ES2300603T3 - Cribado de peptidos que inhiben la union de pp1c a las proteinas bcl-2, bcl-xl y bcl-w. - Google Patents
Cribado de peptidos que inhiben la union de pp1c a las proteinas bcl-2, bcl-xl y bcl-w. Download PDFInfo
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Abstract
Polipéptido que tiene tanto los motivos M1 como M2 y que puede inhibir la interacción Bcl-xL/PP1c, en el que el motivo M1 tiene la secuencia NWGRIVAFFSF y el motivo M2 tiene la secuencia GDEFELRYRRAF, en el que dicho polipéptido tiene dos o más motivos M1 o M2 que tienen un espaciador entre ellos.
Description
Cribado de péptidos que inhiben la unión de PP1c
a las proteínas Bcl-2, Bcl-x_{L} y
Bcl-w.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La invención se refiere a métodos para
identificar polipéptidos y proteínas que interaccionan con PP1
novedosos, a compuestos que pueden inhibir la unión de PP1c a
ciertos factores que interaccionan de manera natural con el mismo,
especialmente proteínas de la familia de Bcl-2
(tales como Bcl-x_{L} y Bcl-w), y
a composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos.
Las serina/treonina fosfatasas se clasifican
como de tipo 1 (PP1) o tipo 2 (PP2), dependiendo de su especificidad
de sustrato y su sensibilidad a los inhibidores. PP1 regula la
progresión del ciclo celular, proliferación, transcripción,
síntesis de proteínas, citocinesis y señalización neuronal (Mc Avoy
et al, 2001). PP1 se regula por su interacción con una
variedad de subunidades de proteínas que dirigen la subunidad
catalítica (PP1c) hacia compartimientos subcelulares específicos y
determina su ubicación, actividad y selectividad de sustrato
(Bollen et al, 2001). PP1 puede regularse mediante la
interacción entre una subunidad catalítica y múltiples subunidades
de selección como diana que permiten la desfosforilación específica
de diversas dianas celulares. El número de subunidades de selección
como diana de PP1c conocidas aumenta continuamente y hasta la fecha
ya se han identificado casi treinta proteínas de mamífero únicas.
Las proteínas que interaccionan con PP1 incluyen las subunidades de
unión a glucógeno, RGL/GM, GL, PTG/R5/U5 y R6 que dirigen la
fosfatasa al glucógeno, las subunidades de asociación a miosina,
M110, NIPP-1, p99/PNUTS, y Sds22, que pueden dirigir
la fosfatasa hacia el núcleo (Bollen, 2001). Los estudios previos
basados en análisis de cristalografía de rayos X y estructurales de
proteínas que interaccionan con PP1 indicaron que PP1c se une a
distintas proteínas de interacción conocidas mediante una secuencia
de aminoácido corta. Los motivos [RK]VxF (o [RK]xVxF)
representan una secuencia consenso generalizada para el
reconocimiento y unión de distintas subunidades reguladoras y
proteínas que interaccionan con PP1c (Egloff et al, 1997;
Aggen et al, 2000).
Usando una línea de células T murinas que puede
propagarse independientemente en presencia de IL-2 o
IL-4 (Pitton et al, 1993), los inventores
han descrito que PP1c es una fosfatasa activada por Ras que
desfosforila Bad (un miembro proapoptótico de la familia de la
proteína Bcl-2) antes de inducir la apoptosis en
respuesta a la carencia de IL-2 (Ayllón et
al, 2000). Realizando estudios competitivos bioquímicos, los
inventores también identificaron recientemente
Bcl-2 como una nueva subunidad de selección como
diana de PP1c que controla su asociación con Bad en células
estimuladas con IL-2 (Ayllón et al,
2001).
Las proteínas de la familia de
Bcl-2 actúan como punto de control intracelular en
la ruta apoptótica. La familia de proteínas de
Bcl-2 se divide en dos grupos funcionales: miembros
antiapoptóticos tales como Bcl-2,
Bcl-x_{L}, Bcl-w, A1 y
Mcl-1 y miembros proapoptóticos tales como Bax, Bak,
Bcl-x_{S} así como el miembro "sólo BH3"
("BH3-only") Bad (White, 1996; Reed, 1998; Chao
y Korsmeyer, 1998). El equilibrio entre homo y heterodímeros de los
miembros de la familia de Bcl-2 puede ser crítico
para mantener la proliferación o la apoptosis celular (Jacobson,
1997; Korsmeyer, 1999; Gross et al, 1999). La regulación por
incremento o por disminución de estas proteínas puede explicar la
supervivencia de algunos tipos de células, aunque también es posible
que los factores de supervivencia utilicen proteína cinasas o
fosfatasas para alterar la capacidad de estas proteínas para
estimular la supervivencia o apoptosis celular. Los miembros de la
familia de Bcl-2 antiapoptóticos interaccionan con
otros agonistas de la muerte de la familia de Bcl-2
y con proteínas que no son de la familia de Bcl-2,
incluyendo R-Ras, H-Ras, Raf,
caspasas, calcineurina y la serina/treonina fosfatasa PP1c (Rebollo
et al, 1999; Ayllón et al, 2001). La familia de
Bcl-2 se ha definido mediante homología de secuencia
basándose en motivos conservados específicos denominados regiones
de homología con Bcl (dominios BH1, BH2, BH3 y BH4). Se ha mostrado
que los dominios BH1, BH2 y BH3 son importantes en la
homodimerización o la heterodimerización y en la modulación de la
apoptosis. Las moléculas antiapoptóticas tienen un dominio BH4
específico.
Bad comparte identidad sólo en el dominio BH3
(Zha et al, 1997) y forma heterodímeros con
Bcl-2 y Bcl-x (Ottilie et
al, 1997). Al estimular las células con IL-3,
NGF y GM-CSF, Bad se fosforila en serina (Del Peso
et al, 1997; Datta et al, 1997), dando como resultado
la asociación con la proteína 14-3-3
y suprimiendo la interacción con Bcl-x (Hsu et
al, 1997). Recientemente se ha mostrado que la asociación de la
proteína 14-3-3 con Bad depende de
la fosforilación de la serina 155 de Bad (Datta et al, 2000;
Zhou et al, 2000).
Bcl-w es una proproteína de
supervivencia que lleva los cuatro dominios de homología de
Bcl-2 (BH) conservados (Gibson et al, 1996).
La expresión reforzada de Bcl-w, como
Bcl-2, hace las líneas celulares linfoide y
mieloide resistentes a la apoptosis inducida por la carencia de
citocinas. La molécula Bcl-x_{L} antiapoptótica
también contiene los cuatro dominios BH conservados (Núnez et
al, 1994). Una segunda isoforma de Bcl-x,
Bcl-x_{S}, codifica para una proteína más pequeña
de 170 aminoácidos que intensifica la apoptosis (Minn et al,
1996). Bcl-x_{L} contiene un segmento hidrófobo en
el extremo C-terminal que se cree que sirve como
anclaje a la membrana (Boise et al, 1993).
La apoptosis o muerte celular programada es un
proceso activo en el que las células inducen su autodestrucción en
respuesta a señales de muerte celular específicas o en ausencia de
señales de supervivencia celular. En realidad este proceso activo
es esencial en el desarrollo normal y homeostasis de organismos
multicelulares. Es opuesto a la necrosis que es la muerte celular
que se produce como resultado de cambios dañinos graves en el
entorno.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se producen diversas patologías debido a la
regulación defectuosa o aberrante de la apoptosis en las células
afectadas de un organismo. Por ejemplo, los defectos que dan como
resultado un nivel disminuido de apoptosis en un tejido en
comparación con el nivel normal requerido para mantener el estado
estacionario del tejido pueden estimular un aumento anómalo de la
cantidad de células en un tejido. Esto puede observarse en diversos
cánceres, en los que la formación de tumores se produce debido a que
las células no mueren a su tasa normal. Algunos virus de ADN, tales
como el virus de Epstein-Barr, virus de la peste
porcina africana y adenovirus, también inhiben o modulan la
apoptosis, reprimiendo así la muerte celular y permitiendo que la
célula huésped continúe reproduciendo el virus.
Por el contrario, un defecto que da como
resultado un aumento de la muerte celular en un tejido puede
asociarse con trastornos degenerativos en los que las células
mueren a una tasa superior a la que se regeneran. Esto se observa
en diversos trastornos, tales como SIDA, senescencia, y trastornos
neurodegenerativos.
Los compuestos que modulan positiva o
negativamente la apoptosis pueden proporcionar medios para el
tratamiento o la prevención de estos trastornos. Como consecuencia,
la descripción de rutas apoptóticas proporciona dianas para el
desarrollo de agentes terapéuticos que pueden usarse para modular la
respuesta de una célula frente a señales de supervivencia celular o
apoptóticas.
Los resultados descritos en la presente
invención indican que los miembros antiapoptóticos de la familia de
Bcl-2, Bcl-w y
Bcl-x_{L} también son subunidades de selección
como diana de PP1c en células estimuladas con IL-4.
Esta observación ofrece una ruta hacia un mecanismo general novedoso
de regulación de la apoptosis celular que puede desempeñar un papel
en la regulación de moléculas pro o antiapoptóticas en respuesta a
señales de muerte celular o de supervivencia celular. Por tanto, la
invención es de importancia particular en los campos del tratamiento
del cáncer y tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.
Más generalmente, la presente invención
proporciona medios para modular la interacción entre PP1 y las
proteínas o polipéptidos que se unen a ella. Por tanto, la presente
invención tiene aplicaciones en una amplia variedad de campos, ya
que PP1 está implicada en muchas rutas biológicas. Por ejemplo, se
sabe que una disminución de la fosforilación del complejo de PP1
activa las cadenas ligeras de miosina del músculo liso y por tanto
relaja los músculos lisos (véase, Uehata et al., 1997). Por
tanto, la hipertensión arterial podría ser un objetivo de la
presente invención.
PP1 es una proteína serina/treonina fosfatasa
eucariota principal que regula diversos procesos celulares tales
como ciclo celular, transcripción y síntesis de proteínas.
La regulación de PP1 también puede afectar a la
regulación aguas abajo de la síntesis de glucógeno hepático que, a
su vez, disminuiría los niveles de glucemia y por tanto trataría la
diabetes en la que la hiperglucemia es un problema grave.
Además, PP1 está implicada en varias infecciones
bacterianas, virales y parasitarias, e inhibir su interacción con
algunas de sus parejas en un contexto infeccioso podría ser
beneficioso para el paciente.
Por tanto, la presente invención se refiere a un
péptido que tienen tanto los motivos M1 como M2 y que puede inhibir
la interacción Bcl-x_{L}/PP1c, en el que el motivo
M1 tiene la secuencia NWGRIVAFFSF y el motivo M2 tiene la secuencia
GDEFELRYRRAF, en el que dicho polipéptido tiene dos o más motivos M1
o M2 que tienen un espaciador entre ellos.
Aún en otra realización, la presente invención
se refiere a una composición farmacéutica que comprende el péptido
mencionado anteriormente y que puede inhibir la interacción
Bcl-x_{L}/PP1c. Los péptidos con aminoácidos
modificados (glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación o
derivación mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos) también
pueden usarse en las composiciones según la invención.
Aún en otra realización, la presente invención
se refiere a una composición farmacéutica que comprende un vector
que comprende un ácido nucleico que codifica para el péptido
mencionado anteriormente.
En los métodos anteriores, los péptidos
mencionados anteriormente que tienen tanto los motivos M1 como M2 y
que pueden inhibir la interacción Bcl-x_{L}/PP1c,
pueden ser por ejemplo los péptidos NWGRIVAFFSF y
GDE
FELRYRRAF.
FELRYRRAF.
Aún en otro aspecto, la presente invención puede
ser útil para un método para tratar animales y plantas que tienen
cualquier enfermedad implicada en la ruta de PP1c, que comprende
administrar a los animales y plantas que necesitan tal tratamiento
péptidos que tienen tanto los motivos M1 como M2 y que pueden
inhibir la interacción Bcl-x_{L}/PP1c.
Aún en otro aspecto, la presente invención puede
ser útil para un método para tratar un animal que tiene diabetes o
hipertensión o un trastorno neurológico o una infección viral o una
infección parasitaria, que comprende administrar a un animal que
necesita tal tratamiento péptidos que tienen tanto los motivos M1
como M2 y que pueden inhibir la interacción
Bcl-x_{L}/PP1c.
En los métodos anteriores, pueden administrarse
por ejemplo los péptidos NWGRIVAFFSF y GDEFELRYRRAF.
En otra realización, la presente invención se
refiere al uso de los péptidos mencionados anteriormente que tienen
tanto los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las interacciones
Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o
Bcl-2/Bad/PP1c, para la preparación de un
medicamento para tratar la diabetes o la hipertensión o trastornos
neurológicos o una infección viral o una infección parasitaria.
Aún en otra realización, la presente invención
se refiere al uso de los péptidos mencionados anteriormente que
tienen tanto los motivos M1 como M2 y que pueden inhibir las
interacciones Bcl-x_{L}/PP1c,
Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c, para
la preparación de un medicamento para tratar la diabetes o la
hipertensión o trastornos neurológicos o una infección viral o una
infección parasitaria.
Figura
1
A) Se inmunoprecipitaron extractos
citoplasmáticos de células estimuladas con o que se sometieron a
carencia de IL-4 (60 U/ml) con anticuerpo
anti-Bcl-x_{L} o
anti-Bcl-w, se transfirieron a
nitrocelulosa y se realizó la inmunotransferencia con anticuerpo
anti-Bad, anti-PP1c,
anti-Bcl-x_{L} y
anti-Bcl-w. Se detectaron bandas de
proteínas usando el sistema ECL. Se muestran los pesos moleculares
de las proteínas correspondientes. Se obtuvieron resultados
similares en tres experimentos independientes. B) Se
inmunoprecipitaron extractos citoplasmáticos de células estimuladas
con IL-4 con anticuerpo anti-cadena
p55 de IL-2R, se transfirieron a nitrocelulosa y se
realizó la inmunotransferencia con anticuerpos
anti-Bcl-w,
Bcl-x_{L} o
anti-IL-2R de p55. Se detectaron
bandas de proteínas usando el sistema ECL. C) Se inmunoprecipitaron
extractos citoplasmáticos de timocitos recién aislados con
anti-Bad, anti-PP1c o un suero
irrelevante y se realizó la inmunotransferencia con
anti-Bcl-2,
anti-Bcl-x_{L},
anti-Bad y anti-PP1c. Se detectaron
proteínas tal como en A. Se obtuvieron resultados similares en tres
experimentos independientes.
