JP4686780B2 - 細胞死抑制活性強化タンパク質ｆｎｋを用いた脱毛の防止 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞死抑制活性強化タンパク質を含む脱毛防止剤に関する。
ヒトの毛髪は約十万本あり、一ヶ月に約１ｃｍ成長する。その成長は持続的なものではなく、ヘアサイクル（毛周期）と呼ばれる成長と退縮のプロセスを繰り返す。一本の毛は、２〜６年の成長期と呼ばれる細胞増殖や分化の盛んな時期を経て、退行期（２〜３週間）へと移行する。退行期では、毛母で細胞分裂が停止し、アポトーシス（細胞死）を生じ、急速に細胞数が減少して萎縮する。その後、休止期（３〜４ヶ月）となり、毛根は棍棒状となり、毛胞の下端から発生した新しい毛が次の成長期に入り、古い毛髪は脱落する。
脱毛は、壮年性脱毛症と円形脱毛症の２つのタイプに大きく分けることができる。壮年性脱毛症では、遺伝的背景と男性ホルモンの作用によるというのは知られていたが、ここ数年の研究から男性ホルモンによって産生が高められたＴＧＦβＩＩがカスパーゼに働きかけ毛母細胞をアポトーシスに至らし、毛母細胞の細胞死が早期退行期開始を促し脱毛へとつながることがわかってきた（非特許文献１参照）。
また、細胞死に起因する脱毛は、抗癌剤の投与による副作用として起こることが知られている。多くの抗癌剤は、細胞分裂を行って増殖している細胞を攻撃する。このため、毛母細胞のような細胞増殖が盛んに起こっている細胞も攻撃され、副作用として脱毛症を引き起こす。
細胞死を抑制することによって脱毛を防止することに関しては、従来より数多くの物質が提案されており、その多くは低分子化合物、アミノ酸等であった（特許文献１〜３等を参照）。これらは、アポトーシス抑制作用をもつ遺伝子の発現を増加させたり、アポトーシスを伝達するシグナルの一つであるカスパーゼ阻害剤を用いるという間接的なもので、その効果は必ずしも満足できるものではなかった。従って、より効果的な脱毛防止剤が望まれているのが現状である。
特開２００４−５３１５５８号公報
特開２００２−３１６９２９号公報
特開２００２−２４９４９８号公報
Ｈｉｂｉｎｏ，Ｔ．，ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｙａｍａ，Ｔ．，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ Ｓｃｉ．，３５，９−１８．（２００４）
脱毛は、壮年性脱毛症と円形脱毛症の２つのタイプに大きく分けることができる。壮年性脱毛症では、遺伝的背景と男性ホルモンの作用によるというのは知られていたが、ここ数年の研究から男性ホルモンによって産生が高められたＴＧＦβＩＩがカスパーゼに働きかけ毛母細胞をアポトーシスに至らし、毛母細胞の細胞死が早期退行期開始を促し脱毛へとつながることがわかってきた（非特許文献１参照）。
また、細胞死に起因する脱毛は、抗癌剤の投与による副作用として起こることが知られている。多くの抗癌剤は、細胞分裂を行って増殖している細胞を攻撃する。このため、毛母細胞のような細胞増殖が盛んに起こっている細胞も攻撃され、副作用として脱毛症を引き起こす。
細胞死を抑制することによって脱毛を防止することに関しては、従来より数多くの物質が提案されており、その多くは低分子化合物、アミノ酸等であった（特許文献１〜３等を参照）。これらは、アポトーシス抑制作用をもつ遺伝子の発現を増加させたり、アポトーシスを伝達するシグナルの一つであるカスパーゼ阻害剤を用いるという間接的なもので、その効果は必ずしも満足できるものではなかった。従って、より効果的な脱毛防止剤が望まれているのが現状である。
細胞死に起因する脱毛の防止に有効な、細胞死抑制活性強化タンパク質を含む脱毛防止剤を提供することを目的とする。細胞死抑制活性を強化したタンパク質であるＦＮＫを有効成分とする脱毛防止剤の使用により脱毛を防止する。
上記のように、細胞死が脱毛の一因であることは示唆されていたが、脱毛には様々な複雑なプロセスが関与している可能性もあり、実際に細胞死の抑制が脱毛を抑制するかを予測することは困難であった。
発明者らは、細胞死抑制活性強化タンパク質であるＦＮＫによる毛母細胞の細胞死の抑制が脱毛防止に寄与するか否かについて鋭意検討を行った。
ＦＮＫは、アポトーシス抑制タンパク質であるＢｃｌ−ｘＬを改変してその活性を強化したタンパク質であり、従来用いられてきたアポトーシス抑制タンパク質では得られない程の優れた効果が得られる。また、ＦＮＫは、アポトーシスのみでなく、ネクローシスも含めた細胞死を抑制する（Ｚｏｎａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉ−ｄｅａｔｈ ＦＮＫ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｓｏｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２００５，ｉｎ ｐｒｅｓｓ．）。従って、ＦＮＫが抑制する細胞死はアポトーシスに限定されない。ＦＮＫの改変元となったＢｃｌ−ｘＬは様々な生物種に存在するが、その配列は非常によく似ている。本件では、ヒトとラット由来のＦＮＫを用いたが、いずれも細胞死抑制効果を有していることがわかり、その他の生物種由来のＦＮＫでも同じような効果が予想される。従って、ＦＮＫを作製するにあたって、その改変元となるＢｃｌ−ｘＬの生物種は限定されない。
通常、タンパク質は細胞膜を通過できない。従って、細胞外からＦＮＫを投与するためには、細胞膜を通過させるための手段が必要となる。タンパク質医薬の場合、その分子量が大きいこともあり如何にしてタンパク質を標的部位に送達するかは大きな問題である。特に生体組織は複雑な構造を有しており、たとえタンパク質医薬が細胞で効果があることが示唆されていたとしても、生体組織に対して効果があるかどうかは予測不可能である。本発明者らは、ＦＮＫのＮ末端側にＰＴＤ（細胞膜通過ドメイン）を連結させた。本件では、ＴＡＴ、Ｒ９、Ｋ２Ｒ７とＲ７Ｇ６の４種類をＰＴＤとして用いたが、いずれも細胞死抑制効果を有していることがわかった。従って、このＰＴＤは、細胞膜通過機能を有していればよく、特定の配列に限定されない。さらに、本発明はＰＴＤを連結させたＦＮＫについて投与ルート、剤形も含めて検討を行い、ＦＫＮが脱毛抑制に効果があることを見出し本発明を完成させた。
本発明の態様は以下のとおりである。
［１］ Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質を有効成分として含む脱毛防止剤。
［２］ Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択される［１］の脱毛防止剤。
［３］ ＦＮＫタンパク質のＮ末端側に細胞膜通過ペプチドが連結している、［１］または［２］の脱毛防止剤。
［４］ 細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかから選択される［３］の脱毛防止剤。
（ｉ）６〜１２個のアルギニンからなるペプチド、
（ｉｉ）６〜１２個のリシンからなるペプチド、
