JP2019064972A - 抗ウイルス性ペプチドおよびその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
さらに本発明者は、かかる知見を他のウイルス種にも展開して研究を続け、RNAウイルスであるオルソミクソウイルス科(Orthomyxoviridae)に属するA型インフルエンザウイルス(Influenza A Virus)またはB型インフルエンザウイルス(Influenza B Virus)のHA遺伝子にコードされるヘマグルチニン(Hemagglutinin)のシグナル配列とCPP配列とを組み合わせた合成ペプチドについても、同様に抗ウイルス活性を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
該ペプチドは、以下の(1)および(2)に示すアミノ酸配列:
(1)水胞性口炎ウイルス(VSV)のG遺伝子にコードされる糖タンパク質(VSV−G糖タンパク質)のシグナル配列、または、A型若しくはB型インフルエンザウイルス(Influenza Virus)のHA遺伝子にコードされるヘマグルチニン(hemagglutinin)のシグナル配列、または、上記いずれかのシグナル配列について1個、2個又は3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列;
(2)細胞膜透過性ペプチド(CPP)として機能するアミノ酸配列;
をともに備えることを特徴とする。
或いは、上記(1)に示すアミノ酸配列と(2)に示すアミノ酸配列とを合わせたアミ
ノ酸残基数が、抗ウイルス性ペプチド全体のアミノ酸残基数の80%以上(より好ましくは90%以上、例えば100%)を占めるような合成ペプチドは、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドのうちの特に好適な一態様である。
また、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドの好適な他の一態様では、上記(2)のCPPとして機能するアミノ酸配列が、ポリアルギニン(特に限定しないが、典型的には、5個以上9個以下のアルギニン残基から構成される)、または、配列番号8〜25のいずれかに示すアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について1個、2個又は3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列であることを特徴とする。
かかる組成物は、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを含むことにより、抗ウイルス剤としての利用、或いは新たな抗ウイルス剤の開発のための研究材料として利用することができる。
かかる構成の方法では、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを対象物に供給することによって、少なくとも1種のウイルス(例えばVSV)の増殖を阻止若しくは抑制することができる。
本明細書中で引用されている全ての文献の全ての内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
また、本明細書において「アミノ酸残基」とは、特に言及する場合を除いて、ペプチド鎖のN末端アミノ酸及びC末端アミノ酸を包含する用語である。
なお、本明細書中に記載されるアミノ酸配列は、常に左側がN末端側であり右側がC末端側である。
従って、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドの具体例には、後述する各配列番号のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列で構成される合成ペプチドに加え、各配列番号のアミノ酸配列において1個、2個又は3個のアミノ酸残基が置換(典型的には同類置換)、欠失又は付加された改変アミノ酸配列であって当該配列番号のアミノ酸配列と同様に抗ウイルス活性を示す改変アミノ酸配列からなる合成ペプチドが包含される。
(1)VSV−G糖タンパク質のシグナル配列、または、A型若しくはB型インフルエンザウイルスのHA遺伝子にコードされるヘマグルチニンのシグナル配列、または、上記いずれかのシグナル配列について1個、2個又は3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列;
(2)CPPとして機能するアミノ酸配列;
をともに備えることで特徴付けられるペプチドである。
VSV−G糖タンパク質は、膜貫通型のI型糖タンパク質であり、現在では「レトロウイルスベクター」におけるエンベロープを構成する糖タンパク質として利用されている。しかしながら、VSV−G糖タンパク質のシグナルペプチド領域が、抗ウイルス活性を有することは見出されておらず、かかるシグナルペプチド領域のアミノ酸配列を合成し、該配列にCPPを付加することにより、人為的に合成された抗ウイルス性ペプチドが得られることは、本願出願当時、全く想定されていないことであった。
配列番号1は、単離された1種のVSV(Vesicular stomatitis New Jersey virus)のVSV−G糖タンパク質に含まれる計16アミノ酸残基からなるシグナル配列である(UniProtKB - P04882)。
配列番号2は、単離された1種のA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに含まれる計16アミノ酸残基からなるシグナル配列である(UniProtKB - P03437)。
