PT1361439E - Rastreio de peptidos inibindo a ligação de pp1c as proteínas blc-2, bcl-x e bcl-w - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "RASTREIO DE PÉPTIDOS INIBINDO A LIGAÇÃO DE PP1C ÀS PROTEÍNAS BLC-2, BCL-Xl E BCL-W"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A invenção refere-se a métodos para a identificação de novos polipéptidos e proteínas que interagem com a PPl, compostos que são capazes de inibir a ligação da PPlc a determinados factores que interagem naturalmente com esta, especialmente proteínas da família Bcl-2 (tal como a Bcl-χχ, e a Bcl-w), e composições farmacêuticas que compreendem a mesma.

ESTADO ANTERIOR DA TÉCNICA

As fosfatases de serina/treonina são classificadas como tipo 1 (PPl) ou tipo 2 (PP2), dependendo da especificidade do seu substrato e da sensibilidade aos inibidores. A PPl regula a progressão no ciclo celular, proliferação, transcrição, síntese de proteínas, citocinese e sinalização neuronal (Mc Avoy et al, 2001). A PPl é regulada através da sua interacção com uma variedade de subunidades proteicas que direccionam a subunidade catalítica (PPlc) para compartimentos subcelulares específicos e determinam a sua localização, actividade e selectividade do substrato (Bollen et al, 2001). A PPl pode ser regulada através da interacção entre uma subunidade catalítica e múltiplas subunidades alvo que permitem a desfosforilação específica de diversos alvos celulares. O número de subunidades conhecidas direccionam a PPlc está a aumentar continuamente e até à data perto de trinta proteínas distintas de mamífero têm sido já identificadas. A proteína que interage com a PPl inclui as subunidades de ligação ao glicogénio, 2 RGL /GM, GL, PTG/R5/U5, e a R6 as quais direccionam a fosfatase ao glicogénio, as subunidades de associação à miosina, M110, NIPP-1, p99/PNUTS, e Sds22, as quais podem dirigir a fosfatase para o núcleo (Bollen, 2001). Estudos anteriores baseados na análise por cristalografia estrutural e de raio-X de proteínas que interagem com a PP1 indicam que a PPlc se liga a distintas proteínas de interacção conhecidas através de uma pequena sequência de aminoácidos. Os domínios [RK]VxF (ou [RK]xVxF] representam uma sequência consenso comum para o reconhecimento e ligação de subunidades reguladoras distintas e proteínas de interacção com a PPl c (Egloff et al, 1997; Aggen et al, 2000).

Utilizando uma linha celular de células T de murino que pode ser expandida de modo independente na presença de IL-2 e IL-4 (Pitton et al, 1993), os inventores têm descrito que a PPlc é uma fosfatase activada pela Ras que defosforila a Bad (um membro pró-apoptótico da família de proteínas Bcl-2) antes de induzir a apoptose em resposta a uma ausência de de IL-2 (Ayllon et al, 2 000) . Através da realização de estudos bioquímicos competitivos, os inventores identificaram também recentemente a Bcl-2 como uma nova subunidade alvo da PPl c que controla a sua associação com a Bad em células estimuladas com IL-2 (Ayllon et al, 2001). A família de proteínas Bcl-2 actua como um ponto de controlo intracelular na via apoptótica. A família de proteínas Bcl-2 está dividida em dois grupos funcionais: os membros anti-apoptóticos como a Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Al e Mcl-1 e os membros pró-apoptóticos como a Bax, Bak, Bcl-xs bem como o membro Bad unicamente BH3 (White, 1996; Reed, 1998; Chão e Korsmeyer, 1998). O equilíbrio entre os homo- 3 e hetero-dímeros dos membros da família Bcl-2 podem ser críticos na manutenção da proliferação celular ou apoptose (Jacobson, 1997; Korsmeyer, 1999; Gross et al, 1999). A sobre- e sub-regulação destas proteínas pode ser responsável pela sobrevivência de alguns tipos de células, embora também seja possível que os factores de sobrevivência utilizem proteínas cinases e fosfatases para alterar a capacidade destas proteínas promoverem a sobrevivência celular ou a apoptose. Os membros anti-apoptóticos da família Bcl-2 interagem com outros agonistas de morte da família Bcl-2 e com proteínas que não são da família Bcl-2, incluindo R-Ras, HRas, Raf, caspases, calcineurina e a fosfatase de serina/treonina PPlc (Rebollo et al, 1999; Ayllón et al, 2001). A família Bcl-2 tem sido definida através de homologia de sequência baseada em domínios específicos conservados denominados regiões de homologia-Bcl (domínios BHl, BH2, BH3 e BH4) . Tem sido demonstrado que os domínios BHl, BH2 e BH3 são importantes na homodimerização e heterodimerização e na modulação da apoptose. As moléculas anti-apoptóticas têm um domínio BH4 específico. A Bad partilha a identidade apenas no domínio BH3 (Zha et al, 1997) e forma hetero-dímeros com a Bcl-2 e a Bcl-x (Otillie et al, 1997). Após estimulação de células com IL-3, NGF e GM-CSF, a Bad torna-se fosforilada na serina (Del Peso et al, 1997; Datta et al, 1997), o que resulta na associação à proteína 14-3-3 e na supressão da interacção com a Bcl-x (Hsu et al, 1997) . Tem sido recentemente demonstrado que a associação da proteína 14-3-3 à Bad é dependente da fosforilação na serina 55 da Bad (Datta et al, 2000; Zhou et al, 2000). 4 A Bcl-w é uma proteína pró-sobrevivência que contém os quatro domínios da homologia Bcl-2 conservados (Gibson et al, 1996) . A expressão reforçada de Bcl-w, como Bcl-2, torna as linhas celulares linfóides e mielóides resistentes à apoptose induzida por ausência de citocinas. A molécula anti-apoptótica Bcl-xL também contém os quatro domínios BH conservados (Núnez et al, 1994) . Uma segunda isoforma Bcl-x, a Bcl-xs, codifica para uma proteína mais pequena de 170 aminoácidos que aumenta a apoptose (Minn et al, 1996) . A Bc1-Xl contém um segmento hidrofóbico na extremidade C-terminal que se acredita servir como uma âncora membranar (Boise et al, 1993). A apoptose ou a morte celular programada é um processo activo no qual as células induzem a sua auto-destruição em resposta a sinais de morte celular específicos ou na ausência de sinais de sobrevivência celular. Na verdade, este processo activo é essencial no desenvolvimento normal e homeostase de organismos multicelulares. Este é oposto à necrose na qual a morte celular ocorre como resultado de alterações adversas severas no ambiente.

Ocorrem várias patologias devido a uma regulação deficiente ou aberrante da apoptose nas células afectadas de um organismo. Por exemplo, defeitos que resultem de um nível de apoptose diminuído num tecido comparado com o nível normal requerido para manter o estado estável do tecido podem promover um aumento anormal da quantidade de células num tecido. Isto tem sido observado em vários cancros, nos quais a formação de tumores ocorre porque as células não estão a morrer à sua taxa normal. Alguns vírus de DNA tal como o vírus Epstein-Barr, o vírus da febre suína africana e o adenovírus, também inibem ou modulam a apoptose, 5 reprimindo assim a morte celular e permitindo à célula hospedeira continuar a reproduzir o vírus.

Pelo contrário, um defeito que resulte num aumento de morte celular num tecido pode estar associado a distúrbios degenerativos nos quais as células estão a morrer a uma taxa mais alta da que estas regeneram. Isto é observado em vários distúrbios, tal com a SIDA, senescência, doenças neurodegenerativas.

Os compostos que modulam de modo positivo ou de modo negativo a apoptose podem fornecer meios para o tratamento ou prevenção destes distúrbios. Como uma consequência, o delineamento de vias apoptóticas fornece alvos para o desenvolvimento de agentes terapêuticos que podem ser utilizados para modular a resposta de uma celular a sinais apoptóticos ou de sobrevivência celular.

Os resultados descritos na presente invenção indicam que os membros anti-apoptóticos da família Bcl-2, Bcl-w e Bcl-xL, também são subunidades alvo da PPlc em células estimuladas com IL-4. Esta observação apresenta um meio para um novo mecanismo geral de regulação de apoptose celular que pode desempenhar um papel na regulação de moléculas pró- ou anti-apoptóticas na resposta à morte celular ou a sinais de sobrevivência celular. Deste modo a invenção é de uma particular importância nos campos de terapia do cancro e terapia de doenças neurodegenerativas.

De um modo mais geral, a presente invenção fornece meios para modular a interacção entre a PPl e as proteínas ou polipéptidos que se ligam a esta. Deste modo, a presente invenção têm aplicações num largo número de campos, uma vez 6 que a PPl está envolvida em muitas vias biológicas. Por exemplo, é conhecido que uma diminuição na fosforilação do complexo PPl activa as cadeias leves de miosina do músculo liso e daí relaxa os músculos lisos (ver, Uehata et ai., 1997). A pressão sanguínea elevada pode assim ser um alvo da presente invenção. A PPl é uma proteína eucariótica principal fosfatase da serina / treonina que regula diversos processos celulares como o ciclo celular, a transcrição e a síntese de proteínas. A regulação da PPl pode também afectar a regulação a jusante da síntese do glicogénio hepático a qual por sua vez irá baixar os níveis de glucose no sangue e assim tratar a diabetes na qual a hiperglicémia é um problema severo.

Adicionalmente, a PPl está envolvida em várias infecções bacterianas, virais e parasitárias, e inibindo a sua interacção com alguns dos seus parceiros num contexto infeccioso poderá ser benéfico para o doente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma série de polipéptidos que têm ambos os domínios Ml e M2 no mesmo polipéptido ou Ml num polipéptido e M2 no outro polipéptido e a qual é capaz de inibir a interacção Bcl-xL / PPlc, em que o domínio Ml tem a sequência NWGRIVAFFSF e o domínio M2 a sequência GDEFELRYRRAF.

Ainda noutra forma da realização a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um 7 péptido ou uma série de péptidos que têm ambos os domínios Ml e M2 e que são capazes de inibir as interacções Bcl-xL / PPlc, Bcl-w / PPlc, ou a Bcl-2 / Bad / PPlc. Tal composição pode, por exemplo, compreender os péptidos NWGRIVAFFSF e GDEFELRYRRAF. De acordo com a invenção também podem ser utilizados nas composições os péptidos com aminoácidos modificados (glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação ou derivação através de grupos protectores / bloqueadores conhecidos).

Ainda noutra forma da realização a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um vector que compreende um ácido nucleico que codifica para um péptido ou uma série de péptidos que têm ambos os domínios NWGRIVAFFSF e M2 GDEFELRYRRAF.

Noutra forma de realização a presente invenção refere-se a um método de identificação de um polipéptido ou proteína que interage com a PPl, que compreende: detecção na sequência dos referidos polipéptido ou proteína, da presença dos dois domínios de ligação à PPl Ml e M2 no mesmo polipéptido, em que o domínio Ml tem a sequência NWGRIVAFFSF e o domínio M2 tem a sequência GDEFELRYRRAF; e confirmação do referido polipéptido ou proteína de interacção com a PPl utilizando um teste bioquímico.

Ainda noutra forma da realização a presente invenção descreve um método de rastreio de compostos que interagem com os reguladores da PPl, em que os péptidos que têm ambos OS domínios Ml NWGRIVAFFSF e M2 GDEFELRYRRAF e que são capazes de inibir as interacções Bcl-xL/PPlc, Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc, estão imobilizados num suporte e é 8 testada a interacção dos referidos compostos com os referidos péptidos.

Ainda noutra forma da realização, a presente invenção refere-se a um método de rastreio de compostos que interagem com a PPl. Este método compreende a obtenção de anticorpos para péptidos que têm ambos os domínios Ml NWGRIVAFFSF e M2 GDEFELRYRRAF e que são capazes de inibir as interacções Bcl-xL/PPlc, Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc, e o teste da interacção dos referidos compostos com os referidos anticorpos.

Noutra forma de realização, a presente invenção refere-se a um método para inibir a interacção in vitro entre a PPlc e a Bcl-xL ou Bcl-w, que compreende um passo de adição de um péptido ou de uma série de péptidos que têm ambos os domínios Ml NWGRIVAFFSF e M2 GDEFELRYRRAF.

Nos métodos acima, os péptidos que têm ambos os domínios Ml e M2 e que são capazes de inibir as interacções Bcl-xL/PPlc, a Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc podem ser por exemplo os péptidos NWGRIVAFFSF e GDEFELRYRRAF.

Ainda noutra forma da realização, a presente invenção refere-se a um kit compreendendo os péptidos que têm ambos os domínios Ml e M2 e que são capazes de inibir as interacções Bcl-xL/PPlc, Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc. Tal kit pode, por exemplo, compreender os péptidos NWGRIVAFFSF e GDEFELRYRRAF. Estes péptidos podem ser imobilizados num suporte sólido.

Ainda noutra forma da realização a presente invenção refere-se a um kit que contém anticorpos para os péptidos 9 que têm ambos os domínios Ml e M2 e que são capazes de inibir as interacções Bcl-xL/PPlc, Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc. Os referidos anticorpos podem por exemplo ser criados contra os péptidos NWGRIVAFFSF e GDEFELRYRRAF.

Ainda noutra forma da realização a presente invenção refere-se à utilização de péptidos que têm ambos os domínios Ml NWGRIVAFFSF e M2 GDEFELRYRRAF e que são capazes de inibir as interacções Bcl-xL/PPlc, Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc, para a preparação de um medicamento para tratar diabetes ou hipertensão ou distúrbios neurológicos ou uma infecção virai ou uma doença parasitária. Os péptidos NWGRIVAFFSF e GDEFELRYRRAF podem por exemplo ser utilizados de acordo com a invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Associação da Bcl-xL e Bcl-w à PPlc e Bad. A) Os extractos citoplasmáticos obtidos a partir de células estimuladas (60 U/ml) ou privadas de IL-4 foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Bcl-xL ou anti-Bcl-w, transferidos para nitrocelulose e colocados a hibridar com anticorpo anti-Bad, anti-PPlc, anti-Bcl-xL e anti-Bcl-w. As bandas de proteína foram detectadas utilizando o sistema ECL. São apresentados os pesos moleculares das proteínas correspondentes. Foram obtidos resultados similares em três experiências independentes. B) Os extractos citoplasmáticos obtidos a partir de células estimuladas com IL-4 foram imunoprecipitados com anticorpo de cadeia I1-2R anti-p55, transferidos para nitrocelulose e colocados a hibridar com anticorpos anti-Bcl-w, Bcl-xL ou IL-2R anti-p55. As bandas de proteína foram detectadas utilizanndo o sistema ECL. C) Os extractos citoplasmáticos obtidos a partir de timócitos 10 isolados recentemente foram imunoprecipitados com anti-Bad, anti-PPlc ou um soro irrelevante e colocados a hibridar com anti-Bcl-2, anti-Bcl-xL, anti-Bad e anti-PPlc. As proteínas foram detectadas como em A. Foram obtidos resultados similares em três experiências independentes.

