女的卵巢,看起来像肺燕麦细胞癌(oat-cell carcinoma of the lung)。
原发性腹膜癌(primary peritoneal carcinoma)由腹膜(peritoneum)发展而来。它甚至可以在卵巢被移除后发展,并且可能看起来类似于间皮瘤(mesothelioma.)。
透明细胞卵巢癌(clear-cell ovarian carcinomas)可能与子宫内膜异位症有关。它们约占上皮性卵巢癌的5-10%,并与盆腔子宫内膜异位症有关。
子宫内膜样腺癌(endometrioid adenocarcinomas)约占上皮性卵巢癌的15–20%。这些肿瘤经常与子宫内膜异位症或子宫内膜癌同时发生。
混合型苗勒氏肿瘤(mixed müllerian tumors)占卵巢癌的不到1%。它们具有可见的上皮细胞及间充质细胞。
粘液性肿瘤(mucinous tumors)包括粘液腺癌及粘液性囊腺癌。粘液腺癌占上皮性卵巢癌的5-10%。
腹膜假性粘液瘤(pseudomyxoma peritonei)是指腹腔内包裹的粘液或凝胶状物质的集合,其很少由原发性粘液性卵巢肿瘤引起。
恶性布伦纳瘤(Malignant Brenner tumors)很少见。组织学上,它们具有致密的纤维基质,具有过渡上皮区域及一些鳞状分化。要归类为恶性布伦纳瘤,它必须具有伦纳肿瘤灶(Brenner tumor foci)及转移细胞癌(transitional cell carcinoma)。转移细胞癌组分通常分化差并且类似于尿路癌(urinary tract cancer)。
性索间质瘤(Sex cord-stromal tumor)包括产生雌激素的颗粒细胞瘤(granulosa cell tumor)、良性肿瘤及男性化的Sertoli-Leydig细胞瘤或成神经细胞瘤(arrhenoblastoma),占卵巢癌的7%。颗粒细胞瘤是最常见的性索间质肿瘤,占70%,分为两种组织学亚型:50岁以上女性发生的成人颗粒细胞瘤及青春期前发生的幼年颗粒细胞瘤或30岁以前。两者都在围绕生发细胞的细胞群的卵泡中发育。
卵巢的生殖细胞肿瘤由卵巢生殖细胞发展而来。生殖细胞肿瘤约占卵巢肿瘤的30%,但仅占卵巢癌的5%,因为大多数生殖细胞肿瘤是畸胎瘤、大多数畸胎瘤是良性的。当肿瘤中的一个胚层发展成鳞状细胞癌时,恶性畸胎瘤倾向于发生在老年妇女中。生殖细胞肿瘤在卵巢中出现时可包括无性细胞瘤(dysgerminomas)、畸胎瘤(teratomas)、卵黄囊肿瘤(yolk sac tumors)/内胚层窦肿瘤(endodermal sinus tumors)及绒毛膜癌(choriocarcinomas)。
应当理解,本文所用的卵巢癌(ovarian carcinoma)可以进一步包括卵巢癌肉瘤(Ovarian carcinosarcoma)、绒毛膜癌(Choriocarcinoma)、成熟畸胎瘤(Matureteratomas)、胚胎癌(Embryonal carcinomas)及原发性卵巢鳞状细胞癌(Primary ovariansquamous cell carcinomas)中的至少一者。更具体而言,卵巢癌肉瘤(Ovariancarcinosarcoma,OCS),也称为恶性混合苗勒氏瘤(malignant mixed müllerian tumor,MMMT),是一种非常罕见的妇科恶性肿瘤(gynecological malignancy),占卵巢恶性肿瘤的1-3%。OCS是由肉瘤及癌组分组成的混合肿瘤。肉瘤组分可以是同源的(包括子宫内膜间质肉瘤、纤维肉瘤及平滑肌肉瘤)、或异源的。致癌成分通常由腺癌及鳞状细胞癌组成。由于患有这种癌症的女性通常没有症状,因此超过一半的女性被诊断为晚期。当存在时,症状可能包括腹部或盆腔疼痛、腹部腹胀或肿胀,进食时迅速感到饱腹或其他消化问题。绒毛膜癌(Choriocarcinoma)可以作为从生殖细胞发育而来的原发性卵巢肿瘤发生,尽管它通常是转移到卵巢的妊娠疾病。成熟畸胎瘤(Mature teratomas)或皮样囊肿(dermoid cysts)是罕见的肿瘤,主要由绝经后发展的良性组织组成。胚胎癌(Embryonal carcinomas)是一种罕见的肿瘤类型,通常见于混合型肿瘤,直接从生殖细胞发育而来,但不是终末分化的;在极少数情况下,它们可能在发育不良的性腺中发育。它们可以进一步发展成各种其他肿瘤,包括绒毛膜癌、卵黄囊肿瘤及畸胎瘤。原发性卵巢鳞状细胞癌(Primary ovarian squamouscell carcinomas)很少见,晚期预后较差。更典型地,卵巢鳞状细胞癌是宫颈转移、子宫内膜样肿瘤中的分化区域、或源自成熟的畸胎瘤。
在一些其他实施例中,本公开的方法、试剂盒及组合物可适用于肝癌。应进一步理解的是,本发明还包括阻止肝源性转移的任何组织、器官或腔、以及在肝组织中具有任何起源转移的任何癌症状况。肝癌,也称为肝癌及原发性肝癌,是从肝脏开始的癌症。从其他地方传播到肝脏的癌症,称为肝转移,比从肝脏开始的癌症更常见。肝癌的症状可能包括肋骨下方右侧肿块或疼痛、腹部肿胀、皮肤发黄、容易瘀伤、体重减轻及虚弱。
肝癌的主要原因是乙型肝炎、丙型肝炎或酒精引起的肝硬化。其他原因包括黄曲霉毒素、非酒精性脂肪肝及肝吸虫病。最常见的类型是肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC),占80%的病例及胆管癌(cholangiocarcinoma)。较少见的类型包括粘液性囊性肿瘤(mucinous cystic neoplasm)及导管内乳头状胆管肿瘤(intraductalpapillary biliary neoplasm)。诊断可以通过血液检查及医学成像来支持,并通过组织活组织检查来确认。如本文所用,HCC是成人中最常见的原发性肝癌类型,并且是肝硬化患者中最常见的死亡原因。它发生在慢性肝炎的情况下,与慢性病毒性肝炎感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或暴露于毒素如酒精或黄曲霉毒素最密切相关。某些疾病,如血色素沉着症、糖尿病及α1-抗胰蛋白酶缺乏症,显着增加了发生HCC的风险。代谢综合征及NASH也越来越被认为是HCC的危险因素。
胆管癌(Cholangiocarcinoma),也称为胆管癌,是一种在胆管中形成的癌症。胆管癌的症状可能包括腹痛、皮肤淡黄色、体重减轻、全身瘙痒及发烧。浅色大便或深色尿液也可能发生。其他胆道癌包括胆囊癌(gallbladder cancer)及壶腹癌(cancer of theampulla of Vater)。胆管癌的危险因素包括原发性硬化性胆管炎(胆管炎性疾病)、溃疡性结肠炎、肝硬化、丙型肝炎、乙型肝炎、某些肝吸虫感染及一些先天性肝畸形。根据血液检查、医学成像、内窥镜检查以及有时手术探查的组合怀疑诊断。通过在显微镜下检查来自肿瘤的细胞来确认所述疾病。它通常是腺癌(形成腺体或分泌粘蛋白的癌症)。
在其他实施例中,本公开的方法、试剂盒及组合物可适用于胰腺癌(pancreaticcancer)。应进一步理解的是,本发明还包括阻止胰腺转移的任何组织、器官或腔、以及在胰腺中具有任何起源转移的任何癌症状况。当胰腺中的细胞(胃后面的腺体器官)开始失去控制并形成肿块时,就会出现胰腺癌(Pancreatic cancer)。有许多类型的胰腺癌。最常见的胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma)约占病例的90%。这些腺癌始于产生消化酶的胰腺部分。共同代表大多数非腺癌的几种其他类型的癌症也可以来自这些细胞。1-2%的胰腺癌病例是神经内分泌肿瘤,其起源于胰腺的激素产生细胞。这些通常不如胰腺癌具有侵袭性。
最常见形式的胰腺癌的体征及症状可能包括黄色皮肤、腹部或背部疼痛、不明原因的体重减轻、浅色粪便、黑色尿液及食欲不振。在疾病的早期阶段通常没有症状,并且特异性足以表示出胰腺癌的症状通常在疾病达到晚期之前不会发展。到诊断时,胰腺癌常常扩散到身体的其他部位。
胰腺癌很少发生在40岁以前,超过一半的胰腺癌发生在70岁以上的人群中。胰腺癌的危险因素包括吸烟、肥胖、糖尿病及某些罕见的遗传疾病。胰腺癌通常通过医学成像技术的组合来诊断,例如超声或计算机断层扫描、血液检查及组织样品检查(活组织检查)。
应当理解,本公开的方法、组合物及试剂盒适用于本文讨论的任何恶性病症或其任何转移的任何类型及/或阶段及/或等级。更进一步,必须理解的是,本发明的方法、组合物及试剂盒可以适用于侵入性以及非侵入性癌症。当提及“非侵入性”癌症时,应为不会生长到主要位置内或之外的正常组织中或侵入正常组织的癌症。当提到“侵袭性癌症”时,应为侵入并在正常、健康的邻近组织中生长的癌症。
更进一步,在一些实施例中,本公开的方法、组合物及试剂盒适用于本文公开的任何转移、转移性癌症或任何癌性病症的状态的任何类型及/或阶段及/或等级。
如本文所用,术语“转移性癌症”或“转移状态”是指已经从其最初开始的位置(原发性癌症)扩散到体内另一个位置的癌症。由使用血液及/或淋巴系统扩散的源自原发性肿瘤或其他转移性肿瘤的转移性癌细胞形成的肿瘤在本文中称为转移性肿瘤或转移。
可在本发明中找到用途的其他恶性肿瘤可包括但不限于血液恶性肿瘤(hematological malignancies)(包括淋巴瘤、白血病、骨髓增殖性疾病、急性淋巴细胞白血病;急性髓性白血病)、发育不良及再生疾病性贫血(aplastic anemia)(病毒诱导及特发性(idiopathic))、骨髓增生异常综合征,所有类型的副肿瘤综合征(paraneoplasticsyndromes)(包括免疫介导及特发性)及实体瘤(包括胃肠道、结肠、肺、肝、乳腺、前列腺、胰腺及卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma))。本发明也可用于治疗或抑制实体瘤,例如位于以下位置的肿瘤:唇及口腔、咽、喉、鼻旁窦、主要唾液腺、甲状腺、食道、胃、小肠、结肠、结直肠、肛管、肝脏、胆囊、脂肪外胆管(extraliepatic bile ducts,)、壶腹(ampulla of vater)、外分泌胰腺、肺、胸膜间皮瘤(pleural mesothelioma)、骨、软组织肉瘤,或位于以下位置的癌(carcinoma)及恶性黑色素瘤(malignant melanoma):皮肤、乳腺、外阴、阴道、子宫颈、子宫体、卵巢、输卵管(fallopian tube)、妊娠滋养细胞肿瘤(gestational trophoblastictumors)、阴茎、前列腺、睾丸、肾、肾盂、输尿管、膀胱、尿道,或眼睑癌(carcinoma of theeyelid),或或结膜癌(carcinoma of the conjunctiva),或结膜恶性黑色素瘤(malignantmelanoma of the conjunctiva),或葡萄膜恶性黑色素瘤(malignant melanoma of theuvea),或视网膜母细胞瘤(retinoblastoma),或泪腺癌(carcinoma of the lacrimalgland),或眼眶肉瘤(sarcoma of the orbit)、脑、脊髓、血管系统、血管肉瘤、肾上腺皮质癌(Adrenocortical carcinoma);艾滋病相关癌症(AIDS-related lymphoma);艾滋病相关淋巴瘤(Anal cancer);肛门癌;阑尾癌;星形细胞瘤(Astrocytoma),儿童小脑或大脑(childhood cerebellar or cerebral);基底细胞癌(Basal cell carcinoma);胆管癌(Bile duct cancer),肝外(extrahepatic);膀胱癌(Bladder cancer);骨癌,骨肉瘤(Osteosarcoma)/恶性纤维组织细胞瘤(Malignant fibrous histiocytoma);脑干胶质瘤(Brainstem glioma);脑肿瘤(Brain tumor);脑肿瘤(Brain tumor),小脑星形细胞瘤(cerebellar astrocytoma);脑肿瘤(Brain tumor),脑星形细胞瘤(cerebralastrocytoma)/恶性胶质瘤(malignant glioma);脑肿瘤,室管膜瘤(ependymoma);脑肿瘤,成神经管细胞瘤(medulloblastoma);脑肿瘤,幕上原始神经外胚层肿瘤(supratentorialprimitive neuroectodermal tumors);脑肿瘤,视觉通路及下丘脑胶质瘤(visualpathway and hypothalamic glioma);乳腺癌;支气管腺瘤/类癌(Bronchial adenomas/carcinoids);伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma);类癌肿瘤(Carcinoid tumor),儿童(childhood);类癌肿瘤,胃肠道(gastrointestinal);不明原发癌(Carcinoma of unknownprimary);中枢神经系统淋巴瘤(Central nervous system lymphoma),原发性;小脑星形细胞瘤(Cerebellar astrocytoma),儿童;脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤(Cerebellarastrocytoma),儿童(childhood);宫颈癌;儿童癌症;慢性淋巴细胞白血病(Chroniclymphocytic leukemia);慢性粒细胞白血病;慢性骨髓增生性疾病;结肠癌;皮肤T细胞淋巴瘤(Cutaneous T-cell lymphoma);促纤维增生性小圆细胞瘤(Desmoplastic smallround cell tumor);子宫内膜癌(Endometrial cancer);室管膜瘤;食管癌;尤因家族肿瘤中的尤因肉瘤;颅外生殖细胞肿瘤,儿童;性腺外生殖细胞肿瘤;肝外胆管癌;眼癌,眼内黑色素瘤(Intraocular melanoma);眼癌,视网膜母细胞瘤(Retinoblastoma;Gallbladdercancer);胆囊癌;胃(胃)癌;胃肠类癌;胃肠道间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST);生殖细胞肿瘤:颅外(extracranial),性腺外(extragonadal)或卵巢;妊娠滋养细胞肿瘤(Gestational trophoblastic tumor);脑干胶质瘤(Glioma of the brain stem);胶质瘤(Glioma),儿童脑星形细胞瘤(Childhood Cerebral Astrocytoma);胶质瘤(Glioma),儿童视觉通路及下丘脑(Childhood Visual Pathway and Hypothalamic);胃类癌;毛细胞白血病(Hairy cell leukemia);头颈部癌症;心脏癌;肝细胞癌(肝癌);霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma);下咽癌(Hypopharyngeal cancer);下丘脑及视觉通路胶质瘤(Hypothalamic and visual pathway glioma),儿童;眼内黑色素瘤(IntraocularMelanoma);胰岛细胞癌(内分泌胰腺);卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma);肾癌(肾细胞癌);喉癌;白血病;白血病,急性淋巴细胞白血病(也称为急性淋巴细胞白血病);白血病,急性髓性白血病(也称为急性骨髓性白血病);白血病,慢性淋巴细胞(也称为慢性淋巴细胞白血病);白血病,慢性粒细胞白血病(也称为慢性粒细胞白血病);白血病,毛细胞;唇癌及口腔癌;肝癌(原发性);肺癌,非小细胞;肺癌,小细胞;淋巴瘤;淋巴瘤,艾滋病相关;淋巴瘤,伯基特(Burkitt);淋巴瘤,皮肤T细胞;淋巴瘤,霍奇金(Hodgkin);淋巴瘤,非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin)(霍奇金除外的所有淋巴瘤的旧分类);淋巴瘤,原发性中枢神经系统(PrimaryCentral Nervous System);Marcus Whittle,致命的疾病;巨球蛋白血症(Macroglobulinemia),Waldenstrom;骨/骨肉瘤恶性纤维组织细胞瘤(Malignant FibrousHistiocytoma of Bone/Osteosarcoma);髓母细胞瘤(Medulloblastoma),儿童;黑色素瘤(Melanoma);黑色素瘤(Melanoma),眼内(Intraocular)(眼);默克尔细胞癌(Merkel CellCarcinoma);间皮瘤(Mesothelioma),成人恶性(Adult Malignant);间皮瘤(Mesothelioma),儿童;隐匿性原发性转移性鳞状颈癌(Metastatic Squamous NeckCancer with Occult Primary);口腔癌;儿童多发性内分泌肿瘤综合征(MultipleEndocrine Neoplasia Syndrome);多发性骨髓瘤/浆细胞瘤(Multiple Myeloma/PlasmaCell Neoplasm);蕈样霉菌病(Mycosis Fungoides);骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndromes);骨髓增生异常/骨髓增生性疾病(Myelodysplastic/Myeloproliferative Diseases);骨髓性白血病(Myelogenous Leukemia),慢性;髓系白血病(Myeloid Leukemia),成人急性;髓系白血病(Myeloid Leukemia),儿童急性;骨髓瘤,多发性(骨髓癌);骨髓增生性疾病(Myeloproliferative Disorders),慢性;鼻腔及鼻旁窦癌;鼻咽癌;神经母细胞瘤;非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin lymphoma);非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer);口腔癌;口咽癌;骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤;卵巢癌;卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤);卵巢生殖细胞肿瘤;卵巢低恶性潜能肿瘤(Ovarian lowmalignant potential tumor);胰腺癌;胰腺癌,胰岛细胞;鼻旁窦及鼻腔癌(Paranasalsinus and nasal cavity cancer);甲状旁腺癌;阴茎癌;咽癌;嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma);松果体星形细胞瘤(Pineal astrocytoma);松果体生殖细胞瘤(Pineal germinoma);松果母细胞瘤及幕上原始神经外胚层肿瘤(Pineoblastoma andsupratentorial primitive neuroectodermal tumors),儿童;垂体腺瘤(Pituitaryadenoma);浆细胞瘤形成/多发性骨髓瘤(Plasma cell neoplasia/Multiple myeloma);胸膜肺母细胞瘤(Pleuropulmonary blastoma);原发性中枢神经系统淋巴瘤(Primarycentral nervous system lymphoma);前列腺癌;直肠癌;肾细胞癌(肾癌);肾盂及输尿管,转移细胞癌;视网膜母细胞瘤;横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma),儿童;唾液腺癌;肉瘤,尤因家族肿瘤(Ewing family of tumors);肉瘤,卡波西;肉瘤,软组织;肉瘤,子宫;塞扎里综合征(Sezary syndrome);皮肤癌(非黑色素瘤(nonmelanoma));皮肤癌(黑色素瘤(melanoma));皮肤癌,默克尔细胞(Merkel cell);小细胞肺癌;小肠癌;软组织肉瘤;鳞状细胞癌-见皮肤癌(非黑色素瘤);鳞状颈癌,隐匿性原发性,转移性;胃癌;幕上原始神经外胚层肿瘤,儿童;T细胞淋巴瘤,皮肤(蕈样真菌病及Sezary综合征);睾丸癌;喉癌;胸腺瘤,儿童;胸腺瘤及胸腺癌;甲状腺癌;甲状腺癌,儿童;肾盂及输尿管移行细胞癌;滋养细胞肿瘤,妊娠;原发部位不明,成人癌;未知的原发部位,儿童癌症;输尿管及肾盂,转移细胞癌;尿道癌;子宫癌,子宫内膜;子宫肉瘤;阴道癌;视觉通路及下丘脑胶质瘤(Visual pathwayand hypothalamic glioma),儿童;外阴癌;Waldenstrom巨球蛋白血症及Wilms肿瘤(肾癌)。
在一些进一步的实施例中,本发明的方法可以进一步包括施用能够直接或间接增加本发明的至少一mTOR激动剂的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的药物,特别是芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸及/或酪氨酸。在一些实施例中,此类化合物可以与本发明的至少一芳香族氨基酸残基一起施用,特别是苯丙氨酸、色氨酸及/或酪氨酸。在一些替代实施例中,所述化合物可以作为唯一的治疗性或非治疗性化合物施用以直接或间接增加本发明的至少一mTOR激动剂的水平、稳定性及生物利用度中的至少一者。
在一些特定及非限制性实施例中,此类化合物可以是例如尼替尼酮(Nitisinone),其是FDA批准的药物,用于1型遗传性高酪氨酸血症(HereditaryHypertyrosinemia Type-1)。更具体而言,尼替辛酮(Nitisinone,INN),也称为NTBC(其完整化学名称的缩写)是FDA批准的药物,用于减缓1型遗传性高酪氨酸血症(HT-1)的作用。它用于所有年龄段的患者,并结合饮食中酪氨酸及苯丙氨酸的限制。除了提高酪氨酸(Y)水平-通过抑制其代谢,药物还增加苯丙氨酸(F)的水平。尼替尼酮的作用机制涉及4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(4-Hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,HPPD)的可逆抑制。它可以防止形成马来酰乙酰乙酸(maleylacetoacetic acid)及富马酰乙酰乙酸(fumarylacetoacetic acid),它们有可能转化为琥珀酰丙酮(succinyl acetone),这是一种损害肝脏及肾脏的毒素。
尼替尼酮具有以下化学结构,如式X所示:
尼替尼酮的系统(IUPAC)名称是2-[2-硝基-4-(三氟甲基)苯甲酰基]环己烷-1,3-二酮(Nitisinone is2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]cyclohexane-1,3-dione)(C14H10F3NO5;CAS号:104206-65-7)。上述尼替尼酮形式的分子量为329.228g/mol。
如上所述,适用于治疗本发明公开的任何癌症病症的本公开方法可以使用本文公开的包含至少一个、至少两个或全部三个芳香族氨基酸残基的任何mTOR激动剂,具体地,(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及/或其任何组合或混合物,可选地以第一剂型的形式,(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物,可选地以第二剂型的形式,及(c)至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,可选地以第三剂型的形式。应当理解,在一些实施例中,任何衍生物或任何本文公开的任何芳香族氨基酸残基的模拟形式可以用于本公开的本激动剂、组合物、试剂盒、方法及用途。然而,在一些实施例中,只要所述衍生物不是氟化芳香族氨基酸残基,则可以使用任何衍生物。在一些实施例中,只要色氨酸衍生物不是氟化色氨酸(更具体而言,L-(4-F)-Trp),任何色氨酸衍生物都可以用于本公开的mTOR激动剂、组合物、试剂盒及方法。在一些进一步的具体实施例中,任何色氨酸衍生物都可以用于本公开的mTOR激动剂、组合物、试剂盒及方法,其中色氨酸衍生物不是氟化色氨酸,特别是(6-F)-Trp或(5-F)-Trp中的任何一者。在一些进一步的实施例中,本公开的mTOR激动剂、组合物、试剂盒及方法可以使用任何酪氨酸衍生物,其中所述酪氨酸衍生物不是氟化酪氨酸,特别是m-FTyr。更进一步,在一些实施例中,任何苯丙氨酸衍生物可以用于本公开的蛋白酶体易位及/或mTOR激动剂、组合物、试剂盒及方法的选择性抑制剂,其中苯丙氨酸衍生物不是氟化苯丙氨酸、o-FPhe、o-p-FPhe中的一者。
在一些进一步的实施例中,本公开的mTOR激动剂、组合物、试剂盒及方法可以用于任何芳香族氨基酸衍生物,其中所述衍生物不是3,5-二氯-O-[(2-苯基)-苯并恶唑-1-7-基]甲基-1-酪氨酸甲酯盐酸盐(3,5-Dichloro-O-[(2-phenyl)-benzoxazo1-7-yl]methyl-L-tyrosine methyl ester hydrochloride)。此外,本公开的mTOR激动剂、组合物、试剂盒及方法可以使用任何芳香族氨基酸衍生物,其中所述衍生物不是3-(2-萘氧基)-1-苯丙氨酸(3-(2-naphthyloxy)-L-phenylalanine)。应当理解,本文讨论的附带条件可以在一些实施例中适用于本公开的任何方面,具体地,适用于本公开的mTOR激动剂、组合物、试剂盒及方法中的任何一者。
本发明的另一方面涉及用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟至少一mTOR激动剂的有效量或在一些实施例中的治疗有效量至少一涉及至少一短期细胞压力状况/过程的病理性疾病。更具体而言,本文使用的任何mTOR激动剂可包含至少一芳香族氨基酸残基、其任何mTOR激动剂模拟物、其任何盐或酯、至少一芳香族氨基酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、及/或mTOR激动性芳香族氨基酸残基模拟物、直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物、其任何组合或混合物、其任何剂型、包含本公开的至少一mTOR激动剂的任何组合物或试剂盒。
如上所述,在上述本发明的方法、组合物及试剂盒的背景下详述的mTOR激动剂与用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟至少一涉及至少一短期细胞压力状况/过程的病理性疾病。
应理解的是,如本文所用,术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”意指在患有病理病症的受试者中预防、改善或延迟疾病活动的一种或多种临床适应症的进展。治疗是指治疗性治疗。那些需要治疗的是患有病理性疾病的受试者。具体而言,提供“预防性治疗(preventive treatment)”(以预防)或“预防性治疗(prophylactictreatment)”以保护性方式起作用,以防御或预防某些事情,特别是病症或疾病。本文所用的术语“治疗或预防(treatment or prevention)”是指对受试者施用的完整范围的积极治疗效果,包括抑制、减少、减轻及缓解与至少一短期细胞应激状况有关的病理疾病/过程及任何相关的状况、疾病、症状、不良副作用或相关疾病。更具体而言,治疗或预防疾病的复发或复发包括预防或推迟疾病的发展、预防或推迟症状的发展及/或减少将要或预期的这些症状的严重程度发展。这些还包括改善现有症状,预防-额外症状及改善或预防症状的潜在代谢原因。应当理解,本文所述的术语“抑制(inhibition)”、“缓减(moderation)”、“减少(reduction)”、“下降(decrease)”或“衰减(attenuation)”涉及过程的延迟、抑制或减少约1%,具体而言,约1%至约5%,约5%至10%,约10%至15%,约15%至20%,约20%至25%,约25%至30%,约30%至35%,约35%至40%,约40%至45%,约45%至50%,约50%至55%,约55%至60%,约60%至65%,约65%至70%,约75%至80%,约80%至85%约85%至90%,约90%至95%,约95%至99%,或约99%至99.9%,100%或更多。
关于上述内容,应当理解,其中例如10%、50%、120%、500%等的百分比值可以与“倍数变化”值互换,即0.1、0.5、1.2、5等。
本文所述的术语“改善(amelioration)”涉及由根据本发明的组合物及方法引起的症状的减轻及受试者状况的改善,其中所述改善可以表现为抑制与本文所述病症相关的病理过程的形式,其量级显着降低,或患病受试者生理状态的改善。
术语“抑制(inhibit)”及所述术语的所有变体旨在包括限制或禁止病理症状的进展及恶化或病理过程进展,所述病理过程症状或过程与之相关。
术语“消除(eliminate)”涉及根据本文所述的本发明方法可选地实质性根除或消除病理症状及可能的病理病因学。
