CN106456699B - 作为抗老化剂抑制抗凋亡的Bcl-2蛋白的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开内容提供了用于选择性地杀死衰老细胞的组合物和方法，其中所述选择性地杀死衰老细胞延迟老化和治疗年龄相关病症。

Description

作为抗老化剂抑制抗凋亡的Bcl-2蛋白的组合物和方法

政府权利

本发明在NIH授予的R01 CA122023的政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年5月5日提交的第61/988,705号美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明涉及Bcl-2抑制剂及其用于治疗和预防与老化期间衰老细胞的积累相关的疾病和病理的方法，所述疾病和病理例如癌症、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨关节炎、动脉粥样硬化、神经变性疾病、糖尿病及许多其他疾病。本发明还涉及含有这些化合物的药物组合物及其各种用途。

发明背景

年龄是许多人类疾病的主要风险因素，这样的人类疾病包括大多数癌症、动脉粥样硬化、神经变性疾病、糖尿病及许多其它疾病。越来越多的证据表明老化与衰老细胞的积累有关。当细胞变得衰老时，其失去其生殖功能，这可能导致组织变性。此外，衰老细胞产生增加水平的自由基和各种炎症介质，其可诱导组织损伤和细胞转化。因此，衰老细胞的选择性耗尽可能是一种新的抗老化策略，其可预防与老化相关的癌症及各种人类疾病，并使身体恢复活力从而在寿命期间活得更健康。这一假设得到了最近的一项研究的支持，该研究显示通过遗传方法选择性耗尽BubR1类固醇小鼠模型中的衰老细胞导致各种年龄相关病理和病症的延迟。然而，没有可以选择性耗尽衰老细胞的药物。因此，需要选择性耗尽衰老细胞的方法。

发明概述

在一个方面，本发明包括选择性地杀死细胞样品中的衰老细胞的方法。该方法包括检测细胞样品中的衰老细胞，向所述细胞施用包含Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物，其中所述抑制剂选择性地杀死衰老细胞，并测量衰老细胞的细胞死亡。

在另一方面，本发明包括一种延迟受试者的老化的至少一个特征的方法。所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物。

在又一方面，本发明包括治疗年龄相关的疾病或病状。所述方法包括向有此需要的受试者施用包含治疗有效量的Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物。

在另一方面，本发明包括一种杀死治疗诱导的衰老细胞的方法。所述方法包括向已经接受DNA损伤治疗的受试者施用包含治疗有效量的Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物，和在DNA损伤治疗后杀死正常组织和肿瘤组织中治疗诱导的衰老细胞。

附图简述

本申请文件包含至少一幅彩色附图。应要求并在缴纳必需的费用后，官方将提供具有彩色附图的本专利申请公开的副本。

图1A-I描绘了显示ABT263以剂量依赖性和时间依赖性方式但细胞类型非依赖性和种类非依赖性方式选择性地杀死培养物中的衰老细胞的图。(图1A-D)ABT263剂量依赖性地杀死通过电离辐射(IR-SC；图1B)、复制性耗尽(Rep-SC；图1C)或表达致癌性Ras(Ras-SC；图1D)来诱导衰老的人WI-38成纤维细胞(WI-38)，但对非衰老WI-38细胞具有细胞毒性(NC；图1A)。(图1E-F)ABT263以时间依赖性方式杀死IR诱导的衰老WI-38细胞(IR-SC)。在用1.25μM ABT263孵育细胞指定的小时数(图1E)或用1.25μM ABT263孵育细胞指定的持续时间72小时(图1F)后，对活细胞进行定量。(图1G-H)ABT263以剂量依赖性、但细胞类型非依赖性和种类非依赖性方式杀死IR诱导的衰老细胞(IR-SC)，但不杀死非衰老细胞(NC)。在用增加浓度的ABT263处理细胞72小时后对活细胞进行定量。(图1G)IMR-90，人IMR-90成纤维细胞；(图1H)REC，人肾上皮细胞(REC)；(图1I)MEF，小鼠胚胎成纤维细胞。给出的数据是来自3次或更多次独立实验的活细胞的平均值±SEM，作为占无ABT263处理的对照的百分比。*，p＜0.05；**，p＜0.01；和***，p＜0.001，相对于无ABT263，图1A-F；和**，p＜0.01；***，p＜0.001；以及***，p＜0.001，相对于用相同浓度的ABT263处理的它们各自的NC，图1G-I。图1A-F为单因素方差分析，图1G-I为双向方差分析。

图2A-N描绘了显示ABT263通过凋亡杀死衰老细胞的图形、流式细胞术图和蛋白质印迹。(图2A-B)ABT263以半胱天冬酶依赖性方式诱导IR诱导的衰老性WI38细胞的凋亡。(图2A)在存在或不存在泛半胱天冬酶抑制剂Q-VD-Oph(QVD，20μM)的情况下，用载剂(VEH)或1.25μM ABT263处理24小时的IR诱导的衰老性WI-38细胞凋亡的代表性流式细胞术分析。II＝活细胞(PI^-和膜联蛋白V^-)；III＝早期凋亡细胞(PI^-和膜联蛋白V⁺)；和IV＝晚期凋亡细胞(PI⁺和膜联蛋白V⁺)。(图2B)来自图2A的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的存活百分比。在另外两个实验中观察到了类似的结果。(图2C)通过QVD的半胱天冬酶抑制消除了IR诱导的衰老WI-38细胞中ABT263诱导的细胞死亡。如图2A处理72小时后对活细胞进行定量。(图2D)在非衰老WI-38细胞(NC)或IR诱导的衰老WI-38细胞(IR-SC)中，ABT263不活化半胱天冬酶8和受体相互作用蛋白1(RIP1)。用载剂(VEH)或1.25μM ABT263(ABT)处理细胞24小时，并通过western印迹分析裂解物。CTL是使用来自用25μM etopide处理6小时的Jurkat细胞的裂解物的阳性对照。Procasp-8，procaspase-8；cCasp-8，切割的半胱天冬酶-8；以及cRIP1，裂解RIP1。(图2E-F)ABT263选择性地活化IR诱导的衰老WI-38细胞(IR-SC)中但不是非衰老WI-38细胞(NC)中的半胱天冬酶3。用载剂(VEH)或1.25μM ABT263(ABT)处理细胞24小时。半胱天冬酶酶原-3(Procasp-3)、切割的半胱天冬酶-3(cCasp-3)和β-肌动蛋白的代表性western印迹示于图2E，相对于β-肌动蛋白的半胱天冬酶酶原3表达的光密度测定定量示于图2F。CTL是使用来自用0.25mg/ml细胞色素C处理1小时的Jurkat细胞的细胞裂解物的阳性对照。(图2G)将WI-38细胞暴露于IR以时间依赖性方式提高衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性和对ABT263的敏感性。空心棒显示暴露于10Gy IR后SA-β-gal⁺细胞在不同时间的百分比。黑色条显示在辐射并用1.25μM ABT263孵育72小时后在不同时间获取经辐射的细胞后活细胞的百分比。(图2H-K)在暴露于来自图7A中呈现的分析的10Gy IR之后的各个时间，WI-38细胞中Bcl-2(图2H)、Bcl-x1(图2I)、Bak(图2J)和Bax(图2K)表达的Western分析的光密度测定定量。(图2L-M)需要抑制Bcl-2和Bcl-x1两者以选择性地杀死衰老细胞。用载剂(VEH)、5μM ABT 199、0.5μM WEHI539或ABT199加WEHI539孵育非衰老(NC；图2L)和IR诱导的衰老(IR-SC；图2M)细胞72小时后测定WI-38活细胞。(图2N)需要敲减Bcl-2和Bcl-x1两者以选择性地杀死衰老细胞。在用携带对照shRNA(CTL)、Bcl-2shRNA、Bcl-x1 shRNA或Bcl-2和Bcl-x1 shRNA的慢病毒感染非衰老(NC)细胞和IR诱导的衰老(IR-SC)细胞72小时后测定WI38活细胞。数据表示为3次独立实验的平均值±SEM，图2N中的那些除外。其中n＝5.*，p＜0.05；**，p＜0.01；***，p＜0.001；和****，p＜0.0001相对于它们各自的对照。图2H-K为单向方差分析。图2C、2F、图2G、图2L-N为双向方差分析。

图3A-J描绘了显示ABT263与更昔洛韦(ganciclovir)一样有效地在TBI p16-3MR小鼠中清除衰老细胞并抑制衰老相关分泌表型(SASP)的示意图像和图表。(图3A)示出了实验设计的图。简言之，将2月龄的雄性p16-3MR小鼠组进行假辐射(CTL)或暴露于6Gy TBI。辐射后16周，它们接受载剂(VEH)、更昔洛韦(GCV，25mg/kg/d，每周期5天，ip)或ABT263(ABT，50mg/kg/每周期，po)的2个周期的处理，治疗周期之间的间隔为2周。处理次日，按照方法中所述对全身发光进行定量。第二天，对小鼠实施安乐死以获取肺用于组织发光定量，并通过qRT-PCR分析p16、IL-1α、TNFα，CCL-5和CXCL-10 mRNA水平。(图3B-C)全身发光成像显示ABT263可以与更昔洛韦一样有效地清除TBI p16-3MR小鼠中的衰老细胞。对照(CTL)和TBIp16-3MR小鼠(TBI)的代表性发光图像示于图3B。包括正常野生型C57BL/6小鼠(WT)作为用于成像的阴性对照。全身发光定量示于图3C。(图3D-F)ABT263可以与更昔洛韦一样有效地清除TBI p16-3MR小鼠肺中的衰老细胞。来自对照(CTL)和TBI p16-3MR小鼠(TBI)的肺的代表性发光图像示于图3D。肺发光定量示于图3E。p16 mRNA在肺中的表达示于图3F。(图3G-J)肺中IL-1α(图3G)、TNFα(图3H)、CCL-5(图3I)和CXCL-10(图3J)mRNA水平的分析证明，ABT263和更昔洛韦在抑制p16-3MR小鼠中TBI诱导的SASP方面同样有效。数据表示为平均值±SEM。对于图3C，N＝4至8只小鼠/组，对于图3E-F为3至5，而对于图3G-J为4。**，p＜0.01和***，p＜0.001相对于CTL。双向方差分析。