Figura
2
A) Se estimularon células Ts1\alpha\beta con
o se sometieron a carencia de IL-4 durante los
tiempos indicados, luego se lisaron. Se transfirieron las proteínas
a nitrocelulosa y se detectaron con sondas con anticuerpos
anti-Bcl-x_{L},
anti-Bcl-w, anti-Bad
y anti-PP1c. Se obtuvieron resultados similares en
dos experimentos independientes.
B) Se inmunoprecipitaron extractos
citoplasmáticos de células estimuladas con o que se sometieron a
carencia de IL-4 durante 24 h con
anti-Bcl-x_{L} o
anti-Bcl-w, se separaron en un gel
de SDS-PAGE en gradiente y se realizó la
inmunotransferencia con anti-Pser,
anti-Bad, anti-PP1c y, como control
interno, con anti-Bcl-x_{L} y
anti-Bcl-w. Se obtuvieron resultados
similares en tres experimentos independientes.
C) Se inmunoprecipitaron extractos
citoplasmáticos de control, células estimuladas con o que se
sometieron a carencia de IL-4 (1 x 10^{7}) con
anticuerpo anti-Bad y se realizó la
inmunotransferencia con serina 112, serina 136 y serina 155 de
anti-Bad. Como control interno, se desarrolló la
inmunotransferencia con anticuerpo anti-Bad. Se
obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes.
Control positivo para la fosforilación de la serina 112 y 136 de
Bad, células estimuladas con IL-2 (carril C);
control positivo para la fosforilación de la serina 155 de Bad,
células COS transfectadas con Bad (carril C).
D) Se inmunoprecipitaron extractos totales (T)
de lisados citoplásmicos de células estimuladas con o que se
sometieron a carencia de IL-4 (1 x 10^{7}) con
anticuerpos anti-PP1c, anti-Raf,
anti-Bcl-x_{L} o
anti-Bad y se realizó la inmunotransferencia con
anti-14-3-3,
anti-PP1c,
anti-Bcl-x_{L} y
anti-Bad. Se obtuvieron resultados similares en dos
experimentos independientes.
Figura
3
A) Se estimó la actividad fosfatasa en
inmunoprecipitados de Bad, Bcl-x_{L} y
Bcl-w de células estimuladas con
IL-4 usando ^{32}P-fosforilasa a
como sustrato.
B) Se añadieron concentraciones diferentes de AO
a inmunoprecipitados de Bad o Bcl-w de células
estimuladas con IL-4. Se estimó la actividad
fosfatasa usando ^{32}P-fosforilasa a como
sustrato. La reacción fue tal como en A. Se obtuvieron resultados
similares en tres experimentos independientes. La actividad
fosfatasa se representa como el porcentaje de la actividad máxima en
sobrenadantes sin tratar.
\newpage
Figura
4
A) Se redujeron Bcl-x_{L} y
Bcl-w de lisados citoplásmicos de células
estimuladas con IL-4 mediante cuatro
inmunoprecipitaciones secuenciales. Se estimó la actividad fosfatasa
en inmunoprecipitados de Bad de células estimuladas con
IL-4 control o en inmunoprecipitados de Bad con
reducción de Bcl-x_{L} y Bcl-w
tras cuatro inmunoprecipitaciones secuenciales. La actividad
fosfatasa se representa como el porcentaje de la actividad máxima
detectada en inmunoprecipitados de anti-Bad control.
B) Se analizó el efecto de la reducción de
Bcl-x_{L} y Bcl-w sobre la
asociación PP1c/Bad. Se inmunoprecipitaron extractos citoplásmicos
de células estimuladas con IL-4 control o extractos
citoplásmicos con reducción de Bcl-x_{L} y
Bcl-w con anticuerpos anti-Bad o
anti-PP1c y se realizó la inmunotransferencia con
anti-Bad,
anti-Bcl-w,
anti-Bcl-x_{L} y
anti-PP1c. Se obtuvieron resultados similares en
tres experimentos independientes. Se detectaron bandas de proteínas
usando el sistema ECL.
Figura
5
A) Secuencia del motivo F X X R X R de
Bcl-2, Bcl-x_{L} y
Bcl-w. B) Membrana con péptidos
Bcl-x_{L} o Bcl-w que contienen el
motivo R/K X V/I X F o F X X R X R, así como péptidos que contienen
motivos mutados, se incubaron con PP1c purificada, seguido por
anticuerpo anti-PP1c y anticuerpo secundario
conjugado con PO. Se detectaron puntos usando el sistema ECL. Los
motivos R/K X V/I X F y F X X R X R están en negrita. Los
aminoácidos mutados dentro del motivo están en negrita y subrayados.
Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos
independientes. El péptido 1 corresponde al motivo de unión a PP1 de
Bcl-x_{L} y Bcl-w. El péptido 2
corresponde al sitio de unión a PP1 mutado en el que los residuos V
y F se mutaron para dar A.
Figura
6
A) Se inmunoprecipitaron extractos citoplásmicos
de células estimuladas con IL-4 control con
anticuerpo anti-Bad. Se hizo competir la interacción
Bcl-x_{L}/PP1c/Bad y
Bcl-w/PP1c/Bad con 1,5 mM de péptidos R, R*, F o R+F
durante 30 min. a temperatura ambiente. Se lavaron los
inmunoprecipitados, se transfirieron a nitrocelulosa y se realizó la
inmunotransferencia con anti-Bad,
anti-PP1c,
anti-Bcl-x_{L} y
anti-Bcl-w. Se obtuvieron resultados
similares en dos experimentos independientes. Para la secuencia de
péptidos, véase Materiales y Métodos o las figuras 5A y 5B.
B) Se inmunoprecipitaron lisados citoplásmicos
de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo
anti-Bad. Se trataron los inmunoprecipitados con 1,5
mM de péptidos R, R*, F o R+F durante 30 min. a temperatura
ambiente. Se lavaron los inmunoprecipitados y se estimó la actividad
fosfatasa usando ^{32}P-fosforilasa a como
sustrato. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos
independientes.
C) Se inmunoprecipitaron lisados citoplásmicos
de células estimuladas con IL-4 con anticuerpo
anti-Bad y luego se trataron con 1,5 mM de péptido
R+F o 3 mM de péptido R o F (30 min., temperatura ambiente). Se
lavaron los inmunoprecipitados y se estimó la actividad fosfatasa
tal como en B.
Figura
7
A) Se trataron las células con o sin AO 1 \muM
en presencia o ausencia de IL-4. Se
inmunoprecipitaron los lisados citoplásmicos con anticuerpo
anti-Bad, se transfirieron a nitrocelulosa y se
detectaron con sondas con fosfo-Bad ser 136 y
anti-Bad, siendo el último para verificar que el
tratamiento con AO in vivo no afecta a la expresión de Bad.
Se detectaron bandas de proteínas usando ECL.
B) Se trataron células durante 6 h con o sin AO
1 \muM en presencia o ausencia de IL-4 y luego se
lavaron, se tiñeron con yoduro de propidio y se analizaron mediante
citometría de flujo.
C) Se trataron células durante 24 h con o sin
oligonucleótido sentido o antisentido 15 \muM en presencia o
ausencia de IL-4. Se añadieron oligonucleótidos a
las 0, 12 y 18 h y luego se lavaron las células, se tiñeron con
yoduro de propidio y se analizaron mediante citometría de flujo. Se
analizó la expresión de Bcl-x_{L} y
Bcl-w tras el tratamiento sentido y antisentido
mediante inmunotransferencia de tipo western.
Figura
8
A) Dos supuestos motivos de unión a PP1 en
proteínas Bcl-2. Alineación de secuencias en la
proximidad de los dominios BH1 y BH3 de algunas proteínas
Bcl-2. Estas secuencias están perfectamente
conservadas en diversas especies (seres humanos, ratones, ratas,
bovinos...).
\global\parskip0.900000\baselineskip
B) Un papel para la fosforilación de la serina
en la unión a PP1.
Se sintetizaron seis péptidos (de 14 AA de
longitud) y se unieron covalentemente a una membrana de celulosa
antes de analizarse para detectar la unión a PP1 tal como se
describió. Se introdujo una mutación de AA puntual en
Ser-136 en 4 péptidos (mutantes 2, 3, 5, 6).
C) Asociación de P13-K p85
(carril 1), P13-K p110 (carril 2), HSP70, (carril
3), y CD4 (carril 4) a PP1c. Se usaron células TS1 \alpha\beta
tratadas con IL-4 (1 x 10^{7}) para la
inmunoprecipitación tal como se describe normalmente. Se
transfirieron inmunoprecipitados a nitrocelulosa, se bloquearon y se
incubaron con anticuerpo primario anti-PP1c. Se lavó
la membrana y se incubó con anticuerpo secundario conjugado con PO y
se desarrollaron proteínas usando ECL.
Figura
9
Histograma para ilustrar el número de proteínas
y el número de aminoácidos que separan los motivos
F-x-x-[RK]-x-[RK] y
[RK]-V-x-[FW]/[RK]-x-V-x-[FW]
(A)
[RK]-V-x-F/[RK]-x-V-x-F
(B).
Los siguientes términos se usan a lo largo del
resto de la memoria descriptiva y reivindicaciones y debe entenderse
que significan, aparte de la definición genérica, la siguiente
definición más precisa; entendiéndose que la definición genérica
también se incluye.
Tal como se usa en el presente documento, la
palabra "imitar" se refiere a un parecido cercano o bien en
estructura y/o bien en función.
Tal como se usa en el presente documento la
palabra "aislado" significa tomado del entorno natural. Aislado
no significa necesariamente que lo que se toma del entorno natural
se purifica al 100%.
Tal como se usa en el presente documento el
término "prueba bioquímica" se refiere a cualquier prueba que
puede identificar un polipéptido o proteína que interacciona.
Ejemplos de pruebas bioquímicas incluyen, pero no se limitan a,
inmunoprecipitación, uso de anticuerpos, ya sean monoclonales o
policlonales, sondas de oligonucleótidos que pueden marcarse con
radioactividad o una enzima, disminución de GST (experimento de
filtración en gel que revela el tamaño de complejos
macromoleculares) tal como se describió en Ayllón et al EMBO
J. 19 2237-2246 (2000), y similares.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "motivo" se refiere a una secuencia o secuencias de
aminoácidos particulares que son similares y tienen la misma
función en diferentes entornos celulares. Un motivo tiene algunos
aminoácidos fijos y otros variables.
Tal como se usa en el presente documento y
durante toda la memoria descriptiva y en las reivindicaciones,
cuando varios aminoácidos están entre corchetes, esto significa que
el aminoácido dentro de los corchetes puede ser uno u otro. Por
tanto, [RK] significa que el motivo puede tener o bien R o bien
K.
Tal como se usa en el presente documento, la
palabra "inhibe" significa que previene las interacciones
específicas, independientemente del mecanismo de esta
prevención.
Tal como se usa en el presente documento una
"composición farmacéutica" incluye, pero no se limita a, los
péptidos de la presente invención descritos a lo largo de la memoria
descriptiva y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Esta
composición farmacéutica comprende una cantidad farmacéuticamente
aceptable de los péptidos de la presente invención. La cantidad
farmacéuticamente aceptable puede estimarse a partir de ensayos de
cultivo celular. Por ejemplo, puede formularse una dosis en modelos
animales para lograr un intervalo de concentración circulante que
incluye o abarca un punto o intervalo de concentración que tiene el
efecto deseado en un sistema in vitro. Por tanto, esta
información puede usarse para determinar con precisión las dosis en
animales, incluyendo seres humanos.
La dosis terapéuticamente eficaz se refiere a
esa cantidad del compuesto que da como resultado la mejora de los
síntomas en un paciente. La toxicidad y eficacia terapéutica de
tales compuestos puede determinarse mediante procedimientos
farmacéuticos habituales en cultivos celulares o en animales
experimentales. Por ejemplo, la DL50 (la dosis letal para el 50% de
la población) así como la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en
el 50% de la población) pueden determinarse usando métodos
conocidos en la técnica. La razón de dosis entre los efectos
tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico que puede expresarse
como la razón entre la DL50 y la DE50 compuestos que muestran
índices terapéuticos altos.
Los datos obtenidos de los estudios en animales
y cultivos celulares pueden usarse para formular un intervalo de
dosificaciones de tales compuestos que está preferiblemente dentro
de un intervalo de concentraciones circulantes que incluye la DE50
con poca o ninguna toxicidad.
La composición farmacéutica puede administrarse
por medio de cualquier vía tal como localmente, oralmente,
sistémicamente, por vía intravenosa, por vía intramuscular, por vía
mucosa, usando un parche y puede encapsularse en liposomas,
micropartículas, microcápsulas y similares. La composición
farmacéutica puede incrustarse en liposomas o incluso encapsularse.
La composición farmacéutica también puede estar en una forma
liofilizada.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Puede usarse cualquier adyuvante o excipiente
farmacéuticamente aceptable en la composición farmacéutica. El
compuesto modulador estará por ejemplo en una forma soluble
combinado con un excipiente farmacéuticamente aceptable. Las
técnicas para formular y administrar estos compuestos pueden
encontrarse en "Remington's Pharmaceutical Sciences" Mack
Publication Co., Easton, PA, última edición.
El modo de administración, dosificaciones
óptimas y formas galénicas pueden determinarse mediante criterios
conocidos en la técnica teniendo en cuenta la gravedad del estado
general del mamífero, incluyendo el ser humano, la tolerancia del
tratamiento y los efectos secundarios.
"Composiciones farmacéuticas" también
incluye vectores que podrían administrarse directamente in
vivo o pueden combinarse con células específicas que pueden o
no extraerse del animal que va a tratarse. Tipos de células
incluyen todas las células eucariotas y procariotas, incluyendo
células musculares, de corazón, hígado, pulmón, cerebro, timocitos,
sanguíneas y similares. Las células bacterianas y vegetales también
se abarcan en la presente invención ya que PP1 se encuentra en
muchos tipos diferentes de células bacterianas y vegetales. Las
células de levadura también se abarcan por la presente invención. De
hecho, cualquier célula que contenga PP1 se abarca por la
presente
invención.
invención.