Figura 2. Efeito da ausência de IL-4 na expressão de Bad, PPlc, Bc1-xl e Bcl-w. A) As células ΤΞίαβ foram estimulados ou privadas com IL-4 para os tempos indicados, depois lisadas. As proteínas foram transferidas para a nitrocelulose e colocadas a hibridar através de sonda com anticorpos anti-Bcl-xL, anti-Bad e anti-PPlc. Foram obtidos resultados similares em duas experiências independentes. B) Os extractos citoplasmáticos obtidos a partir de células estimuladas ou privadas durante 24h de IL-4 foram imunoprecipitados com anti-Bcl-xL ou anti-Bcl-w, separados num gradiente em gel de SDS-PAGE e colocados a hibridar com anti-Pser, anti-Bad, anti-PPlc e, como controlo interno, com anti-Bcl-xL e Anti-Bcl-w. Foram obtidos resultados similares em três experiências independentes. C) Os extractos citoplasmáticos obtidos a partir de células (1 x 1Q7} controlo, estimuladas ou privadas de IL-4 foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Bad e colocados a hibridar com serina 112, serina 136 e serina 155 anti-Bad. Como controlo interno, a hibridação foi desenvolvida com anticorpo anti-Bad. Foram obtidos resultados similares em duas experiências independentes. Controlo positivo para a fosforilação da serina 112 e 13 6 da Bad, células estimuladas com IL-2 (poço C) ; controlo positivo para a 11 fosforilação da serina 155 da Bad, células COS transfectadas com Bad (poço C) . D) Os extractos totais (T) dos lisados citoplasmáticos obtidos a partir de células (1 x 10') estimuladas e privadas de IL-4 foram imunoprecipitados com anticorpo anti-PPlc, anti-Raf, anti-Bcl-χτ, ou anti-Bad e colocados a hibridar com anti-14-3-3, anti-PPlc, anti-Bcl-xL e anti-Bad. Foram obtidos resultados similares em duas experiências independentes.

Figura 3. Estimativa da actividade de fosfatase de serina/treonina no controlo ou em imunoprecipitados de anti-Bcl-xL, Bad e Bcl-w tratados com OA. A) A actividade da fosfatase foi estimada em

imunoprecipitados de Bad, Bcl-xL e Bcl-w obtidos a partir de células estimuladas com IL-4 utilizando a 32P fosforilase a como substrato. B) Foram adicionadas diferentes concentrações de OA a imunoprecipitados de Bad ou Bcl- xL obtidos a partir de células estimuladas com IL-4. A actividade da fosfatase foi estimada utilizando a 32P fosforilase a como substrato. A reacção foi como em A. Foram obtidos resultados similares em três experiências independentes. A actividade da fosfatase é representada como a percentagem de actividade máxima em sobrenadantes não tratados.

Figura 4. Estimativa da actividade de fosfatase de serina/treonina após depleção com Bcl-xL e Bcl-w. 12 A)A BcI-xl e a Bcl-w foram depletadas a partir de lisados citoplasmáticos de células estimuladas com IL-4 através de quatro imunoprecipitações sequenciais. A actividade da fosfatase foi estimada em imunoprecipitados de Bad obtidos a partir de células controlo estimuladas com IL-4 ou em imunoprecipitados de Bad depletados de Bcl-xL e Bcl-w após quatro imunoprecipitações sequenciais. A actividade da fosfatase é representada como a percentagem da actividade máxima detectada em imnoprecipitados controlo anti-Bad. B) Foi analisado o efeito da depleção de Bcl-xL e Bcl-w na associação PPlc/Bad. Os extractos citoplasmáticos obtidos a partir de células controlo estimuladas com IL-4 ou extractos citoplasmáticos depletados de Bcl-xL, e Bcl-w foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Bad ou anti-PPlc e colocados a hibridar com anti-Bad, anti-Bcl-w, anti-Bcl-xL e anti-PPlc. Foram obtidos resultados similares em três experiências independentes. As bandas de proteína foram detectadas utilizando o sistema ECL.

Figura 5. Ensaio de ligação PPlc em péptidos Bcl-xL ou Bcl-w ligados a celulose. A) Sequência do domínio F X X R X R de Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-w. B) A membrana com os péptidos Bcl-xL ou Bcl-w que contêm o domínio R/K X v/l XFouFXXRXR, bem como péptidos que contêm domínios mutados foram incubados com a PPlc purificada, seguido de anticorpo anti-PPlc e anticorpo secundário comjugado com PO. As pontuações foram detectadas utilizando o sistema ECL. Os domínios R/K X V/I X F e F X X R X R estão a negrito. Os aminoácidos mutados no domínio estão a negrito e sublinhados. Foram obtidos resultados similares em duas experiências independentes. 0 péptido 1 corresponde ao domínio de ligação PPl da Bcl-xL e Bcl-w. 0 13 péptido 2 corresponde ao local de ligação ao PPl inutado onde os resíduos V e F foram mutados para A.

Figura 6. Efeito dos péptidos R, R*, F e R + F na interacção Bcl-xL /PPlc/Bad e Bcl-w/PPlc/Bad. A) Extractos citoplasmáticos obtidos a partir de células controlo estimuladas com IL-4 foram imunoprecipitas com anticorpo anti-Bad. A interacção Bcl-xL /PPlc/Bad e Bcl-w/PPlc/Bad foi colocada a competir com 1,5 mM de péptidos R, R*, F ou R + F durante 30 min à temperatura ambiente. Os imunoprecipitados foram lavados, transferidos para a nitrocelulose e colocados a hibridar com anti-Bad, anti-PPlc, anti-Bcl-xL e anti-Bcl-w. Foram obtidos resultados similares em duas experiências independentes. Para a sequência dos péptidos, ver Material e Métodos ou Fig 5A e 5B. B) Os lisados citoplasmáticos obtidos a partir de células estimuladas com IL-4 foram imunoprecipitadas com anticorpo anti-Bad. Os imunoprecipitados foram tratados com 1,5 mM de péptidos R, R*, F ou R + F durante 30 min à temperatura ambiente. Os imunoprecipitados foram lavados e a actividade da fosfatase estimada utilizando a 32P fosforilase a como substrato. Foram obtidos resultados similares em duas experiências independentes. C) Os lisados citoplasmáticos obtidos a partir de células estimuladas com IL-4 foram imunoprecipitadas com anticorpo anti-Bad e posteriormente tratados com 1,5 mM de péptido R + F ou 3 mM de péptido R ou F (3 0 min, temperatura ambiente). Os imunoprecipitados foram lavadas e a actividade de fosfatase estimada com em B. 14

Figura 7. Efeito de OA e oligonucleótidos reverse na apoptose e na fosforilação da serina 136 na Bad. A) As células foram tratados com ou sem 1 μΜ de OA na presença ou na ausência de IL-4. Os lisados citoplasmáticos foram imunoprecipitados com o anticorpo anti-bad, transferidos para a nitrocelulose e colocados a hibridar através de uma sonda com ser 136 da fosfo-bad e anti-Bad, o último para verificar o tratamento que o tratamento com OA in vivo não afecta a expressão de Bad. As bandas de proteína foram detectadas utilizando ECL. B) As células foram tratadas durante 6 h com ou sem 1 μΜ de OA na presença ou ausência de IL-4 e posteriormente lavadas, coradas com iodeto de propídio e analisadas através de citometria de fluxo. C) As células foram tratadas durante 24 h com ou sem 15 μΜ de oligonucleótidos forward ou reverse na presença ou na ausência de IL-4. Foram adicionados oligonucleótidos às 0, 12 e 18 h e posteriormente as células foram lavadas, coradas com com iodeto de propídio e analisadas através de citometria de fluxo. A expressão de Bcl-xL e Bcl-w após o tratamento forward e reverse foi analisada através de western blot.

Figura 8. A) Dois supostos domínios de ligação nas proteínas Bcl-2. 0 alinhamento da sequência na vizinhança do domínio BHl e BH3 de algumas proteínas Bcl-2. Estas sequências são conservadas de modo perfeito em várias espécies (humano, rato, ratazana, bovino...) B)Um papel para a fosforilação da Serina na ligação à PPl 15

Foram sintetizados seis péptidos (de 14 AA de comprimento) e ligados de modo covalente a uma membrana de celulose antes de serem analisados para a ligação à PPl como descrito. Foi introduzida em 4 péptidos uma mutação pontual AA na Ser-136 (mutante2,3,5,6). C) Associação da P13-K p85 (poço 1), P13-K pllO (poço 2), HSP70 (poço 3), e CD4 (poço 4) à PPlc.

Foram utilizadas para a imunoprecipitação células TS1 αβ (1 x 107) tratadas com IL-4 como normalmente descrito. Os imunoprecipitados foram transferidos para a nitrocelulose, bloqueados e incubados com anticorpo primário anti-PPlc. A membrana foi lavada e incubada com anticorpo secundário conjugado com PO e as proteínas foram desenvolvidas utilizando o ECL.

Figura 9. Histograma para ilustrar o número de proteínas e o número de aminoácidos que distam os domínios F-xx-[RK]-x-[RK] e [RK]-V-x-[FW]/ [RK]-x-V-x-[FW] (A) [RK]-V-x-F/ [RK]-x-V-x-F (B).

FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS DA INVENÇÃO

Os seguintes termos que são utilizados durante a restante especificação e reivindicações e devem ser entendidos para significar, para além da definição geral, a seguinte definição mais precisa; sendo entendido que as definições gerais também estão incluídas.

Como aqui utilizado, a palavra "aspecto" significa qualquer característica técnica ou elemento da invenção reivindicada. 16

Como aqui utilizado, a palavra "mimetizar" significa semelhança próxima quer na estrutura e/ou função.

Como aqui utilizado, a palavra "isolado" significa tirado a partir do ambiente natural. Isolado não significa necessariamente que o que é tirado a partir do ambiente natural é 100% purificado.

Como aqui utilizado o termo "teste bioquímico" significa qualquer teste que é capaz de identificar um polipéptido ou proteína de interacção. Exemplos de testes bioquímicos incluem, mas não estão limitados a, imunoprecipitação, utilização de anticorpos quer monoclonais ou policlonais, sondas de oligonucleótidos que podem ser marcados com radioactividade ou com uma enzima, pulldown de GST (experiência de filtração em gel que revela o tamanho dos complexos macromoleculares) como descrito em Ayllón et ai EMBO J. 19 2237-2246 (2000), e os semelhantes.

Como aqui utilizado, o termo "domínio" significa uma sequência ou sequências de aminoácidos particulares que são semelhantes e têm a mesma função em diferentes ambientes celulares. Um domínio apresenta alguns aminoácidos fixos e alguns variáveis.

Como aqui utilizado e durante toda a especificação e nas reivindicações, quando vários aminoácidos se encontram entre parêntesis recto, isto significa que o aminoácido dentro do parêntesis recto pode ser um ou outro. Deste modo [RK] significa que o domínio pode ter R ou K. 17

Como aqui utilizado, a palavra "inibe" significa prevenção das interacções específicas, independentemente do mecanismo desta prevenção.

Como aqui utilizado uma "composição farmacêutica" inclui, mas não está limitada a, os péptidos da presente invenção descritos durante a especificação e um transportador aceite farmaceuticamente. Esta composição farmacêutica compreende uma quantidade de péptidos da presente invenção aceite farmaceuticamente. A quantidade de péptidos aceite farmaceuticamente pode ser estimada a partir de ensaios de cultura de células. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar um intervalo de concentração de circulação que inclui ou cubra um ponto ou intervalo de concentrações que têm o efeito desejado num sistema in vitro. Esta informação pode ser assim utilizado para determinar de modo preciso as doses em animais, incluindo humanos. A dose eficaz terapeuticamente refere-se àquela quantidade de composto que resulta na correcção dos sintomas num doente. A toxicidade e a eficácia terapêutica destes compostos podem ser determinada através procedimentos farmacêuticos padrão em cultura de células ou em animais experimentais. Por exemplo, a LD50 (a dose letal para 50 % da população) bem como a ED50 (a dose eficaz terapeuticamente para 50 % da população) podem ser determinadas utilizando métodos conhecidos na técnica. A razão de dose entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico que pode ser expresso como a razão entre compostos LD 50 e ED50 que exibem altos índices terapêuticos. 18

Os dados obtidos a partir de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de um intervalo de dosagem de tais compostos o qual se situa de modo preferido dentro de um intervalo de concentrações em circulação que inclui a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A composição farmacêutica poderá ser administrada através de qualquer via tal como de modo localizado, de modo oral, de modo sistémico, de modo intravenoso, de modo intramuscular, através das mucosas, utilizando um penso e pode ser encapsulada em lipossomas, micropartícuias, microcápsulas, e os semelhantes. A composição farmacêutica pode ser embebida em lipossomas ou até encapsulada. A composição farmacêutica pode ser também numa forma liofilizada.

[0039] Qualquer transportador ou adjuvante aceite farmaceuticamente pode ser utilizado na composição farmacêutica. O composto modulador será por exemplo numa forma solúvel combinada com um transportador aceite farmaceuticamente. As técnicas para a formulação e administração destes compostos podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publication Co., Easton, PA, última edição. O modo de administração das dosagens óptimas e formas galénicas pode ser determinado através dos critérios conhecidos na técnica tendo em conta a seriedade da condição geral do mamífero, incluindo o humano, a tolerância do tratamento e os efeitos secundários. 19

As "composições farmacêuticas" também incluem vectores os quais podem ser administrados directamente in vivo ou podem ser combinados com células específicas que podem ser ou podem não ser extraídas a partir do animal a ser tratado. Os tipos de células incluem todas as células eucarióticas e procarióticas incluindo músculo, coração, fígado, pulmão, células do cérebro, timócitos, sangue e os semelhantes. As células de planta e de bactéria também podem ser incluídas na presente invenção uma vez que a PPl é encontrada em muitos tipos diferentes de células de planta e de bactéria. As células de levedura também estão incluídas na presente invenção. Na verdade qualquer célula que contenha PPl está incluída na presente invenção.

Assim incluídas pelo termo "composições farmacêuticas" estão todas as formas não só de administração farmacêutica clássica, mas também inclui terapia génica.

Pelo termo "suporte" está designado qualquer tipo de objecto no qual os péptidos possam ser imobilizados. 0 tipo de suporte inclui, mas não está limitado a, poros costar, esferas, resinas, chips de vidro, membranas e os semelhantes. Qualquer suporte que possa ser utilizado para imobilizar proteínas ou péptidos pode ser utilizado nos métodos da presente invenção. Q termo "animal" inclui qualquer ser vivo que não seja um vegetal, incluindo vertebrados tal como mamíferos, aves, répteis, anfíbios e peixes.

Como aqui utilizado os termos "polinucleótidos", "ácidos nucleicos" e "oligonucleótidos" são utilizados de modo intervariável e incluem, mas não são limitados a RNA, DNA, 20 sequências de RNA/DNA de mais do que um nucleótido quer em cadeia simples ou forma dupla. As sequências de polinucleótido da presente invenção podem ser preparadas a partir de qualquer método conhecido incluindo, mas não limitado a, qualquer método sintético, qualquer método recombinante, qualquer método de geração ex vivo e os semelhantes, bem como as suas combinações.

Os polinucleótidos que podem hibridar com qualquer dos nucleótidos discutidos acima também são abrangidos pela presente invenção. Tais nucleótidos são referidos aqui como polinucleótidos "capazes de hibridar". Os polinucleótidos capazes de hibridar podem ser úteis como sondas ou primers, por exemplo.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, tais moléculas capazes de hibridar são de pelo menos 10 nucleótidos de comprimento. De acordo com outra forma de realização da presente invenção, estes são de pelo menos 25 ou pelo menos 50 nucleótidos de comprimento.

Numa forma de realização, as moléculas capazes de hibridar irão hibridar com tais moléculas com tais moléuclas sob condições de hibridação restritas. Um exemplo de condições de hibridação restrita é onde a tentativa de hibridação é levada a cabo a uma temperatura a partir de cerca de 35aC a cerca de 652C utilizando uma solução salina a qual é cerca de 0,9 molar. Contudo, o indivíduo especialista será capaz de variar tais condições como apropriado de modo a ter em conta variáveis tais como o comprimento da sonda, a composição em bases, tipo de iões presentes, etc. 21

Por "prevenção ou tratamento" é entendido controlar uma doença ou condição médica ou deter o início de uma doença ou de uma condição médica.