（ｉｉｉ）６〜１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドにおいて、数個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド、
（ｖ）配列番号１１で表される（ｉ）のペプチド、
（ｖｉ）配列番号１３で表される（ｉｉｉ）のペプチド、
（ｖｉｉ）配列番号１５で表される（ｉｖ）のペプチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号１７で表されるペプチド、
（ｖｉｉｉｉ）配列番号１８で表されるペプチド、
（ｘ）配列番号１９で表されるペプチド、
（ｘｉ）配列番号２０で表されるペプチド、
（ｘｉｉ）配列番号２１で表されるペプチド、ならびに
（ｘｉｉｉ）配列番号２２で表されるペプチド
［５］ 毛母細胞の細胞死に起因する脱毛を防止する［１］〜［４］のいずれかの脱毛防止剤。
［６］ 抗癌剤投与に起因する脱毛を防止する［５］の脱毛防止剤。
［７］ 皮下投与剤である［１］〜［６］のいずれかの脱毛防止剤。
［８］ 皮膚への塗布、散布または噴霧剤である［１］〜［６］のいずれかの脱毛防止剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−０７１５０１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
上記のように、細胞死が脱毛の一因であることは示唆されていたが、脱毛には様々な複雑なプロセスが関与している可能性もあり、実際に細胞死の抑制が脱毛を抑制するかを予測することは困難であった。
発明者らは、細胞死抑制活性強化タンパク質であるＦＮＫによる毛母細胞の細胞死の抑制が脱毛防止に寄与するか否かについて鋭意検討を行った。
ＦＮＫは、アポトーシス抑制タンパク質であるＢｃｌ−ｘＬを改変してその活性を強化したタンパク質であり、従来用いられてきたアポトーシス抑制タンパク質では得られない程の優れた効果が得られる。また、ＦＮＫは、アポトーシスのみでなく、ネクローシスも含めた細胞死を抑制する（Ｚｏｎａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｐｒｅｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ａｎｔｉ−ｄｅａｔｈ ＦＮＫ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ａｓｏｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．２００５，ｉｎ ｐｒｅｓｓ．）。従って、ＦＮＫが抑制する細胞死はアポトーシスに限定されない。ＦＮＫの改変元となったＢｃｌ−ｘＬは様々な生物種に存在するが、その配列は非常によく似ている。本件では、ヒトとラット由来のＦＮＫを用いたが、いずれも細胞死抑制効果を有していることがわかり、その他の生物種由来のＦＮＫでも同じような効果が予想される。従って、ＦＮＫを作製するにあたって、その改変元となるＢｃｌ−ｘＬの生物種は限定されない。
通常、タンパク質は細胞膜を通過できない。従って、細胞外からＦＮＫを投与するためには、細胞膜を通過させるための手段が必要となる。タンパク質医薬の場合、その分子量が大きいこともあり如何にしてタンパク質を標的部位に送達するかは大きな問題である。特に生体組織は複雑な構造を有しており、たとえタンパク質医薬が細胞で効果があることが示唆されていたとしても、生体組織に対して効果があるかどうかは予測不可能である。本発明者らは、ＦＮＫのＮ末端側にＰＴＤ（細胞膜通過ドメイン）を連結させた。本件では、ＴＡＴ、Ｒ９、Ｋ２Ｒ７とＲ７Ｇ６の４種類をＰＴＤとして用いたが、いずれも細胞死抑制効果を有していることがわかった。従って、このＰＴＤは、細胞膜通過機能を有していればよく、特定の配列に限定されない。さらに、本発明はＰＴＤを連結させたＦＮＫについて投与ルート、剤形も含めて検討を行い、ＦＫＮが脱毛抑制に効果があることを見出し本発明を完成させた。
本発明の態様は以下のとおりである。
［１］ Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちの少なくとも１つの置換を有するＦＮＫタンパク質を有効成分として含む脱毛防止剤。
［２］ Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択される［１］の脱毛防止剤。
［３］ ＦＮＫタンパク質のＮ末端側に細胞膜通過ペプチドが連結している、［１］または［２］の脱毛防止剤。
［４］ 細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかから選択される［３］の脱毛防止剤。
（ｉ）６〜１２個のアルギニンからなるペプチド、
（ｉｉ）６〜１２個のリシンからなるペプチド、
（ｉｉｉ）６〜１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドにおいて、数個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド、
（ｖ）配列番号１１で表される（ｉ）のペプチド、
（ｖｉ）配列番号１３で表される（ｉｉｉ）のペプチド、
（ｖｉｉ）配列番号１５で表される（ｉｖ）のペプチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号１７で表されるペプチド、
（ｖｉｉｉｉ）配列番号１８で表されるペプチド、
（ｘ）配列番号１９で表されるペプチド、
（ｘｉ）配列番号２０で表されるペプチド、
（ｘｉｉ）配列番号２１で表されるペプチド、ならびに
（ｘｉｉｉ）配列番号２２で表されるペプチド
［５］ 毛母細胞の細胞死に起因する脱毛を防止する［１］〜［４］のいずれかの脱毛防止剤。
［６］ 抗癌剤投与に起因する脱毛を防止する［５］の脱毛防止剤。
［７］ 皮下投与剤である［１］〜［６］のいずれかの脱毛防止剤。
［８］ 皮膚への塗布、散布または噴霧剤である［１］〜［６］のいずれかの脱毛防止剤。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００５−０７１５０１号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
図１は、１３週齢のマウスにエトポシドを投与した場合の投与後８日目までの短期的な脱毛の様子を示す写真である。図１の投与８日後の矢印を示したマウスは、左から３ｍｇ／ｋｇ投与、３ｍｇ／ｋｇ投与、６ｍｇ／ｋｇ投与および６ｍｇ／ｋｇ投与マウスである。
図２は、１３週齢のマウスにエトポシドを投与した場合の投与後１週間から４週間までの長期的な脱毛の様子を示す写真である。
図３は、ＦＮＫ投与による投与部位に対する脱毛抑制効果を示す写真である。
図４は、ＦＮＫ濃度依存的な脱毛抑制効果を示す写真である。
図５は、各生物種由来および各種ＰＴＤを連結させたＦＮＫの効果を示す写真である。
図６は、ヒト、マウス、ラット、ブタおよびイヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
図７は、ＦＮＫによる毛母細胞の細胞死抑制効果を示す写真である。