Por tanto, se incluyen abarcadas por el término
"composiciones farmacéuticas" todas las formas de
administración farmacéutica no sólo clásica, sino que también
incluye la terapia génica.
Por el término "soporte" se quiere decir
cualquier tipo de objeto sobre el que pueden inmovilizarse los
péptidos. El tipo de soporte incluye, pero no se limita a, pocillos
Costar, perlas, resinas, pastillas de vidrio, membranas y
similares. Cualquier soporte que pueda usarse para inmovilizar
proteínas o péptidos puede usarse en los métodos de la presente
invención.
El término "animal" abarca cualquier ser
vivo que no es vegetal, incluyendo vertebrados tales como mamíferos,
aves, reptiles, anfibios y peces.
Tal como se usa en el presente documento los
términos "polinucleótidos", "ácidos nucleicos" y
"oligonucleótidos" se usan de manera intercambiable e
incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ARN, ADN, ARN/ADN de
más de un nucleótido en forma o bien de cadena sencilla o bien de
dúplex. Las secuencias de polinucleótido de la presente invención
pueden prepararse a partir de cualquier método conocido incluyendo,
pero sin limitarse a, cualquier método sintético, cualquier método
recombinante, cualquier método de generación ex vivo y
similares, así como combinaciones de los mismos.
Los polinucleótidos que pueden hibridarse con
cualquiera de los polinucleótidos tratados anteriormente también
están cubiertos por la presente invención. Tales polinucleótidos se
denominan en el presente documento como polinucleótidos "de
hibridación". Los polinucleótidos de hibridación pueden ser
útiles, por ejemplo, como sondas o cebadores.
Según una realización de la presente invención,
tales moléculas de hibridación tienen una longitud de al menos 10
nucleótidos. Según otra realización, tienen una longitud de al menos
25 o al menos 50 nucleótidos.
En una realización, las moléculas de hibridación
se hibridarán con tales moléculas en condiciones de hibridación
rigurosas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas es
cuando se lleva a cabo la hibridación intentada a una temperatura
de desde aproximadamente 35ºC hasta aproximadamente 65ºC usando una
solución salina que es de aproximadamente 0,9 molar. Sin embargo,
el experto podrá variar tales condiciones según sea apropiado con
el fin de tener en cuenta variables tales como longitud de la sonda,
composición de bases, tipo de iones presentes, etc.
Por "prevenir o tratar" se quiere decir
tratar una enfermedad o estado médico o detener la aparición de una
enfermedad o un estado médico.
Más específicamente, la presente invención se
refiere a un péptido que tiene tanto los motivos M1 como M2 y que
afecta a la interacción Bcl-x_{L}/PP1c, en el que
el motivo M1 tiene la secuencia NWGRIVAFFSF, y el motivo M2 tiene
la secuencia GDEFELRYRRAF, en el que dicho polipéptido tiene dos o
más motivos M1 o M2 que tienen un espaciador entre ellos.
La presente invención no sólo abarca los
péptidos o el conjunto de péptidos específicos descritos
anteriormente, sino también péptidos modificados en los que se
deleciona, añade o cambia un aminoácido, mientras conservan la
misma función de inhibir la interacción
Bcl-x_{L}/PP1c. En particular, pueden usarse
análogos químicos de los aminoácidos, tales como aminoácidos
fosforilados o tiofosforilados. Por ejemplo, se ha demostrado que
un residuo Y fosforilado es similar al F. Por tanto, estos dos
aminoácidos pueden intercambiarse sin afectar a la función del
motivo.
Por tanto, los análogos peptídicos mencionados
anteriormente de los motivos están abarcados en la presente
invención. Estos análogos incluyen aquellas estructuras que son
similares en función pero que no son idénticas en composición. Un
ejemplo de un análogo es un polipéptido que tiene aminoácidos
modificados químicamente que se fosforilan y no pueden
desfosforilarse por las enzimas celulares.
Los péptidos o conjuntos de péptidos según la
presente invención, o incluidos en las composiciones y kits de la
invención, pueden abarcar dos o más motivos en la misma molécula, o
de 2 a 5 motivos, o de 2 a 10 motivos, motivos que se describieron
anteriormente, teniendo un espaciador entre ellos. El espaciador
puede ser una secuencia de aminoácidos o una cadena hidrocarbonada
interrumpida por enlaces covalentes. Un espaciador también puede
ser cualquier entidad química que puede servir para conectar los al
menos dos motivos, y el espaciador también puede contener secuencias
reguladoras entre los al menos dos motivos.
En otra realización, el espaciador de la
presente invención tiene desde aproximadamente 1 hasta
aproximadamente 50 aminoácidos. En una realización particular, el
espaciador tiene aproximadamente 36 aminoácidos.
En otra realización, la presente invención se
refiere a un polipéptido o proteína de fusión que contiene un
polipéptido según las reivindicaciones. Este polipéptido o proteína
de fusión puede prepararse según métodos conocidos en la técnica
tales como los descritos por Sambrook et al, Molecular
Cloning A Laboratory Manual, 2ª Edición (1989). Un polipéptido o
proteína de fusión particular de la invención comprende uno o varios
motivos M1 o M2, unidos con al menos un péptido fusogénico que
ayudará al polipéptido o proteína de fusión a entrar en las células
diana. Dicho péptido fusogénico puede ser, por ejemplo, un epítopo
viral o un ligando para un receptor celular específico tal como
receptores de quimiocina.
Los motivos anteriores, sus análogos y
modificaciones pueden sintetizarse usando, por ejemplo, un
sintetizador "Applied System" o mediante síntesis en fase
sólida de tipo Merrifield (véase, Merrifield, Adv. Enzmol. Related
Areas Mol. Biol. (1969) 32; 221-96 o Merrfield,
Recent Prog. Horm. Res. (1967); 23; 451-82). Los
motivos también pueden producirse de manera recombinante.
La secuencia de ácidos nucleicos que codifica
para los motivos puede insertarse dentro de un vector de expresión
que contiene los elementos necesarios para la transcripción y
traducción de la secuencia que codifica para el péptido/proteína
insertado. Tales elementos de transcripción incluyen una región
reguladora y un promotor. Por tanto, el ácido nucleico que puede
codificar para un compuesto marcador de la presente invención está
operativamente unido a un promotor en el vector de expresión. El
vector de expresión también puede incluir un origen de
replicación.
Se emplea una amplia variedad de combinaciones
de huésped/vector de expresión para expresar ácidos nucleicos de la
presente invención. Vectores de expresión útiles que pueden usarse
incluyen, por ejemplo, segmentos de secuencias de ADN cromosómico,
no cromosómico y sintético. Vectores adecuados incluyen, pero no se
limitan a, derivados de SV40 y pcADN y plásmidos bacterianos
conocidos tales como col El, pCR1, pBR322, pMal-C2,
pET, pGEX tal como se describe por Smith et al (1988), pMB9
y derivados de los mismos, plásmidos tales como RP4, ADN de fagos
tales como los numerosos derivados de fago I tales como NM989, así
como otro ADN de fagos tales como M13 y ADN de fagos de cadena
sencilla filamentosos; plásmidos de levadura tales como el plásmido
de 2 micras o derivados del plásmido 2m, así como vectores lanzadera
de levadura centroméricos y de integración; vectores útiles en
células eucariotas tales como vectores útiles en células de insectos
o de mamíferos; vectores derivados de combinaciones de ADN de fagos
y plásmidos, tales como plásmidos que se han modificado para emplear
ADN de fago o las secuencias de control de la expresión; y
similares.
Por ejemplo, en un sistema de expresión de
baculovirus, pueden usarse tanto vectores de transferencia no de
fusión, tales como, pero sin limitarse a, pVL941 (sitio de clonación
de BamHI, Summers), pVL1393 (sitios de clonación de
BamHI, SmaI, Xbal, EcoRI, NotI,
XmaIII, BglII y PstI; Invitrogen), pVL1392
(sitio de clonación de BglII, PstI, NotI,
XmaIII, EcoRI, XbalI, SmaI y
BamHI; Summers e Invitrogen) y pBlueBacIII (sitio de
clonación de BamHI, BglII, PstI, NcoI y
HindIII, con cribado recombinante azul/blanco, Invitrogen),
como vectores de transferencia de fusión tales como, pero sin
limitarse a, pAc700 (sitios de clonación de BamHI y KpnI, en los que
el sitio de reconocimiento de BamHI comienza con el codón de
iniciación; Summers), pAc701 y pAc70-2 (iguales que
pAc700, con marcos de lectura diferentes), pAc360 (sitio de
clonación de BamHI 36 pares de bases en sentido 3' de un
codón de iniciación de polihedrina; Invitrogen (1995)) y
pBlueBacHisA, B, C (tres marcos de lectura diferentes con sitio de
clonación de BamHI, BglII, PstI, NcoI y
HindIII, un péptido N-terminal para la
purificación ProBond y cribado recombinante azul/blanco de placas;
Invitrogen (220).
Los vectores de expresión de mamíferos
contemplados para su uso en la invención incluyen vectores con
promotores inducibles, tales como los promotores de la
dihidrofolato reductasa, cualquier vector de expresión con un
casete de expresión de DHFR o un covector de amplificación de
DHFR/metotrexato tal como pED (sitios de clonación de PstI,
SalI, SbaI, SmaI y EcoRI, con el vector
que expresa tanto el gen clonado como DHFR; Kaufman, 1991).
Alternativamente, un covector de amplificación de glutamina
sintetasa/metionina sulfoximina, tal como pEE14 (sitios de
clonación de HindIII, XbalI, SmaI, SbaI,
EcoRI y BclI en los que el vector expresa la
glutamina sintetasa y el gen clonado; Celltech). Puede usarse un
vector que dirige la expresión episomal bajo el control del virus
Epstein Barr (EBV) o antígeno nuclear (EBNA), tal como pREP4
(sitios de clonación de BamHI, SfiI, XhoI,
NotI, NheI, HindIII, NheI, PvuII
y KpnI, promotor de RSV-LTR constitutivo,
marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen), pCEP4 (sitios
de clonación de BamHI, SfiI, XhoI, NotI,
NheI, HindIII, NheI, PvuII y
KpnI, promotor del gen temprano inmediato de hCMV
constitutivo, marcador seleccionable de higromicina; Invitrogen),
pMEP4 (sitios de clonación de KpnI, PvuI, NheI,
HindIII, NotI, XhoI, SfiI, BamHI,
promotor del gen de metalotioneína IIa inducible, marcador
seleccionable de higromicina, Invitrogen), pREP8 (sitios de
clonación de BamHI, XhoI, NotI, HindIII,
NheI y KpnI, promotor de RSV-LTR,
marcador seleccionable de histidinol; Invitrogen), pREP9 (sitios de
clonación de KpnI, NheI, HindIII, NotI,
XhoI, SfiI, BamHI, promotor de
RSV-LTR, marcador seleccionable de G418;
Invitrogen), y pEBVHis (promotor de RSV-LTR,
marcador seleccionable de higromicina, péptido
N-terminal purificable mediante resina ProBond y
escindido mediante enterocinasa; Invitrogen).
Los vectores de expresión de mamíferos
seleccionables para su uso en la invención incluyen, pero no se
limitan a, pRc/CMV (sitios de clonación de HindIII,
BstXI, NotI, SbaI y ApaI, selección de
G418, Invitrogen), pRc/RSV (sitios de clonación de HindII,
SpeI, BstXI, NotI, XbaI, selección de
G418, Invitrogen) y similares. Vectores de expresión de mamíferos
del virus de Vaccinia (véase, por ejemplo, Kaufman 1991) que pueden
usarse en la presente invención incluyen, pero no se limitan a,
pSC11 (sitio de clonación de SmaI, selección de TK- y
\beta-gal), pMJ601 (sitios de clonación de
SalI, Smal, AflI, NarI, BspMII,
BamHI, ApaI, NheI, SacII, KpnI y
HindIII; selección de TK- y \beta-gal),
pTKgptF1S (sitios de clonación de EcoRI, PstI,
SalII, AccI, HindII, SbaI, BamHI
y Hpa, selección de TK o XPRT) y similares.
Los sistemas de expresión de levaduras que
también pueden usarse en la presente incluyen, pero no se limitan
a, vector pYES2 no de fusión (sitios de clonación de XbaI,
SphI, ShoI, NotI, GstXI, EcoRI,
BstXI, BamHI, SacI, KpnI y
HindIII, Invitrogen), la pYESHisA, B, C de fusión (sitios de
clonación de XbalI, SphI, ShoI, NotI,
BstXI, EcoRI, BamHI, SacI, KpnI
y HindIII, péptido N-terminal purificado con
resina ProBond y escindido con enterocinasa; Invitrogen), vectores
pRS y similares.
En consecuencia, las células de mamíferos, y
normalmente de seres humanos, así como células bacterianas, de
levaduras, hongos, insectos, nematodos y vegetales se usan en la
presente invención y pueden transfectarse por el ácido nucleico o
vector recombinante tal como se define en el presente documento.
Ejemplos de células adecuadas incluyen, pero no
se limitan a, células VERO, células HELA tales como ATCC nº CCL2,
líneas celulares CHO tales como ATCC nº CCL61, células COS tales
como células COS-7 y células ATCC nº CRL 1650,
W138, BHK, HepG2, 3T3 tales como ATCC nº CRL6361, A549, PC12,
células K562, células 293, células Sf9 tales como ATCC nº CRL1711,
células Cv1 tales como ATCC nº CCL70 y células JURKAT tales como
ATCC nº Tib152.
Otras células adecuadas que pueden usarse en la
presente invención incluyen, pero no se limitan a, cepas de células
huésped procariotas tales como Escherichia coli, (por
ejemplo, la cepa DH5-\alpha), Bacillus
subtilis, Salmonella typhimurium, o cepas de los géneros de
Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, parásitos
como los parásitos Apicomplexan (Plasmodia, Toxoplasma,
Cryptosporidia), Leishmania o Trypanosoma.
Células adecuadas adicionales que pueden usarse
en la presente invención incluyen células de levaduras tales como
las de Saccharomyces tales como Saccharomyces
cerevisiae o Prombe.
