ES2327773T3 - Seleccion de peptidos que unhiben la union de pp1c a proteinas bcl-2, bcl-xl y bcl-w. - Google Patents

Seleccion de peptidos que unhiben la union de pp1c a proteinas bcl-2, bcl-xl y bcl-w. Download PDF

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Abstract

Conjunto de polipéptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 en el mismo polipéptido o M1 en un polipéptido y M2 en el otro polipéptido, en el que M1 y M2 son secuencias de unión a PP1 de mamífero, en el que M1 es RRNFVNKLKPL y M2 es NQAKKRVVFADSTVKVKNVSFEKK o M1 es LDFRNRLQTN y M2 es KKVKKRVS FAND o M1 es RHFVNKLKPLKS y M2 es NQAKKRVVFADS o M1 es TCFRPRLRGS y M2 es SQKKKRWFADM o M1 es GEVFINKGKGF y M2 es RGRQLRVRFATH o M1 es QVKFRRRREG y M2 es YFKRYQVKFRRR o M1 es EDFKAKKKEL y M2 es RITPSYVAFTPE o M1 es SVFMQRLKTNILQ y M2 es IDEVKNVYFKNFVLKVS WITFLLA o M1 es LQFELRYRPV y M2 es TTKAVMFAK o M1 es DLFENRKKKN y M2 es VRRVFIM o M1 es FFKNEKMLY y M2 es RRGSPRVRFEDG o M1 es RRNFVNKLKPL y M2 es TVKVKNVSFEKK.

Description

Selección de péptidos que inhiben la unión de PP1c a proteínas Bcl-2, Bcl-x_{L} y Bcl-w.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere a métodos para identificar polipéptidos y proteínas novedosos que interaccionan con PP1, a compuestos que pueden inhibir la unión de PP1c a determinados factores que interaccionan de manera natural con la misma, especialmente a proteínas de la familia Bcl-2 (tales como Bcl-x_{L} y Bcl-w), y a composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos.
Técnica anterior
Las serina/treonina fosfatasas se clasifican como de tipo 1 (PP1) o de tipo 2 (PP2), dependiendo de su especificidad de sustrato y su sensibilidad frente a inhibidores. PP1 regula la evolución, proliferación y transcripción del ciclo celular, la síntesis de proteínas, la citocinesis y la señalización neuronal (Mc Avoy et al, 2001). PP1 se regula mediante su interacción con una variedad de subunidades de proteína que dirigen la subunidad catalítica (PP1c) hacia compartimentos subcelulares específicos y determina su localización, actividad y selectividad de sustrato (Bollen et al, 2001). PP1 puede regularse mediante la interacción entre una subunidad catalítica y múltiples subunidades de selección como diana que permiten la desfosforilación específica de diversas dianas celulares. El número de subunidades de selección como diana de PP1c conocidas está creciendo continuamente y hasta la fecha se han identificado ya casi treinta proteínas de mamífero únicas. Las proteínas que interaccionan con PP1 incluyen las subunidades de unión a glucógeno, RGL/GM, GL, PTG/R5/U5 y R6 que dirigen la fosfatasa hacia el glucógeno, las unidades de asociación a miosina, M110, NIPP-1, p99/PNUTS y Sds22, que pueden dirigir la fosfatasa hacia el núcleo (Bollen, 2001). Estudios previos basados en análisis estructural y de cristalografía de rayos X de proteínas que interaccionan con PP1 indicaron que PP1c se une a distintas proteínas de interacción conocidas a través de una secuencia de aminoácidos corta. Los motivos [RK]VxF (o [RK]xVxF) representan una secuencia consenso extendida para el reconocimiento y la unión de distintas subunidades reguladoras y proteínas de interacción con PP1c (Egloff et al, 1997; Aggen et al, 2000).
Usando una línea de células T murinas que puede propagarse independientemente en presencia de IL-2 o IL-4 (Pitton et al, 1993), los inventores han descrito que PP1c es una fosfatasa activada por Ras que desfosforila Bad (un miembro proapoptótico de la familia de proteínas Bcl-2) antes de inducir la apoptosis en respuesta a la privación de IL-2 (Ayllón et al, 2000). Mediante la realización de estudios competitivos bioquímicos, los inventores también identificaron recientemente Bcl-2 como una nueva subunidad de selección como diana de Epic que controla su asociación a Bad en células estimuladas con IL-2 (Ayllón et al, 2001).
Las proteínas de la familia Bcl-2 actúan como punto de control intracelular en la ruta apoptótica. La familia de proteínas Bcl-2 se divide en dos grupos funcionales: miembros antiapoptóticos tales como Bcl-2, Bcl-x_{L}, Bcl-w, A1 y Mcl-1, y miembros proapoptóticos tales como Bax, Bak, Bcl-x_{S} así como el miembro "sólo BH3" ("BH3-only") Bad (White, 1996; Reed, 1998; Chao y Korsmeyer, 1998). El equilibrio entre los homo y heterodímeros de los miembros de la familia Bcl-2 puede ser crítico para mantener la apoptosis o proliferación celular (Jacobson, 1997; Korsmeyer, 1999; Gross et al, 1999). La regulación por incremento o por disminución de estas proteínas puede explicar la supervivencia de algunos tipos de células, aunque es posible también que los factores de supervivencia usen proteína cinasas o fosfatasas para alterar la capacidad de estas proteínas para promover la apoptosis o supervivencia celular. Los miembros antiapoptóticos de la familia Bcl-2 interaccionan con otros agonistas de muerte de la familia Bcl-2 y con proteínas distintas de la familia Bcl-2, incluyendo R-Ras, H-Ras, Raf, caspasas, calcineurina y la serina/treonina fosfatasa PP1c (Rebollo et al, 1999; Ayllón et al, 2001). Se ha definido la familia Bcl-2 mediante homología de secuencia basándose en motivos conservados específicos denominados regiones de homología con Bcl (dominios BH1, BH2, BH3 y BH4). Los dominios BH1, BH2 y BH3 han demostrado ser importantes en la homodimerización o la hetero-
dimerización y en la modulación de la apoptosis. Las moléculas antiapoptóticas tienen un dominio BH4 específico.
Bad comparte identidad sólo en el dominio BH3 (Zha et al, 1997) y forma heterodímeros con Bcl-2 y Bcl-x (Ottilie et al, 1997). Tras la estimulación de células con IL-3, NGF y GM-CSF, Bad pasa a estar fosforilado en serinas (Del Peso et al, 1997; Datta et al, 1997), dando como resultado la asociación a la proteína 14-3-3 y suprimiendo la interacción con Bcl-x (Hsu et al, 1997). Se ha demostrado recientemente que la asociación de la proteína 14-3-3 a Bad depende de la fosforilación de la serina 155 de Bad (Datta et al, 2000; Zhou et al, 2000).
Bcl-w es una proteína pro-supervivencia que porta los cuatro dominios conservados de homología con Bcl-2 (BH) (Gibson et al, 1996). La expresión forzosa de Bcl-w, como Bcl-2, hace que las líneas de células linfoides y mieloides sean resistentes a la apoptosis inducida por la privación de citocinas. La molécula antiapoptótica Bcl-x_{L} también contiene los cuatro dominios conservados BH (Núñez et al, 1994). Una segunda isoforma de Bcl-x, Bcl-x_{S}, codifica para una proteína más pequeña de 170 aminoácidos que potencia la apoptosis (Minn et al, 1996). Bcl-x_{L} contiene un segmento hidrófobo en el extremo C-terminal que se cree que sirve como anclaje de membrana (Boise et al, 1993).
La apoptosis o muerte celular programada es un proceso activo en el que las células inducen su autodestrucción en respuesta a señales de muerte celular específicas o en ausencia de señales de supervivencia celular. Este proceso activo es realmente esencial en el desarrollo normal y la homeostasis de organismos multicelulares. Es opuesto a la necrosis, que es la muerte celular que se produce como resultado de cambios perjudiciales graves en el entorno.
Se producen diversas patologías debido a la regulación defectuosa o aberrante de la apoptosis en las células afectadas de un organismo. Por ejemplo, defectos que dan como resultado una disminución del nivel de apoptosis en un tejido en comparación con el nivel normal requerido para mantener el estado estacionario del tejido puede promover un aumento anómalo de la cantidad de células en un tejido. Esto se ha observado en diversos cánceres, en los que la formación de tumores se produce porque las células no mueren a su tasa normal. Algunos virus de ADN tales como el virus de Epstein-Barr, virus de la fiebre porcina africana y adenovirus, también inhiben o modulan la apoptosis, reprimiendo de ese modo la muerte celular y permitiendo que la célula huésped continúe reproduciendo el virus.
Por el contrario, un defecto que da como resultado un aumento de la muerte celular en un tejido puede estar asociado a trastornos degenerativos en los que las células mueren a una tasa superior a la que se regeneran. Esto se observa en diversos trastornos, tales como SIDA, senescencia y enfermedades neurodegenerativas.
Compuestos que modulan de manera positiva o negativa la apoptosis pueden proporcionar medios para el tratamiento o la prevención de estos trastornos. Como consecuencia, la descripción de rutas apoptóticas proporciona dianas para el desarrollo de agentes terapéuticos que pueden usarse para modular la respuesta de una célula frente a señales apoptóticas o de supervivencia celular.
Los resultados dados a conocer en la presente invención indican que los miembros antiapoptóticos de la familia Bcl-2, Bcl-w y Bcl-x_{L} también son subunidades de selección como diana de PP1c en células estimuladas con IL-4. Esta observación ofrece una vía para un mecanismo general de regulación novedoso de la apoptosis celular que puede desempeñar un papel en la regulación de moléculas pro o antiapoptóticas en respuesta a señales de muerte celular o supervivencia celular. Por tanto, la invención es de particular importancia en los campos del tratamiento de cáncer y el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
De manera más general, la presente invención proporciona medios para modular la interacción entre PP1 y las proteínas o los polipéptidos que se unen a la misma. Por tanto, la presente invención tiene aplicaciones en una amplia gama de campos, puesto que PP1 está implicada en muchas rutas biológicas. Por ejemplo, se sabe que una reducción en la fosforilación del complejo PP1 activa las cadenas ligeras de miosina del músculo liso y por tanto relaja los músculos lisos (véase, Uehata et al., 1997). Por tanto, la hipertensión podría ser una diana de la presente invención.
PP1 es una proteína serina/treonina fosfatasa eucariota principal que regula diversos procesos celulares tales como el ciclo celular, la transcripción y la síntesis de proteínas.
La regulación de PP1 también puede efectuar la regulación por disminución de la síntesis de glucógeno hepático que a su vez reduciría los niveles de glucosa en sangre y por tanto trataría la diabetes en la que la hiperglucemia es un problema grave.
Además, PP1 está implicada en varias infecciones bacterianas, virales y parasitarias, e inhibir su interacción con algunos de sus parejas en un contexto infeccioso podría ser beneficioso para el paciente.
Sumario de la invención
Por tanto, la presente invención se refiere a un conjunto de polipéptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 en el mismo polipéptido o M1 en un polipéptido y M2 en el otro polipéptido, en el que M1 y M2 son secuencias de unión a PP1 de mamífero, en el que M1 es RRNFVNKLKPL y M2 es NQAKKRVVFADSTVKVKNVSFEKK o M1 es LDFRNRLQTN y M2 es KKVKKRVSFAND o M1 es RHFVNKLKPLKS y M2 es NQAKKRVVFADS o M1 es TCFRPRLRGS y M2 es SQKKKRVVFADM o M1 es GEVFINKGKGF y M2 es RGRQLRVRFATH o M1 es QVKFRRRREG y M2 es YFKRYQVKFRRR o M1 es EDFKAKKKEL y M2 es RITPSYVAFTPE o M1 es SVFMQRLKTNILQ y M2 es IDEVKNVYFKNFVLKVSWITFLLA o M1 es LQFELRYRPV y M2 es TTKAVMFAK o M1 es DLFENRKKKN y M2 es VRRVFIM o M1 es FFKNEKMLY y M2 es RRGSPRVRFEDG.
Por tanto, la presente descripción se refiere a un péptido o un conjunto de péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bad/PP1c, en el que el motivo M1 tiene la secuencia FXX[RK]X[RK] (SEQ ID NO:5) y el motivo M2 tiene la secuencia [RK]VX[FW] o [RK]XVX[FW] (SEQ ID NO: 1 ó 2) siendo X cualquier aminoácido.
En otra realización, la presente invención se refiere a un conjunto de péptidos que comprende los péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID NO:6) y F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID NO:7) se describe.
Aún en otra realización con respecto a una composición farmacéutica que comprende un conjunto de péptidos tal como se describió anteriormente que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c. Una composición de este tipo puede comprender, por ejemplo, los péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID NO:6) y F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID NO:7). También pueden usarse péptidos con aminoácidos modificados (glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación o derivación mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos) en las composiciones según la invención. Aún en otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para un conjunto de péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 tal como se describió anteriormente.
