CN109689086A - 具有延长的血清半衰期的融合蛋白 - Google Patents

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D·本梅纳姆
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Abstract

提供了衍生自NKp44蛋白的肽、嵌合肽、编码其的核苷酸和包含其的药物组合物。进一步，提供了延长目的蛋白的生物学半衰期的方法。

Description

具有延长的血清半衰期的融合蛋白
相关申请的交叉参考
本申请要求2016年7月11日提交的美国临时专利申请号62/360524和2016年11月14日提交的美国临时专利申请号62/421400的权益，其内容以引用方式被完全并入本文。
技术领域
本发明尤其针对具有延长的体内稳定性的融合蛋白。更具体地，本发明涉及通过与衍生自NKp44的肽融合而获得蛋白质延长的稳定性。
发明背景
肽易于在血液，肝脏或肾脏中变性或酶促降解。因此，肽一般具有数小时的短循环半衰期。肽药物的低稳定性决定了持续频率的递送，以维持活性肽的有效血浆浓度。
不利的药代动力学，比如短的血清半衰期，可以阻止许多其他有希望的候选药物的药物开发。血清半衰期是分子的经验特征，必须通过实验确定每种新的潜在药物的血清半衰期。因此，期望得到使治疗性肽的半衰期持久，同时保持其高药效的技术。
NKp44是在自然杀伤细胞的胞质膜上表达的自然细胞毒性受体。先前公开了衍生自NKp44的特定肽，比如美国专利申请号2007/0203054，其涉及衍生自NKp44受体的高糖基化肽，其能够特异性靶向病毒感染的细胞。进一步，美国专利申请号2004/0072256公开了靶向复合物，其能够将活性物质靶向靶细胞，NKp44或其功能片段；和包含活性物质比如细胞毒性部分；成像部分；或Ig片段的活性片段。美国专利申请号2010/0047169公开了自然杀伤细胞毒性受体NKp30，NKp46和NKp44或其活性片段的结合物和融合蛋白，以及选自在体内有效靶向肿瘤细胞的细胞毒性药物或Ig片段的活性剂。
发明内容
除非另外定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于实践或测试本发明的实施方式，但下文描述了示例性方法和/或材料。如有冲突，将以专利说明书，包括定义为准。另外，材料，方法和实施例仅是说明性的，并非旨在必要的限制。
根据一个方面，本发明提供了嵌合体，其包含附接于(attached to)肽的生长激素，该肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，生长激素包含SEQ IDNO：16中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，肽附接于选自由该生长激素的氨基端、该生长激素的羧基端、以及该生长激素的第一和第二亚基之间组成的组中的至少一个位置。在一些实施方式中，嵌合体包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：71组成的组。
根据另一方面，本发明提供了肽，其包含20至50个氨基酸残基或由其组成，该氨基酸残基衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199。在一些实施方式中，肽包含SEQ ID NO：3或4中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供了嵌合体，其包含衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的20至50个氨基酸残基的肽，该肽附接于目的蛋白(a protein of interest)。
在一些实施方式中，目的蛋白具有生物学活性。在一些实施方式中，目的蛋白是细胞因子。在一些实施方式中，目的蛋白是激素。在一些实施方式中，目的蛋白选自由绒毛膜促性腺激素(CG)和生长激素(GH)组成的组。
在一些实施方式中，肽附接于目的蛋白的氨基端。在一些实施方式中，肽附接于目的蛋白的羧基端。在一些实施方式中，肽附接于选自由目的蛋白的氨基端、目的蛋白的羧基端、以及目的蛋白的第一和第二部分之间组成的组中的至少一个位置。
在一些实施方式中，嵌合体包含两种或更多种衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的肽。在一个实施方式中，衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的第一个肽附接于该目的蛋白的氨基端，并且衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的第二个肽附接于目的蛋白的羧基端。
在一些实施方式中，本发明提供药物组合物，其包含本发明的肽或嵌合体，和药学上可接受的载剂(carrier)。在一些实施方式中，提供了本发明的药物组合物，其用于治疗有此需要的受试者的病况(condition)、疾病(disease)或病症(disorder)。在一些实施方式中，提供了本发明的药物组合物，其用于治疗或减轻在有此需要的受试者中可通过目的蛋白治疗的病况。
在一些实施方式中，本发明提供了包含编码本发明的任何肽或本发明的任何嵌合体的核酸序列的多核苷酸。
在一些实施方式中，本发明提供了包含多核苷酸的载体(vector)，该多核苷酸包含编码本发明的任何肽或本发明的任何嵌合体的核酸序列。
根据另一方面，提供了延长目的蛋白的生物半衰期的方法，该方法包括将至少一种包含20至70个氨基酸残基的肽附接于目的蛋白从而延长目的蛋白的生物半衰期的步骤，该氨基酸残基衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199。
在一些实施方式中，肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2，SEQID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组。
在一些实施方式中，目的蛋白选自由CG和GH组成的组。在一些实施方式中，目的蛋白是细胞因子，例如白细胞介素-2。
在一些实施方式中，延长目的蛋白的生物半衰期导致以下之一：降低剂量给药(dosing)频率、减少目的蛋白的剂量、以及增加目的蛋白在使用中的顺从性。
在一些实施方式中，提供了治疗或减轻有此需要的受试者的病况的方法，该方法包含以治疗有效量的本发明的嵌合体向受试者给药的步骤。
在一些实施方式中，提供了治疗或减轻可通过目的蛋白治疗的病况的方法，包括以治疗有效量的本发明的嵌合体向受试者给药的步骤。
在一些实施方式中，目的蛋白选自由CG和GH组成的组。在一些实施方式中，可通过蛋白质治疗的病况是可通过CG和/或GH治疗的病况。
根据下文给出的具体实施方式，本发明的其他实施方式和全部适用范围将变得明显。然而，应该理解的是，具体实施方式和特定实施例仅以实例说明的方式给出，同时表明了本发明的优选实施方式，因为对于本领域技术人员而言，根据该具体实施方式，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改将变得明显。
附图说明
图1是说明hCG-β-WT、hCG-β-ΔCTP或hCG-β-44尾的单次静脉内(IV)注射给大鼠后，人绒毛膜促性腺激素(hCG)-β-WT、hCG-β-ΔCTP、或hCG-β-44尾变体的血浆浓度变化的图。
图2A是说明大鼠血清中hGH衍生蛋白的浓度(nM)随时间变化的图。
图2B是显示大鼠血清中hGH衍生蛋白的浓度(nM)随时间变化的图，将浓度标准化为(normalized to)注射后第一次测量的药物水平；
图3A是体内测定的时间线说明。
图3B是说明向大鼠皮下注射(SC)Bio-tropin、SPA-SPA变体、或盐水后，hGH的血清浓度(ng/ml)变化的图。
图3C是显示在向大鼠皮下注射(SC)Bio-tropin、SPA-SPA变体、或盐水后，在大鼠血清中的人生长激素(hGH)摩尔数(pmol)以时间依赖性方式变化的图。
图4A-4C是比较药代动力学参数：大鼠总血清中Biotropin和SPA-SPA的Tmax(4A)、Cmax(4B)和t1/2(4C)的图。
图5A是体内测定的时间线说明。
图5B是说明在向大鼠皮下注射Biotropin、SPA、SPA-SPA变体、或盐水后，hGH的血清浓度(ng/ml)变化的图。
图5C是显示在向大鼠皮下注射(SC)Biotropin、SPA、SPA-SPA变体或盐水后，大鼠血清中hGH的摩尔数(pmol)以时间依赖性方式变化的图。
图6A-6B是比较市售重组hGH(hGH)的EC50测量值与hGH变体APE(6A)、SPA和SPA-SPA(6B)的EC50测量值的图。
图7A-7B是显示用GH变体治疗期间大鼠体重的累积变化(％)(7A)和克数(7B)的图，用箭头标记注射天数。
图8A-8B是显示用不同药量(doses)的GH变体APE-APE和SPAmid治疗期间大鼠体重的累积变化(％)(8A)和克数(8B)的图，用箭头标记注射天数。
图9A-9B是说明大鼠的SPAmid和Zomacton治疗组的体重(g)(9A)和克数(9B)增加的图；
图10是逻辑回归曲线(Michaelis-Menten模型)，和MTT结果测定的ED50计算。
图11是说明与rhIL2相比，从不同浓度的注射得到的S2S的计算血清细胞因子水平的图；以及
图12A-12B是说明从不同浓度的注射得到的S2A(12A)和A2A(12B)的计算血清细胞因子水平的图。
具体实施方式
本发明提供衍生自或对应于NKp44(SEQ ID NO：1)的氨基酸130至199的肽，或其类似物、衍生物或片段、其制备方法、编码其的核苷酸和其使用方法。本发明进一步提供长效嵌合体，其包含：目的蛋白或其片段和至少一种衍生自或对应于NKp44(SEQ ID NO：1)的氨基酸130至199的肽、或其类似物、衍生物或片段，编码其的核苷酸、以及其制备方法和使用方法。
本发明部分基于以下令人惊讶的发现：包含与NKp44的氨基酸130-199融合的目的蛋白(例如，人绒毛膜促性腺激素)的嵌合体显示出与未经修饰的目的蛋白相比持久的生物学和血清半衰期。
本发明还部分基于以下令人惊讶的发现：包含与衍生自NKp44的氨基酸130-199的肽(SEQ ID NO：3或4)融合的人生长激素(hGH)的嵌合体显示出与未修饰的hGH相比持久的生物学和血清半衰期。此外，与SEQ ID NO：3或4的肽融合的hGH嵌合体进一步表现出与未修饰的hGH相比增强的效能。
如本文所用，“未修饰的蛋白质”是指未与本发明的任何衍生自NKp44的肽融合的蛋白质。
因此，在一个方面，本发明引入了用于延长生物半衰期和使生物半衰期持久的新工具。在一些实施方式中，本发明通过将至少一种衍生自NKp44(SEQ ID NO：1)的氨基酸130至199的肽附接于目的蛋白，提供用于增强任何目的蛋白的效力和/或效能的肽和方法。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。本文所用的术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”包含原生肽、模拟肽(一般包括非肽键或其他合成修饰)和肽类似物拟肽和半拟肽或其任何组合。在另一个实施方式中，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。
术语“嵌合体”是指通过在一个肽的氨基端和另一个肽的羧基端之间形成的肽键将两个或多个肽联接(joining)而形成的多肽。嵌合体可以通过组成肽的化学偶联形成，或者其可以由编码单个连续结合物的核酸序列表达为单个多肽融合蛋白。
NKp44肽
根据一些实施方式，本发明提供20至50个氨基酸残基的肽，该肽包含衍生自NKp44(SEQ ID NO：1)的氨基酸130至199的序列。根据一些实施方式，本发明提供了衍生自SEQ IDNO：2的20至50个氨基酸残基的肽。
在另一个实施方式中，提供了衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的肽，其中该肽不含：(a)由氨基酸1至129组成的片段，和(b)由氨基酸200至270组成的片段。
在另一个实施方式中，该肽包含至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个连续氨基酸，其衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一个实施方式中，提供了包含至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个连续氨基酸的肽，该氨基酸衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130-199，其中该肽不含：(a)由氨基酸1至129组成的片段，和(b)由氨基酸200至270组成的片段。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，NKp44是如SEQ ID NO： 所示的人NKp44受体(GenBank登记号：NP001186438.1)。
如本文所用，术语“衍生自”或“对应于”是指基于序列知识使用本领域技术人员已知的任何一种合适方法(例如根据本领域的标准协议化学合成)构建氨基酸序列。在一个实施方式中，衍生自或对应于NKp44序列的氨基酸130至199的肽是基于SEQ ID NO：1的残基130至199的肽、或其类似物、变体、衍生物或片段。在一个实施方式中，衍生自或对应于SEQID NO：1的氨基酸130至199的肽具有SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列，或其类似物、变体、衍生物或片段。
在另一个实施方式中，包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的肽具有小于80、79、78、77、76、75、74、73、72、71或70个氨基酸的长度。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽具有SEQ ID NO：2的截短形式和/或是SEQ ID NO：2的片段。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、65、66、67、68、69或70个衍生自SEQ ID NO：2的氨基酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含20至70、20至60、20至55、20至50、20至40、25至70、25至60、25至55、25至50、25至40、30至70、30至60、30至50或30至40个衍生自SEQ ID NO：2的氨基酸。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽为20至70、20至60、20至55、20至50、20至40、25至70、25至60、25至55、25至50、25至40、30至70、30至60、30至50或30至40个氨基酸长。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列或由其组成。在一个实施方式中，衍生自NKp44的截短肽包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列或由其组成。
本领域技术人员将认识到，编码序列中对于肽或蛋白质序列的单个取代、删除或添加，即改变、添加或删除单个氨基酸或少量氨基酸是保守的修饰变化，其中该改变导致具有相似电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸的取代，例如，例如谷氨酸(E)取代为天冬氨酸(D)。
在一些实施方式中，衍生自NKp44的肽包含衍生自SEQ ID NO：2的序列，并具有一个或多个保守取代。根据本发明的另一个实施方式，衍生自NKp44的肽包含与SEQ ID NO：2同源的序列。根据本发明的另一个实施方式，衍生自NKp44的肽包含与SEQ ID NO：2具有大于70％、75％、80％、85％、90％或95％同源性的序列。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
如本文所用，术语“类似物”包括具有与本文具体显示的序列之一基本上相同的氨基酸序列的任何肽，其中一个或多个残基被功能上相似的残基保守取代，并且其显示本文所述的能力。保守取代的实例包括用一种非极性(疏水)残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或蛋氨酸取代另一种，用一种极性(亲水)残基取代另一种，比如精氨酸和赖氨酸之间、谷氨酰胺和天冬酰胺之间、甘氨酸和丝氨酸之间，用一种碱性残基如赖氨酸、精氨酸或组氨酸取代另一种，或用一种酸性残基如天冬氨酸或谷氨酸取代另一种。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
如本文所用，短语“保守取代”还包括使用化学衍生化的残基代替非衍生化的残基，条件是该肽显示必需的功能，比如本文所述的沉铁。
在另一个实施方式中，衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的肽是原生NKp44的变体或其片段，其与原生NKp44(SEQ ID NO：1)的氨基酸130-199或其片段的区别为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个保守氨基酸取代。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽是原生NKp44的变体，其与SEQ ID NO：2的区别为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽是原生NKp44的变体，其与SEQ ID NO：2的区别为至多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个修饰。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽是SEQ ID NO：2的变体，其包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成。