术语“延迟(delay)”、“延迟进展(delaying the onset)”、“延迟(retard)”及其所有变体旨在包括减缓与至少一种短期细胞应激状况/过程相关的病症的进展和/或恶化及其症状,减缓它们的进展、进一步恶化或发展,以便比没有根据本发明的治疗更晚出现。
如上所述,本发明提供的方法及组合物可用于治疗“病理性病症(pathologicaldisorder)”,即涉及至少一短期细胞压力病症/过程的病理性病症或病症,其是指其中存在正常功能疾病的病症、身体或心灵的任何异常情况,导致受影响的人或与所述人接触的人不适、功能疾病或痛苦。应所注意的是,术语“疾病(disease)”、“病症(disorder)”、“病症(condition)”及“疾病(illness)”在本文中等同地使用。
应当理解,本发明描述的任何方法、试剂盒及组合物可适用于治疗及/或改善本文公开的任何病症或与之相关的任何病症。应当理解,当涉及本文的病理学时,可互换使用的术语“相关联(associated)”、“相关(linked)”及“相关(related)”是指疾病、病症、病症或任何病症,具有其中的至少一者:共同因果关系,以高于巧合的频率共存,或至少一疾病、病症或病理学导致第二种疾病、病症、病情或病理。更具体而言,如本文所用,“疾病(disease,disorder)”、“病症(condition)”、“病理学(pathology)”等与受试者的健康有关,可以互换使用,并且具有归因于每个及所有这些术语的含义。
在其又一些方面,本公开提供了具有进一步治疗及非治疗应用的体内及体外调节方法。这种调节方法的非治疗应用可以包括本发明的mTOR激动剂的化妆品及农业用途。
更具体而言,在其另一方面,本公开涉及用于调节与至少一细胞及/或受试者中的蛋白酶体动力学直接或间接相关的生物过程的方法。根据一些实施例,所述方法包括使至少一细胞接触及/或向受试者施用治疗有效量的至少一包含至少一芳香族氨基酸残基的mTOR激动剂、其任何mTOR激动剂模拟物,任何盐或酯、至少一芳香族氨基酸残基及/或mTOR激动性芳香族氨基酸残基模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物、其任何组合或混合物、其任何载体、基质、纳米或微粒、其任何组合或混合物、其任何载体、基质、纳米或微粒、其任何剂型或包含本公开的至少一mTOR激动剂的任何组合物或试剂盒。
在一些更具体的实施例中,通过本公开提供的方法使用的mTOR激动剂可以包含至少一芳香族氨基酸残基或至少两个芳香族氨基酸残基或其任何模拟物的组合,或任何直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒。在一些具体实施例中,本文公开的方法中的mTOR激动剂可包含以下组分中的至少一者。第一组分(a)包含至少一酪氨酸(Y)残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其组合或混合物,可选地以一剂型的形式。mTOR激动剂可以在一些实施例中可选地或另外地包含,作为第二组分(b),至少一色氨酸(W)残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基及/或mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物,可选地以一剂型的形式。在一些进一步的实施例中,本发明的mTOR激动剂可以可选地或另外地包含作为第三组分(c)的至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,应理解,Y及W或Y及F或W及F的任何组合也包括在所公开的方法中。
更进一步,在一些具体实施例中,本公开方法使用的mTOR激动剂可包含以下三种组分的组合:(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、任何盐或其酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。本发明的mTOR激动剂还包括(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物。本公开方法的mTOR激动剂还包括(c)至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。应注意的是,在一些实施例中,当配制成本发明的方法时,至少一个、两个或全部三个芳香族氨基酸残基Y、W、F或其任何模拟物及其任何组合可以用于本发明的方法一种或多种剂量单位形式。
在一些实施例中,其中本公开的方法涉及调节与至少一细胞中的蛋白酶体动力学直接或间接相关联的生物过程,所述至少一细胞可以经受或可能经历氨基酸剥夺、氨基酸饥饿、氨基酸消耗、氨基酸去降解或氨基酸限制。更具体而言,可以向细胞提供不含或具有最少量的所有20个氨基酸的生长培养基。
在又一些其他实施例中,当本公开的方法涉及调节与受试者中的蛋白酶体动力学直接或间接相关联的生物过程时,被治疗的受试者可能受到氨基酸的饮食限制及/或已经受到氨基酸的饮食限制,特别是消耗,或限制所有20种氨基酸,或至少限制必需氨基酸,例如苯丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸和组氨酸中的至少一者。如上所述,可以向治疗对象提供低蛋白或无蛋白饮食方案。
如以下实施例所示,通过本发明的mTOR激动剂调节细胞中的蛋白酶体动力学,控制细胞存活,并且可以成功地用于癌症治疗。然而,这种调节作用也可用于调节及改变肌肉质量。
因此,以目前方面而言,本发明提供了至少一mTOR激动剂,具体地为至少一芳香族氨基酸残基或其任何组合,具体地为Y、W及/或F中至少一者,以用于通过增加细胞及/或受试者中的mTOR活性来调节蛋白酶体动力学。本文使用这种调节来增加肌肉质量、增加肌肉合成代谢、或治疗涉及骨骼肌萎缩的疾病或病症。在这方面,肌肉萎缩或萎缩可能是遗传性的,也可能是由全身性疾病引起的,如癌症或败血症或肾功能不全。
更具体而言,在一些实施例中,本文公开的至少一芳香族氨基酸残基或其任何组合可用于本文公开的方法中以促进肌肉合成代谢、改善肌肉功能、增加肌肉质量、逆转肌肉萎缩或预防肌肉萎缩。在一些实施例中,本发明的mTOR激动剂可适用于以肌肉萎缩为特征的病症的治疗方法,所述病症可以是衰老、骨折、虚弱、恶病质、去神经支配(denervation)、糖尿病、营养不良、运动引起的骨骼肌疲劳、疲劳、虚弱(frailty)、不动(immobilization)、炎性肌炎、营养不良、代谢综合征、神经肌肉疾病、肥胖、术后肌肉无力、创伤后肌肉无力、肌肉减少症及毒素暴露中的任何一者。
在一些实施例中,本公开的方法可用于逆转肌肉萎缩(reverse muscle atrophy)或预防由于骨折、严重烧伤、脊柱损伤、截肢、退行性疾病、恢复需要卧床休息的病症(对于受试者而言,留在重症监护病房,或长期住院)引起的肌肉萎缩(muscle atrophy)。如本文所用,术语“卧床休息”是指受试者被限制或医生要求在床上、坐着及/或躺下每天至少80%的至少3天。此处使用的术语“长期住院”是指在医院或其他医疗保健机构中至少停留五天。
此外,本发明的方法可用于预防或逆转心肌萎缩(例如,当受试者正在或已经患有心脏病、充血性心力衰竭、心脏移植、心脏瓣膜修复、动脉粥样硬化、其他主要血液疾病时)血管或缺血性疾病、以及心脏搭桥手术(heart bypass surgery)。
在本文公开的方法的一些进一步实施例中,受试者患有已知与恶病质相关的疾病或病症,例如来自癌症、病毒感染、特别是艾滋病(HIV感染)、SARS(SARS-CoV感染))及COVID19(SARS-CoV2感染)、慢性心力衰竭、COPD、类风湿性关节炎、肝病、肾病及创伤。在一些实施例中,受试者患有已知与吸收不良有关的疾病或病症。在一些实施例中,这种吸收不良疾病或病症可以是克罗恩病(Crohn's disease)、肠易激综合征(irritable bowel syndrome)、乳糜泻(celiac disease)及囊性纤维化(cystic fibrosis)中的任何一者。在一些实施例中,本公开的方法适用于患有营养不良、肌肉减少症、肌肉去神经支配、肌营养不良症、炎性肌病、脊髓肌萎缩、ALS或重症肌无力的受试者。
更具体而言,肌肉萎缩(Muscular atrophy)是由不动(immobility)、衰老、营养不良、药物或影响肌肉骨骼或神经系统的各种损伤或疾病引起的骨骼肌质量损失。肌肉萎缩导致肌肉无力并导致残疾。肌肉萎缩(Muscular atrophy)会导致快速的肌肉萎缩,并且通常发生在需要固定肢体或卧床休息的受伤或疾病期间。根据肌肉萎缩的持续时间及个体的健康状况,这可以通过活动完全逆转。营养不良首先导致脂肪减少,但可能在长期饥饿中发展为肌肉萎缩,并且可以通过营养疗法逆转。相反地,恶病质(cachexia)是由潜在疾病(例如癌症)引起的消耗性综合征,其引起显着的肌肉萎缩并且不能通过营养疗法完全逆转。肌肉减少症是与衰老相关的肌肉萎缩,可以通过运动减慢。最后,例如肌营养不良或肌病的肌肉疾病可引起萎缩、以及对神经系统的损害,例如脊髓损伤或中风。
肌肉萎缩是由蛋白质合成及蛋白质降解之间的不平衡引起的,尽管其机制因原因而异。肌肉损失可以通过高级影像学研究进行量化。治疗取决于根本原因,但通常包括运动及充足的营养。合成代谢剂可能具有一些功效,但由于副作用而不经常使用。更进一步,在一些实施例中,患有与肌肉萎缩相关的疾病、病症或症状的受试者是由于疾病、病症或症状而骨骼肌质量减少至少5%的受试者。在一些实施例中,这样的受试者可以显示骨骼肌质量减少至少约5%、8%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%,25%,26%,27%,28%,29%,30%,31%,32%,33%,34%,35%,36%,37%,38%,39%,40%,41%%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%或更多的疾病、病症或症状的结果。在一些实施例中,患有与肌肉萎缩相关的疾病、病症或症状的受试者是肌肉重量相对于体重比降低至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少15%、至少16%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、或至少40%或更多的疾病、病症或症状的结果。
在一些实施例中,增加mTOR活化/活性并由此增加本文所述的蛋白酶体核定位的任何方法可用于增加骨骼肌质量。还有,如本文所用,“增加骨骼肌质量”是指骨骼肌质量在统计学上显着增加。在各个方面的一些实施例中,增加骨骼肌质量是指骨骼肌损失的逆转。在各个方面的一些实施方案中,相对于在使骨骼肌与本发明的一个或多个mTOR激动剂(特别是酪氨酸、色氨酸和/或苯丙氨酸中的至少一种、其任何模拟物或组合物)接触之前的骨骼肌质量,增加骨骼肌质量是指骨骼肌质量增加至少5%、至少7%、至少12%、至少15%、至少18%、至少20%、至少21%、至少25%、至少27%、至少30%、至少33%或更多,及/或施用受试者。在一些实施例中,增加的骨骼肌质量是指受试者的骨骼肌质量增加到在与肌肉相关的疾病、病症或症状相关联的骨骼肌萎缩的发作、或肌肉萎缩本身的发作前的骨骼肌的35%以内、33%以内、30%以内、28%以内、24%以内、22%以内、18%以内、15%以内%、12%以内、10%以内、9%以内、8%以内、7%以内、6%以内、至少5%或更多的增加。
因此,本公开提供了增加骨骼肌质量的治疗及非治疗方法,包括使骨骼肌或骨骼肌细胞与本发明的至少一mTOR激动剂接触,所述至少一mTOR激动剂特别是酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸中的至少一者、或其任何模拟物、或其组合及组合物。
在一些实施例中,本发明的mTOR激动剂刺激骨骼肌或骨骼肌细胞中的mTOR活化及相关的蛋白酶体核定位,从而促进骨骼肌合成代谢及增加骨骼肌质量。
在一些进一步的实施例中,本公开提供了增加受试者骨骼肌质量的方法,包括向受试者施用本发明的所述数个mTOR激动剂中的一者或多者的一有效量,所述数个mTOR激动剂具体地为至少一酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸中的至少一者、或其任何模拟物、或包含至少一酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸或其任何模拟物的一组合物的一有效量,可选地以至少一剂型的形式。在一些实施例中,酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸中的至少一者或其任何模拟物刺激mTOR活化及相关的蛋白酶体核定位受试者,从而促进骨骼肌合成代谢并增加受试者的骨骼肌质量。
如本文所述,增加骨骼肌质量的方法可导致肌肉与脂肪比率的增加。因此,本文公开的方法可具有额外的及非治疗性的应用,例如化妆品及/或农业用途。
更具体而言,在一些实施例中,增加骨骼肌质量的方法用于农业目的,具体地,用于增加非人类动物(如牲畜、鱼、家禽或昆虫)的骨骼肌质量(或增加肌肉与脂肪的比例)。在这些实施例中,本发明的每种mTOR激动剂(具体地为至少一芳香族氨基酸残基,更具体地为Y、W及/或F中的至少一者及其任何模拟物)可以作为一添加剂施用,以作为非人类动物的饲料、用作宠物及食品工业。
如本文所用,术语“非人类动物”包括任何生物体,特别是所有脊椎动物、任何非哺乳动物生物体(例如鱼、鸡、两栖动物、爬行动物及昆虫)及哺乳动物(例如家养及/或农业上有用的动物的非人类灵长类动物,例如绵羊、狗、猫、牛、猪等)。如本文所用,术语“牲畜”是指任何养殖动物。优选地,牲畜是反刍动物、单胃动物中的一者或多者,反刍动物例如为牛(cattle)(例如,牛(cows)或公牛(bulls)(包括犊牛(calves))),单胃动物例如为家禽(包括肉鸡(broilers)、鸡(chickens)及火鸡(turkeys))、猪(pigs)(包括仔猪(piglets))、鸟类或绵羊(包括羔羊)。
如上所述,在一些实施例中,本公开进一步提供化妆品非治疗方法。例如,使用调节蛋白酶体动力学并导致主要蛋白酶体核定位的mTOR激动剂的本发明方法可用于增加对这种美容干预或程序感兴趣的受试者的肌肉质量。在一些实施例中,本文提供的芳香族氨基酸残基及其任何组合可可选地在运动后用于增加强度及/或增加肌肉质量。在这方面,根据本文讨论的方法的一些实施例,每个氨基酸残基可以存在于饮料或营养棒或可被受试者消耗的如上所述的任何添加物组合物中。
在本发明的治疗性或非治疗性方法的一些特定实施例中,本发明的mTOR激动剂(具体地为芳香族氨基酸残基Y、W及/或F中的任何一者)可以施用于这些特定氨基酸残基耗尽或饥饿的受试者。在一些实施例中,这样的受试者可以是禁食的受试者。在一些替代实施例中,本发明的mTOR激动剂(具体地为芳香族氨基酸残基Y、W及/或F中的任何一者)可以施用于未耗尽或缺乏这些特定氨基酸残基的受试者。例如,喂食受试者(fed subject)。如本文所用,术语“禁食受试者(fasted subject)”是指在施用本发明方法中使用的至少一种或所有mTOR激动剂之前1、2、3、4、5、6、7或8小时内未进食的受试者。在某些实施方案中,“禁食受试者”在施用本公开方法中使用的最后一种mTOR激动剂后的1、2、3、4、5、6、7或8小时内也不进食。
应当理解,本公开内容还包括用于调节细胞及/或需要其的受试者中的蛋白酶体动力学的方法、组合物及试剂盒。因此,本公开内容还包括可以在体内、体外或离体进行的调节方法。在一些实施例中,本公开的方法可以包括使细胞或受试者中的至少一细胞与一调节有效量的本发明的mTOR激动剂或其任何组合物、组合或试剂盒接触的步骤。如本文所用,“调节”是指引起或促进感兴趣的分子、过程、途径或现象的定性或定量变化、改变或修饰。例如,蛋白酶体的细胞定位。不受限地,此类变化可以是细胞核或细胞溶质蛋白酶体定位特征的增加、减少、变化,或过程、途径或现象的不同组分或分支的相对强度或活性的变化。
在一些进一步的实施例中,本发明的mTOR激动剂及其任何组合、组合物、试剂盒及方法增加细胞中的蛋白酶体核定位。如本文所用,“增加(increasing)”、“增加(increased)”、“增加(increase)”、“刺激(stimulate)”、“增强(enhance)”或“激活(activate)”通常在本文中用于表示增加统计上显着的量;为了避免任何疑问,与蛋白酶体核定位的参考水平相比,“增加(increasing)”、“增加(increased)”、“增加(increase)”、“刺激(stimulate)”、“增强(enhance)”或“激活(activate)”一词意味着增加至少10%。例如,与参考水平相比,增加至少约20%,或至少约30%,或至少约40%,或至少约50%,或至少约60%,或至少约70%,或至少约80%,或至少约90%或更多,并且包括与参考水平相比的100%增加或10-100%之间的任何增加,或与蛋白酶体核定位的参考水平相比的至少约2倍,或至少约3倍,或至少约4倍,至少约5倍或至少约10倍增加,或2倍至10倍或更多的任何增加。
如上所述,本发明的方法涉及使细胞与本发明的激动剂接触的步骤。如本文所用,词语“接触所述细胞”及其类似词语是指引入本文所述的至少一药剂,特别是本发明的mTOR激动剂,本发明的mTOR激动更具体地为至少一芳香族氨基酸,或为其任何模拟物,或为直接或间接增加至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及/或生物利用度中至少一者的任何化合物或药剂,或为包括通过化学及物理手段在体外、离体或体内进入靶细胞的包含本文所述的至少一mTOR激动剂的组合物,无论是直接或间接、还是至少一种mTOR激动剂或包含至少一种mTOR激动剂的组合物是否直接物理接触细胞或被引入环境(例如,培养基、体腔、器官及/或细胞存在或添加细胞的组织)。应当理解,与包含本文所述的至少一药剂(例如Y、W及/或F)的至少一药剂或组合物接触的细胞也可以同时或随后与另一种化合物如生长因子或其他分化剂接触,以进一步稳定及/或分化细胞。接触的步骤还旨在包括通过病毒或非病毒载体暴露细胞,递送至细胞或用mTOR激动剂“装载”细胞的方法,并且其中此类mTOR激动剂在递送时具有生物活性。
将针对特定药剂及用途选择递送方法(例如,以本文公开的涉及短期压力状态的加工为特征或与之相关的病症)。如本领域所知,影响递送的参数可尤其包括受影响的细胞类型(例如,上皮细胞、骨髓淋巴细胞、肌细胞、神经元细胞等)及细胞位置。在一些实施例中,“接触”包括将至少一mTOR激动剂(例如,Y、W及F及/或其模拟物)或包含至少一mTOR激动剂的组合物给予一个体。在一些实施例中,“接触”是指暴露细胞或其中细胞位于本公开中描述的Y、W及F中的一者或多者或其任何模拟物的环境。应当理解,在一些实施例中,术语“接触”不打算包括细胞体内暴露于本文公开的可自然发生的药剂或组合物(即,由于普通膳食的消化)。
应当理解,细胞可以与本公开的所述至少一mTOR激动剂中的任何一者接触,所述至少一mTOR激动剂具体地为至少一芳香族氨基酸残基,更具体地为一起的或分别的至少一酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、及/或其任何模拟物。在一示例性实施例中,细胞可以与包含酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸及/或其任何模拟物中的至少一者的寡肽、肽或多肽接触,例如仅含有Y、W及/或F残基的合成的寡肽、肽或多肽。
在实施实验受试者的方法中,任何表达mTOR的细胞都可以作为调节蛋白酶体动力学的靶细胞,其中mTOR可以被调节,从而调节蛋白酶体动力学的特定细胞类型的非限制性例子,包括成纤维细胞、骨骼组织细胞(如增殖性及肥大性软骨细胞)及软骨细胞、上皮组织细胞(例如肝、肺、乳腺、皮肤、膀胱及肾)、心脏及平滑肌细胞(例如心肌细胞)、神经细胞(神经胶质及神经元)、下丘脑细胞、海马细胞、内分泌细胞(肾上腺、垂体、胰岛α及β细胞)、外分泌胰腺细胞(例如腺泡细胞)、黑素细胞、许多不同类型的造血细胞(例如巨噬细胞、B细胞或T细胞谱系的细胞、中性粒细胞、红细胞及其相应的干细胞及祖细胞、淋巴母细胞)、白色脂肪组织及棕色脂肪组织(例如脂肪细胞)及肠细胞(例如Paneth细胞、肠细胞、杯状细胞)的细胞。在一些实施例中,所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施例中,所述细胞是人细胞。
更进一步地,本公开提供了增加mTOR活性,从而增加受试者中蛋白酶体核定位的方法,所述受试者包括向需要其的受试者施用包含至少一芳香族氨基酸残基的至少一mTOR激动剂,或其任何mTOR激动剂模拟物,或其任何盐或酯,或至少一芳香族氨基酸残基及/或mTOR激动性芳香族氨基酸残基模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,或包含其的任何组合物或试剂盒。
在一些更具体的实施例中,通过本公开提供的方法使用的mTOR激动剂可以包含至少一芳香族氨基酸残基或至少两个芳香族氨基酸残基或其任何模拟物的组合,或任何直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒。在一些具体实施例中,本文公开的方法中的mTOR激动剂可包含以下组分中的至少一者。第一组分(a)包含至少一酪氨酸(Y)残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。mTOR激动剂可以在一些实施例中另外或可选地包含作为第二组分(b)的至少一色氨酸(W)残基,或任何mTOR激动色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物。在又一些进一步的实施例中,本发明的mTOR激动剂可以另外或可选地作为第三组分(c)包含至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些实施例中,YW、YF或FW及其任何模拟物的任何组合都包含在本发明中。
更进一步,在一些具体实施例中,本公开方法使用的mTOR激动剂可包含以下三种组分的组合:(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、任何盐或其酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。本发明的mTOR激动剂还包含(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残基及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物。本公开方法的mTOR激动剂还包括(c)至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基的任何多聚体及/或聚合物形式、及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物及其任何组合或混合物。
如本文所讨论的,与本发明的各个方面有关的本公开的方法涉及施用几种化合物,具体地,如本文所公开的至少一mTOR激动剂,更具体地为至少一芳香族氨基酸残基(特别是酪氨酸、色氨酸及/或苯丙氨酸中的至少一者)、其任何模拟物、直接或间接调节这些芳香族氨基酸残基及/或至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物。因此,应理解,在一些实施例中,每个组分以可接受的形式存在以供给予受试者;任何两个或全部三个组分可以是单个组合物或单个分子的一部分;并且每个组分彼此共同施用给受试者。
如本文所用,术语“共同施用”意味着本发明方法中使用的所有组分可以作为单一剂型(例如包含这些组分的本发明的单一组合物)的一部分一起施用,或以两种或三种(如果使用第三种组分)单独的剂型一起施用。或者,只要所有组分在彼此足够的时间内施用以达到期望的效果(例如,mTOR的活化增加,以及由此导致的蛋白酶体的核定位增加),则可以在本发明方法中使用的另一组分的施用之前、连续地或之后施用每种组分。在这种组合疗法治疗或非治疗应用中,每种组分通过常规但不一定相同的方法施用。包含本发明方法中使用的两种或更多种组分的组合物的施用,不排除在治疗过程中另一时间将一种或多种相同组分单独施用于所述受试者。在一些实施例中,共同施用的所有组分都在彼此不到12小时内施用。在一些实施例中,共同施用的所有组分都在彼此不到8、6、4、3、2、1、0.5或0.25小时内施用。在一些实施例中,所有组分同时(例如,同时)或连续(例如,一个接一个地)施用。在一些实施例中,本发明的治疗方法包括向需要的受试者施用本公开的mTOR激动剂的有效量的步骤。根据本发明的有效量包括任何量的芳香族氨基酸残基酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸(YWF),其有效抑制需要的受试者的细胞中的蛋白酶体易位,例如患有癌症。在一些实施例中的所述有效量可导致肿瘤质量及体积的减少。在一些进一步的实施例中,提供给受试者的有效量可以在每天约0.01gr至约10gr/kg体重之间。在更具体的实施例中,约0.01gr、0.02gr、0.03gr、0.04gr、0.05gr、0.06gr、0.07gr、0.08gr、0.09gr、0.1gr、0.11gr、0.12gr、0.13gr、0.14gr、0.15gr、0.16gr、0.17gr、0.18gr、0.19gr、0.2gr、0.21gr、0.22gr、0.23gr、0.24gr、0.5gr、0.26gr、0.27gr、0.28gr、0.29gr、0.3gr、0.31gr、0.32、0.33gr、0.34gr、0.35gr、0.36gr、0.37gr、0.38gr、0.39gr、0.4gr、0.41gr、0.42gr、0.43gr、0.44gr、0.45gr、0.46gr、0.47gr、0.48gr、0.49gr、0.5gr/kg/天或更多至约1gr/kg/天。在一些特定及非限制性实施例中,本文公开的方法包括以与本发明其他方面相关的本文公开的有效量施用所有三个芳香族氨基酸残基Y、W、F。更具体而言,在一些实施例中,本文公开的方法包括以约0.01mM至约30mM或更高的浓度施用芳香族氨基酸Y、W及F,其中每种芳香族氨基酸残基的浓度为小于45mM,并且在一些进一步的实施例中,浓度不超过35mM,如关于本公开的其他方面所讨论的。在又一些进一步的实施例中,本文公开的方法包括施用约5gr-7gr至约50gr-70gr的每种芳香族氨基酸残基Y、W、F。在一些进一步的实施例中,通过本文公开的方法使用及施用的有效量可以在约0.1gr/天/kg至约0.9gr/天/kg之间(对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F),并且在一些实施例中,不超过0.99gr/天/kg(对于每个芳香族氨基酸残基Y、W、F)。
应当理解,本公开的方法、试剂盒及组合物可适用于任何多细胞生物,特别是任何脊椎动物受试者,更具体地为哺乳动物受试者、禽类受试者、鱼或昆虫的任何受试者。在一些具体实施例中,本公开内容提供的预后以及治疗、美容及农业方法可适用于哺乳动物受试者,特别是人类受试者。“患者”或“受试者”是指可能受上述病症影响并且需要本文所述的治疗及预后方法的任何哺乳动物,包括人、牛、马、犬、鼠及猫受试者。具体而言,所述受试者为人类。
如本文所讨论的,本发明人揭示了mTOR在调节细胞中蛋白酶体动力学中的作用。有趣的是,蛋白酶体的抑制导致其进入细胞核,而这种反应是被抗药性多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)所逃避的反应,其中即使在基础的非压力状态下,蛋白酶体也主要定位于胞质溶胶。所述观察结果可以作为使用蛋白酶体抑制剂治疗效果的决策的预测工具。
因此,本公开的另一方面涉及用于预测及评估患有病理疾病的受试者对一治疗方案的反应性的预后方法、及可选地用于监测疾病进展,所述治疗方案包含在至少一泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)-调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂、及/或至少一蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimeras,PROTAC)。更具体地,在一些实施例中,本文提供的方法可以包括以下步骤。在第一步(a)中,确定受试者的至少一生物样品的至少一细胞或细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位。
第二步(b)涉及将受试者分类为:(i)所述治疗方案的一反应受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位在受试者的至少一样品的至少一细胞中主要是在细胞核。或者,受试者可以被分类为(ii)一抗药性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位在受试者的至少一样品的至少一细胞中是在胞质溶胶。
因此,本公开的方法提供了对受治疗方案影响的哺乳动物的反应性的预测、评估及监测。
如本公开所示,蛋白酶体动力学在不同的细胞过程中起主要作用,因此可能影响各种病理状况。本公开的方法基于确定蛋白酶体的细胞定位。