En otra realización, la presente invención se refiere a un método de identificación de un polipéptido o una proteína que interacciona con PP1, que comprende detectar en la secuencia de un polipéptido o una proteína, la presencia de dos motivos M y M2 de unión a PP1.
Aún en otra realización, la presente invención da a conocer un método de selección de compuestos que interaccionan con reguladores de PP1, en el que los péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 tal como la descripción anterior y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c, se inmovilizan sobre un soporte y se somete a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos péptidos.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a un método de selección de compuestos que interaccionan con PP1. Este método comprende obtener anticuerpos frente a péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 tal como se describió anteriormente y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c, y someter a prueba la interacción de dicho compuesto con dichos anticuerpos.
En otra realización, la presente invención se refiere a un método para inhibir in vitro la interacción entre PP1c y Bcl-x_{L} o Bcl-w, que comprende una etapa de añadir un conjunto de péptidos que imitan tanto a M1 como a M2 tal como se describió anteriormente.
En los métodos anteriores, los péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir la interacción Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c pueden ser por ejemplo los péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID NO:6) y F (GDEFELRYRRAF) SEQ ID NO:7 o el conjunto de péptidos mencionado anteriormente.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a un kit que comprende péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c. Un kit de este tipo puede comprender, por ejemplo, o el conjunto de péptidos mencionado anteriormente, los péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID NO:6) y F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID NO:7). Estos péptidos pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a un kit que contiene anticuerpos frente a péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c. Dichos anticuerpos pueden producirse por ejemplo contra los péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID NO:6) y F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID NO:7) o el conjunto de péptidos mencionado anteriormente.
Aún en otro aspecto, la presente invención puede ser útil como método para tratar un animal que tiene diabetes o hipertensión o un trastorno neurológico o una infección viral o una infección parasitaria, que comprende administrar a un animal que necesita tal tratamiento un conjunto de péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c tal como se describió anteriormente.
En los métodos anteriores, pueden administrarse por ejemplo los péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID NO:6) y F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID NO:7).
En otra realización, la presente invención se refiere al uso del conjunto de péptidos tal como se describió anteriormente que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c, para tratar diabetes o hipertensión o trastornos neurológicos o una infección viral o una infección parasitaria.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere al uso del conjunto de péptidos tal como se describió anteriormente que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1, para la preparación de un medicamento para tratar diabetes o hipertensión o trastornos neurológicos o una infección viral o una enfermedad parasitaria.
Breve descripción de los dibujos Figura 1 Asociación de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c y Bad
(A)
Se inmunoprecipitaron extractos citoplásmaticos de células privadas de o estimuladas con IL-4 (60 U/ml) con anticuerpo anti-Bcl-x_{L} o anti-Bcl-w, se transfirieron a nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia con anticuerpo anti-Bad, anti-PP1c, anti-Bcl-x_{L} y anti-Bcl-w. Se detectaron bandas de proteína usando el sistema ECL. Se muestran los pesos moleculares de las correspondientes proteínas. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes. B) Se inmumoprecipitaron extractos citoplásmaticos de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo anti-cadena p55 de IL-2R, se transfirieron a nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia con anticuerpos anti-Bcl-w, Bcl-x_{L} o anti-IL-2R de p55. Se detectaron bandas de proteína usando el sistema ECL. C) Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de timocitos recién aislados con anti-Bad, anti-PP1c o un suero irrelevante y se realizó la inmunotransferencia con anti-Bcl-2, anti-Bcl-x_{L}, anti-Bad y anti-PP1c. Se detectaron proteínas tal como en A. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
\global\parskip0.990000\baselineskip
Figura 2 Efecto de la privación de IL-4 sobre la expresión de Bad, PP1c, Bcl-x_{L} y Bcl-w
A)
Se estimularon con o se privaron de IL-4 células Ts1\alpha\beta durante los tiempos indicados, luego se lisaron. Se transfirieron las proteínas a nitrocelulosa y se detectaron con sondas con anticuerpos anti-Bcl-x_{L}, anti-Bcl-w, anti-Bad y anti-PP1c. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes.
B)
Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de células estimuladas con o privadas durante 24 horas de IL-4 con anti-Bcl-x_{L} o anti-Bcl-w, se separaron en un gel de SDS-PAGE en gradiente y se realizó la inmunotransferencia con anti-Pser, anti-Bad, anti-PP1c y, como control interno, con anti-Bcl-x_{L} y anti-Bcl-w. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
C)
Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de células estimuladas con o privadas de IL-4 (1 x 10^{7}) control con anticuerpo anti-Bad y se realizó la inmunotransferencia con serina 112, serina 136 y serina 155 de anti-Bad. Como control interno, se desarrolló la inmunotransferencia con anticuerpo anti-Bad. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. Control positivo para la fosforilación de la serina 112 y 136 de Bad, células estimuladas con IL-2 (carril C); control positivo para la fosforilación de la serina 155 de Bad, células COS transfectadas con Bad (carril C).
D)
Se inmunoprecipitaron extractos totales (T) de lisados citoplásmaticos de células estimuladas con o privadas de IL-4 (1 x 10^{7}) con anticuerpo anti-PP1c, anti-Raf, anti-Bcl-x_{L} o anti-Bad y se realizó la inmunotransferencia con anti-14-3-3, anti-PP1c, anti-Bcl-x_{L} y anti-Bad. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 3 Estimación de la actividad serina/treonina fosfatasa en inmunoprecipitados de Bcl-x, Bad y Bcl-w tratados con AO o control
A)
Se estimó la actividad fosfatasa en inmunoprecipitados de Bad, Bcl-x_{L} y Bcl-w de células estimuladas con IL-4 usando ^{32}P-fosforilasa a como sustrato.
B)
Se añadieron concentraciones diferentes de AO a inmunoprecipitados de Bad o Bcl-w de células estimuladas con IL-4. Se estimó la actividad fosfatasa usando ^{32}P-fosforilasa a como sustrato. La reacción fue tal como en A. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes. La actividad fosfatasa se representa como el porcentaje de la actividad máxima en sobrenadantes sin tratar.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 4 Estimación de la actividad serina/treonina fosfatasa tras la reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w
A)
Se redujeron Bcl-x_{L} y Bcl-w de lisados citoplásmaticos de células estimuladas con IL-4 mediante cuatro inmunoprecipitaciones secuenciales. Se estimó la actividad fosfatasa en inmunoprecipitados de Bad de células estimuladas con IL-4 control o en inmunoprecipitados de Bad con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w tras cuatro inmunoprecipitaciones secuenciales. La actividad fosfatasa se representa como el porcentaje de la actividad máxima detectada en inmunoprecipitados de anti-Bad control.
B)
Se analizó el efecto de la reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w sobre la asociación PP1c/Bad. Se inmunoprecipitaron extractos citoplásmaticos de células estimuladas con IL-4 control o extractos citoplásmaticos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w con anticuerpo anti-Bad o anti-PP1c y se realizó la inmunotransferencia con anti-Bad, anti-Bcl-w, anti-Bcl-x_{L} y anti-PP1c. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes. Se detectaron bandas de proteínas usando el sistema ECL.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 5 Ensayo de unión a PP1c sobre péptidos Bcl-x_{L} o Bcl-w unidos a celulosa
A)
Secuencia del motivo F X X R X R de Bcl-2, Bcl-x_{L} y Bcl-w. B)
\quad
La figura 5a contiene las siguientes secuencias:
\quad
FSRRYR (SEQ ID NO:5), \hskip1cm FTARGR (SEQ ID NO:5)
\quad
FELRYR (SEQ ID NO:5), \hskip1cm FETRFR (SEQ ID NO:5')
\global\parskip1.000000\baselineskip
\quad
Se incubó una membrana con péptidos Bcl-x_{L} o Bcl-w que contenían el motivo R/K X V/I X F o F X X R X R, así como péptidos que contenían motivos mutados, con PP1c purificada, seguido por anticuerpo anti-PP1c y anticuerpo secundario conjugado con PO. Se detectaron puntos usando el sistema ECL. Los motivos R/K X V/I X F y F X X R X R están en negrita. Los aminoácidos mutados dentro del motivo están en negrita y subrayados. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. El péptido 1 corresponde al motivo de unión a PP1 de Bcl-x_{L} y Bcl-w. El péptido 2 corresponde al sitio de unión a PP1 mutado en el que los residuos V y F se mutaron para dar A.
\quad
La figura 5b contiene las siguientes secuencias:
NWGRIVAFFSFG
(seq ID Nº:6),
NWGRIAAAFSFG
(seq ID Nº:51),
GDEFELRYRRAF
(seq ID Nº:7),
GDEGELGYGRAF
(seq ID Nº:53),
GDESELSYSRAF
(seq ID Nº:54),
GDEFELGYGRAF
(seq ID Nº:55),
GDEFELSYSRAF
(seq ID Nº:56),
GDEGELRYRRAF
(seq ID Nº:57),
GDESELRYRRAF
(seq ID Nº:58),
GDEGELGYRRAF
(seq ID Nº:59),
GDESELSYRRAF
(seq ID Nº:60),
PNWGRLVAFFVFG
(seq ID Nº:61),
PNWGRLAAAFVFG
(seq ID Nº:62),
GDEFETRFRRTFS
(seq ID Nº:63),
GDEGETGFGRTFS
(seq ID Nº:64),
GDEFETGFGRTFS
(seq ID Nº:65),
GDEFETRFGRTFS
(seq ID Nº:66),
GDEGETGFRRTFS
(seq ID Nº:67),
GDEGETRFRRTFS
(seq ID Nº:68).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 6 Efecto de los péptidos R, R*, F y R+F sobre la interacción Bcl-x_{L}/PP1c/Bad y Bcl-w/PP1c/Bad
A)
Se inmunoprecipitaron extractos citoplásmaticos de células estimuladas con IL-4 control con anticuerpo anti-Bad. Se hizo competir la interacción Bcl-x_{L}/PP1c/Bad y Bcl-w/PP1c/Bad con 1,5 mM de péptidos R, R*, F o R+F durante 30 min. a temperatura ambiente. Se lavaron los inmunoprecipitados, se transfirieron a nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia con anti-Bad, anti-PP1c, anti-Bcl-x_{L} y anti-Bcl-w. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. Para la secuencia de péptidos, véase Materiales y Métodos o las figuras 5A y 5B.
B)
Se inmunoprecipitaron lisados citoplásmaticos de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo anti-Bad. Se trataron los inmunoprecipitados con 1,5 mM de péptidos R, R*, F o R+F durante 30 min. a temperatura ambiente. Se lavaron los inmunoprecipitados y se estimó la actividad fosfatasa usando ^{32}P-fosforilasa a como sustrato. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes.
C)
Se inmunoprecipitaron lisados citoplásmaticos de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo anti-Bad y luego se trataron con 1,5 mM de péptido R+F o 3 mM de péptido R o F (30 min., temperatura ambiente). Se lavaron los inmunoprecipitados y se estimó la actividad fosfatasa tal como en B.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 7 Efecto de AO y oligonucleótidos antisentido sobre la apoptosis y fosforilación de la serina 136 de Bad
A)
Se trataron las células con o sin AO 1 \muM en presencia o ausencia de IL-4. Se inmunoprecipitaron los lisados citoplásmaticos con anticuerpo anti-Bad, se transfirieron a nitrocelulosa y se detectaron con sondas con fosfo-Bad ser 136 y anti-Bad, siendo el último para verificar que el tratamiento con AO in vivo no afecta a la expresión de Bad. Se detectaron bandas de proteínas usando ECL.
B)
Se trataron células durante 6 h con o sin AO 1 \muM en presencia o ausencia de IL-4 y luego se lavaron, se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron mediante citometría de flujo.
C)
Se trataron células durante 24 h con o sin oligonucleótido sentido o antisentido 15 \muM en presencia o ausencia de IL-4. Se añadieron oligonucleótidos a las 0, 12 y 18 h y luego se lavaron las células, se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron mediante citometría de flujo. Se analizó la expresión de Bcl-x_{L} y Bcl-w tras el tratamiento sentido y antisentido mediante inmunotransferencia de tipo Western.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 8
A)
Dos supuestos motivos de unión a PP1 en proteínas Bcl-2.
\quad
Alineación de secuencias en las proximidades del dominio BH1 y BH3 de algunas proteínas Bcl-2. Estas secuencias están perfectamente conservadas en diversas especies (seres humanos, ratones, ratas, bovinos...).