在另一个实施方式中，术语“变体”是指多肽或核苷酸序列，其分别与另一个多肽或多核苷酸相比包含一个或多个氨基酸或核苷酸的修饰。在一些实施方式中，修饰是一个或多个氨基酸或核苷酸分别与另一个多肽或多核苷酸相比的取代、删除和/或插入。在一些实施方式中，该变化可以是次要性质的，比如保守氨基酸取代或对于导致不会显著影响多肽的活性的保守氨基酸取代的核苷酸序列。在一些实施方式中，该变化可以是氨基酸分子的取代，其导致糖基化位点(N-或O-连接)的添加，从而增加多肽的糖基化。
通常，本发明包含肽的衍生物。术语“衍生物”或“化学衍生物”包括具有一个或多个通过侧链或官能团反应而化学衍生化的残基的肽的任何化学衍生物。这种衍生化的分子包括，例如，其中游离氨基已被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰基、苄氧羰基、叔丁氧羰基、氯乙酰基或甲酰基的那些分子。游离羧基可以衍生化以形成盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。游离羟基可以衍生化以形成O-酰基或O-烷基衍生物。组氨酸的咪唑氮可以衍生化以形成N-im-苄基组氨酸。另外，作为化学衍生物包括那些肽，其含有二十个标准氨基酸残基的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。例如：4-羟基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；和鸟氨酸可以取代赖氨酸。
此外，肽的衍生物可以通过化学修饰，包括但不限于，末端-NH2酰化、乙酰化或巯基乙酸酰胺化，以及通过末端-羧基酰胺化，例如，与氨、甲胺等，而不同于本发明的肽的天然序列。肽可以是线性的、环状的或枝状的等，这些构象可以使用本领域熟知的方法实现。
根据本发明的原理的肽衍生物和类似物还可以包括侧链键修饰，包括但不限于，-CH2-NH-、-CH2-S-、-CH2-S＝O、OC-NH-、-CH2-O-、-CH2-CH2-、S＝C-NH-和-CH＝CH-，以及骨架修饰，比如修饰的肽键。肽内的肽键(-CO-NH-)可以被取代，例如，被N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)；酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)H-N)；酮亚甲基键(-CO-CH2-)；a-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)，其中R是任何烷基，例如甲基；卡巴键(-CH2-NH-)；羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)；硫代酰胺键(-CS-NH)；烯烃双键(-CH＝CH-)；和肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。这些修饰可以在沿肽链的一个或多个键处发生，并且甚至几个(例如2-3个)同时发生。
本发明还包含肽衍生物和类似物，其中游离氨基已被衍生化以形成胺盐酸盐、对甲苯磺酰氨基、苄氧羰基氨基、叔丁氧基羰基氨基、氯乙酰氨基或甲酰氨基。游离羧基可以衍生化以形成，例如盐、甲酯和乙酯或其他类型的酯或酰肼。组氨酸的咪唑氮可以衍生化以形成N-im-苄基组氨酸。
如本文所用，术语“盐”是指羧基的盐和肽分子的氨基或胍基的酸加成盐。羧基的盐可以通过本领域已知的方法形成，并且包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及与有机碱的盐，比如与胺(比如三乙醇胺、哌啶、普鲁卡因等)为例形成的盐。酸加成盐包括，例如，与矿物酸(比如，乙酸或草酸为例)的盐。盐在此也描述了添加到肽溶液中以增强钙矿物的水凝胶形成和/或矿化的离子组分。
肽类似物还可含有非天然氨基酸。非天然氨基酸的实例包括但不限于肌氨酸(Sar)、正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、二氨基丁酸、高丝氨酸、异丙基赖氨酸、3-(2′-萘基)-丙氨酸、烟酰基赖氨酸、氨基异丁酸和3-(3′-吡啶基-丙氨酸)。
此外，肽类似物可含有其他衍生化的氨基酸残基，包括但不限于，甲基化氨基酸、N-苄基化氨基酸、O-苄基化氨基酸、N-乙酰化氨基酸、O-乙酰化氨基酸、苄氧羰基取代氨基酸等。具体实例包括，但不限于，甲基-丙氨酸(Me Ala)、MeTyr、MeArg、MeGlu、MeVal、MeHis、N-乙酰基-赖氨酸、O-乙酰基-赖氨酸、苄氧羰基-赖氨酸、酪氨酸-O-苄基、谷氨酸-O-苄基、苄基-组氨酸、精氨酸-甲苯磺酰基、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸等。
本发明进一步包括肽类似物，其可含有氨基酸的一种或多种D-异构体形式。至少一个氨基酸和可能所有氨基酸是D-氨基酸的逆反向(retro-inverso)D-氨基酸肽的产生是本领域熟知的。当肽中的所有氨基酸都是D-氨基酸，并且分子的N-和C-末端被逆转时，结果是具有相同结构基团的分子处于与分子的L-氨基酸形式相同的位置。然而，该分子对蛋白水解降解更稳定，因此可用于本文所述的许多应用中。非对映异构肽可能比具有相同氨基酸序列的所有L-或所有D-氨基酸肽高度有利，因为它们具有较高的水溶性、较低的免疫原性和较低的蛋白水解降解敏感性。如本文所用的术语“非对映异构肽”是指包含L-氨基酸残基且包含D-氨基酸残基的肽。本发明的非对映异构肽中D-氨基酸残基的数量和位置可以是可变的，只要该肽能够显示延长嵌合多肽的半衰期的功能即可。
在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组。在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列选自由SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组成的组。
在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽是糖基化的。在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽的序列包含至少一个糖基化位点、2个糖基化位点、3个糖基化位点、4个糖基化位点、5个糖基化位点、6个糖基化位点、7个糖基化位点、8个糖基化位点、10个糖基化位点、11个糖基化位点、12个糖基化位点或13个糖基化位点。在一个实施方式中，该糖基化位点是“N-连接的”糖基化位点和/或“O-连接的”糖基化位点。
如本文所用，“N-连接的”糖基化位点包括，但不限于，天冬酰胺(Asn)，后面有X-丝氨酸、X-苏氨酸和X-半胱氨酸中的任何一个，其中X是除脯氨酸外的任何一个氨基酸，并且糖基化发生在Asn残基。在本发明中，位于N端、C端或两个N-连接位点之间的任何多肽的氨基酸序列可具有适合特定设计要求所需的任何含量和长度。如本文所用，“O-连接的”糖基化可以在任何丝氨酸或苏氨酸残基处发生，而不带有单一的共同核心结构或共有蛋白质序列。
目的蛋白
本发明的“目的蛋白”包含任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。在一些情况下，编码的多肽小于约50个氨基酸，然后将该多肽称为肽。如果多肽是肽，则其长度将是至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。在一些实施方式中，本发明的目的蛋白包含在动物中具有生物学功能的多肽、肽或蛋白质。在一些实施方式中，本发明的目的蛋白包含征哺乳动物中具有生物学功能的肽或蛋白质。在一些实施方式中，本发明的目的蛋白包含在人类中具有生物学功能的肽或蛋白质。在一些实施方式中，本发明的目的蛋白包含具有生物学意义的任何多肽、肽或蛋白质。在一些实施方式中，目的蛋白包含人类肽、合成肽和/或非人源(比如动物)的肽。在一些实施方式中，目的蛋白包含人类多肽、合成多肽和/或非人源(比如动物)的多肽。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一个实施方式中，目的蛋白是同源物。在一个实施方式中，同源物还指其删除、插入或取代变体(包括氨基酸取代)和其生物活性多肽片段。
本文可互换使用的术语“生物学活性”，“生物活性”或“生物学功能”应理解为是指由目的蛋白或其任何片段直接或间接表现的功能。
在另一个实施方式中，目的蛋白是细胞因子。在另一个实施方式中，细胞因子是低分子量蛋白质。在另一个实施方式中，细胞因子是细胞分泌的蛋白质。在另一个实施方式中，细胞因子诱导和/或调节免疫响应。在另一个实施方式中，细胞因子具有与特定受体(一种或多种)结合的高亲和力。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子包括细胞因子的模拟物，其可用于抑制或加强其体内作用。在另一个实施方式中，细胞因子包括自分泌活性。在另一个实施方式中，细胞因子包含旁分泌活性。在另一个实施方式中，细胞因子包含内分泌活性。在另一个实施方式中，细胞因子是血细胞生成素细胞因子。在另一个实施方式中，细胞因子是干扰素细胞因子。在另一个实施方式中，细胞因子是趋化因子。在另一个实施方式中，细胞因子是肿瘤坏死因子细胞因子。在另一个实施方式中，如本文所用的细胞因子包括生物学活性和临床效力。在另一个实施方式中，如本文所用的细胞因子是治疗性蛋白质。
在另一个实施方式中，本发明的细胞因子是细胞因子拮抗剂。在另一个实施方式中，细胞因子拮抗剂是细胞因子同源物。在另一个实施方式中，细胞因子拮抗剂是细胞因子受体的可溶性片段。在另一个实施方式中，细胞因子拮抗剂是趋化因子受体同源物。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子参与包含Ras-MAP激酶途径的细胞因子信号级联。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子参与JNK的诱导。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子参与p38MAP的诱导。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子诱导细胞增殖。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子参与包含JAK/STAT途径的细胞因子信号级联。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子诱导细胞生长抑制。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子诱导分化。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是4α-螺旋束细胞因子。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是长链4-螺旋束细胞因子。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是短链4-螺旋束细胞因子。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是β-三叶草细胞因子。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是β-夹心细胞因子。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是EGF样细胞因子。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子包含胱氨酸结(knot)二聚化结构域。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子同时包含α链和β链。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是α超家族细胞因子，比如IL-2、IL-4、IL-5、GM-CSF、IL-3、IFN-α或IL-13。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是二聚体4-螺旋束细胞因子。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是IL细胞因子家族的成员。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是长链4-螺旋束超家族细胞因子，比如GH、G-CSF、髓单核细胞生长因子、IL-6、IL-3、IL-7、LIF、抑瘤素M、睫状神经营养因子(CNTF)或胆碱能分化因子(CDF)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是短链4-螺旋束超家族细胞因子，比如IL-2、IL-4、IL-13、IFN-α、IL-5、GM-CSF、IL-3、或巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是二聚体4-螺旋束，比如IFN-γ、IL-10或IFN-β。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是β-三叶草细胞因子，比如IL1-A、IL1-B或FGF。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是β-夹心细胞因子，比如TNF-α或TNF-β。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是EGF样细胞因子，比如TGF-α。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子包含胱氨酸结二聚化结构域。在另一个实施方式中，促性腺激素、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和TGF-β2包含胱氨酸结二聚化结构域。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子同时包含α链和β链。在另一个实施方式中，IL-8、IP10、血小板因子4(PF-4)、bTG、GRO、9E3、HLA-A2、巨噬细胞炎性蛋白1α(MIP-1α)、巨噬细胞炎性蛋白1β(MIP-1β)和黑色素瘤生长刺激因子(MGSA)同时包括α链和β链。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子结合血细胞生成素受体家族成员(也称为I类细胞因子受体家族)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子结合II类细胞因子受体(干扰素或干扰素样细胞因子)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子结合肿瘤坏死因子受体(TNFR)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子结合趋化因子受体。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子结合G蛋白偶联受体。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是生长激素(GH)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是人生长激素(hGH)(Genbank登记号：P01241)。在一个实施方式中，“人生长激素”(hGH)是指多肽，比如Genbank登记号P01241中所述的多肽，其表现出hGH活性(即刺激生长)。在一个实施方式中，本发明的hGH也指同源物。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是生长激素(GH)样细胞因子超家族的成员。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子接近由睫状神经营养因子和粒细胞集落刺激因子(CSF)形成的簇。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子增强细胞因子响应，1型(IFN-γ、TGF-β等)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子增强抗体响应，2型(IL-4、IL-10、IL-13，等)。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是绒毛膜促性腺激素(CG)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是人绒毛膜促性腺激素(hCG)。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是蛋白酶。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是丝氨酸蛋白酶。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是因子VII。在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是重组因子VIIa。