本发明方法的第一步包括确定蛋白酶体在所述受试者的至少一生物样品的至少一细胞中的亚细胞定位。使用任何合适的手段确定蛋白酶体细胞定位的各种方法在本领域中是已知的,并且都适用于本公开。在一些实施例中,用于确定蛋白酶体定位的方法可以包括免疫组织化学方法及细胞分级分离。更具体地,适用于本发明的方法可包括但不限于免疫组织化学、蛋白酶体活性探针(proteasome activity probe,ABP)的活细胞成像、细胞核部分的Western印迹(例如,20及19S亚基的细胞Western印迹)、细胞分馏(Cellfractionation)、免疫荧光显微镜及冷冻电子断层扫描成像。
更具体而言,细胞分级分离(Cell fractionation)是用于分离细胞成分同时保留每个成分的单独功能的过程。组织通常在缓冲溶液中匀浆,所述缓冲溶液是等渗的以阻止渗透破坏。均质化的机制包括研磨、切碎、切碎、压力变化、渗透冲击、冻融和超声。然后将样品保持低温以防止酶促损伤。形成均质的细胞团(细胞匀浆或细胞悬液)。它涉及在存在某些具有正确pH值、离子组成及温度的酶的情况下,在合适的介质中研磨细胞。然后可以应用过滤步骤。根据细胞的来源,此步骤可能不是必需的。然而,动物组织可能会产生必须去除的结缔组织。通常,过滤是通过纱布倾倒或使用吸滤器和相关等级的陶瓷过滤器来实现的。纯化是通过差速离心实现的—重力的顺序增加导致细胞器根据其密度顺序分离。就此而言,其中本公开的方法涉及确定蛋白酶体在细胞或其任何级分中的亚细胞定位的步骤,在一些实施例中,细胞的此类部分可以是本文讨论的细胞分级分离过程的结果。在一些实施例中,细胞部分(cell fraction)可以是细胞核反应(nuclear reaction)。在另外一些实施例中,细胞级分可以是一胞质溶胶部分(cytosolic fraction)。
如本文所用的蛋白质印迹(Western Blot),特别是当应用于细胞级分时,涉及通过丙烯酰胺凝胶将底物与其他蛋白质分离,然后将底物转移至膜(例如,硝酸纤维素、尼龙或PVDF)。然后通过对底物特异的抗体检测底物的存在,所述抗体又通过抗体结合试剂检测。抗体结合试剂可以是例如蛋白A或二抗。如下所述,抗体结合试剂可以是放射性标记的或酶连接的。检测可以通过放射自显影、比色反应或化学发光。所述方法允许量化底物的量并通过膜上的相对位置确定其身份,所述相对位置指示蛋白质在电泳期间在丙烯酰胺凝胶中的迁移距离,其中这是由蛋白质的大小及其他特征产生的。
免疫组织化学分析(Immuno-histochemical Analysis)涉及通过底物特异性抗体在固定细胞中原位检测底物。底物特异性抗体可以是酶相关的(enzyme-linked)或与荧光团相关的。检测是通过显微镜进行的,可以是主观的,也可以是自动评估的。对于酶相关抗体,可能需要进行量热反应。应当理解,免疫组织化学之后通常使用例如苏木精(Hematoxyline)或姬姆萨染色剂(Giemsa stain)对细胞核进行复染。
免疫荧光显微镜(immunofluorescence microscopy)可以观察细胞中的蛋白酶体亚基。在一些实施例中,将细胞接种在玻璃盖玻片上并用4%PFA固定。适当处理后,将固定的细胞与相关的第一及第二抗体一起培育,洗涤并固定。然后使用共聚焦显微镜(例如Zeiss LSM 700)使固定的细胞可视化。
蛋白酶体的活细胞成像(live cell imaging)包括用荧光探针标记活细胞的蛋白酶体亚基,从而允许通过共聚焦荧光显微镜进行体内检测。例如,蛋白酶体亚基可以用任何标签例如GFP标记,例如β4、Rpn2、Rpn6及Rpn13蛋白酶体亚基可以与GFP C-末端融合。大多数蛋白酶体亚基将GFP标记完全整合到其适当的亚复合物中,从而能够对20S核心蛋白酶(core protease,CP)、19S调节颗粒(regulatory particle,RP)及/或holo-26S颗粒进行活细胞成像。
低温电子断层扫描成像(cryo-electron tomographic imaging)是一种促进蛋白质组学规模的原位结构生物学的方法。在cryo-ET研究中,将生物样品、细胞、组织或生物体快速冷冻,变薄至合适的厚度,然后使用电子显微镜成像。冷冻过程使样品保持水合、接近天然状态。当样品沿轴倾斜时捕获多个图像。然后使用计算技术对图像进行对齐及合并,以重建三维图像或断层图。所述方法已经成功地用于绘制相对大的结构如蛋白酶体以及核糖体的位置。
如上所述,基于蛋白酶体活性的探针(Proteasome activity-based probes,ABPs)也可用于检测蛋白酶体定位及活性。ABP是由与小荧光团连接的蛋白酶体抑制剂组成的小分子。蛋白酶体的荧光标记通过催化N-末端苏氨酸对ABP的亲核攻击发生,导致ABP的弹头及蛋白酶体活性位点之间的一共价、不可逆键合。重要的是,与荧光标记的蛋白酶体亚基不同,ABP仅标记完全组装的活性蛋白酶体复合物。ABP以与其催化活性相对应的方式与蛋白酶体反应,并且由于它们的荧光性质,它们可以在凝胶电泳后随后进行荧光扫描或通过荧光显微镜在活细胞中在细胞裂解物中特异性及灵敏地成像。除少数例外,大多数蛋白酶体ABP具有相似的设计,可包含以下组分:
(a)C末端的反应基团(“弹头(warhead)”),通常是环氧酮(epoxyketone,EK)或乙烯基砜(VS);(b)三肽或四肽识别元件;(c)用于检测的报导标记(reporter tag)(通常是荧光团),通常通过接头额外在N末端。因此,探针经常以标记(label)-接头(linker)-识别元件(recognition element)-弹头(warhead)(例如BODIPY-Ahx3-L3-VS)或标记-抑制剂(例如BODIPY-环氧霉素)的形式标注。
蛋白酶体-ABP可分为两类:“广谱(broad-spectrum)”(其对大多数蛋白酶体亚基具有反应性)及“亚基选择性(subunit-selective)”(其显示出对单一亚基类型的强烈偏好)。
应当理解,当涉及蛋白酶体的检测时,本发明包括如上所述检测26S或其任何亚基,特别是20S及19S亚基中的至少一者。
本文公开的方法的第二步涉及将受试者分类为一反应性(或反应者)或无反应性(或非反应者)受试者。如本文所用,主要是在细胞核的亚细胞定位,意味着被检查细胞中的蛋白酶体大多、主要及/或首要定位于细胞核。具体而言,细胞蛋白酶体的首选、优势、主要及/或优先份额显示细胞中的核定位。具体而言,细胞中超过50%的蛋白酶体定位于细胞核,更具体而言,细胞中的蛋白酶体显示核定位的约51%或更多,约52%或更多,约53%或更多,约54%或更多,约55%或更多,60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或甚至100%或更多。在一些实施例中,55%或更多的细胞蛋白酶体在受试者的至少一细胞中的胞质定位表示出对治疗方案的抗药性。
在一些实施例中,通过本公开的方法诊断的受试者,可以在样品的大多数细胞中显示细胞核及胞质溶胶蛋白酶体定位。根据一些实施例,对于这样的受试者,蛋白酶体在所检查样品的至少一细胞中的约50%或更少的核定位指示抗药性。因此,如本公开所示并在本文中讨论的,蛋白酶体在两个区室(胞质溶胶及细胞核)之间的相等分布反应了无反应性或抗药性。更具体而言,在本公开的一些具体实施例中,蛋白酶体的约50%或更多或甚至45%或更多(具体地为45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更多、100%)的胞质定位在本文中代表为位于胞质溶胶,并且指示出对包含至少一UPS调节剂(例如蛋白酶体抑制剂,PROTAC及任何公开的调节剂)的治疗方案的无反应性。
然而,受试者细胞中蛋白酶体的约51%或更多(且更具体地为55%或更多)的细胞核分布在本文中代表为位于主要是在细胞核或细胞核定位,并且对于UPS调节剂(例如,至少一蛋白酶体抑制剂或此后公开的任何调节剂)显示出反应性。更具体而言,细胞中约55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或甚至100%的蛋白酶体的细胞核定位表示出所述受试者对包含至少一UPS调节剂(例如蛋白酶体抑制剂,PROTAC及任何所公开的调节剂)的治疗方案具有反应性。
应进一步理解,在一些实施例中,确定的胞质溶胶定位在约1%-100%之间(具体地为约1%至约5%、约5%至10%、约10%至15%、约15%至20%、约20%至25%、约25%至30%、约30%至35%、约35%至40%、约40%至45%、约45%至50%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-100%)的样品中的细胞,表示所述受试者属于预先建立的抗药性或无反应性的受试者群体。换句话说,所述受试者是无反应性受试者。在一些特定的实施例中,这样的抗药性受试者或受试者群体可能与疾病的复发有关。在一些进一步的实施例中,细胞核定位确定在约1%-100%之间(具体地为约1%至约5%、约5%至10%、约10%至15%、约15%至20%、约20%至25%、约25%至30%、约30%至35%、约35%至40%、约40%至45%、约45%至50%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-100%)的样品中的细胞,表示所述受试者属于预先建立的药物反应性或反应性受试者群体。换句话说,所述受试者是反应性受试者。在一些特定的实施例中,这样的药物反应性受试者或受试者群体可能与良好的预后相关。因此,在一些实施例中,如果样品中50%或更多的细胞显示蛋白酶体的胞质溶胶分布(例如,细胞中约45%或更多的细胞蛋白酶体是在胞质溶胶),则将受试者分类为无反应性或抗药性。在一些进一步的实施例中,如果样品中50%或更多的细胞显示细胞核定位(例如,51%或更多,特别是55%或更多的细胞蛋白酶体是在细胞核),则将受试者分类为反应者。
如上所述,本发明的方法涉及基于细胞区室中蛋白酶体的相对量,特别是胞质溶胶及细胞核来确定蛋白酶体亚细胞定位值。两个区室之间的等效分布反应了无反应性或抗药性。换句话说,蛋白酶体在胞质溶胶及细胞核中的均匀分布(即50%或更多,在一些实施例中,甚至45%或更多)表示出对UPS调节药物(例如蛋白酶体抑制剂)的无反应。因此,大约40%至60%的值(具体地为40%、45%、50%、55%、60%的值)可以用作截止值。在另外一些实施例中,细胞中蛋白酶体的约50%的值可被认为是截止值。应当注意,“截止值(cutoffvalue)”,有时在本文中简称为“截止值(cutoff)”,是在本公开的一些实施例中满足高预后敏感性(真阳性率)及高预后特异性的要求的值(真阴性率)。简单地说,“灵敏度”与从一组样品中识别出反应者患者(样品)本身的比率有关,而“特异性”与从一组样品中正确识别反应者样品的比率有关。应注意的是,截止值也可以作为对照样品提供,或者备选地及/或另外地,作为标准曲线提供,显示出反应者、非反应者及对于在一定程度上显示反应性的受试者(反应性水平,例如低、中及高)。更具体地说,截止值反映了蛋白酶体定位值统计分析的结果预先确定的反应者或非反应者人群的差异。如本文所用,预先建立的群体是指已知对所关注的治疗(例如,包含至少一种蛋白酶体抑制剂的治疗)有反应的患者群体,或者备选地,已知对感兴趣的治疗无反应或抗药性的患者群体感兴趣的治疗。
应强调的是,本发明的性质使得进一步的患者数据的累积可以提高目前提供的截止值的准确性,其通常基于使用分析根据患者数据生成的ROC(接收器操作特性(ReceiverOperating Characteristic))曲线软件程序。
应当理解,如本文所用的“标准”或“预定标准”表示单个标准值或多个标准,与之比较为测试样品确定的蛋白酶体亚细胞核或胞质溶胶定位值。标准可以例如以离散数值的形式或以蛋白酶体定位的不同值的图表的形式提供,或者以基于这些标准制备的比较曲线的形式提供(标准曲线)。
因此,在某些实施例中,本公开的预后方法可可选地进一步涉及使用通过检测及定量已知反应者群体及对所示治疗的非反应者的细胞中的蛋白酶体亚细胞定位而产生的校准曲线。获得此一校准曲线可以指示以提供标准值。
如上所述,在本公开的一些实施例中,可以通过本文讨论的方法提供及/或使用至少一对照样品。如本文所用的“对照样品”可以反应至少一受试者的样品(已知为非反应者的受试者,或者已知为反应者的样品,或显示已知的细胞核及/或胞质溶胶的样品在一定的预定程度),并且在一些实施例中,混合物至少两名、至少三名、至少四名、至少五名、至少六名、至少七名、至少八名、至少九名、至少十名或更多患者,特别是15名、20名、25名、30名、35名、40名、45名、50名、55名、60名、65名、70名、75名、80名、85名、90名、95名、100名或更多患者。对照样品可以替代地或另外地包含已知的胞质溶胶或细胞核蛋白或显示已知的细胞定位的其他细胞组分,其可以用作胞质溶胶或细胞核定位的参考。
在一些实施例中,本发明的方法可特别用于监测疾病进展。在一些实施例中,通过本发明的方法监测疾病进展可以包括预测及确定疾病复发及评估缓解间隔中的至少一者。在这种情况下,本发明的方法可以包括以下步骤:重复本发明方法的步骤(a)以确定至少一暂时分离的受试者的样品的至少一细胞的蛋白酶体亚细胞定位。更具体而言,根据一些实施例,允许监测如上定义的疾病进展的方法可以包括首先步骤(a),以确定在受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或在细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位。在一些实施例中,如果蛋白酶体亚细胞定位在至少一样品的至少一细胞中主要是在细胞核,则所述受试者在下一步骤(b)中被分类为(i)对于所述治疗方案的一反应受试者。或者,如果蛋白酶体亚细胞定位是在胞质溶胶,则可以将受试者分类为(ii)一抗药性受试者。为了监测目的,在步骤(c)中重复测定步骤,用于至少一或多个暂时分离的受试者样品的至少一细胞。下一步骤(d)涉及预测及/或确定受试者中的疾病复发,如果所检查的至少一暂时分离的样品中的至少一者细胞显示出蛋白酶体核定位的丧失,或者可替代地显示出维持的胞质溶胶定位。应当理解,在一些实施例中,在受试者的至少一先前样品显示出蛋白酶体核定位的情况下(例如,在受试者先前已被分类为反应者的情况下),蛋白酶体核定位的“丢失(loss)”是相关的。在一些进一步的实施例中,如果所检查的至少一暂时分离的样品中的至少一细胞维持在所检查的先前样品中揭示的主要蛋白酶体胞质溶胶定位,则也可以预测及/或确定受试者中的疾病复发。在一些实施例中,在蛋白酶体在细胞核及胞质溶胶中均匀分布在暂时分离的样品中的情况下,也可以预测复发。
因此,本发明提供了用于评估受试者对特定治疗方案的反应性,用于监测疾病进展及预测受试者中疾病复发的预后方法。应当指出,“预后”定义为基于医学知识对疾病或病症的未来进程的预测。这突出了本发明的主要优点,即基于在预后受试者的细胞中评估的蛋白酶体动力学,评估反应性或抗药性并由此预测疾病进展的能力。如本文所用,术语“复发”涉及过去影响人的病症、疾病或病症的再次发生。具体而言,所述术语涉及用蛋白酶体抑制剂治疗的疾病的再次发生。
对某种治疗(具体地为包含至少一UPS调节剂(例如,本公开所公开的至少一蛋白酶体抑制剂,PROTAC或任何调节剂)的治疗方案)的术语“反应(response)”或“反应性(responsiveness)”,指与诊断为具有相同病理学的未治疗受试者(例如,病理学的相同类型、阶段、程度及/或分类)相比,或与相同受试者的临床参数相比,在用所示药物治疗之前的至少一相关临床参数的改善。
术语对用特定药物(特别是包含至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案)治疗的“非反应者”或“抗药性”,是指患者没有经历以下方面的改善至少一个临床参数,并被诊断为与经诊断为具有相同病理学的未治疗受试者(例如,相同类型、阶段、程度及/或分类的病理学)或具有与在用特定药物治疗之前的未治疗受试者相同的具有相同临床参数。
在一些实施例中,可以在包含至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂的至少一治疗方案)开始之后获得至少一暂时分离的样品。
应理解的是,在一些特定的实施例中,可以在开始治疗之前获得至少一样品。因此,在一些实施例中,在治疗之前采集至少一样品,并且在治疗之后获得至少一样品。然而,在一些实施例中,本文公开的方法可以应用于已经通过包含至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂的治疗方案)治疗的受试者。因此,在开始治疗之后获得第一及第二样品。因此,这种监测可以提供用于改善及个人化提供给治疗受试者的治疗方案的强大治疗工具。
如上所述,根据本发明的一些实施例,为了评估患者状况,或监测疾病进展,以及对某种治疗的反应性(例如,包含至少一蛋白酶体抑制剂),必须从被检查的患者收集至少两个“暂时分离的(temporally-separated)”测试样品,然后进行比较,为了确定样品之间的蛋白酶体定位值是否有任何变化或差异。这种变化可能反应了受试者反应性的变化。实际上,为了检测具有更准确预测价值的变化,必须从患者那里收集至少两个“暂时分离”的测试样品,最好是更多样品。
使用本文公开的方法确定蛋白酶体细胞定位值,将其应用于每个样品。如上所述,通过确定在不同时间点或时间间隔从同一患者获得的至少两个样品之间的细胞定位变化来计算定位变化。这段时间,也称为“时间间隔(time interval)”,或时间点之间的差异(其中每个时间点是收集特定样品的时间)可以是医务人员认为适当的任何时期,并根据需要进行修改。患者的具体要求及他或她可能处于的临床状态。例如,所述间隔可以是至少一天、至少三天、至少一周、至少两周、至少三周、至少一月、至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月、至少一年甚至更长。
收集并用于评估及分类受试者的样品数量,无论是作为反应者,还是作为抗药性或作为可能经历疾病复发的受试者,可以根据收集它们的频率而改变。例如,可以至少每天、每两天、每四天、每周、每两周、每三周、每月、每两个月、每四个月、每三个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月、每年甚至更多时间来收集样品。此外,为了根据本公开内容评估疾病进展,可以理解细胞核或胞质溶胶蛋白酶体定位值的变化可以计算为在不同时间点采集的至少三个样品的平均变化,或者可以计算变化对于在相邻时间点收集的每两个样品。应理解的是,样品可以在指定的时间间隔内从监测的患者获得数月或数年的时间。更具体而言,为期1年、为期2年、为期3年、为期4年、为期5年、为期6年、为期7年、为期8年、为期9年、为期10年、为期11年、为期12年、为期13年、为期14年、为期15年或更长时间。
在一些进一步的实施例中,预后方法应用于患有致病性疾病的受试者。在一些进一步的实施例中,诊断的受试者患有至少一增殖性疾病及/或至少一蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病。
在一些实施例中,与本发明方法相关的增殖性病症可以是至少一固体或非固体癌症或其任何转移。
在一些具体实施例中,增殖性疾病可以是至少一血液恶性肿瘤及任何相关病症。更进一步,在一些实施例中,蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病可以是淀粉样变性及任何相关病症。
在一些实施例中,本发明的方法可以特别适用于受血液恶性肿瘤影响的患者。在更具体的实施例中,这种血液恶性肿瘤或癌症可以是多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)及/或任何相关病症。因此,本发明的预后方法可用于预测及评估患有MM的受试者对包含至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂的治疗方案的反应性,并且可选地用于监测MM疾病进展的受试者。
在一些进一步的实施例中,本发明的方法提供了用于分类及监测疾病严重性及分期的工具(独立或补充工具)。更具体而言,较高的细胞核定位值可能与轻度疾病相关,而主要的胞质溶胶定位可能反应更晚期的疾病,其可能在一些实施例中涉及复发。
因此,本发明的预后方法通过确定任何患者对包含至少一UPS调节剂的治疗的反应性,提供了用于筛选患者以针对每个患者定制最佳个人治疗方案的诊断及治疗有力工具。本文所用的UPS调节剂是调节由遍在泛素-蛋白酶体系统介导的蛋白质降解的任何药剂或化合物,并且包括直接或间接抑制、减少、减弱或可选地诱导、升高或增加UPS介导蛋白质降解的任何药剂。更具体而言,UPS调节剂是用于通过影响蛋白酶体定位、活性或组装来调节在泛素-蛋白酶体系统的任何试剂。应理解的是,影响蛋白酶体细胞定位的任何UPS调节剂、受蛋白酶体细胞定位影响的药剂及/或它们的生物学效应由蛋白酶体细胞定位直接或间接介导的药剂,在本公开中是特别感兴趣的。在更具体的实施方案中,此类试剂包括但不限于影响泛素缀合的试剂(例如,泛素连接酶E3的调节剂);调节去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUB)活性的试剂;针对未折迭蛋白反应(Unfolded ProteinResponse,UPR)的药物;钙调神经磷酸酶通路抑制剂及/或其活性直接或间接影响蛋白酶体降解的任何试剂。如本文所用,在蛋白缀合是指将在蛋白共价连接至靶底物的过程,这是对于它们的蛋白酶体介导的识别及随后被蛋白酶体降解所必需的中间步骤。
在一些具体实施例中,适用于本发明的UPS调节剂,特别是在本文公开的预后方法及试剂盒中,包括但不限于不直接影响蛋白酶体但影响缀合及DUB的任何药物。在一些实施例中,UPS调节剂可包括:(i)靶向未折迭蛋白应答(UPR)的药物,例如蛋白酶体抑制剂;(ii)需要蛋白酶体活性作为其作用机制一部分的药物,例如PROTAC及IMID;(iii)靶向钙调神经磷酸酶途径的药物。
因此,在一些具体实施例中,本发明的预后方法提供了用于确定对包含至少一靶向未折迭蛋白反应(UPR)的药物的治疗的反应性的治疗工具。未折迭蛋白质反应(UPR),包括内质网相关降解(ERAD)途径、参与细胞蛋白质质量控制(在许多疾病中失调)、炎症及各种其他过程。UPR取决于蛋白酶体的蛋白水解活性。靶向所述途径的药物在本文中也称为UPR的调节剂(具体地,上调或调节作用于所述途径上游或下游的过程或化合物的药物),包括蛋白酶体抑制剂、靶向白介素的单克隆抗体(例如Ustekinumab、Secukinumab)或TNFα(例如英夫利昔单抗(Infliximab)、阿达木单抗(Adalimumab))。UPR的这些调节例如用于治疗炎性肠病、牛皮癣、关节炎及潜在的其他炎性疾病(例如类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis))。TNFα也暗示在某些类型的淀粉样变性中。在一些具体实施例中,本发明的预后方法提供了用于确定对包含至少一蛋白酶体抑制剂的治疗的反应性的治疗工具。
在一些实施例中,适用于本发明的至少一蛋白酶体抑制剂可包括硼替佐米(Bortezomib)、卡非佐米(Carfilzomib)、伊沙唑米(Ixazomib)、马里佐米(Marizomib)、奥普唑米(Oprozomib)及Selinexor中的任何一者。
本文所用的蛋白酶体抑制剂是通过影响可用于治疗癌症的蛋白酶体的活性、定位/分布及/或稳定性来阻断蛋白酶体作用的药物。此外,蛋白酶体抑制剂减少、抑制、降低蛋白酶体的活性及功能,特别是细胞及/或核蛋白的降解,具体地为与非抑制活性相比的约1%至约5%、约5%至10%、约10%至15%、约15%至20%、约20%至25%、约25%至30%、约30%至35%、约35%至40%、约40%至45%、约45%至50%、55%-60%、60%-65%、65%-70%、、70%-75%、75%-80%、80%-85%、85%-90%、90%-95%、95%-100%。迄今为止,其中三种被批准用于治疗多发性骨髓瘤,即硼替佐米(Bortezomib)、卡非佐米(Carfilzomib)及伊沙佐米(Ixazomib)。
蛋白酶体抑制剂的其他实例包括但不限于:Marizomib(salinosporamide A)、Oprozomib(ONX-0912)、delanzomib(CEP-18770)、双硫仑(Disulfiram)、表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate)、Lactacystin、Epoxomicin、MG132及β-羟基β-甲基丁酸酯(Beta-hydroxy beta-methylbutyrate)。
在一些具体实施例中,适用于本公开的方法、组合物及试剂盒的蛋白酶体抑制剂可以是硼替佐米(Bortezomib)。硼替佐米(Bortezomib)以Velcade、Chemobort、Bortecad等品牌销售,是一种用于治疗多发性骨髓瘤及套细胞淋巴瘤的抗癌药物。这包括那些曾经及以前没有接受过治疗的多发性骨髓瘤。其通常与其他药物一起使用。
硼替佐米(Bortezomib)具有以下化学结构,如式I所示:
硼替佐米(Bortezomib)的系统(IUPAC)名称是[(1R)-3-甲基-1-({(2S)-3-苯基-2-[(吡嗪-2-基羰基)氨基]丙酰基}氨基)丁基]硼酸([(1R)-3-methyl-1-({(2S)-3-phenyl-2-[(pyrazin-2-ylcarbonyl)amino]propanoyl}amino)butyl]boronic acid)(C19H25BN4O4;CAS号179324-69-7)。上述硼替佐米形式的分子量为384.237g/mol。
在一些具体实施例中,适用于本公开的方法、组合物及试剂盒的蛋白酶体抑制剂可以是卡非佐米(Carfilzomib)。卡非佐米(Carfilzomib)(以商品名Kyprolis销售)是一种抗癌药物,可作为选择性蛋白酶体抑制剂。在化学上,它是四肽环氧酮及环氧霉素的类似物。卡非佐米(Carfilzomib)共价结合并抑制20S蛋白酶体的胰凝乳蛋白酶样活性。卡非佐米(Carfilzomib)与非蛋白酶体靶标的相互作用最小,从而改善了硼替佐米的安全性。
卡非佐米(Carfilzomib)具有以下化学结构,如式II所示:
卡非佐米(Carfilzomib)的系统(IUPAC)名称是(2S)-4-甲基-N-[(2S)-1-[[(2S)-4-甲基-1-[(2R)-2-甲基环氧乙烷-2-基]-1-氧代戊烷-2-基]氨基]-1-氧代-3-苯基丙-2-基]-2-[[(2S)-2-[(2-吗啉-4-基乙酰基)氨基]-4-苯基丁酰基]氨基]戊酰胺((2S)-4-Methyl-N-[(2S)-1-[[(2S)-4-methyl-1-[(2R)-2-methyloxiran-2-yl]-1-oxop entan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]-2-[[(2S)-2-[(2-morpholin-4-ylace tyl)amino]-4-phenylbutanoyl]amino]pentanamide)(C40H57N5O7;CAS号868540-17-4)。上述卡非佐米(Carfilzomib)形式的分子量为719.91g/mol。
在一些具体实施例中,适用于本公开的方法、组合物及试剂盒的蛋白酶体抑制剂可以是伊沙佐米(Ixazomib)。伊沙佐米(Ixazomib)(商品名Ninlaro)是一种与其他药物联合治疗多发性骨髓瘤的药物。其以胶囊形式口服。
与较老的硼替佐米(只能通过注射施用)一样,其作为蛋白酶体抑制剂,在美国及欧洲具有孤儿药地位,并且是硼酸衍生物。伊沙佐米(Ixazomib)与来那度胺(lenalidomide)及地塞米松(dexamethasone)组合用于至少一次治疗后成人多发性骨髓瘤的治疗。
在治疗浓度下,伊沙佐米(Ixazomib)选择性及可逆地抑制蛋白质-蛋白酶体亚基β-5型(protein proteasome subunit beta type-5,PSMB5),解离半衰期为18分钟。这种机制与硼替佐米(Bortezomib)相同,硼替佐米(Bortezomib)的解离半衰期更长,为110分钟;相比之下,相关药物卡非佐米(Carfilzomib)不可逆地阻断PSMB5。
伊沙佐米(Ixazomib)具有以下化学结构,如式III所示:
伊沙佐米(Ixazomib)的系统名称(IUPAC)为N2-(2,5-二氯苯甲酰基)-N-[(1R)-1-(二羟硼酰基)-3-甲基丁基]甘氨酸酰胺(N2-(2,5-Dichlorobenzoyl)-N-[(1R)-1-(dihydroxyboryl)-3-methylbutyl]glycinami de)(C14H19BCl2N2O4;CAS编号:1072833-77-2)。上述伊沙佐米(Ixazomib)形式的分子量为361.03g/mol。
在一些特定实施例中,适用于本公开的方法、组合物及试剂盒的蛋白酶体抑制剂可以是马里佐米(Marizomib)。盐霉酰胺A(Salinosporamide A)(Marizomib)是一种有效的蛋白酶体抑制剂,被研究为潜在的抗癌剂。这种海洋天然产物是由海洋沉积物中发现的专性海洋细菌热带盐菌(Salinispora tropica)及芳烃盐菌(Salinispora arenicola)产生的。盐霉酰胺A属于一个化合物家族,统称为盐霉酰胺(salinosporamides),它具有一个密集官能化的γ-内酰胺-β-内酯双环核(γ-lactam-β-lactone bicyclic core)。盐霉酰胺A通过共价修饰20S蛋白酶体的活性位点苏氨酸(threonine)残基来抑制蛋白酶体活性。