De um modo mais específico, a presente invenção relaciona-se com um péptido ou uma série de péptidos os quais mimetizam ambos os domínios Ml e M2 e os quais afectam as interacções Bcl-xL/PPlc, a Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc, em que o domínio Ml tem a sequência FXX[RK] X[RK] , e o domínio M2 tem a sequência [RK]VX[FW] ou [RK]XVX[FW], em que X é qualquer aminoácido. A presente invenção refere-se uma série de péptidos que compreendem o péptido NWGRIVAFFSF/ e o péptido GDEFELRYRRAF.

Os péptidos ou série de péptidos de acordo com a presente invenção, ou incluídos nas composições e kits da invenção, podem compreender dois ou mais domínios na mesma molécula, ou 2 a 10 domínios, cujos domínios são descritos acima, tendo um espaçador entre estes. O espaçador pode ser uma sequência de aminoácidos ou uma cadeia de hidrocarbonos inserida através de ligações covalentes. Um espaçador também pode ser qualquer entidade química que pode servir para connectar os pelo menos dois domínios, e o espaçador também pode conter sequências reguladoras entre os pelo menos dois domínios.

Numa outra forma de realização, o espaçador da presente invenção tem desde cerca de 1 a cerca de 50 aminoácidos. Numa forma de realização particular, o espaçador tem cerca de 36 aminoácidos. 22

Numa outra forma de realização, a presente invenção refere-se a um polipéptido de fusão ou proteína que contêm pelo menos um domínio da presente invenção. Este polipéptido de fusão ou proteína podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos na técnica tal como aqueles descritos em Sambrook et ai, Molecular Cloning A Laboratory Manual 2-edição (1989). Um polipéptido de fusão particular ou proteína da invenção compreendem um ou vários domínios Ml ou M2, ligados a pelos menos um péptido fusogénico o qual irá ajudar o polipéptido de fusão ou proteína a entrar nas células alvo. 0 referido péptido fusogénico pode ser por exemplo um epítopo virai ou um ligando para um receptor celular específico como os receptores de quimiocinas.

Os domínios acima, os seus análogos e modificações podem ser sintetizados utilizando, por exemplo, um sintetizador "Applied System" ou através de síntese em fase sólida do tipo Merrifield (ver, Merrifield, Adv. Enzmol. Related Areas Mol. Biol. (1969) 32; 221-96 ou Merrfield, Recent Prog. Horm. Res. (1967); 23; 451-82). Os domínios também podem ser produzidos de modo recombinante. A sequência do ácido nucleico que codifica para os domínios pode ser inserida num vector de expressão o qual contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência codificante do péptido/proteína inseridos. Tais elementos de transcrição incluem uma região reguladora e um promotor. Assim, o ácido nucleico que pode codificar para um composto marcador da presente invenção está ligado de modo operacional a um promotor no vector de expressão. 0 vector de expressão pode também incluir uma origem de replicação. 23 É utilizada uma vasta variedade de combinações do hospedeiro/ vector de expressão na expressão dos ácidos nucleicos da presente invenção. Os vectores de expressão útil que podem ser utilizados incluem, por exemplo, segmentos de de cromossomas, não cromossomas e sequências de DNA sintéticas. Os vectores apropriados incluem, mas não estão limitados a, derivados de SV40 e pcDNA e plasmídeos de bactérias conhecidos tal como col El, pCRl, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX como descrito por Smith et al (1988), pMB9 e os seus derivados, plasmídeos tal como RP4, DNAs de fagos tal como os numerosos derivados do fago I tal como NM989, bem como outro DNA de fago tal como o Ml3 e DNA filamentosa de cadeia simples de fago; plasmídeos de levedura tal como o plasmídeo 2 micron ou derivados do plasmídeo 2m, bem como vectores vaivém centroméricos e integrativos de levedura; vectores úteis em células eucarióticas tal como vectores úteis em células de insecto ou mamífero; vectores derivados a partir de combinações de plasmídeos e DNAs de fagos, tal como plasmídeos que tenham sido modificados para utilizar DNA de fago ou as sequências de controlo de expressão; e os semelhantes.

Por exemplo num sistema de expressão de baculovírus, ambos os vectores de transferência de não-fusão, tal como, mas não limitados a pVL941 (local de clonagem BamHI Summers), PVL1393 (locais de clonagem BamHI, Smal, Xbal, EcoRl, Notl, XmalII, BglII e PstI; Invitrogen), pVLl392 (local de clonagem BglII, PstI , Notl , XmalII, EcoRl, Xball , Smal and BamHI; Summers e Invitrogen) e pBlueBaclll (local de clonagem BamHI, BglII , PstI , Ncol e HindIII, com rastreio recombinante azul/branco, Invitrogen), e vectores de transferência de fusão tal como, mas não limitados a, pAc700 (locais de clonagem BamHI e Kpnl, nos quais o sítio 24 de reconhecimento pela BamHI começa no codão de iniciação; Summers), pAc701 e pAc70-2 (semelhante a pAc700, com diferentes grelhas de leitura), pAc360 (local de clonagem BamHI a 36 pares de base a jusante de um codão de iniciação polihedrina; Invitrogen (1995)) e pBlueBacHisA, B, C (três grelhas de leitura com local de clonagem BamHI, Bglll, PstI, Ncol e Hindlll, pode ser utilizado um péptido N-terminal para purificação ProBond e rastreio de placas recombinante azul/branco; Invitrogen (220)).

Os vectores de expressão de mamíferos contemplados para utilização na invenção incluem vectores com promotores induzidos, tal como os promotores da redutase de dihidrofolato, qualquer vector de expressão com cassete de expressão DHFR ou um vector de co-amplificação DHFR/metotrexato tal como o pED (locais de clonagem PstI, Sal, Sbal, Smal e EcoRl, com o vector a expressar ambos o gene clonado e o DHFR; Kaufman, 1991). De modo alternativo um vector de co-amplificação de sintetase de glutamina/sulfoximina de metionina, tal como o pEEl4 (locais de clonagem Hindlll, Xball, Smal, Sbal, EcoRl e Bell nos quais o vector expressa sintetase de glutamina e o gene clonado; Celltech). Pode ser utilizado um vector que dirige expressão epissomal sob o controlo do Vírus Epstein Barr (EBV) ou do antigénio nuclear (EBNA) tal como o pREP4 (locais de clonagem BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll, Nhel, Pvull e Kpnl, o promotor constitutivo RSV-LTR, o marcador genético higromicina; Invitrogen), o pCEP4 (locais de clonagem BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, Hindlll,Nhel, Pvull e Kpnl, promotor precoce imediato do gene de hCMV contitutivo, o marcador genético higromicina; Invitrogen), pMEP4 (locais de clonagem Kpnl, Pvul, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil, BamHI, promotor de indução do gene metalotiona 25 lia, marcador genético higromicina, Invitrogen), pREP8 (locais de clonagem Kpnl, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil, BamHl, promotor RSV-LTR, marcador genético histidinol; Invitrogen), pREP9 (locais de clonagem Kpnl, Nhel, Hindlll, Notl, Xhol, Sfil, BamHl, promotor RSV-LTR, marcador genético G418, Invitrogen), e pEBVHis (promotor RSV-LTR, marcador genético higromicina, péptido N-terminal purificado através de resina ProBond e clivado pela enterocinase; Invitrogen).

Os vectores genéticos de expressão de mamíferos para a utilização na seguinte invenção incluem, mas não estão limitados a, pRC/CMV (locais de clonagem Hindlll, BstXl, Notl, Sbal e Apal, selecção em G418, Invitrogen), pRc/RSV (locais de clonagem Hindlll, Spel, BstXl, Notl, Xbal, selecção em G418, Invitrogen) e os semelhantes. Os vectores de expressão de mamíferos do vírus vaccinia (ver, por exemplo Kaufman 1991) que podem ser utilizados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, pSCll (Pequeno local de Clonagem, selecção em β-gal TKand), pMJ601 (locais de clonagem Sal, Smal, Afll, NarI, BspMll, BamHl, Apal, Nhel, SacII, Kpnl e Hindlll; selecção em TK e β-gal), pTKgptFlS (locais de clonagem EcoRl, PstI, SalII, Accl, HindII, Sbal, BamHl e Hpa, selecção em TK ou XPRT) e os semelhantes.

Os sistemas de expressão de leveduras que também podem ser usados na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, o vector de não-fusão pYES2 (locais de clonagem Xbal, Sphl, Shol, Notl, GstXl, EcoRl, BstXl, BamHl, Saci, Kpnl e Hindlll, Invitrogen), a fusão pYESHisA, B, C (locais de clonagem Xball, Sphl, Shol, Notl, BstXl, EcoRl, BamHl, Saci, Kpnl e Hindlll, péptido N-terminal 26 purificado com resina ProBond e clivado com enterocinase, Invitrogen), vectores pRS e os semelhantes.

Consequentemente, são utilizadas na presente invenção células de mamífero e tipicamente humanas, bem como células de bactéria, levedura, fungo, insecto, nemátodo e de plantas e podem ser transfectadas por ácido nucleico ou vector recombinante como aqui definido.

Exemplos de células apropriadas incluem, mas não estão limitadas a, células VERO, HELA tal como a ATCC No. CCL2, linhas celulares CHO tal como a ATCC No. CCL61, células COS tal como as células COS-7 e as células ATCC No. CRL 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3 tal como a ATCC No. CRL6361, A549, PC12, células K562, células 293, células Sf9 tal como a ATCC No. CRL1711, células Cvl tal como a ATCC No. CCL7 0 e células JURKAT tal como a ATCC No. Tibl52.

Outras células apropriadas que podem ser utilizadas na presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, estirpes de células de hospedeiro procarióticas tal como a Escherichia coli, (e.g., estirpe DH5-a), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, ou estirpes do género Pseudomonas, Streptomyces e Staphylococcus, parasitas como os parasitas Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia), Leishmania ou Trypanosoma.

Adicionalmente, células adequados que podem ser utilizadas na presente invenção incluem células de levedura tal como aquelas de Saccharomyces tal como o Saccharomyces cerevisiae ou Prombe. 27

Os domínios e péptidos descritos acima estão envolvidos na ligação Bcl-xL e Bcl-w a PPlc e deste modo são assim subunidades alvo envolvidas no controlo de todas as ligações ao PPl. Deste modo, devido à sua implicação na ligação ao PPl, estes domínios são importantes para a regulação de qualquer doença que diga respeito à regulação da fosfatase em todos os tipos de células incluindo todas as células eucarióticas e procarióticas incluindo músculo, coração, fígado, pulmão, células de cérebro, timócitos, sangue e as semelhantes. As células de planta e bactéria são também incluídas na presente invenção uma vez que a PPl é encontrada em muitos tipos diferentes de células de planta e bactéria. As células de levedura estão também incluídas na presente invenção. Na verdade qualquer célula que contenha a PPl é compreendida na presente invenção.

De um modo mais importante, esta regulação pode efectuar a regulação a jusante da, por exemplo, síntese de glicogénio hepático a qual por sua vez iria baixar os níveis de glucose no sangue e assim tratar a diabetes na qual a hiperglicémia é um problema grave. Os péptidos da presente invenção podem ser utilizados para a preparação de um medicamento para tratar a diabetes. Os péptidos da presente invenção podem ser utilizados para a preparação de um medicamento para tratar a pressão sanguínea elevada. Uma diminuição na fosforilação do complexo PPl activa as cadeias leves de miosina do músculo liso e assim relaxa os músculos lisos (ver, Uehata et al. , 1997). Deste modo, os péptidos da presente invenção podem ser utilizados para a preparação de um medicamento para tratar a hipertensão.

Ainda noutra forma de realização a presente invenção refere-se a péptidos utilizados para a preparação de um 28 medicamento para tratar distúrbios neurológicos através da modulação de receptores neurológicos e canais de iões. Deste modo, os péptidos da presente invenção podem ser utilizados para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir os distúrbios neurológicos, tal como a doença de Parkinson. A fosforilação é conhecida por desempenhar um papel na efecção do percursor β-amilóide o qual causa as pragas na doença de Alzheimer. Deste modo, a presente invenção refere-se à utilização de péptidos da presente invenção para a preparação de um medicamento para prevenir ou tratar a doença de Alzheimer.

Ainda noutra forma de realização, a presente invenção refere-se a infecções virais ou microbianas e de um modo mais específico ao vírus herpes simplex, Myocbacterium tuberculosis e à SIDA através da utilização de péptidos da presente invenção para a preparação de um medicamento para prevenir ou tratar a infecção virai. A presente invenção é especialmente útil para tratar a SIDA uma vez que ambas a TAT e transcriptase reversa do vírus HIV-1 poderão ser proteínas de ligação à PPl.

Ainda noutra forma de realização, a presente invenção refere-se a infecções por parasitas tal como a malaria, theíleria ou cryptosporidium através da utilização dos péptidos da presente invenção para a preparação de um medicamento para prevenir ou tratar estas infecções por parasitas. 29

Por exemplo, podem ser administrados no referido animal uma série de péptidos que compreende o péptido NWGRIVAFFSF e o péptido GDEFELRYRRAF, análogos destes péptidos ou os seus equivalentes funcionais num veículo aceite farmaceuticamente.

Noutra forma de realização a presente invenção refere-se a composições farmacêuticos que compreendem um péptido ou uma série de péptidos que mimetizam ambos os domínios Ml e M2 e as quais inibem as interacções Bcl-xL/PPlc, a Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc. Tal composição pode por exemplo compreender o péptido NWGRIVAFFSF e o péptido GDEFELRYRRAF, análogos destes péptidos ou os seus equivalentes funcionais num veículo aceite farmaceuticamente. 0 veículo aceite farmaceuticamente inclui, mas não está limitado a, salinos, adjuvantes e os semelhantes, discutidos de um modo mais extensivo acima. A presente invenção não está limitada apenas a péptidos aqui descritos como uma composição farmacêutica "pura", mas também como uma composição farmacêutica para utilização na terapia génica, que utiliza vectores que codificam para polipéptidos de acordo com a presente invenção.

De um modo mais específico a terapia génica ex vivo e in vivo poderá ser previsível. No que diz respeito a este assunto, qualquer uma das metodologias disponíveis na técnica relacionadas com terapia génica poderão ser utilizadas na prática acima tal como aquelas descritas por Goldspiel et al Clín. Pharm. 12 pgs. 488-505 (1993). 30 A entrega do ácido nucleico terapêutico num doente pode ser directa na terapia génica in vivo (i.e., o doente é directamente exposto ao ácido nucleico ou ao vector que contém o ácido nucleico) ou indirecta na terapia génica ex vivo (i.e. as células são primeiro transformadas in vitro com o ácido nucleico e depois transplantadas no doente).

Por exemplo para a terapia génica in vivo, um vector de expressão contendo o ácido nucleico poderá ser administrado de um modo tal que este se torna intracelular; i.e., através de infecção utilizando um vector anormal ou retroviral atenuado ou outros vectores virais como descrito, por exemplo no documento da Patente U.S. 4,980,286 ou por Robbins et al, Pharmacol. Ther., 80 N2 1 pgs. 35-47 (1998) .