\quad
La figura 8a contiene las siguientes secuencias:
VKQALREAGDFELRYRRAFSDTS
(seq ID Nº:69),
ELFRDGVNWGRIVAFFSFGGAL
(seq ID Nº:70),
RAAGDEFETRRRTFSDLAAQLHV
(seq ID Nº:71),
ELFQGGPNWGRLVAFFVGA
(seq ID Nº:72),
HTLRQAGDDFSRRYRRDFAEMSSQ
(seq ID Nº:73),
ELFRDGVNWGRIVAFFEFGG
(seq ID Nº:74),
FRGRSRSAPPNLWAAQRYGRELRRMSDEEF
(seq ID Nº:75),
FRGRSR
{}\hskip-2,4cm (un fragmento de seq ID Nº75),
RSRSSAP
(seq ID Nº:77).
\vskip1.000000\baselineskip
B)
Un papel para la fosforilación de la serina en la unión a PP1.
\quad
Se sintetizaron seis péptidos y se unieron covalentemente a una membrana de celulosa antes de analizarse para detectar la unión a PP1 tal como se describió. Se introdujo una mutación de AA puntual en Ser-136 en 4 péptidos (mutantes 2, 3, 5, 6).
\quad
La figura 8b contiene las siguientes secuencias:
``EEELSFRGRSRSA
(seq ID Nº:78),
EEELEFRGRSRSA
(seq ID Nº:79),
EEELGFRGRSRSA
(seq ID Nº:80),
RQAGDDFSRRYR
(seq ID Nº:81),
RQAGDDFERRYR
(seq ID Nº:82),
RQAGDDFGRRYR
(seq ID Nº:83)''.
\newpage
C)
Asociación de P13-K p85 (carril 1), P13-K p110 (carril 2), HSP70, (carril 3) y CD4 (carril 4) a PP1c.
\quad
Se usaron células TS1\alpha\beta tratadas con IL-4 (1 x 10^{7}) para la inmunoprecipitación tal como se describe normalmente. Se transfirieron los inmunoprecipitados a nitrocelulosa, se bloquearon y se incubaron con anticuerpo primario anti-PP1c. Se lavó la membrana y se incubó con anticuerpo secundario conjugado con PO y se desarrollaron las proteínas usando ECL.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 9
Histograma para ilustrar el número de proteínas y el número de aminoácidos que separan los motivos F-xx-[RK]-x-[RK] y [RK]-V-x-[FW]/[RK]-x-V-x-[FW](A)[RK]-V-x-F/[RK]-x-V-x-F (B).
\vskip1.000000\baselineskip
Realizaciones preferidas de la invención
Los siguientes términos se usan a lo largo del resto de la memoria descriptiva y las reivindicaciones y debe entenderse que significan, aparte de la definición genérica, la siguiente definición más precisa; entendiéndose que la definición genérica también se incluye.
Tal como se usa en el presente documento, la palabra "imitar" se refiere a un parecido cercano o bien en estructura y/o bien en función.
Tal como se usa en el presente documento, la palabra "aislado" significa tomado del entorno natural. Aislado no significa necesariamente que lo que se toma del entorno natural se purifica al 100%.
Tal como se usa en el presente documento, la expresión "prueba bioquímica" significa cualquier prueba que puede identificar un polipéptido o una proteína de interacción. Los ejemplos de pruebas bioquímicas incluyen, pero no se limitan a, inmunoprecipitación, uso de anticuerpos, ya sean monoclonales o policlonales, sondas de oligonucleótidos que pueden marcarse con radioactividad o una enzima, disminución de GST (experimento de filtración en gel que revela el tamaño de complejos macromoleculares) tal como se describió en Ayllón et al EMBO J. 19 2237-2246(2000), y similares.
Tal como se usa en el presente documento, el término "motivo" se refiere a una secuencia o secuencias de aminoácidos particulares que son similares y tienen la misma función en diferentes entornos celulares. Un motivo tiene algunos aminoácidos fijos y otros variables.
Tal como se usa en el presente documento y durante toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, cuando varios aminoácidos están entre corchetes, esto significa que el aminoácido dentro de los corchetes puede ser uno u otro. Por tanto, [RK] significa que el motivo puede tener o bien R o bien K.
Tal como se usa en el presente documento, la palabra "inhibe" significa que previene las interacciones específicas, independientemente del mecanismo de esta prevención.
Tal como se usa en el presente documento una "composición farmacéutica" incluye, pero no se limita a, los péptidos de la presente invención dados a conocer a lo largo de la memoria descriptiva y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de los péptidos de la presente invención. La cantidad farmacéuticamente aceptable puede estimarse a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluye o engloba un intervalo o punto de concentración que tiene el efecto deseado en un sistema in vitro. Por tanto, esta información puede usarse para determinar con precisión las dosis en animales, incluyendo seres humanos.
La dosis terapéuticamente eficaz se refiere a esa cantidad del compuesto que da como resultado la mejora de los síntomas en un paciente. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o en animales experimentales. Por ejemplo, la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) así como la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) pueden determinarse usando métodos conocidos en la técnica. La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico que puede expresarse como la razón entre la DL50 y la DE50 compuestos que muestran índices terapéuticos altos.
Los datos obtenidos de los estudios en animales y cultivos celulares pueden usarse para formular un intervalo de dosificación de tales compuestos que está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad.
La composición farmacéutica puede administrarse por medio de cualquier vía tal como por vía local, por vía oral, por vía sistémica, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía mucosa, usando un parche y puede encapsularse en liposomas, micropartículas, microcápsulas y similares. La composición farmacéutica puede incrustarse en liposomas o incluso encapsularse. La composición farmacéutica también puede estar en forma liofilizada.
Puede usarse cualquier adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable en la composición farmacéutica. El compuesto modulador estará por ejemplo en una forma soluble combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las técnicas para formular y administrar estos compuestos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publication Co., Easton, PA, última edición.
El modo de administración, las dosificaciones óptimas y las formas galénicas pueden determinarse mediante criterios conocidos en la técnica teniendo en cuenta la gravedad del estado general del mamífero, incluyendo el ser humano, la tolerancia del tratamiento y los efectos secundarios.
Las "composiciones farmacéuticas" también incluyen vectores que podrían administrarse directamente in vivo o que pueden combinarse con células específicas que pueden o no extraerse del animal que va a tratarse. Los tipos de células incluyen todas las células eucariotas y procariotas, incluyendo células musculares, de corazón, de hígado, de pulmón, de cerebro, timocitos, sanguíneas y similares. Las células bacterianas y vegetales también están englobadas en la presente invención ya que PP1 se encuentra en muchos tipos diferentes de células bacterianas y vegetales. Las células de levadura también están englobadas por la presente invención. De hecho, cualquier célula que contenga PP1 está englobada por la presente invención.
Por tanto, se incluyen englobadas por la expresión "composiciones farmacéuticas" todas las formas de administración farmacéutica no sólo clásica, sino que también incluye la terapia génica.
Por el término "soporte" se quiere decir cualquier tipo de objeto sobre el que pueden inmovilizarse los péptidos. El tipo de soporte incluye, pero no se limita a, pocillos Costar, perlas, resinas, pastillas de vidrio, membranas y similares. Cualquier soporte que pueda usarse para inmovilizar proteínas o péptidos puede usarse en los métodos de la presente invención.
El término "animal" engloba cualquier ser vivo que no es vegetal, incluyendo vertebrados tales como mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces.
Tal como se usa en el presente documento, los términos "polinucleótidos", "ácidos nucleicos" y "oligonucleótidos" se usan de manera intercambiable e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ARN, ADN, ARN/ADN de más de un nucleótido en forma o bien de cadena sencilla o bien de dúplex. Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención pueden prepararse a partir de cualquier método conocido incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier método sintético, cualquier método recombinante, cualquier método de generación ex vivo y similares, así como combinaciones de los mismos.
Los polinucleótidos que pueden hibridarse con cualquiera de los polinucleótidos tratados anteriormente también están cubiertos por la presente invención. Tales polinucleótidos se denominan en el presente documento polinucleótidos "de hibridación". Los polinucleótidos de hibridación pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas o cebadores.
Según una realización de la presente invención, tales moléculas de hibridación tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos. Según otra realización, tienen una longitud de al menos 25 o al menos 50 nucleótidos.
En una realización, las moléculas de hibridación hibridarán con tales moléculas en condiciones de hibridación rigurosas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es cuando se lleva a cabo el intento de hibridación a una temperatura de desde aproximadamente 35ºC hasta aproximadamente 65ºC usando una disolución salina que es de aproximadamente 0,9 molar. Sin embargo, el experto podrá variar tales condiciones según sea apropiado con el fin de tener en cuenta variables tales como la longitud de la sonda, la composición de bases, el tipo de iones presentes, etc.
Por "prevenir o tratar" se quiere decir tratar una enfermedad o afección o detener la aparición de una enfermedad o afección.
De manera más específica, la presente invención se refiere a un conjunto de péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que afecta a las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c, en el que el M1 es RRNFVNKLKPL y M2 es NQAKKRWFADSTVKVKNVSFEKK o M1 es LDFRNRLQTN y M2 es KKVKKRVS
FAND o M1 es RHFVNKLKPLKS y M2 es NQAKKRWFADS o M1 es TCFRPRLRGS y M2 es SQKKKRWFAOM o M1 es GEVFINKGKGF y M2 es RGRQLRVRFATH o M1 es QVKFRRRREG y M2 es YFKRYQVKFRRR o M1 es EDFKAKKKEL y M2 es RITPSYVAFTPE o M1 es SVFMQRLKTNILQ y M2 es IDEVKNVYFKNFVLKVS
WITFLLA o M1 es LQFELRYRPV y M2 es TTKAVMFAK o M1 es DLFENRKKKN y M2 es VRRVFIM o M1 es FFKNEKMLY y M2 es RRGSPRVRFED o M1 es RRNFVNKLKPL y M2 es TVKVKNSFEKK.
La presente invención no sólo engloba los péptidos o el conjunto de péptidos específicos descritos anteriormente, sino también péptidos modificados en los que un aminoácido se deleciona, se añade o se cambia mientras que se mantiene la misma función de inhibición de las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c. En particular, pueden usarse análogos químicos de los aminoácidos, tales como aminoácidos fosforilados o tiofosforilados. Por ejemplo, se ha demostrado que un residuo Y fosforilado es similar al residuo F. Por tanto, estos dos aminoácidos pueden intercambiarse sin efectuar la función del motivo. Por tanto, los análogos peptídicos de los motivos mencionados anteriormente están englobados en la presente invención. Estos análogos incluyen aquellas estructuras que son similares en función pero que no son idénticas en composición. Un ejemplo de un análogo es un polipéptido que tiene aminoácidos químicamente modificados que están fosforilados y no pueden desfosforilarse por las enzimas celulares.
Los péptidos o conjuntos de péptidos según la presente invención, o incluidos en las composiciones y los kits de la invención, pueden englobar dos o más motivos en la misma molécula, o de 2 a 5 motivos, o de 2 a 10 motivos, motivos que se describieron anteriormente, que tienen un espaciador entre ellos. El espaciador puede ser una secuencia de aminoácidos o una cadena hidrocarbonada interpuesta mediante enlaces covalentes. Un espaciador también puede ser cualquier entidad química que puede servir para conectar los al menos dos motivos, y el espaciador también puede contener secuencias reguladoras entre los al menos dos motivos.
En otra realización, el espaciador de la presente invención tiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 aminoácidos. En una realización particular, el espaciador tiene aproximadamente 36 aminoácidos.
En otra realización, la presente invención se refiere a un polipéptido o una proteína de fusión que contiene al menos un motivo de la presente invención. Este polipéptido o esta proteína de fusión puede prepararse según métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Edición (1989). Un polipéptido o una proteína de fusión particular de la invención comprende uno o varios motivos M1 o M2, unidos con al menos un péptido fusogénico que ayudará al polipéptido o la proteína de fusión a entrar en las células diana. Dicho péptido fusogénico puede ser, por ejemplo, un epítopo viral o un ligando para un receptor celular específico tal como receptores de quimiocina.
Los motivos anteriores, sus análogos y modificaciones pueden sintetizarse usando, por ejemplo, un sintetizador "Applied System" o mediante síntesis en fase sólida de tipo Merrifield (véase, Merrifield, Adv. Enzmol. Related Areas Mol. Biol. (1969) 32; 221-96 o Merrfield, Recent Prog. Horm. Res. (1967); 23; 451-82). Los motivos también pueden producirse de manera recombinante.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica para los motivos puede insertarse dentro de un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia que codifica para el péptido/la proteína insertada. Tales elementos de transcripción incluyen una región reguladora y un promotor. Por tanto, el ácido nucleico que puede codificar para un compuesto marcador de la presente invención está operativamente unido a un promotor en el vector de expresión. El vector de expresión también puede incluir un origen de replicación.