图4A-O描绘了显示ABT263可以在体内清除衰老的HSC以减轻TBI诱导的早熟造血老化和LT-BM损伤的示意图和流式细胞术图。(图4A)示出了实验设计的图。简言之，将2月龄的雄性C57BL/6小鼠组进行假辐射(CTL)或暴露于6Gy TBI。辐射后8周，它们接受载剂(VEH)、更昔洛韦(GCV，25mg/kg/d，每周期5天，ip)或ABT263(ABT，50mg/kg，每周期7天，ip)2个周期的处理，治疗周期之间的间隔为2周。处理5周后，对小鼠实施安乐死以获得骨髓细胞，用于通过第35天CAFC测定和骨髓移植(BMT)分析HSC衰老和功能。(图4B-C)HSC中的p16mRNA水平(图4B)和SA-β-gal染色(图4C)的分析表明，用ABT263处理清除了由TBI诱导的衰老的HSC。数据表示为平均值±SEM(n＝3和4个独立的分别对p16 mRNA和SA-β-gal染色的测定)。a，相对于CTL，p＜0.05。n.d，不可检测。(图4D)ABT263处理改善来自辐射小鼠的HSC的克隆形成功能。数据表示为平均值±SEM(n＝3次独立测定)。a，p＜0.01相对于CTL。(图4E-O)竞争性和连续BMT证明ABT263处理可以通过改善经辐射的HSC自我更新并产生长期和平衡的多谱系植入的能力来减轻致死辐射的接受者中TBI诱导的早熟造血老化和LT-BM损伤。(图4E)示出竞争性和连续BMT的图。(图4F-G)在原发性BMT后，接受者的外周血中总供体来源的白细胞(CD45.2⁺细胞)、T细胞(CD45.2⁺Thy-1.2⁺细胞)、B细胞(CD45.2⁺B220⁺细胞)和骨髓细胞(M细胞，CD45.2⁺CD11b/Gr-1⁺细胞)移植的代表性流式细胞术分析。(图4H-O)在初级和次级接受者的外周血中总供体来源的白细胞(CD45.2⁺细胞；图4H，图4L)、T细胞(CD45.2⁺Thy-1.2⁺细胞；图4I、图4M)、B细胞(CD45.2⁺B220⁺细胞；图4J、图4N)和骨髓细胞(M细胞，CD45.2⁺CD11b/Gr-1⁺细胞；图4K，图4O)的移植。数据表示为平均值±SEM(每组6位接受者)。a，p＜0.05相对于CTL和b，p＜0.05相对于TBI+VEH。双向方差分析。

图5A-B描绘了显示WI38细胞衰老分析的图像和图。(图5A)示出了通过IR(IR-SC)、复制耗尽(Rep-SC)和致癌性Ras(Ras-SC)的表达诱导的非衰老WI-38细胞(NC)和衰老WI-38细胞的代表性相差、BrdU染色和SA-β-gal染色显微照片。(图5B)与NC相比，IR-SC、Rep-SC和Ras-SC表达增加水平的p16和p21。数据表示为来自三次独立实验的倍数变化的平均值±SEM。**，p＜0.01和***，p＜0.01对NC.学生t检验。

图6A-D描绘了显示ABT263以剂量依赖性方式选择性地杀死培养物中的衰老细胞的图。(图6A-B)MTT测定和(图6C-D)台盼蓝排除测试确认了ABT263可以剂量依赖性地杀死由电离辐射(IR-SC；图6B和图6D)、复制耗尽(Rep-SC)或致癌性Ras(Ras-SC)的表达诱导的衰老WI-38成纤维细胞(WI38)，但对非衰老WI-38细胞没有细胞毒性(NC；图6A和图6C)。在用增加浓度的ABT263处理72小时后，对活细胞进行定量。所示数据是来自3次或更多次独立实验的活细胞的平均值±SEM，作为占没有ABT263处理的对照的百分比，**，p＜0.01；和***，p＜0.001，对无ABT263。单因素方差分析。

图7A-B描绘了IR后WI-38细胞中抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的Western印迹分析。在暴露于10Gy IR后不同时间的WI-38细胞中Bcl-2、Bcl-x1、Bak和Bax的代表性Western印迹图像显示于(图7A)，且Bad、Bid、Noxa和Bim示于(图7B)。β-肌动蛋白用作加载对照。CTL表示使用来自用2μM MG132处理24小时的Hela(图7A)和K562(图7B)细胞的细胞裂解物的阳性对照。

图8A-D描绘了显示单独的Bcl-2或Bcl-x1的抑制不选择性地杀死衰老WI-38细胞的图。(图8A-B)ABT199(特异性Bcl-2抑制剂)对由电离辐射(IR-SC；图8B)诱导的衰老WI-38细胞或非衰老WI-38细胞(NC；图8A)没有细胞毒性(图8A)。(图8C-D)WEHI539(特异性Bcl-x1抑制剂)不选择性地杀死IR-SC。在用增加浓度的ABT199或WEHI593处理72小时后，对活细胞进行定量。呈现的数据是来自3次独立实验的活细胞的平均值±SE，作为占无ABT199或WEHI593处理的对照的百分比。***，p＜0.001，对无ABT199或WEHI593。单因素方差分析。

图9A-F描绘显示TBI以时间依赖性方式诱导p16-3MR小鼠中SC积累的示意图、图像和图。(图9A)描绘p16-3MR转基因的图。(图9B)示出了实验设计的图。具体地，将雄性p16-3MR小鼠暴露于2mos龄的亚致死剂量(6Gy)的TBI。在TBI后的两个、4和6个mos，按照方法中所述对全身发光进行定量。在最后一次成像次日对小鼠实施安乐死，以获取组织，用于发光定量和通过qRT-PCR分析p16 mRNA水平。(图9C-D)全身发光成像显示TBI以时间依赖性方式诱导p16-3MR小鼠中的SC积累。(图9C)对照(CTL)和TBI p16-3MR小鼠(TBI)的代表性发光图像。(图9D)全身发光定量。(图9F)来自对照(CTL)和TBI p16-3MR小鼠的肺、骨骼肌、脑、肝和心脏的代表性发光图像。图像下方的数字是与CTL相比，各种组织中发光的倍数变化的平均值±SEM。(图9E)肺、骨骼肌和脑中p16 mRNA水平的分析确认了TBI增加这些组织中的衰老细胞。数据表示为相对于CTL的倍数变化的平均值±SEM(n＝3只小鼠/组)。*，p＜0.05，相对于CTL。图9D为单向方差分析，图9E为学生t检验。

图10A-E描绘了显示ABT263选择性地减少体外由TBI诱导的衰老的HSC的示意性流式细胞术分析和图表。(图10A-B)说明从对照未经辐射小鼠(CTL)和亚致死全身辐射(TBI)小鼠分离小鼠骨髓HSC以分析HSC衰老和单一HSC诱发活性的策略的图。(图10C-D)来自TBI小鼠的HSC于来自对照未经辐射小鼠(CTL)的细胞相比表达更高水平的p16和p21mRNA和SA-β-gal活性。就图10C而言，数据表示为来自3个独立实验的倍数变化的平均值±SEM，而图10D为来自4只CTL小鼠和3只TBI小鼠的SA-β-gal⁺细胞百分比的平均值±SEM。**，p＜0.01和***，p＜0.001相对于CTL。(图10E)在用载体(VEH)或ABT263(ABT，1.25μM)在HSC扩增培养基中以1个细胞/孔培养个体骨髓HSC7天后，测定克隆形成活性。图10D所示数据是来自2个独立实验的具有形成大集落(＞10，000个细胞)能力的单细胞的百分比的平均值±SEM，来自每组3-4只小鼠的汇集(pooled)的HSC。**，p＜0.01。图10C-D为学生t检验。图10E为双向方差分析。

图11A-F描绘了流式细胞术分析和图表，其显示通过ABT263进行的衰老HSC的清除不减少小鼠中的骨髓HSC和HPC。(图11A-B)如图4A所示，在用载剂(VEH；图11A)或ABT263(ABT；图11B)处理后，来自对照(CTL)或TBI小鼠的骨髓单核细胞(BMC)中HSC和HPC的代表性流式细胞术分析。(图11C-D)BMC中的HPC(图11C)和HSC(图11D)的频率。(图11E-F)来自每只小鼠的后腿中的HPC(图11E)和HSC(图11F)的数量。数据表示为平均值±SEM(每组8至11只小鼠)。

图12A-D描绘了流式细胞术分析和图表，其显示了通过ABT263进行的衰老HSC的清除减弱了TBI诱导的HSC静息的破坏和具有持续性DNA损伤的HSC的存在。(图12A)来自用载剂(VEH)或ABT263(ABT)处理后的对照(CTL)或TBI小鼠的HSC的细胞周期分布的代表性流式细胞术分析。(图12B)G₀HSC(Ki67^-细胞)的百分比。(图12D)在用载剂(VEH)或ABT263(ABT)处理后，γH2AX染色的代表性流式细胞术分析以检测来自对照(CTL)或TBI小鼠的HSCS中的DNA双链断裂。(图12C)HSC γH2AX染色的平均荧光强度(MFI)。数据表示为平均值±SEM(就a而言，n＝8至11只小鼠每组，就b而言为5至11只小鼠)。a，p＜0.05相对于CTL；和b，p＜0.05相对于TBI+VEH。双向方差分析。

图13A-F描绘了流式细胞术分析和图表，其显示通过ABT263进行的衰老HSC的清除促进B细胞淋巴细胞生成。(图13A-B)如图4A所示，用载剂VEH；图13A)或ABT263(ABT；图13B)处理后，来自对照(CTL)或TBI小鼠的骨髓单核细胞(BMC)中的B细胞(B220⁺细胞)、成熟B细胞(MB，B220⁺IgM⁺CD93^-细胞)、未成熟B细胞(IB，B220⁺IgM⁺CD93⁺细胞)和Pre-Pro-B细胞(PB，B220⁺IgM^-CD93^-细胞)。(图13C-F)B细胞(图13C)、成熟B细胞(MB，B220⁺IgM⁺CD93^-细胞；图13D)、未成熟B细胞(IB，B220⁺IgM⁺CD93⁺细胞，图13E)，和BMC中的Pre-Pro-B细胞(PB，B220⁺IgM^-CD93^-细胞；图13F)以平均值±SEM(每组4-6只小鼠)表示。双向方差分析。

