ES2276895T3 - Cribado de peptidos qque inhiben la union de pp1c a las proteinas bcl-2, bcl-xi y bcl-w. - Google Patents

Cribado de peptidos qque inhiben la union de pp1c a las proteinas bcl-2, bcl-xi y bcl-w. Download PDF

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Abstract

Conjunto de polipéptidos que tiene tanto los motivos M1 como M2 en el mismo polipéptido o M1 en un polipéptido y M2 en el otro polipéptido y que puede inhibir la interacción Bcl-xL/PP1c, en el que el motivo M1 tiene la secuencia NWGRIVAFFSF y el motivo M2 tiene la secuencia GDEFELRYRRAF.

Description

Cribado de péptidos que inhiben la unión de PP1c a las proteínas Bcl-2, Bcl-x_{L} y Bcl-w.
Antecedentes de la invención
La invención se refiere a métodos para identificar polipéptidos y proteínas que interaccionan con PP1 novedosos, compuestos que pueden inhibir la unión de PP1c a ciertos factores que interaccionan de manera natural con el mismo, especialmente proteínas de la familia de Bcl-2 (tales como Bcl-x_{L} y Bcl-w), y composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos.
Técnica anterior
Las serina/treonina fosfatasas se clasifican como de tipo 1 (PP1) o tipo 2 (PP2), dependiendo de su especificidad de sustrato y su sensibilidad a los inhibidores. PP1 regula la progresión del ciclo celular, proliferación, transcripción, síntesis de proteínas, citocinesis y señalización neuronal (McAvoy et al, 2001). PP1 se regula por su interacción con una variedad de subunidades de proteínas que dirigen la subunidad catalítica (PP1c) hacia compartimientos subcelulares específicos y determina su ubicación, actividad y selectividad de sustrato (Bollen et al, 2001). PP1 puede regularse mediante la interacción entre una subunidad catalítica y múltiples subunidades de selección como diana que permiten la desfosforilación específica de diversas dianas celulares. El número de subunidades de selección como diana de PP1c conocidas aumenta continuamente y hasta la fecha ya se han identificado casi treinta proteínas de mamífero únicas. Las proteínas que interaccionan con PP1 incluyen las subunidades de unión a glucógeno, RGL/GM, GL, PTG/R5/U5 y R6 que dirigen la fosfatasa al glucógeno, las subunidades de asociación a miosina, M110, NIPP-1, p99/PNUTS, y Sds22, que pueden dirigir la fosfatasa hacia el núcleo (Bollen, 2001). Los estudios previos basados en análisis de cristalografía de rayos X y estructurales de proteínas que interaccionan con PP1 indicaron que PP1c se une a distintas proteínas de interacción conocidas mediante una secuencia de aminoácido corta. Los motivos [RK]VxF (o [RK]xVxF) representan una secuencia consenso generalizada para el reconocimiento y unión de distintas subunidades reguladoras y proteínas que interaccionan con PP1c (Egloff et al, 1997; Aggen et al, 2000).
Usando una línea de células T murinas que puede propagarse independientemente en presencia de IL-2 o IL-4 (Pitton et al, 1993), los inventores han descrito que PP1c es una fosfatasa activada por Ras que desfosforila Bad (un miembro proapoptótico de la familia de la proteína Bcl-2) antes de inducir la apoptosis en respuesta a la carencia de IL-2 (Ayllón et al, 2000). Realizando estudios competitivos bioquímicos, los inventores también identificaron recientemente Bcl-2 como una nueva subunidad de selección como diana de PP1c que controla su asociación con Bad en células estimuladas con IL-2 (Ayllón et al, 2001).
Las proteínas de la familia de Bcl-2 actúan como punto de control intracelular en la ruta apoptótica. La familia de proteínas de Bcl-2 se divide en dos grupos funcionales: miembros anti-apoptóticos tales como Bcl-2, Bcl-x_{L}, Bcl-w, A1 y Mcl-1 y miembros proapoptóticos tales como Bax, Bak, Bcl-x_{S} así como el miembro "sólo BH3" ("BH3-only") Bad (White, 1996; Reed, 1998; Chao y Korsmeyer, 1998). El equilibrio entre homo y heterodimeros de los miembros de la familia de Bcl-2 puede ser crítico para mantener la proliferación o la apoptosis celular (Jacobson, 1997; Korsmeyer, 1999; Gross et al, 1999). La regulación por incremento o por disminución de estas proteínas puede explicar la supervivencia de algunos tipos de células, aunque también es posible que los factores de supervivencia utilicen proteína cinasas o fosfatasas para alterar la capacidad de estas proteínas para estimular la supervivencia o apoptosis celular. Los miembros de la familia de Bcl-2 antiapoptóticos interaccionan con otros agonistas de la muerte de la familia de Bcl-2 y con proteínas que no son de la familia de Bcl-2, incluyendo R-Ras, H-Ras, Raf, caspasas, calcineurina y la serina/treonina fosfatasa PP1c (Rebollo et al, 1999; Ayllón et al, 2001). La familia de Bcl-2 se ha definido mediante homología de secuencia basándose en motivos conservados específicos denominados regiones de homología con Bcl (dominios BH1, BH2, BH3 y BH4). Se ha mostrado que los dominios BH1, BH2 y BH3 son importantes en la homodimerización o la heterodimerización y en la modulación de la apoptosis. Las moléculas antiapoptóticas tienen un dominio BH4 específico.
Bad comparte identidad sólo en el dominio BH3 (Zha et al, 1997) y forma heterodimeros con Bcl-2 y Bcl-x (Ottilie et al, 1997). Al estimular las células con IL-3, NGF y GM-CSF, Bad se fosforila en serina (Del Peso et al, 1997; Datta et al, 1997), dando como resultado la asociación con la proteína 14-3-3 y suprimiendo la interacción con Bcl-x (Hsu et al, 1997). Recientemente se ha mostrado que la asociación de la proteína 14-3-3 con Bad depende de la fosforilación de la serina 155 de Bad (Datta et al, 2000; Zhou et al, 2000).
Bcl-w es una proproteína de supervivencia que lleva los cuatro dominios de homología de Bcl-2 (BH) conservados (Gibson et al, 1996). La expresión reforzada de Bcl-w, como Bcl-2, hace las líneas celulares linfoide y mieloide resistentes a la apoptosis inducida por la carencia de citocinas. La molécula Bcl-x_{L} antiapoptótica también contiene los cuatro dominios BH conservados (Núnez et al, 1994). Una segunda isoforma de Bcl-x, Bcl-x_{S}, codifica para una proteína más pequeña de 170 aminoácidos que intensifica la apoptosis (Minn et al, 1996). Bcl-x_{L} contiene un segmento hidrófobo en el extremo C-terminal que se cree que sirve como anclaje a la membrana (Boise et al,
1993).
La apoptosis o muerte celular programada es un proceso activo en el que las células inducen su autodestrucción en respuesta a señales de muerte celular específicas o en ausencia de señales de supervivencia celular. En realidad este proceso activo es esencial en el desarrollo normal y homeostasis de organismos multicelulares. Es opuesto a la necrosis que es la muerte celular que se produce como resultado de cambios dañinos graves en el entorno.
Se producen diversas patologías debido a la regulación defectuosa o aberrante de la apoptosis en las células afectadas de un organismo. Por ejemplo, los defectos que dan como resultado un nivel disminuido de apoptosis en un tejido en comparación con el nivel normal requerido para mantener el estado estacionario del tejido pueden estimular un aumento anómalo de la cantidad de células en un tejido. Esto puede observarse en diversos cánceres, en los que la formación de tumores se produce debido a que las células no mueren a su tasa normal. Algunos virus de ADN, tales como el virus de Epstein-Barr, virus de la peste porcina africana y adenovirus, también inhiben o modulan la apoptosis, reprimiendo así la muerte celular y permitiendo que la célula huésped continúe reproduciendo el virus.
Por el contrario, un defecto que da como resultado un aumento de la muerte celular en un tejido puede asociarse con trastornos degenerativos en los que las células mueren a una tasa superior a la que se regeneran. Esto se observa en diversos trastornos, tales como SIDA, senescencia, y trastornos neurodegenerativos.
Los compuestos que modulan positiva o negativamente la apoptosis pueden proporcionar medios para el tratamiento o la prevención de estos trastornos. Como consecuencia, la descripción de rutas apoptóticas proporciona dianas para el desarrollo de agentes terapéuticos que pueden usarse para modular la respuesta de una célula frente a señales de supervivencia celular o apoptóticas.
Los resultados descritos en la presente invención indican que los miembros antiapoptóticos de la familia de Bcl-2, Bcl-w y Bcl-x_{L} también son subunidades de selección como diana de PP1c en células estimuladas con IL-4. Esta observación ofrece una ruta hacia un mecanismo general novedoso de regulación de la apoptosis celular que puede desempeñar un papel en la regulación de moléculas pro o antiapoptóticas en respuesta a señales de muerte celular o de supervivencia celular. Por tanto, la invención es de importancia particular en los campos del tratamiento del cáncer y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Más generalmente, la presente invención proporciona medios para modular la interacción entre PP1 y las proteínas o polipéptidos que se unen a ella. Por tanto, la presente invención tiene aplicaciones en una amplia variedad de campos, ya que PP1 está implicada en muchas rutas biológicas. Por ejemplo, se sabe que una disminución de la fosforilación del complejo de PP1 activa las cadenas ligeras de miosina del músculo liso y por tanto relaja los músculos lisos (véase, Uehata et al., 1997). Por tanto, la hipertensión arterial podría ser un objetivo de la presente invención.
PP1 es una proteína serina/treonina fosfatasa eucariota principal que regula diversos procesos celulares tales como ciclo celular, transcripción y síntesis de proteínas.
La regulación de PP1 también puede afectar a la regulación aguas abajo de la síntesis de glucógeno hepático que, a su vez, disminuiría los niveles de glucemia y por tanto trataría la diabetes en la que la hiperglucemia es un problema grave.
Además, PP1 está implicada en varias infecciones bacterianas, virales y parasitarias, e inhibir su interacción con algunas de sus parejas en un contexto infeccioso podría ser beneficioso para el paciente.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un conjunto de polipéptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 en el mismo polipéptido o M1 en un polipéptido y M2 en el otro polipéptido y que puede inhibir la interacción Bcl-x_{L}/PP1c, en el que el motivo M1 tiene la secuencia NWGRIVAFFSF y el motivo M2 tiene la secuencia GDEFELRYRRAF.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un péptido o un conjunto de péptidos que tiene tanto los motivos M1 como M2 y que puede inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, o Bcl-2/Bad/PP1c. Una composición de este tipo puede comprender, por ejemplo, los péptidos NWGRIVAFFSF y GDEFELRYRRAF. Los péptidos con aminoácidos modificados (glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación o derivación mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos) también pueden usarse en las composiciones según la invención.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica para un péptido o un conjunto de péptidos que tiene tanto los motivos M1 NWGRIVAFFSF como M2 GDEFELRYRRAF. En otra realización la presente invención se refiere a un método para identificar un polipéptido o proteína que interacciona con PP1, que comprende: detectar en la secuencia dicho polipéptido o proteína, la presencia de dos motivos M1 y M2 de unión a PP1 en el mismo polipéptido, en el que el motivo M1 tiene la secuencia NWGRIVAFFSF y el motivo M2 tiene la secuencia GDEFELRYRRAF; y confirmar dicho polipéptido o proteína que interacciona con PP-1 usando una prueba bioquímica.
Aún en otra realización, la presente invención describe un método para cribar compuestos que interaccionan con reguladores de PP1, en el que los péptidos que tienen tanto los motivos M1 NWGRIVAFFSF como M2 GDEFELRYRRAF y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, o Bcl-2/Bad/PP1C, se inmovilizan sobre un soporte y se somete a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos péptidos.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a un método para cribar compuestos que interaccionan con PP1. Este método comprende obtener anticuerpos frente a péptidos que tienen tanto los motivos M1 NWGRIVAFFSF como M2 GDEFELRYRRAF y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, o Bcl-2/Bad/PP1C, y someter a prueba la interacción de dicho compuesto con dichos anticuerpos.
En otra realización, la presente invención se refiere a un método para inhibir in vitro la interacción entre PP1c y Bcl-x_{L} o Bcl-w, que comprende una etapa de añadir un péptido o un conjunto de péptidos que tiene tanto M1 NWGRIVAFFSF como M2 GDEFELRYRRAF.