Se emplea una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar los ácidos nucleicos de la presente invención. Los vectores de expresión útiles que pueden usarse incluyen, por ejemplo, segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, derivados de SV40 y pcDNA y plásmidos bacterianos conocidos tales como col El, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX tal como se describe por Smith et al (1988), pMB9 y derivados de los mismos, plásmidos tales como RP4, ADN de fagos tales como los numerosos derivados del fago I tales como NM989, así como otro ADN de fagos tal como M13 y ADN de fago monocatenario filamentoso; plásmidos de levadura tales como el plásmido de 2 micras o derivados del plásmido 2m, así como vectores lanzadera de levadura centroméricos y de integración; vectores útiles en células eucariotas tales como vectores útiles en células de insecto o de mamífero; vectores derivados de combinaciones de ADN de fagos y plásmidos, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fago o las secuencias de control de la expresión; y similares.
Por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus, pueden usarse tanto vectores de transferencia no de fusión, tales como, pero sin limitarse a, pVL941 (sitio de clonación BamHI, Summers), pVL1393 (sitios de clonación BamHI, SmaI, XbaI, EcoRI, NotI, XmaIII, BgIII y PstI; Invitrogen), pVL1392 (sitio de clonación BgIII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbaII, SmaI y BamHI; Summers e Invitrogen) y pBlueBacIII (sitio de clonación BamHI, BgIII, PstI, NcoI y HindIII, con selección recombinante azul/blanco, Invitrogen), como vectores de transferencia de fusión tales como, pero sin limitarse a, pAc700 (sitios de clonación BamHI y KpnI, en los que el sitio de reconocimiento de BamHI comienza con el codón de iniciación; Summers), pAc701 y pAc70-2 (iguales que pAc700, con marcos de lectura diferentes), pAc360 (sitio de clonación BamHI 36 pares de bases en sentido 3' de un codón de iniciación de polihedrina; Invitrogen (1995)) y pBlueBacHisA, B, C (tres marcos de lectura diferentes con sitio de clonación BamHI, BgIII, PstI, NcoI y HindIII, un péptido N-terminal para la purificación ProBond y la selección recombinante azul/blanco de placas; Invitrogen (220).
Los vectores de expresión de mamífero contemplados para su uso en la invención incluyen vectores con promotores inducibles, tales como los promotores de la dihidrofolato reductasa, cualquier vector de expresión con un casete de expresión de DHFR o un vector de coamplificación de DHFR/metotrexato tal como pED (sitios de clonación PstI, SaII, SbaI, SmaI y EcoRI, con el vector que expresa tanto el gen clonado como DHFR; Kaufman, 1991). Alternativamente, un vector de coamplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sitios de clonación HindIII, XbaII, SmaI, SbaI, EcoRI y BcII en los que el vector expresa la glutamina sintetasa y el gen clonado; Celltech). Puede usarse un vector que dirige la expresión episomal bajo el control del virus de Epstein Barr (EBV) o antígeno nuclear (EBNA), tal como pREP4 (sitios de clonación BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII y KpnI, promotor de RSV-LTR constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitios de clonación BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII y KpnI, promotor del gen temprano inmediato de CMVh constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitios de clonación KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI, promotor del gen de metalotioneína IIa inducible, marcador seleccionable de higromicina, Invitrogen), pREP8 (sitios de clonación BamHI, XhoI, NotI, HindIII, NheI y KpnI, promotor de RSV-LTR, marcador seleccionable de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sitios de clonación KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI, promotor de RSV-LTR, marcador seleccionable de G418; Invitrogen) y pEBVHis (promotor de RSV-LTR, marcador seleccionable de higromicina, péptido N-terminal purificable mediante resina ProBond y escindido mediante enterocinasa; Invitrogen).
Los vectores de expresión de mamífero seleccionables para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, pRc/CMV (sitios de clonación HindIII, BstXI, NotI, SbaI y ApaI, selección de G418, Invitrogen), pRc/RSV (sitios de clonación HindII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI, selección de G418, Invitrogen) y similares. Los vectores de expresión de mamífero del virus vaccinia (véase, por ejemplo, Kaufman 1991) que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, pSC11 (sitio de clonación SmaI, selección de TK- y \beta-gal), pMJ601 (sitios de clonación SaII, SmaI, AfII, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI y HindIII; selección de TK- y \beta-gal), pTKgptF1S (sitios de clonación EcoRI, PstI, SaIII, AccI, HindII, SbaI, BamHI y Hpa, selección de TK o XPRT) y similares.
Los sistemas de expresión de levaduras que también pueden usarse en la presente incluyen, pero no se limitan a, el vector pYES2 no de fusión (sitios de clonación XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, KpnI y HindIII, Invitrogen), el pYESHisA, B, C de fusión (sitios de clonación XbaII, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI y HindIII, péptido N-terminal purificado con resina ProBond y escindido con enterocinasa; Invitrogen), vectores pRS y similares.
Por consiguiente, las células de mamífero y normalmente de seres humanos, así como células bacterianas, de levaduras, hongos, insectos, nematodos y vegetales se usan en la presente invención y pueden transfectarse mediante el ácido nucleico o vector recombinante tal como se define en el presente documento.
Los ejemplos de células adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células VERO, células HELA tales como ATCC n.º CCL2, líneas celulares CHO tales como ATCC n.º CCL61, células COS tales como células COS-7 y células ATCC n.º CRL 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3 tales como ATCC n.º CRL6361, células A549, PC12, K562, células 293, células Sf9 tales como ATCC n.º CRL1711, células Cv1 tales como ATCC n.º CCL70 y células JURKAT tales como ATCC n.º Tib152.
Otras células adecuadas que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cepas de células huésped procariotas tales como Escherichia coli, (por ejemplo, la cepa DH5-\alpha), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cepas de los géneros de Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, parásitos como los parásitos Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia), Leishmania o Trypanosoma.
Células adecuadas adicionales que pueden usarse en la presente invención incluyen células de levaduras tales como las de Saccharomyces tales como Saccharomyces cerevisiae o Prombe.
Los motivos y péptidos descritos anteriormente están implicados en la unión de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c y por tanto son subunidades de selección como diana implicadas en el control de todas las uniones a PP1. Por tanto, debido a su implicación en la unión a PP1, estos motivos son importantes para la regulación de cualquier enfermedad relacionada con la regulación de la fosfatasa en todos los tipos de células incluyendo todas las células eucariotas y procariotas incluyendo células musculares, de corazón, de hígado, de pulmón, de cerebro, timocitos, sanguíneas y similares. Las células bacterianas y vegetales también están englobadas en la presente invención ya que PP1 se encuentra en muchos tipos diferentes de células bacterianas y vegetales. Las células de levaduras también están englobadas por la presente invención. De hecho, cualquier célula que contiene PP1 está englobada por la presente invención.
De manera más importante, esta regulación puede efectuar la regulación por disminución de, por ejemplo, la síntesis de glucógeno hepático que a su vez reduciría los niveles de glucosa en sangre y por tanto tratará la diabetes en la que la hiperglucemia es un problema grave. Por tanto, la presente descripción se refiere a tratar la diabetes administrando a un animal que necesita tal tratamiento una cantidad farmacéuticamente aceptable de los péptidos de la presente invención que se describen en detalle en la misma.
Aún en otra realización, la presente descripción se refiere a la administración de los péptidos de la presente invención para normalizar la hipertensión. Una disminución de la fosforilación del complejo de PP1 activa las cadenas ligeras de miosina del músculo liso y por tanto relaja los músculos lisos (véase, Uehata et al., 1997). Por tanto, la presente descripción también se refiere a administrar a un animal una cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos de la presente invención descritos en la misma para prevenir o tratar la hipertensión.
Aún en otra realización, la presente descripción se refiere a tratar trastornos neurológicos modulando receptores neurológicos y canales iónicos. Por tanto, la presente descripción también se refiere a tratar trastornos neurológicos administrando a un animal que necesita tal tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos de la presente invención descritos en la misma para prevenir o tratar los trastornos neurológicos, tales como la enfermedad de Parkinson.
De manera más específica, la presente descripción se refiere a tratar la enfermedad de Alzheimer. Se sabe que la fosforilación desempeña un papel en efectuar el precursor \beta-amiloide que provoca las placas en la enfermedad de Alzheimer. Por tanto, la presente descripción se refiere a tratar la enfermedad de Alzheimer administrando a un animal que necesita tal tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos de la presente invención descritos en la misma para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer.
Aún en otra realización, la presente descripción se refiere a tratar infecciones virales o microbianas y de manera más específica el virus del herpes simple, Myocbacterium tuberculosis y SIDA administrando a un animal que necesita tal tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos de la presente invención descritos en la misma para prevenir o tratar la infección viral.
La presente invención es especialmente útil para tratar el SIDA ya que tanto TAT como la transcriptasa inversa del virus VIH-1 podrían ser proteínas de unión a PP1.
Aún en otra realización, la presente descripción se refiere a tratar infecciones parasitarias tales como malaria, teileria o criptosporidio administrando a un animal que necesita tal tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos de la presente invención descritos en la misma para prevenir o tratar estas infecciones parasi-
tarias.
Los tratamientos mencionados anteriormente implican administrar a un animal que necesita tal tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz de o un conjunto de péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que inhiben las interacciones Bclx_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c. Por ejemplo, podría administrarse a dicho animal un conjunto de péptidos que comprende el péptido R (NWGRIVAFFSF) y el péptido F (GDEFELRYRRAF), análogos de estos péptidos o sus equivalentes funcionales en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un conjunto de péptidos según las reivindicaciones.
El vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitarse a, solución salina, adyuvantes y similares, tratados de manera más extensa anteriormente.
La presente descripción no se limita únicamente a administrar los péptidos descritos en la misma como una composición farmacéutica "pura", sino también como una composición farmacéutica en terapia génica, usando vectores que codifican para polipéptidos según la presente invención.
De manera más específica, la terapia génica ex vivo e in vitro es parte de la presente descripción. A este respecto, cualquiera de las metodologías en relación a la terapia génica disponible dentro de la técnica puede usarse en la práctica de la presente descripción tal como las descritas por Goldspiel et al Clin. Pharm. 12 pág. 488-505 (1993).
La administración del ácido nucleico terapéutico a un paciente puede ser terapia génica in vivo directa (es decir, el paciente se expone directamente al ácido nucleico o vector que contiene ácido nucleico) o terapia génica ex vivo indirecta (es decir, las células se transforman en primer lugar con el ácido nucleico in vitro y entonces se trasplantan en el paciente).
Por ejemplo, para la terapia génica in vivo, se administra un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de tal manera que pasa a ser intracelular; es decir, mediante infección usando un vector retroviral defectuoso o atenuado u otros vectores virales tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense 4.980.286 o por Robbins et al, Pharmacol. Ther., 80 N.º 1 pág. 35-47 (1998).
Los diversos vectores virales que se conocen en la técnica son tales como los descritos en Miller et al. (Meth. Enzymol. 217 pág. 581-599 (1993)) que se han modificado para delecionar aquellas secuencias retrovirales que no se requieren para el empaquetamiento del genoma viral ni la posterior integración en el ADN de la célula huésped. También pueden usarse vectores adenovirales que son ventajosos debido a su capacidad de infectar células en no división y tales vectores adenovirales de alta capacidad se describen en Kochanek (Human Gene Therapy, 10, pág. 2451-2459 (1999)). Los vectores virales quiméricos que pueden usarse son los descritos por Reynolds et al. (Molecular Medecine Today, pág. 25-31 (1999)). También pueden usarse vectores híbridos y se describen por Jacoby et al. (Gene Therapy, 4, pág. 1282-1283 (1997)).
La inyección directa de ADN desnudo o mediante el uso de bombardeo con micropartículas (por ejemplo, Gene Gun®; Biolistic, Dupont) o recubriéndolo con lípidos, también puede usarse en terapia génica. Pueden usarse receptores de superficie celular/compuestos de transfección o mediante encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o administrando el ácido nucleico en unión con un péptido que se sabe que entra en el núcleo o administrándolo en unión con un ligando predispuesto a la endocitosis mediada por receptor (véase Wu & Wu, J. Biol. Chem., 262 págs. 4429-4432 (1987)) para seleccionar como diana tipos de células que expresan específicamente los receptores de interés.
En otra realización, puede producirse un compuesto de ligando de ácido nucleico en el que el ligando comprende un péptido viral fusogénico diseñado de modo que rompe los endosomas, permitiendo así que el ácido nucleico evite la posterior degradación lisosomal. El ácido nucleico puede seleccionarse como diana in vivo para la endocitosis específica de células y la expresión seleccionando como diana un receptor específico tal como el descrito en los documentos WO92/06180, WO93/14188 y WO 93/20221. Alternativamente, el ácido nucleico puede introducirse intracelularmente e incorporarse en el genoma de la célula huésped para la expresión mediante recombinación homóloga (véase Zijlstra et al, Nature, 342, pág. 435-428 (1989)).
En la terapia génica ex vivo, se transfiere un gen dentro de células in vitro usando cultivo tisular y se administran las células al paciente mediante diversos métodos tales como inyección subcutánea, aplicación de las células dentro de un injerto de piel y la inyección intravenosa de células sanguíneas recombinantes tales como células progenitoras o células madre hematopoyéticas.