马里佐米(Marizomib)具有如下化学结构,如式IV所示:
马里佐米(Marizomib)的系统名称(IUPAC)为(4R,5S)-4-(2-氯乙基)-1-((1S)-环己-2-烯基(羟基)甲基)-5-甲基-6-氧-2-氮杂二环[3.2.0]庚烷-3,7-二酮((4R,5S)-4-(2-chloroethyl)-1-((1S)-cyclohex-2-enyl(hydroxy)methyl)-5-methyl-6-oxa-2-azabicyclo[3.2.0]heptane-3,7-dione)(C15H20ClNO4;CAS编号:437742-34-2)。上述马里佐米(Marizomib)形式的分子量为313.781g/mol。
在一些特定实施例中,适用于本公开的方法、组合物及试剂盒的蛋白酶体抑制剂可以是奥普唑米(Oprozomib)。奥普唑米(Oprozomib)(代号ONX0912及PR-047)是一种口服活性的第二代蛋白酶体抑制剂。其选择性地抑制组成性蛋白酶体(PSMB5)及免疫蛋白酶体(LMP7)的糜蛋白酶样活性。
它正在研究用于治疗血液系统恶性肿瘤,特别是多发性骨髓瘤。作为一种环氧酮衍生物,奥普唑米(Oprozomib)在结构上与卡非佐米(carfilzomib)相似,具有口服生物利用的额外优势。与卡非佐米(carfilzomib)一样,它对耐硼替佐米的多发性骨髓瘤细胞具有活性。奥普唑米(Oprozomib)被授予孤儿药地位,用于治疗的巨球蛋白血症及多发性骨髓瘤。奥普唑米(Oprozomib)具有如下化学结构,如式V所示:
奥普唑米(Oprozomib)的系统名称(IUPAC)为N-[(2S)-3-甲氧基-1-[[(2S)-3-甲氧基-1-[[(_2S)-1-[(2R)-2-甲基环氧乙烷-2-基]-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基]氨基]-1-氧氟丙烷-2-烷基]-2-甲基-1,3-噻唑-5-甲酰胺(N-[(2S)-3-methoxy-1-[[(2S)-3-methoxy-1-[[(2S)-1-[(2R)-2-methyloxiran-2-yl]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]-2-methyl-1,3-thiazole-5-carboxamide)(C25H32N4O7S;CAS编号:935888-69-0)。上述奥普唑米(Oprozomib)形式的分子量为532.61g/mol。
在一些特定实施例中,可用于本发明的蛋白酶体抑制剂可以是塞利尼索(Selinexor)。塞利尼索(Selinexor)(INN,商品名Xpovio;开发代码KPT-330)是一种用于抗癌药物的核出口选择性抑制剂。它通过结合核输出蛋白1(exportin 1)而起作用,从而阻断参与癌细胞生长的几种蛋白质从细胞核到胞质溶胶的运输,最终阻止细胞周期并导致凋亡。
美国食品及药物管理局(FDA)批准塞利尼索(Selinexor)与皮质类固醇地塞米松(corticosteroid dexamethasone)组合使用,用于治疗复发性难治性多发性骨髓瘤(RRMM)成年患者,至少两种免疫调节剂及抗CD38单克隆抗体。
塞利尼索(Selinexor)具有如下化学结构,如式VI所示:
塞利尼索(Selinexor)的系统(IUPAC)名称为(2Z)-3-{3-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1,2,4-三唑-1-基}-N′-吡嗪-2-基丙-2-烯酰肼((2Z)-3-{3-[3,5-Bis(trifluoromethyl)phenyl]-1,2,4-triazol-1-yl}-N′-pyrazin-2-ylprop-2-enehydrazide)(C17H11F6N7O;CAS编号:1393477-72-9)。上述塞利尼索(Selinexor)形式的分子量为443.313g/mol。
在又一些进一步的实施例中,本发明的预后方法提供了用于确定对包括至少一PROTAC及相关分子的治疗的反应性的治疗工具。更具体而言,蛋白水解靶向嵌合体(proteolysis targeting chimera,PROTAC)是一种异质双功能小分子,由两个活性域及一个能够通过泛素-蛋白酶体系统诱导靶向蛋白降解的接头组成。从机制上而言,这可以通过化学配体实现,化学配体诱导E3泛素连接酶及感兴趣蛋白之间的分子接近,导致感兴趣蛋白的泛素化及降解。更具体而言,PROTAC由两个共价连接的蛋白结合分子组成:一个能够与E3泛素连接酶结合,另一个与降解的目标蛋白结合。E3连接酶向靶蛋白的募集导致泛素化及随后蛋白酶体对靶蛋白的降解。PROTAC(例如ARVINAS LTD.开发的可应用于本公开的PROTAC)包括ARV-110,其是一种有效的、选择性的、口服可用的雄激素受体(androgenreceptor,AR)降解剂,例如ARV-766及AR-7(即AR Backups)、ARV-471(一种口服雌激素受体(estrogen receptor,ER)靶向蛋白降解剂,用于治疗局部晚期或转移性ER阳性/HER2阴性乳腺癌症患者)等。
在又一些实施例中,本发明的预后方法提供了一种用于确定对包括至少一IMiD的治疗的反应性的治疗工具。免疫调节药物(Imunomodulatory drugs,IMiDs)是一组与沙利度胺(thalidomide)类似的化合物,由于其抗肿瘤坏死因子(TNF)α活性,具有抗血管生成特性及强大的抗炎作用。更具体而言,沙利度胺(thalidomide)(一种谷氨酸的合成衍生物)及其类似物来那度胺(lenalidomide)及泊马度胺(pomalidomide)是治疗多发性骨髓瘤及其他血液系统恶性肿瘤有效的IMiD。最近的研究表示出,IMiDs结合CRBN,CRBN是CRL4 E3连接酶的底物受体,在多发性骨髓瘤细胞中诱导IKZF1及IKZF3的泛素化及降解,有助于其抗骨髓瘤活性。类似地,来那度胺(lenalidomide)通过诱导染色体5q缺失的MDS中CK1α的泛素化及降解发挥治疗作用。最近,新型沙利度胺类似物被设计用于更好的临床疗效,包括CC-122(阿瓦度胺(avadomide))、CC-220(伊贝度胺(iberdomide))及CC-885。因此,应当理解,本文讨论的任何ImID都可以适用于本公开的方法及试剂盒。
此外,在一些实施例中,本发明的预后方法提供了一种用于确定对包括至少一钙调神经蛋白通路调节剂(Calcineurin pathway modulator)的治疗方案的反应性的治疗工具。更具体而言,钙调神经磷酸酶途径是免疫系统的一个关键组成部分,依赖蛋白酶体活性来发挥其关键的细胞及生理作用。钙调磷酸酶抑制剂(如环孢霉素(Cyclosporine)及他克莫司(Tacrolimus))被广泛用作器官移植后的免疫抑制剂,并用于治疗多种自身免疫性疾病。因此,在一些实施例中,本发明的预后方法提供了用于确定对包括任何钙调神经磷酸酶途径抑制剂的治疗方案的反应性的治疗工具。
应当理解,本文讨论的任何UPS调节剂,特别是影响及/或受蛋白酶体细胞定位影响的任何试剂、及/或其生物效应直接或间接由蛋白酶体细胞位置介导的试剂,适用于本公开中讨论的任何方面。
如本文所示,本发明的方法包括确定样品中至少一细胞中蛋白酶体定位的步骤。生物样品是从受试者获得的包含至少一细胞或其任何部分的任何样品。在一些具体实施例中,适用于本发明方法的样品可以包括骨髓、淋巴液、血细胞、血液、血清、血浆、精液、脊髓液或脑脊液、皮肤、呼吸道、肠道及泌尿生殖系统的外分泌物、从任何器官或组织获得的任何样品、通过灌洗获得的任何样品、可选地是乳腺导管系统或子宫、大量积液、体外或离体细胞培养样品和细胞培养成分。在一些特定的实施例中,生物样品可以来自活组织检查。活组织检查(biopsy)是外科医生通常进行的医学检查。所述过程涉及从患者身上提取样本细胞或组织。获得的组织通常由病理学家在显微镜下检查以进行初步评估,并且也可以分析蛋白酶体定位,如本公开所讨论的。当去除整个肿块或可疑区域时,所述过程称为切除活组织检查。切开活组织检查或核心活组织检查对异常组织的一部分进行取样,而不是试图去除整个病变或肿瘤。当用针取出组织或液体样品时,细胞被去除而不保留组织细胞的组织学结构,所述过程称为针吸活组织检查。更进一步地,样品可获自从患者切除的所述组织(例如,在治疗性切除的情况下)。
在一些特定实施例中,特别是在预测及监测MM患者的情况下,通过本发明的方法检查的样品可以是骨髓样品。
通过评估受试者对包含至少一UPS调节剂(例如,至少一蛋白酶体抑制剂PROTAC或本发明公开的任何模块)的特定任选治疗区域的反应性,并预测特定患者的疾病潜在复发,本公开提供了一种用于为患者定制特定的个人治疗方案的工具。
因此,本发明的另一方面涉及用于确定患有病理性疾病的受试者的个人化治疗方案的方法。更具体而言,本发明的方法可以包括以下步骤:
首先在步骤(a)中,确定受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位。
下一步骤(b)涉及将受试者分类为:(i)对于包括至少一UPS调节剂(例如至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂(或任何所公开的UPS调节剂))的至少一治疗方案的一反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核;或(ii)一抗药性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位是在胞质溶胶。在一些实施例中,如果样品的至少一细胞中只有50%或更少的蛋白酶体显示细胞核或主要细胞核定位,在至少一样品的至少一细胞中显示细胞核及胞质溶胶蛋白酶体定位的受试者被分类为抗药性或非反应者。在一些实施例中,如结合本发明的其他方面所描述的确定步骤以及分类步骤,特别是上文所讨论的诊断及预测方法,也适用于所述方面。
下一步骤(c)涉及选择合适的治疗方案。具体地,在一些实施例中,向被分类为反应者的受试者施用至少一UPS调节剂的有效量,例如至少一蛋白酶体抑制剂、其任何组合或包含其的任何组合物。在一些其他实施例中,被分类为抗药性或非反应者的受试者将不会用至少一UPS调节剂治疗,例如至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂、PROTAC或任何公开的UPS调节剂。
此外,在一些实施例中,根据本发明的用于确定个人化治疗方案的方法可以包括向被分类为对于包括至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案具有抗药性的受试者施用的步骤,其中施用了至少一蛋白酶体易位的选择性调节剂的有效量(特别是蛋白酶体易位至胞质溶胶的选择性抑制剂、及/或雷帕霉素激动剂的哺乳动物靶(mTOR)、或其任何组合、可选地与至少一UPS调节剂、特别地至少一酶体抑制剂及/或至少一治疗剂。
在一些实施例中,额外的治疗剂可以是至少一增强短期压力状态或过程的药物。在更具体的实施例中,额外的治疗剂可以是导致、增强及/或加重缺氧的至少一药物。在一些特定实施例中,导致或引起缺氧的试剂可以是抑制或减少血管生成的试剂。用于本公开的方法、组合物及试剂盒中的血管生成抑制剂的非限制性实例包括以下的至少一者:VEGF抑制剂(例如抗VEGF抗体如贝伐单抗(Bevacizumab)及Ramuciumab)、VEGF融合蛋白(例如Ziv-aflibercept/>)、激酶抑制剂(例如Vandanib/>)、Sunitinib/>索拉非尼(Sorafenib)/>雷戈拉非尼(Regorafenib)/>帕唑帕尼(Pazopanib)/>卡博扎替尼(Cabozantinib)/>Axitinib/>)以及与蛋白质降解相关的试剂(例如,通过与E3连接酶的相互作用)(如沙利度胺(Synovir、/>)),以及相关药物(例如来那度胺/>)。
在一些实施例中,本发明提供的至少一mTOR激动剂可包含至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动模拟物,或其任何盐或酯,或至少一芳香族氨基酸残基及/或mTOR激动芳香族氨基酸残余模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,或包含其的任何组合物或试剂盒。
在一些更具体的实施例中,由本公开提供的方法使用的mTOR激动剂可包含至少一芳香族氨基酸残基,或至少两个芳香族氨基残基的组合或其任何模拟物,或直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒。在一些特定实施例中,本文公开的方法的mTOR激动剂可包含以下组分中的至少一者。第一组分(a)包含至少一酪氨酸(Y)残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动剂酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些实施例中,mTOR激动剂可包含作为第二组分(b)的至少一色氨酸(W)残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述色氨酸残基及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物。在又一些实施例中,本发明的mTOR激动剂可包含第三组分(c),其为至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式及其任何组合或混合物。
更进一步,在一些特定实施例中,本发明方法所使用的mTOR激动剂可包含以下三种组分的组合:第一组分(a),其包含至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。本发明的mTOR激动剂还包含组分(b),其包含至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残余物及/或所述mTOR激动色氨酸的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物。本发明方法的mTOR激动剂还包括组分(c),其包含至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动型苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。应当理解,在一些特定实施例中,也作为蛋白酶体动力学的选择性调节剂起作用的mTOR激动剂(适用于本方面)是结合本发明的其他方面指定的任何mTOR激动剂。
在又一些进一步的实施例中,受试者可以接受及/或过去接受包含至少一UPS调节剂的治疗方案,例如至少一蛋白酶体抑制剂、PROTAC或任何公开的调节剂。在一些实施例中,监测这样的受试者的疾病进展。根据这些实施例,所述方法包括以下步骤:
首先(a),确定受试者的至少一生物样品的至少一细胞(或细胞部分)中的蛋白酶体亚细胞定位。应注意的是,在治疗方案开始后获得至少一检查样品。
下一步骤(b)涉及确定以下的至少一者:(i)疾病复发及/或反应性丧失,及/或受试者的抗药性,如果样本中的至少一细胞显示蛋白酶体细胞核定位丧失、或维持的细胞溶质定位,或者(ii)反应性或维持的受试者的反应性,如果样品的至少一细胞显示维持主要的蛋白酶体细胞核定位。
下一步骤(c)涉及选择合适的治疗方案。更具体而言,停止包括至少一UPS调节剂(例如,至少一蛋白酶体抑制剂、PROTAC或任何公开的调节剂)的治疗方案,治疗受试者表现出疾病复发及/或反应性丧失及/或抗药性(维持或新出现)。可替代地,所述步骤可包括维持显示反应性或维持反应性的受试者的治疗方案。
应当理解,在一些实施例中,在开始治疗之前或在治疗期间的任何早期阶段,受试者(表现出保持的反应性或丧失反应性)已经被识别或分类为反应者。
在一些实施例中,可以考虑对于表现出疾病复发及/或反应性丧失及/或抗药性的受试者,可以选择将维持治疗与UPS调节剂(特别是蛋白酶体抑制剂治疗与至少一mTOR激动剂或蛋白酶体易位或穿梭的任何其他选择性调节剂),特别是上文公开的mTOR激动剂的组合。
在一些实施例中,受试者患有至少一增殖性疾病及至少一蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病中的至少一者。
在一些实施例中,与本发明方法相关的增殖性疾病可以是至少一固体及非固体癌症。
在又一些实施例中,根据本发明的用于确定治疗方案的方法可适用于患有至少一增殖性疾病的受试者。在一些实施例中,这种病症可以是至少一血液恶性肿瘤。在又一些替代实施例中,根据本发明的用于确定治疗方案的方法可适用于蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病,例如淀粉样变及/或任何相关病症。
在一些特定实施例中,本发明的方法适用于蛋白质错误折迭疾病,也称为蛋白病(proteopathy)。因此,本公开提供了适用于患有任何蛋白病,特别是淀粉样变的受试者的预后方法及个人化治疗方法。
蛋白病(proteopathy)是指一类疾病,其中某些蛋白质结构异常,从而破坏细胞、组织及身体器官的功能。通常,蛋白质无法折迭成其正常形态;在这种错误折迭的状态下,蛋白质可能以某种方式变得有毒(毒性功能的增加),或者它们可能失去正常功能。蛋白病(proteopathy)(也称为蛋白质病(proteinopathies)、蛋白质构象紊乱(proteinconformational disorders)或蛋白质错误折迭疾病(protein misfolding diseases))包括Creutzfeldt–Jakob病及其他朊病毒疾病(prion diseases)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)、帕金森病(Parkinson's disease)、淀粉样变性(amyloidosis)、多系统萎缩及一系列其他疾病。在一些特定实施例中,蛋白病或蛋白错误折迭疾病可能是淀粉样变性。具体来说,淀粉样变性是一组异常蛋白质(称为淀粉样纤维)在组织中积聚的疾病。症状取决于类型,通常是多变的。它们可能包括腹泻、体重减轻、感觉疲倦、舌头肿大、出血、麻木、站立时感觉昏厥、腿部肿胀或脾脏肿大。
大约有30种不同类型的淀粉样变,每种都是由于一种特定的蛋白质错误折迭。有些是遗传的,有些是后天的。它们分为局部形式及系统形式。四种最常见的全身性疾病是轻链(light chain,AL)、炎症(inflammation,AA)、透析(dialysis,Aβ2M)及遗传性老年(hereditary and old age,ATTR)。应当理解,本发明的预后及个人化治疗方法,以及本文之后公开的任何治疗方法、组合物及试剂盒,可以适用于任何类型的淀粉样变,特别是本公开中讨论的任何类型。
与本公开的方法相关的蛋白质错误折迭疾病的其他例子包括但不限于阿尔茨海默病、脑β-淀粉样血管病(Cerebralβ-amyloid angiopathy)、青光眼视网膜神经节细胞变性(Retinal ganglion cell degeneration in glaucoma)、Prion病(多发性)、帕金森病及其他突触核蛋白病(synucleinopathies)(多发性)、Taopathies(多发性)额颞叶变性(Frontotemporal lobar degeneration,FTLD)、肌萎缩侧索硬化症(Amyotrophic lateralsclerosis,ALS)、亨廷顿舞蹈症(Huntington's disease)及其他三核苷酸重复性疾病(trinucleotide repeat disorders)(多发性)、家族性英国痴呆症(Familial Britishdementia)、家族性丹麦痴呆症(Familial Danish dementia)、遗传性脑出血伴淀粉样变性(Hereditary cerebral hemorrhage with amyloidosis)(冰岛)(HCHWA-I)、亚历山大病(Alexander disease)、Pelizaeus-Merzbacher病、Seipinopathies、家族性淀粉样神经病、老年性系统性淀粉样变性(Familial amyloidotic neuropathy)、Serpinopathy(多发性)、AL(轻链)淀粉样变(原发性系统性淀粉样变(Senile systemic amyloidosis))、AH(重链)淀粉性变、AA(继发性)淀粉样变性、II型糖尿病、主动脉内侧淀粉样变(Aortic medialamyloidosis)、ApoAI淀粉样变,ApoAII淀粉样变及ApoAIV淀粉样变;芬兰型家族性淀粉样变性(Familial amyloidosis of the Finnish type,FAF)、溶菌酶淀粉样变(Lysozymeamyloidosis)以及纤维蛋白原淀粉样变(Fibrinogen amyloidosis)、透析淀粉样变性(Dialysis amyloidosis)、包涵体肌炎/肌病(Inclusion body myositis/myopathy)、白内障、视网膜色素变性伴视紫红质突变(Retinitis pigmentosa with rhodopsinmutations)、甲状腺髓样癌、心房淀粉样变性、垂体泌乳素瘤、遗传性晶格状角膜营养不良、皮肤苔藓淀粉样变性、马洛里小体(Mallory bodies)、角膜乳铁蛋白淀粉样变性、肺泡蛋白沉积症、牙源性(Odontogenic)(Pindborg)肿瘤淀粉样变性、精囊淀粉样变性、载脂蛋白C2淀粉样变性、载脂蛋白C3淀粉样变性、Lect2淀粉样变性、胰岛素淀粉样变性、Galectin-7淀粉样变性(原发性局部皮肤淀粉样变性)、Corneodesmosin淀粉样变性、Enfuvirtide淀粉样变性、囊性纤维化、镰状细胞病。
在一些进一步的实施例中,由于淀粉样变也被分类为沉积疾病,本发明的方法也可适用于任何沉积疾病。如本文所用,沉积疾病是涉及或以不溶性细胞外蛋白片段或任何其他代谢产物沉积为特征的任何疾病,这些代谢产物已变得抗消化,从而干扰及损害组织或器官功能,并可能导致器官衰竭。
此外,在一些实施例中,根据本发明确定个人化治疗方案的方法可适用于恶性肿瘤,特别是血液学癌症,例如MM及/或相关疾病。根据这些实施例,本发明的方法可用于预测、监测及/或确定患有MM及/或其任何相关病症及转移的受试者的个人化治疗方案。
多发性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM),也称为浆细胞性骨髓瘤及单纯性骨髓瘤,是一种浆细胞的癌症,通常是一种能产生抗体的白细胞。通常,最初没有发现症状。随着病情的发展,可能会出现骨痛、出血、频繁感染及贫血。并发症可能包括淀粉样变。多发性骨髓瘤的病因尚不清楚。危险因素包括肥胖、辐射暴露、家族史及某些化学物质。多发性骨髓瘤可能由意义不明的单克隆丙种球蛋白病发展为阴燃性骨髓瘤。异常的浆细胞产生异常抗体,可导致肾脏问题及血液过浓。浆细胞也可以在骨髓或软组织中形成团块。当只有一个肿瘤存在时,称为浆细胞瘤;不止一个则被称为多发性骨髓瘤。多发性骨髓瘤的诊断依据是血液或尿液检测发现异常抗体、骨髓活组织检查发现癌性浆细胞、医学影像发现骨损伤。另一个常见的发现是高血钙水平。由于许多器官可能受到骨髓瘤的影响,症状及体征差异很大。有时用来记忆多发性骨髓瘤的一些常见症状的助记符是CRAB:C=钙(升高),R=肾衰竭,A=贫血,B=骨损伤。骨髓瘤还有许多其他可能的症状,包括机会性感染(如肺炎)及体重减轻。多发性骨髓瘤被认为是可以治疗的,但通常无法治愈。意义不明的单克隆丙种球蛋白病(Monoclonal gammopathy of undetermined significance,MGUS)会增加患多发性骨髓瘤的风险。MGUS以每年1%至2%的速度转化为多发性骨髓瘤,几乎所有的多发性髓瘤病例都在MGUS之前。
阴燃型多发性骨髓瘤(smoldering multiple myeloma)会增加患多发性瘤的风险。被诊断患有这种癌前疾病的个体在前5年每年以10%的速度发展多发性骨髓瘤,在接下来的5年中每年以3%的速度发展,然后每年以1%的速度发展。
肥胖与多发性骨髓瘤有关,体重指数每增加5,风险增加11%。研究报告了骨髓瘤的家族易感性(familial predisposition)。许多蛋白质(paratarg蛋白质)的过度磷酸化(一种以常染色体显性方式遗传的趋势)似乎是这些家族中的常见机制。这种倾向在患有骨髓瘤的非裔美国人中更为常见,并可能导致骨髓瘤的发病率较高。爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus,EBV)很少与多发性骨髓瘤相关,尤其是在因艾滋病毒/艾滋病、器官移植或慢性炎性疾病(如类风湿性关节炎)而免疫缺陷的患者中。EBV阳性的多发性骨髓瘤被世界卫生组织列为EB病毒相关淋巴增生性疾病的一种形式,并被称为EB病毒相关性浆细胞骨髓瘤。EBV阳性疾病更常见于浆细胞瘤而非多发性骨髓瘤型浆细胞癌症。参与EBV+疾病的组织通常表现为EBV+细胞的病灶,表现为快速增殖的未成熟或分化不良的浆细胞。细胞表达EBV基因(例如EBER1及EBER2)的产物。尽管EBV有助于大多数爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)相关淋巴增殖性疾病的发展及/或进展,但其在多发性骨髓瘤中的作用尚不清楚。然而,与EBV阴性浆细胞瘤患者相比,EBV阳性伴局限性浆细胞瘤的患者更有可能发展为多发性骨髓瘤。这表示出EBV可能在浆细胞瘤向全身性多发性骨髓瘤的进展中起作用。应当理解,本公开的方法可以适用于本文所公开的任何类型或阶段的MM。
在一些进一步的实施例中,预后方法以及本公开之后在此公开的治疗方法可适用于各种实体肿瘤,特别是任何器官或组织中可局部施用的任何肿瘤。因此,应当理解,本文结合本发明的其他方面公开的任何增殖性疾病也可以适用于本方面。
因此,本发明人提供了涉及诊断步骤的治疗方法。更具体而言,本发明的另一方面涉及一种用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟有需要的受试者中至少一增殖性疾病及至少一蛋白质错误折迭疾病中的至少一者的进展的方法。更具体而言,本发明的治疗方法可包括以下步骤:
首先在步骤(a)中,确定受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位。在下一步骤(b)中,将受试者分类为:(i)对于包含至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂PROTAC或任何所公开的调节剂)的一治疗方案的一反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核;或(ii)一抗药性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位是胞质溶胶。下一步骤(c)涉及基于反应性选择治疗方案,从而治疗所述受试者。在一些实施例中,所述步骤还包括应用受试者的适当治疗方案。
在一些实施例中,根据本发明选择及应用适当的治疗方案可以包括以下选项中的一者的步骤:
第一选项(i)包括向分类为一反应者的一受试者施用至少一UPS调节剂的一有效量,例如至少一蛋白酶体抑制剂、其任何组合或包含其的任何组合物。
在又一选项(ii)中,向被分类为抗药或非反应性受试者的受试者施用至少一mTOR激动剂的有效量,或其任何组合,可选地与至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂、PROTAC或任何所公开的调节剂)一起施用。此外,在另一选项(iii)中,适用于被分类为一抗药者的受试者的情况,所述步骤包括停止包含至少一UPS调节剂的治疗方案,所述至少一UPS调节剂例如为至少一蛋白酶体抑制剂、或任何公开的调节剂、或其任何组合或包含其的任何组合物。
在一些实施例中,所述受试者可进一步施用至少一额外的治疗剂,例如,至少一增强短期压力状态或过程的药物。在更具体的实施例中,这种额外的治疗剂可以是导致、增强及/或加重缺氧的至少一药物。在一些特定实施例中,导致或引起缺氧的试剂可以是抑制或减少血管生成的试剂。可用于本发明方法的血管生成抑制剂的非限制性实例包括VEGF抑制剂,例如抗VEGF抗体或VEGF融合蛋白、激酶抑制剂及参与蛋白降解的试剂。此外,在一些实施例中,本公开包括与诱导或增强短期压力的治疗方案的组合,例如使用限制饮食。