図２は、１３週齢のマウスにエトポシドを投与した場合の投与後１週間から４週間までの長期的な脱毛の様子を示す写真である。
図３は、ＦＮＫ投与による投与部位に対する脱毛抑制効果を示す写真である。
図４は、ＦＮＫ濃度依存的な脱毛抑制効果を示す写真である。
図５は、各生物種由来および各種ＰＴＤを連結させたＦＮＫの効果を示す写真である。
図６は、ヒト、マウス、ラット、ブタおよびイヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。
図７は、ＦＮＫによる毛母細胞の細胞死抑制効果を示す写真である。
以下、本発明について詳細に説明する。
細胞死抑制活性強化タンパク質であるＦＮＫは、がん原遺伝子であるｂｃｌ−２遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６（４６７８）：１０９７−１０９９，１９８４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１（２２）：７１６６−７１７０，１９８４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１４）：５２１４−５２１８，１９８６；Ｃｅｌｌ４７（１）：１９−２８，１９８６）のホモログからなるｂｃｌ−２ファミリーに属するｂｃｌ−ｘＬ遺伝子（Ｃｅｌｌ ７４（４）：５９７−６０８，１９９３）を改変することにより得られる。
ＦＮＫは、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する。好ましくは３つが置換されている。ＦＮＫをコードする遺伝子は、ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子のコード領域において、第２２番目のＴｙｒをコードするトリプレットコドン（ｔａｃ）をＰｈｅをコードするコドン（ｔｔｔまたはｔｔｃ）に置換する塩基の置換、第２６番目のＧｌｎをコードするコドン（ｃａｇ）をＡｓｎをコードするコドン（ａａｔまたはａａｃ）に置換する塩基の置換および第１６５番目のＡｒｇをコードするコドン（ｃｇｇ）をＬｙｓをコードするコドン（ａａａまたはａａｇ）に置換する塩基の置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つの置換を有するように塩基配列を変異させることにより得られる。ＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の一例として、ラット由来のものをそれぞれ配列番号１および２に、ヒト由来のものをそれぞれ配列番号３および４に示す。
本発明で用いるＦＮＫはいかなる動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質を改変したものでもよく、例えばヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質が挙げられる。図６にヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアラインメントを示す。また、ヒト、マウス、ラット、ブタおよびイヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５〜９に示す。図６において、いずれの動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列においても、第２２番目のアミノ酸はＴｙｒであり、第２６番目のアミノ酸はＧｌｎであり、１６５番目のアミノ酸はＡｒｇである。図６に示されている動物種以外の動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質においても、これら３箇所のアミノ酸は保存されていると考えられ、本発明のＦＮＫタンパク質は由来動物種を問わず、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列において、第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。また、本発明のＦＮＫタンパク質は、各種動物由来のＦＮＫタンパク質が有するアミノ酸配列において、第２２番目、第２６番目および１６５番目のアミノ酸以外のアミノ酸の１個または数個のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質、またはＦＮＫタンパク質が有するアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質も包含する。一般に、遺伝子には個体特異的な遺伝的多型が知られている。ヒトのＢｃｌ−ｘＬタンパク質においても、ＦＮＫタンパク質活性に影響を与えない部位にアミノ酸置換（遺伝的多型）がある場合があり、例えば、配列番号５に表すヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列において、第７０番目のＧｌｙがＡｌａに置換されているものが知られている。本発明のＦＮＫタンパク質は、このような個人によるアミノ酸置換であって、ＦＮＫタンパク質活性に大きな影響を与えないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をも包含する。
本発明のＦＮＫタンパク質は、本明細書に記載のＢｃｌ−ｘＬタンパク質もしくはＦＮＫタンパク質のアミノ酸配列またはｂｃｌ−ｘＬ遺伝子もしくはＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報を基に、得ることができる。例えば、特開２００１−１２０２８１号公報には、ラット由来のＦＮＫタンパク質について記載されており、該公報の記載に従って本発明のＦＮＫタンパク質を得ることができる。
本発明の脱毛防止剤は、ＦＮＫタンパク質を単独で含んでいてもよいが、毛母細胞内の細胞膜を通過し、毛母細胞内へ入って細胞内部で作用し易いように、ＦＮＫタンパク質のＮ末端側に細胞膜通過ドメイン（ＰＴＤ）を有していることが望ましい。ＰＴＤを連結していないＦＮＫタンパク質の場合は、タンパク質を細胞内に導入し得る化合物と混合して用いればよい。
細胞膜通過ドメインはアルギニン、リシンを含む塩基性アミノ酸を主に含む細胞膜通過ペプチドからなり、アミノ酸の光学異性体（Ｄ体、Ｌ体）に依存しない。細胞膜通過ペプチドとしては種々のものが知られており、本発明においてはいかなる細胞膜通過ペプチドを用いることができる。
細胞膜通過ペプチドとして、６個から１２個、好ましくは７個から１１個、さらに好ましくは９個または１０個のアルギニンのみまたはリシンのみからなるペプチド、５個から１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、ならびに前記アルギニンのみまたはリシンのみからなるペプチドまたはアルギニンおよびリシンからなるペプチドにおいて、数個、好ましくは１個から８個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド等が挙げられる。例としてアルギニン９個からなるペプチド（Ｒ９、配列番号１０および１１）、アルギニン７個およびリシン２個からなるペプチド（Ｋ２Ｒ７、配列番号１２および１３）、アルギニン７個およびグリシン６個からなるペプチド（Ｒ７Ｇ６、配列番号１４および１５）等が挙げられる。これらの細胞膜通過ペプチドを連結するとき、ＦＮＫタンパク質のアミノ酸配列の第１番目のメチオニンは残しておいてもよいし、除去してもよい。