在另一个实施方式中，如本文所述的细胞因子是肽。在另一个实施方式中，细胞因子是糖基化的。
在一些实施方式中，目的蛋白是蛋白质、多肽或肽类激素。术语“蛋白质、多肽或肽类激素”是指一类肽，其分泌到血流中并在活体动物(例如人)中具有内分泌功能。在一些实施方式中，肽类激素是信号分子，由体液比如血液携带至身体的器官和组织以发挥其功能。通常，有许多类型的激素作用于身体功能和过程的不同方面。
在另一个实施方式中，目的蛋白是抗体。在一个实施方式中，抗体是单链抗体。在另一个实施方式中，将至少一种衍生自NKp44的肽(例如，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4)插入单链抗体的重链和轻链之间。
肽类激素可以从腺体分泌，比如垂体，包括垂体前叶(例如促乳素(PRL)、促肾上腺皮质激素(ACTH)和生长激素(GH)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、和促甲状腺激素(TSH))、和垂体后叶(例如抗利尿激素、也称血管加压素和催产素)、甲状腺(例如降钙素)、甲状旁腺(例如甲状旁腺激素)，可选地肽类激素可以由胰腺分泌(例如，胰高血糖素、生长抑素和胰岛素)、或可选地由许多不同的器官和组织产生，比如心脏(例如，心房钠尿肽(ANP)或心房利钠因子(ANF))、胃肠道(例如，胆囊收缩素、胃泌素)和脂肪组织储存(例如，瘦蛋白)、以及胎盘(例如，绒毛膜促性腺激素)。
在一些实施方式中，本发明的肽激素包括但不限于：胰岛素、胰高血糖素、促性腺激素(FSH、LH、CG)、人促甲状腺激素、血管紧张素II、碱性成纤维细胞生长因子-2、甲状旁腺激素相关蛋白、血管加压素、催产素、心房钠尿肽(ANP)或心房利钠因子(ANF)、生长抑素、胆囊收缩素、胃泌素和脂肪组织储存(瘦蛋白)。在另一个实施方式中，目的蛋白是激素，比如HCG-β和GH。
在一些实施方式中，本发明的目的蛋白是促生长激素家族的肽类激素。如本文所用，“促生长激素家族”是蛋白质家族，其包括促生长激素(生长激素(GH))、绒毛膜生长催乳素(催乳素)、促乳素、胎盘促乳素相关蛋白、增殖蛋白、增殖蛋白相关蛋白和来自各种鱼类的生长催乳素。
在一些实施方式中，本发明的目的蛋白是分泌素家族的肽。如本文所用，分泌素家族是进化相关的肽类激素家族，其调节来自分泌素受体家族的G蛋白偶联受体的活性。许多主要在肠或胰腺中表达的多肽类激素属于一组这些结构相关肽，包括但不限于，胰高血糖素、抑胃多肽(GIP)、分泌素、血管活性肠肽(VIP)、垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)和生长激素释放激素(GHRH)。
在一些实施方式中，目的蛋白是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。在一个实施方式中，“胰高血糖素样肽-1”(GLP-1)是指哺乳动物多肽。在一个实施方式中，“胰高血糖素样肽-1”(GLP-1)是指人多肽。在一些实施方式中，GLP-1从胰高血糖素前原蛋白(Genbank登记号：NP002045)剪切，其具有结合GLP-1受体并启动信号转导途径的能力，从而导致促胰岛素活性。在一个实施方式中，“促胰岛素活性”是指刺激胰岛素分泌以响应升高的葡萄糖水平的能力，从而引起细胞的葡萄糖摄取和降低的血浆葡萄糖水平。在一些实施方式中，GLP-1多肽包括但不限于美国专利号5,118,666中所述的那些；其通过引用并入本文。在一些实施方式中，细胞因子是胰高血糖素样肽-1激动剂(GLP-1激动剂)。在一些实施方式中，GLP-1激动剂是艾塞那肽(Exenatide)。
在一些实施方式中，本发明的目的蛋白是人“生殖”激素。如本文所用，人“生殖”激素代表一组激素，其由在该组中相同的α亚基和根据该组成员而不同的β亚基组成。人“生殖”激素包括：人绒毛膜促性腺激素(HCG)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和促甲状腺激素(TSH)。
本发明的嵌合体
在一些实施方式中，嵌合体包含目的蛋白和至少一种衍生自NKp44的肽，该肽附接于目的蛋白的氨基端和/或羧基端。在一个方面，本发明提供了嵌合体，其包含：目的蛋白或其活性片段；和至少一种衍生自NKp44的肽。在一个实施方式中，所述至少一种肽附接于目的蛋白的氨基端、羧基端、或氨基端和羧基端两者。在一个实施方式中，至少一种衍生自NKp44的肽附接于目的蛋白的氨基端。在一个实施方式中，至少一种衍生自NKp44的肽附接于目的蛋白的羧基端。在一个实施方式中，至少一种衍生自NKp44的肽附接于目的蛋白的氨基端和羧基端。在一个实施方式中，至少两种衍生自NKp44的肽附接于目的蛋白的氨基端和/或羧基端。在一个实施方式中，至少两种衍生自NKp44的肽附接于目的蛋白的氨基端和羧基端两者。在一个实施方式中，至少三种衍生自NKp44的肽附接于目的蛋白的氨基端和/或羧基端。在一些实施方式中，至少一种衍生自NKp44的肽附接于目的肽的氨基端，并且至少一种衍生自NKp44的肽附接于目的肽的羧基端。在一些实施方式中，衍生自NKp44的肽以串联重复(即，两个或更多个连续重复)附接于目的蛋白的羧基端和/或氨基端。
在一些实施方式中，嵌合体包含至少一种衍生自NKp44的肽，其位于目的蛋白的第一和第二部分之间。如本文所用，术语“部分”是指目的蛋白的连续氨基酸残基的片段。如本文所用，第一和第二部分是指目的蛋白的部分，它们一起构成整个目的蛋白，或者可选地其生物活性片段。在一些实施方式中，嵌合体包含式X1-X2-X3，其中X1是目的肽的第一部分(任选地，信号肽)，X2是本文所述的NKp44衍生肽，并且X3是目的肽的第二部分。对于非限制性实例，其中目的肽是hGH，X1代表hGH的氨基酸1-87，X3代表hGH的氨基酸88-217。在另一个非限制性实例中，其中目的肽是hGH，X1代表hGH的氨基酸1-175，X3代表hGH的氨基酸176-217。
在一些实施方式中，嵌合体包含至少一种衍生自NKp44的肽，其位于目的蛋白的第一和第二部分之间，并且至少一种衍生自NKp44的肽附接于目的蛋白的氨基端和/或羧基端。在一些实施方式中，嵌合体包含下式，该式选自由X2-X1-X2-X3，X2-X2-X1-X2-X3、X2-X1-X2-X2-X3、X2-X2-X1-X2-X2-X3、X1-X2-X3-X2、X1-X2-X3-X2-X2、X1-X2-X2-X3-X2、X1-X2-X2-X3-X2-X2、X2-X1-X2.X3-X2、X2-X2-X1-X2-X3-X2、X2-X2-X1-X2-X3-X2-X2、X2-X1-X2-X3-X2-X2、X2-X1-X2-X2-X3-X2、X2-X2-X1-X2-X2-X3-X2、X2-X1-X2-X2-X3-X2-X2、和X2-X2-X1-X2-X2-X3-X2-X2组成的组。在一些实施方式中，X1是目的肽的第一部分，X2代表本文所述的NKp44衍生肽，X3是目的肽的第二部分。在一些实施方式中，X1是目的肽的第一部分，X2中的每一个独立地选自本文所述的任意NKp44衍生肽，并且X3是目的肽的第二部分。
在一些实施方式中，目的蛋白包含至少两个亚基(例如，hCG)。在该实施方式中，至少一种衍生自NKp44的肽可以连接于(linked to)每个亚基的N和/或C末端。在该实施方式中，至少一种衍生自NKp44的肽可以进一步连接于每个亚基的N和/或C末端。在一些实施方式中，至少一种衍生自NKp44的肽进一步附接于目的蛋白的氨基端和/或羧基端。
在一些实施方式中，衍生自NKp44的肽附接于选自由：目的蛋白的氨基端、目的蛋白的羧基端、以及目的蛋白的第一和第二部分之间组成的组的至少一个位置。
在另一个实施方式中，嵌合体包含细胞因子或其活性片段和衍生自NKp44的肽。在另一个实施方式中，嵌合体包含激素或其活性片段和衍生自NKp44的肽。在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含SEQ ID NO：2中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，衍生自NKp44的肽包含SEQ IDNO：5中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合体包含附接于一种或多种肽的目的蛋白，该肽选自包含由：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于至少两种多肽的目的蛋白，该多肽选自由：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组。在一些实施方式中，嵌合体包含目的蛋白，该目的蛋白附接于至少两种包含SEQ ID NO：2的多肽和选自由：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含目的蛋白，该目的蛋白附接于至少两种包含SEQ ID NO：3的多肽和选自由：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含目的蛋白，该目的蛋白附接于至少两种包含SEQ ID NO：4的多肽和选自由：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含目的蛋白，该同的蛋白附接于至少两种包含SEQ ID NO：5的多肽和选自由：SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组的肽。
在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的羧基端的包含SEQID NO：2所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的肽和附接于目的蛋白的羧基端的包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的肽，该肽位于目的蛋白的第一和第二部分之间。在一些实施方式中，嵌合体包含肽，该肽包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，附接于目的蛋白的第一部分和第二部分之间且进一步附接在选自由：目的蛋白的氨基端和目的蛋白的羧基端组成的组的位置中。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的羧基端的包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的肽和附接于目的蛋白的羧基端的包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的肽，该肽位于目的蛋白的第一和第二部分之间。在一些实施方式中，嵌合体包含肽，该肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，附接于目的蛋白的第一部分和第二部分之间且进一步附接在选自由：目的蛋白的氨基端和目的蛋白的羧基端组成的组的位置中。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的羧基端的包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的肽和附接于目的蛋白的羧基端的包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的肽，该肽位于目的蛋白的第一和第二部分之间。在一些实施方式中，嵌合体包含肽，该肽包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，附接于目的蛋白的第一部分和第二部分之间且进一步附接在选自由：目的蛋白的氨基端和目的蛋白的羧基端组成的组的位置中。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的羧基端的包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的肽和附接于目的蛋白的羧基端的包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的肽。在一些实施方式中，嵌合体包含附接于目的蛋白的氨基端的包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列的肽，该肽位于目的蛋白的第一和第二部分之间。在一些实施方式中，嵌合体包含肽，该肽包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，附接于目的蛋白的第一部分和第二部分之间且进一步附接在选自由；目的蛋白的氨基端和目的蛋白的羧基端组成的组的位置中。
在一些实施方式中，嵌合体包含一种或多种肽，该肽选自包含由：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组的氨基酸序列的肽，附接于目的蛋白的第一部分和第二部分之间和/或附接于目的蛋白的氨基端和/或目的蛋白的羧基端。在一些实施方式中，嵌合体包含一种或多种肽，该肽选自包含由：SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组的氨基酸序列的肽，附接于目的蛋白的第一部分和第二部分之间且进一步附接在选自由：目的蛋白的氨基端和目的蛋白的羧基端组成的组的位置中。
在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽通过连接体附接于目的蛋白。在另一个实施方式中，连接体是共价键。在另一个实施方式中，连接体是肽键。在另一个实施方式中，连接体是取代的肽键。在一些实施方式中，连接体是一个氨基酸或多个氨基酸。
在一些实施方式中，嵌合体还包含前导肽。如本文所用，术语“前导肽”是指位于蛋白质前体形式(例如，本发明的嵌合体)的氨基端的序列，确保进入分泌途径。通常，前导肽序列在成熟过程中被剪切。在另一个实施方式中，嵌合体还包含前导肽，以将表达的嵌合体引导穿过内质网(ER)的膜。在一些实施方式中，前导肽附接于目的蛋白的氨基末端。在一些实施方式中，前导肽附接于衍生自NKp44的肽的氨基端。在一些实施方式中，前导肽包含SEQID NO：8中所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，前导肽包含SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合体还包含标记物。如本文所用，术语“标记物”是指添加到嵌合体中以促进嵌合体的检测和/或纯化的肽序列。市售标记物的非限制性实例包括：FLAG肽、包含组氨酸重复的组氨酸标记物、谷胱甘肽巯基转移酶(GST)、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G、β-半乳糖苷酶、链霉抗生物素蛋白、c-Myc和绿色荧光蛋白。在一些实施方式中，标记物是包含组氨酸重复的组氨酸标记物。在一些实施方式中，组氨酸标记物包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个组氨酸重复。在一些实施方式中，标记物包含SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，标记物包含SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，标记物包含SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，嵌合体包含原生形式的目的蛋白。可选地，在其他实施方式中，嵌合体包含目的蛋白的片段或截短形式。在一个实施方式中，本发明的目的蛋白与原生目的蛋白具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％的同源性。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。在一些实施方式中，嵌合体包含选自表1中所示序列的序列或由其组成。
表1.本发明嵌合体的氨基酸序列
在一些实施方式中，嵌合体的生物学活性至少等同于目的蛋白的生物学活性。在一些实施方式中，在药理学测量比如药代动力学和药效学方面，嵌合体至少等同于目的蛋白。在其他实施方式中，与目的蛋白相比，嵌合体具有增加的Cmax。在其他实施方式中，与目的蛋白相比，嵌合体具有增加的Cavg。在其他实施方式中，与目的蛋白相比，嵌合体具有增加的Tmax。在另一个实施方式中，与目的蛋白相比，嵌合体具有改善的AUC。在另一个实施方式中，与目的蛋白相比，嵌合体具有增强的效能。在另一个实施方式中，与目的蛋白相比，嵌合体具有改善的效力。
在另一个实施方式中，与未修饰的目的蛋白相比，嵌合体具有增加的血清半衰期。在另一个实施方式中，与未修饰的目的蛋白相比，嵌合体具有增加的循环半衰期。在另一个实施方式中，与未修饰的目的蛋白相比，嵌合体在体内具有增加的循环半衰期和血浆停留时间，降低的清除率和增加的临床活性。
在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽充当针对目的蛋白降解的保护剂。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽增加目的蛋白的Cmax。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽延长目的蛋白的Tmax。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽增加目的蛋白的Cavg。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽改善目的蛋白的AUC。在另一个实施方式中，衍生自NKp44的肽延长目的蛋白的循环半衰期。在一些实施方式中，衍生自NKp44的肽增强目的蛋白的效能。在一些实施方式中，衍生自NKp44的肽增强目的蛋白的效力。