Os vários vectores retrovirais que são conhecidos na técnica são tais como aqueles descritos em Miller et al. (Meth. Enzymol. 217 pgs. 581-599 (1993)) os quais têm sido modificados para deletar aquelas sequências retrovirais que não são necessárias para o empacotamento do genoma virai e subsequente integração no DNA da célula hospedeira. Também podem ser utilizados vectores adenovirais os quais são vantajosos devido à sua capacidade para infectar células que não estão em divisão e tais vectores adenovirais de capacidade elevada são descritos em Kochanek (Human Gene Therapy, 10, pgs. 2451-2459 (1999)). Os vectores virais quiméricos que podem ser utilizados são aqueles descritos por Reynolds et al. (Molecular Medecine Today, pgs. 25-31 (1999)). Também podem ser utilizados os vectores híbridos e são descritos por Jacoby et al. (Gene Therapy, 4, pgs. 1282-1283 (1997)) . 31

Também pode ser utilizada em terapia génica a injecção directa de DNA isolado ou através da utilização de bombardeamento de micropartículas (e.g. , Gene Gun®; Biolistic, Dupont) ou através do revestimento do mesmo com lípidos. Para direccionar tipos de células que expressam de modo específico os receptores de interesse podem ser utilizados receptores de superfície celular/compostos transfectantes ou através de encapsulamento em lipossomas, micropartículas ou microcápsulas ou através da administração do ácido nucleico em ligação com o péptido o qual é conhecido por entrar no núcleo ou através da administração do mesmo em ligação com um ligando predisposto para endocitose mediada por receptor (Ver Wu & Wu, J. Biol. Chem., 262 pgs. 4429-4432 (1987)).

Noutra forma de realização pode ser produzido um composto ligando de ácido nucleico no qual o ligando compreende um péptido virai fusogénico designado de modo a romper endossomas, permitindo assim que o ácido nucleico evite a subsequente degradação nos lisossomas. In vivo o ácido nucleico pode ser alvo de endocitose celular específica e expressão através do direccionamento de um receptor específico tal como aquele descrito em W092/06180, W093/14188 e WO93/20221. De modo alternativo o ácido nucleico pode ser introduzido de modo intracelular e incorporado dentro do genoma da célula do hospedeiro para expressão através de recombinação homóloga (ver Zijlstra et al, Nature, 342, pgs. 435-428 (1989)).

Na terapia génica ex vivo, um gene é transferido in vitro para dentro das células utilizando cultura de tecidos e as células são entregues ao doente através de vários métodos tal como injecção de modo subcutâneo, aplicação das células 32 num enxerto de pele e a injecção intravenosa de células recombinantes do sanguet al como células hematopoiéticas estaminais ou progenitoras.

As células nas quais o ácido nucleico pode ser introduzido para os objectivos de terapia génica incluem, por exemplo, células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células do músculo, hepatócitos e células sanguíneas. As células sanguíneas que podem ser utilizadas incluem, por exemplo, linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos, células hematopoiétics ou células progenitoras e as semelhantes.

Os polipéptidos e complexos de polipéptidos da invenção também têm utilização na criação de anticorpos. Deste modo, a presente invenção fornece anticorpos, os quais podem ser monoclonais ou policlonais.

Deste modo, os polipéptidos e complexos da invenção podem ser utilizados como um imunogénio para gerar anticorpos que se ligam especificamente a este imunogénio. Os anticorpos da invenção incluem, mas não estão limitados a policlonais, monoclonais, bi-específicos, humanizados ou anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, fragmentos Fab e fragmentos F (ab'), fragmentos produzidos através de uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id), e fragmentos ligados ao epítopo de qualquer dos fragmentos acima. 0 termo "anticorpo" como aqui usado refere-se a moléculas de imunoglobulina e porções activas imunologicamente de moléculas de imunoglobulina, i.e., moléculas que contêm um local de ligação ao antigénio que se liga de modo específico a um antigénio. As moléculas de 33 imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer classe (e.g. , IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) ou subclasse de molécula de imunoglobulina.

Na produção de anticorpos, o rastreio para o anticorpo desejado pode ser conseguido através de técnicas conhecidas na técnica, e.g., ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado a uma enzima). Por exemplo, para seleccionar anticorpos que reconheçam um domínio específico de um polipéptido da invenção (e.g., um Domínio de Interacção Seleccionado), o indivíduo pode fazer um ensaio de hibridomas gerados para um produto que se liga a um fragmento de polipéptido que contém esse domínio. Para selecção de um anticorpo que se ligue especificamente a um primeiro homólogo polipéptido mas que não se ligue especif icamente a (ou se ligue com menos avidez a) um segundo homólogo polipéptido, o indivíduo pode seleccionar na base da ligação positiva ao primeiro homólogo polipéptido e uma falta de ligação ao (ou reduzida ligação a) segundo homólogo polipéptido.

Para a preparação de anticorpos monoclonais (mAbs) dirigidos a um polipéptido da invenção ou a um fragmento ou a um seu análogo, pode ser utilizada qualquer técnica que forneça a produção de moléculas de anticorpo através de linhas células contínuas em cultura. Por exemplo, a técnica de hibridoma desenvolvida originalmente por Kohler e Milstein (1975, Nature 256: 495-497), bem como a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al. , 1983, Immunology Today 4: 72), e técnica de hibridoma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al. , 1985, em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo 34

IgG, IgM, igE, IgA, IgD e qualquer das suas subclasse. 0 hibridoma que produz os mAbs da invenção pode ser colocado em cultura in vitro ou in vivo. Numa forma de realização adicional da invenção, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos em animais livres de germes utilizando qualquer tecnologia conhecida (PCT/US90/02545,).

Os anticorpos monoclonais incluem mas não estão limitados a anticorpos monoclonais de humano e anticorpos monoclonais quiméricos (e.g. , quimeras humano-rato). Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções são derivadas a partir de espécies de animais diferentes, tais como aquelas que apresentam uma região constante de imunoglobulina humana e uma região variável derivada a partir de um mAb de murino (Ver, e.g., Cabilly et al. , documento da Patente U.S. N2 4,816,567; e Boss et al., documento da Patente U.S. N2 4,816397).

Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo obtidas a partir de espécies não-humanas que têm uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) obtidas a partir de espécies não-humanas e uma região estrutural obtida a partir de uma molécula de imunoglobulina humana (Ver, e.g., Queen, documento da Patente U.S. N2 5, 585,089,).

Os anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados podem ser produzidos através de técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica, por exemplo utilizando os métodos descritos em Publicação PCT Na WO 87/02671; Patente de Aplicação Internacional 184, 187; Patente de Aplicação

Internacional 171,496; Patente de Aplicação Internacional 173,494; Publicação PCT N2 WO 86/01533; Patent U.S. Ns 35 4,816,567; Patente de Aplicação Internacional 125,023; Better et al. , 1988, Science 240: 1041-1043; Liu et al. , 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. , 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 214-218; Nishimura et al. , 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. , 1985, Nature 314: 446-449; e Shaw et al., 1988, J. Natl. Câncer Inst. 80: 1553-1559; Morrison, 1985, Science 229: 1202-1207; Oi et al. , 1986, Bio/Techniques 4: 214; documento da Patente U.S. 5,225,539; Jones et al. , 1986, Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; e Beidler et al. , 1988, J. Immunol. 141: 4053-4060.

Os anticorpos completamente humanos são desejados de modo particular para o tratamento terapêutico de doentes humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos utilizando ratinhos transgénicos que são incapazes de expressar endogenamente genes da cadeia pesada e leve da imunoglobulina, mas que podem expressar genes da cadeia pesada e leve da imunoglobulina. Os ratinhos transgénicos são imunizados da forma normal com um antigénio seleccionado, e.g. , toda ou uma porção de uma BPI da invenção. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio podem ser obtidos utilizando tecnologia convencional de hibridomas. Os transgenes da imunoglobulina humana contidos nos ratinhos transgénicos rearranjam durante a diferenciação de células B, e subsequentemente sofrem troca de classe e mutação somática. Deste modo, utilizando tal técnica, é possível produzir de modo terapêutico anticorpos igG, IgA, IgM e IgE úteis. Para uma visão global desta tecnologia para produzir de anticorpos humanos, ver Lonberg e Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13: 65-93). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para 36 produzir anticorpos humanos e anticorpos humanos monoclonais e protocolos para produzir tais anticorpos, ver, e.g., documento da Patente U.S. 5,625,126; documento da Patente U.S. 5,633,425; documento da Patente U.S. 5,569,825; documento da Patente U.S. 5,661,016; e documento da Patente U.S. 5,545,806. Adicionalmente, companhias como a Abgenix, Inc. (Freemont, CA) e Genpharm (São José, CA) podem estar empenhadas em fornecer anticorpos humanos dirigidos contra um antigénio seleccionado utilizando tecnologia similar àquela descrita acima.

Podem ser gerados anticorpos humanos completos que reconheçam um epítopo seleccionado utilizando uma técnica referida como "selecção guiada". Nesta aproximação é utilizado um anticorpo monoclonal não-humano seleccionado, e.g., um anticorpo de rato, para guiar a selecção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epítopo. (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12: 899-903) .

Os anticorpos da presente invenção também podem ser gerados utilizando vários métodos de apresentação em fagos conhecidos na técnica. Nos métodos de apresentação em fagos, os domínios funcionais do anticorpo são apresentados na superfície de partículas de fagos que transportam sequências de polinucleótidos que codificam para os mesmos. De um modo mais específico, tal fago pode ser utilizado para apresentar domínios de ligação ao antigénio expressos a partir de um repertório ou de uma biblioteca combinatória de anticorpos (e.g. humano ou murino). Os fagos que expressam um domínio de ligação ao antigénio o qual se liga ao antigénio de interesse podem ser seleccionados ou identificados com antigénio, e.g., utilizando um antigénio 37 marcado ou um antigénio ligado ou capturado numa superfície sólida ou esfera. Os fagos utilizados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos incluindo os domínios de ligação fd ou Ml3 expressos a partir a partir de um fago com domínios de anticorpo Fab, Fv ou Fv estabilizado com dissulfito fundidos de modo recombinante com quer o gene III do fago ou o gene VIII da proteína. Os métodos de apresentação em fagos que podem ser utilizados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem aqueles descritos em Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995); Ames et al. , J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); PCT Application No. PCT/GB91/01134; PCT Publications WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e documentos da Patente U.S. Ns. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 e 5,969,108;.

Como descrito nas referências acima, após a selecção dos fagos, as regiões codificantes do anticorpo obtidas a partir do fago podem ser isoladas e utilizadas para gerar anticorpos completos, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento desejado de ligação ao antigénio, e expressas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de insecto, células de planta, levedura, e bactéria, e.g., como descrito em detalhe abaixo. Por exemplo, técnicas para produzir de modo recombinante fragmentos Fab, Fab' e F (ab') 2 também podem ser empregues utilizando métodos conhecidos na artet al como aqueles descritos em PCT publication WO 92/22324; 38

Mullinax et al. , BioTechniques 12 (6): 864-869 (1992); e Sawai et al. , AJRI 34: 26-34 (1995); e Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988).

Exemplos de técnicas que podem ser utilizadas para produzir Fvs de cadeia simples e anticorpos incluem aqueles descritos em documentos das Patentes U.S. 4,946,778 e 5,258,498; Huston et al. , Methods in Enzymology 203: 46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90: 7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240: 1038-1040 (1988).

Adicionalmente a invenção providencia para a utilização de anticorpos bi-específicos, os quais podem ser produzidos através de métodos conhecidos na arte. A produção tradicional de anticorpos bi-específicos de comprimento total é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada - cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias têm diferentes especificidades (Milstein et al., 1983, Nature 305: 537-539). Devido à selecção ao acaso das cadeias pesada e leve da imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura bi-específica correcta. A purificação da molécula correcta, a qual é normalmente realizada por passos de cromatografia de afinidade, é bastante volumosa, e os rendimentos de produto são baixos. Estão descritos procedimentos semelhantes em WO 93/08829, publicado a 13 Maio 1993, e em Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10: 3655-3659 .

De acordo com uma aproximação diferente, os domínios variáveis do anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo - antigénio) são 39 fundidos com as sequências de domínio constante da imunoglobulina. A fusão pode ser com um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, que compreende pelo menos parte da junção, regiões CH2, e CH3. De um modo geral, a primeira região constante da cadeia pesada (CHI) que contém o local necessário para a ligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam para as fusões da cadeia pesada da imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vectores de expressão separados, e são co-transfectados num organismo hospedeiro apropriado. Isto fornece grande flexibilidade no ajustamento das proporções mútuas dos três fragmentos de polipéptidos em formas de realização quando diferentes razões das três cadeias de polipéptidos utilizadas na construção fornecem rendimentos óptimos. Contudo, é possível inserir num vector de expressão as sequências codificantes para dois ou todos os três polipéptidos quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipéptidos em razões iguais resulta em rendimentos altos ou quando as razões não são de particular significância.

Numa outra forma de realização desta aproximação, os anticorpos específicos são compostos por uma cadeia pesada híbrida de imunoglobulina com uma primeira especificidade de ligação num braço, e um par híbrido cadeia pesada -cadeia leve de imunoglobulina (fornecendo uma segunda especificidade) no outro braço. Foi verificado que esta estrutura assimétrica facilita a separação do composto bi-específico desejado a partir das combinações de cadeia de imunoglobulina não desejadas, uma vez que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula específica fornece um modo fácil de separação. 40

Esta aproximação é descrita em WO 94/04690 publicada em 3 Março, 1994. Para detalhes adicionais para geração de anticorpos bi-específicos ver exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121: 210. A invenção fornece fragmentos activos funcionalmente, derivados ou análogos de moléculas de imunoglobulina do anti-polipéptido. Funcionalmente activo significa que o fragmento, derivado ou análogo é capaz de provocar anticorpos anti-anti-idiotipo (i.e., anticorpos terciários) que reconhecem o mesmo antigénio que é reconhecido pelo anticorpo a partir do qual o fragmento, derivado ou análogo é originado. De um modo específico, numa forma de realização, a antigenicidade do idiotipo da molécula de imunoglobulina pode ser aumentada pela delecção de sequências de estrutura ou CRD que estão na posição C-terminal em relação à sequência CDR que reconhece especificamente o antigénio. Para determinar quais as sequências CDR ligadas ao antigénio, podem ser utilizados péptidos sintéticos que contêm as sequências CDR em ensaios de ligação como o antigénio através de qualquer método de ensaio de ligação conhecido na técnica. A presente invenção fornece fragmentos de anticorpo tal como, mas não limitados a, fragmentos F (ab') 2 e fragmentos Fab. Os fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Os fragmentos F (ab') 2 consistem da região variável, da região constante da cadeia leve e do domínio CHI da cadeia pesada e são gerados através de digestão com pepsina da molécula de anticorpo. Os fragmentos Fab são gerados através da redução das pontes dissulfito dos fragmentos F (ab') 2. A invenção também fornece dímeros de 41 cadeia pesada e cadeia leve dos anticorpos da invenção, ou de qualquer seu fragmento mínimo tal como Fvs ou anticorpos de cadeia simples (SCAs) (e.g., como descrito em documento da Patente U.S. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242: 423-42; Huston et ai., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 85: 5879-5883; e Ward et al., 1989, Nature 334: 544-54), ou qualquer outra molécula com a mesma especificidade do anticorpo da invenção. Os anticorpos de cadeia simples são formados através da ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv por uma ponte de aminoácido, resultando num polipéptido de cadeia simples. Podem ser utilizadas técnicas para junção dos fragmentos Fv funcionais em E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038-1041).

Noutras formas de realização, a invenção fornece proteínas de fusão das imunoglobulinas da invenção (ou dos seus fragmentos funcionalmente activos), por exemplo nas quais a imunoglobulina é fundida através de uma ligação covalente (e.g., uma ligação peptídica), quer no N-terminal ou no C-terminal da sequência de aminoácidos de outra proteína (ou da sua porção, de modo preferido uma porção de pelo menos 10, 20 ou 50 aminoácidos da proteína) que não é a imunoglobulina. Numa forma de realização, a imunoglobulina, ou o seu fragmento, é ligada de modo covalente a outra proteína no N-terminal do domínio constante. Como referido acima, tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação, aumentar o tempo de meia vida in vivo, , e aumentar a transição de um antigénio através de uma barreira epitelial para o sistema imunitário.