Los motivos y péptidos anteriormente descritos
están implicados en la unión de Bcl-x_{L} y
Bcl-w a PP1 c y por tanto son subunidades de
selección como diana implicadas en el control de todas las uniones a
PP1. Por tanto, debido a su implicación en la unión a PP1, estos
motivos son importantes para la regulación de cualquier enfermedad
relacionada con la regulación de la fosfatasa en todos los tipos de
células incluyendo todas las células eucariotas y procariotas
incluyendo células musculares, de corazón, hígado, pulmón, cerebro,
timocitos, sanguíneas y similares. Las células bacterianas y
vegetales también se abarcan en la presente invención ya que PP1 se
encuentra en muchos tipos diferentes de células bacterianas y
vegetales. Las células de levaduras también se abarcan por la
presente invención. De hecho, cualquier célula que contiene PP1 se
abarca por la presente invención.
De manera más importante, esta regulación puede
afectar a la regulación aguas abajo de, por ejemplo, la síntesis de
glucógeno hepático que a su vez reduciría los niveles de glucemia y
por tanto tratará la diabetes en la que la hiperglucemia es un
problema grave. Por tanto, la presente descripción se refiere a
tratar la diabetes administrando a un animal que necesita tal
tratamiento una cantidad farmacéuticamente aceptable de los péptidos
de la presente invención que se describen en detalle en ella.
Aún en otra realización, la presente descripción
se refiere a la administración de los péptidos de la presente
invención para normalizar la hipertensión arterial. Una disminución
en la fosforilación del complejo de PP1 activa las cadenas ligeras
de miosina del músculo liso y por tanto relaja los músculos lisos
(véase, Uehata et al., 1997). Por tanto, la presente
descripción también se refiere a administrar a un animal una
cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos de la presente
invención descritos en ella para prevenir o tratar la
hipertensión.
Aún en otra realización, la presente descripción
se refiere a tratar trastornos neurológicos modulando los
receptores neurológicos y los canales de iones. Por tanto, la
presente descripción también se refiere a tratar trastornos
neurológicos administrando a un animal que necesita tal tratamiento
una cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos de la
presente invención descritos en ella para prevenir o tratar los
trastornos neurológicos, tales como la enfermedad de Parkinson.
Más específicamente, la presente descripción se
refiere a tratar la enfermedad de Alzheimer. Se sabe que la
fosforilación desempeña un papel afectando al precursor de
\beta-amiloide que provoca las placas en la
enfermedad de Alzheimer. Por tanto, la presente descripción se
refiere a tratar la enfermedad de Alzheimer administrando a un
animal que necesita tal tratamiento una cantidad farmacéuticamente
eficaz de los péptidos de la presente invención descritos en ella
para prevenir o tratar la enfermedad de Alzheimer.
Aún en otra realización, la presente descripción
se refiere a tratar infecciones virales o microbianas y más
específicamente al virus del herpes simple, Mycobacterium
tuberculosis y SIDA administrando a un animal que necesita tal
tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz de los péptidos de
la presente invención descritos en ella para prevenir o tratar la
infección viral.
La presente invención es especialmente útil para
tratar el SIDA ya que tanto TAT como la transcriptasa inversa del
virus VIH-1 pueden ser proteínas de unión a PP1.
Aún en otra realización, la presente descripción
se refiere a tratar infecciones parasitarias tales como malaria,
theileria o cryptosporidium administrando a un animal que
necesita tal tratamiento una cantidad farmacéuticamente eficaz de
los péptidos de la presente invención descritos en ella para
prevenir o tratar estas infecciones parasitarias.
Los tratamientos mencionados anteriormente
implican administrar a un animal que necesita tal tratamiento una
cantidad farmacéuticamente eficaz de un péptido o un conjunto de
péptidos que imita tanto los motivos M1 como M2 y que inhibe las
interacciones Bcl-x_{L}/PP1c,
Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c. Por
ejemplo, podría administrarse un conjunto de péptidos que comprende
el péptido R (NWGRIVAFFSF) y el péptido F (GDEFELRYRRAF), análogos
de estos péptidos o sus equivalentes funcionales en un vehículo
farmacéuticamente aceptable a dicho animal.
En otra realización la presente invención se
refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido
según las reivindicaciones.
El vehículo farmacéuticamente aceptable incluye,
pero no se limita a, solución salina, adyuvantes y similares,
tratados más exhaustivamente con anterioridad.
La presente descripción no se limita únicamente
a los péptidos descritos como una composición farmacéutica
"pura", sino también como una composición farmacéutica para su
uso en la terapia génica, usando vectores que codifican para
polipéptidos según la presente invención.
Más específicamente, la terapia génica ex
vivo e in vitro es parte de la presente descripción. Con
respecto a esto, puede usarse cualquiera de las metodologías
relativas a la terapia génica disponible en la técnica en la
práctica de la presente descripción, tales como las descritas por
Goldspiel et al Clin. Pharm. 12 págs. 488-505
(1993).
La administración del ácido nucleico terapéutico
dentro de un paciente puede ser terapia génica in vivo
directa (es decir, el paciente se expone directamente al ácido
nucleico o vector que contiene ácido nucleico) o terapia génica
ex vivo indirecta (es decir, en primer lugar se transforman
las células con el ácido nucleico in vitro y luego se
transplantan dentro del paciente).
Por ejemplo, para la terapia génica in
vivo, puede administrarse un vector de expresión que contiene el
ácido nucleico de manera que se vuelve intracelular; es decir,
mediante infección usando un vector retroviral defectuoso o
atenuado u otros vectores virales tal como se describe, por ejemplo,
en la patente estadounidense 4.980.286 o por Robbins et al,
Pharmacol. Ther., 80 nº 1 págs. 35-47 (1998).
Los diversos vectores retrovirales que se
conocen en la técnica son tales como los descritos por Miller et
al. (Meth. Enzymol. 217 págs. 581-599 (1993))
que se han modificado para eliminar las secuencias retrovirales que
no se requieren para empaquetar el genoma viral y la posterior
integración dentro del ADN de la célula huésped. También pueden
usarse vectores adenovirales que son ventajosos debido a su
capacidad para infectar células que no se dividen, y tales vectores
adenovirales de alta capacidad se describen en Kochanek (Human Gene
Therapy, 10, págs. 2451-2459 (1999)). Los vectores
virales quiméricos que pueden usarse son los descritos por Reynolds
et al. (Molecular Medecine Today, págs. 25-31
(1999)). También pueden usarse vectores híbridos y se describen por
Jacoby et al. (Gene Therapy, 4, págs.
1282-1283 (1997)).
La inyección directa de ADN desnudo o mediante
el uso de bombardeo con micropartículas (por ejemplo, Gene Gun®;
Biolistic, Dupont) o recubriéndolo con lípidos, también puede usarse
en terapia génica. Receptores de superficie celular/compuestos de
transfección o mediante encapsulación en liposomas, micropartículas
o microcápsulas, o mediante administración del ácido nucleico en
unión con un péptido que se sabe que entra en el núcleo o mediante
su administración en unión con un ligando predispuesto a la
endocitosis mediada por receptor (véase Wu & Wu, J. Biol.
Chem., 262 págs. 4429-4432 (1987)) pueden usarse
para seleccionar como diana tipos celulares que expresan
específicamente los receptores de interés.
En otra realización, puede producirse un
compuesto de ligando de ácido nucleico en el que el ligando
comprende un péptido viral fusogénico diseñado para romper los
endosomas, permitiendo así al ácido nucleico evitar la posterior
degradación lisosomal. El ácido nucleico puede dirigirse in
vivo para la expresión y endocitosis específica de células
seleccionando como diana un receptor específico tal como los
descritos en los documentos WO92/06180, WO93/14188 y WO 93/20221.
Alternativamente, puede introducirse el ácido nucleico de manera
intracelular e incorporarse dentro del genoma de la célula huésped
para la expresión mediante recombinación homóloga (véase Zijlstra
et al, Nature, 342, págs. 435-428
(1989)).
\newpage
En la terapia génica ex vivo, se
transfiere un gen dentro de las células in vitro usando
cultivo tisular y se administran las células al paciente mediante
diversos métodos tales como inyección subcutánea, aplicación de las
células dentro de un injerto de piel y la inyección intravenosa de
células sanguíneas recombinantes tales como células progenitoras o
células madre hematopoyéticas.
Las células dentro de las que puede introducirse
un ácido nucleico para los fines de la terapia génica incluyen, por
ejemplo, células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos,
fibroblastos, células musculares, hepatocitos y células sanguíneas.
Las células sanguíneas que pueden usarse incluyen, por ejemplo,
linfocitos T, linfocitos B, monocitos, macrófagos, neutrófilos,
eosinófilos, megacariocitos, granulocitos, células hematopoyéticas o
células progenitoras y similares.
Los polipéptidos y complejos de polipéptidos de
la invención también encuentran uso en la preparación de
anticuerpos. Por tanto, la presente descripción proporciona
anticuerpos, que pueden ser monoclonales o policlonales.
Por tanto, los polipéptidos y complejos de la
invención pueden usarse como inmunógeno para generar anticuerpos
que se unen específicamente a un inmunógeno de ese tipo. Los
anticuerpos de la invención incluyen, pero no se limitan a,
anticuerpos policlonales, monoclonales, biespecíficos, humanizados o
quiméricos, anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab y
fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca
de expresión de Fab, anticuerpos anti-idiotípicos
(anti-Id), y fragmentos de unión a epítopo de
cualquiera de los anteriores. El término "anticuerpo" tal como
se usa en el presente documento se refiere a moléculas de
inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de
inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de
unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno. Las
moléculas de inmunoglobulina de la invención pueden ser de cualquier
clase (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) o subclase de molécula
de inmunoglobulina.
En la producción de anticuerpos, el cribado del
anticuerpo deseado puede llevarse a cabo mediante técnicas
conocidas en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo de
inmunoabsorción ligado a enzimas). Por ejemplo, para seleccionar
anticuerpos que reconocen un dominio específico de un polipéptido de
la invención (por ejemplo, un dominio de interacción seleccionado),
pueden someterse a ensayo hibridomas generados para un producto que
se une a un fragmento de polipéptido que contiene tal dominio. Para
la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un
primer homólogo de polipéptido pero que no se une específicamente (o
se une con menos avidez) a un segundo homólogo de polipéptido,
puede seleccionarse basándose en una unión positiva al primer
homólogo de polipéptido y una falta de unión (o unión reducida) al
segundo homólogo de polipéptido.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
(Acm) dirigidos contra un polipéptido de la invención o un
fragmento o un análogo del mismo, puede usarse cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante
líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del
hibridoma desarrollada originalmente por Kohler y Milstein (1975,
Nature 256:495-497), así como la técnica del trioma,
la técnica del hibridoma de célula B humana (Kozbor et al.,
1983, Inmunology Today 4:72), y la técnica del hibridoma de EBV
para producir anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al.,
1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., págs. 77-96). Tales anticuerpos pueden ser de
cualquier clase de inmunoglobulinas incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA,
IgD y cualquier subclase de las mismas. El hibridoma que produce los
Acm de la descripción puede cultivarse in vitro o in
vivo. En una realización adicional de la descripción, pueden
producirse anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes
utilizando tecnología conocida (documento PCT/US90/02545).
Los anticuerpos monoclonales incluyen, pero no
se limitan a, anticuerpos monoclonales humanos y anticuerpos
monoclonales quiméricos (por ejemplo, quimeras ser
humano-ratón). Un anticuerpo quimérico es una
molécula en la que diferentes partes se derivan de diferentes
especies animales, tales como las que tienen una región constante
de inmunoglobulina humana y una región variable derivada de un Acm
murino (véanse, por ejemplo, Cabilly et al., patente
estadounidense número 4.816.567; y Boss et al., patente
estadounidense número 4.816.397). Anticuerpos humanizados son
moléculas de anticuerpos de especies no humanas que tienen una o más
regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la especie no
humana y una región de entramado (framework) de una molécula
de inmunoglobulina humana.(véase, por ejemplo, Queen, patente
estadounidense número 5.585.089).
Los anticuerpos monoclonales humanizados y
quiméricos pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante
conocidas en la técnica, por ejemplo usando métodos descritos en la
publicación PCT número WO 87/02671; solicitud de patente europea
184.187; solicitud de patente europea 171.496; solicitud de patente
europea 173.494; publicación PCT número WO 86/01533; patente
estadounidense número 4.816.567; solicitud de patente europea
125.023; Better et al., 1988, Science
240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al.,
1987, J. Inmunol. 139:3521-3526; Sun et al.,
1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218;
Nishimura et al., 1987, Canc. Res.
47:999-1005; Wood et al., 1985, Nature
314:446-449; y Shaw et al., 1988, J. Natl.
Cancer Inst. 80:1553-1559; Morrison, 1985, Science
229:1202-1207; Oi et al., 1986,
Bio/Techniques 4:214; patente estadounidense 5.225.539; Jones et
al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et
al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al., 1988, J.
Inmunol. 141:4053-4060.
Los anticuerpos completamente humanos se desean
particularmente para el tratamiento terapéutico de pacientes
humanos. Tales anticuerpos pueden producirse usando ratones
transgénicos que no pueden expresar genes endógenos de cadena
ligera y pesada de inmunoglobulinas, pero que pueden expresar genes
humanos de cadena ligera y pesada. Se inmunizan los ratones
transgénicos de la manera normal con un antígeno seleccionado, por
ejemplo, toda o una parte de una BPI de la descripción. Los
anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno pueden
obtenerse usando tecnología de hibridoma convencional. Los
transgenes humanos de inmunoglobulina albergados por el ratón
transgénico se reposicionan durante la diferenciación de la célula
B, y posteriormente experimentan un cambio de clase y mutación
somática. Por tanto, usando una técnica de este tipo, es posible
producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles.
Para un resumen sobre esta tecnología para producir anticuerpos
humanos, véase Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Inmunol.
13:65-93). Para un tratado detallado sobre esta
tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos
monoclonales humanos y protocolos para producir tales anticuerpos,
véanse, por ejemplo, patente estadounidense 5.625.126; patente
estadounidense 5.633.425; patente estadounidense 5.569.825; patente
estadounidense 5.661.016; y patente estadounidense 5.545.806.
Además, pueden contratarse compañías tales como Abgenix, Inc.