如本文所用，“半衰期”是指消除药剂一半量所需的时间。对于非限制性实例，“半衰期”是指药剂浓度达到其初始值或最大值的一半的时间。本文所用的关于本发明嵌合体的术语“延长的(extended)生物学半衰期”、“持久的(prolonged)生物学半衰期”、“增加的血清半衰期”和“增加的循环半衰期”，表明本发明的嵌合体以比内源性蛋白质或其重组产生的形式更慢的速率清除。对于非限制性实例，通过本发明的方法在受试者中产生的合成HCG-β(例如，包含HCG-β或其片段和至少一种衍生自NKp44的肽的嵌合体)的半衰期会“增加”，如果半衰期超过内源性HCG-β或重组产生的原生HCG-β的半衰期。
如本文所用，贯穿全文，术语“改善”、“增加”、“延长”和“增强”以及它们的所有语法形式，可互换使用，以表示至少1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10或20倍增加。在一些实施方式中，提供至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、或200％增加。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
如本文所用，术语“药理性质”是指给药于生理系统的药剂(例如，目的蛋白)的任何期望的或有利的生物学活性或物理化学特征。如本文所用，术语“药代动力学性质”是指在一段时间内药剂(例如，目的蛋白)在受试者、细胞、组织或器官中的作用，包括但不限于吸收、分布、组织定位、生物转化和排泄的过程。
术语“AUC”、“Cmax”和“Tmax”在本文中根据其正常含义使用，是指药代动力学参数，其可用于表征动物或人受试者中特定药物产品的药代动力学响应。本文使用的术语“AUC”是指血浆浓度-时间曲线下的面积，AUC代表物质(例如目的蛋白)的血液、血清或血浆浓度随时间的变化。如本文所用，术语“Cmax”是指在药物给药后观察到的药物的最大或峰值浓度，术语“Tmax”是指最大浓度(Cmax)发生的时间。
本文所用的术语“Cavg”是指药物在剂量给药间隔即约24小时内的血浆浓度，并计算为AUC/剂量给药间隔。
如本文所用，术语“效能(potentcy)”是指蛋白质的特定能力或性能，如适当的实验室测试所示，以产生给定的结果。高效能是指在低浓度下诱导更大响应的能力。如本文所用，“EC50”意指诱导50％最大效应(例如，生物学过程)所需的物质(例如，蛋白质、化合物或药物)的浓度。如本文所用，“IC50”意指诱导50％抑制效应所需的物质(例如，蛋白质、化合物或药物)的浓度。
如本文所用，术语“效力(efficacy)”是指所需效应获得的程度。
在另一个实施方式中，嵌合体以与未修饰的目的蛋白相同的方式使用。
在另一个实施方式中，与目的蛋白相比，嵌合体具有增强的效能。在一些实施方式中，与未修饰的目的蛋白相比，本发明的嵌合体具有更低的EC50。
在另一个实施方式中，本发明的嵌合体在体内具有增加的循环半衰期和血浆停留时间、降低的清除率、和增加的临床活性。在另一个实施方式中，由于如本文所述的嵌合体的改善的性质，这些嵌合体的投药频率低于未修饰的目的蛋白。在另一个实施方式中，降低的投药频率将导致改善的患者顺从性，从而引起改善的治疗效果，以及改善的患者的生活质量。
在另一个实施方式中，与未修饰的细胞因子和/或细胞因子的常规结合物(例如，与聚(乙二醇)连接)相比，本发明的嵌合体具有改善的效能、改善的稳定性、升高的AUC水平和/或增强的循环半衰期。在一些实施方式中，常规结合物具有本发明的结合物(嵌合体)的分子量和连接体结构。
在本发明的一些实施方式中，与天然存在的hCG相比，通过用至少一种衍生自NKp44的肽取代位于hCG羧基端的28个氨基酸，延长了hCG半衰期。
在一些实施方式中，与未修饰的目的蛋白或细胞因子相比，通过本发明的教导制备的目的蛋白(例如细胞因子)的生物学半衰期增加。在一些实施方式中，与未修饰的目的蛋白或细胞因子相比，通过本发明的教导制备的目的蛋白(例如细胞因子)的效能增强。
如本发明的实例部分例证，通过本发明的教导制备的生长激素与未修饰的生长激素相比具有延长的半衰期。此外，与未修饰的生长激素相比，通过本发明的教导制备的生长激素具有更低的EC50值。在一些实施方式中，与未修饰的生长激素相比，通过本发明的教导制备的生长激素具有改善的效力。在一些实施方式中，与未修饰的生长激素相比，通过本发明的教导制备的生长激素具有改善的效能。
合成嵌合体
根据一个实施方式，本发明的嵌合体可以通过本领域已知的用于肽合成的任何方法和/或技术合成或制备。根据另一个实施方式，嵌合体可以通过Merrifield的固相肽合成方法合成(参见J.Am.Chem.Soc，85：2149，1964)。根据另一个实施方式，本发明的嵌合多肽可以使用本领域熟知的标准溶液方法合成(参见，例如，Bodanszky，M.，Principles ofPeptide Synthesis，Springer-Verlag，1984)。
通常，合成方法包括将一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸顺序加入到与适当树脂结合的生长肽链中。正常情况下，第一个氨基酸的氨基或羧基被适当的保护基保护。在有利于形成酰胺键合的条件下，通过添加序列中具有适当保护的互补(氨基或羧基)基团的下一个氨基酸，然后可以将保护的或衍生化的氨基酸附接于惰性固体支持物(树脂)或在溶液中使用。然后从该新添加的氨基酸残基中除去保护基，并加入下一个氨基酸(适当保护的)，等等。在所有所需氨基酸已被以适当的序列连接后，依次或同时除去任何剩余的保护基，如果通过固相方法合成，则肽链从固体支持物上剪切下，得到最终的肽。
在固相肽合成方法中，氨基酸的α-氨基被酸或碱敏感基团保护。这种保护基团应具有对肽键合形成条件稳定，同时易于除去而不破坏生长的肽链的性质。适当的保护基团是叔丁氧基羰基(BOC)、苄氧基羰基(Cbz)、联苯基异丙氧基羰基、叔戊氧基羰基、异冰片氧基羰基、(α，α)-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧基羰基、邻硝基苯基亚磺酰基、2-氰基-叔丁氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)等。在固相肽合成方法中，将C-末端氨基酸附接于适当的固体支持物。适用于上述合成的适当的固体支持物是那些对逐步缩合-脱保护反应的试剂和反应条件呈惰性，以及不溶于所用溶剂介质的物质。适当的固体支持物是氯甲基聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物、羟甲基-聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物等。偶联反应在溶剂，例如乙醇、乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)等中完成。连续保护的氨基酸的偶联可以在本领域熟知的自动多肽合成仪中进行。
在另一个实施方式中，可以合成本发明的肽，使得连接肽的氨基酸残基的一个或多个键是非肽键。在另一个实施方式中，非肽键包括但不限于，亚氨基、酯、酰肼、氨基脲和偶氮键，其可以通过本领域技术人员熟知的反应形成。
在另一个实施方式中，本发明的嵌合多肽提供给受试者本身。在一个实施方式中，将本发明的嵌合多肽作为其与药学上可接受的载剂混合的药物组合物的一部分提供给受试者。
本发明的多核苷酸
本发明进一步包含多核苷酸序列，其包含编码本发明的任何肽的核酸。在另一个实施方式中，编码衍生自NKp44的肽的核酸序列与编码原生人NKp44核酸序列或其片段的氨基酸130至199的核酸序列至少70％、或者可选地至少80％、或者可选地至少90％、或者可选地至少95％、或者可选地至少99％同源。每种可能性代表本发明的单独的实施方式。
在一些实施方式中，本发明提供了编码嵌合体的多核苷酸，所述嵌合体包含目的蛋白和衍生自NKp44的肽。
在一些实施方式中，将本发明的多核苷酸连接于表达载体中，所述表达载体包含顺式调控序列(例如，启动子序列)的转录控制。在一些实施方式中，顺式调控序列适合于指导本发明嵌合体的组成型表达。在一些实施方式中，顺式调控序列适合于指导本发明嵌合体的组织特异性表达。在一些实施方式中，顺式调控序列适合于指导本发明嵌合体的诱导型表达。
在一些实施方式中，适用于本发明的组织特异性启动子包括在特定细胞群中有功能的序列。实例包括但不限于启动子，比如肝脏特异性的白蛋白(Pinkert et al.，(1987)Genes Dev.1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame et al.，(1988)Adv.Immunol.43：235-275)；特别是T细胞受体的启动子(Winoto et al.，(1989)EMBO J.8：729-733)和免疫球蛋白；(Banerji et al.(1983)Cell 33729-740)，神经元特异性启动子，比如神经丝启动子(Byrne et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5473-5477)、胰腺特异性启动子(Edlunch et al.(1985)Science 230：912-916)或乳腺特异性启动子，比如牛奶乳清启动子(美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。适用于本发明的诱导型启动子包括，例如，四环素诱导型启动子(Srour，M.A.，et al.，2003.Thromb.Haemost.90：398-405)。
术语“多核苷酸”是指核酸(例如DNA或RNA)序列，其包含产生多肽所必需的编码序列。在一个实施方式中，多核苷酸是指单链或双链核酸序列，其以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或复合多核苷酸序列的形式(例如，上述的组合)分离和提供。
在一个实施方式中，“互补多核苷酸序列”是指使用逆转录酶或任何其他RNA依赖性DNA聚合酶从信使RNA逆转录产生的序列。在一个实施方式中，随后可以使用DNA聚合酶在体内或体外扩增序列。
在一个实施方式中，“基因组多核苷酸序列”是指衍生(分离)自染色体的序列，因此它代表染色体的连续部分。
在一个实施方式中，“复合多核苷酸序列”是指至少部分互补且至少部分是基因组的序列。在一个实施方式中，复合序列可包括编码本发明多肽所需的一些外显子序列，以及介于其间的一些内含子序列。在一个实施方式中，内含子序列可以是任何来源，包括其他基因，并且一般将包括保守的剪接信号序列。在一个实施方式中，内含子序列包括顺式作用表达调控元件。
在一个实施方式中，本发明的多核苷酸进一步包含编码信号肽的信号序列，以指导本发明的嵌合体穿过细胞膜或进入细胞膜。在一个实施方式中，信号肽指导本发明的嵌合体从细胞分泌。在一个实施方式中，在表达和分泌后，信号肽从前体蛋白剪切，产生成熟蛋白。
在一些实施方式中，使用如实施例1中所述的PCR技术或本领域技术人员已知的任何其他方法或程序制备本发明的多核苷酸。在一些实施方式中，该程序涉及两种不同DNA序列的连接(参见，例如，“Current Protocols in Molecular Biology”，eds.Ausubel etal.，John Wiley&Sons，1992)。
在一个实施方式中，将本发明的多核苷酸插入表达载体(即核酸构建体)中以使重组多肽能够表达。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使该载体适于在原核生物中复制和整合的附加序列。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括使该载体适于在真核生物中复制和整合的附加序列。在一个实施方式中，本发明的表达载体包括穿梭载体，其使得该载体适于在原核生物和真核生物中复制和整合。在一些实施方式中，克隆载体包含转录和翻译起始序列(例如，启动子，增强子)和转录和翻译终止子(例如，多腺苷酸化信号)。
在一个实施方式中，多种原核或真核细胞可用作宿主表达系统以表达本发明的嵌合体。在一些实施方式中，这些包括但不限于微生物，比如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含有多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(比如Ti质粒)转化的植物细胞系统。
在一些实施方式中，使用非细菌表达系统(例如哺乳动物表达系统)来表达本发明的嵌合体。在一个实施方式中，表达载体用于在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸。
在一些实施方式中，在本发明的细菌系统中，可以有利地选择几种表达载体，这取决于表达的多肽的预期用途。在一个实施方式中，期望大量多肽。在一个实施方式中，期望指导蛋白质产物高水平表达的载体，蛋白质产物可能与疏水信号序列融合，该序列指导表达的产物进入细菌的周质或蛋白质产物易于纯化的培养基中。在一个实施方式中，某些融合蛋白用特异性剪切位点改造以帮助多肽的回收。在一个实施方式中，适合于这种操作的载体包括但不限于pET系列的大肠杆菌表达载体[Studier et al.，Methods inEnzymol.185：60-89(1990)]。
在一个实施方式中，使用酵母表达系统。在一个实施方式中，许多含有组成型或诱导型启动子的载体可以用于酵母中，如美国专利号5,932,447中所公开的。在另一个实施方式中，使用促进外源DNA序列整合到酵母染色体中的载体。
在一个实施方式中，本发明的表达载体可以进一步包括附加的多核苷酸序列，其允许例如，来自单个mRNA比如内部核糖体进入位点(IRES)和用于启动子-嵌合多肽的基因组整合的序列的几种蛋白质的翻译。
在一些实施方式中，哺乳动物表达载体包括但不限于，可以从Invitrogen获得的pcDNA3、pcDNA3.1(±)、pGL3、pZeoSV2(±)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，可从Promega获得的pCI，可从Strategene获得的pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，可从Clontech获得的pTRES、及其衍生物。
在一些实施方式中，本发明使用含有来自真核病毒如逆转录病毒的调控元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在一些实施方式中，衍生自牛乳头瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，且衍生自EB病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其他示例性载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE，以及在SV-40早期启动子、SV-40后期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳氏肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或其他在真核细胞中显示出有效表达的启动子指导下允许蛋白质表达的任何其他载体。
在一些实施方式中，提供诸如横向感染和靶向特异性优点的重组病毒载体用于本发明的嵌合体的体内表达。在一个实施方式中，横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，并且是单个受感染细胞产生许多后代病毒粒子，后代病毒粒子出芽并且感染相邻细胞的过程。在一个实施方式中，结果是大面积被迅速感染，其中大部分最初未被原始病毒颗粒感染。在一个实施方式中，产生不能横向扩散的病毒载体。在一个实施方式中，如果所需目的是将特定基因引入仅仅小范围数目的靶细胞中，则该特征可能是有用的。
可以使用各种方法将本发明的表达载体导入细胞中。这些方法一般描述于Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Springs HarborLaboratory，New York(1989，1992)，Ausubel et al.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Baltimore，Md.(1989)，Chang et al.，Somatic GeneTherapy，CRC Press，Ann Arbor，Mich.(1995)，Vega et al.，Gene Targeting，CRC Press，Ann Arbor Mich.(1995)，Vectors：A Survey of Molecular Cloning Vectors and TheirUses，Butterworths，Boston Mass.(1988)和Gilboa et at.[Biotechniques 4(6)：504-512，1986]中并且包括，例如稳定或瞬时转染、脂质转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，参见用于阳性-阴性选择方法的美国专利号5,464,764和5,487,992。
本领域技术人员将理解，本发明的嵌合体也可以使用上文所述的任何适当的给药方式(即，体内基因治疗)从给药予个体的核酸构建体表达。在一个实施方式中，根据需要通过适当的基因递送媒介物/方法(转染、转导、同源重组等)和表达系统将核酸构建体导入适当的细胞中，然后将修饰的细胞在培养物中扩增并返回到个体(即先体外后体内基因治疗)。
在一个实施方式中，已经在动物模型例如啮齿动物[Bohl et al.，Blood.2000；95：2793-2798]、灵长类动物[Gao et al.，Blood，2004，Volume 103，Number 9]中尝试了使用细胞因子的体内基因治疗并证明在慢性肾功能衰竭患者的人体临床试验中是成功的[Lippin et al Blood 2005，106，Number 7]。