Las células dentro de las que puede introducirse un ácido nucleico para los fines de terapia génica incluyen, por ejemplo, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos y células sanguíneas. Las células sanguíneas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos, células hematopoyéticas o células progenitoras y similares.
Los polipéptidos y complejos de polipéptidos de la invención también se usan en la producción de anticuerpos. Por tanto, la presente invención proporciona anticuerpos, que pueden ser monoclonales o policlonales.
Por tanto, los polipéptidos y complejos de la invención pueden usarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen específicamente a un inmunógeno de ese tipo. Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
En la producción de anticuerpos, la selección para obtener el anticuerpo deseado puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio específico de un polipéptido de la invención (por ejemplo, un dominio de interacción seleccionado), pueden someterse a ensayo hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de polipéptido que contiene tal dominio. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo de polipéptido pero que no se une específicamente (o se une con menos avidez) a un segundo homólogo de polipéptido, puede seleccionarse basándose en una unión positiva al primer homólogo de polipéptido y una falta de unión (o unión reducida) al segundo homólogo de polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales (AcM) dirigidos contra un polipéptido de la invención o un fragmento o un análogo del mismo, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today 4:72) y la técnica del hibridoma del VEB para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los AcM de la invención puede cultivarse in vitro o in vivo. En una realización adicional de la invención, pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando tecnología conocida (documento PCT/US90/02545).
Los anticuerpos monoclonales incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales quiméricos (por ejemplo, quimeras ser humano-ratón). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes se derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región constante de inmunoglobulina humana y una región variable derivada de un AcM murino (véase, por ejemplo, Cabilly et al., patente estadounidense número 4.816.567; y Boss et al., patente estadounidense número 4.816.397).
Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie no humana y una región de entramado de una molécula de inmunoglobulina humana. (Véase, por ejemplo, Queen, patente estadounidense número 5.585.089).
Pueden producirse anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando métodos descritos en la publicación PCT número WO 87/02671; la solicitud de patente europea 184.187; la solicitud de patente europea 171.496; la solicitud de patente europea 173,494; la publicación PCT número WO 86/01533; la patente estadounidense número 4.816.567; la solicitud de patente europea 125.023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314: 446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4:214; la patente estadounidense 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060.
Se desean particularmente anticuerpos completamente humanos para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Tales anticuerpos pueden producirse usando ratones transgénicos que no pueden expresar genes endógenos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas, pero que pueden expresar genes humanos de cadena ligera y pesada. Se inmunizan los ratones transgénicos de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, toda o una parte de una BPI de la invención. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes humanos de inmunoglobulina albergados por el ratón transgénico se reposicionan durante la diferenciación de las células B, y posteriormente experimentan un cambio de clase y mutación somática. Por tanto, usando una técnica de este tipo, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para un resumen de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Inmunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ejemplo, la patente estadounidense 5.625.126; la patente estadounidense 5.633.425; la patente estadounidense 5.569.825; la patente estadounidense 5.661.016; y la patente estadounidense 5.545.806. Además, pueden contratarse compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente.
Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado usando una técnica denominada "selección guiada". En este enfoque, se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899-903).
Los anticuerpos de la presente descripción también pueden generarse usando diversos métodos de presentación en fago conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fago, se presentan dominios de anticuerpos funcionales sobre la superficie de partículas de fago que llevan las secuencias de polinucleótidos que codifican para los mismos. De manera más específica, tal fago puede utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o una biblioteca combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés puede seleccionarse o identificarse con un antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado en una perla o superficie sólida. Los fagos usados en estos métodos son normalmente fagos filamentosos incluyendo dominios de unión M13 y fd expresados del fago con dominios de anticuerpos Fab, Fv o Fv estabilizado con disulfuro fusionados de manera recombinante a la proteína o bien del gen III o bien del gen VIII del fago. Los métodos de presentación en fago que pueden usarse para preparar los anticuerpos de la presente descripción incluyen los descritos en Brinkman et al., J. Inmunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Inmunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Inmunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Inmunology 57:191-280 (1994); la solicitud PCT número PCT/GB91/01134; las publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes estadounidenses números 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Tal como se describe en la bibliografía anterior, tras la selección del fago, pueden aislarse las regiones que codifican para el anticuerpo del fago y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y pueden expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, tal como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los dados a conocer en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988).
Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir anticuerpos y Fv de cadena sencilla incluyen las descritas en las patentes estadounidenses 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
La descripción proporciona además el uso de anticuerpos biespecíficos, que pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulinas, en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulinas, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y los rendimientos del producto son bajos. Se dan a conocer procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.
Según un enfoque diferente, se fusionan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión puede realizarse con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. Generalmente, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se transfectan conjuntamente dentro de un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que las razones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en razones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las razones no son de significación particular.
En otra realización de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina sólo en la mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se da a conocer en el documento WO 94/04690 publicado el 3 de marzo de 1994. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210.
La descripción proporciona fragmentos funcionalmente activos, derivados o análogos de las moléculas de inmunoglobulina anti-polipéptido. Funcionalmente activo significa que el fragmento, derivado o análogo puede provocar anticuerpos anti-anti-idiotipo (es decir, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que se reconoce por el anticuerpo del que se deriva el fragmento, derivado o análogo. Específicamente, en una realización, la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede potenciarse mediante la deleción de las secuencias de entramado y CDR que son C-terminales con respecto a la secuencia CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar qué secuencias CDR se unen al antígeno, pueden usarse péptidos sintéticos que contienen las secuencias CDR en ensayos de unión con el antígeno mediante cualquier método de ensayo de unión conocido en la técnica.
La presente descripción proporciona fragmentos de anticuerpo tales como, pero sin limitarse a, fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fab. Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Los fragmentos F(ab')2 consisten en la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada y se generan mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan mediante reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. La descripción también proporciona dímeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la descripción, o cualquier fragmento mínimo de los mismos tal como Fv o anticuerpos de cadena sencilla (ACS) (por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la descripción. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman mediante la unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido de cadena sencilla. Pueden usarse las técnicas para el montaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
En otras realizaciones, la descripción proporciona proteínas de fusión de las inmunoglobulinas de la descripción (o fragmentos funcionalmente activos de las mismas), por ejemplo en las que se fusiona la inmunoglobulina por medio de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), o bien en el extremo N-terminal o bien en el extremo C-terminal a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o parte de la misma, preferiblemente una parte de al menos 10, 20 ó 50 aminoácidos de la proteína) que no es la inmunoglobulina. En una realización, la inmunoglobulina, o un fragmento de la misma, se une covalentemente a la otra proteína en el extremo N-terminal del dominio constante. Tal como se mencionó anteriormente, tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, aumentar la semivida in vivo y potenciar el suministró de un antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario.
Las inmunoglobulinas de la descripción incluyen análogos y derivados que están cualquiera de ellos modificados, es decir, mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula siempre que tal unión covalente no perjudique a la unión inmunoespecífica. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluyen aquellos que se han modificado adicionalmente, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Puede llevarse a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, escisión química específica, acetilación, formilación, etc. Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los anticuerpos anteriores pueden usarse en métodos conocidos en la técnica en relación a la localización y actividad de los polipéptidos de la invención, por ejemplo, para obtener imágenes o radioimágenes de estas proteínas, medir niveles de las mismas en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, etc. y para radioterapia.
Los anticuerpos de la descripción pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante expresión recombinante, y se producen preferiblemente mediante una técnica de expresión recombinante.
La expresión recombinante de anticuerpos, o fragmentos, derivados o análogos de los mismos, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo. Si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, puede ensamblarse un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, según se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que, en resumen, implica la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen partes de la secuencia que codifica para el anticuerpo, hibridación y ligamiento de esos oligonucleótidos, y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo puede obtenerse mediante la clonación del anticuerpo. Si no se dispone de un clon que contiene el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede obtenerse un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpo, o una biblioteca de ADNc generada a partir de cualquier tejido o célula que expresa el anticuerpo) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridarse con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia del gen particular.
Si no se dispone de una molécula de anticuerpo que reconoce específicamente un antígeno particular (o una fuente para una biblioteca de ADNc para clonar un ácido nucleico que codifica para tal anticuerpo), pueden generarse anticuerpos específicos para un antígeno particular mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, inmunizando un animal, tal como un conejo, para generar anticuerpos policlonales o, generando anticuerpos monoclonales. Alternativamente, puede obtenerse un clon que codifica para al menos la parte Fab del anticuerpo explorando bibliotecas de expresión de Fab (por ejemplo, tal como se describe en Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se unen al antígeno específico o explorando bibliotecas de anticuerpos (véanse, por ejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).
Una vez que se obtiene un ácido nucleico que codifica para al menos el dominio variable de la molécula de anticuerpo, puede introducirse en un vector que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 86/05807; la publicación PCT WO 89/01036; y la patente estadounidense número 5.122.464). También se dispone de vectores que contienen la cadena pesada o ligera completa para la coexpresión con el ácido nucleico para permitir la expresión de una molécula de anticuerpo completa. Entonces, puede usarse el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo para introducir la(s) sustitución/sustituciones o deleción/deleciones de nucleótidos necesaria(s) para sustituir (o delecionar) el uno o más residuos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario por un residuo de aminoácido que no contiene un grupo sulfhidrilo. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica para la introducción de deleciones o mutaciones específicas en una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, pero sin limitarse a, mutagénesis química, mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), métodos basados en PCT, etc.
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) mediante corte y empalme de genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Tal como se describió anteriormente, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que se derivan diferentes partes de diferentes especies animales, tales como los que tienen una región variable derivada de un AcM murino y una región constante de anticuerpo humano, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que codifica para una molécula de anticuerpo de la invención, puede producirse el vector para la producción de la molécula de anticuerpo mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por tanto, en el presente documento se describen métodos para preparar la proteína de la invención expresando el ácido nucleico que contiene las secuencias de la molécula de anticuerpo. Pueden usarse métodos que se conocen bien por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen una molécula de anticuerpo que codifica para secuencias y señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención.
Las células huésped usadas para expresar un anticuerpo recombinante de la invención pueden ser o bien células bacterianas tales como Escherichia coli, o bien células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa. De manera más específica, las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), conjuntamente con un vector tal como el elemento promotor del gen temprano intermedio principal de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
Puede utilizarse una variedad de sistemas de vector de expresión-huésped para expresar una molécula de anticuerpo de la invención. Tales sistemas de expresión-huésped representan vehículos mediante los cuales pueden producirse secuencias codificantes de interés y purificarse posteriormente, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresan la molécula de anticuerpo de la invención in situ. Éstas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de cósmido, ADN de plásmido o ADN de bacteriófago recombinantes que contienen las secuencias que codifican para el anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen secuencias que codifican para el anticuerpo; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias que codifican para el anticuerpo; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, VMC; virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican para el anticuerpo; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5 K del virus vaccinia).
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse de manera ventajosa varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que está expresándose. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de una proteína de este tipo, para la generación de composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan, al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el que la secuencia que codifica para el anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en marco con la región codificante de lacZ de modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Pueden usarse también vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de células lisadas mediante adsorción y unión a perlas de una matriz de glutatión-agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de proteasa de factor Xa o trombina de modo que el producto génico diana clonado puede liberarse del resto de GST.
En un sistema de insecto, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (VPNAc) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica para el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y situarse bajo el control de un promotor de VPNAc (por ejemplo, el promotor de polihedrina). En células huésped de mamífero, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus (por ejemplo, un sistema de expresión de adenovirus).
Tal como se trató anteriormente, puede elegirse una cepa de células huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína.
Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo de anticuerpos recombinantes, es útil la expresión estable. Por ejemplo, pueden producirse líneas celulares que expresan de manera estable un anticuerpo de interés transfectando las células con un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del anticuerpo y la secuencia de nucleótidos de un marcador seleccionable (por ejemplo, neomicina o higromicina) y seleccionando para detectar la expresión del marcador seleccionable. Tales líneas celulares modificadas mediante ingeniería pueden ser útiles en la selección y evaluación de compuestos que interaccionan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Los niveles de expresión de la molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación de vectores (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando puede amplificarse un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).
La célula huésped puede contransfectarse con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector para un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector para un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la misma expresión de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede utilizarse un único vector que codifica tanto para los polipéptidos de la cadena pesada como de la ligera. En tales situaciones, debe situarse la cadena ligera antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre de tóxicos (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que se ha expresado de manera recombinante la molécula de anticuerpo de la invención, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad tal como con proteína A o un antígeno específico, y cromatografía en columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial o mediante cualquier otra técnica habitual para la purificación de proteínas.