在一些实施例中,至少一mTOR激动剂包含至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动模拟物,或其任何盐或酯,或所述至少一芳香族氨基酸残基及/或所述mTOR激动性芳香族氨基酸残余模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或直接或间接调节所述至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,或其任何组合物或混合物,或包含其的任何组合物或试剂盒。在一些更具体的实施例中,由本公开提供的方法使用的mTOR激动剂可包含至少一芳香族氨基酸残基或至少两个芳香族氨基残基的组合,或其任何模拟物,或直接或间接调节所述至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或或其任何载体、基质、纳米或微粒。在一些特定实施例中,本文公开的方法的mTOR激动剂可包含以下组分中的至少一者。第一组分(a)包含至少一酪氨酸(Y)残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动剂酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。在一些实施例中,mTOR激动剂可包含作为第二组分(b)的至少一色氨酸(W)残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述色氨酸残基及/或所述mTOR激动色氨酸仿物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物。在又一些实施例中,本发明的mTOR激动剂可包含作为第三组分(c)的至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动型苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。更进一步,在一些特定实施例中,本发明方法所使用的mTOR激动剂可包含以下三种组分的组合:第一组分(a),包含至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、酪氨酸残基及/或mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。本发明的mTOR激动剂还包含组分(b)、至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、色氨酸残余物及/或所述mTOR激动色氨酸的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物。本发明方法的mTOR激动剂还包括组分(c)、至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、苯丙氨酸残基及/或mTOR激动型苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。
在一些实施例中,基于反应性选择治疗方案包括向被分类为反应者的受试者施用至少一UPS调节剂的一有效量,所述至少一UPS调节剂例如为至少一蛋白酶体抑制剂、或任何公开的UPS调节剂、其任何组合或包含其的任何组合物。在一些实施例中,被分类为对蛋白酶抑制剂有抗药性或非反应性的受试者可以不使用这种UPS调节剂,特别是蛋白酶体抑制剂或任何公开的UPS调节剂进行治疗。对于抗药性受试者,可以考虑使用蛋白酶体易位的任何选择性抑制剂,例如本文公开的mTOR激动剂进行治疗(作为单独的治疗化合物或与任何其他化合物,特别是任何UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂)。此外,在一些实施例中,治疗方案的选择,特别是针对被分类为对于UPS调节剂的一抗药性受试者,除了本发明的mTOR激动剂或蛋白酶体易位的任何其他选择性抑制剂之外,还可以包括额外的治疗剂或治疗或饮食方案。在一些实施例中,额外的治疗剂可以是至少一增强短期压力状态或过程的药物。在更具体的实施例中,额外的治疗剂可以是导致、增强及/或加重缺氧的至少一药物。在一些特定实施例中,导致或引起缺氧的试剂可以是抑制或减少血管生成的试剂。可用于本公开的方法、组合物及试剂盒中的血管生成抑制剂的非限制性实例包括以下的至少一者:VEGF抑制剂,例如抗VEGF抗体或VEGF融合蛋白、激酶抑制剂及参与蛋白降解的试剂。此外,这种压力诱导程序可包括通过向受治疗受试者提供限制饮食来提供饥饿状态。
在又一些进一步的实施例中,在轻度或中度反应性的情况下,还可以考虑与本发明的mTOR激动剂(或蛋白酶体易位的任何其他选择性抑制剂)组合,从而增加对UPS调节剂治疗(例如用蛋白酶体抑制剂治疗,或本发明公开的任何其他UPS调节剂)的敏感性。
在一些实施例中,本发明进一步提供至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂、或其与至少一mTOR激动剂的任何组合),用于保护或延迟有需要的受试者中至少一增殖性疾病及至少一蛋白质错误折迭疾病中的至少一者的进展。在一些实施例中,这种方法包括用于评估受试者对于至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的反应性的先前诊断步骤。更具体而言,所述方法涉及确定所述受试者的至少一生物样品的至少一细胞中的蛋白酶体亚细胞定位。在下一步骤中,将受试者分类为(i)对于包含至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案的一反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核;或(ii)一非反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位是在胞质溶胶。最后一步是治疗步骤,包括为受试者选择合适的治疗方案。具体地,向被分类为反应者的受试者施用至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的有效量、其任何组合或包含其的任何组合物。被分类为对于UPS调节剂(例如,至少一蛋白酶抑制剂)有抗药性或无反应的受试者将不会用这种蛋白酶体抑制剂治疗(或将用至少一mTOR激动剂及/或任何其他蛋白酶体易位选择性抑制剂治疗或与之结合)。
具体而言,在例如MM或淀粉样变的慢性疾病中,本文公开的治疗方法可进一步监测患者,从而为患者提供个人化的完整治疗方案。
因此,在一些实施例中,受试者接受及/或曾经接受包含至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案,并监测疾病进展。因此,所述方法可包括以下步骤,首先在步骤(a)中,确定受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位。在一些实施例中,在开始治疗方案之后获得至少一样品。在下一步骤(b)中,确定以下的至少一者:(i)疾病复发及/或反应性丧失及/或抗药性、及/或维持的无反应性,如果所述样品的至少一细胞显示出蛋白酶体核定位丧失、胞质溶胶定位及/或维持的胞质溶胶蛋白酶体定位;或(ii)受试者的反应性或维持的反应性,果样品的至少一细胞显示出维持的主要蛋白酶体核定位。下一步(c)涉及选择及应用适当的治疗方案。更具体而言,在一些实施例中,停止包括显示疾病复发及/或反应性丧失的受试者的至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案。可替代地,所述步骤可包括维持一受试者的治疗方案,所述治疗方案显示出反应性或维持的反应性。
应当理解,在一些实施例中,在开始治疗之前,已经将受试者识别并确定为反应者。
在一些实施例中,对于表现出疾病复发及/或反应性丧失的受试者,还可以考虑将维持的UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂治疗)与至少一mTOR激动剂组合的选项。
在一些实施例中,与本发明方法相关的增殖疾病可以是至少一固体及非固体癌症或其任何转移。
在一些实施例中,本发明的治疗方法可适用于增殖性疾病,特别是至少一血液恶性肿瘤。或者,本发明的方法可适用于至少一蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病,特别是淀粉样变性及任何相关病症。
在更具体的实施例中,本发明提供了适用于至少一血液恶性肿瘤的治疗方法。在更具体的实施例中,这种血液学恶性肿瘤可以是MM。因此,这种方法适用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟受试者的MM的进展及/或任何相关病症。
作为提供预后及定制的治疗方法,本发明还包括提供执行本文公开的方法所需的任何手段、试剂或工具。因此,执行本发明方法所需的试剂及材料可以作为试剂盒来提供。
因此,本发明的另一方面提供了一种试剂盒,所述试剂盒包括:
第一组分(a)包括至少一用于确定至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中蛋白酶体亚细胞定位的装置及/或试剂。在一些实施例中,本发明的试剂盒可可选地进一步包括以下的至少一者:(b)提供蛋白酶体亚细胞定位标准值的预定校准曲线;(c)至少一对照样品;及(d)使用说明。
在一些实施例中,本发明试剂盒的预定校准曲线可以提供蛋白酶体核及胞质定位中的至少一者的标准值。在一些实施例中,这样的值可以是针对反应者及抗药受试者预定的值。
在一些进一步的实施例中,本发明的试剂盒可进一步包含进行蛋白酶体亚细胞定位所需的特定试剂及组分。
应当理解,试剂盒中的组分可以取决于蛋白酶体亚细胞定位的检测方法,并且不限于任何方法。在一些实施例中,本发明的试剂盒可进一步包含至少一的试剂,以用于进行免疫组织化学、蛋白酶体活性探针的活细胞成像、核部分的蛋白质印迹(例如,20及19S亚基的细胞的蛋白质印迹)、细胞分析及冷冻电子断层成像。
在进一步的实施例中,本发明的试剂盒可进一步包括用于确定蛋白酶体亚细胞定位的至少一装置、仪器、装置或任何试剂。
在一些实施例中,本发明的试剂盒可特别适用于预后方法,用于预测及评估患有病理性疾病的受试者对于包括至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的治疗方案的反应性,并且可选地用于监测受试者的疾病进展。因此,在一些实施例中,本发明的试剂盒是预后试剂盒。在又一些实施例中,本发明的试剂盒适用于患有病理性疾病的受试者对于包括至少一UPS调节剂的治疗方案的反应性的预测、预测及评估。在又一些具体实施例中,本发明的试剂盒可适用于本发明的任何诊断方法及治疗方法,具体地,如本文所述。
因此,在一些实施例中,本公开的试剂盒可进一步包括至少一治疗组分或试剂。合适的治疗组分可包括但不限于至少一UPS调节剂,例如至少一蛋白酶体抑制剂及/或至少一选择性蛋白酶体易位抑制剂,特别是本发明公开的至少一mTOR激动剂。在一些实施例中,mTOR激动剂包含至少一芳香族氨基酸残基,或直接或间接调节至少一芳香族氨基酸残基内的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,如本公开所详述。
在一些进一步的实施例中,本公开的试剂盒可以进一步包括至少一额外的治疗剂。在更具体的实施例中,这种额外的治疗剂可以是至少一增强短期压力状态或过程的药剂,例如,至少一导致、增强及/或加重缺氧的药剂。在一些特定实施例中,导致或引起缺氧的试剂可以是抑制或减少血管生成的试剂。可用于本公开的方法、组合物及试剂盒中的血管生成抑制剂的非限制性实例包括以下的至少一者:VEGF抑制剂,例如抗VEGF抗体或VEGF融合蛋白、激酶抑制剂及参与蛋白降解的试剂。此外,本公开还可以包括膳食化合物,其能够向受试者提供限制性膳食。在一些实施例中,本发明还可以提供一种用于确定及/或优化患有病理性疾病的受试者的个人化治疗方案的计算机软件产品。更具体而言,所述产品包括存储程序指令的计算机可读介质,所述程序指令在由计算机读取时使计算机:
a、在至少一细胞中、或在生物样品中的细胞群中、或细胞的任何部分中测定(并可选地定量)蛋白酶体亚细胞定位;
b、确定样品中细胞核或胞质溶胶蛋白酶体定位的程度(具体地,确定主要是在细胞核、胞质溶胶、或均匀分布);可选地,
c、与标准值进行比较,其中所述值反应受试者对于包括至少一UPS调节剂(例如至少一蛋白酶体抑制剂)的至少一治疗方案的反应能力。
如本公开所示,蛋白酶体动力学可以用作个人化药物的强大预后工具,为受试者提供适当的治疗方案。在一些特定的实施例中,本发明提供了一种用于筛选可以用调节蛋白酶体动力学的化合物,特别是蛋白酶体易位抑制剂治疗的患者的工具。实施例14提供了这种筛选的非限制性实例。因此,本发明的另一方面涉及预测及评估患有增殖性疾病(例如癌症)的受试者对蛋白酶体易位选择性抑制剂的反应性的预测方法,以及选择性地监测疾病进展。在一些实施例中,所述方法包括以下步骤:首先(a),确定受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或细胞的任何部分中蛋白酶体亚细胞定位;及(b)如果蛋白酶体亚细胞定位在至少一样品的至少一细胞中是在胞质溶胶的或均匀分布的,则将受试者分类为对于蛋白酶体易位的选择性抑制剂的一反应性受试者。在一些实施例中,所述方法可包括用于确认选择性抑制剂对治疗受试者的蛋白酶体定位的影响的额外及任选的评估步骤。因此,在一些实施例中,所述方法可选地进一步包括以下步骤:(c),在将细胞暴露于选择性抑制剂后,确定步骤(b)中分类为反应性受试者的受试者样品的至少一细胞中的蛋白酶体亚细胞定位。更具体而言,如果蛋白酶体亚细胞定位在与蛋白酶体易位的选择性抑制剂接触的至少一细胞中主要在细胞核,则确认了受试者对于特定选择性抑制剂的反应性。
蛋白酶体选择性抑制剂的具体实施例由本发明公开的mTOR激动剂提供,如下文结合本发明的其他方面所述。
在一些进一步实施例中,上述预测方法可进一步用于本发明的一些方面,以确定癌症患者的个人化治疗方案。本发明的进一步方面涉及治疗癌症的治疗方法,包括上述预测步骤,以及使用特定选择性抑制剂来治疗被分类为对于蛋白酶体易位选择性抑制剂(例如YWF或其组合物)的一反应者的一受试者。
本公开的另一方面涉及用于鉴定蛋白酶体易位的至少一选择性调节剂的筛选方法。在更具体的实施例中,所述方法旨在鉴定蛋白酶体易位至胞质溶胶的抑制剂或替代性增强剂。在更具体的实施例中,所述方法包括以下步骤:
首先(a),确定在细胞压力状态下与候选化合物接触的至少一细胞的蛋白酶体亚细胞定位。在一些实施例中,这种压力状态可以是任何短期压力状态,例如饥饿或缺氧。
下一步骤(b)涉及确定在细胞压力状态下与候选化合物接触的至少一细胞中至少一对照蛋白的亚细胞定位。应当理解,本发明方法的步骤(a)及(b)可以同时进行,或者可替代地,以任一顺序进行。在一些进一步的实施例中,蛋白酶体或对照蛋白的亚细胞定位的测定可以在细胞或所述细胞的任何部分中进行。在又一些其它实施例中,本发明方法使用的至少一控制蛋白可以是至少一输出控制蛋白及/或输入控制蛋白。下一步骤(c)涉及确定候选化合物是:(i)蛋白酶体易位的选择性抑制剂,如果如步骤(a)中所确定的蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核,并且步骤(b)的至少一输出对照蛋白的亚细胞定位在与所述候选化合物接触的至少一细胞中主要是在胞质溶胶的或均匀分布的。替代地或额外地,在将导入的蛋白质用作对照蛋白质(导入的对照蛋白质)的情况下,如果如步骤(a)中确定的蛋白酶体亚细胞定位主要是胞质溶胶的,以及步骤(b)中的至少一者导入的对照蛋白的亚细胞定位在与候选化合物接触的至少一细胞中主要是在细胞核,则将候选物确定为(ii)蛋白酶体易位到胞质溶胶的一选择性增强剂。
在一些实施例中,对照导入及/或导出的蛋白质的导入及/或者导出可以是由至少一核质转运组分(nucleocytoplasmic transport component)直接或间接所介导。
如上所述,本发明筛选方法使用的对照蛋白是通过与核孔复合体(Nuclear PoreComplex)的任何组分或与核质转运(nucleocytoplasmic transport)相关的任何组份直接或间接相互作用而跨核膜输出或输入的任何蛋白。更具体而言,核质转运(nucleocytoplasmic transport)是任何运送物(例如,蛋白质及一些RNP)通过核孔复合体(Nuclear Pore Complex,NPC)在细胞核及胞质溶胶之间的易位。NPC是一种巨大的蛋白质复合体,由约30种不同的蛋白质组成,统称为核孔蛋白(nucleoporins,NUPs)。货物运输通常是由核运输受体(Nuclear Transport Receptors,NTRs)家族(称为核蛋白)所介导。核蛋白通过识别核定位信号(nuclear localization signal,NLS)或核出口信号(nuclearexport signal,NES)与货物结合。最好描述的NTR是importin-Alpha、importin-Beta1、importin-Beta2及染色体区域维护1(chromosome--region maintenance 1,CRM1/exportin-1)。它们都具有N端RanGTP结合结构域、C端货物结合结构域及结合NPC成分的能力。在蛋白质的核输入过程中,进口蛋白α充当衔接蛋白,以识别并连接进口蛋白β及货物蛋白之间的蛋白质。Importin Alpha凭借经典NLS可以精确识别货物蛋白,并且它还具有Importinβ结合(importin-Beta binding,IBB)结构域。此外,某些蛋白质在细胞核及胞质溶胶之间不断来回穿梭(如参与mRNA前处理及mRNA输出的hnRNP蛋白质、转录因子、细胞周期蛋白、信号转导蛋白及运输载体)。能够在细胞核及胞质溶胶之间来回运输的蛋白质被称为穿梭蛋白(shuttling proteins)或核质穿梭蛋白(nucleocytoplasmic shuttlingproteins),且通常含有一个双向信号,所述信号赋予了输入及输出。穿梭蛋白(shuttlingproteins)通常介导蛋白质及特定RNA穿过核膜的易位。穿梭蛋白的非限制性实例包括例如核仁素(nucleolin)、P53、肉豆蔻酰化富含丙氨酸的C激酶底物(Myristoylated alanine-rich C kinase substrate,MARCKS)、Survivin、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor2,Nrf2)、Improtin-Alpha1、TAR(RNA调节元件)DNA结合蛋白43(TDP-43)、Nucleophosmin(NPM)(急性髓性白血病)及Cas相互作用锌指蛋白(Cas-interacting zincfinger protein,CIZ)。
在一些特定实施例中,用于本发明的控制蛋白可以是经由核输出受体、核输入受体或任何穿梭及/或衔接蛋白跨核膜转运的任何蛋白。
在一些实施例中,适用于本筛选方法的输出控制蛋白可以是包含至少一核输出信号(nuclear export signal,NES)的任何蛋白。目前鉴定的NES序列基本上富含亮氨酸(leucine)。在又一些特定实施例中,富含亮氨酸的NES具有某些共有序列:Z-X2–3-Z-X2–3-Z-X-Z,如SEQ ID NO.1所示(其中“Z”可以是L、I、V、F、M中的任何一者;并且“X”可以是任何氨基酸,如所附序列中所示为Xaa)。在又一些特定且非限制性的实施例中,适用于本发明的输出对照蛋白可包含至少一NES序列,所述至少一NES序列包含氨基酸序列LPPLERLTL,如SEQID NO.2所示。在一些特定及非限制性实施例中,在本公开的筛选方法中用作对照输出蛋白的NES序列源自p62蛋白。在一些特定实施例中,NES序列包含由核酸序列编码的氨基酸序列(如SEQ ID NO.3所示)、或其任何变体及同源物。在一些进一步的实施例中,适用于本发明方法的p62衍生的NES序列包含由SEQ ID NO.4表示的氨基酸序列。替代地或额外地,在本筛选方法中使用进口对照蛋白的情况下,这种对照蛋白可以是包含至少一NLS的任何蛋白。在一些实施例中,可用于本发明的进口对照蛋白可包含NLS,所述NLS的特征在于以下共有序列中的至少一者:如SEQ IDNO.5所示的PKKKRKV(单部分(monopartite)),或如SEQ ID NO.6所示的其任何变体及同源物KRXXXXXXXXKKKL,其中“X”可以是任何氨基酸(双部分(bipartite)),或包含如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列PRVRY-NPYTTRP的非经典NLS,或其任何变体及同源物。在又一些特定及非限制性实施例中,可用于本发明的NLS序列可通过SV40 NLS或其任何变体及同源物,所述SV40 NLS包含由SEQ ID NO.8所示的核酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施例中,编码的NLS序列包含由SEQ ID NO.5表示的氨基酸序列。因此,在一些特定且非限制性的实施例中,特别是为了鉴定蛋白酶体易位的抑制剂,控制蛋白(特别是输出的控制蛋白)是至少一核输出受体的至少一底物。核输出受体与具有胞质溶胶细胞功能的不同目标货物(蛋白质或RNA)相互作用并介导其运输。在一些实施例中,此类受体包括核输出受体Exportin1(Xpo1)/CRM1、Exportin4、Exportin 5、Exportint-t(Xpo-t)/los1p、export-In细胞凋亡敏感性蛋白(CAS)/Cse1p及Msn5p(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))。
在一些实施例中,至少一核输出受体可以是CRM1/Exportin 1(染色体维持1(Chromosomal Maintenance 1))。因此,在一些实施例中,本公开的筛选方法使用的对照蛋白可以是CRM1/Exportin 1的任何天然或合成底物,其包含NES。
在一些实施例中,本公开的筛选方法使用的对照蛋白可以是CRM1/Exportin 1的任何天然底物。用于本发明的底物的实例可包括例如NF-κb的p65亚基及本公开中使用的泛素连接酶后期促进复合物(Anaphase Promoting Complex,APC),或CRM1/Exportin 1的任何已知底物。仅举几个例子,Snurportin 1(涉及U snRNA输入)、HIV的Rev-1蛋白、腺瘤性息肉病大肠杆菌肿瘤抑制蛋白(adenomatous polyposis coli tumor suppressor protein,APC)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1B(Cyclin-dependent kinase inhibitor1B,CDKN1B)、II型、主要组织相容性复合物、反式激活剂(class II,majorhistocompatibility complex,transactivator;CIITA)、60S核糖体输出蛋白(60Sribosomal export protein,NMD3)、Ran特异性结合蛋白1(Ran-specific bindingprotein1,RANBP1)、NBP3、Ran、染色质亚家族B成员1的SWI/SNF相关基质相关联肌动蛋白依赖调节剂(SWI/SNF-related matrix-associated actin-dependent regulator ofchromatin subfamily B member 1,SMARCB1)或含有NES序列的p53,在所公开的筛选方法中可以用作输出的对照蛋白。
在一些进一步的实施例中,本公开的筛选方法使用的对照蛋白可以是包含NES的任何嵌合蛋白。具体地,可以使用与NES序列融合的任何标签或任何报告蛋白,例如本公开所例示的NES-GFP。可与NES序列融合以产生本文用作对照蛋白的合成底物的报告蛋白的非限制性实例,在下文中结合适用于本公开方法所使用的进口对照蛋白的NLS序列来进行描述。
在一些实施例中,蛋白酶体易位的选择性诱导物特异性地调节与蛋白酶体动力学直接或间接相关的生物过程。在一些实施例中,调节剂是蛋白酶体易位的选择性抑制剂。这种抑制剂可适用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟受试者中与至少一短期细胞压力状态/过程相关的至少一病症或至少一病理性疾病的进展。
在一些实施例中,特别是为了鉴定增强蛋白酶体易位的化合物,本发明方法使用的对照蛋白(特别是导入的对照蛋白)是至少一细胞核导入受体的至少一底物。细胞核输入受体与细胞核内具有细胞功能的蛋白质相互作用并介导蛋白质的运输。此类受体的实例包括但不限于Imp Alpha/Imp Beta复合物、Snurportin/Impβ复合物、RIP Alpha/Imp-Beta复合物、Imp7/Imp-Beta复合物、TRN1、Sxm1p/Kap108p(酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae))、Mtr10p/Kap111p(酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae))、Nmd5p/Kap119p(酿酒啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、Kap114p(酿酒酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))及Pdr6p/Kap122p(酿酒葡萄酵母(Saccharomycescerevisiae))。因此,本文公开的细胞核导入受体的任何底物,特别是包含NLS序列的任何蛋白质,可以用作本公开的筛选方法中的导入对照蛋白。在一些进一步的实施例中,本公开的筛选方法所使用的导入的对照蛋白可以是包含NLS的任何嵌合蛋白。具体地,可以使用与NLS序列融合的任何标记或任何报告蛋白,例如NLS-GFP等。
可与上述NLS及/或NES序列融合的合成底物的非限制性实例可包括任何标记或报告蛋白。此类报告蛋白的非限制性实例可包括但不限于Flag、HA、myc或任何荧光蛋白,例如GFP、EGFP、Emerald、Superfolder GFP、Azami Green、mWasabi、TagGFP、TurboGFP、AcGFP、ZsGreen、T-Sapphire、EBFP、EBFP2、Azurite、mTagBFP、mECFP、Cerulean、mTurquoise、CyPet、AmCyan1、Midori Ishi Cyan、TagCFP、EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、,TagYFP、PhiYFP、ZsYellow1、mBanana、Kusabira Orange、Kusabira Orange 2、mOrange、mOrange2、dTomato、dTomato-Tandem、TagRFP、TagRFP-T、DsRed、DsRed2、DsRed Express(T1)、DsRed单体、mTangerine、mRuby、mApple、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、HcRed1、mRaspberry、dKeima Tandem、HcRed Tandem、mPlum及AQ143等。
如本文所述,本公开提供了筛选蛋白酶体易位的选择性调节剂的方法。如本文所用,“调节剂”是指在感兴趣的分子、过程、途径或现象中导致、引起或促进定性或定量变化、改变或修饰的任何化合物。具体地说,蛋白酶体从细胞核向胞质溶胶的易位。无限制地,这种变化可能是蛋白酶体易位的增加、升高、增强及增强。在又一些替代实施例中,所述变化可以是蛋白酶体易位到胞质溶胶的减少、减少、抑制、减弱。
在另一方面,本发明还提供了至少一mTOR调节化合物的筛选方法。这种mTOR调节剂(激动剂或拮抗剂)可用作蛋白酶体动力学的调节剂。优选地,在各种病理及/或生理条件及过程中。本发明的方法包括在与至少一候选化合物或与多种候选化合物接触的至少一细胞中确定蛋白酶体亚细胞定位的步骤。在一些实施例中,细胞在基础条件下与候选细胞接触。导致主要细胞核蛋白酶体亚细胞定位的候选化合物被分类为mTOR激动剂,导致主要胞质溶胶蛋白酶体定位的候选物质被分类为mTOR拮抗剂。
候选化合物可以是任何无机或有机分子、任何小分子、基于核酸的分子、任何适配体、任何肽(L-以及D-aa残基)或其任何组合。待测试化合物可称为测试化合物或候选化合物。在各种实施例中,任何化合物都可用作测试或候选化合物。在一些实施例中,可以使用FDA批准的适合人类的化合物库。化合物库可从许多公司商购,包括但不限于MaybridgeChemical Co.(Trevillet,Cornwall,英国)、Comgenex(Princeton,新泽西州(NJ))、Microsource(New Milford,中非(CT))、Aldrich(Milwaukee,WI)、AKos Consulting andSolutions GmbH(瑞士巴塞尔)、Ambienter(法国巴黎)、Asinex(俄罗斯莫斯科)、Aurora(奥地利格拉茨)、BioFocus DPI(瑞士)、Bionet(英国Camelford)、ChemBridge(加利福尼亚州圣地亚哥)、Chem Div(加利福尼亚州圣迭戈)、Chemical Block Lt(俄罗斯莫斯科)、ChemStar(俄罗斯首都莫斯科)、Exclusive Chemistry,Ltd(俄罗斯奥布宁斯克)、Enamine(乌克兰基辅)、Evotec(德国汉堡)、Indofine(新泽西州希尔斯堡)、Interbio screen(俄罗斯莫斯科,微化学有限公司(俄罗斯莫斯科)、奥塔瓦(安大略省多伦多市)、PharmEx有限公司(俄罗斯莫斯科市)、普林斯顿生物分子公司(新泽西州蒙茅斯枢纽市)、科学交流中心(新罕布什尔州奥斯西比中心)、Specs(荷兰代尔夫特市)、TimTec(德国纽瓦克市)、多伦多研究公司(美国纽约州北部)、UkrOrgSynthesis(乌克兰基辅)、Vitas-M(俄罗斯莫斯科州)、Zelinsky Institute(俄罗斯莫斯科省)及Bicoll(中国上海)。组合库可用,可以准备。细菌、真菌、植物及动物提取物形式的天然化合物库可在市场上买到,或可通过本领域熟知的方法容易制备。从天然来源(如动物、细菌、真菌及植物来源)及海洋样品中分离的化合物可测试是否存在潜在有用的药物化合物、蛋白酶体易位的选择性调节剂。应当理解,待筛选的试剂也可以由化学成分或人造化合物衍生或合成。在一些实施例中,可用于本发明的文库可包含至少10000种化合物、至少50000种化合物、至少100000种化合物、至少250000种化合物或更多。