En los métodos anteriores, los péptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir la interacción Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, o Bcl-2/Bad/PP1c, pueden ser por ejemplo los péptidos NWGRIVAFFSF y GDE
FELRYRRAF.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a un kit que comprende péptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, o Bcl-2/Bad/PP1c. Un kit de este tipo puede comprender, por ejemplo, los péptidos NWGRIVAFFSF y GDEFELRYRRAF. Estos péptidos pueden inmovilizarse sobre un soporte sólido.
Aún en otra realización la presente invención se refiere a un kit que contiene anticuerpos frente a péptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, o Bcl-2/Bad/PP1c. Dichos anticuerpos pueden prepararse, por ejemplo, frente a los péptidos NWGRIVAFFSF y GDE
FELRYRRAF.
Aún en otra realización la presente invención se refiere al uso de péptidos que tienen tanto los motivos M1 NW
GRIVAFFSF como M2 GDEFELRYRRAF y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, o Bcl-2/Bad/PP1c, para la preparación de un medicamento para tratar la diabetes o la hipertensión o trastornos neurológicos o una infección viral o una enfermedad parasitaria. Los péptidos NWGRIVAFFSF y GDEFELRYRRAF pueden usarse, por ejemplo, según la invención.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1
Asociación de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c y Bad
A) Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de células estimuladas con o que se sometieron a carencia de IL-4 (60 U/ml) con anticuerpo anti-Bcl-x_{L} o anti-Bcl-w, se transfirieron a nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia con anticuerpo anti-Bad, anti-PP1c, anti-Bcl-x_{L} y anti-Bcl-w. Se detectaron bandas de proteínas usando el sistema ECL. Se muestran los pesos moleculares de las proteínas correspondientes. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes. B) Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo anti-cadena p55 de IL-2R, se transfirieron a nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia con anticuerpos anti-Bcl-w, Bcl-x_{L} o anti-IL-2R de p55. Se detectaron bandas de proteínas usando el sistema ECL. C) Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de timocitos recién aislados con anti-Bad, anti-PP1c o un suero irrelevante y se realizó la inmunotransferencia con anti-Bcl-2, anti-Bcl-x_{L}, anti-Bad y anti-PP1c. Se detectaron proteínas tal como en A. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
Figura 2
Efecto de la carencia de IL-4 sobre la expresión de Bad, PP1c, Bcl-x_{L} y Bcl-w
A) Se estimularon células Ts1\alpha\beta con o se sometieron a carencia de IL-4 durante los tiempos indicados, luego se lisaron. Se transfirieron las proteínas a nitrocelulosa y se detectaron con sondas con anticuerpos anti-Bcl-x_{L}, anti-Bcl-w, anti-Bad y anti-PP1c. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes.
B) Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de células estimuladas con o que se sometieron a carencia de IL-4 durante 24 h con anti-Bcl-x_{L} o anti-Bcl-w, se separaron en un gel de SDS-PAGE en gradiente y se realizó la inmunotransferencia con anti-Pser, anti-Bad, anti-PP1c y, como control interno, con anti-Bcl-x_{L} y anti-Bcl-w. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.
C) Se inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de control, células estimuladas con o que se sometieron a carencia de IL-4 (1 x 10^{7}) con anticuerpo anti-Bad y se realizó la inmunotransferencia con serina 112, serina 136 y serina 155 de anti-Bad. Como control interno, se desarrolló la inmunotransferencia con anticuerpo anti-Bad. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. Control positivo para la fosforilación de la serina 112 y 136 de Bad, células estimuladas con IL-2 (carril C); control positivo para la fosforilación de la serina 155 de Bad, células COS transfectadas con Bad (carril C).
D) Se inmunoprecipitaron extractos totales (T) de lisados citoplásmicos de células estimuladas con o que se sometieron a carencia de IL-4 (1 x 10^{7}) con anticuerpos anti-PP1c, anti-Raf, anti-Bcl-x_{L} o anti-Bad y se realizó la inmunotransferencia con anti-14-3-3, anti-PP1c, anti-Bcl-x_{L} y anti-Bad. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes.
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Figura 3
Estimación de actividad serina/treonina fosfatasa en control o inmunoprecipitados de Bcl-x, Bad y Bcl-w tratados con AO
A) Se estimó la actividad fosfatasa en inmunoprecipitados de Bad, Bcl-x_{L} y Bcl-w de células estimuladas con IL-4 usando ^{32}P fosforilasa a como sustrato.
B) Se añadieron concentraciones diferentes de AO a inmunoprecipitados de Bad o Bcl-w de células estimuladas con IL-4. Se estimó la actividad fosfatasa usando ^{32}P fosforilasa a como sustrato. La reacción fue tal como en A. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes. La actividad fosfatasa se representa como el porcentaje de la actividad máxima en sobrenadantes sin tratar.
Figura 4
Estimación de actividad serina/treonina fosfatasa tras la reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w
A) Se redujeron Bcl-x_{L} y Bcl-w de lisados citoplásmicos de células estimuladas con IL-4 mediante cuatro inmunoprecipitaciones secuenciales. Se estimó la actividad fosfatasa en inmunoprecipitados de Bad de células estimuladas con IL-4 control o en inmunoprecipitados de Bad con reducción de Bel-x_{L} y Bcl-w tras cuatro inmunoprecipitaciones secuenciales. La actividad fosfatasa se representa como el porcentaje de la actividad máxima detectada en inmunoprecipitados de anti-Bad control. B) Se analizó el efecto de la reducción de Bel-x_{L} y Bcl-w sobre la asociación PP1c/Bad. Se inmunoprecipitaron extractos citoplásmicos de células estimuladas con IL-4 control o extractos citoplásmicos con reducción de Bcl-x_{L}, y Bcl-w con anticuerpos anti-Bad o anti-PP1c y se realizó la inmunotransferencia con anti-Bad, anti-Bcl-w, anti-Bcl-x_{L} y anti-PP1c. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes. Se detectaron bandas de proteínas usando el sistema ECL.
Figura 5
Ensayo de unión a PP1c sobre péptidos Bcl-x_{L} o Bcl-w unidos a celulosa
A) Secuencia del motivo F X X R X R de Bcl-2, Bcl-x_{L} y Bcl-w. B) Membrana con péptidos Bcl-x_{L} o Bcl-w que contienen el motivo R/K X V/I X F o F X X R X R, así como péptidos que contienen motivos mutados, se incubaron con PP1c purificada, seguido por anticuerpo anti-PP1c y anticuerpo secundario conjugado con OP. Se detectaron puntos usando el sistema ECL. Los motivos R/K X V/I X F y F X X R X R están en negrita. Los aminoácidos mutados dentro del motivo están en negrita y subrayados. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. El péptido 1 corresponde al motivo de unión a PP1 de Bcl-x_{L} y Bcl-w. El péptido 2 corresponde al sitio de unión a PP1 mutado en el que los residuos V y F se mutaron para dar A.
Figura 6
Efecto de los péptidos R, R*, F y R+F sobre la interacción Bcl-x_{L} /PP1c/Bad y Bcl-w/PP1c/Bad
A) Se inmunoprecipitaron extractos citoplásmicos de células estimuladas con IL-4 control con anticuerpo anti-Bad. Se hizo competir la interacción Bcl-x_{L} /PP1c/Bad y Bcl-w/PP1c/Bad con 1,5 mM de péptidos R, R*, F o R+F durante 30 min. a temperatura ambiente. Se lavaron los inmunoprecipitados, se transfirieron a nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia con anti-Bad, anti-PP1c, anti-Bcl-x_{L} y anti-Bcl-w. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. Para la secuencia de péptidos, véase Materiales y Métodos o las figuras 5A y 5B.
B) Se inmunoprecipitaron lisados citoplásmicos de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo anti-Bad. Se trataron los inmunoprecipitados con 1,5 mM de péptidos R, R*, F o R+F durante 30 min. a temperatura ambiente. Se lavaron los inmunoprecipitados y se estimó la actividad fosfatasa usando ^{32}P fosforilasa a como sustrato. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes.
C) Se inmunoprecipitaron lisados citoplásmicos de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo anti-Bad y luego se trataron con 1,5 mM de péptido R+F o 3 mM de péptido R o F (30 min., temperatura ambiente). Se lavaron los inmunoprecipitados y se estimó la actividad fosfatasa tal como en B.
Figura 7
Efecto de AO y oligonucleótidos antisentido sobre la apoptosis y fosforilación de la serina 136 de Bad
A) Se trataron las células con o sin AO 1 \muM en presencia o ausencia de IL-4. Se inmunoprecipitaron los lisados citoplásmicos con anticuerpo anti-Bad, se transfirieron a nitrocelulosa y se detectaron con sondas con fosfo-Bad ser 136 y anti-Bad, siendo el último para verificar que el tratamiento con AO in vivo no afecta a la expresión de Bad. Se detectaron bandas de proteínas usando ECL.
B) Se trataron células durante 6 h con o sin AO 1 \muM en presencia o ausencia de IL-4 y luego se lavaron, se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron mediante citometría de flujo.
C) Se trataron células durante 24 h con o sin oligonucleótido sentido o antisentido 15 \muM en presencia o ausencia de IL-4. Se añadieron oligonucleótidos a las 0, 12 y 18 h y luego se lavaron las células, se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron mediante citometría de flujo. Se analizó la expresión de Bcl-x_{L} y Bcl-w tras el tratamiento sentido y antisentido mediante inmunotransferencia de tipo western.
Figura 8
A) Dos supuestos motivos de unión a PP1 en proteínas Bcl-2. Alineación de secuencias en la proximidad de los dominios BH1 y BH3 de algunas proteínas Bcl-2. Estas secuencias están perfectamente conservadas en diversas especies (seres humanos, ratones, ratas, bovinos...).
B) Un papel para la fosforilación de la serina en la unión a PP1.
Se sintetizaron seis péptidos (de 14 AA de longitud) y se unieron covalentemente a una membrana de celulosa antes de analizarse para detectar la unión a PP1 tal como se describió. Se introdujo una mutación de AA puntual en Ser-136 en 4 péptidos (mutantes 2, 3, 5, 6).
C) Asociación de P13-K p85 (carril 1), P13-K p110 (carril 2), HSP70, (carril 3), y CD4 (carril 4) a PP1c. Se usaron células TS1 \alpha\beta tratadas con IL-4 (1 x 10^{7}) para la inmunoprecipitación tal como se describe normalmente. Se transfirieron inmunoprecipitados a nitrocelulosa, se bloquearon y se incubaron con anticuerpo primario anti-PP1c. Se lavó la membrana y se incubó con anticuerpo secundario conjugado con OP y se desarrollaron proteínas usando ECL.
Figura 9
Histograma para ilustrar el número de proteínas y el número de aminoácidos que separan los motivos F-xx-[RK]-x-[RK] y [RK]-V-x-[FW] / [RK]-x-V-x-[FW] (A) [RK]-V-x-F / [RK]-x-V-x-F (B).
Realizaciones preferidas de la invención
Los siguientes términos se usan a lo largo del resto de la memoria descriptiva y reivindicaciones y debe entenderse que significan, aparte de la definición genérica, la siguiente definición más precisa; entendiéndose que la definición genérica también se incluye.
Tal como se usa en el presente documento, la palabra "aspecto" se refiere a cualquier elemento o característica técnica de la invención reivindicada.
Tal como se usa en el presente documento, la palabra "imitar" se refiere a un parecido cercano o bien en estructura y/o bien en función.
Tal como se usa en el presente documento la palabra "aislado" significa tomado del entorno natural. Aislado no significa necesariamente que lo que se toma del entorno natural se purifica al 100%.
Tal como se usa en el presente documento el término "prueba bioquímica" se refiere a cualquier prueba que puede identificar un polipéptido o proteína que interacciona. Ejemplos de pruebas bioquímicas incluyen, pero no se limitan a, inmunoprecipitación, uso de anticuerpos, ya sean monoclonales o policlonales, sondas de oligonucleótidos que pueden marcarse con radioactividad o una enzima, disminución de GST (experimento de filtración en gel que revela el tamaño de complejos macromoleculares) tal como se describió en Ayllón et al EMBO J. 19 2237-2246(2000), y similares.
Tal como se usa en el presente documento, el término "motivo" se refiere a una secuencia o secuencias de aminoácidos particulares que son similares y tienen la misma función en diferentes entornos celulares. Un motivo tiene algunos aminoácidos fijos y otros variables.
Tal como se usa en el presente documento y durante toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, cuando varios aminoácidos están entre corchetes, esto significa que el aminoácido dentro de los corchetes puede ser uno u otro. Por tanto, [RK] significa que el motivo puede tener o bien R o bien K.