また、細胞膜通過ペプチドとして、ＨＩＶ−１・ＴＡＴの細胞膜通過ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６および１７）やショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアの細胞膜通過ドメインＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１８）が挙げられる。その他、ＶＰ２２のＣ末端（２６７−３００）ペプチドＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＲＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号１９）、ＨＩＶ−１／Ｒｅｖ（３４−５０）ペプチドＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号２０）、ＦＨＶ／ｃｏａｔ（３５−４９）ペプチドＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号２１）、Ｋ−ＦＧＦのＮ末端（７−２２）の疎水性領域ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２２）等が挙げられる。
また、ＦＮＫタンパク質と細胞膜通過ペプチドの間にスペーサー配列を有していてもよい。スペーサー配列はアミノ酸数個からなりその配列には限定はないが、例えば、１個から５個、好ましくは１個から３個、さらに好ましくは１個のグリシンが挙げられる。
これらの細胞膜通過ペプチドは、それぞれの細胞膜通過ペプチドをコードするＤＮＡをＦＮＫをコードするＤＮＡと連結して融合ＤＮＡを作製し、この融合ＤＮＡを遺伝子工学の手法により大腸菌等の宿主細胞で発現させることによって、Ｎ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質を作製することができる。あるいはまた、２価の架橋剤（例えば、ＥＤＣやβ−アラニン等を介して、ＦＮＫタンパク質と細胞膜通過ペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質を作製することができる。
細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質として、ヒトＦＮＫタンパク質にＫ２Ｒ７ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２３に、アミノ酸配列を配列番号２４に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質にＲ７Ｇ６ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２５に、アミノ酸配列を配列番号２６に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質にＲ９ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２７に、アミノ酸配列を配列番号２８に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質に１個のＧｌｙをスペーサーとしてＴａｔの細胞膜通過ドメインを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す）およびラットＦＮＫタンパク質に１個のＧｌｙをスペーサーとしてＴａｔの細胞膜通過ドメインを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号３１に、アミノ酸配列を配列番号３２に示す）等が挙げられる。
本発明のＦＮＫタンパク質またはＦＮＫタンパク質に細胞膜通過ドメインを連結したタンパク質を含む脱毛防止剤は、毛母細胞の細胞死に起因する脱毛症を予防し、または脱毛の進行を防止することができる。このような脱毛症として抗癌剤投与による副作用である脱毛症、壮年性脱毛症、円形脱毛症が挙げられる。抗癌剤投与の副作用としての脱毛症の場合の抗癌剤には限定はないが、ＣＰＡ、ＩＦＯ、ＭＴＸ、ＡＤＲ、ＤＮＲ、ブレオマイシン（ＢＬＭ、ブレオ）、エピルビシン（ＥＰＩ、ファルモルビシン）、ビンクリスチン（ＶＣＲ、オンコビン）、ビンデシン（ＶＤＳ、フィルデシン）、エトポシド（ＶＰ−１６、ラステット、ベプシド）、ミトキサントロン（ＭＩＴ、ノバントロン）等の投与による脱毛症が挙げられる。
本発明の脱毛防止剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。投与方法に特に制限はなく、直接塗布、散布、注射ないし噴霧または、皮膚（表皮、真皮）、皮下組織等の他の部位を介しての浸透ないし拡散に基づく物理的接触等の、公知の手段を用いることが可能である。好ましくは脱毛が起こっている部位、または起こり得る部分に局所的に投与する。剤形としては、軟膏剤、注射剤、塗布剤、経皮吸収剤、局所徐放剤等が挙げられる。水溶液、乳剤、懸濁液、クリーム、ゲルなどの状態で調製され得る。なお、細胞膜通過ドメイン（タンパク質導入ペプチド）を用いることにより、目的のタンパク質を皮膚表面から真皮および表皮細胞へ導入させることが可能であることが示されている（Ｐａｒｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．，１３（２）：２０２−２０８（２００２）（２００２年４月３０日刊行）。すなわち、ＴＡＴペプチドまたは９残基のリシンからなるポリリシンをＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）に融合させ、マウスの皮膚上に噴霧することにより、ＴＡＴ−ＳＯＤおよび９Ｌｙｓ−ＳＯＤが皮膚の中の表皮および真皮に到達したことが、ＳＯＤ酵素活性の測定および免疫抗体法による測定により示されている。従って、本発明の細胞膜通過ペプチドが連結したＦＮＫも噴霧剤、塗布剤、軟膏剤等による皮膚への塗布、散布、噴霧等により、皮膚を通して毛母細胞に導入することが可能である。また、ＦＮＫは、そのタンパク質精製過程で７Ｍ Ｕｒｅａ、２％ＳＤＳ、１ｍＭ ＤＴＴで処理していながら脱毛防止活性は保持しているので（実施例参照）、一般的にタンパク質が変性すると予想されるような添加物、例えばイオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アルコール等を使用することができる。脱毛防止効果を減じない範囲で、必要に応じて、他の公知の成分、例えば、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ安定剤、抗酸化剤、防腐剤、着色剤、安定化財、溶解補助剤、粘度調整剤、香料等を加えてもよい。投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、脱毛の状態などによって適宜設定することができるが、一般的には１ｎｇ〜１ｍｇ／日の範囲で、好ましくは０．１〜１０μｇ／日の範囲で投与されることが望ましい。この１回投与量を１日１回あるいは数回に分けて投与する。