发明详述

老化与衰老细胞的积累相关。本发明人使用人衰老成纤维细胞发现可以选择性地杀死衰老细胞同时对正常细胞具有最低毒性的Bcl-2家族抑制剂。该发现表明，Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的抑制剂是新的抗老化剂，其具有通过选择性地消除衰老细胞来延迟衰老相关病症和延长更健康寿命的潜力。因此，本发明包括通过向细胞施用包含Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物来选择性地杀死细胞样品中的衰老细胞的方法。此外，本发明包括通过向受试者施用包含Bcl-2家族中的至少一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物来延迟老化的至少一个特征或治疗受试者的年龄相关疾病或病状的方法。另外，本发明包括在已接受DNA损伤治疗的受试者中杀死治疗诱导的衰老细胞的方法。

I.组合物

在一个方面，本发明的组合物包含Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂。在某些实施方案中，本发明的组合物包含Bcl-2和Bcl-x1的至少一种抑制剂。该组合物可以包含抑制Bcl-2和Bcl-x1二者的单一抑制剂。或者，该组合物可包含两种抑制剂，其中一种抑制剂抑制Bcl-2，第二抑制剂抑制Bcl-x1。在前述实施方案的每一个中，除了Bcl-2和/或Bcl-x1之外，所述抑制剂还可抑制其它Bcl-2家族蛋白。Bcl-2家族蛋白质在下文更详细地描述。

除了Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂之外，本发明的组合物还可任选地包含一种或多种其它药物或治疗活性剂。本发明的组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载剂或稀释剂。此外，本发明的组合物可包含防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、增甜剂、着色剂、增味剂、盐(本发明的物质本身可以以药学上可接受的盐的形式提供)、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。

下面进一步详细描述本发明的其它方面。

(a)Bcl-2抑制剂

本文所用“Bcl-2抑制剂”包括Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂。具体地，本发明的Bcl-2抑制剂选择性地杀死衰老细胞。确定化合物是否抑制Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的方法在本领域中是已知的。例如，可以按照下文的详细描述来测量Bcl-2家族蛋白的核酸表达、蛋白质表达或活性。确定化合物是否选择性地杀死衰老细胞的方法在本领域中是已知的。例如，参见II(b)部分和II(c)部分。

B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族的成员控制外部线粒体膜(OMM)的完整性，因此在确定细胞对内在途径诱导的凋亡的敏感性中是关键的。基于结构和功能特征，可以将Bcl-2家族成员分为三个亚家族：抗凋亡家族、多结构域促凋亡家族和仅-BH3前凋亡家族。抗凋亡亚家族抑制凋亡并促进细胞存活，但不抑制细胞增殖。因此，Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白也可称为促存活蛋白。抗凋亡Bcl-2家族蛋白的非限制性实例可包括Bcl-2、Bcl-x1、Bcl-w、Mcl-1、Bfl1/A-1和Bcl-B。抗凋亡Bcl-2家族蛋白的特征在于存在多达四个相对短的序列基序，其长度小于20个氨基酸，称为Bcl-2同源1(BH1)、BH2、BH3和BH4结构域。它们还具有C端膜锚定序列和类似的三维结构。Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的抑制剂可通过拮抗Bcl-2蛋白家族的促存活功能从而诱导凋亡来促进细胞死亡。本发明的抑制剂可以抑制Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白。因此，本发明的抑制剂可以抑制一种或多种选自Bcl-2、Bcl-x1、Bcl-w、Mcl-1、Bfl1/A-1和Bcl-B的抗凋亡蛋白。在某些实施方案中，本发明的抑制剂是Bcl-2、Bcl-x1和Bcl-w抑制剂。在一个特定实施方案中，本发明的抑制剂是Bcl-2和Bcl-x1抑制剂。应理解，本发明的抑制剂可主要抑制Bcl-2和/或Bcl-x1，但也对Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的其它成员具有抑制作用。

Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的抑制剂可以是抑制Bcl-2家族蛋白的核酸表达、蛋白表达或蛋白功能的抑制剂。抑制剂可以选择性地抑制Bcl-2家族蛋白的一个、两个、三个、四个、五个、六个或更多个成员。在一个实施方案中，抑制剂可影响Bcl-2家族蛋白的核酸或蛋白质表达。减少核酸和蛋白质表达的抑制剂的非限制性实例可包括组蛋白脱乙酰酶抑制剂，例如丁酸钠和缩酚酸肽；合成的细胞毒性类视黄醇例如芬维A胺；及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂例如夫拉平度(flavopiridol)。或者，该抑制剂可以是反义分子。例如，奥利默森钠(oblimersen sodium)(G3139)是靶向BCL-2 mRNA的Bcl-2反义。在另一个实施方案中，抑制剂可以是Bcl-2家族相互作用的天然抑制剂。例如，促红细胞生成素分子(含吡咯的天然产物)，例如GX15-070(obatoclax)，可抑制Bcl-2家族蛋白，例如Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w和Mcl-1。此外，天然抑制剂棉酚(AT-101)及其衍生物、阿朴棉子酚酮(apogossypolone)、TW37和TM-1206可抑制Bcl-2家族蛋白例如Bcl-2、Bcl-x1和Mcl-1。在另一个实施方案中，可以将抑制剂设计为结合抗细胞凋亡Bcl-2家族蛋白的疏水性丛(hydrophobic grove)代替仅-BH3蛋白(即BH3-模拟物)。因此，抑制剂可以是Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的小分子抑制剂。例如，与Bcl-2和Bcl-x1、结合Bcl-2、Bcl-x1、和Bcl-w的ABT-737和ABT-263(navitoclax)相互作用的基于异噁唑烷的小分子。其它Bcl-2家族抑制剂的非限制性实例可包括SAHB_A、三联苯、苯甲酰脲、A-385358、A-874009、A-1155463、A-1331852、阿朴棉子酚酮、BM-1074、BM-1197、BXI-72、HA-14、抗霉素A、ABT199、WEHI539、MIM-1和BH₃I。在一个特定实施方案中，抑制剂是类似于ABT-263的分子。在一个示例性实施方案中，Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的抑制剂是ABT-263。

在一个实施方案中，施用Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂。例如，可以施用Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的1种、2种、3种、4种、5种或更多种抑制剂。施用的每种Bcl-2抑制剂可以靶向Bcl-2家族中相同或不同的抗凋亡蛋白。在一个实施方案中，可以施用Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的两种抑制剂。在另一个实施方案中，可以施用Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的一种抑制剂。

根据待治疗的疾病或病症、待治疗的受试者的年龄和病症，药物组合物的剂量可在宽范围内变化。在使抑制剂与样品接触的实施方案中，抑制剂的浓度可以为约0.3125μM至约5μM。或者，抑制剂的浓度可以为约0.01μM至约10μM。例如，抑制剂的浓度可以是约0.01、约0.05、约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10μM。另外，抑制剂的浓度可以大于10μM。例如，抑制剂的浓度可以是约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85、约90、约95或约100μM。

在向受试者施用包含Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物的实施方案中，抑制剂的剂量可以为约0.1mg/kg至约500mg/kg。例如，抑制剂的剂量可以是约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg或约25mg/kg。或者，抑制剂的剂量可为约25mg/kg、约50mg/kg、约75mg/kg、约100mg/kg、约125mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg、约225mg/kg或约250mg/kg。另外，抑制剂的剂量可以是约300mg/kg、约325mg/kg、约350mg/kg、约375mg/kg、约400mg/kg、约425mg/kg、约475mg/kg或约500mg/kg。在一个特定实施方案中，抑制剂的剂量可以是约50mg/kg。包含Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物可以通过各种途径(局部施用、肠内或肠胃外施用)以多种频率、间隔和持续时间施用于受试者。

i.Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的核酸表达

在一个实施方案中，可以测量Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的核酸表达以鉴定抑制Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的化合物。例如，在化合物存在下，当Bcl-2家族蛋白核酸表达相对于未处理的对照降低时，该化合物下调Bcl-2家族蛋白。在一个特定实施方案中，可以测量Bcl-2家族蛋白mRNA以鉴定调节Bcl-2家族蛋白的化合物。

用于评估细胞中核酸表达的量的方法在本领域中是公知的，并且本领域技术人员已知的用于评估核酸表达的量的所有合适的方法都包括在本发明的范围内。本文所用术语“核酸表达的量”或“核酸表达水平”是指核酸表达的可测量水平，例如但不限于所表达的信使RNA(mRNA)转录物或mRNA的特异性变体或其它部分、核酸的酶促活性或其它活性的水平，以及特定代谢物的水平。术语“核酸”包括DNA和RNA，并且可以是双链或单链的。评估核酸表达的量的合适方法的非限制性实例可包括阵列，例如微阵列；PCR，例如RT-PCR(包括定量RT-PCR)；核酸酶保护测定和Northern印迹分析。在一个特定实施方案中，测定靶核酸的表达量部分地包括测量靶核酸mRNA表达的水平。

在一个实施方案中，可以通过使用阵列(例如微阵列)确定核酸表达的量。使用核酸微阵列的方法在本领域中是公知的。例如，与靶基因的表达产物互补或可杂交的核酸探针可以用于阵列中。术语“杂交”或“可杂交”是指与互补核酸的序列特异性非共价结合相互作用。在一个优选的实施方案中，杂交在高严格条件下进行。促进杂交的适当的严格条件是本领域技术人员已知的，或者可以在Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.16.3.6中找到。本文所用术语“探针”是指将与核酸靶序列杂交的核酸序列。在一个实例中，探针与核酸的RNA产物或与其互补的核酸序列杂交。探针的长度取决于杂交条件和探针的序列及核酸靶序列。在一个实施方案中，探针长度为至少8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、250、400、500或更多个核苷酸。

在另一个实施方案中，可以使用PCR测定核酸表达的量。PCR方法在本领域中是公知的，并且可以包括定量PCR、半定量PCR、多重PCR或其任何组合。具体地，可以采用定量RT-PCR确定核酸表达的量。进行定量RT-PCR的方法在本领域中是常见的。在这样的一个实施方案中，用于定量RT-PCR的引物可以包含靶基因的正向和反向引物。本文所用术语“引物”是指核酸序列，无论是在纯化的限制性消化物中天然存在的还是合成产生的，当置于引物延伸产物合成的条件下时，其能够作为合成点，其与诱导的核酸链互补(例如在核苷酸和诱导剂(例如DNA聚合酶)的存在下，在合适的温度和pH下)。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发所需延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于多种因素，包括温度、引物序列和所使用的方法。引物通常含有15至25个或更多个核苷酸，尽管它可以含有更少或更多。确定引物的合适长度所涉及的因素是本领域普通技术人员容易知晓的。