As imunoglobulinas da invenção incluem análogos e derivados que são ambos modificados, i.e., através de junção covalente de qualquer tipo de molécula desde que tal junção 42 covalente não impeça a ligação específica. Por exemplo, mas não através de meio de limitação, os derivados e análogos das imunoglobulinas incluem aqueles que têm sido modificados adicionalmente, e.g., através de glicosilação, acetilação, peguilação, fosforilação, amidação, derivatização através de grupos protectores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Qualquer dos numerosas modificações químicas pode ser levada a cabo através de técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitadas a clivagem química específica, acetilação, formilação, etc. Adicionalmente, o análogo ou derivado podem conter um ou mais aminoácidos não-clássicos.

Os anticorpos anteriores podem ser utilizados em métodos conhecidos na arte relacionados com a localização e actividade dos polipéptidos da invenção, e.g., para imagiologia ou radioimagiologia destas proteínas, medição dos seus níveis em amostras fisiológicas apropriadas, em métodos de diagnóstico, etc. e para radioterapia.

Os anticorpos da invenção podem ser produzidos através de qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, por exemplo, através de síntese química ou através de expressão recombinante, e são produzidos de modo preferido através de técnica de expressão recombinante. A expressão recombinante de anticorpos, ou fragmentos, derivados ou os seus análogos, requere construção de um ácido nucleico que codifica para o anticorpo. Se a sequência de nucleótidos do anticorpo é conhecida, um ácido nucleico que codifica para o anticorpo pode ser sujeito a junção a partir de oligonucleótidos sintetizados 43 quimicamente (e.g., como descrito em Kutmeier et ai., 1994, BioTechniques 17:242), a qual, de modo breve, envolve a síntese de oligonucleótidos abrangentes que contêm porções da sequência que codifica para o anticorpo, hibridação e ligação destes nucleótidos, e posteriormente amplificação dos oligonucleótidos ligados através de PCR.

De modo alternativo, o ácido nucleico que codifica para o anticorpo pode ser obtido através de clonagem do anticorpo. Se não está disponível um clone que contém o ácido nucleico que codifica para o anticorpo particular, mas é conhecida a sequência da molécula de anticorpo, pode ser obtido um ácido nucleico que codifique para o anticorpo a partir de uma fonte apropriada (e.g., uma biblioteca de cDNA de anticorpos, ou uma biblioteca de cDNA gerada a partir de qualquer tecido ou células que expressem o anticorpo) através de amplificação por PCR utilizando primers sintéticos que hibridem com os terminais 3' e 5' da sequência ou através de clonagem utilizando uma sonda de oligonucleótido específica para a sequência do gene particular.

Se uma molécula de anticorpo que reconhece especificamente um antigénio particular não está disponível (ou uma fonte de biblioteca de cDNA para clonagem de um ácido nucleico que codifique para estet al anticorpo), podem ser gerados anticorpos específicos para um antigénio particular através de qualquer método conhecido na arte, por exemplo, através da imunização de um animal, tal como um coelho, para gerar anticorpos policlonais ou, através da geração de anticorpos monoclonais. De modo alternativo, pode ser obtido através de rastreio da bibliotecas de expressão de Fab um clone que codifique para pelo menos a porção Fab do anticorpo (e.g., 44 como descrito em Huse et ai., 1989, Science 246: 1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se liguem ao antigénio específico ou através de rastreio de bibliotecas de anticorpos (Ver, e.g., Clackson et al. , 1991, Nature 352: 624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 94: 4937) .

Uma vez obtido um ácido nucleico que codifica pelo menos o domínio variável da molécula de anticorpo, este pode ser introduzido num vector que contém a sequência de nucleótidos que codifica para a região constante da molécula de anticorpo (Ver, e.g., PCT Publication WO 86/05807; PCT Publication wo 89/01036; e documento da Patente U.S. Ns 5,122,464) . Também estão disponíveis os vectores que contêm a cadeia completa leve ou pesada para co-expressão com o ácido nucleico para permitir a expressão de uma molécula completa de anticorpo. Posteriormente, o ácido nucleico que codifica para o anticorpo pode ser utilizado para introduzir a substituição(s) ou delecção(s) de nucleótido necessária para substituir (ou deletar) uma ou mais regiões variáveis de resíduos de cisteína que participam numa ligação dissulfito intracadeia com um resíduo de aminoácido que não contém o grupo sulfidrilo. Tais modificações podem ser levadas a cabo através de qualquer método conhecido na arte para introduzir mutações específicas ou delecções numa sequência de nucleótidos, por exemplo, mas não limitado a, mutagénese química, mutagénese dirigida in vitro (Hutchinson et al. , 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), métodos baseados em PCT, etc.

Adicionalmente, podem ser utilizadas técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 81: 851-855; Neuberger et 45 al. , 1984, Nature 312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452-454) através de splicing de genes a partir de uma molécula de anticorpo de rato de especificidade apropriada para o antigénio em conjunto com genes de uma molécula de anticorpo de humano de actividade biológica apropriada. Como descrito acima, um anticorpo quimérico é uma molécula na qual diferentes porções são derivadas a partir de diferentes espécies de animais, tais como aquelas que apresentam uma região variável derivada a partir de um mAb de murino e uma região constante de anticorpo de humano, e.g. , anticorpos humanizados.

Uma vez obtido um ácido nucleico que codifique para uma molécula de anticorpo da invenção, o vector para a produção de uma molécula de anticorpo pode ser produzido através de tecnologia de DNA recombinante utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Deste modo, são aqui descritos métodos para a preparação da proteína da invenção através da expressão de ácidos nucleicos que contêm as sequências da molécula de anticorpo. Podem ser utilizados métodos que são bem conhecidos por aqueles especialistas na técnica para construir vectores de expressão que contêm sequências codificantes para a molécula de anticorpo e sinais controlo de transcrição e tradução apropriados. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas de síntese, e recombinação génica in vivo. Ver, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) e Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY). 46 O vector de expressão é transferido para a célula hospedeira através de técnicas convencionais e as células transfectadas são posteriormente colocadas em cultura através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo da invenção.

As células do hospedeiro utilizadas para expressar um anticorpo recombinante da invenção podem ser quer células de bactérias tal como a Escherichia coli, ou células eucarióticas, especialmente para a expressão da molécula completa de anticorpo recombinante. De um modo mais específico, as células de mamífero tal como as células de ovário de hamster chinês (CHO), em conjunção com um vector tal como o principal intermediário do elemento do promotor precoce do gene do citomegalovírus humano é um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., 198, Gene 45: 101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2).

Podem ser utilizados uma vasta variedade de sistemas de vectores de expressão do hospedeiro para expressar uma molécula de anticorpo da invenção Tais sistemas de expressão de hospedeiro representam veículos através dos quais podem ser produzidas e subsequentemente purificadas as sequências codificantes de interesse, mas também representa células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências codificantes de nucleótidos apropriadas, expressar in si tu a molécula de anticorpo da invenção. Estas incluem mas não estão limitadas a microorganismos tal como bactérias (e.g., E. coli, B. subtilis) transformadas com DNA recombinante de bacteriófagos, DNA de plasmídeo ou vectores de expressão de DNA de cosmídeo que contêm sequências codificantes do anticorpo; levedura (e.g. Saccharomyces, Pichia) 47 transformada com vectores de expressão recombinantes de levedura que contêm sequências codificantes de anticorpo; sistemas celulares de insecto infectados com vectores de expressão de vírus recombinantes (e.g., baculovirus) que contêm as sequências codificantes de anticorpo; sistemas celulares de planta infectados com vectores de expressão de vírus recombinantes (e.g. vírus mosaico da couve-flor, caMV; vírus mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vectores de expressão de plasmídeos recombinantes (e.g., plasmídeo Ti) que contêm sequências codificantes de anticorpo; ou sistemas celulares de mamífero (e.g., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que transportam constructos de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamífero (e.g., promotor da metalotionina) ou de vírus de mamífero (e.g., o promotor tardio do adenovírus; o promotor 7,5 K do vírus vaccinia).

Nos sistemas bacterianos, pode ser seleccionado de modo vantajoso um número de vectores de expressão dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo a ser expressa. Por exemplo, quando é para ser produzida uma larga quantidade det al proteína, para a geração de composições farmacêuticas compreendendo uma molécula de anticorpo, podem ser desejáveis vectores que dirigem a expressão de altos níveis de produtos de proteína de fusão que estão de imediato purificados. Tais vectores incluem, mas não estão limitados a, ao vector de expressão pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), no qual a sequência codificante do anticorpo pode ser ligada individualmente dentro do vector em alinhamento com a região codificante do lacZ de modo que seja produzida uma proteína de fusão, vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 48 5503-5509); e os semelhantes. Também podem ser utilizados vectores pGEX para expressar polipéptidos estranhos como proteínas de fusão com S-transferase de glutationa (GST). Geralmente, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser facilmente purificadas a partir de células lisadas através de adsorção e ligação a esferas glutationo agarose em matriz seguida de eluição na presença de glutationo livre. Os vectores pGEX são desenhados de modo a incluir trombina ou locais de clivagem da protease factor Xa de modo que o produto do gene alvo clonado possa ser libertado a partir da região GST.

Num sistema de insecto, o vírus de poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) é utilizado como vector para expressar genes estranhos. O vírus cresce em células Spodoptera frugiperda. A sequência codificante do anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemlo o gene poliedrina) do vírus e colocada sob o controlo de um promotor AcNPV (por exemplo o promotor do poliedrina). Em células hospedeiras de mamífero, pode ser utilizado um número de sistemas de expressão baseados em vírus (e.g., um sistema de expressão adenovírus).

Como acima discutido, pode ser escolhida uma estirpe de célula hospedeira que module a expressão das sequências inseridas, ou modifique e processe o produto do gene do modo específico desejado. Tais modificações (e.g., glicosilação) e processamento (e.g., clivagem) dos produtos de proteína podem ser importantes para a função da proteína. 49 A expressão estável é útil para produção a longo prazo e de alto rendimento de anticorpos recombinantes. Por exemplo, podem ser produzidas linhas celulares que expressem de modo estável um anticorpo de interesse através da transfecção das células com um vector de expressão que compreende uma sequência de nucleótidos do anticorpo e uma sequência de nucleótidos de um marcador genético (e.g., neomicina ou higromicina), ou da selecção para a expressão do marcador genético. Tais linhas celulares fabricadas podem ser úteis no rastreio e avaliação de compostos que interagem de modo directo ou indirecto com a molécula do anticorpo.

Os níveis de expressão da molécula de anticorpo podem ser aumentados por amplificação em vector (para uma revisão, ver Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nova Iorque, 1987)). Quando um marcador num sistema de vector que expressa um anticorpo é amplificável, o aumento no nível do inibidor presente em cultura da célula hospedeira irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também irá aumentar (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257). A célula hospedeira pode ser transfectada com dois vectores de expressão da invenção, o primeiro vector que codifica um polipéptido derivado de cadeia pesada e o segundo vector que codifica um polipéptido derivado de cadeia leve. Os dois vectores podem conter marcadores genéticos idênticos os quais permitem igual expressão de polipéptidos de cadeia pesada e leve. De modo alternativo, pode ser usado um único vector que codifique para ambos os polipéptidos de cadeia 50 pesada e leve. Nestas tais situações, a cadeia leve deverá ser colocada antes da cadeia pesada de modo a evitar um excesso tóxico de cadeia pesada livre (Proudfoot, 1986, Nature 322: 52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 2197). As sequências codificantes para as cadeias pesada e leve podem compreender cDNA ou DNA genómico.

Uma vez tendo sido expressa de modo recombinante a molécula de anticorpo da invenção, esta pode ser purificada através de qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de anticorpo, por exemplo, através de cromatografia (e.g. , cromatografia de troca iónica, cromatograf ia de afinidade tal como com proteína A ou antigénio específico, e cromatografia por tamanho em coluna), centrifugação, solubilidade diferencial, ou através de qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas.

De modo alternativo, qualquer proteína de fusão pode ser purificada de imediato através da utilização de um anticorpo específico para a proteína de fusão a ser expressa. Por exemplo, um sistema descrito por Janknecht et al. permite a purificação imediata de proteínas de fusão não - desnaturadas expressas em linhas celulared de humano (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8972-897). Neste sistema, o gene de interesse é subclonado num plasmídeo vaccinia de recombinação det al modo que a grelha de leitura aberta do gene seja fundida durante a tradução com um marcador amino-terminal que consiste em seis resíduos de histidina. Um marcador serve como um domínio de ligação à matriz para a proteína de fusão. Os extractos obtidos a partir de células infectadas com o vírus vaccinia recombinante são aplicados em colunas de 51 agarose de Ni+2 - ácido nitriloacético e as proteínas marcadas com histidina são eluídas de modo selectivo com tampões contendo imidazol. outra forma de realização, os anticorpos da invenção ou os seus fragmentos são conjugados a uma fracção terapêutica ou de diagnóstico. Os anticorpos podem ser utilizados para o diagnóstico ou para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento. A detecção pode ser facilitada através do acoplamento do anticorpo a uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, radionúclidos radioactivos, metais emissores de positrões (para uso na tomografia de emissão de positrões), iões metálicos paramagnéticos não radioactivos. Ver na generalidade documento da Patente U.S. N2 4,741,900 para iões metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para utilização como diagnósticos de acordo com a presente invenção. Enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; materiais fluorescentes apropriados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansilo e ficoeritrina; materiais luminiscentes adequados incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina, e aquorina; e radionúclidos radioactivos adequados incluem l231, 13lI, 11_LIn e 99Tc.

Os anticorpos da invenção ou os seus fragmentos podem ser conjugados com um agente terapêutico ou porção do fármaco 52 para modificar uma dada resposta biológica. 0 agente terapêutica ou porção do fármaco não é para ser compreendido como limitado aos agentes químicos terapêuticos clássicos. Por exemplo, a porção do fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma actividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina da pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína tal como factor de necrose tumoral, interferão-a, interferão-β, factor de crescimento do nervo, factor de crescimento derivado das plaquetas, activador plasminogénio de tecidos, agente trombótico ou um agente anti-angiogénico, e.g., angiostatina ou endostatina; ou, um modificador de resposta biológica tal como a linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante do crescimento de macrófagos e granulócitos (GM-CSF), factor estimulante de crescimento de granulócitos (G-CSF), factor de crescimento do nervo (NGF) ou outro factor de crescimento. São bem conhecidas técnicas para conjugação da tal fracção terapêutica a anticorpos, ver, e.g. Arnon et al. , "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al. , "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody 53

In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

De modo alternativo, um anticorpo pode ser conjugado a um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado como descrito por Segai em documento da Patente U.S. Ne 4,676,980.

Pode ser utilizado como uma terapêutica um anticorpo com ou sem uma fracção terapêutica conjugada com este o qual pode ser administrado sozinho ou em combinação com factor (s) citotoxico e/ou citocina (s). A presente invenção refere-se não só a péptidos, ao seu uso e veículos aceites farmaceuticamente compreendendo os mesmos, mas também a métodos de utilização dos péptidos e dos domínios como aqui descrito.

De um modo mais específico, a presente invenção tem utilização para vários métodos nos quais os péptidos aqui descritos são utilizados para os seguintes propósitos: (1) Um método de identificação de um polipéptido ou proteína de interacção com a PPl, que compreende a detecção na sequência do referido polipéptido ou proteína, da presença de dois domínios de ligação ao PPl Ml e M2. (2) Um método de rastreio de compostos que interagem com reguladores da PPl, que compreende: 54 (a) imobilização dos péptidos aqui descritos num suporte; e (b) teste da interacção dos referidos compostos com os referidos péptidos imobilizados. (3) Um método de rastreio de compostos que interagem com a PP1, que compreende: (a) obtenção dos anticorpos para péptidos dentro da descrição da presente invenção; e (b) teste da interacção dos referidos compostos com os referidos anticorpos. (4) Um método para o teste de moléculas que inibem ou aumentam a actividade da PPl ou alteram a sua localização através de interacção, compreendendo o referido método: (a) imobilização dos péptidos aqui descritos num suporte; e (b) teste da interacção dos referidos compostos com os referidos péptidos imobilizados.