在一个实施方式中，使用植物表达载体。在一个实施方式中，多肽编码序列的表达由许多启动子驱动。在一些实施方式中，使用病毒启动子，比如，例如CaMV的35S RNA和19SRNA启动子[Brisson et al.，Nature 310：511-514(1984)]、或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu et al.，EMBO J.6：307-31l(1987)]。在另一个实施方式中，使用植物启动子，例如，RUBISCO的小亚基[Coruzzi et al.，EMBO J.3：1671-1680(1984)；和Brogli et al.，Science 224：838-843(1984)]或热休克启动子，例如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurleyet al.，Mol.Cell.Biol.6：559-565(1986)]。在一个实施方式中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔和本领域技术人员熟知的其他技术将构建体导入植物细胞中。参见，例如，Weissbach&Weissbach[Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，NY，Section VIII，pp 421-463(1988)]。本领域熟知的其他表达系统如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统也可被本发明使用。
应当理解，除了含有插入的编码序列(编码多肽)的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可以包括改造以优化表达的多肽的稳定性、生产、纯化、产量或活性的序列。
在一些实施方式中，在有效条件下培养转化的细胞，该条件允许表达大量重组多肽。在一些实施方式中，有效培养条件包括但不限于允许蛋白质产生的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施方式中，有效培养基是指培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在一些实施方式中，培养基一般包括具有可同化的碳、氮和磷酸盐源的水溶液，以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养素，例如维生素。在一些实施方式中，本发明的细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和培养皿中培养。在一些实施方式中，在对重组细胞适当的温度、pH和氧含量下进行培养。在一些实施方式中，培养条件在本领域普通技术人员的专业知识范围内。
在一些实施方式中，取决于用于生产的载体和宿主系统，本发明的所得嵌合体保留在重组细胞内、分泌到发酵培养基中、分泌到两个细胞膜之间的空间中，例如大肠杆菌中的周质空间；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。在一个实施方式中，在培养的预定时间后，重组多肽的回收受到影响。
在一个实施方式中，本文使用的短语“回收重组多肽”是指收集含有多肽的完整发酵培养基，并且不需要隐含附加的分离或纯化步骤。
在一个实施方式中，使用多种标准蛋白质纯化技术——比如，但不限于，亲和层析、离子交换层析、过滤、电泳、疏水相互作用层析、凝胶过滤层析、反相层析、刀豆蛋白A层析、聚焦层析和差异溶解——纯化本发明的嵌合体。
在一个实施方式中，为了促进回收，可以改造表达的编码序列以编码本发明的多肽和融合的可剪切部分。在一个实施方式中，可以设计融合蛋白，使得多肽可以通过亲和层析容易地分离；例如，通过固定在对可剪切部分特异的柱上。在一个实施方式中，在多肽和可剪切部分之间改造剪切位点，并且通过用在该位点特异性剪切融合蛋白的适当酶或药剂处理，多肽可以从色谱柱释放[例如，参见Booth et al.，Immunol.Lett.19：65-70(1988)；和Gardella et al.，J.Biol.Chem.265：15854-15859(1990)]。
在一个实施方式中，本发明的嵌合多肽以“基本上纯的”形式回收，其允许在本文所述的应用中有效使用蛋白质。
如本文所用，术语“基本上纯的”描述肽/多肽或其他已与其原生污染物分离的物质。一般，当至少约60至75％的样品表现出单个肽骨架时，单体肽是基本上纯的。次要变体或化学修饰一般共享相同的肽序列。基本上纯的肽可以包含超过约85至90％的肽样品，并且可以超过95％纯度、超过97％纯度或超过约99％纯度。可以在聚丙烯酰胺凝胶上测量纯度，通过染色确定均匀性。可选地，出于某些目的，可能需要高分辨率，并且可以使用HPLC或类似的纯化方法。对于大多数目的，可以使用简单的色谱柱或聚丙烯酰胺凝胶来确定纯度。
术语“纯化的”不要求材料以表现出绝对纯度的形式存在——不包括其他化合物的存在。相反，它是一个相对的定义。在起始材料或天然材料纯化至少一个数量级、2或3、或4或5个数量级之后，肽处于“纯化的”状态。
在一个实施方式中，本发明的嵌合多肽基本上不含天然相关的宿主细胞组分。术语“基本上不含天然相关的宿主细胞组分”描述了从天然宿主细胞状态下伴随肽或其他物质的原生污染物分离的肽或其他物质。因此，在与其天然来源的宿主细胞不同的细胞系统中化学合成或合成的肽将不含其天然相关的宿主细胞组分。
在一个实施方式中，还可以使用体外表达系统合成本发明的多肽。在一个实施方式中，体外合成方法是本领域熟知的，并且该系统的组分是市售的。
药物组合物
根据另一方面，本发明提供药物组合物，其包含作为活性成分的治疗有效量的本发明的嵌合体，和药学上可接受的载剂和/或稀释剂。在一些实施方式中，药物组合物促进化合物向生物体给药。
在另一个实施方式中，本发明的药物组合物可以以本发明嵌合体的药学上可接受的盐或其类似物、或其衍生物的形式配制。在另一个实施方式中，药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的那些盐，比如衍生自无毒无机或有机酸，比如盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐，以及与游离羧基形成的那些盐，比如衍生自无毒无机或有机碱，比如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-(乙氨基)乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
如本文所用，术语“载剂”是指与治疗化合物一起给药的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载剂可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，比如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等、聚乙二醇、甘油、丙二醇、或其他合成溶剂。当静脉内给药药物组合物时，水是优选的载剂。盐溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载剂，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。如果需要，该组合物还可含有少量的润湿剂或乳化剂、或pH缓冲剂，比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；还设想了用于调节张力的药剂，比如氯化钠或葡萄糖。载剂总共可占本文提供的药物组合物的按重量计约0.1％至约99.99999％。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指适当给药于受试者，例如人。例如，术语“药学上可接受的”可以表示由联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出用于动物，尤其是人类。
在另一个实施方式中，本发明的组合物采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、乳膏、软膏、泡沫、糊剂、缓释制剂等的形式。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以与传统的粘合剂和载剂，比如甘油三酯、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶配制成栓剂。口服制剂可包括标准载剂，比如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。适当的药物载剂的实例描述于E.W.Martin的“Remington′s PharmaceuticalSciences”中，其内容通过引用并入本文。这些组合物将包含治疗有效量的本发明嵌合体，优选基本上纯化的形式，以及适当量的载剂，以便为受试者提供合适的给药形式。
根据本发明的一个实施方式，药物组合物包含0.1％-95％的本发明的嵌合多肽(一种或多种)、其衍生物或类似物。根据本发明的另一个实施方式，药物组合物包含1％-70％的嵌合多肽(一种或多种)衍生物或其类似物。根据本发明的另一个实施方式，待给药的组合物或制剂可包含一定量的嵌合多肽(一种或多种)，其衍生物，或类似物，根据本发明的实施方式，其量可有效治疗正在被治疗的受试者的该病况或疾病。
本发明的一个实施方式涉及本发明的嵌合多肽、其衍生物、或类似物，以单位剂型存在并通过药学领域熟知的任何方法制备。在本发明的一个实施方式中，单位剂型是片剂、胶囊、锭剂、薄片、贴剂、安瓿、小瓶或预填充注射器的形式。此外，可任选地使用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确药量还将取决于给药途径、和疾病或病症的性质，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。可从源自体外或体内动物模型测试生物测定或系统的药量-响应曲线外推有效药量。
根据一个实施方式，本发明的组合物以药物组合物的形式给药，所述药物组合物包含本发明的活性组分(嵌合体)中的至少一种和药学上可接受的载剂或稀释剂。在另一个实施方式中，本发明的组合物可以以任何常规的口服、肠胃外或透皮剂型单独或一起给药。
如本文所用，术语“给药(administering或administration)”和类似术语是指在合理的医疗实践中，以提供治疗效果的方式向受试者递送包含活性药剂的组合物的任何方法。
取决于目的组织的位置，本发明的嵌合体可以以适合于将嵌合多肽提供给目的组织内的细胞的任何方式给药。因此，例如，可以将包含本发明的嵌合多肽的组合物导入例如体循环中，所述体循环将肽分布到目的组织中。可选地，可将组合物局部施于目的组织(例如，注射、或作为连续输注泵送、或作为组织内的推注(bolus)、施于皮肤表面的全部或部分等)。
在一些实施方式中，嵌合体和/或包含嵌合体的药物组合物通过口服、直肠、阴道、局部、鼻、眼、透皮、皮下、肌肉内、腹膜内或静脉内给药途径给药。药物组合物的给药途径将取决于待治疗的疾病或病况。适当的给药途径包括但不限于，肠胃外注射、例如皮内、静脉内、肌肉内、病灶内、皮下、鞘内和本领域已知的任何其他注射方式。尽管通过其他途径给药的肽的生物利用度可以低于通过肠胃外注射给药的肽，但是通过使用适当的制剂，可以设想通过透皮、口服、直肠、阴道、局部、鼻、吸入和眼部治疗方式给药本发明的组合物是可能的。此外，有希望通过任何适当的途径导入本发明的药物组合物，包括心室内和鞘内注射；心室内注射可以通过例如附接于储存器的心室内导管来促进。也可以使用肺部给药，例如通过使用吸入器或喷雾器。
对于局部应用，可以将本发明的肽、其衍生物、类似物或片段与药学上可接受的载剂组合，以便基于所需活性递送有效剂量。载剂可以是，例如但不限于，软膏、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫、气溶胶、栓剂、垫或凝胶棒的形式。
对于口服应用，药物组合物可以是片剂或胶囊的形式，其可以包含任何下列成分、或类似性质的化合物：粘合剂，比如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，比如淀粉或乳糖；崩解剂，比如海藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，比如硬脂酸镁；或助流剂，比如胶体二氧化硅。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以包含液体载剂如脂肪油。此外，剂量单位形式可包含各种其他改变剂量单位物理形式的材料，例如糖、虫胶或其他肠溶剂的包衣。本发明的片剂进一步是薄膜包衣的。
出于肠胃外给药的目的，可以使用芝麻油或花生油溶液或丙二醇水溶液，以及相应水溶性盐的无菌水溶液。如果需要，可以适当地缓冲这种水溶液，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内注射。
根据一些实施方式，本发明的肽(例如嵌合体)、其衍生物或类似物可以在控释系统中递送。在另一个实施方式中，输液泵可用于给药肽，比如被使用的肽，例如其用于将胰岛素或化学疗法递送至特定器官或肿瘤。在另一个实施方式中，本发明的肽与可生物降解的、生物相容的聚合物植入物组合给药，聚合物植入物在选定的位点在受控的时间段内释放肽。优选的聚合物材料的实例包括但不限于，聚酸酐、聚原酸酯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯、其共聚物和共混物(参见Medical applications of controlled release，Langer and Wise(eds.)，1974，CRC Pres.，Boca Raton，Fla.，其内容通过引用整体并入本文)。在另一个实施方式中，控释系统可以放置在治疗靶点附近，因此仅需要全身药量的一小部分。
目前描述的肽(例如，嵌合体)、其衍生物或类似物也可以包含在人工产生的结构中，比如脂质体、ISCOMS、缓释颗粒和其他增加血清中肽或多肽的半衰期的媒介物。脂质体包括乳剂、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、薄片状层等。用于目前描述的肽的脂质体由标准的形成囊泡的脂质形成，所述脂质通常包括中性和带负电荷的磷脂和甾醇，比如胆固醇。脂质的选择通常由比如脂质体大小和血液中的稳定性这些考虑因素决定。有多种方法可用于制备脂质体，作为综述，例如，Coligan，J.E.et al，Current Protocols inProtein Science，1999，John Wiley&Sons，Inc.，New York，并且还参见美国专利号4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369。
该组合物还包括将活性物质并入聚合物化合物比如聚乳酸、聚乙醇酸、水凝胶等的颗粒制剂中或其上，或并入脂质体、微乳液、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球上。这些组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
在一个实施方式中，本发明提供组合制剂。在一个实施方式中，“组合制剂”尤其定义“组分试剂盒(kit of parts)”，其意义在于如上定义的组合伙伴可以独立给药或通过使用不同的固定组合与区别量的组合伙伴，即同时地、一致地、分开地或顺序地剂量给药(dosed)。在一些实施方式中，所述组分试剂盒的部分然后可以例如同时给药或按时间顺序交叉，即在不同时间点并且对于组分试剂盒的任何部分具有相同或不同的时间间隔。在一些实施方式中，组合伙伴总量的比率可以在组合制剂中给药。在一个实施方式中，组合制剂可以变化，例如，以便应对待治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要，其中不同的需要可能是由于特定疾病、疾病的严重性、年龄、性别或体重、这些本领域技术人员可以容易地做出。
在一个实施方式中，应当理解，与每种药剂本身的治疗相比，本发明的嵌合体可以与附加的活性剂一起提供给个体，以实现改善的治疗效果。在另一个实施方式中，对组合疗法相关的不良副作用采取措施(例如，剂量给药和选择互补剂)。
在一个实施方式中，取决于待治疗病况的严重程度和响应性，剂量给药可以是单次或多次给药，治疗过程持续数天至数周或直至治愈或疾病情形减少。
在一些实施方式中，用治疗安全有效量的肽(例如嵌合体)进行给药。如本文所用，术语“安全有效量”是指当以目前所述方式使用时足以产生所需治疗响应而没有与合理益处/风险比相应的过度不良副作用(例如毒性、刺激或过敏性响应)的组分的量。在另一个实施方式中，嵌合体的治疗有效量是对于体内可测量的预期生物学效应所必需的嵌合体的量。给药的实际量，给药的速率和时间进程将取决于所治疗病况的性质和严重程度。治疗的处方，例如关于剂量、时间等的决定由全科医生或专科医生负责，并且一般考虑待治疗的病症、个体患者的状况、递送的部位、给药方法和其他对于从业者已知的因素。技术和协议的实例可以在Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.，LippincottWilliams&Wilkins，Philadelphia，Pa.，(2005)中找到。在一些实施方式中，最初可以从体外测定估计有效量或药量的制备。在一个实施方式中，可以在动物模型中配制药量，并且这种信息可以用于更准确地确定人类的有用药量。