Alternativamente, puede purificarse fácilmente cualquier proteína de fusión utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión que está expresándose. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al. permite la rápida purificación de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humanas (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de vaccinia de tal manera que el marco de lectura abierto del gen se fusiona de manera traduccional a una cola amino-terminal que consiste en seis residuos de histidina. La cola sirve como dominio de unión a la matriz para la proteína de fusión. Se cargan extractos de células infectadas con virus vaccinia recombinante en columnas de Ni2+-ácido nitriloacético-agarosa y se eluyen selectivamente proteínas con colas de histidina con tampones que contienen imidazol.
En otra realización, los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos se conjugan con un resto de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse para diagnóstico o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Puede facilitarse la detección acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radiactivos, metales que emiten positrones (para su uso en tomografía por emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase en general la patente estadounidense número 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse a anticuerpos para su uso como agentes de diagnóstico según la presente invención. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y los núclidos radiactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{111}In y ^{99}Tc.
Los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden conjugarse con un agente terapéutico o resto farmacológico para modificar una respuesta biológica dada. El agente terapéutico o resto farmacológico no ha de interpretarse como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o un polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o la toxina diftérica; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, interferón \alpha, interferón \beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo angiostatina o endostatina; o un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2
(IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento.
Se conocen bien las técnicas para conjugar tal resto terapéutico con anticuerpos, véanse, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Alternativamente, puede conjugarse un anticuerpo con un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo según se describe por Segal en la patente estadounidense número 4.676.980.
Puede usarse un anticuerpo con o sin un resto terapéutico conjugado con él como agente terapéutico que se administra solo o en combinación con factor(es) citotóxico(s) y/o citocina(s).
La presente invención no sólo se refiere a los péptidos, su uso y administración en vehículos farmacéuticamente aceptables, sino también a métodos de uso de los péptidos y a motivos según se da a conocer en la misma.
De manera más específica, la presente invención presenta una utilización para varios métodos en los que los péptidos descritos en la misma se usan para los siguientes fines:
(1)
Un método de identificación de un polipéptido o una proteína que interacciona con PP1, que comprende detectar en la secuencia de dicho polipéptido o dicha proteína, la presencia de dos motivos M1 y M2 de unión a PP1.
(2)
Un método de selección de compuestos que interaccionan con reguladores de PP1, que comprende:
(a)
inmovilizar péptidos descritos en el presente documento sobre un soporte; y
(b)
someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos péptidos inmovilizados.
(3)
Un método de selección de compuestos que interaccionan con PP1, que comprende:
(a)
obtener anticuerpos frente a péptidos dentro de la descripción de la presente invención; y
(b)
someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos anticuerpos.
(4)
Un método para someter a prueba moléculas que inhiben o potencian la actividad de PP1 o cambian su localización mediante interacción, comprendiendo dicho método:
(a)
inmovilizar péptidos descritos en el presente documento sobre un soporte; y
(b)
someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos péptidos inmovilizados.
Además de métodos, la presente invención se refiere a kits. Los kits comprenden conjuntos de péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c, en los que M1 es RRNFVNKLKPL y M2 es NQAKKRVVFADSTVKVKNVSFEKK o M1 es LDFRNRLQTN y M2 es KKVKKRVSFAND o M1 es RHFVNKLKPLKS y M2 es NQAKKRVVFADS o M1 es TCFRPRLRGS y M2 es SQKKKRVVFADM o M1 es GEVFINKGKGF y M2 es RGRQLRVRFATH o M1 es QVKFRRRREG y M2 es YFKRYQVKFRRR o M1 es EDFKAKKKEL y M2 es RITPSYVAFTPE o M1 es SVFMQRLKTNILQ y M2 es IDEVKNVYFKNFVLKVSWITFLLA o M1 es LQFELRYRPV y M2 es TTKAVMFAK o M1 es DLFENRKKKN y M2 es VRRVFIM o M1 es FFKNEKMLY y M2 es RRGSPRVRFEDG.
Aún en otra realización, la presente descripción se refiere a un kit que contiene anticuerpos frente a péptidos que imitan tanto a los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl2/Bad/PP1c. Estos anticuerpos pueden haberse producido contra los péptidos R (NWGRIVAFFSF) y F (GDE
FELRYRRAF), los análogos de estos péptidos o sus equivalentes funcionales.
Además de los péptidos o los anticuerpos, los kits de la presente invención también incluyen reactivos para interpretar la interacción. Tales reactivos se conocen en la técnica y se describieron anteriormente y en Sambrook (citado anteriormente).
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a un método de selección de células para hallar interacciones con PP1 en las células, comprendiendo dicho método o bien usar anticuerpos contra los motivos M1 y M2 o bien péptidos que incluyen estos motivos o sus equivalentes funcionales.
Por tanto, la presente descripción se refiere también a un nuevo tratamiento con un fármaco derivado de fosfatasa basado en la administración intracelular de péptidos con una secuencia o secuencias que rodean los sitios de unión a PP1/PP2 (motivos M1 y M2) identificados en algunas proteínas de interacción. Este enfoque de tratamiento farmacológico, derivado de la genética química (Gura, 2000), inhibiría específicamente la interacción de algunas proteínas diana médicamente importantes con PP1/PP2A.
Esta estrategia terapéutica, denominada "bloqueo de la expresión peptídica" ("peptidic knockout") de las rutas de PP1/PP2 tiene su base en dos resultados recientes. El primer resultado fue la identificación de una supuesta secuencia distintiva ("signature") de PP1. Por tanto, a partir de la caracterización de dos motivos de unión a PP1 diferentes en proteínas Bcl-2 y su existencia en la mayoría de las proteínas de unión a PP1, puede concluirse que la presencia combinatoria de los motivos puede usarse como una secuencia distintiva predictiva para la unión a PP1. Por tanto, puede usarse el sitio web denominado "PP1 signature" ("secuencia distintiva de PP1") (en preparación en el Instituto Pasteur) que contiene todas las supuestas secuencias de PP1 derivadas de una biblioteca Swisprot para identificar supuestas dianas de unión a PP1 de interés.
El segundo resultado fue la identificación de sitios de unión a PP2A en cinco proteínas. Se mapearon recientemente los sitios de unión a PP2A de una Vpr codificada por un virus (VIH-1) y una Ck2a parasitaria codificada por Theileria. A partir de los datos obtenidos, puede afirmarse que la administración intracelular de algunos péptidos que imitan a estas secuencias de unión a PP2A conduce a apoptosis en células tumorales (Hela, Jurkat, S) o infectadas (Vpr o VIH-1 o Theileria).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos pueden realizarse usando los materiales y métodos descritos a continuación:
1. Materiales y métodos 1.1. Células y cultivo
Ts1\alpha\beta es una línea de células T murinas que expresa las cadenas \alpha y \beta del receptor de IL-2 (Pitton et al, 1993) que puede propagarse independientemente en IL-2, IL-4 o IL-9. Se cultivaron las células en RPMI-1640 complementado con el 5% de suero de ternera fetal inactivado por calor, glutamina 2 mM, Hepes 10 mM, arginina 0,55 mM, asparagina 0,24 mM, 2-ME 50 \muM y 60 U/ml de IL-4.
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1.2. Linfocinas, anticuerpos, reactivos y plásmidos
Se usó rIL-4 murina o sobrenadante de una sublínea de HeLa transfectada con pKCRIL-4.neo como fuente de IL-4 murina. Los anticuerpos anti-Bcl-x_{L} y anti-Bcl-w eran de Calbiochem (La Jolla, CA), Transduction Laboratories (Lexington, KY) o StressGen Biotechnology (Victoria, Canadá). El anticuerpo anti-PP1c específico procedía de UBI (Lake Placid, NY), Calbiochem o Transduction Laboratories. El anticuerpo anti-histonas procedía de Chemicon International (Temecula, CA). El anticuerpo anti-proteína 14-3-3 procedía de UBI (Lake Placid, NY). Las serinas 112 y 136 de anticuerpo anti-Bad procedían de New England BioLabs (Beverly, MA) y la serina 155 procedía de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). El anticuerpo anti-Raf procedía de Transduction Laboratories. Los anticuerpos anti-Pser y pan-Ras procedían de Calbiochem. La proteína PP1c recombinante procedía de Calbiochem. Mito 2813 (anticuerpo anti-piruvato deshidrogenasa mitocondrial) lo proporcionó el Dr. Serrano, Centro Nacional de Biotecnología (Madrid).
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1.3. Inmunoprecipitación e inmunotransferencia de tipo Western
Se estimularon las células (1x10^{7}) con, o se privaron de, IL-4 y se lisaron durante 20 min. a 4ºC en tampón de lisis (Tris HCl 50 mM pH 8, NP-40 al 1%, NaCl 137 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM, glicerol al 10% y cóctel de inhibidores de proteasa). También se usaron tampones libres de detergentes o digitonina para la inmunoprecipitación. Para el análisis de fosforilación, se complementó también el tampón con cóctel de inhibidores de fosfatasa. Se inmunoprecipitaron los lisados con el anticuerpo apropiado y se añadió la Proteína A-Sepharose. Alternativamente, se lisaron las células en el tampón de muestra de Laemmli y se separaron los extractos de proteínas mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, se bloquearon y se incubaron con anticuerpo primario. Se lavó la membrana y se incubó con anticuerpo secundario conjugado con PO. Las proteínas se desarrollaron usando ECL.
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1.4. Ensayo de fosfatasa in vitro
Se lisaron las células estimuladas con IL-4 (1x10^{7}) en tampón de lisis, se inmunoprecipitaron los sobrenadantes con el anticuerpo correspondiente, seguido por incubación con Proteína A-Sepharose. Se lavaron los inmunoprecipitados con tampón fosfatasa (Tris HCl 50 mM, pH 7,5, 2-ME al 0,1%, EDTA 0,1 mM y BSA 1 mg/ml) y se mezclaron con [^{32}P]fosforilasa a, diluida en tampón fosfatasa complementado con cafeína. Se incubó la reacción (40 min. a 30ºC), se detuvo con 200 \mul de TCA al 20% y se centrifugó. Se usó un total de 185 \mul del sobrenadante para estimar la generación de fosfato libre liberado a partir de la [^{32}P]fosforilasa a.
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1.5. Síntesis de péptidos
Se prepararon péptidos que comprendían el motivo R/K X V/I X F (R) (SEQ ID No. 1) o F X X R X R (F) (SEQ ID No. 2) de Bcl-w y Bcl-X_{L}, así como los péptidos mutados (véase la figura 8A para la secuencia) mediante síntesis automatizada de "spot" (mancha) en una membrana de celulosa aminoderivatizada. Se bloqueó la membrana, se incubó con PP1c purificada y, tras varias etapas de lavado, se incubó con anticuerpo anti-PP1c, seguido por anticuerpo secundario conjugado con PO. Se desarrollaron las manchas usando el sistema ECL.
Se sintetizaron los péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID No. 6), F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID No. 7) o R* (NWGRIAAAFSF) (SEQ ID No. 8) en un sintetizador automatizado de múltiples péptidos usando el procedimiento en fase sólida y química habitual de Fmoc. Se confirmaron la pureza y composición de los péptidos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa y mediante el análisis de aminoácidos.
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1.6. Competición de la interacción proteína-proteína
Se sometió a competencia la interacción Bcl-w/PP1c y Bcl-x_{L}/PP1c por los péptidos R, F o R*. Se inmunoprecipitaron los lisados de las células estimuladas con IL-4 con anticuerpo anti-Bad y se añadió Proteína A-Sepharose. Se sometió a competencia la interacción Bcl-w/PP1c y Bcl-x_{L}/PP1c mediante la incubación con los péptidos R, F o R* (30 min., temperatura ambiente). Tras lavar, o bien se sometieron a ensayo los inmunoprecipitados para determinar la actividad fosfatasa de la proteína o bien se transfirieron a nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia con el anticuerpo correspondiente.
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1.7. Oligonucleótidos sentido y antisentido
Los análogos de fosfotioato de los oligonucleótidos de Bcl-x_{L} y Bcl-w, incluyendo el codón de iniciación ATG, se adquirieron de Isogen Bioscience. La secuencia de los oligonucleótidos sentido y antisentido es tal como sigue. Bcl-x_{L} sentido, ATG TCT CAG AGC AAC (SEQ ID No. 9); Bcl-X_{L} antisentido, GTT GCT CTG AGA CAT (SEQ ID No. 10); Bcl-w sentido, ATG GCG ACC CCA GCC (SEQ ID No. 11); Bcl-w antisentido, GGC TGG GGT CGC CAT (SEQ ID No. 12).