配列番号3は、単離された1種のB型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに含まれる計15アミノ酸残基からなるシグナル配列である(UniProtKB - P03460)。
配列番号4は、単離された1種のVSV(Vesicular stomatitis Indiana virus)のVSV−G糖タンパク質に含まれる計16アミノ酸残基からなるシグナル配列である(UniProtKB - P04884)。
配列番号5は、単離された1種のA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに含まれる計16アミノ酸残基からなるシグナル配列である(UniProtKB - P03440)。
配列番号6は、単離された1種のA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに含まれる計16アミノ酸残基からなるシグナル配列である(UniProtKB - P03435)。
配列番号7は、単離された1種のA型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに含まれる計16アミノ酸残基からなるシグナル配列である(UniProtKB - P03439)。
配列番号8のアミノ酸配列は、FGF2(塩基性線維芽細胞増殖因子)由来の合計14アミノ酸残基から成るNoLS(核小体局在シグナル:Nucleolar localization signal)に対応する。
配列番号9のアミノ酸配列は、核小体タンパク質の1種(ApLLP)由来の合計19アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号10のアミノ酸配列は、HSV−1(単純ヘルペスウイルス タイプ1)のタンパク質(γ(1)34.5)由来の合計16アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号11のアミノ酸配列は、HIC(human I-mfa domain-containing protein)のp40タンパク質由来の合計19アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号12のアミノ酸配列は、MDV(Marek病ウイルス)のMEQタンパク質由来の合計16アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号13のアミノ酸配列は、アポトーシスを抑制するタンパク質であるSurvivin- deltaEx3由来の合計17アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号14のアミノ酸配列は、血管増殖因子であるAngiogenin由来の合計7アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号15のアミノ酸配列は、核リンタンパク質であってp53腫瘍抑制タンパク質と複合体を形成するMDM2由来の合計8アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号16のアミノ酸配列は、ベータノダウイルスのタンパク質であるGGNNVα由来の合計9アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号17のアミノ酸配列は、NF−κB誘導性キナーゼ(NIK)由来の合計7アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号18のアミノ酸配列は、Nuclear VCP-like protein由来の合計15アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号19のアミノ酸配列は、核小体タンパク質であるp120由来の合計18アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号20のアミノ酸配列は、HVS(ヘルペスウイルスsaimiri)のORF57タンパク質由来の合計14アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号21のアミノ酸配列は、細胞内情報伝達に関与するプロテインキナーゼの1種であるヒト内皮細胞に存在するLIMキナーゼ2(LIM Kinase 2)の第491番目のアミノ酸残基から第503番目のアミノ酸残基までの合計13アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号22のアミノ酸配列は、IBV(トリ伝染性気管支炎ウイルス:avian infectious bronchitis virus)のNタンパク質(nucleocapsid protein)に含まれる合計8アミノ酸残基から成るNoLSに対応する。
配列番号23のアミノ酸配列は、HIV(ヒト免疫不全ウイルス:Human Immunodeficiency Virus)のTATに含まれるタンパク質導入ドメイン由来の合計9アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号24のアミノ酸配列は、上記TATを改変したタンパク質導入ドメイン(PTD4)の合計11アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
配列番号25のアミノ酸配列は、ショウジョウバエ(Drosophila)の変異体であるAntennapediaのANT由来の合計18アミノ酸配列から成る膜透過性モチーフに対応する。