Tal como se usa en el presente documento, la palabra "inhibe" significa que previene las interacciones específicas, independientemente del mecanismo de esta prevención.
Tal como se usa en el presente documento una "composición farmacéutica" incluye, pero no se limita a, los péptidos de la presente invención descritos a lo largo de la memoria descriptiva y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Esta composición farmacéutica comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de los péptidos de la presente invención. La cantidad farmacéuticamente aceptable puede estimarse a partir de ensayos de cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluye o abarca un punto o intervalo de concentración que tiene el efecto deseado en un sistema in vitro. Por tanto, esta información puede usarse para determinar con precisión las dosis en animales, incluyendo seres humanos.
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La dosis terapéuticamente eficaz se refiere a esa cantidad del compuesto que da como resultado la mejora de los síntomas en un paciente. La toxicidad y eficacia terapéutica de tales compuestos puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos habituales en cultivos celulares o en animales experimentales. Por ejemplo, la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) así como la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) pueden determinarse usando métodos conocidos en la técnica. La razón de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico que puede expresarse como la razón entre la DL50 y la DE50 compuestos que muestran índices terapéuticos altos.
Los datos obtenidos de los estudios en animales y cultivos celulares pueden usarse para formular un intervalo de dosificaciones de tales compuestos que está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50 con poca o ninguna toxicidad.
La composición farmacéutica puede administrarse por medio de cualquier vía tal como localmente, oralmente, sistémicamente, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía mucosa, usando un parche y puede encapsularse en liposomas, micropartículas, microcápsulas, y similares. La composición farmacéutica puede incrustarse en liposomas o incluso encapsularse. La composición farmacéutica también puede estar en una forma liofilizada.
Puede usarse cualquier adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable en la composición farmacéutica. El compuesto modulador estará por ejemplo en una forma soluble combinado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las técnicas para formular y administrar estos compuestos pueden encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack Publication Co., Easton, PA, última edición.
El modo de administración, dosificaciones óptimas y formas galénicas pueden determinarse mediante criterios conocidos en la técnica teniendo en cuenta la gravedad del estado general del mamífero, incluyendo el ser humano, la tolerancia del tratamiento y los efectos secundarios.
"Composiciones farmacéuticas" también incluye vectores que podrían administrarse directamente in vivo o pueden combinarse con células específicas que pueden o no extraerse del animal que va a tratarse. Tipos de células incluyen todas las células eucariotas y procariotas, incluyendo células musculares, de corazón, hígado, pulmón, cerebro, timocitos, sanguíneas y similares. Las células bacterianas y vegetales también se abarcan en la presente invención ya que PP1 se encuentra en muchos tipos diferentes de células bacterianas y vegetales. Las células de levadura también se abarcan por la presente invención. De hecho, cualquier célula que contenga PP1 se abarca por la presente invención.
Por tanto, se incluyen abarcadas por el término "composiciones farmacéuticas" todas las formas de administración farmacéutica no sólo clásica, sino que también incluye la terapia génica.
Por el término "soporte" se quiere decir cualquier tipo de objeto sobre el que pueden inmovilizarse los péptidos. El tipo de soporte incluye, pero no se limita a, pocillos Costar, perlas, resinas, pastillas de vidrio, membranas y similares. Cualquier soporte que pueda usarse para inmovilizar proteínas o péptidos puede usarse en los métodos de la presente invención.
El término "animal" abarca cualquier ser vivo que no es vegetal, incluyendo vertebrados tales como mamíferos, aves, reptiles, anfibios y peces.
Tal como se usa en el presente documento los términos "polinucleótidos", "ácidos nucleicos" y "oligonucleótidos" se usan de manera intercambiable e incluyen, pero nos e limitan a, secuencias de ARN, ADN, ARN/ADN de más de un nucleótido en forma o bien de cadena sencilla o bien de dúplex. Las secuencias de polinucleótido de la presente invención pueden prepararse a partir de cualquier método conocido incluyendo, pero sin limitarse a, cualquier método sintético, cualquier método recombinante, cualquier método de generación ex vivo y similares, así como combinaciones de los mismos.
Los polinucleótidos que pueden hibridarse con cualquiera de los polinucleótidos tratados anteriormente también están cubiertos por la presente invención. Tales polinucleótidos se denominan en el presente documento como polinucleótidos "de hibridación". Los polinucleótidos de hibridación pueden ser útiles, por ejemplo, como sondas o cebadores.
Según una realización de la presente invención, tales moléculas de hibridación tienen una longitud de al menos 10 nucleótidos. Según otra realización, tienen una longitud de al menos 25 o al menos 50 nucleótidos.
En una realización, las moléculas de hibridación se hibridarán con tales moléculas en condiciones de hibridación rigurosas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es cuando se lleva a cabo la hibridación intentada a una temperatura de desde aproximadamente 35ºC hasta aproximadamente 65ºC usando una solución salina que es de aproximadamente 0,9 molar. Sin embargo, el experto podrá variar tales condiciones según sea apropiado con el fin de tener en cuenta variables tales como longitud de la sonda, composición de base, tipo de iones presentes, etc.
Por "prevenir o tratar" se quiere decir tratar una enfermedad o estado médico o detener la aparición de una enfermedad o un estado médico.
Más específicamente, la presente invención se refiere a un péptido o un conjunto de péptidos que imita tanto los motivos M1 como M2 y que afecta a las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, o Bcl-2/Bad/PP1c, en el que el motivo M1 tiene la secuencia FXX[RK]X[RK], y el motivo M2 tiene la secuencia [RK]VX[FW] o [RK]XVX[FW], en las que X es cualquier aminoácido.
La presente invención se refiere un conjunto de péptidos que comprende el péptido NWGRIVAFFSF/ y el péptido GDEFELRYRRAF.
Los péptidos o conjuntos de péptidos según la presente invención, o incluidos en las composiciones y kits de la invención, pueden abarcar dos o más motivos en la misma molécula, o de 2 a 10 motivos, motivos que se describieron anteriormente, teniendo un espaciador entre ellos. El espaciador puede ser una secuencia de aminoácidos o una cadena hidrocarbonada interpuesta mediante enlaces covalentes. Un espaciador también puede ser cualquier entidad química que puede servir para conectar los al menos dos motivos, y el espaciador también puede contener secuencias reguladoras entre los al menos dos motivos.
En otra realización, el espaciador de la presente invención tiene desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 50 aminoácidos. En una realización particular, el espaciador tiene aproximadamente 36 aminoácidos.
En otra realización, la presente invención se refiere a un polipéptido o proteína de fusión que contiene al menos un motivo de la presente invención. Este polipéptido o proteína de fusión puede prepararse según métodos conocidos en la técnica tales como los descritos por Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Edición (1989). Un polipéptido o proteína de fusión particular de la invención comprende uno o varios motivos M1 o M2, unidos con al menos un péptido fusogénico que ayudará al polipéptido o proteína de fusión a entrar en las células diana. Dicho péptido fusogénico puede ser, por ejemplo, un epítopo viral o un ligando para un receptor celular específico tal como receptores de quemocina.
Los motivos anteriores, sus análogos y modificaciones pueden sintetizarse usando, por ejemplo, un sintetizador "Applied System" o mediante síntesis en fase sólida de tipo Merrifield (véase, Merrifield, Adv. Enzmol. Related Areas Mol. Biol. (1969) 32; 221-96 o Merrfield, Recent Prog. Horm. Res. (1967); 23; 451-82). Los motivos también pueden producirse de manera recombinante.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica para los motivos puede insertarse dentro de un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia que codifica para el péptido/proteína insertada. Tales elementos de transcripción incluyen una región reguladora y un promotor. Por tanto, el ácido nucleico que puede codificar para un compuesto marcador de la presente invención está operativamente unido a un promotor en el vector de expresión. El vector de expresión también puede incluir un origen de replicación.
Se emplea una amplia variedad de combinaciones de huésped/vector de expresión para expresar ácidos nucleicos de la presente invención. Vectores de expresión útiles que pueden usarse incluyen, por ejemplo, segmentos de secuencias de ADN cromosómico, no cromosómico y sintético. Vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, derivados de SV40 y pcDNA y plásmidos bacterianos conocidos tales como col El, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX tal como se describe por Smith et al (1988), pMB9 y derivados de los mismos, plásmidos tales como RP4, ADN de fagos tales como los numerosos derivados de fago I tales como NM989, así como otro ADN de fagos tales como M13 y ADN de fago de cadena sencilla filamentosos; plásmidos de levadura tales como el plásmido de 2 micras o derivados del plásmido 2m, así como vectores lanzadera de levadura centroméricos y de integración; vectores útiles en células eucariotas tales como vectores útiles en células de insectos o de mamíferos; vectores derivados de combinaciones de ADN de fagos y plásmidos, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fago o las secuencias de control de la expresión; y similares.
Por ejemplo, en un sistema de expresión de baculovirus, pueden usarse tanto vectores de transferencia no de fusión, tales como, pero sin limitarse a, pVL941 (sitio de clonación de BamHI, Summers), pVL1393 (sitios de clonación de BamHI, SmaI, Xbal, EcoRI, NotI, XmaIII, BglII y PstI; Invitrogen), pVL1392 (sitio de clonación de BglII, PstI, NotI, XmaIII, EcoRI, XbalI, SmaI y BamHI; Summers e Invitrogen) y pBlueBacIII (sitio de clonación de BamHI, BglII, PstI, NcoI y HindIII, con selección recombinante azul/blanco, Invitrogen), como vectores de transferencia de fusión tales como, pero sin limitarse a, pAc700 (sitios de clonación de BamHI y KpnI, en los que el sitio de reconocimiento de BamHI comienza con el codón de iniciación; Summers), pAc701 y pAc70-2 (iguales que pAc700, con marcos de lectura diferentes), pAc360 (sitio de clonación de BamHI 36 pares de bases en sentido 3' de un codón de iniciación de polihedrina; Invitrogen (1995)) y pBlueBacHisA, B, C (tres marcos de lectura diferentes con sitio de clonación de BamHI, BglII, PstI, NcoI y HindIII, un péptido N-terminal para la purificación ProBond y cribado recombinante azul/blanco de placas; Invitrogen (220).
Los vectores de expresión de mamíferos contemplados para su uso en la invención incluyen vectores con promotores inducibles, tales como los promotores de la dihidrofolato reductasa, cualquier vector de expresión con un casete de expresión de DHFR o un covector de amplificación de DHFR/metotrexato tal como pED (sitios de clonación de PstI, SalI, SbaI, SmaI y EcoRI, con el vector que expresa tanto el gen clonado como DHFR; Kaufman, 1991). Alternativamente, un covector de amplificación de glutamina sintetasa/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sitios de clonación de HindIII, XbalI, SmaI, SbaI, EcoRI y BclI en los que el vector expresa la glutamina sintetasa y el gen clonado; Celltech). Puede usarse un vector que dirige la expresión episomal bajo el control del virus Epstein Barr (EBV) o antígeno nuclear (EBNA), tal como pREP4 (sitios de clonación de BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII y KpnI, promotor de RSV-LTR constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitios de clonación de BamHI, SfiI, XhoI, NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII y KpnI, promotor del gen temprano inmediato de hCMV constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pMEP4 (sitios de clonación de KpnI, PvuI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI, promotor del gen de metalotioneina IIa inducible, marcador seleccionable de higromicina, Invitrogen), pREP8 (sitios de clonación de BamHI, XhoI, NotI, HindIII, NheI y KpnI, promotor RSV-LTR, marcador seleccionable de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sitios de clonación de KpnI, NheI, HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI, promotor RSV-LTR, marcador seleccionable de G418; Invitrogen), y pEBVHis (promotor de RSV-LTR, marcador seleccionable de higromicina, péptido N-terminal purificable mediante resina ProBond y escindido mediante enterocinasa; Invitrogen).
Los vectores de expresión de mamíferos seleccionables para su uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, pRc/CMV (sitios de clonación de HindIII, BstXI, NotI, SbaI y ApaI, selección de G418, Invitrogen), pRc/RSV (sitios de clonación de HindII, SpeI, BstXI, NotI, XbaI, selección de G418, Invitrogen) y similares. Vectores de expresión de mamíferos del virus de Vaccinia (véase, por ejemplo, Kaufman 1991) que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, pSC11 (sitio de clonación de SmaI, selección de TK- y \beta-gal), pMJ601 (sitios de clonación de SalI, Smal, AflI, NarI, BspMII, BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI y HindIII; selección de TK- y \beta-gal), pTKgptF1S (sitios de clonación de EcoRI, PstI, SalII, AccI, HindII, SbaI, BamHI y Hpa, selección de TK o XPRT) y similares.