(Freemont, CA) y Genpharm (San Jose, CA) para proporcionar
anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando
tecnología similar a la descrita anteriormente.
Los anticuerpos completamente humanos que
reconocen un epítopo seleccionado pueden generarse usando una
técnica denominada como "selección guiada." En este enfoque,
se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por
ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un
anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo.
(Jespers et al. (1994) Bio/technology
12:899-903).
Los anticuerpos de la presente descripción
también pueden generarse usando diversos métodos de presentación de
fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación de
fagos, se presentan dominios de anticuerpos funcionales sobre la
superficie de partículas de fagos que llevan las secuencias de
polinucleótido que codifican para los mismos. Más específicamente,
tales fagos pueden utilizarse para presentar dominios de unión a
antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca
combinatoria de anticuerpos (por ejemplo, humanos o murinos). Los
fagos que expresan un dominio de unión a antígeno que se une al
antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con
antígenos, por ejemplo, usando antígenos marcados o antígenos unidos
o capturados sobre una perla o superficie sólida. Los fagos usados
en estos métodos son normalmente fagos filamentosos incluyendo
dominios de unión M13 y fd expresados del fago con dominios de
anticuerpos Fab, Fv o Fv estabilizado con disulfuro fusionados de
manera recombinante a la proteína o bien del gen III o bien del gen
VIII del fago. Los métodos de presentación de fagos que pueden
usarse para preparar los anticuerpos de la presente descripción
incluyen los descritos en Brinkman et al., J. Inmunol.
Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J.
Inmunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough
et al., Eur. J. Inmunol. 24:952-958 (1994);
Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton
et al., Advances in Inmunology 57:191-280
(1994); solicitud PCT número PCT/GB91/01134; publicaciones PCT WO
90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO
95/15982; WO 95/20401; y patentes de los EE.UU. números 5.698.426;
5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047;
5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 y
5.969.108.
Tal como se describe en las referencias
anteriores, tras la selección del fago, pueden aislarse las regiones
del fago que codifican para el anticuerpo y usarse para generar
anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier
otro fragmento de unión a antígeno deseado, y expresarse en
cualquier huésped deseado, incluyendo células de mamíferos, células
de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo,
tal como se describe en detalle a continuación. Por ejemplo, también
pueden emplearse técnicas para producir de manera recombinante
fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 usando métodos conocidos en la
técnica tales como los descritos en la publicación PCT WO 92/22324;
Mullinax et al., BioTechniques
12(6):864-869 (1992); y Sawai et al.,
AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al.,
Science 240:1041-1043 (1988).
Ejemplos de técnicas que pueden usarse para
producir anticuerpos y Fv de cadena sencilla incluyen las descritas
en las patentes de los EE.UU. 4.946.778 y 5.258.498; Huston et
al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991);
Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y
Skerra et al., Science 240:1038-1040
(1988).
La descripción proporciona además el uso de
anticuerpos biespecíficos, que pueden prepararse mediante métodos
conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos
biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos
pares de cadena pesada-cadena ligera de
inmunoglobulina, en los que las dos cadenas tienen especificidades
diferentes (Milstein et al., 1983, Nature
305:537-539). Debido a la distribución aleatoria de
las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, estos hibridomas
(cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 moléculas de
anticuerpos diferentes, de las que sólo una tiene la estructura
biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que
normalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de
afinidad, es bastante complicada, y los rendimientos del producto
son bajos. Se describen procedimientos similares en el documento WO
93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker et
al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659.
Según un enfoque diferente, se fusionan dominios
variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas
(sitios de combinación anticuerpo-antígeno) a
secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión puede
realizarse con un dominio constante de cadena pesada de
inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones de
bisagra, CH2 y CH3. Generalmente, la primera región constante de
cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión
de la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones.
Los ADN que codifican para las fusiones de cadena pesada de
inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de
inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y
se cotransfectan dentro de un organismo huésped adecuado. Esto
proporciona una gran flexibilidad para ajustar las proporciones
mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en realizaciones en
las que las razones desiguales de las tres cadenas de polipéptido
usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin
embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o
las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la
expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en razones iguales
da como resultado altos rendimientos o cuando las razones no son de
significación particular.
En otra realización de este enfoque, los
anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada de
inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en
un brazo, y un par de cadena pesada-cadena ligera de
inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad
de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura
asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado
de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas, ya
que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina sólo en la
mitad de la molécula biespecífica proporciona un modo fácil de
separación. Este enfoque se describe en el documento WO 94/04690
publicado el 3 de marzo de 1994. Para más detalles para generar
anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh et al.,
Methods in Enzymology, 1986, 121:210.
La descripción proporciona fragmentos
funcionalmente activos, derivados o análogos de las moléculas de
inmunoglobulina anti-polipéptido. Funcionalmente
activo significa que el fragmento, derivado o análogo puede obtener
anticuerpos anti-anti-idiotipo (es
decir, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que
se reconoce por el anticuerpo del que se deriva el fragmento,
derivado o análogo. Específicamente, en una realización, la
antigenicidad del idiotipo de la molécula de inmunoglobulina puede
potenciarse mediante la deleción de las secuencias "framework"
y CDR que son C-terminales con respecto a la
secuencia CDR que reconoce específicamente el antígeno. Para
determinar qué secuencias CDR se unen al antígeno, pueden usarse
péptidos sintéticos que contienen las secuencias CDR en ensayos de
unión con el antígeno mediante cualquier método de ensayo de unión
conocido en la técnica.
La presente descripción proporciona fragmentos
de anticuerpo tales como, pero sin limitarse a, fragmentos
F(ab')2 y fragmentos Fab. Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Los fragmentos F(ab')2 consisten en la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada y se generan mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan mediante reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. La descripción también proporciona dímeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la descripción, o cualquier fragmento mínimo de los mismos tal como Fv o anticuerpos de cadena sencilla (SCA) (por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la descripción. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman mediante unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido de cadena sencilla. Pueden usarse las técnicas para el montaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
F(ab')2 y fragmentos Fab. Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Los fragmentos F(ab')2 consisten en la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio CH1 de la cadena pesada y se generan mediante digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan mediante reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')2. La descripción también proporciona dímeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la descripción, o cualquier fragmento mínimo de los mismos tal como Fv o anticuerpos de cadena sencilla (SCA) (por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense 4.946.778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la descripción. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman mediante unión de los fragmentos de cadena pesada y ligera de la región Fv por medio de un puente de aminoácidos, dando como resultado un polipéptido de cadena sencilla. Pueden usarse las técnicas para el montaje de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242:1038-1041).
En otras realizaciones, la descripción
proporciona proteínas de fusión de las inmunoglobulinas de la
descripción (o fragmentos funcionalmente activos de las mismas),
por ejemplo en las que se fusiona la inmunoglobulina por medio de
un enlace covalente (por ejemplo, un enlace peptídico), o bien en el
extremo N-terminal o bien en el extremo
C-terminal a una secuencia de aminoácidos de otra
proteína (o parte de la misma, preferiblemente una parte de al
menos 10, 20 ó 50 aminoácidos de la proteína) que no es la
inmunoglobulina. En una realización, la inmunoglobulina, o un
fragmento de la misma, se une covalentemente a otra proteína en el
extremo N-terminal del dominio constante. Tal como
se mencionó anteriormente, tales proteínas de fusión pueden
facilitar la purificación, aumentar la semivida in vivo, e
intensificar la administración de un antígeno a través de una
barrera epitelial al sistema inmunitario.
Las inmunoglobulinas de la descripción incluyen
análogos y derivados que están cualquiera de ellos modificados, es
decir, mediante unión covalente de cualquier tipo de molécula
siempre que tal unión covalente no perjudique a la unión
inmunoespecífica. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los
derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluyen aquellos que
se han modificado adicionalmente, por ejemplo, mediante
glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación,
derivatización mediante grupos protectores/de bloqueo conocidos,
escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína,
etc. Puede llevarse a cabo cualquiera de varias modificaciones
químicas mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero sin limitarse
a, escisión química específica, acetilación, formilación, etc.
Adicionalmente, el análogo o derivado puede contener uno o más
aminoácidos no clásicos.
Los anticuerpos anteriores pueden usarse en
métodos conocidos en la técnica referentes a la localización y
actividad de los polipéptidos de la invención, por ejemplo, para
formar de imágenes o radioimágenes de estas proteínas, medir
niveles de las mismas en muestras fisiológicas apropiadas, en
métodos de diagnóstico, etc. y para radioterapia.
Los anticuerpos de la descripción pueden
producirse mediante cualquier método conocido en la técnica para la
síntesis de anticuerpos, por ejemplo, mediante síntesis química o
mediante expresión recombinante, y se producen preferiblemente
mediante una técnica de expresión recombinante.
La expresión recombinante de anticuerpos, o
fragmentos, derivados o análogos de los mismos, requiere la
construcción de un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo.
Si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, puede
ensamblarse un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo a
partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo,
según se describe en Kutmeier et al., 1994, BioTechniques
17:242), que, en resumen, supone la síntesis de oligonucleótidos
solapantes que contienen partes de la secuencia que codifica para
el anticuerpo, hibridación y ligamiento de esos oligonucleótidos, y
luego la amplificación de los oligonucleótidos ligados por PCR.
Alternativamente, el ácido nucleico que codifica
para el anticuerpo puede obtenerse mediante la clonación del
anticuerpo. Si no se dispone de un clon que contiene el ácido
nucleico que codifica para el anticuerpo particular, pero se conoce
la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede obtenerse un ácido
nucleico que codifica para el anticuerpo a partir de una fuente
adecuada (por ejemplo, una biblioteca de ADNc de anticuerpo, o una
biblioteca de ADNc generada a partir de cualquier tejido o célula
que exprese el anticuerpo) mediante amplificación por PCR usando
cebadores sintéticos que pueden hibridarse con los extremos 3' y 5'
de la secuencia o mediante clonación usando una sonda de
oligonucleótido específica para la secuencia del gen particular.
Si no se dispone de una molécula de anticuerpo
que reconoce específicamente un antígeno particular (o una fuente
para una biblioteca de ADNc para clonar un ácido nucleico que
codifica para tal anticuerpo), pueden generarse anticuerpos
específicos para un antígeno particular mediante cualquier método
conocido en la técnica, por ejemplo, inmunizando un animal, tal
como un conejo, para generar anticuerpos policlonales o, generando
anticuerpos monoclonales. Alternativamente, puede obtenerse un clon
que codifica para al menos la parte Fab del anticuerpo cribando
bibliotecas de expresión de Fab (por ejemplo, según se describe en
Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281)
para clones de fragmentos Fab que se unen al antígeno específico o
cribando bibliotecas de anticuerpos (véanse, por ejemplo, Clackson
et al., 1991, Nature 352:624; Hane et al., 1997 Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94:4937).
Una vez que se obtiene un ácido nucleico que
codifica para al menos el dominio variable de la molécula de
anticuerpo, puede introducirse en un vector que contiene la
secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de
la molécula de anticuerpo (véase, por ejemplo, la publicación PCT WO
86/05807; la publicación PCT WO 89/01036; y la patente
estadounidense número 5.122.464). También se dispone de vectores que
contienen la cadena pesada o ligera completa para la coexpresión
con el ácido nucleico para permitir la expresión de una molécula de
anticuerpo completa. Entonces, puede usarse el ácido nucleico que
codifica para el anticuerpo para introducir la(s)
sustitución/sustituciones o deleción/deleciones de nucleótidos
necesarias para sustituir (o eliminar) el o más residuos de
cisteína de la región variable que participan en un enlace disulfuro
intracatenario por un residuo de aminoácido que no contiene un
grupo sulfhidrilo. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo
mediante cualquier método conocido en la técnica para la
introducción de mutaciones o deleciones específicas en una
secuencia de nucleótidos, por ejemplo, pero sin limitarse a,
mutagénesis química, mutagénesis dirigida al sitio in vitro
(Hutchinson et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), métodos
basados en PCT, etc.
Además, pueden usarse técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et
al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855;
Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608;
Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)
mediante el corte y empalme de genes de una molécula de anticuerpo
de ratón de especificidad de antígeno apropiada junto con genes de
una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada.
Tal como se describió anteriormente, un anticuerpo quimérico es una
molécula en la que se derivan diferentes partes de diferentes
especies animales, tales como los que tienen una región variable
derivada de un Acm murino y una región constante de anticuerpo
humano, por ejemplo, anticuerpos humanizados.
Una vez que se ha obtenido un ácido nucleico que
codifica para una molécula de anticuerpo de la descripción, puede
producirse el vector para la producción de la molécula de anticuerpo
mediante tecnología de ADN recombinante usando técnicas bien
conocidas en la técnica. Por tanto, en el presente documento se
describen métodos para preparar la proteína de la invención
expresando el ácido nucleico que contiene las secuencias de la
molécula de anticuerpo. Pueden usarse métodos que se conocen bien
por los expertos en la técnica para construir vectores de expresión
que contienen una molécula de anticuerpo que codifica para
secuencias y señales de control transcripcional y traduccional
apropiadas. Estos métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN
recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación
genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas
en Sambrook et al. (1990, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY) y Ausubel et al. (eds., 1998, Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY).
El vector de expresión se transfiere a una
célula huésped mediante técnicas convencionales y las células
transfectadas se cultivan entonces mediante técnicas convencionales
para producir un anticuerpo de la descripción.
Las células huésped usadas para expresar un
anticuerpo recombinante de la descripción pueden ser o bien células
bacterianas tales como Escherichia coli, o bien células
eucariotas, especialmente para la expresión de la molécula de
anticuerpo recombinante completa. Más específicamente, las células
de mamífero tales como las células de ovario de hámster chino
(CHO), en conjunción con un vector tal como el elemento promotor del
gen temprano intermedio principal de citomegalovirus humano es un
sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et
al., 198, Gene 45:101; Cockett et al., 1990,
Bio/Technology 8:2).