在一些特定实施例中,通过本发明的筛选方法筛选的候选化合物可以是小分子。本文所用的“小分子”是质量小于约2千道尔顿(kDa)的有机分子。在一些实施例中,小分子小于约1.5kDa,或小于约1kDa。在一些实施例中,小分子小于约800道尔顿(Da)、600Da、500Da、400Da、300Da、200Da或100Da。通常,小分子具有至少50Da的质量。在一些实施例中,小分子是非聚合的。在一些实施例中,小分子不是氨基酸。在一些实施例中,小分子不是核苷酸。在一些实施例中,小分子不是醣类。在一些实施例中,小分子包含多个碳-碳键,并且可以包含一个或多个杂原子及/或一个或更多个对与蛋白质的结构相互作用(例如氢键)重要的官能团,例如胺、羰基、羟基或羧基,并且在一些实施例中包含至少两个官能团。小分子通常包含一个或多个环状碳或杂环结构及/或芳香族或多芳香族结构,任选被一个或更多个上述官能团取代。
本发明提供了蛋白酶体易位的特异性调节剂及用于鉴定这些选择性调节剂(特别是抑制剂)的筛选方法。本发明进一步证明了这种选择性抑制剂(例如YWF,三连体(triad))在选择性杀伤癌症细胞方面的治疗潜力。因此,本发明包括使用任何选择性调节剂(特别是蛋白酶体移位的任何选择性抑制剂)来选择性诱导癌症细胞的凋亡及细胞死亡。因此,本发明的另一方面涉及一种通过选择性抑制蛋白酶体移位到这些细胞的胞质溶胶来选择性诱导癌症细胞凋亡的方法。在一些实施例中,所述方法包括使细胞与至少一蛋白酶体易位选择性抑制剂的有效量接触,或与包含所述选择性抑制剂的任何组合物接触。
在一些实施例中,选择性抑制剂是mTOR激动剂,例如本公开的YWF或其任何组合物。在另外一些实施例中,选择性抑制剂可以是通过本文公开的筛选方法获得的任何化合物。
如上所述,本发明证明了选择性抑制蛋白酶体易位在癌症细胞中的治疗应用。因此,本发明在其额外方面进一步包含一种用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟受试者癌症的进展的方法,具体地是通过选择性地抑制蛋白酶体易位到受试者的癌症细胞的胞质溶胶。在一些实施例中,所述方法包括向受试者施用治疗至少一蛋白酶体易位选择性抑制剂的有效量或含有所述选择性抑制剂的任何组合物的步骤。在一些实施例中,选择性抑制剂是mTOR激动剂,例如本公开的YWF或其任何组合物。在另外一些实施例中,选择性抑制剂可以是通过本文公开的筛选方法获得的任何化合物。
应当理解,本发明还包括至少一蛋白酶体移位选择性抑制剂,用于通过选择性抑制蛋白酶体移位到癌症细胞胞质溶胶中来选择性诱导癌细胞凋亡的方法。此外,本发明还提供了至少一蛋白酶体易位选择性抑制剂,用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延缓受试者癌症的进展的方法,如上文所述。
应当理解,本公开所公开的任何病症,特别是本文之前结合本发明的其他方面所讨论的任何癌症病症,也适用于本方面。
本文定义及使用的所有定义应理解为对字典定义的控制、通过引用合并的文件中的定义及/或定义术语的普通含义。
本文中使用的词语“约”表示可能比所述值高至1%、更具体为5%、更具体为10%、更具体为15%,并且在某些情况下高达20%或更低的值,偏差范围包括整数值,并且如果适用的话还包括非整数值,构成了一连续范围。在一些实施例中,词语“约”是指±10%。
除非明确相反,否则本说明书及权利要求书中使用的不定冠词“一(a)”及“一(an)”应理解为“至少一(at least one)”。必须注意,如本说明书及所附权利要求书所使用的,单数形式“一(a)”、“一(an)”及“所述(the)”包括复数引用,除非内容明确另有规定。
此处在说明书及权利要求中使用的短语“及/或”应理解为指如此结合的元件(即,在某些情况下结合存在而在其他情况下分离存在的元件)中的“一个或两个”。用“及/或”列出的多个元件应以相同的方式进行解释,即“一个或多个”元件如此结合。除“及/或”明确辨识的元件外,其他元件可以可选地存在,无论是否与明确辨识的那些元件相关或无关。因此,作为非限制性示例,在一实施例中,当与例如“包含”的开放式语言结合使用时,对“A及/或B”的引用可以仅指A(可选地包括除B之外的元件);在另一实施例中仅限于B(可选地包括除A以外的元件);在又一实施例中,连接到A及B两者(可选地包括其他元件);等方式。
如本文在说明书及权利要求中所使用的,“或”应理解为具有与上文定义的“及/或”相同的含义。例如,当分隔列表中的项目时,“或”或“及/或”应被解释为包含,即包括至少一个,但也包括一个以上的元件的数量或列表、以及可选的其他未列出的项目。只有明确表示相反的术语,如“仅一个”或“恰好一个”,或当在权利要求中使用时,“由组成”将指包含一个数量或元件列表中的恰好一个元件。一般而言,本文中使用的术语“或”仅应解释为表示排他性替代品(即,“一个或另一个,但不包括两者”),当前面加上排他性术语时,如权利要求中使用的“其中之一”、“其中一个”、“仅一个”或“完全一个”,应具有专利法领域中使用的一般含义。
如本文在说明书及权利要求书中所使用的,参照一个或多个元件的一列表中的短语“至少一”,应理解为指从元件列表中的任何一个或更多个元件中选择的至少一元件,但不一定包括元件列表中具体列出的每个元件中的至少一者,并且不排除元件列表中的元件的任何组合。无论是否与特定标识的那些元件相关,所述定义还允许元件可选地存在于短语“至少一”所指的元件列表中特定标识的元件之外。因此,作为非限制性示例,在一实施例中,“A及B中的至少一者”(或等效地为“A或B中的至少一者”,或等效地为“A及/或B中的至少一者)可以指可选地包括超过一个的A,而不存在B(并且可选地包括除B之外的元件);在另一实施例中,对于至少一者是指可选地包括超过一个的B,不存在A(并且可选地包括除A以外的元件);在又一实施例中,对于至少一者是指可选地包括超过一个的A,以及至少一可选地包括少于一个的B(并且可选地包括其他元件);等
还应理解,除非明确相反地指出,在本文所要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中,所述方法的步骤或动作顺序不一定限于所述方法步骤或动作所述的顺序。
在本说明书以及随后的实施例及权利要求书中,所有转折短语如“包含(comprising)”、“包括(including)”、“携带(carrying)”、“具有(having)”、“包含(containing)”及“涉及(involving)”、“持有(holding)”、“组成(composed of)”等应理解为开放式,即指包括但不限于,应理解为包含所述整数或步骤或整数或步骤组,但不排除任何其他整数或步骤。根据美国专利局专利审查程序手册的规定,只有转折短语“由…组成(consisting of)”及“主要由…组成(consisting essentially of)”分别为封闭或半封闭转折短语。更具体而言,词语“包括(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(includes)”,“包括(including)”及“具有(having)”以及它们的缀合物意味着“包括但不限于(including but not limited to)”。词语“由…组成(consisting of)”是指“包括并限于(including and limited to)”。术语“基本上由…组成(consisting essentiallyof)”是指组合物、方法或结构可包括额外的成分、步骤及/或部分,但前提是额外的成分及/或步骤不会实质上改变要求保护的组合物、方法及结构的基本及新颖特征。
应当注意,本发明的各种实施例可以范围格式呈现。应当理解,范围格式的描述仅仅是为了方便及简洁,不应被解释为对本发明范围的不灵活限制。因此,范围的描述应被认为已经具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单个数值。例如,对例如1至6的范围的描述应当被认为具有具体公开的子范围(例如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等)以及所述范围内的单个数字(例如1、2、3、4、5及6)。这适用于范围的宽度。每当此处指示数值范围时,意味着在所指示的范围内包括任何引用的数字(分数或整数)。短语“第一指示数字及第二指示数字之间的范围/范围”及“第一指示数字”到“第二指示数字之间的范围”在本文中可互换地使用,并且意味着包括第一及第二指示数字以及其间的所有分数及整数。
如本文所用,词语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术及程序,包括但不限于化学、药理学、生物、生物化学及医学领域的从业者已知的或从已知的方式、方法、技术及程序发展而来的那些方式、手段及程序。
应当理解,为了清楚起见,在单独实施例的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反地,为了简洁起见,在单个实施例的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供,或者以任何合适的子组合提供,或者适合于本发明的任何其他描述的实施例。在各种实施例的上下文中描述的某些特征不应被认为是那些实施例的基本特征,除非所述实施例在不具有这些元件的情况下是不起作用的。
如上所述及在下面的权利要求部分中所要求保护的本发明的各种实施例及方面在以下示例中得到实验支持。
关于所公开及所描述的内容,应当理解,本发明不限于本文公开的特定实施例、方法步骤及组合物,因为这些方法步骤及组成可能有所不同。还应理解,这里使用的词语仅用于描述特定实施例的目的,而不旨在限制。
以下实施例代表了发明人在实施本发明的方面中所采用的技术。应当理解,虽然这些技术是用于实践本发明的优选实施例的示例,但是根据本公开,本领域技术人员将认识到,在不脱离本发明的精神及预期范围的情况下,可以进行许多修改。
示例
在不作进一步阐述的情况下,相信本领域技术人员可以使用前面的描述充分利用本发明。因此,以下优选的具体实施例仅被解释为说明性的,而不是以任何方式限制所要求保护的发明。
实验程序
免疫荧光显微镜
将细胞接种在玻璃盖玻片上36小时。在指定的处理之后,将其用4%PFA固定15分钟,用(磷酸盐缓冲盐水)PBS洗涤,并在室温下在含有10%山羊血清的PBS中培育1小时,然后用指定的一级抗体培育2小时。用PBS大量洗涤后,将固定细胞与相关二级抗体培育1小时、洗涤并固定。使用Zeiss LSM700共焦显微镜(Zeiss,Oberkochen,德国)获取图像。
细胞转染与蛋白质过表达
使用CalFectinTM(SignaGen)转染试剂转染cDNA。LipofectamineTM RNAiMAX(Invitrogen)用于转染siRNA寡核苷酸。根据制造商的说明进行转染。细胞被慢病毒载体(Lentiviral vectors)感染,其中当指示出感染时,所述载体含有四环素诱导启动子。加入多西环素(200ng/ml)以诱导基因表达。
蛋白酶体亚基的显微可视化
使用关键资源表中列出的一级及二级抗体,通过间接免疫荧光显示蛋白酶体亚基α6、β1及PSMD1。为了观察活细胞中的蛋白酶体,我们表达了与GFP C端融合的β4、Rpn2、Rpn6及Rpn13蛋白酶体亚基的cDNA。蛋白酶体融合的Dendra2的光转化如前所述进行(McKinney等人,2009年自然方法(Nat Methods.)131–133)。
细胞分级
将细胞在分级缓冲液[20mM HEPES pH 7.3、10mM KCl、5mM ATP、5mM MgCl2及蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Roche)]中培育20分钟,然后加入NP-40(至0.1%)。然后将其充分混合并以1000x g离心5分钟。收集上清液作为胞质溶胶部分(cytosolic fraction),用PBS洗涤颗粒(细胞核)两次。为了溶解核颗粒,加入补充有0.5%脱氧胆酸钠的分级缓冲液,然后进行超声处理。
细胞裂解物及蛋白质印迹
用冰冷的PBS洗涤细胞两次,并刮入裂解缓冲液(50mM Tris-HCl,pH7.4,130mMNaCl,0.5%NP-40)中,所述缓冲液补充有新添加的蛋白酶抑制剂鸡尾酒、5mM ATP、10mM碘乙酰胺及5mM N-乙基马来酰亚胺。根据制造商的说明(Pierce,Rockford,IL)通过BCA测定法测量蛋白质浓度。通过SDS-PAGE解析30μg细胞蛋白,转移到硝化纤维膜上,并用合适的抗体进行免疫印迹。
自噬通量测量
如前所述进行自噬分析(Nyfeler等人,2011,摩尔细胞生物学(Mol Cell Biol)(14):2867-76)。简言之,使用高通量显微镜(IXM-C,Molecular Devices)对稳定表达RFP-GFP-LC3的细胞进行成像。基于RFP通道来创建代表自噬点(autophagic puncta)的掩模(mask),然后用于定量GFP通道中的强度。这些值依次用于计算自噬通量(autophagicflux)。将数据与在完全培养基中生长的细胞进行比较。
降解率的测量
用[35S]蛋氨酸及半胱氨酸(20μCi/ml)标记细胞16小时。随后进行广泛洗涤,并在含有2mM两种未标记氨基酸的培养基中进一步培养8小时。通过测定相对于细胞蛋白中残留的放射性的标记氨基酸向培养基的释放来评估降解率(使用三氯乙酸沉淀将两者分离)(Gropper等人,1991,JPEN J Parenter Enteral Nutr 15,48–53)。
基于荧光的蛋白酶体活性测定
如前所述(Berkers等人,2007,Mol Pharm;4(5):739-48.)追踪活细胞蛋白酶体活性。简言之,将Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS添加到培养基中,最终浓度为1μM。培育15分钟后,用Zeiss LSM 700共焦显微镜观察细胞。体外蛋白酶体活性测定如前所述进行(Braten等人,2016年)。简言之,将细胞级分在37℃下与5μM Suc LLVY AMC(琥珀酰-Leu-Leu-Val-Tyr-氨基-4-甲基香豆素(Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-amido-4-methylcoumarin))在反应缓冲液(40mM Tris-HCl pH 7.2、2mM DTT、5mM MgCl2、10mM磷酸肌酸、0.1mg/ml磷酸肌酸激酶、5mM ATP)中培育30分钟。通过加入1%SDS停止反应,并在360nm/460nm(ex/em)处测量荧光。
蛋白质质谱样品制备
2-3mg细胞提取物蛋白在8M尿素及100mM碳酸氢铵中,用DTT(2.8mM;在60℃下30分钟)培育,用碘乙酰胺(8.8mM;室温下黑暗中30分钟)修饰,并用修饰的胰蛋白酶(Promega;酶与底物的比例为1:50)在2M尿素及25mM碳酸氢铵中消化(在37℃下过夜)。另外进行第二次胰蛋白酶化4小时。使用Sep-Pak C18(Waters)将胰蛋白酶肽脱盐并干燥。如质谱法所述,将10μg蛋白质用于蛋白质组分析。
蛋白质质谱
使用配有毛细管HPLC(easy nLC 1000,Thermo)的Q Exactive plus质谱仪(Thermo Fisher Scientific)通过LC-MS/MS分析胰蛋白酶肽。将肽加载到C18捕集柱(0.3x5mm,LC Packings)上,所述C18捕集柱在线(on-line)连接到国产毛细管柱(20cm,内径75微米),所述C18捕集柱填充有Reprosil C18Aqua(Dr.Maisch GmbH,德国)、溶剂A(0.1%甲酸水溶液)。将肽混合物用5-28%线性梯度的溶剂B(95%乙腈及0.1%甲酸)在水中溶解180分钟,然后在28-95%的5分钟梯度下及在95%乙腈及0.1%甲酸下以0.15μl/min的流速溶解25分钟。质谱在正模式(m/z 350–1800,分辨率70000)下进行,使用重复的全MS扫描,然后是从第一次MS扫描中选择的10个最主要离子(>1个电荷)的碰撞诱导解离(35标准化碰撞能量下的HCD)。启用了动态排除列表,排除持续时间为20秒。
蛋白质组学数据分析
质谱原始数据通过MaxQuant软件(版本1.4.1.2,http://www.maxquant.org)用于峰值采集及量化。随后,使用仙女座引擎(Andromeda engine)对蛋白质进行鉴定,在人类UniProt数据库中搜索前体质量及碎片离子的质量公差为20ppm的蛋白质。Met氧化、N-末端乙酰化、Cys上的N-乙基马来酰亚胺及氨基甲酰基甲基、Lys上的GlyGly以及Ser、Thr及Tyr残基上的磷酸化被设置为可变的转译后修饰。最小肽长度设置为6个氨基酸,最多允许两个错误剪切(mis-cleavages)。使用目标诱饵策略将肽及蛋白质水平错误发现率(falsediscovery rates,FDR)过滤至1%。过滤蛋白质表,以消除反向数据库及常见污染物的标识。MaxQuant软件用于无标记半定量分析(基于肽的提取离子电流(extracted ioncurrents)(XICs)),能够从任何实验中识别的每个肽的每个LC/MS运行中进行定量。在SILAC标记的样品中,也使用MaxQuant软件进行定量。数据合并及统计测试由Perseus 1.4软件完成。
氨基酸水平测量
如前所述进行代谢分析(MacKay等人,2015)。简言之,用冰冷的PBS快速洗涤细胞3次,并用50%甲醇及30%乙腈的水溶液提取。将样品在4℃下以16000x g离心10分钟,并使用HPLC-MS(Q-Exactive Orbitrap质谱仪(Thermo Scientific)连接至Thermo SciencesUltiMate 3000HPLC系统)分析上清液。HPLC装置由ZIC pHILIC柱(SeQuant,150×2.1mm,5μm,Merck)及ZIC pHILIC保护柱(SeQuant,20×2.1mm)组成。水性流动相溶剂为20mM碳酸铵,用0.1%氢氧化铵调节至pH 9.4。有机流动相为乙腈。氨基酸及其他代谢产物在15分钟的线性梯度上从80%有机物分离到80%水溶液。柱温度为45℃,流速为200μl/min,运行时间为27分钟。使用Q-Exactive质谱仪以35,000(200m/z)的分辨率及电喷雾电离及极性切换模式,在75–1000m/z的质量范围内检测所有代谢物。所有代谢物的质量准确度均低于5ppm。使用Thermo Xcalibur软件获取数据。使用Thermo TraceFinder软件测定不同氨基酸的峰面积,通过所述软件通过单电荷离子的准确质量及HPLC柱上的已知保留时间来鉴定代谢物。之前已对市售标准化合物进行了分析,以确定ZIC pHILIC柱上的离子质量及保留时间。基于Lowry方法进行蛋白质定量以进行标准化。
细胞存活测定
将细胞以15,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。36小时后,如所述处理细胞,并在对照环境(21%O2,5%CO2,37℃)下使用高通量荧光显微镜(IXM-C,分子装置(Molecular devices))对其进行活体观察。Hoechst 33342用于染色所有细胞,碘化丙啶(propidium iodide)或SYTOXTM(Thermo)用于染色死亡细胞。使用MetaXpress软件(Molecular Devices)的Live/Dead模块进行数据分析。
大鼠心脏成像
将动物进行牺牲处置(IP氨基甲酸乙酯1.6mg/kg),将心脏转移到定制的室中,并使用Langendorff装置用含氧的Tyrod溶液灌注,以进行调整(如所示的氨基酸饥饿及补充)。然后将心脏切成约0.4mm厚的样品,用Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS培育,并如上所述成像(参见基于荧光的蛋白酶体活性测定)。
大鼠神经培养成像
如前所述,将动物及组织进行处理并接种细胞(Hakim等人,蛋白酶体抑制对突触蛋白停滞的影响。EMBO J.9,e201593594(2016))。在培养两周后,按指示处理细胞,随后用Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS培育并如上所述的进行成像(参见基于荧光的蛋白酶体活性测定)。
果蝇肠道成像
WT苍蝇在酵母玉米粉糖蜜麦芽提取物培养基(对照(control,Cont.))或5%蔗糖溶液(饥饿(starvation,St.))上保持6小时。如前所述,对肠进行解剖、固定及染色[Shaw等人,Hippo通路在果蝇成虫中肠再生期间调节肠干细胞增殖(The Hippo pathwayregulates intestinal stem cell proliferation during Drosophila adult midgutregeneration)。发展(Development)1374147–4158(2010))。
致瘤性(Tumorigenicity)
MDAMB231(HTB26TM)或RT4(/>HTB2TM)用胰蛋白酶分离细胞,用PBS洗涤,使其浓度达到70×106个细胞/ml。将细胞悬浮液(7×106/0.1ml)皮下接种在12周龄NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠(JAX库存号005557(n=8/组)的两侧。接种细胞形成可触及的肿块后,每周在两侧(靠近生长的肿瘤)皮下注射500μl生理盐水、补充25mM/每种YWF的生理盐水或补充25mM//每种QLR的生理盐水。在每个实验中最大的肿瘤达到不允许进一步生长的大小后,从伦理角度而言,将所有小鼠进行牺牲处理,切除异种移植物,进行称重,并在福尔马林中固定。如前所述,石蜡包埋切片采用标准免疫组化方案染色(Kravtsova Ivantsiv等人,KPC1介导的NF-κB1p105至p50的泛素化及蛋白酶体加工限制肿瘤生长(KPC1-mediated ubiquitination and proteasomal processing of NF-κB1 p105to p50 restricts tumor growth)。细胞161(Cell 161),333–347(2015))。根据制造商的方案,使用末端的脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(Terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling,TUNEL)检测凋亡细胞,并通过针对凋亡标志物裂解Caspase3的免疫荧光。每周两次使用卡尺进行肿瘤体积监测。所有动物实验均在Technion认可的动物护理委员会的监督下进行。
多发性骨髓瘤骨髓分析
从疑似及后来确诊患有MM的患者身上采集了33份骨髓活组织检查,并在赫尔辛基委员会(Helsinki Committee)批准后在RAMBAM医疗保健校区进行了处理。对于每一个这样的活组织检查,都存在蛋白酶体抑制剂治疗效果的数据,即反应性(responsive)或难治性(refractory)。24例活组织检查来自首次确诊的患者,其中8例患者病情复发,进行了第二次活组织检查。这些临床数据与活组织检查分开保存,活组织检查对蛋白酶体亚单位及MM细胞标记物进行编码及染色。病理学家评估了每个样品:患者对蛋白酶体抑制剂治疗是否有反应或抗药性;并确定了MM细胞中蛋白酶体的分布:主要是在胞质溶胶、均匀分布或主要是在细胞核。由于蛋白酶体、MM标记物或两者均缺乏染色,排除了5例活组织检查。在对剩余的28例编码病例进行组织病理学分类后,显示每个病例的临床结果,并根据临床反应(对药物敏感或抗药)绘制每个分布类别(细胞核偏好、均匀分布或胞质溶胶偏好)。
示例1
氨基酸饥饿诱导26S蛋白酶体从细胞核向胞质溶胶的主动易位
发明人先前已经表示出,在氨基酸饥饿超过24小时后,蛋白酶体经历自噬降解(1)。为了阐明蛋白酶体在较短时间的压力后的命运,使用荧光显微镜及亚细胞分级来监测20S及19S复合物的定位(图1)。在氨基酸饥饿8小时后,核蛋白酶体(构成细胞酶的很大一部分)被转移到胞质溶胶(图1A及1B)。用输出蛋白1(exportin1)抑制剂Leptomycin B(LMB)处理饥饿的细胞(Kudo,N.等人(1998),细胞研究(Cell Res.)242540–547),其导致易位的抑制,从而表示出所述募集是活跃的(图1A及1B)。LMB处理还导致非压力细胞中蛋白酶体的细胞核积累(nuclear accumulation),证明了基础蛋白酶体分布的动态性质,这也可以由其在细胞核导入抑制剂伊维菌素(Ivermectin)存在下的胞质溶胶积累所支持(Wagstaff,K.M.等人(2011),J.Biomol.Screen.,16、192–200)(图1C)。压力诱导的易位并非单一细胞类型独有,在其他恶性及非恶性细胞系中也可观察到(图2A及2B)。
通过观察饥饿果蝇肠道中的蛋白酶体,这一观察结果也在体内进行了测试。蛋白酶体在对照苍蝇中的定位明显是细胞核的,而在仅以水及糖为食的苍蝇中,它被转移到胞质溶胶中(图1D)。
示例2
蛋白酶体募集是可逆的及特异的,但不限于营养压力
接下来,测试了蛋白酶体再分布的可逆性,特别是考虑到之前的发现,即长期饥饿会导致蛋白酶体的自噬降解(文献1)。向饥饿8小时的细胞补充氨基酸,在2-4小时内几乎完全恢复核蛋白酶体库(图1E及2C)。为了证明恢复的蛋白酶体并非来自于从头合成(de novosynthesis),而是来自于之前迁移到胞质溶胶中的复合物池,我们使用了两种独立的实验方法:(1)在环己酰亚胺(cycloheximide,CHX)(一种蛋白质合成抑制剂)的存在下补充氨基酸。发明人发现,它不会阻止蛋白酶体在细胞核中的再次出现(图1F)。(2)蛋白酶体用光可转换荧光团标记,允许将预先存在的蛋白酶体从绿色转换为红色(图2D),从而仅遵循在氨基酸缺失之前合成的复合物。同一视野的实时成像显示出,氨基酸饥饿诱导蛋白酶体重新分布到胞质溶胶,而它们的补充导致先前迁移的复合物重新定位至细胞核(图1G)。蛋白酶体易位的可逆性表示出,它不仅在向其自噬破坏过渡,还可能用于刺激所述区室(compartment)中的蛋白水解(参见下图3)。支持这一观点的发现是,核蛋白酶体池占总细胞酶的很大一部分,根据报导,酵母中高达80%(文献21)。发明人发现,在细胞核仅占细胞体积约1/10的哺乳动物细胞中,核蛋白酶体的浓度比胞质溶胶中的浓度高约6倍(图2E)。在压力下,几乎整个池在短时间内转移到胞质溶胶中,为所述区室提供了相当大的催化能力。
为了测试蛋白酶体对饥饿的反应是否是特异性的,在其他压力下对其定位进行了评估。研究发现,虽然缺氧也诱导蛋白酶体易位(图1H),但热休克(图1I)及通过AMPK的自噬诱导物(图1J)都不会导致蛋白酶体从细胞核输出。这进一步区分了哺乳动物细胞中新鉴定的氨基酸饥饿诱导的易位,与通过AMPK介导的酵母中葡萄糖饥饿后蛋白酶体储存颗粒的形成(S.J.Russell等人,J.Biol.Chem.27421943-21952(1999))。综上所述,似乎显示出蛋白酶体从细胞核到胞质溶胶的穿梭是特异性的,并且最可能起到病理生理作用。
示例3
一种尚未确定的mTOR信号通路调节压力诱导的蛋白酶体动力学
由于氨基酸传感在很大程度上由mTOR信号网络介导(22-23),Torin1(一种mTOR特异性抑制剂)被用于测试所述途径是否也导致饥饿诱导的蛋白酶体易位。与氨基酸饥饿类似,Torin1在完全生长培养基存在下诱导20S及19S亚复合物的核输出(图3A及3B)。类似地,使mTOR表达沉默的短发夹RNA(shRNA)也会导致蛋白酶体易位至胞质溶胶(图3C)。综上所述,这些不同的实验方法确立了mTOR信号在蛋白酶体动力学中的作用。
虽然mTOR是一种主要的信号介质,但它并不是细胞氨基酸库的唯一传感器。其他途径包括PIK3CA及GCN2(Dever,T.E.等人(1992),细胞(Cel)68585–596;Tato,I.等人(2011)(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)),286,6128–6142;Wolfner,M.等人(1975)(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)),96273–290)。因此,测试了这些报导的途径是否是氨基酸饥饿后蛋白酶体输出所必需的。沉默GCN2(非带电tRNA的传感器及eIF2α的激酶(Wek,S.a.等,(1995)分子细胞生物(Mol.Cell.Biol.),154497-4506))不影响蛋白酶体的输出。相反地,沉默GCN2增强了蛋白酶体的输出(图4A及4B)。这一发现与GCN2通过抑制蛋白质合成在减少短缺期间对氨基酸的需求方面发挥的作用一致(Surawera,A.等人,(2012)分子细胞(Mol.Cell)48242-253)。有趣的是,GCN2沉默对自噬的刺激没有影响(图4C),表示出UPS负责短期剥夺期间的大多数氨基酸补充。
另一研究表示出PIK3CA及AKT参与了氨基酸传感(Tato,I.等人(2011)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)286,6128–6142)。这些基因中的任何一者的沉默都不会影响蛋白酶体易位对氨基酸缺失的反应(图4D及4E)。综上所述,这些发现使mTOR途径成为唯一已知的介导压力诱导的蛋白酶体动力学的途径。