核酸表达的量可以通过测量核酸序列的完整mRNA转录物或测量核酸序列的mRNA转录物的一部分来测量。例如，如果使用核酸阵列来测量mRNA表达的量，则阵列可以包含针对感兴趣的核酸序列的mRNA的一部分的探针，或者阵列可以包含针对感兴趣的核酸序列的完整mRNA。类似地，在PCR反应中，可以将引物设计成扩增感兴趣的核酸序列的全部cDNA序列或cDNA序列的一部分。本领域技术人员将认识到，存在可用于扩增感兴趣的核酸序列的整个cDNA或cDNA的一部分的多于一组引物。设计引物的方法在本领域中是已知的。从生物样品中提取RNA的方法在本领域中是已知的。

表达水平可以标准化或可以不标准化为对照核酸的水平。这样的对照核酸不应与本发明的aiRNA核苷酸序列特异性杂交。这允许对在不同场合进行的测定进行比较。

ii.Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的蛋白表达

在另一个实施方案中，可以测量Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的蛋白表达以鉴定调节一种或多种Bcl-2家族蛋白的化合物。例如，当在化合物存在下，Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的蛋白表达相对于未处理的对照降低时，该化合物下调Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的蛋白质表达。在一个特定实施方案中，可以利用免疫印迹测量Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的蛋白质表达。

用于评估蛋白质表达量的方法在本领域中是公知的，本领域技术人员已知的用于评估蛋白质表达量的所有合适的方法都在本发明的范围内。用于评估蛋白质表达量的合适方法的非限制性实例可包括基于表位结合剂的方法和基于质谱的方法。

在一些实施方案中，用于评估蛋白质表达量的方法是质谱法。通过利用质量和电荷的固有性质，质谱(MS)可以解析并且可靠地鉴定多种复杂化合物，包括蛋白质。传统的定量MS使用电喷雾电离(ESI)，随后串联MS(MS/MS)(Chen等，2001；Zhong等，2001；Wu等，2000)，同时正在利用辅助激光解吸/电离(MALDI)接着飞行时间(TOF)MS开发更新的定量方法(Bucknall等，2002；Mirgorodskaya等，2000；Gobom等，2000)。根据本发明，可以使用质谱法来寻找由本发明的靶核酸编码的蛋白质的水平。

在一些实施方案中，评估蛋白质表达量的方法是基于表位结合剂的方法。本文所用术语“表位结合剂”是指抗体、适体、核酸、寡核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、脂质、代谢物、小分子或其识别并能够结合靶基因蛋白的片段。核酸可以包括RNA、DNA和天然存在的或合成产生的衍生物。

本文所用术语“抗体”通常是指识别并可结合抗原的表位的多肽或蛋白质。本文所用抗体可以是本领域中所理解的完整抗体，即由两条重链和两条轻链组成，或者可以是具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且包括但不限于，抗体片段例如Fab′、Fab、F(ab′)2、单结构域抗体、Fv和单链Fv。术语抗体也指多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和人源化抗体。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术在本领域中是公知的。用于制备和表征抗体的手段在本领域中也是公知的(参见例如Antibodies：A Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory，1988；通过引用整体并入本文)。

本文所用术语“适体”是指多核苷酸，通常是在生物化学活性、分子识别或结合属性方面具有有用的生物活性的RNA或DNA。通常，适体具有分子活性，例如在特定表位(区域)与靶分子结合。通常接受的是，具有与多肽结合的特异性的适体可以通过体外进化方法合成和/或鉴定。用于制备和表征适体的方法，包括通过体外进化方法，在本领域中是公知的(参见例如US 7,939,313；通过引用整体并入本文)。

一般来说，评估蛋白质表达量的基于表位结合剂的方法包括在有效地允许表位结合剂与多肽形成复合物的条件下使包含多肽的样品与对多肽具有特异性的表位结合剂接触。基于表位结合剂的方法可以在溶液中进行，或者表位结合剂或样品可以固定在固体表面上。合适的表面的非限制性实例包括微量滴定板、试管、珠、树脂及其它聚合物。

如本领域技术人员将理解的，表位结合剂可以以多种方式连接到基底上。表位结合剂可以首先合成，随后与底物连接，或者可以在底物上直接合成。底物和表位结合剂可以用化学官能团衍生化以随后连接两者。例如，底物可以用化学官能团衍生化，所述化学官能团包括但不限于氨基、羧基、氧代基或硫醇基。使用这些官能团，表位结合剂可以使用官能团直接连接或使用接头间接连接。

表位结合剂也可以非共价地连接到底物上。例如，可以制备生物素化表位结合剂，其可以结合共价地涂覆有链霉亲和素的表面，导致连接。或者，可以采用诸如光聚合和光刻的技术在表面上合成表位结合剂。将表位结合剂附着于固体表面的其它方法和在基底上合成生物分子的方法在本领域中是公知的，即来自Affymetrix的VLSIPS技术(例如，参见美国专利No.6,566,495，和Rockett和Dix，Xenobiotica30(2)：155-177，两者的全部内容通过引用并入本文)。

在有效条件下使样品与表位结合剂接触足以允许形成复合物的一段时间通常包括将表位结合剂组合物加入样品中并将混合物孵育足够长的时间以使表位结合剂与存在的任何抗原相结合。此时，洗涤复合物，并且可以通过本领域中公知的任何方法检测复合物。检测表位结合剂-多肽复合物的方法通常基于标记或标志物的检测。本文所用术语“标记”是指附着于表位结合剂或其它基底材料的任何物质，其中所述物质可通过检测方法来检测。合适的标记的非限制性实例包括发光分子、化学发光分子、荧光染料、荧光淬灭剂、有色分子、放射性同位素、闪烁体、生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、蛋白A、蛋白G、抗体或其片段、多组氨酸、Ni2+、Flag标签、myc标签、重金属和酶(包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶)。基于标记或标志物的检测来检测表位结合剂-多肽复合物的方法在本领域中是公知的。

在一些实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫测定。免疫测定可以以多种不同的形式进行。一般来说，免疫测定可以分为两类：竞争性免疫测定和非竞争性免疫测定。在竞争性免疫测定中，样品中未标记的分析物与标记的分析物竞争与抗体的结合。洗去未结合的分析物并测量结合的分析物。在非竞争性免疫测定中，抗体被标记，而不是被分析物。非竞争性免疫测定可以使用一种抗体(例如，捕获抗体被标记)或多于一种抗体(例如，至少一种未标记的捕获抗体和至少一种被标记的“封端”或检测抗体)。合适的标记描述于上文。

在一些实施方案中，基于表位结合剂的方法是ELISA。在另一些实施方案中，基于表位结合剂的方法是放射免疫测定。在另一些实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫印迹或Western印迹。在替选实施方案中，基于表位结合剂的方法是阵列。在另一个实施方案中，基于表位结合剂的方法是流式细胞术。在一些不同的实施方案中，基于表位结合剂的方法是免疫组织化学(IHC)。IHC使用抗体检测和定量完整组织样品中的抗原。组织样品可以是新鲜冷冻的和/或福尔马林固定的、石蜡包埋的(或塑料包埋的)组织块，其被制备用于通过IHC进行研究。制备用于通过IHC进行研究的组织块的方法以及进行IHC的方法在本领域中是公知的。

iii.Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的活性

在一个实施方案中，可以测量Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的活性以鉴定调节Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的化合物。例如，可以测量凋亡作为Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的活性的指示。可以使用如下文II(c)部分所述的本领域标准方法测量细胞凋亡。例如，当在化合物存在下，衰老细胞的凋亡相对于未处理的对照增加时，所述化合物可下调Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白。

在另一个实施方案中，可以测量细胞活力作为Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的活性的指示。细胞活力可以使用如下文II(c)部分中所述本领域标准方法测量。例如，当在化合物存在下，衰老细胞的细胞活力相对于未处理的对照降低时，化合物可下调Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白。

在另一个实施方案中，可以测量半胱天冬酶3作为Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的活性的指示。在Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的抑制剂的存在下，可以激活半胱天冬酶3。可以将其测量为胱天蛋白酶3的增加或半胱天冬酶3的减少。胱天蛋白酶可以使用例如上述用于检测蛋白质表达的方法来测量。

(b)组合物的组分

本公开内容还提供了药物组合物。所述药物组合物包含作为活性成分的Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白至少一种抑制剂和至少一种药学上可接受的赋形剂。

所述药学上可接受的赋形剂可以是稀释剂、粘合剂、填充剂、缓冲剂、pH调节剂、崩解剂、分散剂、防腐剂、润滑剂、掩味剂、矫味剂或着色剂。用于形成药物组合物的赋形剂的量和类型可以根据制药科学的已知原理来选择。

在一个实施方案中，赋形剂可以是稀释剂。稀释剂可以是可压缩的(即可塑性变形的)或磨损脆性(abrasively brittle)的。合适的可压缩稀释剂的非限制性实例包括微晶纤维素(MCC)、纤维素衍生物、纤维素粉末、纤维素酯(即，乙酸酯和丁酸酯混合酯)、乙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米淀粉、磷酸化玉米淀粉、预胶化玉米淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、淀粉-乳糖、淀粉-碳酸钙、淀粉羟乙酸钠、葡萄糖、果糖、乳糖、一水合乳糖、蔗糖、木糖、乳糖醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糖糊精和海藻糖。合适的磨损脆性稀释剂的非限制性实例包括磷酸氢钙(无水或二水合物)、磷酸三钙、碳酸钙和碳酸镁。

在另一个实施方案中，赋形剂可以是粘合剂。合适的粘合剂包括但不限于淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮、聚乙烯醇、C₁₂-C₁₈脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、多肽、寡肽及其组合。

在另一个实施方案中，赋形剂可以是填充剂。合适的填料包括但不限于碳水化合物、无机化合物和聚乙烯吡咯烷酮。作为非限制性实例，填料可以是硫酸钙、二碱和三碱、淀粉、碳酸钙、碳酸镁、微晶纤维素、磷酸氢钙、碳酸镁、氧化镁、硅酸钙、滑石、改性淀粉、乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇。