Puede utilizarse una variedad de sistemas de
vector de expresión-huésped para expresar una
molécula de anticuerpo de la descripción. Tales sistemas de
expresión-huésped representan vehículos mediante los
cuales pueden producirse secuencias codificantes de interés y
purificarse posteriormente, pero también representan células que
pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias
codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar la molécula de
anticuerpo de la descripción in situ. Éstas incluyen pero no
se limitan a microorganismos tales como bacterias (por ejemplo,
E. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión
de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o de ADN de
cósmido que contienen las secuencias que codifican para el
anticuerpo; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia)
transformadas con vectores de expresión de levaduras recombinantes
que contienen secuencias que codifican para el anticuerpo; sistemas
de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus
recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen las
secuencias que codifican para el anticuerpo; sistemas de células
vegetales infectadas con vectores de expresión de virus
recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, VMC;
virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformados con vectores de
expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que
contienen secuencias que codifican para el anticuerpo; o sistemas de
células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3)
que albergan constructos de expresión recombinantes que contienen
promotores derivados del genoma de las células de mamífero (por
ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por
ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor de 7,5 K del
virus vaccinia).
En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse
ventajosamente varios vectores de expresión dependiendo del uso
pretendido para la molécula de anticuerpo que se está expresando.
Por ejemplo, cuando va a producirse una gran cantidad de tal
proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas que
comprenden una molécula de anticuerpo, pueden ser deseables
vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de
proteína de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores
incluyen, pero no se limitan, al vector de expresión de E.
coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en los
que la secuencia que codifica para el anticuerpo puede ligarse
individualmente en el vector en el marco con la región codificante
de lacZ de modo que se produce una proteína de fusión;
vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res.
13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J.
Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Pueden
usarse también vectores pGEX para expresar polipéptidos foráneos
como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa
(GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden
purificarse fácilmente de células lisadas mediante adsorción y
unión a perlas de una matriz de glutatión-agarosa
seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores
pGEX se diseñan para incluir sitios de escisión de proteasa de
factor Xa o trombina de modo que el producto génico objetivo clonado
puede liberarse del resto de GST.
En un sistema de insectos, se usa el virus de la
polihedrosis nuclear de Autographa californica (VPNAc) como
vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de
Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica para el
anticuerpo puede clonarse individualmente en regiones no esenciales
(por ejemplo el gen de polihedrina) del virus y situarse bajo el
control de un promotor de VPNAc (por ejemplo, el promotor de
polihedrina). En células huésped de mamíferos, pueden utilizarse
varios sistemas de expresión basados en virus (por ejemplo, un
sistema de expresión de adenovirus).
Tal como se trató anteriormente, puede elegirse
una cepa de células huésped que modula la expresión de las
secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en la
forma específica deseada. Tales modificaciones (por ejemplo,
glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los
productos proteicos pueden ser importantes para la función de la
proteína.
Para la producción de alto rendimiento, a largo
plazo de anticuerpos recombinantes, es útil la expresión estable.
Por ejemplo, pueden producirse líneas celulares que expresan de
manera estable un anticuerpo de interés transfectando las células
con un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos
del anticuerpo y la secuencia de nucleótidos de un marcador
seleccionable (por ejemplo, neomicina o higromicina), y
seleccionando la expresión del marcador seleccionable. Tales líneas
celulares modificadas mediante ingeniería pueden ser útiles en el
cribado y evaluación de compuestos que interaccionan directa o
indirectamente con la molécula de anticuerpo.
Los niveles de expresión de la molécula de
anticuerpo pueden aumentarse mediante amplificación de vectores
(para una revisión, véase Bebbington y Hentschel, The use of vectors
based on gene amplification for the expression of cloned genes in
mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nueva York,
1987)). Cuando puede amplificarse un marcador en el sistema de
vector que expresa el anticuerpo, el aumento en el nivel de
inhibidor presente en el cultivo de la célula huésped aumentará el
número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada
está asociada con el gen del anticuerpo, también aumentará la
producción del anticuerpo (Crouse et al., 1983, Mol. Célula.
Biol. 3:257).
La célula huésped puede contransfectarse con dos
vectores de expresión de la invención, codificando el primer vector
para un polipéptido derivado de la cadena pesada y codificando el
segundo vector para un polipéptido derivado de la cadena ligera.
Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos
que permiten la misma expresión de polipéptidos de cadena pesada y
ligera. Alternativamente, puede utilizarse un único vector que
codifica tanto para los polipéptidos de la cadena pesada como de la
ligera. En tales situaciones, debe colocarse la cadena ligera antes
de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre
tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias codificantes para las
cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que se ha expresado de manera
recombinante la molécula de anticuerpo de la descripción, puede
purificarse mediante cualquier método conocido en la técnica para
la purificación de una molécula de anticuerpo, por ejemplo,
mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio
iónico, cromatografía de afinidad tal como con proteína A o un
antígeno específico, y cromatografía en columna de distribución por
tamaño), centrifugación, solubilidad diferencial, o mediante
cualquier otra técnica habitual para la purificación de
proteínas.
Alternativamente, puede purificarse fácilmente
cualquier proteína de fusión utilizando un anticuerpo específico
para la proteína de fusión que se está expresando. Por ejemplo, un
sistema descrito por Janknecht et al. permite la rápida
purificación de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas
en líneas celulares humanas (Janknecht et al., 1991, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema,
el gen de interés se subclona en un plásmido de recombinación de
vaccinia de tal manera que el marco de lectura abierto del gen se
fusiona de manera traduccional a la cola
amino-terminal que consiste en seis residuos de
histidina. La cola sirve como un dominio de unión a la matriz para
la proteína de fusión. Se cargan extractos de células infectadas
con virus vaccinia recombinante en columnas de Ni^{2+}-ácido
nitriloacético-agarosa y se eluyen selectivamente
proteínas con colas de histidina con tampones que contienen
imidazol.
En otra realización, los anticuerpos de la
descripción o fragmentos de los mismos, se conjugan con un resto de
diagnóstico o terapéutico. Los anticuerpos pueden usarse para
diagnóstico o para determinar la eficacia de un régimen de
tratamiento dado. Puede facilitarse la detección acoplando el
anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias
detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos,
materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales
bioluminiscentes, núclidos radiactivos, metales que emiten
positrones (para su uso en tomografía por emisión de positrones), e
iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. Véase, generalmente
la patente estadounidense número 4.741.900 para iones metálicos que
pueden conjugarse con anticuerpos para su uso como agentes de
diagnóstico según la presente descripción. Las enzimas adecuadas
incluyen peroxidasa del rábano, fosfatasa alcalina,
beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos
prostéticos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina;
los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona,
fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,
diclorotriazinilaminofluoresceína, cloruro de dansilo y
ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen
luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen
luciferasa, luciferina y acuorina; y los núclidos radiactivos
adecuados incluyen ^{125}I, ^{131}I, ^{111}In y ^{99}Tc.
Los anticuerpos de la descripción o fragmentos
de los mismos pueden conjugarse a un agente terapéutico o resto
farmacológico para modificar una respuesta biológica dada. El agente
terapéutico o resto farmacológico no ha de interpretarse como
limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo,
el resto farmacológico puede ser una proteína o polipéptido que
tiene una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden
incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A,
exotoxina de pseudomonas o la toxina diftérica; una proteína tal
como el factor de necrosis tumoral,
\alpha-interferón,
\beta-interferón, factor de crecimiento nervioso,
factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del
plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente
antiangiogénico, por ejemplo angiostatina o endostatina; o, un
modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina,
interleucina-1 (IL-1),
interleucina-2 (IL-2),
interleucina-6 (IL-6), factor
estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos
(GM-CSF), factor estimulante de colonias de
granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso
(NGF) u otro factor de crecimiento.
Se conocen bien las técnicas para conjugar tal
resto terapéutico con anticuerpos, véase, por ejemplo, Arnon et
al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In
Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,
Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R.
Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug
Delivery", en Controlled Drug Delivery (2ª Ed.), Robinson et
al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc.
1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer
Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And
Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs.
475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future
Prospective Of The Therapeutic Use De Radiolabeled Antibody In
Cancer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection
And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs.
303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et
al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of
Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev.,
62:119-58 (1982).
Alternativamente, puede conjugarse un anticuerpo
a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de
anticuerpo según se describe por Segal en la patente estadounidense
número 4.676.980.
Puede usarse un anticuerpo con o sin un resto
terapéutico conjugado a él como un agente terapéutico que podría
administrarse solo o en combinación con factor(es)
citotóxico(s) y/o citocina(s).
La presente descripción no sólo se refiere a los
péptidos, su uso y administración en vehículos farmacéuticamente
aceptables que los comprenden, sino también a métodos de uso de los
péptidos y los motivos según se describe en ella.
Más específicamente, la presente descripción
presenta una utilización para varios métodos en los que los péptidos
descritos en ella se usan para los siguientes fines:
(1) Un método de identificación de un
polipéptido o proteína que interacciona con PP1, que comprende:
detectar en la secuencia de dicho polipéptido o proteína, la
presencia de dos motivos M1 y M2 de unión a PP1.
(2) Un método de cribado de compuestos que
interaccionan con reguladores de PP1, que comprende:
- (a)
- inmovilizar péptidos descritos en el presente documento sobre un soporte; y
- (b)
- someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos péptidos inmovilizados.
(3) Un método de cribado de compuestos que
interaccionan con PP1, que comprende:
- (a)
- obtener anticuerpos frente a péptidos dentro de la descripción de la presente invención; y
- (b)
- someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos anticuerpos.
(4) Un método para someter a prueba moléculas
que inhiben o intensifican la actividad de PP1 o cambian su
ubicación mediante interacción, comprendiendo dicho método:
- (a)
- inmovilizar los péptidos descritos en ella sobre un soporte; y
- (b)
- someter a prueba la interacción de dichos compuestos con dichos péptidos inmovilizados.
Además de métodos, la presente descripción se
refiere a kits. Los kits comprenden, pero no se limitan a, péptidos
o conjuntos de péptidos que imitan a ambos motivos M1 y M2 y que
pueden inhibir las interacciones Bcl-x_{L}/PP1c,
Bcl-w/PP1c o Bcl-2/Bad/PP1c, en las
que el motivo M1 tiene la secuencia
FXX[RK]X[RK], y el motivo M2 tiene la
secuencia [RK]VX[FW] o [RK]XVX[FW], en
las que X es cualquier aminoácido. Tales kits pueden comprender,
por ejemplo, los péptidos R (NWGRIVAFFSF) y F (GDEFELRYRRAF). Estos
péptidos pueden inmovilizarse sobre cualquier soporte sólido,
descrito anteriormente, y que incluye resinas, pocillos Microstar,
pastillas de vidrio y similares.
Aún en otra realización, la presente descripción
se refiere a un kit que contiene anticuerpos frente a péptidos que
imitan ambos motivos M1 y M2 y que pueden inhibir las interacciones
Bcl-x_{L}/PP1c, Bcl-w/PP1c o
Bcl2/Bad/PP1c. Estos anticuerpos pueden haberse producido frente a
los péptidos R (NWGRIVAFFSF) y F (GDEFELRYRRAF), los análogos de
estos péptidos o sus equivalentes funcionales.
Además de los péptidos o los anticuerpos, los
kits de la presente descripción también incluyen reactivos para
interpretar la interacción. Tales reactivos se conocen en la técnica
y se describieron anteriormente y en Sambrook (véase
anteriormente).
Aún en otra realización, la presente invención
se refiere a un método de cribado de células para hallar
interacciones con PP1 en las células, comprendiendo dicho método o
bien usar anticuerpos frente a los motivos M1 y M2 o bien péptidos
que incluyen estos motivos o sus equivalentes funcionales.
Por tanto, la presente descripción se refiere
también a un nuevo tratamiento con un fármaco derivado de fosfatasa
basado en la administración intracelular de péptidos con una
secuencia o secuencias que rodean los sitios de unión a PP1/PP2
(motivos M1 y M2) identificados en algunas proteínas de interacción.
Este enfoque de tratamiento farmacológico, derivado de la genética
química (Gura, 2000), inhibiría específicamente la interacción de
algunas proteínas diana médicamente importantes con PP1/PP2A.
Esta estrategia terapéutica, denominada
"bloqueo de la expresión peptídica" ("peptidic knockout")
de las rutas de PP1/PP2 tiene su base en dos resultados recientes.
El primer resultado fue la identificación de una supuesta secuencia
distintiva de PP1. Por tanto, a partir de la caracterización de dos
motivos de unión a PP1 diferentes en proteínas
Bcl-2 y su existencia en la mayoría de las proteínas
de unión a PP1, puede concluirse que la presencia combinatoria de
los motivos puede usarse como una secuencia distintiva predictiva
para la unión a PP1. Por tanto, el sitio web denominado "PP1
signature" ("secuencia distintiva de PP1") (en preparación
en el Instituto Pasteur) que contiene todas las supuestas secuencias
de PP1 derivadas de una biblioteca Swisprot puede usarse para
identificar supuestas dianas de unión a PP1 de interés.
El segundo resultado fue la identificación de
sitios de unión a PP2A en cinco proteínas. Se mapearon recientemente
los sitios de unión a PP2A de una Vpr codificada por un virus
(VIH-1) y una Ck2a parasitaria codificada por
Theileria. A partir de los datos obtenidos, puede afirmarse que la
administración intracelular de algunos péptidos que imitan a estas
secuencias de unión a PP2A conduce a apoptosis en células de tumores
(Hela, Jurkat, S) o infectadas (Vpr o VIH-1 o
Theileria).
Los siguientes ejemplos pueden llevarse a cabo
utilizando los materiales y métodos descritos a continuación:
Ts1\alpha\beta es una línea de células T
murinas que expresan las cadenas \alpha y \beta del receptor de
la IL-2 (Pitton et al, 1993) que puede
propagarse independientemente en IL-2,
IL-4 o IL-9. Las células se
cultivaron en medio RPMI-1640 complementado con un
5% de suero bovino fetal inactivado por calor, glutamina 2 mM,
Hepes 10 mM, arginina 0,55 mM, asparagina 0,24 mM,
2-ME 50 \muM y 60 U/ml de
IL-4.
Se utilizó rIL-4 murina o
sobrenadante de una sublínea de HeLa transfectada con
pKCRIL-4.neo como una fuente de
IL-4 murina. Los anticuerpos
anti-Bcl-x_{L} y
anti-Bcl-w procedían de Calbiochem
(La Jolla, CA), Transduction Laboratories (Lexington, KY) o
StressGen Biotechnology (Victoria, Canadá).