接下来,重要的是,确定与感知短缺压力有关的氨基酸。已知调节mTOR活性的“典型(canonical)”三连体(trio)是Gln、Leu及Arg(QLR)(González,A.等人(2017)EMBO J.36,397-408;Wolfson,R.L.等人(2017)(细胞代谢)(Cell Metab.)26,301-309)。这三种氨基酸被显示为调节几种mTOR下游途径,其中几种mTOR下游途径为TFEB及ULK1介导的自噬(Jung,C.H.等人(2009)分子生物细胞(Mol.Biol.Cell)20,1992-2003;Settenbre,C.等人(2011)科学(Science)(80),332,1429–1433;Tan,H.W.S.等人(2017)国家公社(Nat Commun)8,338)以及通过p70-S6K及4EBP的磷酸化进行转译(von Manteufel,S.R.等人(1996)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)93,4076-4080;Price,D.J.等人(1992)科学(Science)257973-977)。研究发现,与它们对自噬及翻译的影响不同,饥饿培养基中添加Gln、Leu及Arg不会阻止mTOR介导的蛋白酶体输出(图3D)。
因此,在寻找影响mTOR调节的蛋白酶体动力学的一种或几种氨基酸时,筛选了整个氨基酸库。Tyr、Trp及Phe(YWF)这三种芳香族氨基酸被鉴定为饥饿诱导的蛋白酶体易位的强抑制剂(图3D及图4F)。将它们单独添加到饥饿培养基中(在没有任何其他氨基酸的情况下)具有显着的效果,但三者的组合具有最强的效果。在一补充实验中,测试了从完整培养基中仅减去YWF(剩下17个,包括QLR)是否足以诱导蛋白酶体易位。如图3D所示,YWF的缺失足以诱导蛋白酶体向胞质溶胶募集。重要的是,YWF对蛋白酶体运动的影响是特定的:如图4G及图4H所示,虽然LMB抑制NF-κB的p65亚基及泛素连接酶后期促进复合物(AnaphasePromoting Complex,APC)的核输出,但YWF对于这两种已知的输出蛋白-1(exportin-1)底物没有影响。类似地,虽然LMB导致融合到细胞核输出信号(nuclear export signal,NES)的模型蛋白GFP的核积累,但YWF对其细胞分布没有影响,正如预期的那样,其主要是在胞质溶胶(图4I)。综上所述,这些发现清楚地表示出,YWF通过干扰mTOR信号通路而不是核输出的物理机制来抑制蛋白酶体输出,因此可能构成所述通路的新的调控信号。
示例4
YWF对蛋白酶体动力学的调节独立于QLR对mTOR介导的自噬的调节
在那个阶段,重要的是,测试YWF(新发现的调节蛋白酶体动力学的氨基酸)是否影响已知由QLR控制的mTOR下游效应。YWF效应对于它们通过mTOR引发的信号也是特定的。虽然它们添加到饥饿培养基中抑制蛋白酶体易位(图3D),但它不抑制自噬激活(图3E)。相反地,它可能会进一步刺激它,因为蛋白酶体募集的应对机制受到抑制。与此发现一致,虽然YWF的缺失足以诱导蛋白酶体募集(图3D),但它不会上调节自噬。事实上,它甚至下调节它(图3E),这可能是由于募集的蛋白酶体的蛋白水解活性所导致。此外,还发现,与QLR不同,YWF不能逆转饥饿对mTOR介导的p70-S6K磷酸化的影响(图3F)。此外,YWF的减少不会抑制p70-S6K磷酸化,甚至会刺激它(图3F)。这种效应可能是由于补充氨基酸,通过蛋白酶体刺激的胞质溶胶蛋白降解介导的(见下文)。向饥饿培养基中添加蛋白酶体或自噬抑制剂不会挽救磷酸化(图3F)。总上所述,这些发现强烈表示出,YWF在mTOR水平上发挥其信号作用,而不是通过对蛋白酶体或自噬机制的直接作用而在下游发挥作用。值得注意的是,在测试条件下,26S蛋白酶体的两个亚复合物都保持稳定(图3G),这显示出了本发明人先前的报告,即复合物在短期压力期间是稳定的(文献1),以及本公开中报告的所有变化都是由于其重新分布所导致。
因此,虽然通过使用不同的抑制剂,显示mTOR传递不同的下游信号(C.C.Thoreen等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.)2848023-8032(2009)],但发明人表示出不同组的激动性氨基酸导致不同的下游效应。
示例5
蛋白质体在未折迭的蛋白质压力下穿梭是由ATF4介导的,并与饥饿的信号通路不同地而受到调节
如上所述,通过eIF2α-ATF4信号传导途径刺激UPR的药物(例如Tunicamycin)也在诱导蛋白酶体细胞核输出(图1D及图2C)。eIF2α-ATF4途径的刺激是通过几种蛋白激酶对eIF2α的磷酸化介导的,每种蛋白激酶都被不同的刺激激活。在UPR的情况下,激酶PERK磷酸化eIF2α(Harding,H.P.,Zhang,Y.及Ron,D.(1999)自然(Nature)397,271-274),而氨基酸饥饿通过激酶GCN2的刺激活性上调节所述途径。由于发现GCN2在氨基酸饥饿后的蛋白酶体募集中不起作用(图4A及4B),因此测试了eIF2α-ATF4途径是否可能以另一种方式参与。通过ATF4的沉默观察到,所述转录因子在UPR期间是蛋白酶体输出所必需的,但在氨基酸饥饿后则为不需要的(图3H)。此外,在没有任何外源性压力的情况下,ATF4的过度表达足以诱导蛋白酶体输出(图3I)。
示例6
蛋白酶体易位是增强胞质溶胶蛋白水解所必需的
为了阐明蛋白酶体易位在压力下的作用,在喂食及饥饿的细胞中监测了蛋白质分解,表示出在氨基酸剥夺压力下,蛋白质降解被刺激了约2倍(图5A)。为了将增强的蛋白水解与核蛋白酶体富集胞质溶胶联系起来,LMB用于抑制蛋白酶体向胞质溶胶的输出,这导致抑制饥饿诱导的蛋白质分解刺激(图5A)。如上所述,LMB对自噬没有影响(Huang,R.等人(2015)分子细胞(Mol.Cell),57,456–467],其对降解的抑制作用很可能是由于其对蛋白酶体募集的影响。
然后在细胞核及胞质溶胶部分监测蛋白酶体活性,表示出其核活性在饥饿后降低,同时胞质溶胶活性增加(图5B)。同时,使用HMGCS1检查了增加的胞质溶胶活性,HMGCS1是蛋白酶体的真正胞质溶胶底物,在mTOR抑制后降解(文献9),并证明其在压力下的加速降解在很大程度上取决于蛋白酶体向胞质溶胶的输出(图5C)。使用模型基质GFP-CL1(一种标记有CL1降解蛋白的GFP分子,一种使其快速泛素化及蛋白酶体破坏的基序)获得了类似的结论(Gilon,T.等人(1998)EMBO J.172759-2766),其未经自噬去除(图6A)。为了将GFP-CL1转化为一种独特的胞质溶胶基质,向其添加了一种NES。研究发现,虽然这种胞质溶胶GFP物种在饥饿条件下降解,但当蛋白酶体输出受阻时,它相当稳定。同时,主要通过自噬去除的RFP(Berko,D.等人(2012)分子细胞(Mol.Cell)48601-611;Kim,P.K.等人(2008)国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)10520567-20574)仍然被降解(图5D)。
已经表示出,在mTOR介导的压力期间,泛素化最初被上调节,可能是由于连接酶活性的增加,随后由于蛋白酶体的去除,生成的泛素缀合物的水平降低(文献9)。似乎通过YWF或LMB阻止蛋白酶体从细胞核输出,抑制泛素加合物的降解及耗竭(图5E)。相反地,与饥饿细胞相比,单独缺失YWF导致缀合物的水平甚至更低。在这些条件下,蛋白酶体被运输到胞质溶胶(图3C),共轭底物的降解被加速(图5E)。在这些条件下,假设剩余的17个氨基酸的存在会减弱泛素连接酶的受刺激活性,导致与完全饥饿条件下观察到的缀合物相比的缀合物的先验水平较低。
通过在荧光蛋白酶体活性探针的存在下观察活细胞(Berkers,C.R.等人(2007)分子药学(Mol.Pharm.)4739-748),发明人能够直接定位蛋白酶体的活性,再次表示出饥饿以及YWF的减少导致蛋白酶体活性易位至胞质溶胶。向饥饿培养基中添加LMB或YWF会抑制蛋白酶体活性从细胞核迁移(图5F)。
为了评估蛋白酶体易位对细胞蛋白质群体稳定性的影响,进行了蛋白质组学分析,监测了蛋白酶体输出刺激及抑制后其水平的变化。发明人发现,在氨基酸饥饿刺激的蛋白酶体易位时,观察到约900个蛋白质的水平降低。通过使用LMB或YWF抑制蛋白酶体输出,防止了这种变化(图5G)。在不同条件下鉴定的蛋白质及其动力学在很大程度上重迭。对受LMB或YWF蛋白酶体易位抑制影响最大的蛋白质的分析表示出,分别有83%及87%的蛋白质仅位于胞质溶胶或由胞质溶胶及细胞核共享(图6B及6C)。对这些蛋白质组中富集的细胞途径的进一步分析揭示出代谢途径的关键介质(图6D)。这与不受蛋白酶体动力学影响的蛋白质(其中包括主要通过自噬降解的核糖体)形成对比(图6E)。
尽管自噬不受LMB(Huang,R.等人(2015)分子细胞(Mol.Cell)57,456–467)或YWF(图3E)的影响,但有必要进一步确定我们鉴定的底物主要依赖蛋白酶体进行蛋白水解。正如预期的那样,监测核糖体蛋白的反应(核糖体蛋白是在胞质溶胶,已知是真正的自噬底物),发现实验设置确定它们在很大程度上受到自噬去除的影响,而在较小程度上受到蛋白酶体动力学的影响(图6F)。
示例7
蛋白酶体向胞质溶胶的募集为细胞提供了对细胞在压力下生存至关重要的氨基酸
接下来,旨在直接评估蛋白酶体易位对压力细胞中氨基酸库的贡献。为此,采用LC-MS来解析及测量不同实验条件下的不同氨基酸的相对丰度。为了测量蛋白酶体输出后氨基酸库的变化,在不存在或存在LMB的情况下,使用mTOR抑制剂Torin1处理后测量其水平的增加。虽然Torin1刺激自噬及蛋白酶体募集,但LMB仅抑制后者。测量结果表示出,LMB对蛋白酶体输出(proteasome export)的抑制显着地抑制了Torin1产生的氨基酸的增加(图5H,上图),表示出易位蛋白酶体的重要作用是在短期剥夺期间用氨基酸补充细胞。类似地,在含有除YWF外的所有氨基酸的培养基中培养细胞,发现YWF可刺激蛋白酶体易位,但对自噬没有影响(图3C-3G),导致除Glu外的所有可检测氨基酸水平增加(图5H,下图)。有趣的是,Glu也不受向Torin1处理的细胞中添加LMB的影响,进一步支持了这些发现的有效性。接下来监测蛋白酶体易位、细胞蛋白水解增加及氨基酸供应对细胞死亡的影响。通过两种不同细胞系的活时间推移监测细胞存活,表示出虽然对整个氨基酸库的饥饿耐受良好,但通过添加YWF抑制蛋白酶体的募集导致其死亡(图5I)。评估这三种氨基酸的不同组合对细胞凋亡的影响(单独或成对)发现,整个三种氨基酸组合的细胞毒性作用明显强于任何其他组合。这种意想不到的协同效应表示出,它们都是诱导最大效应所必需的(图5J及6G)。
然后,发明人测试了在YWF存在的情况下,防止蛋白酶体在压力期间进入细胞核(否则会将其驱动至细胞核,因此是致命的),是否会挽救细胞。据推测,如果蛋白酶体以高水平保留在胞质溶胶中,细胞将存活。发明人沉默了核孔复合物成员NUP93,根据报导,NUP93选择性地促进Smads的细胞核导入,但不促进NLS携带蛋白质的核导入(Chen,X.等人,分子细胞生物(Mol.Cell.Biol.)304022-34(2010)),并发现其导致蛋白酶体主要是胞质溶胶分布(图5K)。在饥饿条件下,胞质溶胶中蛋白酶体浓度进一步增加。重要的是,YWF及LMB均未对其在缺乏NUP93的细胞中的分布产生显着影响(图5K),表示出YWF的毒性作用仅是由于其从蛋白酶体中清空胞质溶胶的能力(图5L)。发明人验证了NUP93沉默不会损害NLS介导的细胞核输入(图6H),表示出其敲除对蛋白酶体易位的影响并非所有进入细胞核的蛋白质所共有的。
综上所述,这些发现进一步强调了所述观察结果,即YWF引起的压力诱导细胞死亡是由于其对蛋白酶体从细胞核转移到胞质溶胶的抑制作用,以及其迁移到胞质溶胶(其中在胞质溶胶中刺激蛋白水解并补充耗尽的氨基酸库)对于细胞生存至关重要。
示例8
压力诱导的胞质溶胶蛋白酶体募集在不同物种及组织中是保守的
接下来,证明蛋白酶体对压力反应的“普遍性(universality)”很重要。使用蛋白酶体活性探针的活体显微镜,可以监测其在新鲜组织中的定位。如图7A所示,离体灌注大鼠心脏中的蛋白酶体活性集中在细胞核中,与培养细胞中的观察结果相似。使灌注的心脏遭受氨基酸饥饿,导致心肌细胞的细胞核从蛋白酶体中排出。YWF阻止了这种蛋白酶体易位(图7A)。从大鼠脑中分离的原代细胞也是如此(图7B)。
然后在体内测试这种现象,并在饥饿的果蝇的肠道中监测蛋白酶体。如示例1所示,且如图1D所示,对照苍蝇中蛋白酶体的定位明显是在细胞核,而在仅以水及糖为食的苍蝇中,蛋白酶体被转移到胞质溶胶中。进一步证明了,蛋白酶体输出在压力下发挥了一功能性作用,测试了皮质类固醇的作用,皮质类固醇的分泌在压力下受到刺激,包括代谢压力,例如生理性夜间睡眠禁食。似乎向分化的小鼠肌肉细胞中添加地塞米松(dexamethasone)导致蛋白酶体易位,氨基酸饥饿也是如此(图7C)。
综上所述,在不同物种及组织中观察到的蛋白酶体在压力下的募集保持,显然将其作为一种基本的压力应对机制。
示例9
自噬与蛋白酶体定位及活性之间的相互关系
研究表示出,UPS的活性及自噬在时间上相关(文献18、24)。因此,重要的是,评估这种相互作用是否也反应在蛋白酶体的定位中。几项实验证据表示出,情况确实如此:(1)由其主调节因子TFEB的过度表达刺激的自噬的上调节(Settenbre,C.等人(2012)EMBOJ.311095–1108)(图8A)导致了蛋白酶体在细胞核中积聚(图9A)。特别使用组成型活性TFEB,其中被mTOR磷酸化的两个Ser残基(一种导致其转录活性抑制的修饰(Settenbre,C.等人(2012)EMBO J.311095-1108)突变为Ala,因此刺激了独立于细胞信息的自噬;(2)ZKSCAN3是自噬的主要转录抑制因子(Chauhan,S.S.等人(2013)分子细胞(Mol.Cell)50,16-28)的过度表达导致了蛋白酶体募集到胞质溶胶中(图9Bi);(3)3-甲基腺嘌呤(3-methyl adenine,3-MA)对自噬的抑制诱导了相同的效果(图9B ii);(4)ATG5缺失导致的自噬损伤导致蛋白酶体在压力下加速向胞质溶胶移动(图9C);(5)毫不奇怪地,蛋白酶体的抑制还导致TFEB的过度表达(图9D),这与已知在这些条件下发生的自噬的激活一致(Zhu,K.等人(2010)Oncogene 29,451-462)。
有趣的是,也在饥饿状态下,人们注意到蛋白酶体的抑制伴随着其细胞核积累(图9D)。这种效应对几种蛋白酶体抑制剂以及19S及20S亚复合物都是常见的(图9E)。即使在饥饿条件下,蛋白酶体在受到抑制后的细胞核积累似乎也是活跃的,因为向营养良好的细胞中添加抑制剂会导致其进一步的细胞核积累(图9F),而在饥饿后蛋白酶体已经迁移到胞质溶胶中后添加抑制剂会使其完全迁移到细胞核中(图9G及图8B)。这一现象的机制尚未解开。可以假设蛋白酶体的抑制及随后细胞氨基酸库的减少(现在不能被抑制的酶补充)激活了自噬,自噬刺激蛋白水解,补充耗尽的氨基酸库,如所证明的,导致了蛋白酶体在细胞核中积聚(图9A-9B)。重新定位的机制是否与TFEB的激活有关(图9D)或与受刺激的自噬产生的更下游的代谢效应有关,尚待确定。
示例10
蛋白酶体抑制剂抗性的多发性MM细胞在基础代谢条件下表现出蛋白酶体的胞质溶胶分布,这在其抗性中起重要作用
蛋白酶体抑制剂被用作MM的第一条治疗线,MM是免疫浆细胞的恶性克隆扩增。与其他药物一样,这些药物也通过UPS发挥了一些作用,它们彻底改变了患者的管理及预后。尽管如此,患者对治疗的反应范围很广,并且在获得良好的结果后,几乎所有患者都会在某一时刻复发,尽管他们正在接受维持治疗(19)。蛋白酶体抑制抵抗的潜在机制仍然难以捉摸(文献19),并且在患者来源的培养MM细胞中也得到了证明(文献25)。监测耐硼替佐米(Bortezomib-resistant)的MM培养细胞中蛋白酶体的定位,发现与它们的敏感对应物不同,蛋白酶体显示出细胞核偏好的丧失(图10A)。为了测试对蛋白酶体抑制剂的抵抗是否至少部分归因于胞质溶胶中蛋白酶体的高水平,并试图克服它,使用YWF在饥饿期间迫使胞质溶胶蛋白酶体进入细胞核。结果表示出,与蛋白酶体抑制剂不同,蛋白酶体抑制剂仅在敏感MM细胞中诱导凋亡,添加YWF后蛋白酶体的强制核隔离也在硼替佐米抗药细胞(Bortezomib-resistant cells)中诱导细胞凋亡(图10A及10B)。这些发现表示出,细胞在不同条件下逃避蛋白酶体动力学的正常调节并维持胞质溶胶中蛋白酶体的能力,有助于它们对治疗的耐受性及可能的攻击性。YWF也能在抗药细胞中实现主要的核定位,这为此类患者的治疗开辟了潜在的治疗途径。
有趣的是,与其他组织的细胞相比,敏感的MM细胞表现出更强的蛋白酶体细胞核偏好(图1A、图2A及2B),并且在饥饿状态下无法将蛋白酶体募集到胞质溶胶中,这是其他细胞在压力期间采用的一种基本保护机制(图10A)。这些观察结果可能是为什么这种恶性肿瘤最初成为蛋白酶体抑制药物的靶点提供了可能的机制推理。这些细胞似乎具有异常低的胞质溶胶蛋白酶体储备,这可能是降解由它们合成的大量免疫球蛋白分子产生的错误折迭蛋白所必需的。这一点,加上胞质溶胶蛋白酶体的缺乏,使它们的压力耐受阈值低于其他细胞。
示例11
蛋白酶体动力学为新诊断的MM患者蛋白酶体抑制剂治疗的疗效提供了预测工具
基于我们在培养细胞中的结果,假设新诊断的MM患者中的基础蛋白酶体分布可以为他们对蛋白酶体抑制剂的易感性提供预测工具。
为了验证这一假设,在开始治疗前,对MM患者的骨髓活组织检查中的蛋白酶体分布进行了盲评估。直到后来,这些发现才与患者对蛋白酶体抑制剂治疗的反应相关。
与培养的细胞相似,活组织检查中的蛋白酶体在不同的患者中被发现,以显示不同的亚细胞分布模式:它主要是在细胞核或是在胞质溶胶,或均匀分布在两个区室之间(图10C)。将组织病理学结果与临床结果进行比较表示出,当蛋白酶体主要为细胞核时,90%的患者对治疗有反应。与之形成鲜明对比的是,细胞核偏好的丧失预示着所述疾病具有抗药性的可能性很高:80%分布均匀的患者。此外,100%表现出蛋白酶体胞质溶胶优势的患者:对于治疗具有抗药性(图10D,图11中的示意图)。
重要的是,在复发的患者组中,在恢复治疗之前进行了第二次活组织检查,所有在所述阶段对治疗产生抗药性的患者也失去了之前蛋白酶体的核优势(当他们对药物敏感时观察到)。相比之下,复发后仍对药物敏感的患者的所有活组织检查都保持了蛋白酶体的核优势。值得注意的是,两组患者在复发前的缓解期也存在显着差异:抗药患者(伴随着核蛋白酶体定位丧失),从首次诊断到复发的平均间隔时间为24个月。相比之下,那些对药物保持敏感(同时保持核蛋白酶体优势)的患者的平均缓解间隔为44个月(图10E)。综上所述,我们在组织培养及患者中的发现揭示了导致MM抗药性的机制之一,并可能为护理人员提供治疗效果的有用预测工具。
示例12
蛋白酶体募集对体内肿瘤生长至关重要,其抑制作用导致细胞死亡及肿瘤大小减小
接下来在肿瘤模型中检查YWF对蛋白酶体动力学的可能影响。据推测,实体肿瘤固有的应力梯度是蛋白酶体迁移的刺激因素,与外围肿瘤相比,实体肿瘤的核心更缺氧,营养相对较缺少(Minchinton,A.I.及Tannock,I.F.(2006)Nat.Rev.Cancer 6,583–592)。这一假设与所发现的一致,即除了营养缺乏,缺氧还诱导蛋白酶体募集(图1H)。
使用小鼠中的人类乳腺及尿路上皮肿瘤模型,发明人表示出,在肿瘤的非压力边缘,蛋白酶体主要是在细胞核(图12A)。这与蛋白酶体在胞质溶胶中更丰富的核心形成对比(图12A)。注射YWF(皮下注射至肿瘤床)后,在肿瘤核心也观察到蛋白酶体的明显细胞核定位(图12A及12B)。相反地,注射QLR不影响蛋白酶体分布(图12B及13A、13B)。重要的是,通过饮用水口服YWF对蛋白酶体定位的影响与皮下注射相同(图12B)。
接下来,重要的是,要证明在压力期间将蛋白酶体“锁定(locking)”在细胞核中对肿瘤具有细胞毒性作用。因此,对肿瘤进行凋亡标记物TUNEL及裂解Caspase3染色。如图12所示,伴随着它们对蛋白酶体细胞核积累的诱导,YWF对压力的肿瘤细胞也产生了广泛的细胞毒性作用(图12C及12D)。肿瘤的这些部分还显示了受损组织、坏死及纤维化的特征性结构(图12C、12D及13C)。正如预期的,在对照组(QLR)中也可见零星的死亡细胞,但在YWF治疗的肿瘤核心中,凋亡及组织坏死的程度要高得多(图12C及12D)。
从宏观上观察肿瘤并比较其重量,发明人发现,与对照肿瘤相比,YWF在细胞水平上的作用(即蛋白酶体核保留及凋亡)也伴随着肿瘤大小的显着减少,最多减少约80%(图14A-14E及15D)。重要的是,YWF是有效的肿瘤生长抑制剂,无论其施用途径(皮下或口服饮用水)或测试的肿瘤类型(图14A-14E)。YWF即使在肿瘤发展过程中晚期施用也是有效的,在这种情况下,允许肿瘤在开始治疗之前达到显着的大尺寸(图15A-15C)。
鉴于在培养的细胞中,所有三种芳香氨基酸都是实质性抑制蛋白酶体募集及随后的凋亡所必需的(图5J),其目的是在肿瘤模型中检查这一点。因此,通过饮用水处理小鼠,使用Tyr、Trp及Phe的所有组合-单个氨基酸以及所有可能的氨基酸对。如图14F及14G所示,只有它们三个一起导致了肿瘤尺寸的显着减小。此外,当直接比较时,三者显示出显着的协同效应,远优于任何其他组合(图15E、15F)。重要的是,所有20种氨基酸的施用对肿瘤生长没有影响(图14F)。
因此,本公开的发现揭示了蛋白酶体动力学作为实体瘤中压力应对机制的关键作用,这对实体瘤及血液系统恶性肿瘤具有潜在的治疗意义。
示例13
D-YWF以及L-YWF及D-YWF两种异构体的混合物可防止压力诱导的蛋白酶体易位
如图3及图5所示,L-YWF影响饥饿细胞的蛋白酶体易位。接下来研究了YWF的D-异构体对饥饿细胞的影响。如图16所示,D异构体也明显抑制蛋白酶体募集,但其效率低于L异构体。
芳香族氨基酸(如Phe、Trp、Tyr及His)先前被报导形成广泛的纳米结构(包括纤维、纳米管、纳米带、扭曲的纳米片、树枝状结构等),这取决于自组装条件。这些纳米纤维结构显示出明显的细胞毒性。通过使用D-对映体,Gazit等人(ACS Nano 2020,14,2,1694-1706)最近证明了氨基酸手性(amino acid chirality)在自组装过程中的关键作用。更具体而言,L-及D-异构体的外消旋混合物阻止了每个对映体形成这些纳米纤维结构。因此,如果在饥饿细胞中观察到的L-YWF的致死性与这些结构的形成有关,则外消旋混合物应防止这种效应。因此,用L-YWF及D-YWF的外消旋混合物处理被冷却的细胞。如图16中的下图所示,外消旋混合物有效抑制蛋白酶体募集,表示出L-YWF的致死性与纳米纤维结构的形成无关。
示例14
扫描肿瘤活组织检查以定位蛋白酶体,以确定YWF治疗的候选反应者,为定制治疗提供工具
接下来,发明人对来自人类肿瘤(例如肝胆、脑、肺、胰腺、结直肠、弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)、乳腺及卵巢)的大量活组织检查组织进行病理检查,以确定蛋白酶体的定位。所述分析可作为对蛋白酶体易位选择性抑制剂(如YWF)治疗敏感的肿瘤的指标,并进一步用作监测临床结果及可用治疗成功的预后工具。
如前面的示例及实验程序中所述,确定每个样品的蛋白酶体定位。至少在所检查的肿瘤组织的肿瘤细胞的一部分中显示出蛋白酶体胞质溶胶分布,或相等分布的肿瘤组织被分类为蛋白酶体易位选择性抑制剂的候选反应者,例如本发明的YWF三联体。如下文所述,进一步评估候选反应者。
接下来,使用患者来源的肿瘤异种移植物(patient-derived xenografts,PDXs)在体内证实基于病理及临床发现的预测,以进一步评估候选反应者。更具体而言,患者的新鲜手术样品-PDX是在SCID小鼠中产生的。然后用蛋白酶体易位的选择性抑制剂(例如YWF)治疗小鼠。蛋白酶体的定位与治疗反应之间的相关性。所述方法证明了蛋白酶体分布确实是定制治疗的有效患者特异性指标的概念。所述模型进一步提供了对潜在机制线索以及目标及标记识别的访问。为此,对健康小鼠组织及其相应植入的人类肿瘤进行转录组学分析。这些组织与小鼠血浆一起也进行代谢组学分析。
示例15
YWF治疗小鼠自发性内源性肿瘤的疗效
受YWF施用可在小鼠异种移植模型中强烈抑制肿瘤生长的发现的鼓舞,本发明人接下来评估了本发明的riad对免疫有能力的动物体内的内源性组织产生的肿瘤的影响。因此,使用了APCfl/fl CDX2 Cre ER模型。在所述肿瘤模型中,通过施用莫昔芬(tamoxifen)(一种雌激素受体调节剂),在肠道中选择性地诱导腺瘤性息肉病大肠杆菌(AdenomatousPolyposis Coli,APC)基因的敲除(knockout,KO)。APC是一个关键的抑癌基因,所述基因的突变在大多数人类癌症患者中发现。
所述模型可以监测肿瘤的生长情况,这些肿瘤(1)是由于细胞失调而从正常组织中产生的,就像在真实的癌症病例中一样;(2)概括患者事件的分子链;(3)在生物体内的真实解剖部位生长;及(4)在免疫系统完整的动物中发育,已知免疫系统在肿瘤发生中起作用。
在胃肠道肿瘤的诱导及发展之后,小鼠在其饮用水中用YWF处理,如之前对异种移植模型所述。如图17所示,YWF治疗显着降低了肿瘤负担,如下参数所示:
首先,如图17A所示,在盲肠中,发育的肿瘤正在形成一个肿瘤集合体,通过称量盲肠来评估。相对于无肿瘤动物中正常盲肠的重量,多余的重量代表了肿瘤生长的程度。与安慰剂组相比,YWF减少了87%的盲肠肿瘤生长。
第二,如图17B所示,沿着肠道,不同的肿瘤正在形成,其数量表示出了疾病的程度。与对照组相比,YWF减少了>88%的肠道肿瘤数量。
第三,如图17C所示,除了它们的数量外,还使用卡尺测量每个肠道肿瘤,并计算其体积。将单个动物中所有此类肿瘤的体积相加,得出总体积作为肿瘤负荷的指示。与安慰剂组相比,YWF减少了98%的平均肿瘤体积负荷。
发明人发现,在显微镜下也可以看到YWF对肿瘤的收缩作用,在某些情况下,治疗几乎完全消除了它们。相比之下,安慰剂组大肿瘤清晰可见,几乎掩盖了正常的肠道组织(图18A及18B)。使用PROX1对样品进行染色,PROX1是一种高级异型增生的标记物,进一步证明YWF与对照安慰剂组相比强烈抑制癌症的生长(图18A)(图18B)。
为了建立蛋白酶体定位与观察到的肿瘤生长抑制之间的联系,如异种移植物中所示,对样品进行蛋白酶体亚基α5染色。如图19所示,蛋白酶体在很大程度上转移到安慰剂组肿瘤内细胞的胞质溶胶中,而YWF治疗将其隔离在细胞核中。
综上所述,内源性APC结肠癌模型中的这些结果概括了异种移植模型中获得的结果,强调了本发明治疗方法的有效性,以及其应用的相对普遍性,即可以使用YWF治疗的各种肿瘤类型。
示例16
评估YWF组合物与L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)高剂量治疗相关的毒性及疗效
发明人接着评估了与高浓度苯丙氨酸(45mM F,如WO2015137383A1(14)所公开的)相比,用本发明的YWF三联体(每种浓度为1.6mM的YWF)处理的效果,因此,培养细胞的培养基补充了适当的氨基酸。由于肿瘤细胞本身就有压力(由于高代谢需求及营养物质及氧气的灌注不足),因此使用培养中的饥饿细胞来模拟不同治疗的效果。类似地,为了模拟每种处理对体内“正常”组织的影响(这些组织没有受到压力),将相同的氨基酸添加到培养中的非饥饿细胞中。
如图20所示,YWF混合物是受试者中对抗压力癌症细胞最有效的治疗方法。尽管其浓度相对较低,但这表示出了三种芳香族氨基酸的协同作用。重要的是,这样的低浓度对非压力细胞的不良影响最小(如果有的话)。相反地,高浓度苯丙氨酸(45mM F,(14))的处理对非压力细胞也具有高度致死性。其对压力及非压力细胞的毒性表示出,与本公开的低剂量YWF混合物不同,所述方法是非选择性的。
因此,本发明的YWF混合物不仅对压力细胞(模拟整个生物体中的肿瘤细胞)显示出最高的疗效,而且是最有选择性的治疗,对非压力细胞(模仿患者中的非癌组织)几乎没有有害影响。
除了评估45mM的苯丙氨酸(F)外,接下来评估高浓度(45mM)的额外芳香族氨基酸残基色氨酸(W)的影响。如图20所示,结果与45mM F的结果相似,强调了高剂量下单一芳香族氨基酸的选择性不足,以及三联体的显着协同作用(及毒性不足)。值得注意的是,酪氨酸(Y)不溶于45mM的程度,因此没有单独测试,W及F也是如此。
就培养细胞的结果而言,这些数据使本发明的YWF混合物具有优越性,因此明显优选使用。此外,这些数据清楚地表示出,使用45mM F(或W)的处理是非选择性的,并且可能会损害压力及非压力细胞。
本发明人接下来旨在使用小鼠肿瘤模型评估上述治疗的体内抗肿瘤作用。肿瘤形成后,每组接受不同的治疗,最终将肿瘤大小与对照组(QLR)进行比较。如图21所示,低剂量YWF组合显着抑制了约75%的肿瘤生长,而单独使用F即使在浓度为45mM时也不会产生任何益处。
因此,使用45mM F的治疗在消除培养物中的压力癌细胞方面明显低于预设公开的以1.6mM/每种的YWF的混合物。此外,用高剂量的苯丙氨酸(45mM F)治疗是非选择性的,因此对非压力细胞有害,而YWF是选择性的及无害的。更重要的是,与显着减小肿瘤尺寸的本发明的YWF三联体不同,用高剂量苯丙氨酸(45mM F)治疗对异种移植小鼠模型中的肿瘤生长没有影响。
这些比较实验清楚地显示了YWF三联体的优势,并证明了其治疗用途的可行性。
序列表
<110> 技术研发基金会有限公司(TECHNION RESEARCH & DEVELOPMENT FOUNDATIONLTD.)