在一个实施方式中，本文所述活性成分的毒性和治疗效力可通过在细胞培养物或实验动物中通过体外标准药物程序确定。在一个实施方式中，从这些体外和细胞培养测定和动物研究中获得的数据可用于配制用于人的一系列剂量。在一个实施方式中，剂量根据使用的剂型和所用的给药途径而变化。在一个实施方式中，确切的制剂，给药途径和剂量可以由个体医生根据患者的病况选择。[参见例如，Fingl，et al.，(1975)“ThePharmacological Basis of Therapeutics”，Ch.1p.1]。
包含目前描述的嵌合多肽作为活性成分的药物组合物可根据常规药物复合技术制备。参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th Ed.，Mack PublishingCo.，Easton，Pa.(1990)。还参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，Pa.(2005)。
在一个实施方式中，制备包括在相容的药物载剂中配制的本发明制备物的组合物，将其置于适当的容器中，并标记用于治疗表明的病况。
在一个实施方式中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置中，比如FDA批准的试剂盒，其包含一种或多种含有活性成分的单位剂型。在一个实施方式中，包装例如包括金属或塑料箔，比如泡罩包装。在一个实施方式中，包装或分配器装置随附给药说明。在一个实施方式中，包装或分配器放置在容器中，容器上贴有与容器相关的商品说明，容器为管理药物制造、使用或销售的政府机构规定的形式，商品说明反映组合物或人或兽给药的形式得到了政府批准。在一个实施方式中，这种商品说明是美国食品和药物管理局批准的用于处方药或批准的产品插页的标签。
如本文所用，术语“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何需要诊断，预后或治疗的受试者，特别是哺乳动物受试者，例如，人。
如本文所用，术语“治疗(treatment或treating)”疾病、病症或病况包含减轻其至少一种症状、降低其严重性或抑制其进展。治疗不必意味着疾病、病症或病况完全治愈。为了有效治疗，本文有用的组合物仅需要降低疾病、病症或病况的严重性，降低与其相关的症状的严重性，或者为患者或受试者的生活质量提供改善。
如本文所用，术语“防止(prevention)”疾病、病症或病况包含延迟、防止、抑制或阻碍疾病、病症或病况的发作。如根据目前描述的主题使用的，术语“防止”涉及预防(prophylaxis)的过程，其中受试者在疾病/病症过程的诱导或发作之前暴露于目前描述的肽。这可以在个体具有遗传谱系的情况下进行，该遗传谱系指示要防止疾病/病症发生的倾向。例如，对于其祖先显示出对于某些类型的病症(例如，炎性病症)倾向的个体，这可能是正确的。术语“抑制”用于描述其中疾病/病症过程已经开始，但尚未实现该病况的明显症状的情况。因此，个体的细胞可能患有疾病/病症，但尚未在临床上确认疾病/病症的外部迹象。在任何一种情况下，术语预防都可以应用于包含防止和抑制。相反，术语“治疗”是指活性剂的临床应用，以对抗其临床表现已在患者中实现的已存在病况。
如本文所用，术语“病况”包括与正常相比的解剖学和生理学偏差，其构成活体动物或其一个部分的正常状态的损害，其中断或改变身体功能的表现。
除非另有说明，否则本文所述的任何浓度范围、百分比范围或比率范围应理解为包括该范围内的任何整数的浓度、百分比或比率及其分数，比如整数的十分之一和百分之一。
除非另有说明，否则本文所述的与任何物理特征相关的任何数字范围，比如聚合物亚单元、大小或厚度，应理解为包括所述范围内的任何整数。
组合物的用途
根据一些方面，提供了一种方法，方法包括以下步骤：附接至少一种衍生自SEQ IDNO：1的氨基酸130至199的肽至目的蛋白，其中该肽不含：(a)包含氨基酸1至129的片段，(b)包含氨基酸200至270的片段，从而产生包含目的蛋白的嵌合体。
在一些实施方式中，该方法用于延长目的蛋白的生物学半衰期。在一些实施方式中，该方法用于增加目的蛋白的生物学效应。在一些实施方式中，该方法用于降低目的蛋白的剂量给药频率。在一些实施方式中，该方法用于减少目的蛋白的剂量。在一些实施方式中，该方法用于减少目的蛋白的剂量给药频率、减少目的蛋白的剂量或减少两者。在一些实施方式中，该方法用于增加目的蛋白的顺从性。
在一些实施方式中，本发明提供延长目的蛋白的生物学半衰期的方法，该方法包括步骤：附接至少一种衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的肽至目的蛋白，其中该肽不含：(a)包含氨基酸1至129的片段，(b)包含氨基酸200至270的片段，从而产生包含目的蛋白的嵌合体，其具有与目的蛋白自身(未修饰的目的蛋白)相比延长的生物学半衰期。
在另一个实施方式中，本发明进一步提供了改善目的蛋白的曲线下面积(AUC)的方法，该方法包括步骤：附接至少一种衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的肽至目的蛋白，其中该肽不含：(a)包含氨基酸1至129的片段，(b)包含氨基酸200至270的片段，从而改善目的蛋白的曲线下面积(AUC)。
在一些实施方式中，本发明提供降低目的蛋白的剂量给药频率的方法，该方法包括步骤：附接至少一种衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的肽至目的蛋白，其中该肽不含：(a)包含氨基酸1至129的片段，(b)包含氨基酸200至270的片段，从而降低所述目的蛋白的剂量给药频率。
在另一个实施方式中，本发明进一步提供增加肽疗法的使用顺从性的方法，其包括：向有此需要的受试者提供嵌合体，该嵌合体包含附接于至少一种衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的肽的目的蛋白，其中该肽不含：(a)包含氨基酸1至129的片段，(b)包含氨基酸200至270的片段，从而增加肽疗法的使用顺从性。
根据一些方面，本发明提供治疗或减轻在受试者中可被目的蛋白或包含其的药物制剂治疗或减轻的疾病的方法，该方法包含向受试者给药治疗有效量的嵌合体的步骤，该嵌合体包含目的蛋白和至少一种衍生自NKp44的肽，从而治疗或减轻在受试者中可被目的蛋白治疗或减轻的疾病。
根据另一个实施方式，该方法包含向有此需要的受试者给药有效量的本发明的嵌合体或包含其的药物组合物，其剂量小于使用目的蛋白时所需的剂量，该目的蛋白未通过本发明的教导修饰。如本文所用，术语“剂量(dosage)”是指向有此需要的受试者给药的药量大小、频率和数量。根据另一个实施方式，该方法包含向有此需要的受试者给药有效量的本发明的嵌合体或包含其的药物组合物，其频率低于使用目的蛋白时所需的频率，该目的蛋白未通过本发明的教导修饰。
根据另一个实施方式，该方法包含向有此需要的受试者给药有效量的本发明的嵌合体或包含其的药物组合物，其药量小于当未与本发明肽融合的治疗性目的蛋白给药时所需的药量。如本文所用，术语“药量(dose)”涉及治疗活性剂(例如，本发明的嵌合体)一次给药的数量(quantity)/量(amount)。在另一个实施方式中，提供了本发明的嵌合体或包含嵌合体的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗在有此需要的受试者中可用目的蛋白治疗的病况。
在另一个实施方式中，提供了本发明的嵌合体或包含嵌合体的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于治疗在有此需要的受试者中可用目的蛋白治疗的病况。
在另一个实施方式中，本发明提供了本发明的嵌合体或包含嵌合体的组合物，其用于治疗或减轻有此需要的受试者中可被目的蛋白治疗或减轻的病况。
在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于促进器官移植。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于减轻炎症。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于诱导红细胞生成。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于诱导生长。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于诱导体重增加。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于减轻体重增加。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于癌症治疗，其将容易被本领域普通技术人员理解。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于诱导免疫响应。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于感染病治疗，其将容易被本领域普通技术人员理解。在另一个实施方式中，感染病选自由寄生虫感染、细菌感染、真菌感染和病毒感染组成的组。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于细菌感染治疗。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于病毒感染治疗。在另一个实施方式中，病毒感染由病毒家族的病毒造成，该病毒家族选自由：腺病毒科、乳头瘤病毒科、多瘤病毒科、疱疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科、细小病毒科、星状病毒科、杯状病毒科和微小核糖核酸病毒科、冠状病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、披膜病毒科、砂粒病毒科、布尼亚病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副黏病毒科和弹状病毒科、呼肠孤病毒科、指环病毒科和丁型肝炎病毒组成的组。在另一个实施方式中，本发明的嵌合体用于治疗过敏症，其将容易被本领域普通技术人员理解。
如本文所用，“癌症”或“初癌(pre-malignancy)”是与细胞增殖相关的疾病。非限制性类型的癌症包括癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、胚细胞瘤和生殖细胞肿瘤。在一个实施方式中，癌是指来源于上皮细胞的肿瘤，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌和结肠癌。在一个实施方式中，肉瘤是指来源于间充质细胞的肿瘤，包括但不限于葡萄状肉瘤、软骨肉瘤、尤文氏肉瘤、恶性血管内皮细胞瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤。在一个实施方式中，淋巴瘤是指来源于造血细胞的肿瘤，其离开骨髓并倾向于在淋巴结中成熟，包括但不限于霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤和免疫增殖性疾病。在一个实施方式中，白血病是指来源于造血细胞的肿瘤，其离开骨髓并且倾向于在血液中成熟，包括但不限于急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、急性髓性白血病、慢性髓性白血病、毛细胞白血病、T细胞前淋巴细胞白血病、大颗粒淋巴细胞白血病和成人T细胞白血病。在一个实施方式中，胚细胞瘤是指来源于未成熟前体细胞或胚胎组织的肿瘤，包括但不限于肝母细胞瘤、成神经管细胞瘤、肾胚细胞瘤、成神经细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤。在一个实施方式中，生殖细胞肿瘤是指来源于生殖细胞的肿瘤，包括但不限于生殖细胞瘤或精原细胞瘤生殖细胞瘤(GGCT、SGCT)和非生殖细胞瘤或非精原细胞瘤生殖细胞瘤(NGGCT、NSGCT)。在一个实施方式中，生殖细胞瘤或精原细胞瘤包括但不限于生殖细胞瘤、无性细胞瘤和精原细胞瘤。在一个实施方式中，非生殖细胞瘤或非精原细胞瘤是指纯的和混合的生殖细胞瘤，包括但不限于胚胎癌、内胚窦瘤、绒毛膜癌、泪室癌、多胚胎瘤、性腺母细胞瘤和畸胎癌。
本发明的生长激素的用途
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体包括含有信号肽的构建体。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体包括截短的构建体。包含本发明所教导的生长激素的非限制性示例性嵌合体在SEQ ID NO：16至18中列出。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体通过刺激肝脏和其他组织分泌IGF-I来刺激身体生长。在另一个实施方式中，IGF-I刺激软骨细胞的增殖，导致骨生长。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体诱导对蛋白质、脂质和碳水化合物代谢的代谢作用。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体具有直接效应。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体刺激脂肪代谢。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体通过刺激脂肪细胞中甘油三酯的分解和氧化来刺激脂肪的利用。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体通过诱导IGF-I具有间接效应。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体刺激碳水化合物代谢。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体将血糖维持在正常范围内。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体包含抗胰岛素活性。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体抑制胰岛素刺激外周组织中葡萄糖摄取的能力和增强肝脏中葡萄糖合成的能力。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体刺激胰岛素分泌，引起高胰岛素血症。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体刺激组织中的蛋白质合成代谢。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体刺激氨基酸摄取、增加蛋白质合成和减少蛋白质的氧化。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于补偿受试者中生长激素的有限产生或不产生。在另一个实施方式中，包含如本发明所教导的生长激素的嵌合体补偿生长激素释放激素(GHRH)的有限产生或不产生。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体补偿生长抑素的活性增加。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体补偿饥饿激素的有限产生或不产生。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于治疗与下丘脑、垂体或靶细胞中的损伤相关的疾病。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于治疗与靶细胞对激素的响应降低相关的疾病。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于治疗患有严重生长迟缓的儿童。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于治疗病理性身材矮小的儿童。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于增强运动表现。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于治疗衰老症状。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于治疗衰老的美容症状。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的生长激素的嵌合体用于增强女性受试者的乳汁生成。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的奶牛生长激素的嵌合体用于增强奶牛的产奶量。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的动物生长激素的嵌合体用于动物农业技术。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的家畜动物生长激素的嵌合体用于增强家畜动物——比如但不限于猪——的生长。
本发明绒毛膜促性腺激素的用途