これらのうち、特にNoLSやTATに関連するアミノ酸配列(又はその改変アミノ酸配列)が好ましい。例えば、配列番号21や配列番号22に示すようなNoLS関連のCPP配列、或いは配列番号23〜25のTATやANT関連のCPP配列は、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを構築するために好適に用いることができる。
(1)抗ウイルス性シグナル配列と(2)CPP配列とが、実質的に隣接して配置されていることが好ましい。具体的には、(1)抗ウイルス性シグナル配列と(2)CPP配列との間に、両配列部分に包含されないアミノ酸残基が存在しない、或いは、存在していても該アミノ酸残基数は10個以下(より好ましくは5個以下、例えば1個か2個のアミノ酸残基)程度が好ましい。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、ペプチド鎖を構成する全アミノ酸残基数が100以下が適当であり、80以下が好ましく、70以下(例えば30前後から50前後程度のペプチド鎖)が好ましい。このような鎖長の短いペプチドは、化学合成が容易であり、容易に抗ウイルス性ペプチドを提供することができる。特に限定されるものではないが、免疫原(抗原)になり難いという観点から直鎖状又はへリックス状のものが好ましい。このような形状のペプチドはエピトープを構成し難い。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた固相合成法により、所望するアミノ酸配列、修飾(C末端アミド化等)部分を有するペプチド鎖を合成することができる。
一般的な技法によって、この組換えベクターを所定の宿主細胞(例えばイースト、昆虫細胞、植物細胞)に導入し、所定の条件で当該宿主細胞又は該細胞を含む組織や個体を培養する。このことにより、目的とするペプチドを細胞内で発現、生産させることができる。そして、宿主細胞(分泌された場合は培地中)からペプチドを単離し、必要に応じてリフォールディング、精製等を行うことによって、目的の抗ウイルス性ペプチドを得ることができる。
なお、組換えベクターの構築方法及び構築した組換えベクターの宿主細胞への導入方法等は、当該分野で従来から行われている方法をそのまま採用すればよく、かかる方法自体は特に本発明を特徴付けるものではないため、詳細な説明は省略する。
こうして得られるポリヌクレオチドは、上述のように、種々の宿主細胞中で又は無細胞タンパク質合成システムにて、抗ウイルス性ペプチド生産のための組換え遺伝子(発現カセット)を構築するための材料として使用することができる。
なお、抗ウイルス性組成物(抗ウイルス剤)に含有される抗ウイルス性ペプチドは、抗ウイルス活性を損なわない限りにおいて、塩の形態であってもよい。例えば、常法に従って通常使用されている無機酸又は有機酸を付加反応させることにより得られ得る該ペプチドの酸付加塩を使用することができる。或いは、抗ウイルス活性を有する限り、他の塩(例えば金属塩)であってもよい。従って、本明細書及び特許請求の範囲に記載の「ペプチド」は、かかる塩形態のものを包含する。
ここで開示される抗ウイルス性組成物の用途や形態に応じて適宜異なり得るが、典型的には、水、生理学的緩衝液、種々の有機溶媒が挙げられる。適当な濃度のアルコール(エタノール等)水溶液、グリセロール、オリーブ油のような不乾性油であり得る。或いはリポソームであってもよい。また、抗ウイルス性組成物に含有させ得る副次的成分としては、種々の充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、表面活性剤、色素、香料等が挙げられる。
抗ウイルス性組成物(抗ウイルス性剤)の典型的な形態として、液剤、懸濁剤、乳剤、エアロゾル、泡沫剤、顆粒剤、粉末剤、錠剤、カプセル、軟膏、水性ジェル剤等が挙げられる。また、注射等に用いるため、使用直前に生理食塩水又は適当な緩衝液(例えばPBS)等に溶解して薬液を調製するための凍結乾燥物、造粒物とすることもできる。
なお、抗ウイルス性ペプチド(主成分)及び種々の担体(副成分)を材料にして種々の形態の組成物(薬剤)を調製するプロセス自体は従来公知の方法に準じればよく、かかる製法自体は本発明を特徴付けるものでもないため詳細な説明は省略する。処方に関する詳細な情報源として、例えばComprehensive Medicinal Chemistry, Corwin Hansch監修,Pergamon Press刊(1990)が挙げられる。この書籍の全内容は本明細書中に参照として援用されている。
ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、比較的高い濃度のカチオン、塩類(例えば塩化ナトリウム)或いは血清のような有機物が存在する系においても抗ウイルス活性を維持し得る。従って、ここで開示される抗ウイルス性組成物は、カチオン、塩類や血清等が存在する系(場)での使用に好適である。例えば、本発明によって提供される抗ウイルス性組成物は、液剤として、静脈内、筋肉内、皮下、皮内若しくは腹腔内への注射或いは灌腸によって患者に投与することができる。
或いは、錠剤等の固体形態のものは経口投与することができる。また、衛生陶器表面の洗浄目的に使用する場合は、比較的多量(例えば1〜100mg/mL)の抗ウイルス性ペプチドを含有する液剤を対象物の表面に直接スプレーするか、或いは、当該液剤で濡れた布や紙で対象物の表面を拭くとよい。これらは例示にすぎず、従来のペプチド系抗生物質やペプチドを構成成分とする農薬、医薬部外品等と同じ形態、使用方法を適用することができる。