抗癌剤投与の副作用である脱毛を防止する場合、本発明の脱毛防止剤は抗癌剤投与の前後どのタイミングで投与してもよい。一例として、抗癌剤投与前、例えば、抗癌剤投与前数時間〜直後の投与が挙げられる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
細胞死抑制活性強化タンパク質であるＦＮＫは、がん原遺伝子であるｂｃｌ−２遺伝子（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２６（４６７８）：１０９７−１０９９，１９８４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１（２２）：７１６６−７１７０，１９８４；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３（１４）：５２１４−５２１８，１９８６；Ｃｅｌｌ４７（１）：１９−２８，１９８６）のホモログからなるｂｃｌ−２ファミリーに属するｂｃｌ−ｘＬ遺伝子（Ｃｅｌｌ ７４（４）：５９７−６０８，１９９３）を改変することにより得られる。
ＦＮＫは、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有する。好ましくは３つが置換されている。ＦＮＫをコードする遺伝子は、ｂｃｌ−ｘＬ遺伝子のコード領域において、第２２番目のＴｙｒをコードするトリプレットコドン（ｔａｃ）をＰｈｅをコードするコドン（ｔｔｔまたはｔｔｃ）に置換する塩基の置換、第２６番目のＧｌｎをコードするコドン（ｃａｇ）をＡｓｎをコードするコドン（ａａｔまたはａａｃ）に置換する塩基の置換および第１６５番目のＡｒｇをコードするコドン（ｃｇｇ）をＬｙｓをコードするコドン（ａａａまたはａａｇ）に置換する塩基の置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つの置換を有するように塩基配列を変異させることにより得られる。ＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびアミノ酸配列の一例として、ラット由来のものをそれぞれ配列番号１および２に、ヒト由来のものをそれぞれ配列番号３および４に示す。
本発明で用いるＦＮＫはいかなる動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質を改変したものでもよく、例えばヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質が挙げられる。図６にヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアラインメントを示す。また、ヒト、マウス、ラット、ブタおよびイヌ由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５〜９に示す。図６において、いずれの動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列においても、第２２番目のアミノ酸はＴｙｒであり、第２６番目のアミノ酸はＧｌｎであり、１６５番目のアミノ酸はＡｒｇである。図６に示されている動物種以外の動物種由来のＢｃｌ−ｘＬタンパク質においても、これら３箇所のアミノ酸は保存されていると考えられ、本発明のＦＮＫタンパク質は由来動物種を問わず、Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列において、第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換のうちのいずれか１つ、いずれか２つまたは３つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。また、本発明のＦＮＫタンパク質は、各種動物由来のＦＮＫタンパク質が有するアミノ酸配列において、第２２番目、第２６番目および１６５番目のアミノ酸以外のアミノ酸の１個または数個のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質、またはＦＮＫタンパク質が有するアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、ＦＮＫタンパク質活性を有するタンパク質も包含する。一般に、遺伝子には個体特異的な遺伝的多型が知られている。ヒトのＢｃｌ−ｘＬタンパク質においても、ＦＮＫタンパク質活性に影響を与えない部位にアミノ酸置換（遺伝的多型）がある場合があり、例えば、配列番号５に表すヒトＢｃｌ−ｘＬタンパク質のアミノ酸配列において、第７０番目のＧｌｙがＡｌａに置換されているものが知られている。本発明のＦＮＫタンパク質は、このような個人によるアミノ酸置換であって、ＦＮＫタンパク質活性に大きな影響を与えないアミノ酸置換を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をも包含する。
本発明のＦＮＫタンパク質は、本明細書に記載のＢｃｌ−ｘＬタンパク質もしくはＦＮＫタンパク質のアミノ酸配列またはｂｃｌ−ｘＬ遺伝子もしくはＦＮＫタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報を基に、得ることができる。例えば、特開２００１−１２０２８１号公報には、ラット由来のＦＮＫタンパク質について記載されており、該公報の記載に従って本発明のＦＮＫタンパク質を得ることができる。
本発明の脱毛防止剤は、ＦＮＫタンパク質を単独で含んでいてもよいが、毛母細胞内の細胞膜を通過し、毛母細胞内へ入って細胞内部で作用し易いように、ＦＮＫタンパク質のＮ末端側に細胞膜通過ドメイン（ＰＴＤ）を有していることが望ましい。ＰＴＤを連結していないＦＮＫタンパク質の場合は、タンパク質を細胞内に導入し得る化合物と混合して用いればよい。
細胞膜通過ドメインはアルギニン、リシンを含む塩基性アミノ酸を主に含む細胞膜通過ペプチドからなり、アミノ酸の光学異性体（Ｄ体、Ｌ体）に依存しない。細胞膜通過ペプチドとしては種々のものが知られており、本発明においてはいかなる細胞膜通過ペプチドを用いることができる。
細胞膜通過ペプチドとして、６個から１２個、好ましくは７個から１１個、さらに好ましくは９個または１０個のアルギニンのみまたはリシンのみからなるペプチド、５個から１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、ならびに前記アルギニンのみまたはリシンのみからなるペプチドまたはアルギニンおよびリシンからなるペプチドにおいて、数個、好ましくは１個から８個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド等が挙げられる。例としてアルギニン９個からなるペプチド（Ｒ９、配列番号１０および１１）、アルギニン７個およびリシン２個からなるペプチド（Ｋ２Ｒ７、配列番号１２および１３）、アルギニン７個およびグリシン６個からなるペプチド（Ｒ７Ｇ６、配列番号１４および１５）等が挙げられる。これらの細胞膜通過ペプチドを連結するとき、ＦＮＫタンパク質のアミノ酸配列の第１番目のメチオニンは残しておいてもよいし、除去してもよい。