在另一个实施方案中，赋形剂可以是缓冲剂。合适的缓冲剂的代表性实例包括但不限于磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、tris缓冲液和缓冲盐水(例如Tris缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)。

在各种实施方案中，赋形剂可以是pH调节剂。作为非限制性实例，pH调节剂可以是碳酸钠、碳酸氢钠、柠檬酸钠、柠檬酸或磷酸。

在另一个实施方案中，赋形剂可以是崩解剂。崩解剂可以是非泡腾剂或泡腾剂。非泡腾崩解剂的合适实例包括但不限于淀粉，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化淀粉和改性淀粉；增甜剂；粘土，例如膨润土；微晶纤维素；藻酸盐；淀粉羟乙酸钠；胶，例如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆、刺梧桐树胶、pecitin和黄蓍胶。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

在另一个实施方案中，赋形剂可以是分散剂或分散增强剂。合适的分散剂可包括但不限于淀粉、藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯木纤维素、淀粉羟乙酸钠、异形硅酸盐和微晶纤维素。

在另一个替代实施方案中，赋形剂可以是防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，例如BHA、BHT、维生素A、维生素C、维生素E或棕榈酸视黄酯、柠檬酸、柠檬酸钠；螯合剂例如EDTA或EGTA；和抗微生物剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇或苯酚。

在另一个实施方案中，赋形剂可以是润滑剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括矿物质，例如滑石或二氧化硅；和脂肪，例如植物硬脂酸、硬脂酸镁或硬脂酸。

在另一个实施方案中，赋形剂可以是掩味剂。掩味材料包括纤维素醚；聚乙二醇；聚乙烯醇；聚乙烯醇和聚乙二醇共聚物；甘油单酯或甘油三酯；丙烯酸聚合物；丙烯酸聚合物与纤维素醚的混合物；醋酸纤维素邻苯二甲酸酯；及其组合。

在一个替代实施方案中，赋形剂可以是矫味剂。矫味剂可以选自合成矫味油和矫味芳香剂和/或天然油；来自植物、叶、花、果实及其组合的提取物。

在另一个实施方案中，赋形剂可以是着色剂。合适的颜色添加剂包括但不限于食品、药物和彩妆(cosmetic colors)(FD&C)、药物和彩妆(D&C)或外用药物和彩妆(Ext.D&C)。

组合物中赋形剂或赋形剂组合的重量分数可以为组合物总重量的约99％或更小、约97％或更小、约95％或更小、约90％或更小、约85％或更小、约80％或更小、约75％或更小、约70％或更小、约65％或更小、约60％或更小、约55％或更小、约50％或更小、约45％或更小、约40％或更小、约35％或更小、约30％或更小、约25％或更小、约20％或更小、约15％或更小、约10％或更小、约5％或更小、约2％或约1％或更小。

组合物可以配制成各种剂型，并通过多种不同的方式施用，这些方式将递送治疗有效量的活性成分。这样的组合物可以根据需要以含有常规无毒的药学上可接受的载体、佐剂和载剂的剂量单位制剂口服(例如吸入)、肠胃外或局部施用。局部施用还可以涉及使用透皮施用，例如透皮贴剂或离子电渗装置。本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌内、关节内或胸骨内注射或输注技术。药物的制剂在例如Gennaro，A.R.，Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(第18版，1995)和Liberman，H.A.和Lachman，L.编著，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Dekker Inc.，New York，NY(1980)中有讨论。在一个特定实施方案中，组合物可以是食品补充剂，或者组合物可以是化妆品。

用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、囊片、微丸剂、粉剂、丸剂和颗粒剂。在这样的固体剂型中，活性成分通常与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合，其实例在上文详述。口服制剂还可以以水性混悬剂、酏剂或糖浆形式施用。对于这些，活性成分可与各种增甜剂或矫味剂、着色剂以及如果需要的话乳化剂和/或混悬剂以及稀释剂如水、乙醇、甘油及其组合相组合。对于通过吸入给药，化合物以来自加压容器或分配器的气溶胶喷雾的形式递送，所述加压容器或分配器含有合适的推进剂(例如气体例如二氧化碳)或喷雾器。

对于肠胃外给药(包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内和腹膜内)，制剂可以是水性溶液或基于油的溶液。水溶液可以包括无菌稀释剂，例如水、盐水溶液、药学上可接受的多元醇例如甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂和/或抗真菌剂，例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、氯丁醇、苯酚、硫柳汞等；抗氧化剂例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和/或用于调节张力的试剂，例如氯化钠、右旋糖或多元醇例如甘露醇或山梨醇。水溶液的pH可以用酸或碱例如盐酸或氢氧化钠来调节。油基溶液或混悬液可以进一步包含芝麻油、花生油、橄榄油或矿物油。组合物可以存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，并且可以在冷冻干燥(冻干)条件下储存，在施用前即刻仅需要添加携带的无菌液体(例如注射用水)。临时注射溶液和混悬液可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。

对于局部(例如，透皮或透粘膜)施用，制剂中通常包括适合于待渗透的屏障的渗透剂。适于局部施用的药物组合物可以配制为软膏剂、霜剂、混悬剂、洗剂、粉剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油。在一些实施方案中，药物组合物作为局部软膏或霜剂施用。当配制在软膏中时，活性成分可以与石蜡或水易混性软膏基质一起使用。或者，活性成分可以用水包油乳膏基质或油包水基质配制成霜剂。适于局部施用于眼睛的药物组合物包括滴眼剂，其中活性成分溶解或混悬于合适的载体(特别是水性溶剂)中。适于在口中局部施用的药物组合物包括糖锭、锭剂和漱口剂。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂、气溶胶喷雾剂、片剂或栓剂来实现，并且透皮施用可以通过本领域通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂、贴剂或霜剂来实现。

在某些实施方案中，将包含一种或多种Bcl-2家族蛋白的至少一种抑制剂的组合物包封在合适的载剂中以帮助将化合物递送至靶细胞，以提高组合物的稳定性，或使组合物的潜在毒性最小化。本领域技术人员将理解，多种载剂适合于递送本发明的组合物。合适的结构化流体递送系统的非限制性实例可包括纳米颗粒、脂质体、微乳液、胶束、树枝状聚合物及其它含磷脂系统。将组合物掺入递送载剂中的方法在本领域中是已知的。

在一个替选实施方案中，可以使用脂质体递送载剂。考虑到其结构和化学性质，脂质体根据实施方案适于递送一种或多种Bcl-2家族蛋白的至少一种抑制剂。一般来说，脂质体是具有磷脂双层膜的球形囊泡。脂质体的脂质双层可以与其他双层(例如，细胞膜)融合，从而将脂质体的内容物递送到细胞。以这种方式，可以通过包封在与靶细胞膜融合的脂质体中将至少一种或多种Bcl-2家族蛋白的至少一种抑制剂选择性地递送至细胞。

脂质体可以由具有不同烃链长度的多种不同类型的磷脂构成。磷脂通常包含通过磷酸甘油酯连接到多种极性基团之一的两种脂肪酸。合适的磷脂包括磷脂酸(PA)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、二磷脂酰甘油(DPG)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。包含磷脂的脂肪酸链的长度可以为约6至约26个碳原子，脂质链可以是饱和的或不饱和的。合适的脂肪酸链包括(括号中表示常用名)正十二酸酯(月桂酸酯)、正十四酸酯(肉豆蔻酸酯)、正十六酸酯(棕榈酸酯)、正十八酸酯(硬脂酸酯)、正二十烷酸酯(廿烷酸酯)、正二十四烷酸酯(木蜡酸酯)、顺-9-十六碳烯酸酯(棕榈油酸酯)、顺-9-十八烷酸酯(油酸酯)、顺-9，12-十八碳二烯酸酯(亚油酸酯)、全顺-9，12，15-十八烷三烯酸酯(亚麻酸酯)和全顺-5，8，11，14-二十碳四烯酸酯(花生酸酯)。磷脂的两条脂肪酸链可以相同或不同。可接受的磷脂包括二油酰PS、二油酰PC、二硬脂酰PS、二硬脂酰PC、二肉豆蔻酰PS、二肉豆蔻酰PC、二棕榈酰PG、硬脂酰、油酰PS、棕榈酰、亚麻酰基PS等。

磷脂可以来自任何天然来源，并且因此可以包含磷脂的混合物。例如，蛋黄富含PC、PG和PE，大豆含有PC、PE、PI和PA，而动物脑或脊髓富含PS。磷脂也可来自合成来源。可以使用具有不同比例的各磷脂的磷脂的混合物。不同磷脂的混合物可导致具有有利的活性或活性性质的稳定性的脂质体组合物。上述磷脂可以与阳离子脂质以最佳比例混合，所述阳离子脂质例如N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵、1，1′-双十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青过氧化物、3，3′-脱氧氧杂羰花青碘化物、1，1′-十二烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青过氧化物、1，1′-二油基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青甲磺酸盐、N-4-(去油基氨基苯乙烯基)-N-甲基碘化吡啶鎓或1，1′-二亚油基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐。

脂质体可任选地包含鞘脂，其中鞘氨醇是甘油和磷酸甘油酯的一种脂肪酸一种的或胆固醇(动物细胞膜的主要组分)的结构对应物。脂质体可以任选地含有聚乙二醇化脂质，其是与聚乙二醇(PEG)的聚合物共价连接的脂质。PEG的大小范围可以为约500至约10,000道尔顿。

脂质体可以进一步包含合适的溶剂。溶剂可以是有机溶剂或无机溶剂。合适的溶剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甲基吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、乙腈、醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃或其组合。

携带至少一种或多种Bcl-2家族蛋白(即，具有至少一种甲硫氨酸化合物)的抑制剂的脂质体可以通过制备用于药物递送的脂质体的任何已知方法来制备，例如，美国专利号：4,241,046、4,394,448、4,529,561、4,755,388、4,828,837、4,925,661、4,954,345、4,957,735、5,043,164、5,064,655、5,077,211和5,264,618中所详述的，其公开内容通过引用整体并入本文。例如，脂质体可以通过在水溶液中超声处理脂质、溶剂注射、脂质水合、反向蒸发或通过反复冷冻和解冻的冷冻干燥来制备。在一个优选的实施方案中，脂质体通过超声处理形成。脂质体可以是多层的，其具有如同洋葱一样的许多层或单层。脂质体可以大或小。持续高剪切声处理倾向于形成较小的单层脂质体。