Abrangidos também pela presente invenção estão fármacos que após a utilização dos métodos da presente invenção verifica-se inibirem e/ou aumentarem a actividade da PPl, actividade da PPlc ou localização através de interacção.

Para além de métodos, a presente invenção refere-se a kits. Os kits compreendem, mas não estão limitados a, péptidos ou série de péptidos os quais mimetizam ambos os domínios Ml e M2 e os quais são capazes de inibir as interacções Bcl-xL/PPlc, a Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc, em que o domínio Ml tem a sequência FXX [RK] X [RK] , e o domínio M2 tem a sequência [RK] VX [FW] ou [RK] XVX [FW] , em que X é qualquer aminoácido. Tais kits compreendem os péptidos 55 NWGRIVAFFSF e GDEFELRYRRAF. Estes péptidos podem estar imobilizados em qualquer suporte sólido, acima descrito, e os quais incluem resinas, poros microstar, chips de vidro e os semelhantes.

Ainda noutra forma de realização a presente invenção refere-se a um kit que contém anticorpos para péptidos os quais mimetizam ambos os motivos Ml e M2 e os quais são capazes de inibir as interacçóes Bcl-xL/PPlc, a Bcl-w/PPlc, ou a Bcl-2/Bad/PPlc. Estes anticorpos podem ter sido criados contra os péptidos NWGRIVAFFSF e os péptidos GDEFELRYRRAF, os análogos destes péptidos ou os seus equivalentes funcionais.

Para além dos péptidos ou dos anticorpos, os kits da presente invenção também incluem reagentes para interpretar a interacção. Tais reagentes são conhecidos na técnica e descritos acima e em Sambrook (acima).

Ainda noutra forma de realização, a presente invenção diz respeito a um método de rastreio de células para encontrar interacçóes PPl nas células, compreendendo o referido método quer a utilização de anticorpos contra os domínios Ml e M2 ou péptidos incluindo estes domínios ou os seus equivalentes funcionais. A presente invenção refere-se assim a uma nova terapia de fármacos derivada da fosfatase baseada na entrega intracelular de péptidos com uma sequência ou sequências rodeando os locais de ligação PP1/PP2 (domínios Ml e M2) identificados em algumas proteínas de interacção. Esta aproximação de terapia de fármacos, derivada a partir da genética química (Gura, 2000), iria inibir de modo 56 específico a interacção de algumas proteínas alvo importantes do ponto de vista médico com PP1/PP2A.

Esta estratégia terapêutica, designada "Knockout peptídico" das vias PP1/PP2 tem a base em dois resultados recentes. 0 primeiro resultado foi a identificação de uma suposta assinatura PPl. Deste modo, a partir da caracterização de dois domínios distintos de ligação à PPl nas proteínas Bcl-2 e da sua existência na maioria das proteínas de ligação à PPl, pode ser concluído que a presença combinatória dos domínios pode ser utilizada como uma assinatura preditiva para a ligação à PPl. Deste modo, o si te da web designado "assinatura PPl" (em preparação no Instituto Pasteur) que contém todas as supostas sequências PPl derivadas de uma biblioteca Swisprot pode ser utilizado para identificar supostos alvos de ligação à PPl de interesse. 0 segundo resultado foi a identificação de locais de ligação à PP2A em 5 proteínas. Foram recentemente mapeados os locais de ligação à PP2A de um Vpr codificado por vírus (HIV-1) e um Ck2a de parasita codificado por Theileria. A partir dos dados obtidos pode ser referido que a entrega intracelular de alguns péptidos que mimetizam estas sequências de ligação à PP2A leva à apoptose em tumores (Hela, Jurkat, S) ou células infectadas (Vpr ou HIV-1 ou Theileria).

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos podem ser efectuados utilizando os materiais e métodos descritos abaixo: 1. Material e Métodos 57 1.1. Células e cultura A TslaB é uma linha celular de células T de murino que expressa as cadeias α e β do receptor IL-2 (Pitton et al, 1003) que pode ser expandida independentemente em 11-2, IL-4 ou IL-9. As células foram colocadas em cultura em RPMI-1640 suplementado com 5 % de soro fetal de vitela inactivado pelo calor com glutamina a 2 mM, Hepes a 10 mM, arginina a 0,55 mM, asparagina a 0,24 mM, 2-ME a 50 μΜ e 60 U/ml de IL-4. 1.2. Linfocinas, anticorpos, reagentes e plasmídeos

Foi utilizado como uma fonte de IL-4 de murino o rIL-4 de murino ou o sobrenadante de uma sub-linha HeLa transfectada com pKCRIL-4.neo. Os anticorpos anti-Bcl-xL e anti-Bcl-w eram da Calbiochem (La Jolla, CA), Transduction Laboratories Lexington, KY) ou StressGen Biotechnology (Victória, Canadá). O anti-PPlc específico era da UBI (Lake Placid, NI), Calbiochem ou Transduction Laboratories. O anticorpo anti-histonas era da Chemicon International (Temecula, CA). O anticorpo anti-proteína 14-3-3 era da UBI (Lake Placid, NI) . Os anti-serina 112 e 136 da Bad eram da New England BioLabs (Beverly, MA) e anti-serina 155 da Bad era da Cell Signaling Technology (Beverly, MA). O anticorpo anti-Raf era da Transduction Laboratories. Os anticorpos anti-Pser e pan-Ras eram da Calbiochem. A proteína recombinante PPlc era da Calbiochem. A mito 2813 (piruvato desidrogenase anti-mitocondrial) foi fornecida pelo Dr Serrano, Centro Nacional de Biotecnologia (Madrid). 1.3. Imunoprecipitação e western blot

As células (1 x 107) foram estimuladas ou privadas de IL-4 e lisadas durante 20 min a 4 2C em tampão de lise (Tris-Hcl 58 a 50 mM pH 8, NP-40 a 1 %, NaCl a 137 mM, MgCl2 a 1 mM, CaCl2 a 1 mM, glicerol a 10 % e um cocktail de inibidores de protease). Também foram utilizados para a imunoprecipitação digitonina e tampões livres de detergentes. Para a análise de fosforilação, o tampão foi também suplementado com o cocktail de inibidores de fosfatase. Os lisados foram imunoprecipitados com o anticorpo Apropriado e foi adicionada Sefarose Proteína A. De modo alternativo, as células foram lisadas em tampão de amostra Laemli e os extractos proteicos separados através de SDS - PAGE, transferidos para nitrocelulose, bloqueados e incubados com o anticorpo primário. A membrana foi lavada e incubada com anticorpo secundário conjugado com PO. As proteínas foram desenvolvidas utilizando o ECL. 1.4. Ensaio in vitro da fosfatase

As células (1 χ 107) estimuladas com IL-4 foram lisadas em tampão de lise, os sobrenadantes foram imunoprecipitados com o anticorpo correspondente, seguidos de incubação com Sefarose Proteína A. Os imunoprecipitados foram lavados com tampão de fosfatase (Tris HC1 a 50 mM, pH 7,5, 2-ME a 0,1 %, EDTA a 0,1 mM e BSA a 1 mg/ml) e misturados com fosforilase a [32P], diluída em tampão fosfatase suplementado com cafeína. A reacção foi incubada (40 min a 3 0 aC) , interrompida com 2 00 μΐ de TCA a 2 0% e centrifugada. Foram utilizados um total de 185 μΐ do sobrenadante para estimar a geração de fosfato livre libertado a partir de fosforilase a [32P] . 1.5. Síntese de péptidos

Os péptidos que compreendem os domínios R/K X V/I X F (R) (SEQ ID Na 1) OU F X X R X R (F) (SEQ ID NQ 2) da Bcl-w e Bcl-xr,, bem como os péptidos mutados (ver Figura 8A para a 59 sequência) foram preparados por síntese automática em pontuação numa membrana de celulose aminoderivatizada. A membrana foi bloqueada, incubada com PPlc purificada e, após vários passos de lavagem, incubada com anticorpo anti-PPlc, seguida de anticorpo secundário conjugado com PO. As pontuações foram desenvolvidas utilizando o sistema ECL.

Os péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID N2 3), F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID Na 4) ou R* (NWGRIAAAFSF) (SEQ ID Na 5) foram sintetizados num sintetizador de péptidos múltiplo automático utilizando o procedimento de fase-sólida e química Fmoc padrão. A pureza e composição dos péptidos foram confirmadas através de cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa e através de análise de aminoácidos. 1.6. Competição de interacção proteína - proteína A interacção Bcl-w/PPlc e Bcl-xL/PPlc foi analisada em ensaio de competição através de péptidos R, F ou R*. Os lisados obtidos a partir de células estimuladas com IL-4 foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Bad e foi adicionada Sefarose Proteína A. A interacção Bcl-w/PPlc e Bc1-Xl/PP1c foi analisada em ensaio de competição através de incubação com os péptidos R, F ou R* (30 min, temperatura ambiente). Após lavagem, os imunoprecipitados foram ensaiados quer para actividade da proteína fosfatase ou transferidos para nitrocelulose e colocados a hibridar com o anticorpo correspondente. 1.7. Oligonucleótidos forward e reverse

Os análogos de fosfotioato dos olígonuleótidos obtidos a partir de Bcl-xL e Bcl-w, incluindo o codão de iniciação ATG foram adquiridos a partir da Isogen Bíoscience. A 60 sequência dos oligonucleótidos forward e reverse são como se segue: Bcl-xL forward, ATG TCT CAG AGC AAC (SEQ ID Ns 6); Bc1-Xl reverse, GTT GCT CTG AGA CAT (SEQ ID N2 7); Bcl-w forward, ATG GCG ACC CCA GCC (SEQ ID N2 8); Bcl-w reverse, GGC TGG GGT CGC CAT (SEQ ID N2 9).

2. RESULTADOS EXPERIMENTAIS 2.1. Identificação da Bcl-w e da Bcl-Xz, como proteínas de interacção com a PPlc

Foi previamente apresentado que a molécula anti apoptótica Bcl-2 é uma subunidade alvo da fosfatase de serina/treonina PPlc em células Τεΐαβ estimuladas com IL-2 e que a sequência da Bcl-2 que interage com PPlc é o domínio R/K X V/I X F (SEQ ID Ns 10) (Ayllón et al, 2001) . Dado que a Bcl-xL e a Bcl-w também contêm o domínio bem conservado R/K X V/I X F observado na Bcl-2, foi explorada a possibilidade de que as moléculas anti - apoptóticas Bcl-xL e Bcl-w possam estar também associadas com a PPlc em células Τβίαβ estimuladas com IL-4, as quais não expressam Bcl-2 e expressam Bcl-xL e Bcl-w. Foram realizadas experiências de co-imunoprecipitação recíproca de proteínas citoplasmáticas sob estimulação com IL-4 ou condições de ausência utilizando anticorpos específicos. A PPl c e a Bad foram detectadas através de Western blot em imunoprecipitados de anti - Bcl-xL de células estimuladas com IL-4, diminuindo durante o período de subnutrição (Fig. IA). A hibridação através de uma sonda da membrana com anticorpo anti - Bcl-xL apresentou níveis similares em todas as condições analisadas. A PPlc e a Bad foram também detectadas em imunoprecipitados anti - Bcl-w de células estimuladas com IL-4, diminuindo após a ausência de linfocinas (Fig IA). A membrana foi também hibridada 61 através de uma sonda com anticorpo anti-Bcl-w, apresentado níveis similares. A imunoprecipitação para os lisados citoplasmáticos com um anticorpo irrelevante, anti - cadeia IL-2R da p55, não conseguiu detectar aquelas associações (Fig 1B) . De modo semelhante, a Bcl-xL, Bcl-w e PPlc foram detectadas em imunoprecipitados de Bad e foi também observada a interacção entre estas proteínas através de imunoprecipitação de lisados livres de detergente bem como nas proteínas citoplasmáticas isoladas através de lise com digitonina (dados não apresentados). Estas associações foram também observadas em timócitos recém - isolados (Fig 1C) . Dado que o número de complexos Bcl-xL/PPlc/Bad e Bcl-w/PPlc/Bad diminui após a ausência de IL-4, foi analisada a sob-regulação da expressão de qualquer das proteínas envolvidas na formação do complexo. Deste modo, foi analisada a expressão total de Bcl-xL, Bcl-w, PPlc e Bad em células Τ8αβ estimuladas ou privadas de IL-4. Todas as proteínas analisadas estavam expressas em células estimuladas ou privadas de IL-4 (Fig 2) . Como um controlo interno de aplicação de proteína, as membranas foram colocadas a hibridar através de uma sonda com anticorpo anti - Histonas. Como o número de agregados diminui após a ausência de IL-4 sem modificação da expressão total das proteínas do complexo, as modificações pós-traducionais da Bcl-xL ou da Bcl-w que podem afectar a formação do complexo trimolecular foram posteriormente analisadas. 0 estado de fosforilação da serina da Bcl-xL e Bcl-w foi analisado de seguida. Os extractos citoplasmáticos obtidos a partir de células estimuladas ou privadas de IL-4 foram imunoprecipitados com anti-Bcl-xL ou anti-Bcl-w e colocados a hibridar com anticorpos específicos anti-PSer, anti-PPlc, anti-Bad, anti-Bcl-w e anti- Bcl-xL (Fig 3). A fosforilação da serina de Bcl-xL e Bcl-w foi observada em células 62 controlo estimuladas com IL-4, diminuindo após a ausência de IL-4. De acordo como os resultados na Fig 1, o nível de Bad e PPlc associadas a Bcl-xL e Bcl-w diminui aquando da ausência de linfocinas. Este resultado sugere uma correlação entre a fosforilação da serina da Bcl-xL e Bcl-w e a formação dos compl exos trimoleculares.