また、細胞膜通過ペプチドとして、ＨＩＶ−１・ＴＡＴの細胞膜通過ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号１６および１７）やショウジョウバエのホメオボックスタンパク質アンテナペディアの細胞膜通過ドメインＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号１８）が挙げられる。その他、ＶＰ２２のＣ末端（２６７−３００）ペプチドＤＡＡＴＡＴＲＧＲＳＡＡＳＲＰＲＥＲＰＲＡＰＡＲＳＡＳＲＰＲＲＰＶＥ（配列番号１９）、ＨＩＶ−１／Ｒｅｖ（３４−５０）ペプチドＴＲＱＡＲＲＮＲＲＲＲＷＲＥＲＱＲ（配列番号２０）、ＦＨＶ／ｃｏａｔ（３５−４９）ペプチドＲＲＲＲＮＲＴＲＲＮＲＲＲＶＲ（配列番号２１）、Ｋ−ＦＧＦのＮ末端（７−２２）の疎水性領域ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号２２）等が挙げられる。
また、ＦＮＫタンパク質と細胞膜通過ペプチドの間にスペーサー配列を有していてもよい。スペーサー配列はアミノ酸数個からなりその配列には限定はないが、例えば、１個から５個、好ましくは１個から３個、さらに好ましくは１個のグリシンが挙げられる。
これらの細胞膜通過ペプチドは、それぞれの細胞膜通過ペプチドをコードするＤＮＡをＦＮＫをコードするＤＮＡと連結して融合ＤＮＡを作製し、この融合ＤＮＡを遺伝子工学の手法により大腸菌等の宿主細胞で発現させることによって、Ｎ末端側に細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質を作製することができる。あるいはまた、２価の架橋剤（例えば、ＥＤＣやβ−アラニン等を介して、ＦＮＫタンパク質と細胞膜通過ペプチドを結合させる方法によって細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質を作製することができる。
細胞膜通過ペプチドを連結したＦＮＫタンパク質として、ヒトＦＮＫタンパク質にＫ２Ｒ７ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２３に、アミノ酸配列を配列番号２４に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質にＲ７Ｇ６ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２５に、アミノ酸配列を配列番号２６に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質にＲ９ペプチドを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２７に、アミノ酸配列を配列番号２８に示す）、ヒトＦＮＫタンパク質に１個のＧｌｙをスペーサーとしてＴａｔの細胞膜通過ドメインを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号２９に、アミノ酸配列を配列番号３０に示す）およびラットＦＮＫタンパク質に１個のＧｌｙをスペーサーとしてＴａｔの細胞膜通過ドメインを連結させたもの（ＤＮＡ配列を配列番号３１に、アミノ酸配列を配列番号３２に示す）等が挙げられる。
本発明のＦＮＫタンパク質またはＦＮＫタンパク質に細胞膜通過ドメインを連結したタンパク質を含む脱毛防止剤は、毛母細胞の細胞死に起因する脱毛症を予防し、または脱毛の進行を防止することができる。このような脱毛症として抗癌剤投与による副作用である脱毛症、壮年性脱毛症、円形脱毛症が挙げられる。抗癌剤投与の副作用としての脱毛症の場合の抗癌剤には限定はないが、ＣＰＡ、ＩＦＯ、ＭＴＸ、ＡＤＲ、ＤＮＲ、ブレオマイシン（ＢＬＭ、ブレオ）、エピルビシン（ＥＰＩ、ファルモルビシン）、ビンクリスチン（ＶＣＲ、オンコビン）、ビンデシン（ＶＤＳ、フィルデシン）、エトポシド（ＶＰ−１６、ラステット、ベプシド）、ミトキサントロン（ＭＩＴ、ノバントロン）等の投与による脱毛症が挙げられる。
本発明の脱毛防止剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。投与方法に特に制限はなく、直接塗布、散布、注射ないし噴霧または、皮膚（表皮、真皮）、皮下組織等の他の部位を介しての浸透ないし拡散に基づく物理的接触等の、公知の手段を用いることが可能である。好ましくは脱毛が起こっている部位、または起こり得る部分に局所的に投与する。剤形としては、軟膏剤、注射剤、塗布剤、経皮吸収剤、局所徐放剤等が挙げられる。水溶液、乳剤、懸濁液、クリーム、ゲルなどの状態で調製され得る。なお、細胞膜通過ドメイン（タンパク質導入ペプチド）を用いることにより、目的のタンパク質を皮膚表面から真皮および表皮細胞へ導入させることが可能であることが示されている（Ｐａｒｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ．，１３（２）：２０２−２０８（２００２）（２００２年４月３０日刊行）。すなわち、ＴＡＴペプチドまたは９残基のリシンからなるポリリシンをＳＯＤ（スーパーオキシドジスムターゼ）に融合させ、マウスの皮膚上に噴霧することにより、ＴＡＴ−ＳＯＤおよび９Ｌｙｓ−ＳＯＤが皮膚の中の表皮および真皮に到達したことが、ＳＯＤ酵素活性の測定および免疫抗体法による測定により示されている。従って、本発明の細胞膜通過ペプチドが連結したＦＮＫも噴霧剤、塗布剤、軟膏剤等による皮膚への塗布、散布、噴霧等により、皮膚を通して毛母細胞に導入することが可能である。また、ＦＮＫは、そのタンパク質精製過程で７Ｍ Ｕｒｅａ、２％ＳＤＳ、１ｍＭ ＤＴＴで処理していながら脱毛防止活性は保持しているので（実施例参照）、一般的にタンパク質が変性すると予想されるような添加物、例えばイオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、アルコール等を使用することができる。脱毛防止効果を減じない範囲で、必要に応じて、他の公知の成分、例えば、希釈剤、等張化剤、担体、ｐＨ安定剤、抗酸化剤、防腐剤、着色剤、安定化財、溶解補助剤、粘度調整剤、香料等を加えてもよい。投与量は、投与方法、適用する患者の年齢、体重、脱毛の状態などによって適宜設定することができるが、一般的には１ｎｇ〜１ｍｇ／日の範囲で、好ましくは０．１〜１０μｇ／日の範囲で投与されることが望ましい。この１回投与量を１日１回あるいは数回に分けて投与する。
抗癌剤投与の副作用である脱毛を防止する場合、本発明の脱毛防止剤は抗癌剤投与の前後どのタイミングで投与してもよい。一例として、抗癌剤投与前、例えば、抗癌剤投与前数時間〜直後の投与が挙げられる。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