如对普通技术人员显而易见的，可以改变控制脂质体形成的所有参数。这些参数包括但不限于温度、pH、甲硫氨酸化合物的浓度、脂质的浓度和组成、多价阳离子的浓度、混合速率、溶剂的存在和浓度。

在另一实施方案中，本发明的组合物可以作为微乳液递送至细胞。微乳液通常是透明的、热力学稳定的溶液，其包含水溶液、表面活性剂和“油”。在这种情况下，“油”是超临界流体相。表面活性剂位于油-水界面。任何多种表面活性剂均适用于微乳剂制剂，其包含本文所述的或本领域中已知的那些。适用于本发明的水性微区通常具有约5nm至约100nm的特征结构尺寸。这种尺寸的聚集体是可见光的差散射体，因此，这些溶液是光学透明的。本领域技术人员将理解，微乳液可以并且将具有多种不同的微观结构，包括球形、棒形或盘形聚集体。在一个实施方案中，所述结构可以是胶束，其是最简单的微乳液结构，其通常是球形或圆柱形物体。胶束像水包油滴，反胶束像油包水滴。在一个替代实施方案中，微乳液结构是薄片。它包括由表面活性剂层分离的连续的水和油层。微乳液的“油”最佳地包含磷脂。上文针对脂质体详述的任何磷脂适用于涉及微乳液的实施方案。一种或多种Bcl-2家族蛋白的至少一种抑制剂可以通过本领域通常已知的任何方法包封在微乳液中。

在另一个实施方案中，可以在树突状大分子或树状聚合物中递送一种或多种Bcl-2家族蛋白的至少一种抑制剂。一般来说，树枝状聚合物是分支的树状分子，其中每个分支是在一定长度之后分成两个新分支(分子)的分子的互连链。这种分支持续直到分支(分子)变得如此密集地堆积，使得冠层形成球体。通常，树枝状聚合物的性质由其表面的官能团决定。例如，亲水端基(例如羧基)通常会形成水溶性树枝状聚合物。或者，可将磷脂掺入树枝状聚合物的表面以促进跨皮肤的吸收。详述用于脂质体实施方案中的任何磷脂均适合用于树枝状聚合物实施方案中。本领域中通常已知的任何方法均可用于制备树枝状聚合物并将本发明的组合物包封在其中。例如，树枝状聚合物可通过反应步骤的迭代序列产生，其中每个额外的迭代导致更高级的树枝状聚合物。因此，它们具有规则的、高度分枝的3D结构，具有几乎均匀的尺寸和形状。此外，树枝状聚合物的最终大小通常由合成期间使用的迭代步骤的数目控制。各种树枝状聚合物的大小适用于本发明。通常，树枝状聚合物的大小可以在约1nm至约100nm的范围内。

II.方法

本公开内容包括选择性地杀死样品中的一种或多种衰老细胞的方法，所述方法包括使包含有效量的Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物与样品相接触。在另一方面，本公开内容包括选择性地杀死有此需要的受试者中的一种或多种衰老细胞的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物。

选择性地杀死一种或多种衰老细胞是指本发明的组合物不会以相同的浓度明显杀死非衰老细胞。因此，非衰老细胞中抑制剂的中值致死剂量或LD 50可以是衰老细胞中抑制剂的LD 50的约5至约50倍。本文所用LD 50是杀死细胞样品中一半细胞所需的抑制剂的浓度。例如，非衰老细胞中抑制剂的LD 50可以比衰老细胞中抑制剂的LD 50高约5、约6、约7、约8、约9或约10倍。或者，非衰老细胞中抑制剂的LD 50可以比衰老细胞中的抑制剂高约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、约35倍、约40倍、约45倍或约50倍。另外，非衰老细胞中抑制剂的LD 50可以比衰老细胞中抑制剂的LD 50高大于50倍。在一个特定实施方案中，非衰老细胞中抑制剂的LD 50比衰老细胞中抑制剂的LD 50高大于10倍。在另一个特定实施方案中，非衰老细胞中抑制剂的LD 50比衰老细胞中抑制剂的LD 50高大于20倍。

从活跃分裂的细胞到代谢活跃的非分裂细胞的进展称为“衰老”或“细胞衰老”。本文所用术语“衰老”和“细胞衰老”可以互换使用。术语“衰老”还指细胞在多轮分裂后进入的状态，并且作为细胞途径的结果，即使细胞保持代谢活性，也防止进一步的细胞分裂发生。衰老细胞可以以以下方式中的一种或多种不同于其预-衰老对应物：1)它们阻止生长并且不能被刺激以通过生理性有丝分裂原重新进入细胞周期；2)它们变得耐受凋亡性细胞死亡；和/或3)它们获得改变的分化功能。

与不受控制地生长和分裂的癌细胞相反，大多数分化的真核细胞增殖的能力是有限的。换句话说，正常细胞对它们可以进行的细胞分裂的数目具有固有地确定的限制。已将这种现象称为“复制性细胞衰老”，并且是限制细胞的增殖能力从而防止肿瘤转化的内在抗癌机制。另一种形式的衰老是“早熟细胞衰老”。早熟细胞衰老例如复制性细胞衰老是有丝分裂细胞的终端命运，其特征在于永久细胞周期停滞。然而，与复制性细胞衰老不同，早期细胞衰老不需要端粒衰退，并且可以通过多种应激物诱导，包括但不限于紫外光、活性氧、化学疗法、环境毒素、吸烟、电离辐射、染色质结构变形、过度有丝分裂信号传导和致癌突变。另一种形式的衰老是治疗诱导的衰老(TIS)，其指的是通过治疗剂迫使肿瘤细胞子集进入衰老状态的现象。已知TIS因某些治疗(包括放射治疗和化疗)而发展。

受试者的多个器官和组织中衰老细胞的数量随年龄增加。衰老细胞的积累可能驱使老化与年龄相关疾病的恶化。例如，老年组织中衰老细胞的积累可能导致年龄相关的组织功能障碍、再生能力降低和疾病。在这种情况下，衰老被认为是有害的，因为它有助于组织更新和功能的减少。作为一个非限制性实例，老化的组织可能缺乏在需要增殖时对应激反应的能力，从而导致随着衰老而看到的适应性降低。该模型的关键组成部分是大量的衰老细胞应当存在于不存在病状或者在有病状之前老化的组织中。

(a)衰老细胞

衰老细胞可以是停止分裂但保持代谢活性的细胞。非分裂细胞仍可存活数周，但是不能生长/复制DNA，尽管在培养基中存在足够的空间、营养物和生长因子。因此，衰老生长停滞基本上是永久的，因为衰老细胞不能被已知的生理刺激物刺激增殖。此外，本发明的衰老细胞可以对某些凋亡信号具有抗性，并且可以获得基因表达的广泛变化。对凋亡的抗性可以解释衰老细胞随年龄增加。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的操作可以导致注定要通过凋亡死亡的细胞衰老，及相反地导致注定衰老的细胞经历凋亡。

由于复制性细胞衰老、早熟细胞衰老或治疗诱导的衰老，本发明的衰老细胞可以是衰老的。由于复制而衰老的衰老细胞可能经历了大于60次群体倍增。或者，由于复制而衰老的衰老细胞可经历大于40、大于50、大于60、大于70或大于80次群体倍增。过早细胞衰老的衰老细胞可以由但不限于紫外线、活性氧、化学治疗剂、环境毒素、吸烟、电离辐射、染色质结构变形、过度促有丝分裂信号传导和致癌突变诱导。在一个特定实施方案中，可通过电离辐射(IR)诱导过早细胞衰老。在另一个特定实施方案中，早熟细胞衰老也可以通过用Ras致癌基因的异位转染诱导。治疗诱导的衰老的衰老细胞可能已经暴露于DNA损伤治疗。

本发明的衰老细胞通常可以是真核细胞。衰老细胞的非限制性实例可包括但不限于乳腺上皮细胞、角质形成细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞(大血管)、内皮细胞(微血管)、上皮细胞、成纤维细胞、毛囊真皮乳头细胞、肝细胞、黑素细胞、成骨细胞、前脂肪细胞、免疫系统的原代细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、神经元、胶质细胞、收缩细胞、外分泌分泌上皮细胞、细胞外基质细胞、激素分泌细胞、角化上皮细胞、胰岛细胞、晶状体细胞、间充质干细胞、胰腺腺泡细胞、小肠潘氏细胞、造血细胞的原代细胞、神经系统的原代细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞、湿层化屏障上皮细胞和干细胞。在一个特定实施方案中，干细胞是成体干细胞。成体干细胞是维持和修复发现它们的组织的干细胞，并且通常由其所来源的组织来指代。成体干细胞的非限制性实例包括肌肉干细胞、造血干细胞、心脏干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、肠干细胞、皮肤干细胞、脂肪衍生的干细胞、内皮干细胞和牙髓干细胞。在一个特定实施方案中，本发明的衰老细胞是成纤维细胞。在另一个特定实施方案中，衰老细胞可以是造血干细胞。

此外，本发明的衰老细胞可见于可再生组织中，所述可再生组织包括脉管系统、造血系统、上皮器官和基质。本发明的衰老细胞还可以在衰老或慢性年龄相关病理学的部位发现，例如骨关节炎和动脉粥样硬化。此外，本发明的衰老细胞可以与良性发育不良或癌前病变和良性前列腺增生相关。在一个实施方案中，本发明的衰老细胞可在DNA损伤治疗后于正常和肿瘤组织中发现。在一个特定实施方案中，衰老细胞可以在老化或年龄相关病理的部位处发现。

年龄相关病理可包括通过受试者的细胞或细胞群体的非增殖或衰老状态诱导或维持而完全或部分介导的任何疾病或病状。非限制性实例包括可能缺乏病状的可见指示的年龄相关组织或器官衰退或诸如变性疾病或功能减退性病症的公开病状。例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、白内障、黄斑变性、青光眼、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗塞、中风、高血压、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨关节炎、2型糖尿病、肥胖、脂肪功能障碍、冠状动脉疾病、脑血管疾病、牙周病和癌症治疗相关的残疾例如各种组织中的萎缩和纤维化、脑和心脏损伤及治疗相关的骨髓增生异常综合征。另外，年龄相关病理可包括加速老化疾病，例如早幼粒综合征(即Hutchinson-Gilford早年衰老综合征、Werner综合征、Bloom综合征、Rothmund-Thomson综合征、Cockayne综合征、色素性干皮病、毛发性白血病、组合的色素性干皮病-Cockayne综合征、限制性皮肤病)、共济失调毛细血管扩张症、范可尼贫血、弗里德赖希共济失调、先天性角化不良、再生障碍性贫血、IPF等。本文所述的鉴定年龄相关疾病或病状的方法可以包括检测衰老细胞的存在。