Los sistemas de expresión de levaduras que también pueden usarse en la presente incluyen, pero no se limitan a, vector pYES2 no de fusión (sitios de clonación de XbaI, SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, SacI, KpnI y HindIII, Invitrogen), la pYESHisA, B, C de fusión (sitios de clonación de XbalI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI y HindIII, péptido N-terminal purificado con resina ProBond y escindido con enterocinasa; Invitrogen), vectores pRS y similares.
En consecuencia, las células de mamíferos, y normalmente de seres humanos, así como células bacterianas, de levaduras, hongos, insectos, nematodos y vegetales se usan en la presente invención y pueden transfectarse por el ácido nucleico o vector recombinante tal como se define en el presente documento.
Ejemplos de células adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células VERO, células HELA tales como ATCC nº CCL2, líneas celulares CHO tales como ATCC nº CCL61, células COS tales como células COS-7 y células ATCC nº CRL 1650, W138, BHK, HepG2, 3T3 tales como ATCC nº CRL6361, A549, PC12, células K562, células 293, células Sf9 tales como ATCC nº CRL1711, células Cv1 tales como ATCC nº CCL70 y células JURKAT tales como ATCC nº Tib152.
Otras células adecuadas que pueden usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cepas de células huésped procariotas tales como Escherichia coli, (por ejemplo, la cepa DH5-\alpha), Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cepas de los géneros de Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, parásitos como los parásitos Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma, Cryptosporidia), Leishmania o Trypanosoma.
Células adecuadas adicionales que pueden usarse en la presente invención incluyen células de levaduras tales como las de Saccharomyces tales como Saccharomyces cerevisiae o Prombe.
Los motivos y péptidos anteriormente descritos están implicados en la unión de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1 c y por tanto son subunidades de selección como diana implicadas en el control de todas las uniones a PP1. Por tanto, debido a su implicación en la unión a PP1, estos motivos son importantes para la regulación de cualquier enfermedad relacionada con la regulación de la fosfatasa en todos los tipos de células incluyendo todas las células eucariotas y procariotas incluyendo células musculares, de corazón, hígado, pulmón, cerebro, timocitos, sanguíneas y similares. Las células bacterianas y vegetales también se abarcan en la presente invención ya que PP1 se encuentra en muchos tipos diferentes de células bacterianas y vegetales. Las células de levaduras también se abarcan por la presente invención. De hecho, cualquier célula que contiene PP1 se abarca por la presente invención.
De manera más importante, esta regulación puede afectar a la regulación aguas abajo de, por ejemplo, la síntesis de glucógeno hepático que a su vez reduciría los niveles de glucemia y por tanto tratará la diabetes en la que la hiperglucemia es un problema grave. Los péptidos de la presente invención pueden usarse para la preparación de un medicamento para tratar la diabetes. Los péptidos de la presente invención pueden usarse para la preparación de un medicamento para tratar la hipertensión arterial. Una disminución en la fosforilación del complejo de PP1 activa las cadenas ligeras de miosina del músculo liso y por tanto relaja los músculos lisos (véase, Uehata et al., 1997). Por tanto, los péptidos de la presente invención pueden usarse para la preparación de un medicamento para tratar la
hipertensión.
Aún en otra realización la presente invención se refiere a péptidos usados para la preparación de un medicamento para tratar trastornos neurológicos modulando los receptores neurológicos y los canales de iones. Por tanto, los péptidos de la presente invención pueden usarse para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir los trastornos neurológicos, tales como la enfermedad de Parkinson.
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Se sabe que la fosforilación desempeña un papel afectando al precursor de \beta-amiloide que provoca las placas en la enfermedad de Alzheimer. Por tanto, la presente invención se refiere al uso de los péptidos de la presente invención para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a infecciones virales o microbianas y más específicamente al virus del herpes simple, Myocbacterium tuberculosis y SIDA mediante el uso de los péptidos de la presente invención para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar la infección viral.
La presente invención es especialmente útil para tratar el SIDA ya que tanto TAT como la transcriptasa inversa del virus VIH-1 pueden ser proteínas de unión a PP1.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a infecciones parasitarias tales como malaria, theileria o cryptosporidium mediante el uso de los péptidos de la presente invención para la preparación de un medicamento para prevenir o tratar estas infecciones parasitarias.
Por ejemplo, puede administrase un conjunto de péptidos que comprende el péptido NWGRIVAFFSF y el péptido GDEFELRYRRAF, análogos de estos péptidos o sus equivalentes funcionales en un vehículo farmacéuticamente aceptable a dicho animal.
En otra realización la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido o conjunto de péptidos que imita tanto los motivos M1 como M2 y que inhibe las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c, Bcl-2/Bad/PP1c. Una composición de este tipo puede, por ejemplo, comprender el péptido NWGRIVAFFSF y el péptido GDEFELRYRRAF, análogos de estos péptidos o sus equivalentes funcionales en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero no se limita a, solución salina, adyuvantes y similares, tratados más exhaustivamente con anterioridad.
La presente invención no se limita únicamente a los péptidos descritos como una composición farmacéutica "pura", sino también como una composición farmacéutica para su uso en la terapia génica, usando vectores que codifican para polipéptidos según la presente invención.
Más específicamente, podría considerarse la terapia génica ex vivo e in vitro. Con respecto a esto, puede usarse cualquiera de las metodologías relativas a la terapia génica disponible en la técnica en la práctica de lo anterior, tales como las descritas por Goldspiel et al Clin. Pharm. 12 págs. 488-505 (1993).
La administración del ácido nucleico terapéutico dentro de un paciente puede ser terapia génica in vivo directa (es decir, el paciente se expone directamente al ácido nucleico o vector que contiene ácido nucleico) o terapia génica ex vivo indirecta (es decir, en primer lugar se transforman las células con el ácido nucleico in vitro y luego se transplantan dentro del paciente).
Por ejemplo, para la terapia génica in vivo, puede administrarse un vector de expresión que contiene el ácido nucleico de manera que se vuelve intracelular; es decir, mediante infección usando un vector retroviral defectuoso o atenuado u otros vectores virales tal como se describe, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. 4.980.286 o por Robbins et al, Pharmacol. Ther., 80 nº 1 págs. 35-47 (1998).
Los diversos vectores retrovirales que se conocen en la técnica son tales como los descritos por Miller et al. (Meth. Enzymol. 217 págs. 581-599 (1993)) que se han modificado para eliminar las secuencias retrovirales que no se requieren para empaquetar el genoma viral y la posterior integración dentro del ADN de la célula huésped. También pueden usarse vectores adenovirales que son ventajosos debido a su capacidad para infectar células que no se dividen, y tales vectores adenovirales de alta capacidad se describen en Kochanek (Human Gene Therapy, 10, págs. 2451-2459 (1999)). Los vectores virales quiméricos que pueden usarse son los descritos por Reynolds et al. (Molecular Medecine Today, págs. 25-31 (1999)). También pueden usarse vectores híbridos y se describen por Jacoby et al. (Gene Therapy, 4, págs. 1282-1283 (1997)).
La inyección directa de ADN desnudo o mediante el uso de bombardeo con micropartículas (por ejemplo, Gene Gun®; Biolistic, Dupont) o recubriéndolo con lípidos, también puede usarse en terapia génica. Receptores de superficie celular/compuestos de transfección o mediante encapsulación en liposomas, micropartículas o microcápsulas, o mediante administración del ácido nucleico en unión con un péptido que se sabe que entra en el núcleo o mediante su administración en unión con un ligando predispuesto a la endocitosis mediada por receptor (véase Wu & Wu, J. Biol. Chem., 262 págs. 4429-4432 (1987)) pueden usarse para seleccionar como diana tipos celulares que expresan específicamente los receptores de interés.
En otra realización, puede producirse un compuesto de ligando de ácido nucleico en el que el ligando comprende un péptido viral fusogénico diseñado para romper los endosomas, permitiendo así al ácido nucleico evitar la posterior degradación lisosomal. El ácido nucleico puede dirigirse in vivo para la expresión y endocitosis específica de células seleccionando como diana un receptor específico tal como los descritos en los documentos WO92/06180, WO93/14188 y WO 93/20221. Alternativamente, puede introducirse el ácido nucleico de manera intracelular e incorporarse dentro del genoma de la célula huésped para la expresión mediante recombinación homóloga (véase Zijlstra et al, Nature, 342, págs. 435-428 (1989)).
En la terapia génica ex vivo, se transfiere un gen dentro de las células in vitro usando cultivo tisular y se administran las células al paciente mediante diversos métodos tales como inyección subcutánea, aplicación de las células dentro de un injerto de piel y la inyección intravenosa de células sanguíneas recombinantes tales como células progenitoras o células madre hematopoyéticas.
Las células dentro de las que puede introducirse un ácido nucleico para los fines de la terapia génica incluyen, por ejemplo, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos y células sanguíneas. Las células sanguíneas que pueden usarse incluyen, por ejemplo, linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariocitos, granulocitos, células hematopoyéticas o células progenitoras y similares.
Los polipéptidos y complejos de polipéptidos de la invención también encuentran uso en la preparación de anticuerpos. Por tanto, la presente invención proporciona anticuerpos, que pueden ser monoclonales o policlonales.
Por tanto, los polipéptidos y complejos de la invención pueden usarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen específicamente a un inmunógeno de ese tipo. Los anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanizados o quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id), y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo" tal como se usa en el presente documento se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase de molécula de inmunoglobulina.
En la producción de anticuerpos, el cribado del anticuerpo deseado puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio específico de un polipéptido de la invención (por ejemplo, un dominio de interacción seleccionado), pueden someterse a ensayo hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de polipéptido que contiene tal dominio. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo de polipéptido pero que no se une específicamente (o se une con menos avidez) a un segundo homólogo de polipéptido, puede seleccionarse basándose en una unión positiva al primer homólogo de polipéptido y una falta de unión (o unión reducida) al segundo homólogo de polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales (Acm) dirigidos contra un polipéptido de la invención o un fragmento o un análogo del mismo, puede usarse cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica del trioma, la técnica del hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., 1983, Inmunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los Acm de la invención puede cultivarse in vitro o in vivo. En una realización adicional de la invención, pueden producirse anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando tecnología conocida (PCT/US90/02545,).
Los anticuerpos monoclonales incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos monoclonales quiméricos (por ejemplo, quimeras ser humano-ratón). Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes partes se derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región constante de inmunoglobulina humana y una región variable derivada de un Acm murino (véase, por ejemplo, Cabilly et al., patente de los EE.UU. número 4.816.567; y Boss et al., patente de los EE.UU. número 4.816.397).
Anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie no humana y una región framework de una molécula de inmunoglobulina humana.(véase, por ejemplo, Queen, patente de los EE.UU. número 5.585.089).
Los anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando métodos descritos en la publicación PCT número WO 87/02671; solicitud de patente europea 184.187; solicitud de patente europea 171.496; solicitud de patente europea 173.494; publicación PCT número WO86/01533; patente de los EE.UU. número 4.816.567; solicitud de patente europea 125.023; Better et al., 1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al., 1987, J. Inmunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature 314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4:214; patente de los EE.UU. 5.225.539; Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al., 1988, J. Inmunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos se desean particularmente para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Tales anticuerpos pueden producirse usando ratones transgénicos que no pueden expresar genes endógenos de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas, pero que pueden expresar genes humanos de cadena ligera y pesada. Se inmunizan los ratones transgénicos de la manera normal con un antígeno seleccionado, por ejemplo, toda o una parte de una BPI de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden obtenerse usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes humanos de inmunoglobulina albergados por el ratón transgénico se reposicionan durante la diferenciación de la célula B, y posteriormente experimentan un cambio de clase y mutación somática. Por tanto, usando una técnica de este tipo, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para un resumen sobre esta tecnología para producir anticuerpos humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Inmunol. 13:65-93). Para un tratado detallado sobre esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos, véase, por ejemplo, patente de los EE.UU. 5.625.126; patente de los EE.UU. 5.633.425; patente de los EE.UU. 5.569.825; patente de los EE.UU. 5.661.016; y patente de los EE.UU. 5.545.806. Además, pueden contratarse compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la descrita anteriormente.
Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse usando una técnica denominada como "selección guiada." En este enfoque, se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo. (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899-903).