ＦＮＫによる脱毛の抑制
細胞死を誘導するための方法として抗癌剤であるエトポシドを用いた。多くの抗癌剤は、細胞分裂を行って増殖している細胞を攻撃する。このため、毛母細胞のような細胞増殖が盛んに起こっている細胞も攻撃され、脱毛症を引き起こす。
モデル動物としては幼少時のラットを使用した。ヒト毛母細胞が常に増殖するのに対し、ラットの場合、成体になると増殖がほとんど停止してしまうため抗癌剤の感受性が落ちてしまう。従って、モデル動物としてヒトと同様に毛母細胞が増殖中である幼少時のラット（１３日齢）を用いた。この実験系では、エトポシド投与後５日後から脱毛が始まり、投与後１週間で脱毛のピークに達する（図１）。この脱毛は、ヒトの場合と同様一時的なもので、４週間後には元の状態まで回復する（図２）。なお、幼少時のラットを抗癌剤による脱毛モデルとして使用する方法は、既に用いられている方法である（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，１３４−１３７．（２００１））。
本実施例には以下の材料を用いた。
実験動物
ラット（Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ哺乳１０日齢を日本エスエルシーより購入。）
抗癌剤
エトポシド（カタログ番号Ｅ−１３８３をシグマより購入。）２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解して保存溶液を作製した。使用時に生理食塩水にて約４０倍に希釈して腹腔内注射に用いた。
ＦＮＫ
ＦＮＫ（ラットまたはヒト由来の配列をもつもの）にＰＴＤ（細胞膜通過ドメイン）を結合した蛋白質を大腸菌で発現させ精製した。この発現及び精製に関しては、既に報告されている方法を用いて行った（Ａｓｏｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１７１０７−１７１１２．（２００２））。生理食塩水にて０〜１０００ｎＭに希釈して皮下注射に用いた。
対照投与群は、ＦＮＫの溶媒を生理食塩水で希釈したものを用いた。
本実施例は以下の方法で行った。
ラット哺乳１０日齢を購入し、親１匹とその子供（通常９〜１２匹）を一つのケージに入れ動物舎にて飼育し環境に慣らす。哺乳１３日齢にてＦＮＫ ０〜１０００ｎＭを１００μｌラット頸部背側に皮下注射にて投与する。その１時間後に、抗癌剤（エトポシド）を３ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔内注射にて投与する。哺乳２１日齢にてＦＮＫを皮下注射した部位の脱毛抑制を判定する。
以下の結果が得られた。
ＦＮＫ投与で、投与した部位のみに脱毛抑制効果があった（図３、表１）。図３中右の図はＦＮＫを投与した部位を示す図である。
１３日齢のラットに溶媒（対照）、または、ＰＴＤ−ＦＮＫ（ＴＡＴ−ｒＦＮＫ ３００ｎＭ、ＴＡＴ−ｈＦＮＫ ３００ｎＭ、Ｒ９−ｈＦＮＫ ３００ｎＭ、Ｋ２Ｒ７−ｈＦＮＫ ３００ｎＭ、または、Ｒ７Ｇ６−ｈＦＮＫ ３００ｎＭ）を１００μｌラット頸部背側に皮下注射にて投与する。その１時間後に、エトポシドを３ｍｇ／ｋｇ（ラットの体重１ｋｇあたり３ｍｇのエトポシド）となる量を腹腔内注射にて投与する。エトポシド投与８日後（２１日齢）にて脱毛抑制を判定した。対照投与群では、約８８％のラットが投与部位で脱毛状態であったが、ＴＡＴ−ｒＦＮＫ投与群では、脱毛はわずか１０％にまで抑制された。また、ＴＡＴ−ｒＦＮＫ投与群以外のすべてのＰＴＤ−ＦＮＫ投与群で１７〜２５％と顕著な脱毛抑制効果が得られた。対照投与したラットでは顔部と尾部以外の体全体に抗癌剤による脱毛がみられたが、ＦＮＫを頸部背側に投与したラットではＦＮＫを投与した部位に脱毛抑制がみられた。
ＦＮＫ濃度依存的に脱毛抑制効果が見られた（図４）。
対照投与したラットでは顔部と尾部以外の体全体の部分に抗癌剤による脱毛がみられたが、ＦＮＫを頸部背側に投与したラットではＦＮＫを投与した部位に脱毛抑制がみられた。ＦＮＫ濃度が３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭと増加するに従ってその効果も増加し、３００ｎＭと１０００ｎＭでほとんど差がないことから、３００ｎＭで十分な効果が得られていることがわかった。
また、この効果がＦＮＫの濃度に依存することからも脱毛抑制効果はＦＮＫの活性であることが裏付けられた。
ＦＮＫの脱毛抑制効果は、改変元タンパク質の生物種やＰＴＤの配列に依存しない（図５）。
対照投与したラットでは顔部と尾部以外の体全体の部分に抗癌剤による脱毛がみられたが、ＦＮＫを頸部背側に投与したラットではＦＮＫを投与した部位に脱毛抑制がみられた。ＦＮＫは、改変元タンパク質がヒト由来のタンパク質（ｈＦＮＫ）、ラット由来のタンパク質（ｒＦＮＫ）いずれも脱毛抑制がみられた。また、ＰＴＤは、ＴＡＴ、Ｒ９いずれを用いた場合でも脱毛抑制がみられた。
細胞死を誘導するための方法として抗癌剤であるエトポシドを用いた。多くの抗癌剤は、細胞分裂を行って増殖している細胞を攻撃する。このため、毛母細胞のような細胞増殖が盛んに起こっている細胞も攻撃され、脱毛症を引き起こす。
モデル動物としては幼少時のラットを使用した。ヒト毛母細胞が常に増殖するのに対し、ラットの場合、成体になると増殖がほとんど停止してしまうため抗癌剤の感受性が落ちてしまう。従って、モデル動物としてヒトと同様に毛母細胞が増殖中である幼少時のラット（１３日齢）を用いた。この実験系では、エトポシド投与後５日後から脱毛が始まり、投与後１週間で脱毛のピークに達する（図１）。この脱毛は、ヒトの場合と同様一時的なもので、４週間後には元の状態まで回復する（図２）。なお、幼少時のラットを抗癌剤による脱毛モデルとして使用する方法は、既に用いられている方法である（Ｄａｖｉｓ，Ｓ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１，１３４−１３７．（２００１））。
本実施例には以下の材料を用いた。
実験動物
ラット（Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴ哺乳１０日齢を日本エスエルシーより購入。）
抗癌剤
エトポシド（カタログ番号Ｅ−１３８３をシグマより購入。）２０ｍｇ／ｍｌとなるようにＤＭＳＯに溶解して保存溶液を作製した。使用時に生理食塩水にて約４０倍に希釈して腹腔内注射に用いた。
ＦＮＫ
ＦＮＫ（ラットまたはヒト由来の配列をもつもの）にＰＴＤ（細胞膜通過ドメイン）を結合した蛋白質を大腸菌で発現させ精製した。この発現及び精製に関しては、既に報告されている方法を用いて行った（Ａｓｏｈ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９，１７１０７−１７１１２．（２００２））。生理食塩水にて０〜１０００ｎＭに希釈して皮下注射に用いた。
対照投与群は、ＦＮＫの溶媒を生理食塩水で希釈したものを用いた。
本実施例は以下の方法で行った。