兰巴姆医疗技术有限公司(RAMBAM MED-TECH LTD.)
<120> 酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸作为调节蛋白酶体动力学的促动剂、其在治疗中的组成、方法及用途、以及抗药性的预后方法(TYROSINE, TRYPTOPHAN AND PHENYLALANINEAS mTOR AGONISTS MEDIATING
PROTEASOME DYNAMICS, COMPOSITIONS, METHODS AND USES THEREOF IN
THERAPY, AND PROGNOSTIC METHODS FOR DRUG-RESISTANCE)
<130> 2807807-JDB
<150> US 62/705,668
<151> 2020-07-09
<150> US 63/147,888
<151> 2021-02-10
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 富含亮氨酸的 NES 共有序列
<220>
<221> MISC_特征(MISC_FEATURE)
<222> (1)..(1)
<223> Xaa 是 Leu、Ile、Val、Phe 或 Met 中的任何一者
<220>
<221> MISC_特征(MISC_FEATURE)
<222> (2)..(2)
<223> Xaa是任何重复n次的氨基酸,其中n是2或3
<220>
<221> MISC_特征(MISC_FEATURE)
<222> (3)..(3)
<223> Xaa 是 Leu、Ile、Val、Phe 或 Met 中的任何一者
<220>
<221> MISC_特征(MISC_FEATURE)
<222> (4)..(4)
<223> Xaa是任何重复n次的氨基酸,其中n是2或3
<220>
<221> MISC_特征(MISC_FEATURE)
<222> (5)..(5)
<223> Xaa 是 Leu、Ile、Val、Phe 或 Met 中的任何一者
<220>
<221> MISC_特征(MISC_FEATURE)
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是任何氨基酸
<220>
<221> MISC_特征(MISC_FEATURE)
<222> (7)..(7)
<223> Xaa 是 Leu、Ile、Val、Phe 或 Met 中的任何一者
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NES序列
<400> 2
Leu Pro Pro Leu Glu Arg Leu Thr Leu
1 5
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自 p62 的 NES 编码序列
<400> 3
gcccgtcggc cgccgccaac tacctgctct gtaccaactg ccggaaagtg ctgcggaagg 60
ataaaagaat 70
<210> 4
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自 p62 的 NES 序列
<400> 4
Ala Thr Gln Ser Leu Ala Glu Gln Met Arg Lys Ile Ala Leu Glu Ser
1 5 10 15
Glu Gly
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经典 NLS,(单环(monopartite))
<400> 5
Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
1 5
<210> 6
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 经典 NLS,(二环(bipartite))
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(12)
<223> Xaa是任何氨基酸
<400> 6
Lys Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Lys Lys Lys Leu
1 5 10 15
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 非经典NLS
<400> 7
Pro Arg Val Arg Tyr Asn Pro Tyr Thr Thr Arg Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 来自SV40的 NLS编码序列
<400> 8
ccaccaaaga agaagagaaa ggtt 24
Claims (45)
1.一种雷帕霉素的哺乳动物标靶的激动剂,即为mTOR激动剂,其特征在于,所述雷帕霉素的哺乳动物标靶的激动剂包含至少两个芳香族氨基酸残基或其任何模拟物的一组合,或直接或间接调节所述两个芳香族氨基酸氨基酸残基中至少一者的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,所述mTOR激动剂包含以下的至少两者:
(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述酪氨酸残基及/或所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;
(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述色氨酸残基及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物;及
(c)至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。
2.如权利要求1所述的mTOR激动剂,其特征在于,所述mTOR激动剂包括:
(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述酪氨酸残基及/或所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;
(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述色氨酸残余物及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物;及
(c)至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。
3.一种组合物,其特征在于,所述组合物包含作为一活性成分的至少一mTOR激动剂或其任何载体、基质、纳米或微粒,任选地为至少一剂型的形式,所述mTOR激动剂包含以下的至少两者:
(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述酪氨酸残基及/或所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;
(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述色氨酸残基及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物;及
(c)至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物、及/或稀释剂。
4.如权利要求3所述的组合物,其特征在于,所述组合物包括:
(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述酪氨酸残基及/或所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物;
(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述色氨酸残余物及/或所述mTOR激动性色氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物;及
(c)至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物。
5.如权利要求3及4中任一项所述的组合物,其特征在于,所述至少一mTOR激动剂配制成一口服剂型或一注射剂型。
6.如权利要求5所述的组合物,其特征在于,所述口服剂型为适于添加到固体、半固体或液态食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、医疗食品、药物及/或一药物组合物中的一制剂。
7.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括以下的至少两者:
(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述酪氨酸残基及/或所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,任选地以一第一剂型的形式;
(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述色氨酸残余物及/或所述mTOR激动性色氨酸仿物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物,任选地以一第二剂型的形式;及
(c)至少一苯丙氨酸残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,任选地以一第三剂型的形式。
8.如权利要求7所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包含至少一泛素蛋白酶体系统调节剂及/或至少一治疗剂,任选地以一第四剂型的形式。
9.一种用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟一受试者中与胞质溶胶蛋白酶体定位及/或活性相关的至少一病症或至少一病理性疾病的进展的方法,其特征在于,所述方法包括向所述受试者施用至少一mTOR激动剂的一有效量的步骤,所述至少一mTOR激动剂包含至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动模拟物,或其任何盐或酯,或所述至少一芳香族胺基酸残基及/或所述mTOR激动性模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或直接或间接调节所述至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,或其任何剂型,或包含所述至少一mTOR激动剂的任何组合物或试剂盒。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述至少一mTOR激动剂包括:
(a)至少一酪氨酸残基、任何mTOR激动性酪氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述酪氨酸残基及/或所述mTOR激动性酪氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,任选地以一第一剂型的形式;
(b)至少一色氨酸残基、任何mTOR激动性色氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述色氨酸残余物及/或所述mTOR激动性色氨酸仿物的任何多聚体及/或聚合物形式、或其任何组合或混合物,任选地以一第二剂型的形式;及
(c)至少一苯丙氨酸(F)残基、任何mTOR激动性苯丙氨酸模拟物、其任何盐或酯、所述苯丙氨酸残基及/或所述mTOR激动性苯丙氨酸模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式、及其任何组合或混合物,任选地以一第三剂型的形式。
11.如权利要求9至10中任一项所述的方法,其特征在于,在施用所述至少一mTOR激动剂之前、之后及/或同时,还向所述受试者施用至少一泛素蛋白酶体系统调节剂及/或至少一治疗剂中的至少一者。
12.如权利要求9至11中任一项所述的方法,其特征在于,所述至少一mTOR激动剂配制为一口服剂型或一注射剂型。
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,所述口服剂型为适于添加到固体、半固体或液态食品、饮料、食品添加剂、食品补充剂、医疗食品、药物及/或一药物组合物中的一制剂。
14.如权利要求9至13中任一项所述的方法,其特征在于,所述至少一mTOR激动剂口服施用于所述受试者。
15.如权利要求9至14中任一项所述的方法,其特征在于,所述受试者受到及/或曾经受到数个氨基酸的饮食限制。
16.如权利要求9至15中任一项所述的方法,其特征在于,与胞质溶胶蛋白酶体定位及/或活性相关的所述病理性疾病是至少一增殖性疾病及/或至少一蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病中的至少一者。
17.如权利要求16所述的方法,其特征在于,其中以下的至少一者:
(a)所述增殖性疾病是一良性或恶性实体瘤及非实体瘤中的至少一者;及
(b)所述蛋白质错误折迭疾病是淀粉样变性及任何相关病症。
18.一种具有至少一mTOR激动剂的一有效量在一方法中的用途,其特征在于,用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟与至少一短期细胞压力状态及/或过程相关的至少一病症或至少一病理性疾病的进展,所述至少一mTOR激动剂包括至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动性模拟物,或其任何盐或酯,或所述至少一芳香族氨基酸残基及/或所述mTOR激动性模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或其任何组合或混合物,或其任何剂型,或包含所述mTOR激动剂的任何组合物或试剂盒。
19.一种用于调节至少一细胞及/或一受试者中与蛋白酶体动力学直接或间接相关的一生物过程的方法,其特征在于,所述方法包括接触所述至少一细胞及/或向所述受试者施用至少一mTOR激动剂的一治疗有效量的步骤,所述至少一mTOR激动剂包括至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动性模拟物,或其任何盐或酯,或所述至少一芳香族氨基酸残基及/或所述mTOR激动性模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或直接或间接调节所述至少一芳香族胺基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或其任何组合或混合物,或其任何载体、基质、纳米或微粒,或其任何剂型或,或包含所述mTOR激动剂的任何组合物或试剂盒。
20.一种通过选择性调节蛋白酶体易位到数个癌症细胞的胞质溶胶来选择性诱导所述数个癌症细胞凋亡的方法,其特征在于,所述方法包括将所述数个细胞与至少一蛋白酶体穿梭的选择性调节剂的一有效量接触,或与包含所述选择性调节剂的任何组合物接触。
21.一种通过选择性调节蛋白酶体易位到一受试者的数个癌症细胞的胞质溶胶来治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延缓所述受试者的一癌症的进展的方法,其特征在于,所述方法包括向所述受试者施用至少一选择性蛋白酶体易位抑制剂的一治疗有效量,或与包含所述选择性抑制剂的任何组合物一起施用。
22.一种预后方法,用于预测及评估患有一病理性疾病的一受试者对包括至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一治疗方案的反应性,并且可选地用于监测疾病进展,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)确定所述受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位;及
(b)将所述受试者分类为:
(i)对于所述治疗方案的一反应性受试者,如果在所述至少一样品的至少一细胞中蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核;或
(ii)一抗药性受试者,如果在所述至少一样品的至少一细胞中蛋白酶体亚细胞定位是在胞质溶胶;
从而预测、评估及监测一哺乳动物受试者对所述治疗方案的反应性。
23.如权利要求22所述的预后方法,其特征在于,对于同时显示细胞核的及胞质溶胶的蛋白酶体定位的一受试者,所述至少一细胞中的所述蛋白酶体的50%或更少的一细胞核定位指示出抗药性。
24.如权利要求22至23中任一项所述的方法,其特征在于,所述监测疾病进展包括预测及确定疾病复发及评估缓解间隔中的至少一者,并且其中所述方法还包括以下步骤:
(c)重复步骤(1)(a)以针对所述受试者的至少一暂时分离的样品的至少一细胞来确定蛋白酶体亚细胞定位;及
(d)如果所述至少一暂时分离的样品中的至少一者细胞显示蛋白酶体细胞核定位的丢失或维持的胞质溶胶定位,则预测及/或确定所述受试者的疾病复发。
25.如权利要求22至24中任一项所述的方法,其特征在于,所述至少一暂时分离的样品是在开始至少一治疗方案之后获得的,所述至少一治疗方案包含至少一泛素蛋白酶体系统调节剂。
26.如权利要求22至25中任一项所述的方法,其特征在于,所述受试者患有至少一增殖性疾病及/或至少一蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病中的至少一者。
27.如权利要求26所述的方法,其特征在于,所述增殖性疾病是至少一血液学恶性肿瘤,并且其中所述蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病是淀粉样变及任何相关病症。
28.如权利要求22至27中任一权利要求所述的方法,其特征在于,所述血液学癌症是多发性骨髓瘤及/或任何相关病症,并且其中所述预测方法用于预测及评估患有多发性骨髓瘤的一受试者对包含至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一治疗方案的反应性,并且任选地,用于监测所述受试者的多发性骨髓瘤疾病进展。
29.一种用于确定患有一病理性疾病的一受试者的一个性化治疗方案的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)确定所述受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位;
(b)将所述受试者分类为:
(i)对于包含至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的至少一治疗方案的一反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核;或
(ii)对于所述治疗方案的一抗药性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位在胞质溶胶;及
(c)向分类为一反应者的一受试者施用至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一有效量、其任何组合或包含其的任何组合物。
30.如权利要求29所述的方法,其特征在于,所述方法包括向分类为一抗药者的一受试者施用一治疗方案的步骤,所述治疗方案包含至少一泛素蛋白酶体系统调节剂、至少一mTOR激动剂的一有效量、或其任意组合,任选地,具有至少一泛素蛋白酶体系统调节剂及/或至少一治疗剂中的至少一者。
31.如权利要求30所述的方法,其特征在于,所述至少一调节剂选择性地抑制蛋白酶体易位至胞质溶胶及/或充当一mTOR激动剂,所述选择性抑制剂及/或mTOR激动剂包含至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动性模拟物,或其任何盐或酯,或所述至少一芳香族氨基酸残基及/或所述mTOR激动性芳香族氨基酸残基模拟物的任何多聚体及/或聚合物形式,或任何直接或间接调节所述至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的化合物,或其任何组合或混合物、任何载体、基质、纳米或微粒,或包含其的任何组合物或试剂盒。
32.如权利要求29至31中任一项所述的方法,其特征在于,所述受试者接受及/或曾经接受包含至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一治疗方案,并监测疾病进展,所述方法包括以下步骤:
(a)确定所述受试者的至少一生物样品的至少一细胞中的蛋白酶体亚细胞定位,其中所述样品中的至少一者是在所述治疗方案开始后获得的;
(b)确定以下的至少一者:
(i)所述受试者的疾病复发及/或反应性丧失及/或抗药性,如果所述样品的至少一细胞显示蛋白酶体细胞核定位丧失;或
(ii)所述受试者的反应性或维持的反应性,如果所述样品的至少一细胞显示维持的主要蛋白酶体细胞核定位;及
(c)停止包括显示疾病复发及/或反应性丧失及/或抗药性的一受试者的至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一治疗方案,或维持显示反应性或维持的反应性的一受试者的所述治疗方案。
33.如权利要求29至32中任一项所述的方法,其特征在于,所述受试者患有至少一增殖性疾病及/或至少一蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病中的至少一者。
34.如权利要求33所述的方法,其特征在于,所述增殖性疾病是至少一血液学恶性肿瘤,并且其中所述蛋白质错误折迭疾病或沉积疾病是淀粉样变及/或任何相关病症。
35.如权利要求29至34中任一项所述的方法,其特征在于,所述血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤及/或相关病症,并且其中所述方法用于确定患有多发性骨髓瘤及/或者任何相关病症的一受试者的一个人化治疗方案。
36.一种方法,用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟有其需要的一受试者中的至少一增殖性疾病及/或至少一蛋白质错误折迭疾病的进展,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)确定所述受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位;
(b)将所述受试者分类为:
(i)对于包含至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一治疗方案的一反应性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位主要在细胞核;或
(ii)一抗药性受试者,如果蛋白酶体亚细胞定位是在胞质溶胶;及
(c)基于所述反应性来选择一治疗方案,从而用选择的所述治疗方案治疗所述受试者。
37.如权利要求36所述的方法,其特征在于,步骤(c)包括:
(i)向分类为一反应者的一受试者施用至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一有效量、其任何组合或包含其的任何组合物;或
(ii)向分类为一抗药者的受试者施用至少一mTOR激动剂的一有效量或其任何组合,任选地,与至少一泛素蛋白酶体系统调节剂及/或至少一治疗剂一起施用。
38.如权利要求36至37中任一项所述的方法,其特征在于,所述至少一mTOR激动剂包含至少一芳香族氨基酸残基,或其任何mTOR激动剂模拟物,或其任何盐或酯,或所述至少一芳香族氨基酸残基及/或所述mTOR激动性模拟物的任何多聚体及/或多聚体形式、直接或间接调节所述至少一芳香族氨基酸残基的水平、稳定性及生物利用度中至少一者的任何化合物,或其任何组合或混合物,或任何载体、基质、纳米或微粒,或其任何组合或混合物,或包含其的任何组合物或试剂盒。
39.如权利要求36至38中任一项所述的方法,其特征在于,所述受试者接受及/或曾经接受包含至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一治疗方案,并监测疾病进展,所述方法包括以下步骤:
(a)确定所述受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位,其中所述样品的至少一者是在所述治疗方案开始后获得的;
(b)确定以下的至少一者:
(i)疾病复发及/或反应性丧失及/或耐药性,如果所述样品的至少一细胞显示蛋白酶体细胞核定位丧失或维持胞质溶胶定位;或
(ii)所述受试者的反应性或维持的反应性,如果所述样品的至少一细胞显示维持的主要蛋白酶体细胞核定位;及
(c)停止包括显示疾病复发及/或反应性丧失的受试者的至少一泛素蛋白酶体系统调节剂的一治疗方案,或维持显示反应性或维持反应性的受试者的所述治疗方案。
40.如权利要求36至39中任一项所述的方法,其特征在于,所述增殖性疾病是至少一血液恶性肿瘤,并且其中所述蛋白质错误折迭疾病是淀粉样变及任何相关病症。
41.如权利要求36至40中任一项所述的方法,其特征在于,所述血液恶性肿瘤是多发性骨髓瘤,并且其中所述方法用于治疗、预防、抑制、减少、消除、保护或延迟一受试者中的多发性骨髓瘤的进展及/或任何相关病症。
42.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:
(a)至少一装置及/或试剂,用于确定至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位;
所述试剂盒任选地还包括以下的至少一者:
(b)提供蛋白酶体亚细胞定位的数个标准值的预定校准曲线;
(c)至少一对照样品;及
(d)使用说明。
43.一种预后方法,用于预测及评估患有一增殖性疾病的一受试者对蛋白酶体易位的一选择性调节剂的反应性,并且任选地用于监测疾病进展,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)确定所述受试者的至少一生物样品的至少一细胞中或所述细胞的任何部分中的蛋白酶体亚细胞定位;及
(b)如果蛋白酶体亚细胞定位在所述至少一样品的至少一细胞中是在胞质溶胶或均匀分布,则将所述受试者分类为对于所述蛋白酶体易位的选择性抑制剂的一反应性受试者;
任选地,所述方法还包括以下步骤:
(c)如果所述受试者在与所述蛋白酶体易位的选择性抑制剂接触后,蛋白酶体亚细细胞定位主要是在一细胞中细胞核,确定在步骤(b)中分类为一反应性受试者的一受试者的一样品的至少一细胞中的蛋白酶体亚细胞定位,并确认所述受试者的反应性。
44.一种用于鉴定蛋白酶体易位的至少一选择性调节剂的筛选方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)在任选地数个细胞压力状态下与一候选化合物接触的至少一细胞中或在所述细胞的任何部分中测定蛋白酶体亚细胞定位;
(b)在任选地数个细胞压力状态下与所述候选化合物接触的至少一细胞中或在所述细胞的任何部分中测定至少一对照蛋白的亚细胞定位,其中所述至少一对照蛋白是至少一输出对照蛋白及/或至少一输入对照蛋白;及
(c)确定所述候选化合物为:
(i)蛋白酶体易位的一选择性抑制剂,如果步骤(a)的蛋白酶体亚细胞定位主要是在细胞核,并且步骤(b)的所述至少一输出对照蛋白的亚细胞定位在与所述候选化合物接触的至少一细胞中主要是在胞质溶胶或均匀分布;或
(ii)蛋白酶体易位的一选择性增强剂,如果步骤(a)的蛋白酶体亚细胞定位主要是在胞质溶胶,并且步骤(b)的所述至少一输入对照蛋白的亚细胞定位在与所述候选化合物接触的至少一细胞中主要是在细胞核。
45.如权利要求44所述的方法,其特征在于,所述至少一输入对照蛋白或所述至少一输出对照蛋白是由至少一核质转运组分所介导。
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