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2. Resultados experimentales 2.1. Identificación de Bcl-w y Bcl-x_{L} como proteínas que interaccionan con PP1c
Se demostró anteriormente que la molécula antiapoptótica Bcl-2 es una subunidad de selección como diana de la serina/treonina fosfatasa PP1c en células TS1\alpha\beta estimuladas con IL-2 y que la secuencia de Bcl-2 que interacciona con PP1c es el motivo R/K X V/I X F (SEQ ID No. 10) (Ayllón et al, 2001). Dado que Bcl-X_{L} y Bcl-w también contienen el motivo R/K X V/I X F bien conservado observado en Bcl-2, se investigó la posibilidad de que las moléculas antiapoptóticas Bcl-x_{L} y Bcl-w también puedan asociarse a PP1c en las células TS1\alpha\beta estimuladas con IL-4, que no expresan Bcl-2 y expresan Bcl-x_{L} y Bcl-w. Se realizaron experimentos de coinmunoprecipitación recíprocos de proteínas citoplasmáticas en condiciones de estimulación con o privación de IL-4 usando anticuerpos específicos. Se detectaron PP1c y Bad mediante inmunotransferencia de tipo Western en inmunoprecipitados de anticuerpo anti-Bcl-X_{L} de células estimuladas con IL-4, disminuyendo a lo largo de todo el periodo de privación (figura 1A). La detección con sonda de la membrana con anticuerpo anti-Bcl-X_{L} demostró niveles similares en todas las condiciones analizadas. Se detectaron también PP1c y Bad en inmunoprecipitados de anticuerpo anti-Bcl-w de células estimuladas con IL-4, que disminuían tras someter a privación de linfocinas (figura 1A). Se detectó con sonda también la membrana con el anticuerpo anti-Bcl-w, mostrando niveles similares. La inmunoprecipitación para los lisados citoplasmáticos con un anticuerpo irrelevante, anticuerpo anti-cadena p55 de IL-2R, no pudo detectar esas asociaciones (figura 1B). De manera similar, se detectaron Bcl-X_{L}, Bcl-w y PP1c en inmunoprecipitados de Bad y se observó también la interacción entre estas proteínas mediante inmunoprecipitación de lisados libres de detergente así como en proteínas citoplasmáticas aisladas mediante lisis con digitonina (datos no mostrados). Se observaron también estas asociaciones en timocitos recién aislados (figura 1C). Dado que el número de complejos Bcl-X_{L}/PP1c/Bad y Bcl-w/PP1c/Bad disminuye tras la privación de IL-4, se analizó la regulación por disminución de la expresión de cualquiera de las proteínas implicadas en la formación del complejo. Por tanto, se analizó la expresión total de Bcl-x_{L}, Bcl-w, PP1c y Bad en células TS1\alpha\beta estimuladas con, o privadas de, IL-4. Se expresaron todas las proteínas analizadas en células estimuladas con, o privadas de, IL-4 (figura 2). Como control interno de carga de proteína, se detectaron con sonda las membranas con anticuerpo anti-histonas. Dado que el número de agregados disminuye tras la privación de IL-4 sin modificación de la expresión total de las proteínas del complejo, se analizó entonces si las modificaciones postraduccionales de Bcl-x_{L} o Bcl-w pueden afectar a la formación del complejo trimolecular. Se analizó a continuación el estado de fosforilación de serinas de Bcl-x_{L} y Bcl-w. Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de células estimuladas con o privadas de IL-4 con anticuerpo anti-Bcl-x_{L} o anti-Bcl-w y se realizó la inmunotransferencia con anticuerpos específicos anti-Pser, anti-PP1c, anti-Bad, anti-Bcl-w y anti-Bcl-x_{L} (figura 3). Se observó la fosforilación de serinas de Bcl-xL y Bcl-w en células estimuladas con IL-4 control, que disminuía tras la privación de IL-4. De acuerdo con los resultados de la figura 1, el nivel de Bad y PP1c asociados a Bcl-x_{L} y Bcl-w disminuye tras la privación de linfocinas. Este resultado sugiere una correlación entre la fosforilación de serinas de Bcl-x_{L} y Bcl-w y la formación de complejos trimoleculares.
Recientemente se demostró que IL-2, así como IL-3, induce la fosforilación de serinas de Bad (Ayllón et al, 2000). La figura 4A muestra que la IL-4 induce la fosforilación de Bad en la serina 136 pero no en las serinas 112 y 155. Además, la privación de IL-4 induce la desfosforilación de la serina 136 de Bad. Se usaron células estimuladas con IL-2 (C, fosforilación de ser 112 y 136) o células COS (C, fosforilación de ser 155) que sobreexpresaban Bad como controles positivos. La fosforilación de serinas de Bad inducida por IL-3 da como resultado su asociación a la proteína 14-3-3, suprimiendo la interacción con Bcl-x (Zhou et al, 2000). La figura 4B muestra que la fosforilación de serinas de Bad en respuesta a IL-4 no da como resultado la unión a la proteína 14-3-3. Se detectó esta proteína en los extractos totales a partir de células estimuladas con IL-4 control (carril T) y no se observó ni en PP1c, ni en los inmunoprecipitados de Bcl-xL o Bad de las células estimuladas con, o privadas de, IL-4. Como control interno, se muestra la interacción de Raf y la proteína 14-3-3 en inmunoprecipitados de Raf (figura 4B).
La figura 5A muestra la actividad fosfatasa en inmunoprecipitados de Bcl-x_{L}, Bcl-w y Bad de células estimuladas con IL-4. Se midió la actividad enzimática en los inmunoprecipitados usando fosforilasa a marcada con ^{32}P como sustrato. Es interesante observar que la actividad fosfatasa detectada en los inmunoprecipitados de Bcl-xL y Bcl-w corresponde casi a la actividad fosfatasa observada en los inmunoprecipitados de Bad. Para confirmar que esta actividad fosfatasa se debía a PP1c, se estimó la actividad enzimática en los inmunoprecipitados de Bad o Bcl-w de células estimuladas con IL-4 en presencia de diferentes concentraciones de ácido ocadaico (AO) (figura 5B). Las concentraciones de AO que inhiben la actividad de tipo 2A (10^{-9} M) no tenían ningún efecto sobre la actividad fosfatasa asociada a Bad o Bcl-w in vitro. La adición de AO 10^{-8} M a los inmunoprecipitados de Bcl-w o Bad da como resultado una inhibición de - 50% de la actividad fosfatasa, que se reduce fuertemente tras la adición de AO 10^{-6} M (figura 5B). También se estimó el efecto del AO sobre la actividad fosfatasa en sobrenadantes de los inmunoprecipitados de Bad y Bcl-w. Las concentraciones del AO que no tenían ningún efecto sobre la actividad enzimática en los inmunoprecipitados de Bad y Bcl-w (10^{-9} M) muestran una inhibición de \sim50% en el sobrenadante, tal como se esperaba a partir de una asociación de actividades de tipo 1 y tipo 2A (figura 5B). El efecto selectivo del AO sugiere que la actividad fosfatasa observada en los inmunoprecipitados de Bad y Bcl-w es PP1c.
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2.2. Bcl-w y Bcl-x_{L} son nuevas subunidades de selección como diana de PP1c
Recientemente se demostró que Bcl-2 es una subunidad de selección como diana de PP1c (Ayllón et al, 2001). Dado que Bcl-w y Bcl-x_{L} también se asocian a PP1c y que la secuencia del sitio de unión de Bcl-2 a PP1c está conservada en Bcl-x_{L} y Bcl-w, se lanzó la hipótesis de que estas moléculas antiapoptóticas pueden ser nuevas subunidades de selección como diana de PP1c. Para probar esta hipótesis, se redujo Bcl-x_{L} y Bcl-w mediante inmunoprecipitación secuencial con anticuerpo anti-Bcl-x_{L}+Bcl-w de los extractos citoplasmáticos de células estimuladas con IL-4. Se inmunoprecipitó el sobrenadante de la cuarta inmunoprecipitación con anticuerpo anti-Bcl-x_{L}+Bcl-w con anticuerpo anti-Bad (5º) y se estimó la actividad fosfatasa (figura 6A). Se detectaron trazas de actividad fosfatasa asociada a Bad en los extractos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w, en comparación con el alto nivel de actividad observado en los inmunoprecipitados de anticuerpo anti-Bad control de las células estimuladas con IL-4. Dado que en ausencia de Bcl-x_{L} y Bcl-w no se detectó ninguna actividad fosfatasa asociada a Bad significativa, se investigó la posibilidad de que estas moléculas antiapoptóticas puedan controlar el direccionamiento de PP1c a Bad. Para este fin, se realizaron inmunoprecipitaciones con anticuerpo anti-Bad en extractos citoplasmáticos de células estimuladas con IL-4 o en extractos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w (5º). Se detectaron PP1c, Bcl-x_{L} y Bcl-w en los inmunoprecipitados de anticuerpo anti-Bad control y no se observaron en los inmunoprecipitados de anticuerpo anti-Bad procedentes de extractos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w (figura 6B). En un experimento recíproco, se detectaron Bad, Bcl-x_{L} y Bcl-w en inmunoprecipitados de anticuerpo anti-PP1c de células control y no se observaron en inmunoprecipitados de PP1c procedentes de extractos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w (figura 6B). Este resultado sugiere que Bcl-x_{L} y Bcl-w son necesarios para la asociación de PP1c a Bad.
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2.3. Determinación del sitio de unión de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c
Se ha descrito que el motivo R/K X V/I X F lo comparten la mayor parte de las subunidades de selección como diana de PP1c (21, 23). Se demostró que la subunidad Bcl-2 de selección como diana de PP1c también comparte este motivo conservado (Ayllón et al, 2001). De manera interesante, las secuencias de Bcl-x_{L} y Bcl-w también contienen este motivo (figura 7B). Para analizar si esta secuencia de B_{cl}-x_{L} y Bcl-w estaba implicada en la unión a PP1c, se generaron péptidos inmovilizados en nitrocelulosa de las proteínas Bcl-x_{L} y Bcl-w que contenían este motivo. Se incubó la membrana con la proteína PP1c purificada. La figura 7B muestra las secuencias que interaccionan con PP1c. El motivo R/K X V/I X F (SEQ ID No. 10), presente en Bcl-x_{L} y Bcl-w, interacciona con PP1c y su mutación en los residuos V y F críticos reduce fuertemente la unión de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c (figura 7B). El análisis de los sitios de unión de Bcl-2 a PP1c mostró, además del motivo R/K X V/I X F (SEQ ID No. 10), dos secuencias (FSRRYR (SEQ ID No. 13) y FTARGR (SEQ ID No. 14), que se unen a PP1c (Ayllón et al, 2001). De manera interesante, también se observaron secuencias similares en Bcl-x_{L} y Bcl-w (figura 7A). Las secuencias FELRYR (SEQ ID No. 15) y FETRFR (SEQ ID No. 16) de Bcl-x_{L} y Bcl-w respectivamente, también interaccionan con PP1c y su mutación inhibe la unión a PP1c, aunque la afinidad depende del tipo de mutación puntual (figura 7B). Se determinó el motivo consenso de interacción F X X R X R (SEQ ID No. 5) mediante la comparación de secuencias de Bcl-2, Bcl-x_{L} y Bcl-w.
Para confirmar de manera concluyente que los motivos R/K X V/I X F y F X X R X R están implicados en la unión de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c, se llevaron a cabo experimentos de competencia en complejos trimoleculares. Se inmunoprecipitaron lisados de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo anti-Bad y se sometió a competencia la interacción Bcl-x_{L}/PP1c y Bcl-w/PP1c usando los péptidos R*(NWGRIAAAFSF) (SEQ ID No. 8), R (NWGRI
VAFFSF) (SEQ ID No. 6) o F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID No. 17) (figura 8A). Se detectaron Bcl-x_{L}, Bcl-w y PP1c en los inmunoprecipitados de anticuerpo anti-Bad control, así como en los inmunoprecipitados de anticuerpo anti-Bad tratados con el péptido R*. La cantidad de Bcl-x_{L}, Bcl-w y PP1c asociados a Bad disminuye tras la competencia con el péptido F o R, siendo casi indetectable con la competencia de los inmunoprecipitados de Bad con los péptidos F+R (figura 8A). Se observa un nivel similar de Bad en los inmunoprecipitados de anticuerpo anti-Bad control o tratados con péptido. Finalmente, para confirmar que Bcl-x_{L} y Bcl-w son subunidades de selección como diana de PP1c, se estimó la actividad fosfatasa en los inmunoprecipitados de Bad control o tratados con péptido. Se detectó la actividad fosfatasa en los inmunoprecipitados control o tratados con péptido R* (figura 8B), disminuyendo con la competencia de la interacción con los péptidos F o R. La actividad enzimática disminuyó fuertemente con la competencia con los péptidos R y F. Como control interno, la figura 8C muestra la actividad fosfatasa en los inmunoprecipitados de Bad control o tratados con péptido. La concentración del péptido F o R usada fue el doble de la concentración usada en los inmunoprecipitados tratados con el péptido F+R. Como en la figura 8B, la actividad fosfatasa se redujo drásticamente con el tratamiento de los inmunoprecipitados de Bad con los péptidos F+R. Tomados juntos, estos resultados ilustran que Bcl-x_{L} y Bcl-w, así como Bcl-2, son subunidades de selección como diana de PP1c.