Los anticuerpos de la presente invención también pueden generarse usando diversos métodos de presentación de fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de fagos, se presentan dominios de anticuerpos funcionales sobre la superficie de partículas de fagos que llevan las secuencias de nucleótidos que codifican para los mismos. Más específicamente, tales fagos pueden utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). Los fagos que expresan un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con antígenos, por ejemplo, usando antígenos marcados o antígenos unidos o capturados sobre una perla o superficie sólida. Los fagos usados en estos métodos son normalmente fagos filamentosos incluyendo dominios de unión M13 y fd expresados del fago con dominios de anticuerpos Fab, Fv o Fv estabilizado con disulfuro condensados recombinantemente a la proteína o bien del gen III o bien del gen VIII del fago. Los métodos de presentación de fagos que pueden usarse para preparar los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman et al., J. Inmunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Inmunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Inmunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Inmunology 57:191-280 (1994); solicitud de PCT número PCT/GB91/01134; publicaciones PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y patentes de los EE.UU. números 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.
Tal como se describe en las referencias anteriores, tras la selección del fago, pueden aislarse las regiones del fago que codifican para el anticuerpo y usarse para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, tal como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, también pueden emplearse técnicas para producir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988).
Ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir anticuerpos y Fv de cadena sencilla incluyen las descritas en las patentes de los EE.UU. 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
La invención proporciona además el uso de anticuerpos biespecíficos, que pueden prepararse mediante métodos conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Milstein et al., 1983, Nature 305:537-539). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de anticuerpos diferentes, de las que sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que normalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante complicada, y los rendimientos del producto son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.
Según un enfoque diferente, se condensan dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La condensación puede realizarse con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de bisagra, CH2, y CH3. Generalmente, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se transfectan conjuntamente dentro de un organismo huésped adecuado. Esto proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en las que las razones desiguales de las tres cadenas de polipéptido usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en razones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las razones no son de significación particular.
En otra realización de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina sólo en la mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de separación. Este enfoque se describe en el documento WO 94/04690 publicado el 3 de marzo de 1994. Para más detalles para generar anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 1986, 121:210.
La invención proporciona fragmentos funcionalmente activos, derivados o análogos de las moléculas de inmunoglobulina anti-polipéptido. Funcionalmente activo significa que el fragmento, derivado o análogo puede obtener anticuerpos anti-anti-idiotipo (es decir, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que se reconoce por el anticuerpo del que se deriva el fragmento, derivado o análogo. Específicamente, en una realización, la antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede potenciarse mediante la deleción de las secuencias framework y CDR que son C-terminales con respecto a la secuencia CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para determinar qué secuencias CDR se unen al antígeno, pueden usarse péptidos sintéticos que contienen las secuencias CDR en ensayos de unión con el antígeno mediante cualquier método de ensayo de unión conocido en la técnica.
La presente invención proporciona fragmentos de anticuerpo tales como, pero sin limitarse a, fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fab. Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Los fragmentos F(ab')2 consisten en la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada y se generan mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan mediante reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. La invención también proporciona dímeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la invención, o cualquier fragmento mínimo de los mismos tal como Fv o anticuerpos de cadena sencilla (SCA) (por ejemplo, tal como se describe en la patente de los EE.UU. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman mediante unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido de cadena sencilla. Pueden usarse las técnicas para el montaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
En otras realizaciones, la invención proporciona proteínas de fusión de las inmunoglobulinas de la invención (o fragmentos funcionalmente activos de las mismas), por ejemplo en las que se condensa la inmunoglobulina por medio de un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), o bien en el extremo N-terminal o bien en el extremo C-terminal a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o parte de la misma, preferiblemente una parte de al menos 10, 20 ó 50 aminoácidos de la proteína) que no es la inmunoglobulina. En una realización, la inmunoglobulina, o un fragmento de la misma, se une covalentemente a otra proteína en el extremo N-terminal del dominio constante. Tal como se mencionó anteriormente, tales proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, aumentar la semivida in vivo, e intensificar la administración de un antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmunitario.
Las inmunoglobulinas de la invención incluyen análogos y derivados que están cualquiera de ellos modificados, es decir, mediante unión covalente de cualquier tipo de molécula siempre que tal unión covalente no perjudique a la unión inmunoespecífica. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluyen aquellos que se han modificado adicionalmente, por ejemplo, mediante glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Puede llevarse a cabo cualquiera de varias modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, escisión química específica, acetilación, formilación, etc. Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los anticuerpos anteriores pueden usarse en métodos conocidos en la técnica referentes a la localización y actividad de los polipéptidos de la invención, por ejemplo, para formar de imágenes o radioimágenes de estas proteínas, medir niveles de las mismas en muestras fisiológicas apropiadas, en métodos de diagnóstico, etc. y para radioterapia.
Los anticuerpos de la invención pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica para la síntesis de anticuerpos, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante expresión recombinante, y se producen preferiblemente mediante una técnica de expresión recombinante.
La expresión recombinante de anticuerpos, o fragmentos, derivados o análogos de los mismos, requiere la construcción de un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo. Si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, puede ensamblarse un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, según se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques 17:242), que, en resumen, supone la síntesis de oligonucleótidos solapantes que contienen partes de la secuencia que codifica para el anticuerpo, hibridación y ligamiento de esos oligonucleótidos, y luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo puede obtenerse mediante la clonación del anticuerpo. Si no se dispone de un clon que contiene el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede obtenerse un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo a partir de una fuente adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpo, o una biblioteca de ADNc generada a partir de cualquier tejido o célula que exprese el anticuerpo) mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridarse con los extremos 3' y 5' de la secuencia o mediante clonación usando una sonda de oligonucleótido específica para la secuencia del gen particular.
Si no se dispone de una molécula de anticuerpo que reconoce específicamente un antígeno particular (o una fuente para una biblioteca de ADNc para clonar un ácido nucleico que codifica para tal anticuerpo), pueden generarse anticuerpos específicos para un antígeno particular mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, inmunizando un animal, tal como un conejo, para generar anticuerpos policlonales o, generando anticuerpos monoclonales. Alternativamente, puede obtenerse un clon que codifica para al menos la parte Fab del anticuerpo cribando bibliotecas de expresión de Fab (por ejemplo, según se describe en Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281) para clones de fragmentos Fab que se unen al antígeno específico o cribando bibliotecas de anticuerpos (véanse, por ejemplo, Clackson et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).
Una vez que se obtiene un ácido nucleico que codifica para al menos el dominio variable de la molécula de anticuerpo, puede introducirse en un vector que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO 86/05807; la publicación PCT WO 89/01036; y la patente de los EE.UU. No. 5.122.464). También se dispone de vectores que contienen la cadena pesada o ligera completa para la coexpresión con el ácido nucleico para permitir la expresión de una molécula de anticuerpo completa. Entonces, puede usarse el ácido nucleico que codifica para el anticuerpo para introducir la(s) sustitución(ones) o deleción(ones) de nucleótidos necesarias para sustituir (o eliminar) el o más residuos de cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro intracatenario por un residuo de aminoácido que no contiene un grupo sulfhidrilo. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica para la introducción de mutaciones o deleciones específicas en una secuencia de nucleótidos, por ejemplo, pero sin limitarse a, mutagénesis química, mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), métodos basados en PCT, etc.
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) mediante el corte y empalme de genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada. Tal como se describió anteriormente, un anticuerpo quimérico es una molécula en la que se derivan diferentes partes de diferentes especies animales, tales como los que tienen una región variable derivada de un Acm murino y una región constante de anticuerpo humano, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que codifica para una molécula de anticuerpo de la invención, puede producirse el vector para la producción de la molécula de anticuerpo mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por tanto, en el presente documento se describen métodos para preparar la proteína de la invención expresando el ácido nucleico que contiene las secuencias de la molécula de anticuerpo. Pueden usarse métodos que se conocen bien por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen una molécula de anticuerpo que codifica para secuencias y señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo. Véase, por ejemplo, las técnicas descritas en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
El vector de expresión se transfiere a una célula huésped mediante técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales para producir un anticuerpo de la invención.
Las células huésped usadas para expresar un anticuerpo recombinante de la invención pueden ser o bien células bacterianas tales como Escherichia coli, o bien células eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de anticuerpo recombinante completa. Más específicamente, las células de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), en conjunción con un vector tal como el elemento promotor del gen de expresión precoz principal de citomegalovirus humano es un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8:2).
Puede utilizarse una variedad de sistemas de vector de expresión-huésped para expresar una molécula de anticuerpo de la invención. Tales sistemas de expresión-huésped representan vehículos mediante los cuales pueden producirse secuencias codificantes de interés y purificarse posteriormente, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar la molécula de anticuerpo de la invención in situ. Éstas incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o de ADN de cósmido que contienen las secuencias que codifican para el anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes que contienen secuencias que codifican para el anticuerpo; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las secuencias que codifican para el anticuerpo; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, VMC; virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que contienen secuencias que codifican para el anticuerpo; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de las células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5 K del virus vaccinia).
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso pretendido para la molécula de anticuerpo que se está expresando. Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de tal proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan, al vector de expresión de E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en los que la secuencia que codifica para el anticuerpo puede ligarse individualmente en el vector en el marco con la región codificante de lacZ de modo que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Pueden usarse también vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de células lisadas mediante adsorción y unión a perlas de una matriz de glutatión-agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de proteasa de factor Xa o trombina de modo que el producto génico objetivo clonado puede liberarse del resto de GST.
En un sistema de insectos, se usa el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (VPNAc) como vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica para el anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y situarse bajo el control de un promotor de VPNAc (por ejemplo, el promotor de polihedrina). En células huésped de mamíferos, pueden utilizarse varios sistemas de expresión basados en virus (por ejemplo, un sistema de expresión de adenovirus).
Tal como se trató anteriormente, puede elegirse una cepa de células huésped que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en la forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína.
Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo de anticuerpos recombinantes, es útil la expresión estable. Por ejemplo, pueden producirse líneas celulares que expresan de manera estable un anticuerpo de interés transfectando las células con un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del anticuerpo y la secuencia de nucleótidos de un marcador seleccionable (por ejemplo, neomicina o higromicina), y seleccionando la expresión del marcador seleccionable. Tales líneas celulares modificadas mediante ingeniería pueden ser útiles en el cribado y evaluación de compuestos que interaccionan directa o indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Los niveles de expresión de la molécula de anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación de vectores (para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression de cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nueva York, 1987)). Cuando puede amplificarse un marcador en el sistema de vector que expresa el anticuerpo, el aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada está asociada con el gen del anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Célula. Biol. 3:257).
La célula huésped puede contransfectarse con dos vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector para un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el segundo vector para un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la misma expresión de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede utilizarse un único vector que codifica tanto para los polipéptidos de la cadena pesada como de la ligera. En tales situaciones, debe colocarse la cadena ligera antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que se ha expresado de manera recombinante la molécula de anticuerpo de la invención, puede purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad tal como con proteína A o un antígeno específico, y cromatografía en columna de distribución por tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante cualquier otra técnica habitual para la purificación de proteínas.
Alternativamente, puede purificarse fácilmente cualquier proteína de fusión utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión que se está expresando. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al. permite la rápida purificación de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas celulares humanas (Janknecht et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de vaccinia de tal manera que el marco de lectura abierto del gen se fusiona de manera traduccional a la cola amino-terminal que consiste en seis residuos de histidina. La cola sirve como un dominio de unión a la matriz para la proteína de fusión. Se cargan extractos de células infectadas con virus vaccinia recombinante en columnas de Ni2+-ácido nitriloacético-agarosa y se eluyen selectivamente proteínas con colas de histidina con tampones que contienen imidazol.
En otra realización, los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos, se conjugan con un resto de diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse para diagnóstico o para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Puede facilitarse la detección acoplando el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radiactivos, metales que emiten positrones (para su uso en tomografía por emisión de positrones), e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase, generalmente la patente de los EE.UU. número 4.741.900 para iones metálicos que pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como agentes de diagnóstico según la presente invención. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina, y acuorina; y los núclidos radiactivos adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{111}In y ^{99}Tc.
Los anticuerpos de la invención o fragmentos de los mismos pueden conjugarse a un agente terapéutico o resto farmacológico para modificar una respuesta biológica dada. El agente terapéutico o resto farmacológico no ha de interpretarse como limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que tiene una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o la toxina diftérica; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral, \alpha-interferón, \beta-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo angiostatina o endostatina; o, un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento.
Se conocen bien las técnicas para conjugar tal resto terapéutico con anticuerpos, véase, por ejemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use De Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwinet al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Alternativamente, puede conjugarse un anticuerpo a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpo según se describe por Segal en la patente de los EE.UU. número 4.676.980.