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的绒毛膜促性腺激素(CG)的嵌合体包括包含信号肽的构建体。在另一个实施方式中，包含本发明所教导CG的嵌合体包括截短的构建体。在另一个实施方式中，CG是人绒毛膜促性腺激素(hCG)。包含本发明所教导的hCG的嵌合体的非限制性示例序列在SEQ ID NO：13中列出。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的CG的嵌合体用于补偿受试者中绒毛膜促性腺激素的有限产生或不产生。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的CG的嵌合体用于治疗哺乳动物的不育症。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体用于治疗人类的不育症。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体诱导哺乳动物比如人的月经。在另一个实施方式中，包含如本发明所教导的hCG的嵌合体引发排卵。在另一个实施方式中，包含如本发明所教导的hCG的嵌合体改善卵巢刺激期间的子宫内膜厚度。在另一个实施方式中，包含如本发明所教导的hCG的嵌合体与其他激素如LH和/或FSH联合使用。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体减少了睾酮缺乏的症状。在另一个实施方式中，当与睾酮和/或阿那曲唑给药时，包含本发明所教导的hCG的嵌合体减少睾酮缺乏的症状。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体用于控制或治疗病毒感染。在另一个实施方式中，病毒感染是逆转录病毒感染。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的CG的嵌合体用于控制或治疗人体免疫缺陷病毒(HIV)感染和其他病毒相关的免疫缺陷病症。如本文所用，术语“控制”意指减少、缓解或稳定由病毒引起的感染和/或任何其他现存的有害的病况或副作用。
在另一个实施方式中，包含如本发明所教导的hCG的嵌合体用于治疗和/或缓解神经变性疾病或病况(例如，阿尔茨海默病或其他痴呆、多发性硬化(MS)，精神分裂症，黄斑变性，青光眼，糖尿病视网膜病，周围神经病，亨廷顿舞蹈病，肌萎缩性脊髓侧索硬化症和帕金森氏病，包括例如像脑卒中的脑血管事件的CNS损伤)。如本文所用，术语“治疗和/或缓解”是指减少或完全去除疾病或医学病况的一种或多种症状(包括神经病学症状或行为表现)。当向处于疾病或医学病况风险的人给药时，这种治疗或缓解可包括延迟或消除一种或多种症状的发作。用于治疗或缓解成功的测试在本领域中是公知的。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体诱导对蛋白质、脂质和/或碳水化合物代谢的代谢作用。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体具有直接效应。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体用于治疗II型糖尿病。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体与一种或多种抗糖尿病药(例如胰岛素、α葡糖苷酶抑制剂等)一起用于治疗II型糖尿病。
在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体用于治疗恶性肿瘤。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体用于治疗乳腺癌。在另一个实施方式中，包含本发明所教导的hCG的嵌合体用于治疗乳腺肿瘤。
在讨论中，除非另有说明，否则修饰本发明实施方式的一个特征或多个特征的条件或关系特征的形容词，比如“基本上”和“约”，应理解为表示条件或特征被限定在偏差范围内，该偏差对于预期应用的实施方式的操作是可接受的。除非另有说明，否则说明书和权利要求中的词语“或”被认为是包含性的“或”而不是排他性的“或”，并且表示其连接的项目中的至少一个或任何组合。
应当理解，上文和本文其他地方使用的术语“一”和“一个”是指所列举的组分中的“一个或多个”。除非另外特别说明，否则本领域普通技术人员将清楚，单数的使用包括复数。因此，术语“一”，“一个”和“至少一个”在本申请中可互换使用。
为了更好地理解本教导并且决不限制本教导的范围，除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例以及其他数值的所有数字应理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非表明相反的意思，否则在以下说明书和所附权利要求书中列出的数值参数是近似值，其可以根据试图获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数至少应根据报告的有效数字的数量并通过应用普通的舍入技术来解释。
在本申请的说明书和权利要求书中，每个动词“包含”，“包括”和“具有”及其结合物，用于表明动词的一个或多个对象不一定是组分、要素、或对象部分、或动词的对象的完整列表。
本文所用的其他术语意在由它们在本领域中公知的含义来定义。
在考察以下实施例后，本发明的其它目的、优点和新颖特征对于本领域普通技术人员来说，将变得明显，这些实施例不意图是限制性的。另外，如上文描述的和如下面的权利要求部分中要求保护的本发明的各种实施方式和方面中的每一个在以下实施例中找到实验支持。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以组合形式提供在单个实施方式中。相反，为简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何适当的子组合提供，或者在本发明的任何其他描述的实施方式中适当地提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有那些要素的情况下不起作用。
实施倒
一般地，在本文使用的命名法和在本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学，微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中有详尽的说明。参见，例如，“MolecularCloning：A laboratory Manual”Sambrook et al.，(1989)；“Current Protocols inMolecular Biology”Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson et al.，“Recombinant DNA”，Scientific AmericanBooks，New York；Birren et al.(eds)“Genome Analysis：A Laboratory ManualSeries”，Vols.1-4，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)；方法论，如美国专利号.4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057所示；“CellBiology：A Laboratory Handbook”，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“Cultureof Animal Cells-A Manual of Basic Technique”by Freshney，Wiley-Liss，N.Y(1994)，Third Edition；“Current Protocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites et al.(eds)，“Basic and Clinical Immunology”(8th Edition)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)：Mishell and Shiigi(eds)，“Strategies forProtein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual”CSHLPress(1996)；“Bacteriophage Methods and Protocols”，Volume 1：Isolation，Characterization，and Interactions，所有这些通过引用并入。其他一般参考文献贯穿在本文档中提供。
如上所述和如下面的权利要求书部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中找到实验支持。现在参考以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明本发明的一些实施方式。
材料和方法
hCG-β和hGH变体：用于构建hCG-β-44尾变体(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列和对照变体列于表2和3中。
表2.用于构建hCG-β变体的氨基酸序列。
表3.用于构建hGH变体的氨基酸序列
hGH变体的产生：使用转染药剂(购自Biomiga的GeneTran转染药剂)，用编码嵌合肽变体的质粒瞬时转染悬浮的HEK293F细胞，以便产生分泌的SPA-SPA hGH变体。通过使用快速蛋白质液相色谱(FPLC)从悬浮介质中纯化分泌的SPA-SPA hGH变体。
GH衍生变体的注射和血清纯化：使用5个大鼠组：Biotropin组50ug/ml(2.26uM)、Biotropin组100ug/ml(4.52uM)、SPA-SPA组(2.26uM)、SPA-SPA组(4.52uM)、盐水组(n＝3)。在注射前对大鼠进行称重。接下来，使用异氟烷3％麻醉大鼠，并将0.45ml每种注射变体对大鼠组进行皮下注射(SC)。在实验过程中给大鼠供应水和食物。
血清纯化：从尾部动脉收集450或250微升血液样品到0.5ml蛋白质LoBind管中。将收集的样品在室温(RT)下温育30分钟以允许血液凝结。接下来，血液以3,000g离心5分钟，4℃，将血清转移到新的0.5ml LoBind管中。将血清样品保持在-20℃直至测试。在注射前和注射后2小时、4小时、8小时、12小时和24小时收集血液样品。(注射后2小时和4小时，收集250ul血液。在注射之前和注射后8小时、12小时和24小时，收集450ul血液，因为检测需要更高水平的血清)。
hGH衍生蛋白质的测量：将样品在冰上解冻30分钟，短暂涡旋并在4℃下旋转减慢。接下来，进行稀释以测量血清样品：(稀释样品的最佳体积应至少为200ul)。对于2小时和4小时时间点样品：用稀释缓冲液对血清样品进行1：2稀释。对于0小时、8小时、12小时、24小时和48小时时间点样品，不需要稀释血清样品，因为由于蛋白质的降解，样品需要更浓缩。接下来，使用Immulite 2000装置测量GH水平，并计算每个样品检测的hGH的量。进一步，计算每种注射蛋白质中每个时间点的平均结果。使用从Immulite 2000装置获得的结果计算存在于大鼠血清中的每种注射蛋白质的摩尔数。
例如：第二时间点的Biotropin 2.26uM在血清样品中显示7.09ng/ml的结果：7.09ng-1ml血清。由于大鼠(体重400gr的大鼠中)血液体积约为25.5ml，血清体积为血液体积的～50％-60％，意味着血清体积为～13.5ml。在第一时间点收集～300ul血清，意味着剩下～13.2ml。
血清7.09ng-1ml血清
Xng-13.5ml血清
X＝(7.09ng×13.5ml)/1ml＝95.7ng
在鼠体内的全血清中有95.7ng的hGH。
因为Biotropin MW是22126Da：
22129gr-1mol
22129ngr-1mol
95.7ngr-Xnmol
X＝(95.7ngr×1nmol)/22129ngr＝0.0043nmol＝4.327pmol。
在第二时间点在整个鼠体内有4.327pmol。
基于根据stef7.4计算的摩尔浓度计算注射药量(ug/kg)：
给400gr大鼠注射400ul的74.4ug/ml溶液：
1ml-74.4ug
0.4ml-X
X＝(0.4ml×74.4ug)/1ml＝29.76ug
注射29.76ug到重量为0.4kg，因此：
0.4kg-29.76ug
1kg-X
X＝(1kg×29.76ug)/0.4kg＝74.4ug
对于2.26uM的SPA-SPA，注射药量为74.4ug/kg。
对于4.52uM的SPA-SPA，注射药量为149ug/kg。
药代动力学参数：为了计算药代动力学参数，使用PLSolver(Excel Add-on)。为了更好地理解t1/2是否受注射药量的影响-计算注射药量/t1/2比率。
实施例1
hCG-β和衍生自NKp44的肽的嵌合体表现出延长的血清半衰期
产生附接于衍生自NKp44的肽(hCG-P-44尾变体)的hCG-β的嵌合体，以评价衍生自NKp44的肽对血清半衰期的影响。
与具有strep标记物的hCG-β-WT(SEQ ID NO：10)，和具有strep标记物的hCG-β-ΔCTP(SEQ ID NO：12)相比，评估在大鼠血浆中具有strep标记物的hCG-β-44尾变体(SEQ IDNO：13)的血清半衰期。将不同的蛋白质注射到Sprague Dawley大鼠中。如图1所证明，具有strep标记物的hCG-β-44尾变体证明比具有strep标记物的hCG-β-WT和具有strep标记物的hCG-β-ΔCTP更高的血浆浓度。该结果证明本发明衍生自NKp44的肽的延长hCG-β血清半衰期的能力(图1)。
实施例2
hCG和衍生自NKp44的肽的嵌合体表现出延长的血清半衰期
产生附接于衍生自本发明的NKp44的肽的人生长激素(hGH)的嵌合体，以评价衍生自NKp44的肽对血清半衰期的影响。
为了评价嵌合体是否表现出延长的血清半衰期，不同的蛋白质，带标记物的hGH-WT(SEQ ID NO：20)、hGH-44尾(SEQ ID NO：21)和hGH-44尾-NA(SEQ ID NO：24)，每一个在羧基末端具有组氨酸标记物以允许检测蛋白质，注射进Sprague Dawley大鼠中。如图2所证明，嵌合体证明比野生型hGH(SEQ ID NO：20)更高的血浆浓度。这些结果证明本发明衍生自NKp44的肽的延长hGH血清半衰期的能力(图2A-B)。
实施例3
hGH的SPA-SPA和SPA变体的药代动力学特性
将根据本发明产生的hGH的SPA-SPA变体(SEQ ID NO：27)的药代动力学特性与市售的hGH变体(BiotropinTM)进行比较。组氨酸标记物(SEQ ID NO：7)添加到每个测试变体的羧基末端以允许蛋白质的检测。
给Sprague Dawley大鼠注射2种不同浓度的蛋白质SPA-SPA变体和Biotropin。盐水用作阴性对照。在几个时间点(0、2小时(hr)、4小时、8小时、12小时、24小时和48小时)收集血液并测试血清以检测hGH(图3A)。
注射后，紧接着血液中的Biotropin浓度显示出快速增加，两者的注射浓度在注射后2小时达到峰值浓度。2小时峰值后，Biotropin浓度急剧下降，hGH水平消失。在注射后12小时，Biotropin变得完全检测不到(表4和5，以及图3B-C)。
与Biotropin相比，SPA-SPA变体显示出缓慢和温和的增加。在两个注射组中，在注射后4小时达到hGH浓度的峰值。4小时峰值之后，SPA-SPA变体缓慢降低，但是甚至在注射后48小时，仍然可检测到(表4和5，以及图3B-C)。
进一步的结果证明，注射2.26uM Biotropin的大鼠呈现7.09ng/ml的hGH峰值，而注射4.52uM(两倍)的大鼠呈现21.09ng/ml(比2.26um组的结果高2倍)的峰值。相反，注射2.26uM SPA-SPA变体的大鼠呈现2.39ng/ml的hGH峰值，而注射4.52uM(两倍)的大鼠呈现3.08ng/ml的峰值(比2.26um组的结果高～0.3倍)。血清中低量SPA-SPA变体的一种可能的解释可能是肽的缓慢释放。因此，它缓慢积累直至注射后4小时达到其峰值，然后肽被缓慢清除。
表4.在大鼠血清中检测到的hGH的平均结果(ng/ml)。
时间点(hr)/注射的GH 0 2 4 8 12 24 48
Biotropin 2.26uM 0 7.09 1.64 0.13 0 0 0
Biotropin4.52uM 0 21.09 5.01 0.58 0 0 0
SPA-SPA 2.26uM 0 1.53 2.39 2.12 1.79 1.16 0.13
SPA-SPA 4.52uM 0 2.19 3.08 3.06 2.59 1.49 0.17
盐水 0 0 0 0 0 0 0
表5.在大鼠总血清中的hGH(pmol)。计算基于表4。
时间点(hr)/注射的GH 0 2 4 8 12 24 48
Biotropin 2.26uM 0 4.327 0.979 0.074 0 0 0
Biotropin4.52uM 0 14.155 2.990 0.338 0 0 0
SPA-SPA 2.26uM 0 0.629 0.957 0.830 0.683 0.433 0.048
SPA-SPA 4.52uM 0 0.897 1.235 1.197 0.990 0.555 0.062
结果显示SPA-SPA变体的t1/2高于市售的hGH变体(Bio-tropin)(表6，图4C)，这意味着SPA-SPA肽呈现更慢的消除速率和更好的稳定性，因此，在血流中停留更长。此外，尽管在注射后12小时检测不到Biotropin，但在注射后48小时仍可检测到SPA-SPA变体。表6.基于表5，通过PKSolver分析仪进行的大鼠总血清中hGH变体的药代动力学分析。
此外，进行实验以便测试hGH的单-SPA变体(SEQ ID NO：30)。给Sprague Dawley大鼠注射Biotropin、SPA和SPA-SPA变体。盐水用作阴性对照。在几个时间点(0、2小时、4小时、6小时、24小时、36小时和48小时)收集血液并测试血清以便检测hGH(图5A)。
血液中的Biotropin浓度证明快速增加，其在注射后2小时达到～10.6ng/ml的峰值。注射后4小时呈现hGH水平的急剧下降，并且到注射后24小时hGH水平完全消失(表7和8，以及图5B-C)。SPA变体在注射后2小时(2.6ng/ml)证明血液中较低的浓度峰值，之后hGH减少并到注射后24小时消失(表7和8，以及图5B-C)。SPA-SPA变体显示缓慢和温和增加，并在注射后6小时达到浓度峰值。之后，SPA-SPA变体的水平缓慢下降，并且在注射后48小时仍存在可检测水平的肽(表7、8和图5B-C)。