(b)检测衰老细胞

在一方面，本发明的方法可包括检测衰老细胞。衰老细胞可以在体内或体外检测。用于在体外和体内检测衰老细胞的合适标记在本领域中是已知的。例如，检测衰老细胞的方法可以包括但不限于通过掺入5-溴脱氧尿苷(BrdU)或³H-胸苷检测DNA复制的缺乏；蛋白质例如增殖细胞核抗原(PCNA)和Ki-67的免疫染色；衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的组织化学染色；检测p16、p19、Pail、Igfbp2、IL-6、Mmp 13、Nrg1、分化的胚胎-软骨细胞表达-1(DEC1)、p15(CDK1)和诱杀死亡受体-2(DCR2)的表达；检测细胞学标志物，例如衰老相关的异染色质灶(SAHF)和衰老相关的DNA损伤灶(SDF)。SAHF可以通过优先结合DNA染料例如4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和某些异染色质相关组蛋白修饰(例如，H3 Lys9甲基化)和蛋白质(例如，异染色质蛋白-1(HP1))的存在来检测。另外，可以按照美国专利号5,491,069和美国专利申请号2010/0086941中所述检测衰老细胞。在某些实施方案中，通过SA-β-gal的组织化学染色来检测衰老细胞。

在某些实施方案中，在样品中检测到一种或多种衰老细胞。样品可以是来自受试者的细胞样品、组织样品或活检样品。一般来说，样品可能取决于年龄相关的病状。例如，样品可以是组织活检材料。因此，组织样品可来自食道、胃、肝、胆囊、胰腺、肾上腺、膀胱、胆囊、大肠、小肠、肾、肝、胰腺、结肠、胃、胸腺、脾、脑、脊髓、神经、脂肪组织、心脏、肺、眼睛、角膜、皮肤或胰岛组织或器官。在一个特定实施方案中，组织样品可来自肺、骨骼肌和脑。在另一个特定实施方案中，组织样品可来自肝脏和心脏。或者，样品可以是细胞样品。因此，细胞样品可以是卵母细胞和/或精子、间充质干细胞、脂肪细胞、中枢神经系统神经元和神经胶质细胞、收缩细胞、外分泌分泌上皮细胞、细胞外基质细胞、激素分泌细胞、角质化上皮细胞、胰岛细胞、肾细胞、晶状体细胞、胰腺腺泡细胞、小肠潘氏细胞、造血谱系的原代细胞、神经系统的原代细胞、感觉器官和周围神经元支持细胞或湿分层屏障上皮细胞。衰老细胞的检测可用于评估组织的复制史，从而提供与组织的实足年龄相比的生理学评估的方法。

衰老细胞的数量可以随年龄增加。组织或样品中衰老细胞的数量可以为小于1％至大于15％。在一个实施方案中，组织或样品中衰老细胞的数量可以小于1％、小于2％、小于3％、小于4％或小于5％。在另一个实施方案中，组织或样品中衰老细胞的数量可以为约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。在另一个实施方案中，组织或样品中衰老细胞的数目可以大于10％、大于11％、大于12％、大于13％、大于14％或大于15％。

(c)测量细胞死亡

在一方面，本发明的方法可包括衰老细胞的细胞死亡。测量细胞死亡的方法在本领域中是已知的。例如，可以通过Giemsa染色、台盼蓝排除、荧光显微镜和流式细胞术的吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染色、碘化丙啶(PI)染色、膜联蛋白V测定、TUNEL测定、DNA梯度、LDH活性和MTT测定来测量细胞死亡。在一个优选的实施方案中，细胞死亡是由于凋亡的诱导。由于凋亡诱导的细胞死亡可以通过观察包括细胞皱缩、细胞质浓缩、染色质分离和浓缩、膜起泡和膜结合凋亡小体形成的形态特征来测量。由于诱导凋亡而导致的细胞死亡可以通过观察生物化学标志来测量，所述生物化学标志包括核小体间DNA切割成寡核苷酸长度片段。传统的基于细胞测量由凋亡诱导引起的细胞死亡的方法包括光和电子显微镜、活体染料和核染色。生物化学方法包括DNA梯度、乳酸脱氢酶释放和MTT/XTT酶活性。此外，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口端标记DNA片段(TUNEL)和原位端标记(ISEL)技术，当与标准流式细胞染色方法结合使用时产生将细胞死亡与各种细胞参数(包括细胞周期和细胞表型)联系在一起的信息数据。这些方法的综述参见Loo和Rillema，Methods Cell Biol.1998；57：251-64，其通过引用并入本文。在一个示例性实施方案中，由凋亡引起的细胞死亡可以通过半胱天冬酶原-3的减少来测量。半胱天冬酶-3已经被认为是与“死亡级联”的起始相关的“效应物”半胱天冬酶，因此是细胞进入凋亡信号通路的入口点的重要标志物。半胱天冬酶-3被上游半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9激活，并且由于其用作不同信号传导途径的收敛点，所以非常适合作为凋亡测定中的读出。

这些方法的结果可用于测定活细胞的百分比。在一个优选的实施方案中，细胞死亡可以测量为活细胞的减少。由于本发明的组合物选择性地杀死衰老细胞，活细胞的减少指示衰老细胞减少。如II(b)部分中所述，样品中衰老细胞的数量可以为小于1％至大于15％。因此，施用本发明的抑制剂后活细胞的减少可以大于15％至小于1％。例如，活细胞的减少可以小于1％、小于2％、小于3％、小于4％或小于5％。或者，活细胞的减少可以是约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。另外，活细胞的减少可以大于10％、大于11％、大于12％、大于13％、大于14％或大于15％。

(d)施用

在某些方面，可以向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。使用标准有效技术进行施用，包括外周(即，不通过施用到中枢神经系统中)或局部施用于中枢神经系统。外周施用包括但不限于经口、吸入、静脉内、腹膜内、关节内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、颊、舌下或栓剂施用。局部施用(包括直接进入中枢神经系统(CNS))包括但不限于通过腰椎、心室内或实质内导管或使用手术植入的控释制剂。施用途径可以由待治疗的疾病或病状决定。例如，如果疾病或病状是COPD或IPF，组合物可以通过吸入施用。或者，如果疾病或病状是骨关节炎，则可以通过关节内发明施用组合物。基于待治疗的疾病或病状来确定施用途径在本领域技术人员的能力范围内。在一个特定实施方案中，经口施用本发明的组合物。

用于有效施用的药物组合物被有意地设计为适合于所选择的施用模式，并且适当使用药学上可接受的赋形剂，例如相容性分散剂、缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等。通过引用整体并入本文的Remington′s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Co.，Easton Pa.，16Ed ISBN：0-912734-04-3(最新版本)提供了从业者通常已知的制剂技术纲要。

对于治疗应用，向受试者施用治疗有效量的本发明的组合物。“治疗有效量”是足以产生可测量的反应(例如，衰老细胞的细胞死亡、抗老化反应、与变性疾病相关的症状的改善或与功能减退病症相关的症状的改善)的治疗组合物的量。本发明治疗组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便施用有效实现特定受试者所期望治疗反应的量的活性化合物。所选择的剂量水平将取决于多种因素，包括治疗组合物的活性、制剂、施用途径、与其它药物或治疗的组合、年龄、年龄相关疾病或病状、变性疾病、功能减退病症、症状以及所治疗的受试者的身体状况和此前的病史。在一些实施方案中，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性毒性的情况下逐步增加剂量。治疗有效剂量的确定和调整以及何时和如何进行这样的调整的评估是医学领域的普通技术人员已知的。

给药频率可以是每天或每周或每月一次、两次、三次或更多次，根据需要有效治疗症状。相对于疾病本身治疗的施用时机和治疗持续时间将由围绕病例的情况决定。治疗可立即开始，例如在由紧急医疗人员施加的损伤部位。治疗可以在医院或诊所本身开始，或者在从医院出院后或在门诊诊所看到之后的时间开始。治疗的持续时间可以是从一次性施用的单一剂量到治疗性治疗的终生疗程。

可以使用标准临床技术确定和优化典型的剂量水平，并且将取决于施用模式。

(e)受试者

受试者可以是啮齿动物、人、家畜动物、伴侣动物或动物园动物。在一个实施方案中，受试者可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施方案中，受试者可以是家畜。合适的家畜动物的非限制性实例可包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在另一个实施方案中，受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性实例可包括宠物例如狗、猫、兔和鸟。在另一个实施方案中，受试者可以是动物园动物。本文所用“动物园动物”是指可在动物园中发现的动物。这样的动物可以包括非人灵长类动物、大型猫、狼和熊。在一个特定实施方案中，受试者是人。

人类受试者可以是任何年龄。然而，由于衰老细胞通常与老化相关，所以人类受试者可以是较老的人类受试者。在一些实施方案中，人类受试者可以是约30、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95岁或更大年龄。在一些优选的实施方案中，人类受试者年龄为30岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为40岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为45岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为50岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为55岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为60岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为65岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为70岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为75岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为80岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为85岁或更大。在另一些优选的实施方案中，人类受试者的年龄为90岁或更大。

此外，有此需要的受试者可以是患有如下所述的年龄相关疾病或病状的受试者。

(f)老化和与年龄有关的疾病

已经证明，衰老细胞驱使年龄相关的病状，并且这些细胞的选择性消除可以预防或延迟年龄相关的恶化。因此，衰老细胞可以是治疗老化和年龄相关疾病的治疗靶标。因此，去除衰老细胞可延迟组织功能障碍并延长健康范围。期望衰老细胞的清除改善组织环境，从而改善其余非衰老细胞的功能。