Anti-PP1c específico procedía de UBI (Lake Placid,
NY), Calbiochem o Transduction Laboratories. El anticuerpo
anti-histonas procedía de Chemicon International
(Temecula, CA). El anticuerpo anti-proteína
14-3-3 procedía de UBI (Lake Placid,
NY). Las serinas 112 y 136 de anti-Bad procedían de
New England BioLabs (Beverly, MA) y la serina 155 procedía de Cell
Signaling Technology (Beverly, MA). El anticuerpo
anti-Raf procedía de Transduction Laboratories. Los
anticuerpos anti-Pser y pan-Ras
procedían de Calbiochem. La proteína PP1c recombinante procedía de
Calbiochem. Mito 2813 (anti-piruvato deshidrogenasa
mitocondrial) se proporcionó por el Dr. Serrano, Centro Nacional de
Biotecnología (Madrid).
Se estimularon las células (1 x 10^{7}) con, o
se sometieron a carencia de, IL-4 y se lisaron
durante 20 min. a 4ºC en tampón de lisis (Tris HCl 50 mM pH 8,
NP-40 al 1%, NaCl 137 mM, MgCl_{2} 1 mM,
CaCl_{2} 1 mM, glicerol al 10% y cóctel de inhibidores de
proteasa). También se utilizaron tampones libres de detergentes o
digitonina para la inmunoprecipitación. Para el análisis de
fosforilación, también se complementó el tampón con cóctel de
inhibidores de fosfatasa. Los lisados se inmunoprecipitaron con el
anticuerpo apropiado y se añadió la Proteína
A-Sepharose. Alternativamente, se lisaron las
células en el tampón de muestra de Laemmli y se separaron los
extractos de proteínas mediante SDS-PAGE, se
transfirieron a nitrocelulosa, se bloquearon y se incubaron con
anticuerpo primario. Se lavó la membrana y se incubó con anticuerpo
secundario conjugado con PO. Las proteínas se desarrollaron
utilizando la ECL.
Se lisaron las células estimuladas con
IL-4 (1 x 10^{7}) en tampón de lisis, se
inmunoprecipitaron los sobrenadantes con el anticuerpo
correspondiente, seguido por incubación con Proteína A - Sepharose.
Se lavaron los inmunoprecipitados con tampón fosfatasa (Tris HCl 50
mM, pH 7,5, 2-ME al 0,1%, EDTA 0,1 mM y BSA 1 mg/ml)
y se mezclaron con [^{32}P]-fosforilasa a,
diluida en tampón fosfatasa complementado con cafeína. Se incubó la
reacción (40 min. a 30ºC), se paró con 200 \mul de TCA al 20% y
se centrifugó. Se utilizó un total de 185 \mul del sobrenadante
para calcular la generación de fosfato libre liberado de la
[^{32}P]-fosforilasa a.
Se prepararon péptidos que comprendían el motivo
R/K X V/I X F (R) o F X X R X R (F) de Bcl-w y
Bcl-x_{L}, así como los péptidos mutados (véase
la figura 8A para comprobar la secuencia) mediante síntesis
automatizada de spot (mancha) en una membrana de celulosa
aminoderivatizada. Se bloqueó la membrana, se incubó con PP1c
purificada y, tras varias etapas de lavado, se incubó con anticuerpo
anti-PP1c, seguido por anticuerpo secundario
conjugado con PO. Se desarrollaron las manchas utilizando el sistema
de ECL.
Se sintetizaron los péptidos R (NWGRIVAFFSF), F
(GDEFELRYRRAF) o R* (NWGRIAAAFSF) en un sintetizador automatizado
de múltiples péptidos utilizando el procedimiento en fase sólida y
la química habitual de Fmoc. Se confirmaron la pureza y la
composición de los péptidos mediante cromatografía de líquidos de
alta resolución en fase inversa y mediante el análisis de los
aminoácidos.
Se sometió a competencia la interacción
Bcl-w/PP1c y Bcl-x_{L}/PP1c por
los péptidos R, F, o R*. Se inmunoprecipitaron los lisados de las
células estimuladas con IL-4 con el anticuerpo
anti-Bad y se añadió proteína A - Sepharose. Se
sometió a competencia la interacción Bcl-w/PP1c y
Bcl-x_{L}/PP1c mediante la incubación con los
péptidos R, F o R* (30 min., temperatura ambiente). Tras el lavado,
los inmunoprecipitados o bien se sometieron a ensayo para
determinar la actividad fosfatasa de la proteína o bien se
transfirieron a nitrocelulosa y se sometieron a inmunotransferencia
con el anticuerpo correspondiente.
Los análogos del fosfotioato de los
oligonucleótidos de Bcl-x_{L} y
Bcl-w, incluyendo el codón de iniciación ATG, se
adquirieron de Isogen Bioscience. Las secuencias de los
oligonucleótidos sentido y antisentido son las siguientes.
Bcl-x_{L} sentido, ATG TCT CAG AGC AAC;
Bcl-x_{L} antisentido, GTT GCT CTG AGA CAT;
Bcl-w sentido, ATG GCG ACC CCA GCC;
Bcl-w antisentido, GGC TGG GGT CGC CAT.
Se demostró anteriormente que la molécula
antiapoptótica Bcl-2 es una subunidad de selección
como diana de la serina/treonina fosfatasa PP1c en células
TS1\alpha\beta estimuladas con IL-2 y que la
secuencia de Bcl-2 que interacciona con PP1c es el
motivo R/K X V/I X F (Ayllón et al, 2001). Dado que
Bcl-x_{L} y Bcl-w también
contienen el motivo R/K X V/I X F bien conservado observado en
Bcl-2, se investigó la posibilidad de que las
moléculas antiapoptóticas Bcl-x_{L} y
Bcl-w también puedan asociarse a PP1c en las células
TS1\alpha\beta estimuladas con IL-4, que no
expresan Bcl-2 y que expresan
Bcl-x_{L} y Bcl-w. Se realizaron
experimentos de coinmunoprecipitación recíprocos de proteínas
citoplasmáticas en condiciones de estimulación o carencia de
IL-4 utilizando anticuerpos específicos. Se
detectaron PP1c y Bad mediante inmunotransferencia tipo Western
blot en inmunoprecipitados de
anti-Bcl-x_{L} de células
estimuladas con IL-4, disminuyendo a lo largo de
todo el periodo de carencia (figura 1A). La detección con sonda de
la membrana con anticuerpos
anti-Bcl-x_{L} demostró niveles
similares en todas las condiciones analizadas. También se detectaron
PP1c y Bad en inmunoprecipitados de
anti-Bcl-w de células estimuladas
con IL-4, que disminuían tras someter a carencia de
linfocina (figura 1A). La membrana también se sometió a detección
con sonda con el anticuerpo
anti-Bcl-w, mostrando niveles
similares. La inmunoprecipitación para los lisados citoplásmicos con
un anticuerpo irrelevante, anti-cadena p55 de
IL-2R, no pudo detectar esas asociaciones (figura 1
B). De manera similar, se detectaron Bcl-x_{L},
Bcl-w y PP1c en inmunoprecipitados de Bad y también
se observó la interacción entre estas proteínas mediante
inmunoprecipitación de lisados libres de detergentes, así como en
proteínas citoplasmáticas aisladas mediante lisis con digitonina
(datos no mostrados). Estas asociaciones también se observaron en
timocitos recién aislados (figura 1C). Dado que el número de
complejos Bcl-x_{L}/PP1c/Bad y
Bcl-w/PP1c/Bad disminuye tras someter a carencia de
IL-4, se analizó la regulación por disminución de la
expresión de cualquiera de las proteínas implicadas en la formación
del complejo. Por tanto, se analizó la expresión total de
Bcl-x_{L}, Bcl-w, PP1c y Bad en
células TS1\alpha\beta estimuladas con, o sometidas a carencia
de, IL-4. Todas las proteínas analizadas se
expresaron en las células estimuladas con, o sometidas a carencia
de, IL-4 (figura 2). Como un control interno de la
carga de proteínas, se detectaron con sonda las membranas con un
anticuerpo anti-histonas. Dado que el número de
agregados disminuye tras someter a carencia de IL-4
sin modificación de la expresión total de las proteínas del
complejo, se analizó entonces si las modificaciones tras la
traducción de Bcl-x_{L} o Bcl-w
pueden afectar a la formación del complejo trimolecular. A
continuación se analizó el estado de fosforilación de la serina de
Bcl-x_{L} y Bcl-w. Los extractos
citoplasmáticos de células estimuladas o sometidas a carencia de
IL-4, se inmunoprecipitaron con
anti-Bcl-x_{L} o
anti-Bcl-w y se sometieron a
inmunotransferencia con los anticuerpos específicos
anti-Pser, anti-PP1c,
anti-Bad, anti-Bcl-w
y anti- Bcl-x_{L} (figura 3). Se observó la
fosforilación de serina de Bcl-x_{L} y
Bcl-w en las células estimuladas con
IL-4 control, que disminuía tras someter a carencia
de IL-4. De acuerdo con los resultados de la figura
1, el nivel de Bad y PP1c asociados a Bcl-x_{L} y
Bcl-w disminuye al someter a carencia de linfocina.
Este resultado sugiere una correlación entre la fosforilación de
serina de Bcl-x_{L} y Bcl-w y la
formación de complejos trimoleculares.
Recientemente se demostró que
IL-2, así como IL-3, induce la
fosforilación de serina de Bad (Ayllón et al, 2000). La
figura 4A muestra que IL-4 induce la fosforilación
de Bad en la serina 136 pero no en las serinas 112 y 155. Además,
la carencia de IL-4 induce la desfosforilación de la
serina 136 de Bad. Se utilizaron las células estimuladas con
IL-2 (C, fosforilación de ser 112 y 136) o las
células COS (C, fosforilación de ser 155) que sobreexpresan Bad
como controles positivos. La fosforilación de la serina de Bad
inducida por IL-3 da como resultado su asociación a
la proteína 14-3-3, suprimiendo la
interacción con Bcl-x (Zhou et al, 2000). La
figura 4B muestra que la fosforilación de serina de Bad en respuesta
a IL-4 no da como resultado la unión a la proteína
14-3-3. Esta proteína se detectó en
los extractos totales a partir de las células estimuladas con
IL-4 control (carril T) y no se observó ni en PP1c,
ni en los inmunoprecipitados de Bcl-x_{L} o Bad
de las células estimuladas con, o sometidas a carencia de,
IL-4. Como control interno se muestra la interacción
de Raf y la proteína 14-3-3 en los
inmunoprecipitados de Raf
(figura 4B).
(figura 4B).
La figura 5A muestra la actividad fosfatasa en
los inmunoprecipitados de Bcl-x_{L},
Bcl-w y Bad de células estimuladas con
IL-4. Se midió la actividad enzimática en los
inmunoprecipitados utilizando fosforilasa marcada con ^{32}P como
sustrato. Es interesante observar que la actividad fosfatasa
detectada en los inmunoprecipitados de Bcl-x_{L}
y Bcl-w corresponde casi a la actividad fosfatasa
observada en los inmunoprecipitados de Bad. Para confirmar que esta
actividad fosfatasa se debía a PP1c, se estimó la actividad
enzimática en los inmunoprecipitados de Bad o Bcl-w
de las células estimuladas con IL-4 en presencia de
diferentes concentraciones de ácido ocadaico (AO) (figura 5B). Las
concentraciones de AO que inhiben la actividad tipo 2A (10^{-9} M)
no tenían efecto sobre la actividad fosfatasa asociada a Bad o
Bcl-w in vitro. La adición de AO 10^{-8} M
a los inmunoprecipitados de Bcl-w o Bad da como
resultado la inhibición de ~ 50% de la actividad fosfatasa, que se
reduce fuertemente tras la adición de AO 10^{-6} M (figura 5B).
También se estimó el efecto del AO sobre la actividad fosfatasa en
sobrenadantes de los inmunoprecipitados de Bad y
Bcl-w. Las concentraciones del AO que no tenían
efecto sobre la actividad enzimática en los inmunoprecipitados de
Bad y Bcl-w (10^{-9} M) muestran una inhibición
de ~50% en el sobrenadante, tal como se esperaba a partir de una
asociación de las actividades de tipo 1 y tipo 2A (figura 5B). El
efecto selectivo del AO sugiere que la actividad fosfatasa observada
en los inmunoprecipitados de Bad y Bcl-w es
PP1c.
Recientemente se demostró que
Bcl-2 es una subunidad de selección como diana de
PP1c (Ayllón et al, 2001). Dado que Bcl-w y
Bcl-x_{L} también se asocian a PP1c y que la
secuencia del sitio de unión de Bcl-2 a PP1c está
conservada en Bcl-x_{L} y Bcl-w,
se lanzó la hipótesis de que estas moléculas antiapoptóticas pueden
ser nuevas subunidades de selección como diana de PP1c. Para probar
esta hipótesis, se redujo Bcl-x_{L} y
Bcl-w mediante la inmunoprecipitación secuencial de
anti-Bcl-x_{L}+Bcl-w
de los extractos citoplasmáticos de las células estimuladas con
IL-4. Se inmunoprecipitó el sobrenadante de la
cuarta inmunoprecipitación de
anti-Bcl-x_{L}+Bcl-w
con el anticuerpo anti-Bad (5º) y se estimó la
actividad fosfatasa (figura 6A). Se detectaron trazas de la
actividad fosfatasa asociada a Bad en los extractos con reducción de
Bcl-x_{L} y Bcl-w, en comparación
con el alto nivel de actividad observado en los inmunoprecipitados
de anti-Bad control de las células estimuladas con
IL-4. Dado que en ausencia de
Bcl-x_{L} y Bcl-w no se detectó
una actividad fosfatasa asociada a Bad significativa, se investigó
la posibilidad de que estas moléculas antiapoptóticas puedan
controlar el direccionamiento de PP1c a Bad. Para este fin, se
obtuvieron inmunoprecipitaciones de anti-Bad en
extractos citoplasmáticos de células estimuladas con
IL-4 o en extractos con reducción de
Bcl-x_{L} y Bcl-w (5º). Se
detectaron PP1c, Bcl-x_{L} y Bcl-w
en los inmunoprecipitados de anti-Bad control y no
se observaron en los inmunoprecipitados de anti-Bad
procedentes de los extractos con reducción de
Bcl-x_{L} y Bcl-w (figura 6B). En
un experimento recíproco, se detectaron Bad,
Bcl-x_{L} y Bcl-w en
inmunoprecipitados de anti-PP1c de células control
y no se observaron en inmunoprecipitados de PP1c procedentes de
extractos con reducción de Bcl-x_{L} y
Bcl-w (figura 6B). Este resultado sugiere que
Bcl-x_{L} y Bcl-w son necesarios
para la asociación de PP1c a Bad.