表7.在大鼠血清中检测到的hGH的平均结果(ng/ml)。
表8.在大鼠总血清中的hGH(pmol)。
进一步，将检测变体的药代动力学参数与Biotropin进行比较。结果证明，Biotropin的Cmax和Tmax高于嵌合肽。相比之下，SPA-SPA变体的t1/2高于其他肽，这意味着SPA-SPA肽在体内保持更长并且呈现更慢的消除速率(表9)。
表9.基于表3的大鼠总血清中hGH变体和Biotropin的药代动力学分析。
t<sub>1/2</sub>(hr) Tmax(hr) Cmax(ng/ml)
Biotropin 1.013 2 10.610
SPA 3.90 2 2.66
SPA-SPA 7.48 4 2.46
实施例4
使用FDC-P1-9D11细胞系测定三种hGH制备物的EC50。
三种hGH变体：APE(200μg/ml)(SEQ ID NO：33)、SPA-SPA(200μg/ml)(SEQ ID NO：27)和SPA(200μg/ml)(SEQ ID NO：30)用于生物测定。首先将每个样品过滤消毒，然后用培养基稀释至50μg/mI。如Solomon et al.，Growth hormone&IGF Research 16(2006)297至307页中所述进行生物测定，其上下文通过引用并入本文。
所提供的3个样品的假定蛋白质浓度为0.2mg/ml。生物测定一式三份进行，仅使用两个96孔板中的60个内孔进行。hGH是市售的重组人垂体生长激素(也称为hGH(PLR)，参见www.plr-ltd.com目录号：GHP-24)，用作对照。结果证明蛋白质APE的活性是hGH的约3分之2，但差异在统计学上是临界的(图6A，表10)。
与hGH相比，蛋白质SPA-SPA活性高～0.2倍，蛋白质SPA活性低～12％，但这些差异无统计上显著性(图6B，表10)。结果显示在图6A和6B中，并总结在表10中。
表10.EC50生物测定结果的总结
*浓度是应用蛋白的浓度；将10μl加入到100μl细胞悬浮液中。
hGH-SPA-SPA(SEQ ID NO：27)、hGH-SPA(SEQ ID NO：30)、hGH-APE(SEQ ID NO：33)的分子量(MW)与PLR的hGH的分子量(MW)不同，(～21.5kDa)。因此，不应该在重量上进行活性比较，而应在分子基础上进行比较。通过使用其分子量和从测定获得的EC50计算每种蛋白的摩尔浓度(M)，使用以下方程式进行校正：
例如：
SPA变体：[18.1/29.43]＝0.62
校正结果如表11所示，表明SPA和SPA-SPA变体比GH参照更有效，因为它们需要更少的分子就能达到它们的EC50(分别为0.62M和0.41M的变体，对照0.74M的参照)。APE变体呈现较低的效力，因为需要更多的分子才能达到其EC50(0.8M)。
表11.基于Mw的计算结果
实施例5
评估人生长激素(hGH)变体对大鼠体重增加的影响
为了评估hGH SPA-SPA变体和Biotropin对大鼠体重增加的影响，进行了体内研究。重量为100克的垂体切除的Sprague Dawley雄性大鼠(大约模拟在5周龄，当它们仍处于潜在生长期时的大鼠)皮下注射(SC)持续10天，用：1)根据标准协议，每日药量为0.12mg/kg的Biotropin，达到总药量为1.2mg/kg(摩尔浓度将基于该值计算)；2)与Biotropin相同摩尔浓度的hGH SPA-SPA变体，每5天注射一次；或3)相同摩尔药量的Biotropin，每5天注射一次。
在第0天、第1天、第2天、第5天、第8天和第11天从每只大鼠取血液样品，并如上所述测试hGH血清水平。另外，在第0天、第1天、第2天、第5天、第8天和第11天对大鼠进行称重，以跟踪生长速率。任选地，在第14、17、21、24、27和30天对大鼠称重以进一步跟踪生长速率。
实施例6
人生长激素(hGH)变体对大鼠体重增加的体内影响
将重量为～90克的垂体切除的Sprague Dawley雄性大鼠(模拟在～5周龄，当它们仍处于潜在生长期时的大鼠)用Zomacton(商品GH)或其他GH变体皮下注射(SC)：APEmidA(SEQ ID NO：59)和SPAmid(SEQ ID NO：57)、AGAA(SEQ ID NO：45)，其剂量为包含与Zomacton 1.8mg/kg相同数量的分子。大鼠每5天治疗一次，持续10天。在研究期间测量体重以便测量GH的影响。
在该测定中，与Zomacton(商品GH)和未处理的对照大鼠相比，测试的变体是APEmidA、SPAmid和AGAA。在测定前几周观察大鼠以确保没有任何体重增加。
根据以下顺序，用GH变体对四组垂体切除的大鼠(～90gr)每5天注射一次：
1)Zomacton注射一总药量为1.8mg/kg。(注射液量(Injection stock)为81.3uM，7.3nmol/90gr大鼠)。
2)APEmidA注射剂包含与第1组中注射的Zomacton相同的摩尔浓度。
3)SPAmid注射剂包含与第1组中注射的Zomacton相同的摩尔浓度。
4)AGAA注射剂包含与第1组中注射的Zomacton相同的摩尔浓度。
另外，一组未治疗的垂体切除的大鼠用作对照。在注射当天、注射后一天和两天以及第10天(研究结束)测量体重。
结果证明，在SPAmid注射组中观察到最高的体重增加-增加9.8％的总体重。APEmidA组总共体重增加5.3％，AGAA组总共体重增加6.2％(图7)。对照组体重减轻了其体重的1.3％(参见对照，图7)。注射Zomacton的组显示体重减轻总计0.5％(参见Zomacton，图7)。这是Zomacton组在这次测试中第一次体重减轻。Zomacton组中的大鼠中的一只(50号)在大多数实验日显示出体重减轻。它在注射后体重立即增加，然而在注射后第二天显示出急剧的体重减轻(～5％)。这可能是由于对Zomacton的高度敏感性-由Zomacton给药引起的急剧的体重增加，以及当Zomacton停止其效应时体重迅速减轻。测试组每组仅由4只大鼠组成，这意味着每只大鼠对该组的平均值具有高度影响。如果从分析中消除该大鼠，则总重量变化为0.7％的增加。重要的是要考虑到每只个体大鼠对注射变体的响应可能不同。因此，这是一种可能的解释。
这些结果对应于PLR测定的结果(未显示)，其呈现SPAmid是最有效的变体(EC50＝～43-59)，APEmidA接近EC50＝～45-76。AGAA具有EC50＝～617-1775的高范围结果。
值得注意的是，当关注SPAmid组时，似乎有两个主要的体重增加组：一组增加其体重的～6％，第二组增加～14％(参见表12)。有趣的是，增加最高百分比的组包含起始体重较低的大鼠(79.7ge与89.4gr相比)。该结果与以下假设相矛盾：与起始体重较低的大鼠相比，具有较高起始体重的大鼠将增加更多的体重。该组中另外两只大鼠呈现出相对接近的体重(81.3gr和81.0gr)，其中一只增加～6％，另一只增加～14％。
表12.每5天注射一次SPAmid变体的垂体切除的大鼠的体重跟踪。
进行进一步的实验以估计APE-APE(SEQ ID NO：42)和SPAmid(SEQ ID NO：57)每种的最佳药量。将体重～90gr的垂体切除的Sprague Dawley雄性大鼠分成3组，每组每5天用APE-APE或SPAmid变体皮下注射(SC)一次，药量包含与0.3mg/kg、0.9mg/kg和1.8mg/kg的商品GH(Zomacton)相同的分子数。将大鼠分开并按以下顺序注射：
1)0.45mg/kg APE-APE注射-包含与0.3mg/kg Zomacton相同的摩尔浓度(注射液量为13.5uM，1.22nmol/90gr大鼠)。
2)1.36mg/kg APE-APE注射-包含与0.9mg/kg Zomacton相同的摩尔浓度(注射液量为40.7uM，3.66nmol/90gr大鼠)。
3)2.7mg/kg APE-APE注射-包含与1.8mg/kg Zomacton相同的摩尔浓度(注射液量为81.3uM，7.3nmol/90gr大鼠)。
1)0.4mg/kg SPAmid注射-包含与0.3mg/kg Zomacton相同的摩尔浓度(注射液量为13.5uM，1.22nmol/90gr大鼠)。
2)1.2mg/kg SPAmid注射-包含与0.9mg/kg Zomacton相同的摩尔浓度(注射液量为40.7uM，3.66nmol/90gr大鼠)。
3)2.4mg/kg SPAmid注射-含有与1.8mg/kg Zomacton相同的摩尔浓度(注射液量为81.3uM，7.3nmol/90gr大鼠)。
在注射当天、注射后一天和两天以及第10天(研究结束)测量体重。
结果(图8A-B)表明，在所有测试组中APE-APE变体引起的体重增加高于SPAmid。具体而言，当大鼠接受最高剂量的GH(分子数等同于1.8mg/kg的Zomacton)时，观察到最高的平均体重增加-APE-APE变体证明10.8％的增加，而SPAmid引起9.9％的体重增加。当注射APE-APE时，第二剂量(等同于0.9mg/kg Zomacton的分子数)引起9.8％的体重增加，当使用SPAmid时引起8.2％的体重增加。最低剂量(包含等同于0.3mg/kg的Zomacton的分子数)在APE-APE组中引起5.9％的增加，在SPAmid组中引起5.2％的增加。
应当注意，在等同于0.9mg/kg和1.8mg/kg的APE-APE变体的组中，通常有两只大鼠呈现较高的体重增加而一只大鼠呈现较低的体重增加。而在SPAmid组中，有两只大鼠体重增加较低，另一只体重增加相对较高。因此，可能的假设是APE-APE组可以增加比平均显示更多的体重，而SPAmid组可以增加更少的体重。由于在每组中只有3只大鼠，假设是不能依靠的，因此需要进行更多的研究。
实施例7
GH对垂体切除的大鼠的影响
垂体切除的Sprague Dawley雄性大鼠，体重为～82gr(模拟年龄为～5周龄，当它们仍处于潜在生长期时的大鼠)用Zomacton(商品GH)同时也用另一种GH变体-SPAmid皮下注射(SC)。SPAmid的总剂量为5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg。Zomacton的总剂量为与SPAmid相似的摩尔比——5mg/kg(即3.76mg/kg)和15mg/kg(即11.28mg/kg)。Zomacton，3.76mg/kg组，每天给药一次，持续9天。而Zomacton 11.28mg/kg组和SPAmid组每5天给药一次。在研究期间测量小鼠的体重以便测量GH的影响。
在SPAmid(5mg/kg)组中，看到体重增加11.9％、在SPAmid(10mg/kg)组中，看到体重增加13.4％、并且在SPAmid(15mg/kg)组中，看到体重增加14.8％。这表明增加药量的SPAmid与体重增加之间存在正相关(图9A-B)。
相反，在Zomacton 3.76mg/kg(等同于5mg/kg SPAmid)组中，在十天的实验期间每天给予注射持续9天，导致体重增加22.3％，在Zomacton 11.28mg/kg(等同于15mg/kgSPAmid)组中，每5天给予注射一次，即在10天实验期间注射两次，导致体重增加7.5％。
这表明Zomacton 11.28mg/kg(等同于15mg/kg SPAmid)组显示的体重增加是同等SPAmid治疗组中引起的增加的一半好(7.5％与14.8)。进一步，似乎每日剂量比在5天内给予GH一次有更强的影响。
实施例8
评估鼠血液中细胞因子变体的耐受性
一些具有治疗潜力的细胞因子有时也是有害的，并且当给药受试者时引出不利的免疫响应。由于这种风险，比如IL-2等细胞因子已显示临床效果不佳。然而，在法定剂量下，一些细胞因子可以提供治疗效果而不引出不利响应。当以低药量给药时，在血液中表现出持久的耐受性的本发明的细胞因子变体可以提供改善的治疗效果。
为了评估本发明的细胞因子嵌合体的药代动力学特征，将三种IL-2变体与Peprotech重组人IL2(rhIL2Mw＝15.51kDa)进行比较。变体命名为“S2S”(Mw＝26.5kDa，SEQID NO：69)、“S2A”(Mw＝26kDa，SEQ ID NO：65)和“A2A”(SEQ ID NO：67)。由于质量比＝～0.58-每个变体分子近似等同于～1.72个rhIL2分子。
体外测定：为了确立S2A在培养中的效应并评估质量与国际单位(IU)比率，使用MTT对CTLL-2衍生细胞系(CTLD)进行活力测试(图10A-B)。将数据拟合成曲线(Michaelis-Menten模型，图10A)，并外推ED50(图10B)。Pep的ED50为0.017且S2A的ED50为0.115。质量比为6.7时，调整质量比ED50为6.7×0.58＝3.9。
比活性定义为
所以其是制造商公告的量(ED50＝0.66，SA＝I×10^7)的近似5.8倍。
其保持与Peprotech的6.7比。
体内试验：为了评估血液中细胞因子的耐受性，用不同药量的细胞因子给鼠注射(SC)，并以设定的间隔取血。分离血清并使用ELISA计算细胞因子水平。根据校准曲线的线性相位的线性回归的斜率计算质量。曲线显示S2S在血液中具有更好的耐受性和/或更慢的释放速率。即使考虑质量比补偿(10ug药量的rhIL2等同于17.24ug的S2S)，S2S的水平也更高且更耐受，这暗示药代动力学和药效学有很大差异(图11)。
对S2A(图12A)和A2A(图12B)进行了类似的实验。根据校准曲线的线性相位的线性回归的斜率计算质量。尤其是，在血浆水平和耐受性方面，S2A和A2A变体都表现出与S2S相似的模式。
尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但显然许多替代、修改和变化对于本领域技术人员而言将变得明显。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这些替代、修改和变化。

Claims (23)

1.一种嵌合体，其包含附接于肽的生长激素，所述肽包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的嵌合体，其中所述生长激素包含SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的嵌合体，其中所述肽附接于选自由：所述生长激素的氨基端，所述生长激素的羧基端、以及所述生长激素的第一和第二亚基之间组成的组的至少一个位置。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合体，其包含选自由：SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：29、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：71组成的组的氨基酸序列。
5.一种肽，其包含衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的20至50个氨基酸残基。
6.根据权利要求5所述的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO：3或4所示的氨基酸序列。
7.一种嵌合体，其包含附接于目的蛋白的根据权利要求5-6中任一项所述的肽。
8.根据权利要求7所述的嵌合体，其中所述目的蛋白具有生物学活性。
9.根据权利要求7所述的嵌合体，其中所述目的蛋白是细胞因子。
10.根据权利要求7所述的嵌合体，其中所述目的蛋白是激素。
11.根据权利要求7所述的嵌合体，其中所述目的蛋白选自由：绒毛膜促性腺激素(CG)和生长激素(GH)组成的组。
12.根据权利要求7所述的嵌合体，其中所述肽附接于选自由：所述目的蛋白的氨基端、所目的蛋白的羧基端、以及所述目的蛋白的第一和第二部分之间组成的组的至少一个位置。
13.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-4、7-12中任一项所述的嵌合体和药学上可接受的载剂。
14.一种多核苷酸，其包含编码根据权利要求5-6中任一项所述的肽或根据权利要求1-4、7-12中任一项所述的嵌合体的核酸序列。
15.一种载体，其包含根据权利要求14所述的多核苷酸。
16.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于在有此需要的受试者中治疗或减轻通过所述目的蛋白可治疗的病况。
17.一种延长目的蛋白的生物学半衰期的方法，其包括以下步骤：通过附接至少一种包含衍生自SEQ ID NO：1的氨基酸130至199的20至70个氨基酸残基的肽至目的蛋白而提供嵌合体，从而延长目的蛋白的生物学半衰期。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽包含选自由：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5组成的组的氨基酸序列。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述延长目的蛋白的生物学半衰期导致以下之一：降低剂量给药频率、和减少目的蛋白的剂量。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述延长目的蛋白的生物学半衰期导致在所述目的蛋白的使用中顺从性增加。
21.一种治疗或减轻通过目的蛋白可治疗的病况的方法，其包含向受试者给药治疗有效量的根据权利要求1-4、7-12中任一项所述的嵌合体的步骤。
22.根据权利要求17-21中任一项所述的方法，其中所述目的蛋白选自由CG和GH组成的组。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述通过目的蛋白可治疗的病况是通过选自CG和GH的激素可治疗的病况。
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