Foi recentemente apresentado que a IL-2, bem como a IL-3, induz a fosforilação da serina da Bad (Ayllón et al, 2000). A figura 4A apresenta que a IL-4 induz a desfosforilação da Bad na serina 136 mas não nas serinas 112 e 155. Mais ainda, a ausência de IL-4 induz a desfosforilação da serina 136 da Bad. Foram utilizadas como controlos positivos células estimuladas com IL-2 (C, fosforilação da serina 112 e 136) ou células COS (C, fosforilação da serina 155) que sobre-expressam Bad. A fosforilação da serina da Bad induzida por IL-3 resulta na sua associação à proteína 14-3-3, suprimindo a interacção com Bcl-x^ (Zhou et al, 2000). A figura 4B apresenta que a fosforilação da serina na Bad em resposta a IL-4 não resulta na ligação à proteína 14-3-3. Esta proteína foi detectada nos extractos totais obtidos a partir de células controlo estimuladas com IL-4 (poço T) e não foi observada nem em imunoprecipitados de PPlc nem de Bc1-Xl ou Bad de células estimuladas ou privadas de IL-4. Como um controlo interno, é apresentada a interacção da Raf e da proteína 14-3-3 em imunoprecipitados de Raf (Fig 4B). A figura 5A apresenta a actividade de fosfatase em imunoprecipitados de Bcl-xL, Bcl-w e Bad em céulas estimuladas com IL-4. A actividade enzimátíca nos imunoprecipitados foi medida utilizando como substrato a fosforilase a marcada com J/P. É interessante verificar que a actividade de fosfatase detectada em imunoprecipitados de 63

Bcl-xL e Bcl-w quase corresponde à activídade da fosfatase observada em imunoprecipitados de Bad. Para confirmar que esta activídade de fosfatase era devida à PPlc, a actividade enzimática foi estimada em imunoprecipitados de Bad ou Bcl-w obtidos a partir de células estimuladas com IL-4 na presença de diferentes concentrações de ácido ocadáico (OA) (Fig 5B). As concentrações de OA que inibem a actividade do tipo 2A (1CT9 M) não têm efeito na actividade de fosfatase in vitro associada à Bad ou Bcl-w. A adição de OA a 1CT8 M a imunoprecipitados de Bcl-w ou Bad resulta na inibição a ~ 50 % da actividade de fosfatase, a qual é reduzida fortemente após a adição de OA a 10“6m (Fig 5B) . O efeito do OA na actividade de fosfatase foi também estimado em sobrenadantes de imunoprecipitados de Bad e Bcl-w. As concentrações de OA que não tinham efeito na actividade enzimática em imunoprecipitados de Bad e Bcl-w (IO-9 M) apresentam inibição a ~ 50 % no sobrenadante, como esperado a partir de uma associação de actividades tipo 1 e tipo 2A (Fig 5B). O efeito selectivo do OA sugere que a actividade de fosfatase observada em imunoprepitados de Bad e Bcl-w é PPlc. 2.2. A Bcl-xL e Bcl-w são novas subunidades alvo da PPlc

Foi recentemente apresentado que a Bcl-2 é uma subunidade alvo da PPlc (Ayllón et al, 2001). Dado que a Bcl-w e Bcl-xL estão também associadas a PPlc e que a sequência do local de ligação da Bcl-2 à PPlc é conservada em Bcl-xL e Bcl-w, foi colocada a hipótese de que estas moléculas anti - apoptóticas possam ser novas subunidades alvo da PPlc. Para testar esta hipótese, foram depletadas Bcl-xL e Bcl-w através de imunoprecipitação sequencial anti- Bcl-xL + Bcl-w de extractos citoplasmáticos de células estimuladas com IL-4. 0 sobrenadante obtido a partir da quarta 64 imunoprecipitação anti- Bcl-xL + Bcl-w foi imnoprecipitado com anticorpo anti - Bad (5S) e foi estimada a actividade de fosfatase (Fig. 6A). Foram detectados vestígios de actividade de fosfatase associada à Bad em extractos depletados de Bcl-xL e Bcl-w comparado com o elevado nível de actividade observado em imunoprecipitados anti-Bad controlo de células estimuladas com IL-4. Dado que na ausência de Bcl-xL e Bcl-w não é detectada actividade de fosfatase significante associada à Bad, foi explorada a possibilidade de que estas moléculas anti - apoptóticas possam controlar o direccionamento da PP1C a Bad. Com este objectivo, foram realizadas imunoprecipitações anti - Bad em extractos citoplasmáticos de células estimuladas com IL-5 ou em extractos depletados de Bcl-xL e Bcl-w (5S). As PPlc, Bc1-xl e Bcl-w foram detectadas em imunoprecipitados anti-Bad controlo e não foram observados em imunoprecipitados anti-Bad obtidos a partir de extractos depletados de Bcl-xL e Bcl-w (Fig 6B). Numa experiência recíproca, foram detectadas Bad, Bcl-xL e Bcl-w em imunoprecipitados anti-PPlc de células controlo e não foram observados imunoprecipitados PPlc obtidos a partir de extractos depletados de Bcl-xL e Bcl-w (Fig 6B) . Este resultado sugere que a Bcl-xL e a Bcl-w são necessárias para a associação da PPlc à Bad. 2.3. Determinação do local de ligação da Bcl-xL e Bcl-w à PPlc

Tem sido descrito que o domínio R/K X V/I X F é partilhado pela maioria das subunidades alvo da PPlc (21, 23}. Foi apresentado que a subunidade alvo da PPlc Bcl-2 também partilha este domínio conservado (Ayllón et ai, 2001). De modo interessante, as sequências de Bcl-xL e Bcl-w também contêm este domínio (Fig 7B). Para analisar se esta 65 sequência de Bcl-xL e Bcl-w estava envolvida na ligação à PPlc, nós gerámos péptidos imobilizados em nitrocelulose de proteínas Bcl-xL e Bcl-w contendo este domínio. A membrana foi incubada com proteína PPlc purificada. A figura 7B apresenta as sequências de ínteracção com a PPlc. 0 domínio R/K X V/I X F (SEQ ID Ns 10) , presente na Bcl-xL e Bcl-w, interage com a PPlc e a sua mutação nos resíduos críticos V e F reduz fortemente a ligação da Bcl-xL e Bcl-w à PPlc (Fig 7B) . A análise dos locais de ligação Bcl-2 à PPlc apresenta, em adição ao domínio R/K X V/I X F (SEQ ID Na 10), duas sequências (FSRRYR (SEQ ID Na 11) e FTARGR (SEQ ID N2 12), que se ligam à PPlc (Ayllón et al, 2001). De modo interessante, foram também observadas sequências similares em Bcl-x^ e Bcl-w (Fig 7A). As sequências FELRYR (SEQ ID Na. 13) e FETRFR (SEQ ID Ns 14) de Bcl-xL e Bcl-w, respectivamente também inteagem com a PPlc e a sua mutação inibe a ligação à PPlc, embora a afinidade dependa do tipo de mutação pontual (Fig 7B) . Foi determinado o domínio consenso F X X R X R (SEQ ID N2 15) de ínteracção através de comparação de sequênciad de Bcl-2, Bcl-xL e Bcl-w.

Para confirmar de modo conclusivo que os domínios R/K X V/I XFeFXXRXR estão envolvidos na ligação das Bcl-Χτ, e Bcl-w à PPlc, foram realizadas experiências de competição em complexos trimoleculares. Os lisados obtidos a partir de células estimuladas com IL-4 foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Bad e a ínteracção Bcl-xL/PPlc e Bcl-w/PPlc foi analisada em ensaio de competição utilizando os péptidos R* (NWGRIAAAFSF) (SEQ ID Ne 16) , R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID N2 17) ou F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID N2 18) (Fig 8A). As Bcl-xL, Bcl-w e PPlc foram detectadas em imunoprecipitados controlo anti-Bad, bem como em imunoprecipitados anti-Bad tratados com péptido R* . A 66 quantidade de Bcl-xL, Bcl-w e PPlc associadas a Bad diminui após a competição com o péptido F ou R, não sendo quase detectada após competição com imunoprecipitados Bad com péptidos F + R (Fig 8A) . É observado nível semelhante de Bad em imunoprecipitados anti-Bad controlo ou tratados com péptido. Finalmente, para confirmar que a Bel-xL e a Bcl-w são subunidades alvo da PPlc, nós estimámos a actividade de fosfatase em imunoprecipitados de Bad controlo ou tratados com péptido. A actividade de fosfatase foi detectada em imunoprecipitados controlo ou tratados com péptido R* (Fig 8B) , diminuindo após competição da interacção com péptidos F ou R. A actividade enzimática estava fortemente diminuída após competição com péptidos R ou F. Como um controlo interno, a Fig 8C apresenta a actividade de fosfatase em imunoprecipitados de Bad controlo ou tratados com péptido. A concentração dos péptidos F ou R utilizada foi o dobro da concentração utilizada em imunoprecipitados tratados com péptidos F + R. Como na Fig 8B, a actividade de fosfatase estava drasticamente diminuída após tratamento de imunoprecipitados de Bad com péptidos F + R. Tidos em conta juntos, estes resultados ilustram que a Bcl-xL e Bcl-w, bem como a Bcl-2, são subunidades alvo da PPlc. 2.4. A inibição da actividade enzimática de PPlc bloQueia a apoptose

Como a ausência de IL-4 se correlaciona com a desfosforilação de Bad e com a apoptose, foi colocada a hipótese de que a inibição da actividade de fosfatase pelo tratamento com ácido ocadáico (OA) pode evitar a desfosforilação da Bad e a apoptose. 0 tratamento de células com OA a 1 μΜ na ausência de IL-4 evita a desfosforilação da Bad na serina 13 6 (Fig 9A) . Não foram observadas alterações na expressão total de Bad após 67 tratamento com OA, sugerindo que ο OA não afecta a expressão da proteína. Em adição, as células privadas de IL-4 tratadas com OA a 1 μΜ durante 6 h apresentavam redução significativa na fracção de células apoptóticas comparada com células não tratadas (Fig 9B). Finalmente, a inibição da expressão de Bcl-xL e Bcl-w através de tratamento das células com oligonucleótido reverse também induz a apoptose em células estimuladas com IL-4 (Fig 9C). Foi estimada através de Western blot a inibição da expressão de Bcl-xL e Bcl-w após tratamento com oligonucleótido reverse. 3. RESULTADOS BIO-INFORMÁTICOS - Assinatura preditiva para interacções PPl; presença combinatória dos domínios [RK] VxF ou [RK] xVxF e F-x-x- [RK] -x- [RK] em proteínas caracterizadas de ligação à PPl A presença combinatória destes dois domínios de ligação à PPl sugere um mecanismo geral em que a ligação sequencial à PPlc através de um destes motivos pode favorecer a ligação através do segundo motivo e permitir a função catalítica. Além disso estes domínios também poderão representar uma assinatura preditiva para identificar novas potenciais proteínas de ligação à PPl. Para testar de modo parcial este conceito, foi realizada uma análise bioinformática através da utilização do programa "prose" (Katja Shuerer, IP) na biblioteca Swissprot Release40 (Outubro 2001) que contém 101602 sequências de proteína não redundantes.

Como apresentado na Tabela IA, a procura da presença de apenas um consenso indica que 19,47 % das sequências na biblioteca contêm domínios [RK] VxF ou [RK] xVxF e 16% contêm o domínio semelhante à Bcl-2 F-x-x - [RK] - x -[RK] . Em contraste, de modo consistente com a noção de 68 assinatura preditiva, a análise de presença combinatória de ambos os domínios de ligação à PPl [RK] VxF ou [RK] xVxF e F - x - x - [RK] - x - [RK] revela apenas 4013 sequências positivas, que corresponde a 3,94 % da biblioteca (Tabela 1 B). Em adição se a equivalência F = W (normalmente aceite para domínios [RK] Vx [FW] / [RK] xVx [FW]) for aplicada, foram encontradas 4783 sequências positivas correspondendo a 4,7 da biblioteca. Em adição, a equivalência que ocorre ocasionalmente entre R/K e Q aumenta ligeiramente o número de proteínas positivas (5769 sequências que corresponde a 5,67 %).

Adicionalmente, como esperado, estas sequências incluem todas as proteínas conhecidas de interacção com a PPl da família Bcl-2 (não apresentadas). No global, esta análise indica que cerca de 5 % das sequências de proteína partilham na sua sequência dois supostos domínios de ligação à PPl. De modo interessante, a análise estatística sugere que a distância que separa os dois domínios de ligação à PPl está compreendida entre 0 e 180 aa para 50 % das proteínas (Figura 11) . Em adição, uma análise mais detalhada revela um pico maior que representa 22,3 % das sequências positivas (897 sequências para um total de 4013) o qual corresponde a um intervalo de 0 - 50 aa entre os dois domínios. Estes dados são consistentes com a observação de que a distância de 3 6 aa separa os dois domínios de ligação nos domínios BHl e BH3 das proteínas Bcl-2/Bcl-w e Bcl-xL (não apresentados).

Na base desta análise, o Instituto Pasteur está a criar e irá manter em ordem um novo si te da web "Assinatura PPl" o qual contém todas as sequências seleccionadas a partir da biblioteca Swissprot Release 40 correspondendo a proteínas 69 que contêm os dois domínios de ligação à PPl. Através da simples inserção do nome de uma proteína ou um número de acesso ou através de análise de blast, toda a gente irá saber de modo imediato se a proteína tem uma suposta assinatura PPl. Em adição, o utilizador irá identificar de modo imediato a sequência que compreende os dois supostos domínios de ligação à PPl.

As proteínas de ligação à PPl mais caracterizadas partilham os dois domínios de ligação e podem ser identificadas no si te da web (tabela 2) . Para validar esta proposta de "estratégia de assinatura preditiva", foram seleccionados ao acaso quatro candidatos e foi confirmada a sua associação à PPl através de experiências simples de co-imunoprecipitação (Figura 10B).

TABELA IA UM DOMÍNIO SEQUÊNCIAS POSITIVAS % BIBLIOTECA TOTAL F-x-x-R-x-R 4,074 4 F-x-x[RK]-[RK] 16,260 16 [RK]-V-X-F 8,895 8,76 [RK]-x-V-x-F 9,935 9,48 [RK]-V-x-F ou [RK]-X-V-x-F 16,273 16,02 [RK]-V-X-[FW]ou [RK}-X-V-X-[FW] 19,787 19,48 70

TABELA 1B DOIS DOMÍNIOS SEQUÊNCIAS POSITIVAS % BIBLIOTECA TOTAL [RK]-V-x-F ou [RK]-x-V-x-F -f F-x-x-R-x-R 1,025 1 [RK]-V-x-F ou [RK]-x-V-x-F + F-X-x-R-x-R 4,013 3.94 [RK]-V-x-[FW] ou [RK]-x-V-x-[FW] + F-X-x-[RK]-x-[RK] 4,783 4.70 [RKQ]-V-x-F/W ou [RKQ]-X-V-X-F/W + F-x-x-[RK]-x-[RK] 5,769 5.67 71TABELA 2A. Duas presumíveis sequências de ligação a PPl em proteínas caracterizadas de interacção com a PPl

Proteína/gene domínio 1 Levedura Resíduos domínio 2 Resíduos GIP2 (homólogo de GM) 6320895 227 QFERKNEKLD 12-18 LIRSKSVHFDQA 216- GIP2h/YIL045 S49933 SLEFLHKPR 55-60 QRSKSVHFD 191- 202 RLS *YAL014 LO5146 56 DLFNERRQRR 110-116 MPTRHNVRWEEN 45- REG2 6319525 RSWFKARKRRD 152-157 KPRERHIKFNDN 163- 174 I Rato PTG AAB49689 Mamífero 28- 38 NQAKKRWFADS 56- RRNFVN KLKPL 67 TVKVKNVSFEKK 149- 160 *GL CAA77083 Y LDFRNRLQTN 121-130 KKVKKRVSFAND 56- 67 R5 humano 4885559 RH FVNKLKPLKS 48-60 NQAKKRWFADS 79- 90 U5 AAC60216 TCFRPRLRGS 101-110 S QKKKRWFADM 61- 72 Factor de Splicing PSF P23246 369 GEVFINKGKGF 324-334 RGRQLRVRFATH 358- Proteína Ribossomal P22451 L5 QVKFRRRREG 17-26 YFKRYQVKFRRR 12- 23 GRP-78 P20029 EDFKAKKKEL 615- 620 RITPSYVAFTPE 61- 12 HOpRB humano SVFMQRLKTNI P06400 LQ 758-770 IDEVKNVYFKNF 285- 296 VLKV SWITFLLA 190- 201 AKAPs <AKAP149/AKAP220 /Yotiao) LQFELRYRPV 250-255 TTKAVMFAK 141- 145 Hsp-90-a (Hsp 86) PO 7901 3 DLFENRKKKN 53-358 VRRVFIM 367- 370 MYPT2 humano 4505319 FFKNEKMLY 331-340 RRGSFRVRFEDG 48- 59 1-2 CAA55475 humano RQFEMKRKLHY 128-138 Não detectado * Estas duas sequências correspondem a um consensus altamente degenerado (F-X-X-R/K-X-R/K/Q) Consensus F-X- X-R/K-X-R/K R/K- X-V/I-X-For R/K- -V/I-X- F 72

Exemplo 4-0 percursor β-amilóide como uma nova proteína de interacção com o PPl

Os depósitos de amilóide fibrilhar são lesões patológicas que definem doenças do cérebro de Alzheimer e presume-se que interferem na morte neuronal. A amilóide é composta de um fragmento de proteína de 39 a 42 aminoácidos da proteína precursora amilóide (APP). Uma vez que a deposição ir vitro de amilóide fibrilhar tem sido demonstrada ser dependente da concentração de APP, a redução ou inibição da libertação de APP é um alvo terapêutico. 0 percursor β-amilóide (APP) é sobre-expresso em células PCI2 tratadas com NGF, através da transfecção de um cDNA que codifica para o percursor β-amilóide (APP) de acordo com os métodos de Sambrook et al, acima.