再生医療の分野において、皮膚、骨、各種の臓器の培養時のウイルス感染を防止することは重要である。ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、哺乳動物細胞及び組織に対する毒性が極めて低く、少なくとも1種のウイルスに対して選択的に抗ウイルス作用を示し得る。このため、培養臓器等のウイルス感染を防止する薬剤として極めて有用である。例えば、後述する実施例に示すように、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドを適当な濃度で培養液中に含有することによって、培養中の臓器、組織、細胞等へのウイルス感染を防止する、或いは宿主中でのウイルス増殖を抑制することができる。
表1に示す計3種のペプチドを市販のペプチド合成機を用いて製造した。具体的には次のとおりである。
サンプル1は、(1)抗ウイルス性シグナル配列として配列番号1に示すアミノ酸配列(VSV−G糖タンパク質のシグナル配列)を使用し、そのC末端側に(2)CPP配列として配列番号21のアミノ酸配列(LIMキナーゼ2のNoLS)を含む合成ペプチドである。
サンプル2は、(1)抗ウイルス性シグナル配列として配列番号2に示すアミノ酸配列(A型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのシグナル配列)を使用し、そのC末端側に(2)CPP配列として配列番号21のアミノ酸配列(LIMキナーゼ2のNoLS)を含む合成ペプチドである。
サンプル3は、(1)抗ウイルス性シグナル配列として配列番号3に示すアミノ酸配列(B型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのシグナル配列)を使用し、そのC末端側に(2)CPP配列として配列番号21のアミノ酸配列(LIMキナーゼ2のNoLS)を含む合成ペプチドである。
合成した各サンプルのペプチドは、DMSO(ジメチルスルホキシド)に溶かし、各サンプルペプチドのストック液(濃度2.5mM)を調製した。
次いで、0.3%のウシ血清アルブミン(BSA)、100U/mLのペニシリン、0.1mg/mLのストレプトマイシンを含むイーグル最小必須培地(MEM)に対して上記いずれかのサンプルペプチドのストック液を適量供給し、10μMまたは50μMの濃度で上記いずれかの合成ペプチドを含む供試ペプチド含有MEMを調製した。また、コントロールとして何れのサンプルペプチドも含まないコントロールMEMも用意した。
各サンプルの合成ペプチドについて、抗ウイルス活性(ウイルス増殖抑制効果)を調べた。本試験例では、対象ウイルスとしてIndiana型VSV(Vesicular stomatitis Indiana virus)を使用し、TCID50法に基づいて力価(感染価)を測定した。具体的には以下のとおりである。
先ず、予め入手しておいた上記供試ウイルス(Indiana型VSV)を適宜希釈し、感染価が103TCID50/mLであるウイルス液を調製した。
予め市販の6ウェルプレートにてMDCK細胞(イヌ腎臓上皮細胞)を培養しておき、各培養ウェル内に上記感染価のウイルス液1mLを接種した。接種後1時間ほど37℃にてインキュベートし、その後、各ウェルから接種したウイルス液を除去し、PBSで各ウェルを1回洗浄した。
次いで、各ウェルに、上記調製したいずれかの供試ペプチド含有MEM、若しくはコントロールMEMを、ウェルあたり2mL供給し、35℃で培養した。
この結果より、ここで開示される抗ウイルス性ペプチドは、少なくとも1種の標的とするウイルスに対して抗ウイルス活性を発揮し得ることが確かめられた。なお、いずれのサンプルペプチドについても細胞毒性は認められなかった。
例えば、本実施例では、(1)抗ウイルス性シグナル配列として配列番号1〜3に示すものを採用しているが、他の既知の(1)抗ウイルス性シグナル配列(例えば配列番号4〜7に示すもの)或いはそれらの改変配列を採用してもよい。また、本実施例では、(2)CPP配列として配列番号21に示すものを採用しているが、他の既知の(2)CPP配列(例えば配列番号8〜20,22〜25に示すもの)を採用してもよい。
Claims (7)
- 少なくとも1種のウイルスの増殖を抑制する合成ペプチドであって、
以下の(1)および(2)に示すアミノ酸配列:
(1)水胞性口炎ウイルスのG遺伝子にコードされる糖タンパク質のシグナル配列、または、A型若しくはB型インフルエンザウイルスのHA遺伝子にコードされるヘマグルチニンのシグナル配列、または、上記いずれかのシグナル配列について1個、2個又は3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列; および
(2)細胞膜透過性ペプチド(CPP)として機能するアミノ酸配列;
をともに備えることを特徴とする、合成ペプチド。 - 総アミノ酸残基数が100以下である、請求項1に記載の合成ペプチド。
- 前記(1)に示すアミノ酸配列が、配列番号1〜7のいずれかに示すアミノ酸配列である、請求項1または2に記載の合成ペプチド。
- 前記(2)に示すアミノ酸配列が、配列番号8〜25のいずれかに示すアミノ酸配列、または、該アミノ酸配列について1個、2個又は3個のアミノ酸残基が同類置換されて形成された改変アミノ酸配列である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の合成ペプチド。
- 配列番号26〜28のいずれかに示すアミノ酸配列を有する、請求項1に記載の合成ペプチド。
- 少なくとも1種のウイルスの増殖を抑制する抗ウイルス性組成物であって、
請求項1〜5のいずれか一項に記載の合成ペプチドと、
薬学上許容され得る少なくとも1種の担体と、
を備える、組成物。 - 少なくとも1種のウイルスの増殖を抑制する方法であって、
インビトロにおいて対象物に対して請求項1〜5のいずれか一項に記載の合成ペプチドを少なくとも1回供給することを包含する、ウイルス増殖抑制方法。
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