Puede usarse un anticuerpo con o sin un resto terapéutico conjugado a él como un agente terapéutico que podría administrarse solo o en combinación con factor(es) citotóxico(s) y/o citocina(s).
La presente invención no sólo se refiere a los péptidos, su uso y vehículos farmacéuticamente aceptables que los comprenden, sino también a métodos de uso de los péptidos y los motivos según se describe en ella.
Más específicamente, la presente invención presenta una utilización para varios métodos en los que los péptidos descritos en ella se usan para los siguientes fines:
(1) Un método de identificación de un polipéptido o proteína que interacciona con PP1, que comprende: detectar en la secuencia de dicho polipéptido o proteína, la presencia de dos motivos M1 y M2 de unión a PP1.
(2) Un método de cribado de compuestos que interaccionan con reguladores de PP1, que comprende:
(a)
inmovilizar péptidos descritos en el presente documento sobre un soporte; y (b) someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos péptidos inmovilizados.
(3) Un método de cribado de compuestos que interaccionan con PP1, que comprende:
(a)
obtener anticuerpos frente a péptidos dentro de la descripción de la presente invención; y
(b)
someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos anticuerpos.
(4) Un método para someter a prueba moléculas que inhiben o intensifican la actividad de PP1 o cambian su ubicación mediante interacción, comprendiendo dicho método:
(a)
inmovilizar los péptidos descritos en ella sobre un soporte; y
(b)
someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos péptidos inmovilizados.
También están englobados por la presente invención fármacos que tras usar los métodos de la presente invención se encuentra que inhiben y/o intensifican la actividad de PP1, la actividad de PP1c o la ubicación por interacción.
Además de métodos, la presente invención se refiere a kits. Los kits comprenden, pero no se limitan a, péptidos o conjuntos de péptidos que imitan a ambos motivos M1 y M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c, en las que el motivo M1 tiene la secuencia FXX[RK]X[RK], y el motivo M2 tiene la secuencia [RK]VX[FW] o [RK]XVX[FW], en las que X es cualquier aminoácido. Tales kits comprenden los péptidos NWGRIVAFFSF y GDEFELRYRRAF. Estos péptidos pueden inmovilizarse sobre cualquier soporte sólido, descrito anteriormente, y que incluye resinas, pocillos Microstar, pastillas de vidrio y similares.
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a un kit que contiene anticuerpos frente a péptidos que imitan ambos motivos M1 y M2 y que pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o Bcl2/Bad/PP1c. Estos anticuerpos pueden haberse producido frente a los péptidos NWGRIVAFFSF y GDEFELRYRRAF, los análogos de estos péptidos o sus equivalentes funcionales.
Además de los péptidos o los anticuerpos, los kits de la presente invención también incluyen reactivos para interpretar la interacción. Tales reactivos se conocen en la técnica y se describieron anteriormente y en Sambrook (véase anteriormente).
Aún en otra realización, la presente invención se refiere a un método de cribado de células para hallar interacciones con PP1 en las células, comprendiendo dicho método que comprende o bien usar anticuerpos frente a los motivos M1 y M2 o bien péptidos que incluyen estos motivos o sus equivalentes funcionales.
Por tanto, la presente invención se refiere también a un nuevo tratamiento con un fármaco derivado de fosfatasa basado en la administración intracelular de péptidos con una secuencia o secuencias que rodean los sitios de unión a PP1/PP2 (motivos M1 y M2) identificados en algunas proteínas de interacción. Este enfoque de tratamiento farmacológico, derivado de la genética química (Gura, 2000), inhibiría la interacción de algunas proteínas diana médicamente importantes con PP1/PP2A.
Esta estrategia terapéutica, denominada "bloqueo de la expresión peptídica" ("peptidic knockout") de las rutas de PP1/PP2 tiene su base en dos resultados recientes. El primer resultado fue la identificación de una supuesta secuencia distintiva de PP1. Por tanto, a partir de la caracterización de dos motivos de unión a PP1 diferentes en proteínas Bcl-2 y su existencia en la mayoría de las proteínas de unión a PP1, puede concluirse que la presencia combinatoria de los motivos puede usarse como una secuencia distintiva ("signature") predictiva para la unión a PP1. Por tanto, el sitio web denominado "PP1 signature" ("secuencia distintiva de PP1") (en preparación en el Instituto Pasteur) que contiene todas las supuestas secuencias de PP1 derivadas de una biblioteca Swisprot puede usarse para identificar supuestas dianas de unión a PP1 de interés.
El segundo resultado fue la identificación de sitios de unión a PP2A en cinco proteínas. Se mapearon recientemente los sitios de unión a PP2A de una Vpr codificada por un virus (VIH-1) y una Ck2a parasitaria codificada por Theileria. A partir de los datos obtenidos, puede afirmarse que la administración intracelular de algunos péptidos que imitan a estas secuencias de unión a PP2A conduce a apoptosis en células de tumores (Hela, Jurkat, S) o infectadas (Vpr o VIH-1 o Theileria).
Ejemplos
Los siguientes ejemplos pueden llevarse a cabo utilizando los materiales y métodos descritos a continuación:
1. Materiales y métodos 1. 1. Células y cultivo
Ts1\alpha\beta es una línea de células T murinas que expresan las cadenas \alpha y \beta del receptor de la IL-2 (Pitton et al, 1993) que puede propagarse independientemente en IL-2, IL-4 o IL-9. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con 5% de suero bovino fetal inactivado por calor, glutamina 2 mM, Hepes 10 mM, arginina 0,55 mM, asparagina 0,24 mM, 2-ME 50 \muM y 60 U/ml de IL-4.
1.2. Linfocinas, anticuerpos, reactivos y plásmidos
Se utilizó rIL-4 murina o sobrenadante de una sublínea de HeLa transfectada con pKCRIL-4.neo como una fuente de IL-4 murina. Los anticuerpos anti-Bcl-x_{L} y anti-Bcl-w procedían de Calbiochem (La Jolla, CA), Transduction Laboratories (Lexington, KY) o StressGen Biotechnology (Victoria, Canadá). Anti-PP1c específico procedía de UBI (Lake Placid, NY), Calbiochem o Transduction Laboratories. El anticuerpo anti-histonas procedía de Chemicon International (Temecula, CA). El anticuerpo anti-proteína 14-3-3 procedía de UBI (Lake Placid, NY). Las serinas 112 y 136 de anti-Bad procedían de New England BioLabs (Beverly, MA) y la serina 155 procedía de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). El anticuerpo anti-Raf procedía de Transduction Laboratories. Los anticuerpos anti-Pser y pan-Ras procedían de Calbiochem. La proteína PP1c recombinante procedía de Calbiochem. Mito 2813 (anti-piruvato deshidrogenasa mitocondrial) se proporcionó por el Dr. Serrano, Centro Nacional de Biotecnología (Madrid).
1.3. Inmunoprecipitación e inmunotransferencia tipo western blot
Se estimularon las células (1 x 10^{7}) con, o se sometieron a carencia de, IL-4 y se lisaron durante 20 min. a 4ºC en tampón de lisis (Tris HCl 50 mM pH 8, NP-40 al 1%, NaCl 137 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM, glicerol al 10% y cóctel de inhibidores de proteasa). También se utilizaron tampones libres de detergentes o digitonina para la inmunoprecipitación. Para el análisis de fosforilación, también se complementó el tampón con cóctel de inhibidores de fosfatasa. Los lisados se inmunoprecipitaron con el anticuerpo apropiado y se añadió la Proteína A-Sepharose. Alternativamente, se lisaron las células en el tampón de muestra de Laemmli y se separaron los extractos de proteínas mediante SDS-PAGE, se transfirieron a nitrocelulosa, se bloquearon y se incubaron con anticuerpo primario. Se lavó la membrana y se incubó con anticuerpo secundario conjugado con PO. Las proteínas se desarrollaron utilizando la ECL.
1.4. Ensayo de fosfatasa in vitro
Se lisaron las células estimuladas con IL-4 (1 x 10^{7}) en tampón de lisis, se inmunoprecipitaron los sobrenadantes con el anticuerpo correspondiente, seguido por incubación con Proteína A - Sepharose. Se lavaron los inmunoprecipitados con tampón fosfatasa (Tris HCl 50 mM, pH 7,5, 2-ME al 0,1%, EDTA 0,1 mM y BSA 1 mg/ml) y se mezclaron con [^{32}P]-fosforilasa a, diluida en tampón fosfatasa complementado con cafeína. Se incubó la reacción (40 min. a 30ºC), se paró con 200 \mul de TCA al 20% y se centrifugó. Se utilizó un total de 185 \mul del sobrenadante para calcular la generación de fosfato libre liberado de la [^{32}P]-fosforilasa a.
1.5. Síntesis de péptidos
Se prepararon péptidos que comprendían el motivo R/K X V/I X F (R) (SEQ ID No. 1) o F X X R X R (F) (SEQ ID No. 2) de Bcl-w y Bcl-x_{L}, así como los péptidos mutados (véase la figura 8A para comprobar la secuencia) mediante síntesis automatizada de spot (mancha) en una membrana de celulosa aminoderivatizada. Se bloqueó la membrana, se incubó con PP1c purificada y, tras varias etapas de lavado, se incubó con anticuerpo anti-PP1c, seguido por anticuerpo secundario conjugado con PO. Se desarrollaron las manchas utilizando el sistema de ECL.
Se sintetizaron los péptidos R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID No. 3), F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID No. 4) o R* (NWGRIAAAFSF) (SEQ ID No. 5) en un sintetizador automatizado de múltiples péptidos utilizando el procedimiento en fase sólida y la química habitual de Fmoc. Se confirmaron la pureza y la composición de los péptidos mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa y mediante el análisis de los aminoácidos.
1.6. Competencia de la interacción proteína-proteína
Se sometió a competencia La interacción Bcl-w/PP1c y Bcl-x_{L}/PP1c por los péptidos R, F, o R*. Se inmunoprecipitaron los lisados de las células estimuladas con IL-4 con el anticuerpo anti-Bad y se añadió proteína A - Sepharose. Se sometió a competencia la interacción Bcl-w/PP1c y Bcl-x_{L}/PP1c mediante la incubación con los péptidos R, F o R* (30 min., temperatura ambiente). Tras el lavado, los inmunoprecipitados o bien se sometieron a ensayo para determinar la actividad fosfatasa de la proteína o bien se transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia con el anticuerpo correspondiente.
1.7. Oligonucleótidos sentido y antisentido
Los análogos del fosfotioato de los oligonucleótidos de Bcl-x_{L} y Bcl-w, incluyendo el codón de iniciación ATG, se adquirieron de Isogen Bioscience. Las secuencias de los oligonucleótidos sentido y antisentido son las siguientes. Bcl-x_{L} sentido, ATG TCT CAG AGC AAC (SEQ ID No. 6); Bcl-x_{L} antisentido, GTT GCT CTG AGA CAT (SEQ ID No. 7); Bcl-w sentido, ATG GCG ACC CCA GCC (SEQ ID No. 8); Bcl-w antisentido, GGC TGG GGT CGC CAT (SEQ ID No. 9).