ラット哺乳１０日齢を購入し、親１匹とその子供（通常９〜１２匹）を一つのケージに入れ動物舎にて飼育し環境に慣らす。哺乳１３日齢にてＦＮＫ ０〜１０００ｎＭを１００μｌラット頸部背側に皮下注射にて投与する。その１時間後に、抗癌剤（エトポシド）を３ｍｇ／ｋｇとなるように腹腔内注射にて投与する。哺乳２１日齢にてＦＮＫを皮下注射した部位の脱毛抑制を判定する。
以下の結果が得られた。
ＦＮＫ投与で、投与した部位のみに脱毛抑制効果があった（図３、表１）。図３中右の図はＦＮＫを投与した部位を示す図である。
ＦＮＫ濃度依存的に脱毛抑制効果が見られた（図４）。
対照投与したラットでは顔部と尾部以外の体全体の部分に抗癌剤による脱毛がみられたが、ＦＮＫを頸部背側に投与したラットではＦＮＫを投与した部位に脱毛抑制がみられた。ＦＮＫ濃度が３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭと増加するに従ってその効果も増加し、３００ｎＭと１０００ｎＭでほとんど差がないことから、３００ｎＭで十分な効果が得られていることがわかった。
また、この効果がＦＮＫの濃度に依存することからも脱毛抑制効果はＦＮＫの活性であることが裏付けられた。
ＦＮＫの脱毛抑制効果は、改変元タンパク質の生物種やＰＴＤの配列に依存しない（図５）。
対照投与したラットでは顔部と尾部以外の体全体の部分に抗癌剤による脱毛がみられたが、ＦＮＫを頸部背側に投与したラットではＦＮＫを投与した部位に脱毛抑制がみられた。ＦＮＫは、改変元タンパク質がヒト由来のタンパク質（ｈＦＮＫ）、ラット由来のタンパク質（ｒＦＮＫ）いずれも脱毛抑制がみられた。また、ＰＴＤは、ＴＡＴ、Ｒ９いずれを用いた場合でも脱毛抑制がみられた。
ＦＮＫによる毛母細胞の細胞死抑制
１３日齢のラットにＴＡＴ−ｒＦＮＫ ３００ｎＭ、または、対照（生理食塩水）を１００ｍｌラット頸部背側に皮下注射にて投与した。その１時間後に、エトポシド３ｍｇ／ｋｇ、または、対照（生理食塩水）を腹腔内注射にて投与した。エトポシド投与２日、３日、４日、および８日後に投与部位の皮膚組織を固定し薄切した後、ヘマトキシリン・エオシンにて染色した。結果を図７に示す。図７に示すように、ＦＮＫを投与したラットでは毛母細胞の細胞死抑制効果がみられた。
１３日齢のラットにＴＡＴ−ｒＦＮＫ ３００ｎＭ、または、対照（生理食塩水）を１００ｍｌラット頸部背側に皮下注射にて投与した。その１時間後に、エトポシド３ｍｇ／ｋｇ、または、対照（生理食塩水）を腹腔内注射にて投与した。エトポシド投与２日、３日、４日、および８日後に投与部位の皮膚組織を固定し薄切した後、ヘマトキシリン・エオシンにて染色した。結果を図７に示す。図７に示すように、ＦＮＫを投与したラットでは毛母細胞の細胞死抑制効果がみられた。
ＦＮＫ投与のタイミングと脱毛抑制効果
１３日齢のラットにエトポシド３ｍｇ／ｋｇを投与し、エトポシドの投与３時間前、１時間前、直後、２４時間後、４８時間後および７２時間後にＴＡＴ−ｒＦＮＫ ３００ｎＭをラット頸部背側に皮下注射にて投与して、脱毛抑制効果を調べた。
表２に示すように、ＦＮＫ投与１回のみ（実験群７）、１日１回、２日間（実験群４、８）、１日１回、３日間（実験群３、９）、１日１回、４日間（実験群１、２）は、いずれも脱毛防止効果がみられた。しかし、これらの実験群の間で脱毛防止効果の程度に差はみられなかった。
表２の結果より、抗癌剤が細胞に作用する時点でＦＮＫが働くように投与することにより脱毛効果が得られることが示唆された。
１３日齢のラットにエトポシド３ｍｇ／ｋｇを投与し、エトポシドの投与３時間前、１時間前、直後、２４時間後、４８時間後および７２時間後にＴＡＴ−ｒＦＮＫ ３００ｎＭをラット頸部背側に皮下注射にて投与して、脱毛抑制効果を調べた。
表２に示すように、ＦＮＫ投与１回のみ（実験群７）、１日１回、２日間（実験群４、８）、１日１回、３日間（実験群３、９）、１日１回、４日間（実験群１、２）は、いずれも脱毛防止効果がみられた。しかし、これらの実験群の間で脱毛防止効果の程度に差はみられなかった。
表２の結果より、抗癌剤が細胞に作用する時点でＦＮＫが働くように投与することにより脱毛効果が得られることが示唆された。
配列番号１０から３２、合成
実施例に記載のように、本発明のＦＮＫタンパク質は、細胞死に起因する脱毛を抑制することができる。特に、細胞膜通過ドメイン（ＰＴＤ）を連結したＦＮＫタンパク質を皮下に投与するか、あるいは皮膚上に投与することにより、ＰＴＤを連結したＦＮＫタンパク質は、毛母細胞中に入り、毛母細胞の細胞死を抑制することにより脱毛を抑制することができる。本発明において、ＦＮＫタンパク質が毛母細胞に直接導入され、毛母細胞の細胞死を抑制し、その結果脱毛防止に効果があることがはじめて示された。本発明のＦＮＫタンパク質またはＦＮＫタンパク質に細胞膜通過ドメインを連結したタンパク質は細胞死に起因する脱毛の防止剤として有用である。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
Claims (8)
- Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の第２２番目のＴｙｒのＰｈｅへの置換、第２６番目のＧｌｎのＡｓｎへの置換および１６５番目のＡｒｇのＬｙｓへの置換を有するＦＮＫタンパク質を有効成分として含む脱毛防止剤。
- Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質がヒト由来（配列番号５）、マウス由来（配列番号６）、ラット由来（配列番号７）、ブタ由来（配列番号８）およびイヌ由来（配列番号９）Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質から選択される請求項１記載の脱毛防止剤。
- ＦＮＫタンパク質のＮ末端側に細胞膜通過ペプチドが連結している、請求項１または２に記載の脱毛防止剤。
- 細胞膜通過ペプチドが、以下のペプチド（ｉ）〜（ｘｉｉｉ）のいずれかから選択される請求項３記載の脱毛防止剤。
（ｉ）６〜１２個のアルギニンからなるペプチド、
（ｉｉ）６〜１２個のリシンからなるペプチド、
（ｉｉｉ）６〜１５個のアルギニンおよびリシンからなるペプチド、
（ｉｖ）（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのペプチドにおいて、数個のアミノ酸がグリシンに置換されたペプチド、
（ｖ）配列番号１１で表される（ｉ）のペプチド、
（ｖｉ）配列番号１３で表される（ｉｉｉ）のペプチド、
（ｖｉｉ）配列番号１５で表される（ｉｖ）のペプチド、
（ｖｉｉｉ）配列番号１７で表されるペプチド、
（ｉｘ）配列番号１８で表されるペプチド、
（ｘ）配列番号１９で表されるペプチド、
（ｘｉ）配列番号２０で表されるペプチド、
（ｘｉｉ）配列番号２１で表されるペプチド、ならびに
（ｘｉｉｉ）配列番号２２で表されるペプチド - 毛母細胞の細胞死に起因する脱毛を防止する請求項１〜４のいずれか１項に記載の脱毛防止剤。
- 抗癌剤投与に起因する脱毛を防止する請求項５記載の脱毛防止剤。
- 皮下投与剤である請求項１〜６のいずれか１項に記載の脱毛防止剤。
- 皮膚への塗布、散布または噴霧剤である請求項１〜６のいずれか１項に記載の脱毛防止剤。
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