As células que expressam o percursor β-amilóide são posteriormente incubadas com um péptido de penetração que corresponde ao local de ligação repressivo da PPl tal como o domínio Ml contendo a sequência FXX [RK] X [RK] e o domínio M2 [RK] VX [FW] ou [RKXVX [FW], em que X é qualquer aminoácido. A presença da amilóide é testada utilizando anticorpos monoclonais ou sondas de hibridação marcadas. A presença de amilóide pode ser detectada. 73

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<11Q> INSTITUT PASTEUR

<120> RASTREIO DE PÉPTIDOS INIBINDO A LIGAÇÃO DE PPlC ÀS PROTEÍNAS BLC-2, BCL-XL E BCL-W

<130> B5324 - JAZ/VMA/VG <140> EP 02291170.5 <141> 2002-05-07 <160> 83 <170> Patent In version 3.1

<210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> SINTÉTICO <220> <221> MISC__FEATURE <222> (2)..(2) <223> qualquer aininoácido <220> <221> MISC„FEATURE <222> (4)..(4) <223> qualquer aminoácido <400> 1

Arg Xâa Vai Xaa Phe 1 * 5 <210> 2

<211> 5 <212> PRT <213> SINTÉTICO <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) . . (2) <223> qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) . . (4) <223> qualquer aminoácido <400> 2 77 tys Xaa V@1 Xaa Phe

l S <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> SINTÉTICO <220> <221> MISC_FEATURE < 2 2:2 > (2)..(2) <223 > qualquer aminoácido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4).. (4) <223> qualquer aminoácido <400> 3 Arg Xaa Ile Xaa Phe 1 s <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> SINTÉTICO <220> <221> MISC_FEATURE ·'. 2 2 2 > (2) ..(2) <223> qualquer aminoácido <220> <221> MI SC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> qualquer aminoácido <400> 4 Lys Xaa Ile Xaa Phe 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> SINTÉTICO <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> qualquer aminoácido 78 <220> <221> ΜISC_FΕATURE <222> (3)..(3) <223> qualquer aminoácido <220> <221> ΜΙSC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> qualquer aminoácido <40Q> 5

Phe Xaa Xaa Arg Xaa Arg 1 5

<210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 6

Asn Trp Gly Arg Ile Vai Ala Phe Phe Ser Phe X 5 10

<210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 7

Gly Asp Glu Phe Glu Leu. Arg Tyr Arg Arg Ala Phe 1 S 10

<210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 8

Asn Trp Gly Arg lie Ala Ala Ala Phe Ser Phe I S 10 <210> 9

<211> 15 <212> DNA <213> SINTÉTICO <400> 9 79 atgtctcaga gcaac 15

<210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> SINTÉTICO <400> 10 gtfcgctcfcga gacafc 15

<210> 11 <211> 15 <212> DNA <213> SINTÉTICO <400> 11 atggcgaccc cagcc 15 <210> 12

< 211> 15 <212> DNA <213> SINTÉTICO <400> 12 ggctggggtc gccat 15

< 210 > 13 <211> 6 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 13

Phe Ser Arg Arg Tyr Arg 1 5

<210> 14 <211> 6 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 14

Phe Thr Ala Arg Gly Arg 1 5 <210> 15 <211> 6 80 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 15 l···* pf c® Glu Leu Arg Tyr Arg 5 <210> 16 <211> 6 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 16

Phe Glu Thr Arg Phe Arg 1 5

<210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 17

Gin Phe Glu Arg Lys Asrt Glu Lys Leu Asp 15 10

<210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 18

Leu lie Arg Ser Lys Ser Vai His Phe Asp Gin Ala 15 10

<210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 19

Ser Leu Glu Phe Leu ffíe Lye Pro Arg Arg Leu Ser 1 5 10

<210> 20 <211> 9 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 20 81

Gin Arg Ser Lys Ser Vai Hie Phe Asp 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 21 Asp Leu Phe Asn Glu Arg Arg Gin Arg Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 22 Met : Pro Thr Arg Mis Asn Vai Arg Trp Glu Glu Asn 1 5 10 <210> 23 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 23 Arg Ser Trp Phe Lys Ala Arg Lys Arg Arg Asp Ile 1 5 ' 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 24 Lys Pro Arg Glu Arg His Ile Lys Phe Asn Asp Asn 1 S 10 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 25

Arg Arg Asn. Phe Vai Asn Lys Leu Lys Pro Leu 1 5 10 <210> 26 <211> 12 82

<212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 26

Asn Gin Ala Lys Lys Arg Vai Vai Phe Ala Asp Ser 15 10

<210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 27

Thr Vai Lys Vai Lys Asn Vai Ser Phe Glu Lys Lys 1 5 10

<210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 28

Leu Aep Phe Arg Asn Arg Leu Gin Thr Aan 1 5 10 <210> 29 <211> 12

<212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 29

Lys Lys Vai Lys Lys Arg Vai Ser Phe Ala Asn Asp l 5 10

<210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 30

Arg His Phe Vai Asn Lys Leu Lys Pro Leu Lys Ser 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 31

Asn Gin Ala Lys Lys Arg Vai Vai Phe Ala Asp Ser 1 5' 10 83

<210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 32

Thr Cya Phe Arg Pro Arg Leu Arg Gly Ser 1 5 10

<210> 33 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 33

Ser Gin Lys Lys Lys Arg Vai Vai Phe Ala Asp Met 1 S 10

<210> 34 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 34

Gly Glu Val Phe Ile Asn Lys Gly Lys Gly Phe 15 10

<21G> 35 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 35

Arg Gly Arg Gin Leu Arg Val Arg Phe Ala Thr His 1 5 10

<210> 36 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 36

Gin Val Lys Phe Arg Arg Arg Arg Glu Gly 1 5 10 <210> 3?

<211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO 84 <400> 37

Tyr Phe Lys Arg Tyr Gin ¥al Lys Phe Arg Arg Arg 1 5 10

<210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 38

Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu 15 10

<210> 39 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 39 Arg Ile Thr Pro Ser Tyr Vai Ala Phe Thr Pro Glu 1 5 10 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> SINTÉTICO <40 0> 40 Ser Vai Phe Met Gin Arg Leu Lyt Thr Asn He Leu οιn 1 5 10 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 41 Ile Asp Glu Vai Lys Asn Vai Tyr Phe Lys Asn Phe 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 42

Vai Leu Lys Vai Ser Trp Ile Thr Phe Leu Leu àla 15 10 <210> 43 <211> 10 85

<212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 43

Leu Gin Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Pro Vai 1 5 10

<21G> 44 <211> 9 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 44

Thr Thr Lys Ala Vai Met Phe Ala Lys 1 5

<210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 45

Asp Leu Phe Glu Asn Arg Lys Lys Lys Asn l 5 10 <210> 46 <211> 7

<212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 46

Vai Arg Arg Vai Phe Ile Met 1 5

<210> 47 <211> 9 <212> PRT

<213> SINTÉTICO <400> 47

Phe Phe Lys Asn Glu Lye Met Leu Tyr J» mtr <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 48

Arg Arg Gly Ser Pro Arg Vai Arg Phe Glu Asp Gly 1 5 10 86

<210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 49

Arg Gin. Phe Glu Met Lys Arg Lys Leu Ei as Tyr 1 5 10 <210> 50 <211> 12

<212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 50

Asm Trp Gly Arg Ile Vai Ala Phe Phe Ser Phe Gly 15 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 51

Aen Trp Gly Arg Ile Ala Alá Ala Phe Ser Phe Gly 1 ' 5 10 <210> 52 <211> 12

<212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 52

Gly Aep Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe 15 10

<210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 53

Gly Aap Glu Gly Glu Leu Gly Tyr Gly Arg Ala Phe 1 ' S 10

<210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO 87 <400> 54 Gly Aep Glu Ser Glu Leu Ser Tyr Ser Arg Ala Phe ι 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 55 Gly Asp Glu Phe Glu Leu Gly Tyr Gly Arg Ala Phe 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213 > SINTÉTICO <400> 56 Gly Αβρ Glu Phe Glu Leu Ser Tyr Ser Arg Ala Phe 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 57 Gly Aep Glu Gly Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 58 Gly Ãsp Glu Ser Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 59 Gly Àsp Glu Gly Glu Leu < 3ly Tyr Arg Arg Ala Phe 1 5 10 <210> 60 <211> 12

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I 89 <400> 65

Gly Asp Glu Phe Glu Thr Gly Phe Gly Arg Thr Phe Ser 15 io <210> 66 <211> 13

<212> PRT <213> SINTÉTICO <4G0> 66

Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Phe Gly Arg Thr Phe Ser 15 10

<210> 67 <211> 13 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 67

Gly Asp Glu Gly Glu Thr Gly Phe Arg Arg Thr Phe Ser 15 10

<210> 68 <211> 13 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 68

Gly Asp Glu Gly Glu Thr Arg Phe Arg Arg Thr Phe Ser 1 S 10 <210> 69 <211> 23 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 69

Vai Lys Gin Ala. Leu Arg Glu Ala Gly Asp Phe Glu Leu Arg Tyr Arg 15 10 15

Arg Ala Phe Ser Asp Thr Ser 20

<210> 70 <211> 22 <212> PRT <213> SINTÉTICO 90 <400> 70

Glu Leu Phe Arg Asp Gly Vai Asn Trp Gly Arg lie Vai Ala Phe phe 15 10 15

Ser Phe Gly Gly Ala Leu 20

<210> 71 <211> 23 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 71

Arg Ala Ala Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Arg Arg Thr Phe Ser Asp i s 10 15

Leu Ala Ala Gin Leu His Vai 20 <210> 72 <211> 19

<212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 72

Glu Leu Phe Gin Gly Gly Pro Asn Trp Gly Arg Leu Vai Ala Phe Phe 15 10 15

Vai Gly Ala <210> 73 <211> 24

<212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 73

His Thr Leu Arg Oln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg Arg 15 10

Aep Phe Ala Glu Met Ser Ser Gin 20 91

<210> 74 <211> 20 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 74

Glu Leu Phe Arg Asp Gly Vai Asn Trp Gly Arg Ile Vai Ala Phe Phe 1 5 10 15

Glu Phe Gly Gly 20

<210> 75 <211> 30 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 75

Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala Pro Pro &sn. Leu Trp Ala Ala Gin 15 10 15

Arg Tyr Gly Arg Glu Leu Arg Arg Met Ser Asp Glu Glu Phe 20 25 30

<210> 76 <211> 6 <2 12> PRT <213> SINTÉTICO <400> 76

Phe Arg Gly Arg Ser Arg 1 S <210> 77

<211> 7 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 77

Arg Ser Arg Ser Ser Ala Pro 1 ' 5 <210> 78 <211> 13 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 78

Glu Glu Glu, Leu Ser Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala 1 S 10 92 <210> 79 <211> 13 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 79

Glu Glu Glu Leu Glu Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala 1 5 10

<210> 80 <211> 13 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 80

Glu Glu Glu Leu Gly Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala 1 5 10 <210> 81

<211> 12 < 212 > PRT <213> SINTÉTICO <400> 81

Arg Gin Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg 1 5 10

<210> 82 <211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 82

Arg Gin Ala Gly Asp Asp Phe Glu Arg Arg Tyr Arg 15 10 <210> 83

<211> 12 <212> PRT <213> SINTÉTICO <400> 83

Arg Gin. Ala Gly Asp Aap Phe Gly Arg Arg Tyr Arg 1 5 10

Lisboa, 15 de Fevereiro de 2007

Claims (18)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Conjunto de polipéptidos que têm ambos os domínios Ml e M2 no mesmo polipéptido ou Ml num polipéptido e M2 no outro polipéptido e o qual é capaz de inibir a interacção Bcl-xL/PPlc, em que o domínio Ml tem a sequência NWGRIVAFFSF e o domínio M2 tem a sequência GDEFELRYRRAF.

2. Conjunto de péptidos de acordo a reivindicação 1, em que os referidos péptidos são glicosilados, acetilados, fosforilados ou amidados.

3. Conjunto de ácidos nucleicos isolados que codificam para um conjunto de péptidos de acordo com a reivindicação 1 ou uma sequência de ácido nucleico que hibrida sob condições rigorosas com um dos referidos ácidos nucleicos que codifica o referido conjunto de péptidos.

4. Vector que compreende os ácidos nucleicos de acordo com a reivindicação 3.

5. Método de identificação de um polipéptido ou proteína que interage com a PPl, que compreende: detecção na sequência do referido polipéptido ou proteína, da presença de dois domínios de ligação à PPl Ml e M2 no mesmo polipéptido, em que o domínio Ml tem a sequência NWGRIVAFFSF e o domínio M2 tem a sequência GDEFELRYRRAF; e confirmação que o referido identificado polipéptido ou proteína é um polipéptido ou proteína que interage com a PP-1 utilizando um teste bioquímico.

6. Método da reivindicação 5, em que o referido teste bioquímico consiste em co-imunoprecipítar o referido 2 polipéptido ou proteína identificado que interage com a PPl e a PPl.

7. Método de rastreio de compostos que inibem ou aumentam a actividade de PPl ou alteram a sua localização através da interacção ou que interagem com reguladores da PPl, que compreende: (a) imobilização de péptidos num suporte de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2; e (b) testar a interacção dos referidos compostos com os péptidos do passo (a).

8. Método de rastreio de compostos que interagem com PPl, que compreende: (a) obtenção de anticorpos para os péptidos de acordo com as reivindicações 1 ou 2; e (b) testar a interacção do referido composto com os referidos anticorpos.

9. Composto farmacêutico que compreende o conjunto de péptidos de acordo com as reivindicações 1 ou 2.

10. Composição farmacêutica que compreende um ácido nucleico que codifica para o conjunto de péptidos de acordo com as reivindicações 1 ou 2.

11. Composição farmacêutica que compreende o vector da reivindicação 4.

12. Método para inibir a interacção in vítro entre a PPlc e a Bc1-Xl, que compreende um passo de adição de um conjunto de péptidos que contém ambos os domínios Ml e M2 no mesmo 3 péptido, em que o conjunto de péptidos compreende NWGRIVAFFSF e GDEFELRYRRAF.

13. kit que compreende anticorpos para a série de péptidos de acordo com as reivindicações 1 ou 2 e reagentes para interpretar a interacção.

14. Utilização do conjunto de péptidos de acordo com as reivindicações 1 ou 2, para a preparação de um medicamento para tratar ou prevenir a diabetes, elevada pressão sanguínea, um distúrbio neurológico, uma doença virai ou uma infecção microbiana associada a PPl.

15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o distúrbio neurológico é doença de Parkinson ou doença de Alzheimer.

16. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que a doença virai é HIV-1.

17. Anticorpos para os péptidos de acordo com as reivindicações 1 ou 2.

18. Anticorpos de acordo com a reivindicação 17, caracterizados de modo a que sejam anticorpos monoclonais. Lisboa, 15 de Fevereiro de 2007