\newpage
2. Resultados experimentales 2.1. Identificación de Bcl-w y Bcl-x_{L} como proteínas que interaccionan con PP1c
Se demostró anteriormente que la molécula antiapoptótica Bcl-2 es una subunidad de selección como diana de la serina/treonina fosfatasa PP1c en células TS1\alpha\beta estimuladas con IL-2 y que la secuencia de Bcl-2 que interacciona con PP1c es el motivo R/K X V/I X F (SEQ ID No. 10) (Ayllón et al, 2001). Dado que Bcl-x_{L} y Bcl-w también contienen el motivo R/K X V/I X F bien conservado en Bcl-2, se investigó la posibilidad de que las moléculas antiapoptóticas Bcl-x_{L} y Bcl-w también puedan asociarse a PP1c en las células TS1\alpha\beta estimuladas con IL-4, que no expresan Bcl-2 y que expresan Bcl-x_{L} y Bcl-w. Se realizaron experimentos de coinmunoprecipitación recíprocos de proteínas citoplasmáticas en condiciones de estimulación o carencia de IL-4 utilizando anticuerpos específicos. Se detectaron PP1c y Bad mediante inmunotransferencia tipo Western blot en inmunoprecipitados de anti-Bcl-x_{L} de células estimuladas con IL-4, disminuyendo a lo largo de todo el periodo de carencia (figura 1A). La detección con sonda de la membrana con anticuerpos anti-Bcl-x_{L} demostró niveles similares en todas las condiciones analizadas. También se detectaron PP1c y Bad en inmunoprecipitados de anti-Bcl-w de células estimuladas con IL-4, que disminuían tras someter a carencia de linfocina (figura 1A). La membrana también se sometió a detección con sonda con el anticuerpo anti-Bcl-w, mostrando niveles similares. La inmunoprecipitación para los lisados citoplásmicos con un anticuerpo irrelevante, anti-cadena p55 de IL-2R, no pudo detectar esas asociaciones (figura 1 B). De manera similar, se detectaron Bcl-x_{L}, Bcl-w y PP1c en inmunoprecipitados de Bad y también se observó la interacción entre estas proteínas mediante inmunoprecipitación de lisados libres de detergentes, así como en proteínas citoplasmáticas aisladas mediante lisis con digitonina (datos no mostrados). Estas asociaciones también se observaron en timocitos recién aislados (figura 1C). Dado que el número de complejos Bcl-x_{L}/PP1c/Bad y Bcl-w/PP1c/Bad disminuye tras someter a carencia de IL-4, se analizó la regulación por disminución de la expresión de cualquiera de las proteínas implicadas en la formación del complejo. Por tanto, se analizó la expresión total de Bcl-x_{L}, Bcl-w, PP1c y Bad en células TS1\alpha\beta estimuladas con, o sometidas a carencia de, IL-4. Todas las proteínas analizadas se expresaron en las células estimuladas con, o sometidas a carencia de, IL-4 (figura 2). Como un control interno de la carga de proteínas, se detectaron con sonda las membranas con un anticuerpo anti-histonas. Dado que el número de agregados disminuye tras someter a carencia de IL-4 sin modificación de la expresión total de las proteínas del complejo, se analizó entonces si las modificaciones tras la traducción de Bcl-x_{L} o Bcl-w pueden afectar a la formación del complejo trimolecular. A continuación se analizó el estado de fosforilación de la serina de Bcl-x_{L} y Bcl-w. Los extractos citoplasmáticos de células estimuladas o sometidas a carencia de IL-4, se inmunoprecipitaron con anti-Bcl-x_{L} o anti-Bcl-w y se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos específicos anti-Pser, anti-PP1c, anti-Bad, anti-Bcl-w y anti- Bcl-x_{L} (figura 3). Se observó la fosforilación de serina de Bcl-x_{L} y Bcl-w en las células estimuladas con IL-4 control, que disminuía tras someter a carencia de IL-4. De acuerdo con los resultados de la figura 1, el nivel de Bad y PP1c asociados a Bcl-x_{L} y Bcl-w disminuye al someter a carencia de linfocina. Este resultado sugiere una correlación entre la fosforilación de serina de Bcl-x_{L} y Bcl-w y la formación de complejos trimoleculares.
Recientemente se demostró que IL-2, así como IL-3, induce la fosforilación de serina de Bad (Ayllón et al, 2000). La figura 4A muestra que IL-4 induce la fosforilación de Bad en la serina 136 pero no en las serinas 112 y 155. Además, la carencia de IL-4 induce la desfosforilación de la serina 136 de Bad. Se utilizaron las células estimuladas con IL-2 (C, fosforilación de ser 112 y 136) o las células COS (C, fosforilación de ser 155) que sobreexpresan Bad como controles positivos. La fosforilación de la serina de Bad inducida por IL-3 da como resultado su asociación a la proteína 14-3-3, suprimiendo la interacción con Bcl-x (Zhou et al, 2000). La figura 4B muestra que la fosforilación de serina de Bad en respuesta a IL-4 no da como resultado la unión a la proteína 14-3-3. Esta proteína se detectó en los extractos totales a partir de las células estimuladas con IL-4 control (carril T) y no se observó ni en PP1c, ni en los inmunoprecipitados de Bcl-x_{L} o Bad de las células estimuladas con, o sometidas a carencia de, IL-4. Como control interno se muestra la interacción de Raf y la proteína 14-3-3 en los inmunoprecipitados de Raf (figura 4B).
La figura 5A muestra la actividad fosfatasa en los inmunoprecipitados de Bcl-x_{L}, Bcl-w y Bad de células estimuladas con IL-4. Se midió la actividad enzimática en los inmunoprecipitados utilizando fosforilasa marcada con ^{32}P como sustrato. Es interesante observar que la actividad fosfatasa detectada en los inmunoprecipitados de Bcl-x_{L} y Bcl-w corresponde casi a la actividad fosfatasa observada en los inmunoprecipitados de Bad. Para confirmar que esta actividad fosfatasa se debía a PP1c, se estimó la actividad enzimática en los inmunoprecipitados de Bad o Bcl-w de las células estimuladas con IL-4 en presencia de diferentes concentraciones de ácido ocadaico (AO) (figura 5B). Las concentraciones de AO que inhiben la actividad tipo 2A (10^{-9} M) no tenían efecto sobre la actividad fosfatasa asociada a Bad o Bcl-w in vitro. La adición de AO 10^{-8} M a los inmunoprecipitados de Bcl-w o Bad da como resultado la inhibición de \sim50% de la actividad fosfatasa, que se reduce fuertemente tras la adición de AO 10^{-6} M (figura 5B). También se estimó el efecto del AO sobre la actividad fosfatasa sobre sobrenadantes de los inmunoprecipitados de Bad y Bcl-w. Las concentraciones del AO que no tenían efecto sobre la actividad enzimática en los inmunoprecipitados de Bad y Bcl-w (10^{-9} M) muestran una inhibición de \sim50% en el sobrenadante, tal como se esperaba a partir de una asociación de las actividades de tipo 1 y tipo 2A (figura 5B). El efecto selectivo del AO sugiere que la actividad fosfatasa observada en los inmunoprecipitados de Bad y Bcl-w es PP1c.
2.2. Bcl-w y Bcl-xL son nuevas subunidades de selección como diana de PP1c
Recientemente se demostró que Bcl-2 es una subunidad de selección como diana de PP1c (Ayllón et al, 2001). Dado que Bcl-w y Bcl-x_{L} también se asocian a PP1c y que la secuencia del sitio de unión de Bcl-2 a PP1c está conservada en Bcl-x_{L} y Bcl-w, se lanzó la hipótesis de que estas moléculas antiapoptóticas pueden ser nuevas subunidades de selección como diana de PP1c. Para probar esta hipótesis, se redujo Bcl-x_{L} y Bcl-w mediante la inmunoprecipitación secuencial de anti-Bcl-x_{L}+Bcl-w de los extractos citoplasmáticos de las células estimuladas con IL-4. Se inmunoprecipitó el sobrenadante de la cuarta inmunoprecipitación de anti- Bcl-x_{L}+Bcl-w con el anticuerpo anti-Bad (5º) y se estimó la actividad fosfatasa (figura 6A). Se detectaron trazas de la actividad fosfatasa asociada a Bad en los extractos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w, en comparación con el alto nivel de actividad observado en los inmunoprecipitados de anti-Bad control de las células estimuladas con IL-4. Dado que en ausencia de Bcl-x_{L} y Bcl-w no se detectó una actividad fosfatasa asociada a Bad significativa, se investigó la posibilidad de que estas moléculas antiapoptóticas puedan controlar el direccionamiento de PP1c a Bad. Para este fin, se obtuvieron inmunoprecipitaciones de anti-Bad en extractos citoplasmáticos de células estimuladas con IL-4 o en extractos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w (5º). Se detectaron PP1c, Bcl-x_{L} y Bcl-w en los inmunoprecipitados de anti-Bad control y no se observaron en los inmunoprecipitados de anti-Bad procedentes de los extractos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w (figura 6B). En un experimento recíproco, se detectaron Bad, Bcl-x_{L} y Bcl-w en inmunoprecipitados de anti-PP1c de células control y no se observaron en inmunoprecipitados de PP1c procedentes de extractos con reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w (figura 6B). Este resultado sugiere que Bcl-x_{L} y Bcl-w son necesarios para la asociación de PP1c a Bad.
2.3. Determinación del sitio de unión de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c
Se ha descrito que el motivo R/K X V/I X F lo comparten la mayor parte de las subunidades que tienen subunidades de selección como diana de PP1c (21, 23). Se demostró que la subunidad Bcl-2 de selección como diana de PP1c también comparte este motivo conservado (Ayllón et al, 2001). Resulta interesante que las secuencias de Bcl-x_{L} y Bcl-w también contienen este motivo (figura 7B). Para analizar si esta secuencia de Bcl-xL y Bcl-w estaba implicada en la unión a PP1c, se generaron péptidos inmovilizados a nitrocelulosa de las proteínas Bcl-x_{L} y Bcl-w que contenían este motivo. Se incubó la membrana con la proteína PP1c purificada. La figura 7B muestra las secuencias que interaccionan con PP1c. El motivo R/K X V/I X F (SEQ ID No. 10), presente en Bcl-x_{L} y Bcl-w, interacciona con PP1c y su mutación en los residuos V y F críticos reduce fuertemente la unión de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c (figura 7B). El análisis de los sitios de unión de Bcl-2 a PP1c mostró, además del motivo R/K X V/I X F (SEQ ID No. 10), dos secuencias (FSRRYR (SEQ ID No. 11) y FTARGR (SEQ ID No. 12), que se unen a PP1c (Ayllón et al, 2001). Resulta interesante que también se observaran secuencias similares en Bcl-x_{L} y Bcl-w (figura 7A). Las secuencias FELRYR (SEQ ID No. 13) y FETRFR (SEQ ID No. 14) de Bcl-x_{L} y Bcl-w, respectivamente, también interaccionan con PP1c y su mutación inhibe la unión a PP1c, aunque la afinidad depende del tipo de mutación puntual (figura 7B). Se determinó el motivo consenso de interacción F X X R X R (SEQ ID No. 15) mediante la comparación de las secuencias de Bcl-2, Bcl-x_{L} y Bcl-w.
Para confirmar de manera concluyente que los motivos R/K X V/I X F y F X X R X R participan en la unión de Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c, se llevaron a cabo experimentos de competencia en complejos trimoleculares. Se inmunoprecipitaron lisados de células estimuladas con IL-4 con anticuerpos anti-Bad y se hizo competir la interacción Bcl-x_{L}/PP1c y Bcl-w/PP1c usando los péptidos R*(NWGRIAAAFSF) (SEQ ID No. 16), R (NWGRIVAFFSF) (SEQ ID No. 17) o F (GDEFELRYRRAF) (SEQ ID No. 18) (figura 8A). Se detectaron Bcl-xL, Bcl-w y PP1c en los inmunoprecipitados de anti-Bad control, así como en los inmunoprecipitados de anti-Bad tratados con el péptido R*. La cantidad de Bcl-x_{L}, Bcl-w y PP1c asociados a Bad disminuye tras la competencia con el péptido F o R, siendo casi indetectable con la competencia de los inmunoprecipitados de Bad con los péptidos F+R (figura 8A). Se observa un nivel similar de Bad en los inmunoprecipitados de anti-Bad control o tratados con péptido. Finalmente, para confirmar que Bcl-x_{L} y Bcl-w son subunidades de selección como diana de PP1c, se estimó la actividad fosfatasa en los inmunoprecipitados de Bad control o tratados con péptido. Se detectó la actividad fosfatasa en los inmunoprecipitados control o en los tratados con péptido R* (figura 8B), disminuyendo con la competencia de la interacción con los péptidos F o R. La actividad enzimática disminuyó fuertemente con la competencia con los péptidos R y F. Como control interno, la figura 8C muestra la actividad fosfatasa en los inmunoprecipitados de Bad control o tratados con péptido. La concentración del péptido F o R usada fue el doble de la concentración utilizada en los inmunoprecipitados tratados con el péptido F+R. Al igual que en la figura 8B, la actividad fosfatasa se redujo drásticamente con el tratamiento de los inmunoprecipitados de Bad con los péptidos F+R. Tomados juntos, estos resultados ilustran que Bcl-x_{L} y Bcl-w, así como Bcl-2, son subunidades de selección como diana de PP1c.