Se ha descrito que el motivo R/K X V/I X F lo
comparten la mayor parte de las subunidades de selección como diana
de PP1c (21, 23). Se demostró que la subunidad Bcl-2
de selección como diana de PP1c también comparte este motivo
conservado (Ayllón et al, 2001). Resulta interesante que las
secuencias de Bcl-x_{L} y Bcl-w
también contienen este motivo (figura 7B). Para analizar si esta
secuencia de Bcl-xL y Bcl-w estaba
implicada en la unión a PP1c, se generaron péptidos inmovilizados a
nitrocelulosa de las proteínas Bcl-x_{L} y
Bcl-w que contenían este motivo. Se incubó la
membrana con la proteína PP1c purificada. La figura 7B muestra las
secuencias que interaccionan con PP1c. El motivo R/K X V/I X F,
presente en Bcl-x_{L} y Bcl-w,
interacciona con PP1c y su mutación en los residuos V y F críticos
reduce fuertemente la unión de Bcl-x_{L} y
Bcl-w a PP1c (figura 7B). El análisis de los sitios
de unión de Bcl-2 a PP1c mostró, además del motivo
R/K X V/I X F, dos secuencias (FSRRYR y FTARGR, que se unen a PP1c
(Ayllón et al, 2001). Resulta interesante que también se
observaran secuencias similares en Bcl-x_{L} y
Bcl-w (figura 7A). Las secuencias FELRYR y FETRFR de
Bcl-x_{L} y Bcl-w,
respectivamente, también interaccionan con PP1c y su mutación inhibe
la unión a PP1c, aunque la afinidad depende del tipo de mutación
puntual (figura 7B). Se determinó el motivo consenso de interacción
F X X R X R mediante la comparación de las secuencias de
Bcl-2, Bcl-x_{L} y Bcl-w.
Bcl-2, Bcl-x_{L} y Bcl-w.
Para confirmar de manera concluyente que los
motivos R/K X V/I X F y F X X R X R participan en la unión de
Bcl-x_{L} y Bcl-w a PP1c, se
llevaron a cabo experimentos de competencia en complejos
trimoleculares. Se inmunoprecipitaron lisados de células
estimuladas con IL-4 con anticuerpos
anti-Bad y se hizo competir la interacción
Bcl-x_{L}/PP1c y Bcl-w/PP1c usando
los péptidos R*(NWGRIAAAFSF), R (NWGRIVAFFSF) o F (GDEFELRYRRAF)
(figura 8A). Se detectaron Bcl-xL,
Bcl-w y PP1c en los inmunoprecipitados de
anti-Bad control, así como en los
inmunoprecipitados de anti-Bad tratados con el
péptido R*. La cantidad de Bcl-x_{L},
Bcl-w y PP1c asociados a Bad disminuye tras la
competencia con el péptido F o R, siendo casi indetectable con la
competencia de los inmunoprecipitados de Bad con los péptidos F+R
(figura 8A). Se observa un nivel similar de Bad en los
inmunoprecipitados de anti-Bad control o tratados
con péptido. Finalmente, para confirmar que
Bcl-x_{L} y Bcl-w son subunidades
de selección como diana de PP1c, se estimó la actividad fosfatasa en
los inmunoprecipitados de Bad control o tratados con péptido. Se
detectó la actividad fosfatasa en los inmunoprecipitados control o
en los tratados con péptido R* (figura 8B), disminuyendo con la
competencia de la interacción con los péptidos F o R. La actividad
enzimática disminuyó fuertemente con la competencia con los péptidos
R y F. Como control interno, la figura 8C muestra la actividad
fosfatasa en los inmunoprecipitados de Bad control o tratados con
péptido. La concentración del péptido F o R usada fue el doble de
la concentración utilizada en los inmunoprecipitados tratados con
el péptido F+R. Al igual que en la figura 8B, la actividad fosfatasa
se redujo drásticamente con el tratamiento de los
inmunoprecipitados de Bad con los péptidos F+R. Tomados juntos,
estos resultados ilustran que Bcl-x_{L} y
Bcl-w, así como Bcl-2, son
subunidades de selección como diana de PP1c.
Dado que la carencia de IL-4 se
correlaciona con la desfosforilación de Bad y con la apoptosis, se
lanzó la hipótesis de que la inhibición de la actividad fosfatasa
mediante el tratamiento con ácido ocadaico (AO) puede evitar la
desfosforilación de Bad y la apoptosis. El tratamiento de las
células con AO 1 \muM en ausencia de IL-4 evitó
la desfosforilación de Bad en la serina 136 (figura 9A). No se
observó ningún cambio en la expresión total de Bad tras el
tratamiento con AO, lo que sugiere que el AO no afecta a la
expresión de la proteína. Además, las células con carencia de
IL-4 tratadas con AO 1 \muM durante 6 h mostraron
una reducción significativa en la fracción de células apoptóticas
en comparación con las células no tratadas (figura 9B). Finalmente,
la inhibición de la expresión de Bcl-x_{L} y
Bcl-w mediante el tratamiento con oligonucleótidos
antisentido de las células también induce la apoptosis en las
células estimuladas con IL-4 (figura 9C). Se estimó
la inhibición de la expresión de Bcl-x_{L} y
Bcl-w mediante el tratamiento con oligonucleótidos
antisentido mediante inmunotransferencia de tipo Western blot.
La presencia combinatoria de estos dos motivos
de unión de PP1 sugiere un mecanismo general en el que la unión
secuencial a PP1c a través de uno de estos motivos puede favorecer
la unión a través del segundo motivo y permitir la función
catalítica. Además, estos motivos también podrían representar una
secuencia distintiva predictiva para identificar las posibles
nuevas proteínas de unión a PP1. Para probar parcialmente este
concepto, se llevó a cabo un análisis bioinformático utilizando el
programa "prosa" (Katja Shuerer, IP) en la biblioteca
Swissprot Release 40 (octubre de 2001) que contiene 101602
secuencias de proteínas no redundantes.
Tal como se muestra en la tabla 1A, la búsqueda
para determinar la presencia de un solo consenso indica que el
19,47% de las secuencias en la biblioteca contiene los motivos
[RK]VxF o [RK]xVxF y que el 16% contiene el motivo de
tipo Bcl-2,
F-x-x-[RK]-x-[RK].
Por el contrario, de manera consecuente con la noción de la
secuencia distintiva predictiva, el análisis de la presencia
combinatoria de ambos motivos de unión de PP1, [RK]VxF o
[RK]xVxF y
F-x-x-[RK]-x-[RK],
sólo reveló 4013 secuencias positivas, correspondientes al 3,94% de
la biblioteca (tabla 1B). Además, si se aplica la equivalencia F =
W (normalmente aceptada para los motivos
[RK]Vx[FW]/[RK]xVx[FW]), se encontraron
4783 secuencias positivas correspondientes al 4,7 de la biblioteca.
Además, la equivalencia ocasional entre R/K y Q aumenta ligeramente
el número de proteínas positivas (5769 secuencias correspondientes
al 5,67%).
Además, tal como se esperaba, estas secuencias
incluyen todas las proteínas conocidas que interaccionan con PP1 de
la familia de Bcl-2 (no mostrada). En conjunto, este
análisis indica que aproximadamente el 5% de las secuencias de las
proteínas comparten los dos supuestos motivos de unión a PP1 en su
secuencia. Resulta interesante que el análisis estadístico sugiere
que la distancia que separa los dos motivos de unión a PP1 comprende
entre 0 y 180 aa para el 50% de las proteínas (figura 11). Además,
un análisis más detallado revela un pico principal que representa
el 22,3% de las secuencias positivas (897 secuencias para un total
de 4013) que corresponden a un intervalo de 0-50 aa
entre los dos motivos. Estos datos concuerdan con la observación de
que una distancia de 36 aa separa los dos motivos de unión en los
dominios BH1 y BH3 de las proteínas
Bcl-2/Bcl-w y
Bcl-x_{L} (no mostrados).
Partiendo de la base de este análisis, el
Instituto Pasteur está creando y mantendrá en orden un nuevo
sitio web "PP1 signature" que contiene todas las secuencias
seleccionadas de la biblioteca de Swissprot Release 40
correspondientes a proteínas que albergan los dos motivos de unión a
PP1. Mediante la simple introducción del nombre de una proteína o
un número de registro o a través de un análisis con BLAST, se
conocerá inmediatamente si la proteína tiene una supuesta secuencia
distintiva de PP1. Además, el usuario identificará inmediatamente la
secuencia que engloba los dos supuestos motivos de unión a PP1.
Las proteínas de unión a PP1 más caracterizadas
comparten los dos motivos y pueden identificarse en el sitio web
(tabla 2). Para validad esta propuesta de "estrategia de secuencia
distintiva predictiva", se seleccionaron aleatoriamente cuatro
candidatos y se confirmó su asociación con PP1 mediante simples
experimentos de coinmunoprecipitación (figura 10B).
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\vskip1.000000\baselineskip
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Los depósitos de amiloide fibrilar definen
lesiones patológicas en enfermedades cerebrales de tipo Alzheimer y
se cree que median en la muerte neuronal. El amiloide está compuesto
por un fragmento de proteína de 39 a 42 aminoácidos de la proteína
precursora amiloide (APP). Dado que se ha mostrado que la deposición
de amiloide fibrilar in vitro depende de la concentración de
APP, reducir o inhibir la liberación de APP es un objetivo
terapéutico.
El precursor \beta-amiloide
(APP) se sobreexpresa en células PC12 tratadas mediante NGF,
mediante transfección de un ADNc que codifica para el precursor
\beta-amiloide (APP) según los métodos de Sambrook
et al., mencionado anteriormente.
Entonces se incuban las células que expresan el
precursor \beta-amiloide con un péptido de
penetración correspondiente al sitio de unión a PP1 punitivo tal
como el motivo M1 que tiene la secuencia
FXX[RK]X[RK] y el motivo M2
[RK]VX[FW] o [RKXVX[FW], en los que X es
cualquier aminoácido.
Se somete a prueba la presencia de amiloide
usando anticuerpos monoclonales o un
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> INSTITUTO PASTEUR
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODOS DE CRIBADO DE PROTEÍNAS O
POLIPÉPTIDOS QUE INTERACCIONAN CON PP1, PÉPTIDOS QUE INHIBEN LA
UNIÓN DE PP1c A LAS PROTEÍNAS DE Bcl-2,
BCL-XL Y BCL-W, Y USOS DE LOS
MISMOS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> B5324 - JAZ/VMA/VG
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Nueva solicitud de patente
internacional
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
06-05-2002
\vskip0.400000\baselineskip
<150> Documento EP 02291170.5
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<151>
07-05-2002
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip0.5cm
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<210> 50
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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<400> 50
\hskip0.5cm
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<210> 51
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip0.5cm
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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<400> 52
\hskip0.5cm
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<211> 12
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<213> SINTÉTICA
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\hskip0.5cm
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\hskip0.5cm
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\hskip0.5cm
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<213> SINTÉTICA
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\hskip0.5cm
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\hskip0.5cm
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<213> SINTÉTICA
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<400> 59
\hskip0.5cm
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<213> SINTÉTICA
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\hskip0.5cm
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\hskip0.5cm
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<400> 64
\hskip0.5cm
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<400> 67
\hskip0.5cm
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<211> 13
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<400> 68
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
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<211> 23
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<400> 69
\hskip0.5cm
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<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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<400> 70
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
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<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
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<211> 19
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
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<211> 24
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<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
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<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip0.5cm
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<210> 74
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<211> 20
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<213> SINTÉTICA
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
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<211> 6
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<213> SINTÉTICA
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip0.5cm
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<213> SINTÉTICA
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 80
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 82
\hskip0.5cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> SINTÉTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip0.5cm
Claims (17)
1. Polipéptido que tiene tanto los motivos M1
como M2 y que puede inhibir la interacción
Bcl-x_{L}/PP1c, en el que el motivo M1 tiene la
secuencia NWGRIVAFFSF y el motivo M2 tiene la secuencia
GDEFELRYRRAF, en el que dicho polipéptido tiene dos o más motivos M1
o M2 que tienen un espaciador entre ellos.
2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que dicho polipéptido está glucosilado, acetilado, fosforilado o
amidado.
3. Polipéptido según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el polipéptido tiene de 2 a 10
motivos.
4. Polipéptido según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que el espaciador tiene de 2 a 5
motivos.
5. Polipéptido según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho espaciador es una secuencia
de aminoácidos o una cadena hidrocarbonada interrumpida por enlaces
covalentes.
6. Polipéptido según la reivindicación 5, en el
que dicho espaciador tiene desde 1 hasta 50 aminoácidos.
7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el
que dicho espaciador tiene 36 aminoácidos.
8. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que dicho espaciador es una entidad química que conecta los dos o
más motivos.
9. Polipéptido según la reivindicación 1, en el
que el espaciador contiene secuencias reguladoras entre los dos o
más motivos.
10. Ácido nucleico aislado que codifica para el
polipéptido según la reivindicación 1 o una secuencia de ácido
nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con dicho ácido
nucleico que codifica para dicho polipéptido.
11. Vector que comprende el ácido nucleico según
la reivindicación 10.
12. Compuesto farmacéutico que comprende el
polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
13. Composición farmacéutica que comprende un
ácido nucleico que codifica para los polipéptidos según las
reivindicaciones 1 ó 2.
14. Composición farmacéutica que comprende el
vector según la reivindicación 11.
15. Uso del polipéptido según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, para la preparación de un medicamento
para tratar o prevenir la diabetes, la hipertensión arterial, un
trastorno neurológico, una enfermedad viral o una infección
microbiana asociada con PP1.
16. Uso según la reivindicación 15, en el que el
trastorno neurológico es la enfermedad de Parkinson o la enfermedad
de Alzheimer.
17. Uso según la reivindicación 15, en el que la
enfermedad viral es VIH-1.
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