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2.4. La inhibición de la actividad enzimática de PP1 bloquea la apoptosis
Dado que la privación de IL-4 se correlaciona con la desfosforilación de Bad y la apoptosis, se lanzó la hipótesis de que la inhibición de la actividad fosfatasa mediante el tratamiento con ácido ocadaico (AO) puede evitar la desfosforilación de Bad y la apoptosis. El tratamiento de las células con AO 1 \muM en ausencia de IL-4 evitó la desfosforilación de Bad en la serina 136 (figura 9A). No se observó ningún cambio en la expresión total de Bad tras el tratamiento con AO, lo que sugiere que el AO no afecta a la expresión de la proteína. Además, las células privadas de IL-4 tratadas con AO 1 \muM durante 6 h mostraron una reducción significativa en la fracción de células apoptóticas en comparación con células no tratadas (figura 9B). Finalmente, la inhibición de la expresión de Bcl-x_{L} y Bcl-w mediante el tratamiento con oligonucleótidos antisentido de las células también induce la apoptosis en células estimuladas con IL-4 (figura 9C). Se estimó la inhibición de la expresión de Bcl-x_{L} y Bcl-w tras el tratamiento con oligonucleótidos antisentido mediante inmunotransferencia de tipo Western.
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3. Resultados bioinformáticos - Secuencia distintiva predictiva para las interacciones de PP1: presencia combinatoria de los motivos [RK]VxF o [RK]xVxF y F-x-x-[RK]-x-[RK] en las proteínas de unión a PP1 caracterizadas
La presencia combinatoria de estos dos motivos de unión a PP1 sugiere un mecanismo general en el que la unión secuencial a PP1c a través de uno de estos motivos puede favorecer la unión a través del segundo motivo y permitir la función catalítica. Además, estos motivos también podrían representar una secuencia distintiva predictiva para identificar posibles nuevas proteínas de unión a PP1. Para probar parcialmente este concepto, se llevó a cabo un análisis bioinformático usando el programa "prose" (Katja Shuerer, IP) en la biblioteca Swissprot Release 40 (octubre de 2001) que contiene 101602 secuencias de proteínas no redundantes.
Tal como se muestra en la tabla 1A, la búsqueda para determinar la presencia de un solo consenso indica que el 19,47% de las secuencias en la biblioteca contiene los motivos [RK]VxF o [RK]xVxF y que el 16% contiene el motivo de tipo Bcl-2, F-x-x-[RK]-x-[RK]. Por el contrario, de manera consecuente con la noción de la secuencia distintiva predictiva, el análisis de la presencia combinatoria de ambos motivos de unión a PP1, [RK]VxF o [RK]xVxF y F-x-x-[RK]-x-[RK], sólo reveló 4013 secuencias positivas, correspondientes al 3,94% de la biblioteca (tabla 1B). Además, si se aplica la equivalencia F = W (normalmente aceptada para los motivos [RK]Vx[FW]/[RK]xVx[FW]), se encontraron 4783 secuencias positivas correspondientes al 4,7 de la biblioteca. Además, la equivalencia ocasional entre R/K y Q aumenta ligeramente el número de proteínas positivas (5769 secuencias correspondientes al 5,67%).
Además, tal como se esperaba, estas secuencias incluyen todas las proteínas conocidas que interaccionan con PP1 de la familia Bcl-2 (no mostrada). En conjunto, este análisis indica que aproximadamente el 5% de las secuencias de proteínas comparten los dos supuestos motivos de unión a PP1 en su secuencia. De manera interesante, el análisis estadístico sugiere que la distancia que separa los dos motivos de unión a PP1 comprende entre 0 y 180 aa para el 50% de las proteínas (figura 11). Además, un análisis más detallado revela un pico principal que representa el 22,3% de las secuencias positivas (897 secuencias para un total de 4013) que corresponden a un intervalo de 0-50 aa entre los dos motivos. Estos datos concuerdan con la observación de que una distancia de 36 aa separa los dos motivos de unión en los dominios BH1 y BH3 de las proteínas Bcl-2/Bcl-w y Bcl-x_{L} (no mostrados).
Partiendo de la base de este análisis, el Instituto Pasteur está creando y mantendrá en orden un nuevo sitio web "PP1 signature" que contiene todas las secuencias seleccionadas de la biblioteca de Swissprot Release 40 correspondientes a proteínas que albergan los dos motivos de unión a PP1. Mediante la simple introducción del nombre de una proteína o un número de registro o a través de un análisis con BLAST, se conocerá inmediatamente si la proteína tiene una supuesta secuencia distintiva de PP1. Además, el usuario identificará inmediatamente la secuencia que engloba los dos supuestos motivos de unión a PP1.
Las proteínas de unión a PP1 más caracterizadas comparten los dos motivos y pueden identificarse en el sitio web (tabla 2). Para validar esta propuesta de "estrategia de secuencia distintiva predictiva", se seleccionaron aleatoriamente cuatro candidatos y se confirmó su asociación a PP1 mediante simples experimentos de coinmunoprecipitación (figura 10B).
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TABLA 1A
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TABLA 1B 
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TABLA 2A Dos supuestas secuencias de unión a PP1 en proteínas que interaccionan con PP1 caracterizadas
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Ejemplo 4 Precursor \beta-amiloide como nueva proteína que interacciona con PP1
Los depósitos de amiloide fibrilar definen lesiones patológicas en enfermedades cerebrales de tipo Alzheimer y se cree que median en la muerte neuronal. El amiloide está compuesto por un fragmento de proteína de 39 a 42 aminoácidos de la proteína precursora amiloide (APP). Dado que se ha mostrado que la deposición de amiloide fibrilar in vitro depende de la concentración de APP, reducir o inhibir la liberación de APP es una diana terapéutica.
El precursor \beta-amiloide (APP) se sobreexpresa en células PC12 tratadas mediante NGF, mediante transfección de un ADNc que codifica para el precursor \beta-amiloide (APP) según los métodos de Sambrook et al., citado anteriormente.
Entonces se incuban las células que expresan el precursor \beta-amiloide con un péptido de penetración correspondiente al sitio de unión a PP1 punitivo tal como el motivo M1 que tiene la secuencia FXX[RK]X[RK] y el motivo M2 [RK]VX[FW] o [RKXVX[FW], en los que X es cualquier aminoácido.
Se somete a prueba la presencia de amiloide usando anticuerpos monoclonales o una sonda de hibridación marcada. No puede detectarse la presencia de amiloide.
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<110> INSTITUTO PASTEUR
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<120> MÉTODOS DE SELECCIÓN DE POLIPÉPTIDOS O PROTEÍNAS QUE INTERACCIONAN CON PP1, PÉPTIDOS QUE INHIBEN LA UNIÓN DE PP1c A PROTEÍNAS Bcl-2, Bcl-x_{L} Y Bcl-w, Y USOS DE LOS MISMOS
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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<400> 56
\hskip1cm62 
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<210> 57
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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<210> 58
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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<210> 59
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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<210> 60
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\hskip1cm66 
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<210> 61
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\hskip1cm67 
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<210> 62
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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<400> 62
\hskip1cm68 
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<210> 63
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\hskip1cm69 
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<210> 64
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\hskip1cm70 
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<210> 65
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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<400> 65
\hskip1cm71 
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<210> 66
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm72 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 67
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\hskip1cm73 
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<210> 68
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\hskip1cm74 
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<210> 69
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<211> 23
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\hskip1cm75 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 70
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<211> 22
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
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<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
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\hskip1cm76 
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<211> 23
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<212> PRT
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\newpage
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\hskip1cm77 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
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<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm78 
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<210> 73
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<211> 24
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm79 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
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<211> 20
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<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm80 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
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<211> 6
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm82 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip1cm83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip1cm84 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip1cm85 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm86 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip1cm87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip1cm88 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El péptido inhibe la unión de PP1C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip1cm89

Claims (26)

1. Conjunto de polipéptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 en el mismo polipéptido o M1 en un polipéptido y M2 en el otro polipéptido, en el que M1 y M2 son secuencias de unión a PP1 de mamífero, en el que M1 es RRNFVNKLKPL y M2 es NQAKKRVVFADSTVKVKNVSFEKK o M1 es LDFRNRLQTN y M2 es KKVKKRVS
FAND o M1 es RHFVNKLKPLKS y M2 es NQAKKRVVFADS o M1 es TCFRPRLRGS y M2 es SQKKKRWFADM o M1 es GEVFINKGKGF y M2 es RGRQLRVRFATH o M1 es QVKFRRRREG y M2 es YFKRYQVKFRRR o M1 es EDFKAKKKEL y M2 es RITPSYVAFTPE o M1 es SVFMQRLKTNILQ y M2 es IDEVKNVYFKNFVLKVS
WITFLLA o M1 es LQFELRYRPV y M2 es TTKAVMFAK o M1 es DLFENRKKKN y M2 es VRRVFIM o M1 es FFKNEKMLY y M2 es RRGSPRVRFEDG o M1 es RRNFVNKLKPL y M2 es TVKVKNVSFEKK.
2. Conjunto de polipéptidos según la reivindicación 1, en el que dichos péptidos están glicosilados, acetilados, fosforilados o amidados.
3. Conjunto de ácidos nucleicos aislados que codifican para un conjunto de péptidos según la reivindicación 1 o una secuencia de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con uno de dichos ácidos nucleicos que codifican para dicho conjunto de péptidos.
4. Vector que comprende los ácidos nucleicos según la reivindicación 3.
5. Método de identificación de un polipéptido o una proteína que interacciona con PP1, que comprende: detectar en la secuencia de dicho polipéptido o dicha proteína, la presencia de dos motivos M1 y M2 de unión a PP1 en el mismo polipéptido, en el que el motivo M1 y M2 se elige de uno de los pares de motivos de la reivindicación 1; y
confirmar dicho polipéptido o dicha proteína que interacciona con PP1 identificado usando una prueba bioquímica.
6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha prueba bioquímica consiste en coinmunoprecipitar dicho polipéptido o dicha proteína que interacciona con PP1 identificado y PP1.
7. Método de selección de compuestos que inhiben o potencian la actividad de PP1 o cambian su localización mediante interacción o que interaccionan con reguladores de PP1, que comprende:
(a)
inmovilizar péptidos según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 sobre un soporte; y
(b)
someter a prueba la interacción de dichos compuestos con los péptidos de la etapa (a).
\vskip1.000000\baselineskip
8. Método de selección de compuestos que interaccionan con PP1, que comprende:
i.
obtener anticuerpos frente a péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2; y
ii.
someter a prueba la interacción de dicho compuesto con dichos anticuerpos.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Compuesto farmacéutico que comprende el conjunto de péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2.
10. Composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica para el conjunto de péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2.
11. Composición farmacéutica que comprende el vector según la reivindicación 4.
12. Método para inhibir in vitro la interacción entre PP1c y Bcl-X_{L}, que comprende una etapa de añadir un conjunto de péptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 en el mismo péptido, en el que el conjunto de péptidos comprende uno de los pares de motivos M1 y M2 de la reivindicación 1.
13. Kit que comprende anticuerpos frente al conjunto de péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2 y reactivos para interpretar la interacción.
14. Uso del conjunto de péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2, para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la diabetes, la hipertensión, un trastorno neurológico, una enfermedad viral o una infección microbiana asociados a PP1.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que el trastorno neurológico es la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer.
16. Uso según la reivindicación 14, en el que la enfermedad viral es VIH-1.
17. Anticuerpos frente a los péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2.
18. Anticuerpos según la reivindicación 17, caracterizados porque son anticuerpos monoclonales.
19. Conjunto de polipéptidos según la reivindicación 1, en el que hay dos o más motivos M1 y M2 en el mismo polipéptido.
20. Conjunto de polipéptidos según la reivindicación 19, en el que hay de 2 a 5 motivos M1 y M2 en el mismo polipéptido.
21. Conjunto de polipéptidos según la reivindicación 19, en el que hay de 2 a 10 motivos M1 y M2 en el mismo polipéptido.
22. Conjunto de polipéptidos según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, en el que dichos motivos M1 y M2 tienen un espaciador entre ellos.
23. Conjunto de polipéptidos según la reivindicación 22, en el que el espaciador se selecciona de una secuencia de aminoácidos, una cadena hidrocarbonada o una entidad química que conecta los al menos dos motivos.
24. Conjunto de polipéptidos según la reivindicación 23, en el que dicho espaciador de aminoácidos tiene entre 1 y 50 aminoácidos.
25. Conjunto de polipéptidos según la reivindicación 23, en el que dicho espaciador de aminoácidos tiene 36 aminoácidos.
26. Conjunto de polipéptidos según la reivindicación 23, en el que dicho espaciador contiene secuencias reguladoras entre los motivos.
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