2.4. La inhibición de la actividad enzimática de PP1 bloquea de la apoptosis
Dado que la carencia de IL-4 se correlaciona con la desfosforilación de Bad y con la apoptosis, se lanzó la hipótesis de que la inhibición de la actividad fosfatasa mediante el tratamiento con ácido ocadaico (AO) puede evitar la desfosforilación de Bad y la apoptosis. El tratamiento de las células con AO 1 \muM en ausencia de IL-4 evitó la desfosforilación de Bad en la serina 136 (figura 9A). No se observó ningún cambio en la expresión total de Bad tras el tratamiento con AO, lo que sugiere que el AO no afecta a la expresión de la proteína. Además, las células con carencia de IL-4 tratadas con AO 1 \muM durante 6 h mostraron una reducción significativa en la fracción de células apoptóticas en comparación con las células no tratadas (figura 9B). Finalmente, la inhibición de la expresión de Bcl-x_{L} y Bcl-w mediante el tratamiento con oligonucleótidos antisentido de las células también induce la apoptosis en las células estimuladas con IL-4 (figura 9C). Se estimó la inhibición de la expresión de Bcl-x_{L} y Bcl-w mediante el tratamiento con oligonucleótidos antisentido mediante inmunotransferencia de tipo Western blot.
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3. Resultados bioinformáticos - Secuencia distintiva predictiva para las interacciones de PP1: presencia combinatoria de los motivos [RK]VxF o [RK]xVxF y F-x-x-[RK]-x-[RK] en las proteínas de unión a PP1 caracterizadas
La presencia combinatoria de estos dos motivos de unión de PP1 sugiere un mecanismo general en el que la unión secuencial a PP1c a través de uno de estos motivos puede favorecer la unión a través del segundo motivo y permitir la función catalítica. Además, estos motivos también podrían representar una secuencia distintiva predictiva para identificar las posibles nuevas proteínas de unión a PP1. Para probar parcialmente este concepto, se llevó a cabo un análisis bioinformático utilizando el programa "prosa" (Katja Shuerer, IP) en la biblioteca Swissprot Release 40 (octubre de 2001) que contiene 101602 secuencias de proteínas no redundantes.
Tal como se muestra en la tabla 1A, la búsqueda para determinar la presencia de un solo consenso indica que el 19,47% de las secuencias en la biblioteca contiene los motivos [RK]VxF o [RK]xVxF y que el 16% contiene el motivo de tipo Bcl-2, F-x-x-[RK]-x-[RK]. Por el contrario, de manera consecuente con la noción de la secuencia distintiva predictiva, el análisis de la presencia combinatoria de ambos motivos de unión de PP1, [RK]VxF o [RK]xVxF y F-x-x-[RK]-x-[RK], sólo reveló 4013 secuencias positivas, correspondientes al 3,94% de la biblioteca (tabla 1B). Además, si se aplica la equivalencia F = W (normalmente aceptada para los motivos [RK]Vx[FW]/[RK]xVx[FW]), se encontraron 4783 secuencias positivas correspondientes al 4,7 de la biblioteca. Además, la equivalencia ocasional entre R/K y Q aumenta ligeramente el número de proteínas positivas (5769 secuencias correspondientes al 5,67%).
Además, tal como se esperaba, estas secuencias incluyen todas las proteínas conocidas que interaccionan con PP1 de la familia Bcl-2 (no mostrada). En conjunto, este análisis indica que aproximadamente el 5% de las secuencias de las proteínas comparten los dos supuestos motivos de unión a PP1 en su secuencia. Resulta interesante que el análisis estadístico sugiere que la distancia que separa los dos motivos de unión a PP1 comprende entre 0 y 180 aa para el 50% de las proteínas (figura 11). Además, un análisis más detallado revela un pico principal que representa el 22,3% de las secuencias positivas (897 secuencias para un total de 4013) que corresponden a un intervalo de 0-50 aa entre los dos motivos. Estos datos concuerdan con la observación de que una distancia de 36 aa separa los dos motivos de unión en los dominios BH1 y BH3 de las proteínas Bcl-2/Bcl-w y Bcl-x_{L} (no mostrados).
Partiendo de la base de este análisis, el Instituto Pasteur está creando y mantendrá en orden un nuevo sitio web "PP1 signature" que contiene todas las secuencias seleccionadas de la biblioteca de Swissprot Release 40 correspondientes a proteínas que albergan los dos motivos de unión a PP1. Mediante la simple introducción del nombre de una proteína o un número de registro o a través de un análisis con BLAST, se conocerá inmediatamente si la proteína tiene una supuesta secuencia distintiva de PP1. Además, el usuario identificará inmediatamente la secuencia que engloba los dos supuestos motivos de unión a PP1.
Las proteínas de unión a PP1 más caracterizadas comparten los dos motivos y pueden identificarse en el sitio web (tabla 2). Para validad esta propuesta de "estrategia de secuencia distintiva predictiva", se seleccionaron aleatoriamente cuatro candidatos y se confirmó su asociación con PP1 mediante simples experimentos de coinmunoprecipitación (figura 10B).
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TABLA 1A
1
TABLA 1B
3 
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TABLA 2A Dos supuestas secuencias de unión a PP1 en proteínas que interaccionan con PP1 caracterizadas
4
5 
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Ejemplo 4 Precursor \beta-amiloide como nueva proteína que interacciona con PP1
Los depósitos de amiloide fibrilar definen lesiones patológicas en enfermedades cerebrales de tipo Alzheimer y se cree que median en la muerte neuronal. El amiloide está compuesto por un fragmento de proteína de 39 a 42 aminoácidos de la proteína precursora amiloide (APP). Dado que se ha mostrado que la deposición de amiloide fibrilar in vitro depende de la concentración de APP, reducir o inhibir la liberación de APP es un objetivo terapéutico.
El precursor \beta-amiloide (APP) se sobreexpresa en células PC12 tratadas mediante NGF, mediante transfección de un ADNc que codifica para el precursor \beta-amiloide (APP) según los métodos de Sambrook et al., mencionado anteriormente.
Entonces se incuban las células que expresan el precursor \beta-amiloide con un péptido de penetración correspondiente al sitio de unión a PP1 punitivo tal como el motivo M1 que tiene la secuencia FXX[RK]X[RK] y el motivo M2 [RK]VX[FW] o [RKXVX[FW], en los que X es cualquier aminoácido.
Se somete a prueba la presencia de amiloide usando anticuerpos monoclonales o una sonda de hibridación marcada. No puede detectarse la presencia de amiloide.
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<211> 5
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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\sa{Arg Xaa Val Xaa Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) . . (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4) . . (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Xaa Val Xaa Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4).. (4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Xaa Ile Xaa Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Xaa Ile Xaa Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (3)..(3)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (5)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cualquier aminoácido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Xaa Xaa Arg Xaa Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Phe Phe Ser Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Glu Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Trp Gly Arg Ile Ala Ala Ala Phe Ser Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgtctcaga gcaac 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gttgctctga gacat 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atggcgaccc cagcc 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggctggggtc gccat 
\hfill
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Ser Arg Arg Tyr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Thr Ala Arg Gly Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Glu Leu Arg Tyr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Phe Glu Thr Arg Phe Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Phe Glu Arg Lys Asn Glu Lys Leu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Ile Arg Ser Lys Ser Val His Phe Asp Gln Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Leu Glu Phe Leu His Lys Pro Arg Arg Leu Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Arg Ser Lys Ser Val His Phe Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Leu Phe Asn Glu Arg Arg Gln Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Pro Thr Arg His Asn Val Arg Trp Glu Glu Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ser Trp Phe Lys Ala Arg Lys Arg Arg Asp Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Pro Arg Glu Arg His Ile Lys Phe Asn Asp Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Arg Asn Phe Val Asn Lys Leu Lys Pro Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Gln Ala Lys Lys Arg Val Val Phe Ala Asp Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Val Lys Val Lys Asn Val Ser Phe Glu Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Asp Phe Arg Asn Arg Leu Gln Thr Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Lys Val Lys Lys Arg Val Ser Phe Ala Asn Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg His Phe Val Asn Lys Leu Lys Pro Leu Lys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asn Gln Ala Lys Lys Arg Val Val Phe Ala Asp Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Cys Phe Arg Pro Arg Leu Arg Gly Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Gln Lys Lys Lys Arg Val Val Phe Ala Asp Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Glu Val Phe Ile Asn Lys Gly Lys Gly Lys Gly Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gly Arg Gln Leu Arg Val Arg Phe Ala Thr His}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Val Lys Phe Arg Arg Arg Arg Glu Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Phe Lys Arg Tyr Gln Val Lys Phe Arg Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Ile Thr Pro Ser Tyr Val ala Phe Thr Pro Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
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\sa{Gly Asp Glu Gly Glu Leu Arg Tyr Arg Arg Ala Phe}
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<213> SINTÉTICA
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\sa{Gly Asp Glu Gly Glu Leu Gly Tyr Arg Arg Ala Phe}
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<213> SINTÉTICA
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<213> SINTÉTICA
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<213> SINTÉTICA
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<211> 23
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<213> SINTÉTICA
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\sa{Arg Ala Ala Gly Asp Glu Phe Glu Thr Arg Arg Arg Thr Phe Ser Asp}
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<213> SINTÉTICA
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<213> SINTÉTICA
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<213> SINTÉTICA
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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\sa{Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala Pro Pro Asn Leu Trp Ala Ala Gln}
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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<400> 76
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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<400> 77
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<213> SINTÉTICA
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\sa{Glu Glu Glu Leu Ser Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala}
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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<400> 79
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\sa{Glu Glu Glu Leu Glu Phe Arg Gly Arg Ser Arg Ser Ala}
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<213> SINTÉTICA
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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\sa{Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Ser Arg Arg Tyr Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> SINTÉTICA
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<213> SINTÉTICA
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<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Arg Gln Ala Gly Asp Asp Phe Gly Arg Arg Tyr Arg}

Claims (18)

1. Conjunto de polipéptidos que tiene tanto los motivos M1 como M2 en el mismo polipéptido o M1 en un polipéptido y M2 en el otro polipéptido y que puede inhibir la interacción Bcl-x_{L}/PP1c, en el que el motivo M1 tiene la secuencia NWGRIVAFFSF y el motivo M2 tiene la secuencia GDEFELRYRRAF.
2. Conjunto de péptidos según la reivindicación 1, en el que dichos péptidos están glucosilados, acetilados, fosforilados o amidados.
3. Conjunto de ácidos nucleicos aislados que codifican para un conjunto de péptidos según la reivindicación 1 o una secuencia de ácido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con uno de dichos ácidos nucleicos que codifican para dicho conjunto de péptidos.
4. Vector que comprende los ácidos nucleicos según la reivindicación 3.
5. Método de identificación de una proteína o polipéptido que interacciona con PP1, que comprende:
detectar en la secuencia de dicho polipéptido o proteína, la presencia de dos motivos M1 y M2 de unión a PP1 en el mismo polipéptido, en el que el motivo M1 tiene la secuencia NWGRIVAFFSF y el motivo M2 tiene la secuencia GDEFELRYRRAF; y
confirmar que dicho polipéptido o proteína identificado es un polipéptido o proteína que interacciona con PP-1 usando una prueba bioquímica.
6. Método según la reivindicación 5, en el que dicha prueba bioquímica consiste en coinmunoprecipitar dicho polipéptido o proteína que interacciona con PP-1, y PP1.
7. Método de cribado de compuestos que inhiben o intensifican la actividad de PP1 o cambian su ubicación mediante interacción o que interaccionan con reguladores de PP1, que comprende:
(a) inmovilizar péptidos según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 sobre un soporte; y
(b) someter a prueba la interacción de dichos compuestos con los péptidos de la etapa (a).
8. Método de cribado de compuestos que interaccionan con PP1, que comprende:
(a) obtener anticuerpos frente a péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2; y
(b) someter a prueba la interacción de dicho compuesto con dichos anticuerpos.
9. Compuesto farmacéutico que comprende el conjunto de péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2.
10. Composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que codifica para el conjunto de péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2.
11. Composición farmacéutica que comprende el vector según la reivindicación 4.
12. Método para inhibir in vitro la interacción entre PP1c y Bcl-_{XL}, que comprende una etapa de añadir un conjunto de péptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 en el mismo péptido, en el que el conjunto de péptidos comprende NWGRIVAFFSF y GDEFELRYRRAF.
13. Kit que comprende anticuerpos frente al conjunto de péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2 y reactivos para interpretar la interacción.
14. Uso del conjunto de péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2, para la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la diabetes, hipertensión arterial, un trastorno neurológico, una enfermedad viral o una infección microbiana asociada con PP1.
15. Uso según la reivindicación 14, en el que el trastorno neurológico es la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer.
16. Uso según la reivindicación 14, en el que la enfermedad viral es VIH-1.
17. Anticuerpos frente a los péptidos según las reivindicaciones 1 ó 2.
18. Anticuerpos según la reivindicación 17, caracterizados porque son anticuerpos monoclonales.
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