本公开内容提供了用于延迟受试者老化的至少一个特征的方法，所述方法包括向受试者施用包含治疗有效量的Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物。本文所用“老化的特征”可以包括但不限于免疫系统的系统性衰退、肌肉萎缩和降低的肌肉强度、降低的皮肤弹性、延迟的伤口愈合、视网膜萎缩、降低的晶状体透明度、降低的听力、骨质疏松症、肌肉减少、头发发白、皮肤皱纹、视力差、脆弱和认知损伤。

一方面，本发明的组合物选择性地杀死衰老细胞。这样，在老化过程中靶向衰老细胞可以是预防性策略。因此，向受试者施用包含治疗有效量的Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物可以预防老年受试者的伴随疾病和延迟死亡率。此外，选择性地杀死衰老细胞可以增强免疫系统、延长健康寿命和改善受试者的生活质量。另外，选择性地杀死衰老细胞可延迟肌肉减少。肌肉减少是与老化相关的骨骼肌质量、质量和强度的退化性损失。因此，肌肉减少的延迟可以减轻受试者的脆弱、减少跌倒的风险、减少骨折和降低功能性残疾。此外，选择性地杀死衰老细胞可延迟皮肤的衰老。老年皮肤皱纹增加、免疫屏障功能降低并且对皮肤癌和创伤的易感性提高。这样，选择性地杀死衰老细胞可以延迟皮肤皱纹、延迟免疫屏障功能降低的发生，并降低对受试者皮肤癌和创伤的易感性。选择性地杀死衰老细胞还可延迟视网膜萎缩的发生，并且通过视觉测试测量降低的晶状体透明度。

测量老化的方法在本领域中是已知的。例如，可以通过事件性非椎骨骨折、事件性髋骨骨折、事件性总骨折、事件性椎骨骨折、事件性重复性骨折、骨折后的功能恢复、腰椎和髋骨矿物质密度降低、膝关节屈曲、NSAID使用、疼痛的关节数目和骨关节炎来测量骨的老化。老化也可以在肌肉中通过功能下降、下落速率、反应时间和握力、上下肢的肌肉质量减少和双任务10米步速来测量。此外，可以通过收缩和舒张血压变化、事件性高血压、主要心血管事件例如心肌梗死、中风、充血性心脏病和心血管死亡率在心血管系统中测量衰老。此外，可以通过认知衰退、事件性抑郁和事件性痴呆在大脑中测量衰老。此外，可通过感染率、上呼吸道感染率、流感样疾病的发生率、导致入院的事件性严重感染、事件性癌症、植入物感染率和胃肠道感染率来测量免疫系统的衰老。老化的其它指标可以包括但不限于口腔健康、牙齿损失、胃肠道症状的速率、空腹血糖和/或胰岛素水平的变化、身体组成、肾功能下降、生活质量、与日常生活活动相关的事件性残疾以及事件性护理入院。测量皮肤老化的方法在本领域中是已知的，并且可以包括跨表皮水分损失(TEWL)、皮肤水合、皮肤弹性、乌鸦脚的面积比分析、敏感性、辐射、粗糙、斑点、松弛、皮肤色调均匀性、柔软度和浮肿(深度变化)。

本公开内容还提供了治疗年龄相关疾病或病状的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用包含治疗有效量的Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物。本文所用“年龄相关疾病或病状”可包括但不限于变性疾病或功能减退性病症，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、白内障、黄斑变性、青光眼、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗死、中风、高血压、特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺病(COPD)、骨关节炎、2型糖尿病、肥胖症、脂肪功能障碍、冠状动脉疾病、脑血管疾病、牙周病、癌症治疗相关的残疾例如各种组织的萎缩和纤维化、脑和心脏损伤以及治疗相关的骨髓增生异常综合征以及与DNA损伤修复和端粒维持中的加速老化和/或缺陷相关的疾病例如类癌综合征(即，Hutchinson-Gilford早年衰老综合征、Werner综合征、Bloom综合征、Rothmund-Thomson综合征、Cockayne综合征、色素性干皮症、毛细血管萎缩症、组合的色素性干皮病-Cockayne综合征、限制性皮肤病)、共济失调毛细血管扩张症、范可尼贫血、弗里德赖希共济失调、先天性角化不良、再生障碍性贫血、IPF等。诊断和鉴定年龄相关疾病或病状的方法在本领域中是已知的。

本公开内容还提供了杀死治疗诱导的衰老细胞的方法。所述方法包括向已经接受DNA损伤治疗的受试者施用包含治疗有效量的Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物，和杀死治疗诱导的正常组织和肿瘤组织中的治疗诱导的衰老细胞，接着进行DNA损伤治疗。

DNA损伤治疗的非限制性实例可包括γ-辐射、烷化剂例如氮芥(苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑)；亚硝基脲(链脲霉素、卡莫司汀、洛莫司汀)；烷基磺酸盐(白消安)；三嗪(达卡巴嗪、替莫唑胺)和乙烯亚胺(噻替派、六甲蜜胺)；铂药物，例如顺铂、卡铂、奥沙利铂；抗代谢物，例如5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、克拉屈滨)、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、培美曲塞、喷司他丁、硫鸟嘌呤；蒽环类，例如柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星；抗肿瘤抗生素，例如放线菌素D、博莱霉素、丝裂霉素-C、米托蒽醌；拓扑异构酶抑制剂，例如拓扑异构酶I抑制剂(托泊替康、伊立替康)和拓扑异构酶II抑制剂(依托泊苷、替尼泊苷、米托蒽醌)；有丝分裂抑制剂，例如紫杉烷(紫杉醇、多西他赛)；埃坡霉素(伊沙匹隆)、长春花生物碱(长春碱、长春新碱、长春瑞滨)和雌氮芥。

基于电离辐射和各种化疗剂在体内引起明显的衰老反应的观察，治疗诱导的衰老细胞可能是DNA损伤治疗(例如癌症治疗)后长期后果(ramification)的原因。因此，治疗诱导的衰老细胞的全身积累可能驱使癌症幸存者的加速生理下降。加速的生理下降也可以被称为加速老化。因此，一旦通过全身放射或化疗移除肿瘤，则可以在多种其他器官中触发衰老，导致患者的长期后果。长期后果可能包括导致受试者残疾和合并症的生活质量下降。例如，已经接受DNA损伤治疗的受试者可能经历生理功能的不成比例的下降，例如不能爬上楼梯或抬起以将物品放在货架上和/或增加的功能性残疾例如难以进食、敷料并保持足够的卫生。另外，电离辐射的晚期作用可包括长期骨髓损伤和/或肺纤维化。长期骨髓损伤可以促进发育不良性贫血和/或骨髓增生异常综合征或白血病。此外，本发明人证明，在电离辐射之后，肺、肌肉和脑中的衰老细胞大大增加。这些长期后果提供了加速老化和癌症治疗之间的联系。测量加速老化的方法可以如上述测量老化的方法所述。因此，向受试者施用包含本发明抑制剂的组合物可以防止已经接受DNA损伤治疗的受试者加速老化。

实施例

包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表由发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因此可以被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对公开的具体实施方案进行许多改变，并且仍然获得相同或相似的结果。

实施例1.ABT263选择性地以剂量依赖性和时间依赖性方式、但细胞类型非依赖性和种类非依赖性方式杀死培养物中的衰老细胞。

正常人类细胞可在广泛的细胞分裂或暴露于基因毒性或致癌应激(例如电离辐射(IR)或突变体Ras^8-10的表达)后经历衰老。通过任何这些方法诱导衰老的细胞具有几个特征(图5)。细胞衰老是一种重要的肿瘤抑制机制，因为它永久地阻止受损和遗传性疾病细胞的增殖，并促进它们被免疫系统去除^8-10。然而，如果SC产生超过免疫清除能力或免疫系统不能有效地去除SC，则SC可以在组织中积累；实际上，这在老化和暴露于IR^2，6后在小鼠和人中发生。SC可以破坏组织结构和功能，并通过分泌炎性细胞因子和许多其他因素(称为衰老相关分泌表型(SASP)^2，5，6)直接和间接加速干细胞和祖细胞耗尽。通过由药物AP20187激活的INK-ATTAC转基因选择性消除BubR1亚等位基因早衰症小鼠的p16^Ink4a(p16)-阳性SC延迟了几种年龄相关病理的发病⁷。此外，这些小鼠SC的晚期耗尽减弱年龄相关疾病的进展⁷。这些发现表明，SC在某些年龄相关疾病中起着起因作用。因此，SC与不依赖于转基因的药物的药理学清除是延长人体健康寿命的重要目标。这样的溶酶体药物也可能是新型的放射缓解剂，因为SC参与IR的某些晚期作用的发病机制，例如长期BM(LT-BM)损伤和肺纤维化^11，12。

尽管已作出许多努力以鉴定选择性地杀死SC的小分子，但在筛选数千种化合物后，甚至我们自己的组亦仍未发现senolytic药物。因此，我们采取了一个有针对性的方法，单独滴定靶向预计对衰老维持而言重要的途径的少数小分子的细胞毒性。我们评估了用分子孵育后，非衰老(N)或通过IR诱导衰老(S)的正常人WI-38成纤维细胞的存活率(表1)。有了这种方法，我们鉴定出ABT263作为一种有效的senolytic药物。WI-38细胞对ABT263(LD₅₀＝12.6μM)具有抗性，而IR诱导的SC是高度敏感的(LD₅₀＝0.61μM)(图1A-D；图6)。当通过复制耗尽或致癌性Ras表达诱导衰老时，我们观察到类似的结果(图1A-D和表2)。因此，ABT263应当具有针对SC的优异治疗窗口，而不管它们如何诱导。ABT263对SC的细胞毒性是快速的，仅需要约24小时来杀死大多数(70-80％)的SC(图1E-F)。此外，ABT263以细胞类型非依赖性和种类非依赖性方式对SC具有细胞毒性，因为不同的衰老人和小鼠细胞对ABT263比其非衰老对应物更敏感(图1G-I)。

实施例2.ABT263通过凋亡杀死衰老细胞。

ABT263是许多肿瘤细胞凋亡的强效诱导剂¹³。为了确定ABT263作用于SC的机制，我们分析了在用或不用泛半胱天冬酶抑制剂Q-VD-OPh(QVD)的载体或ABT263处理后IR诱导的WI-38SC的凋亡¹⁴。ABT263通过诱导凋亡选择性地杀死SC，其通过QVD消除(图2A-C)。ABT263可能通过固有凋亡途径杀死SC^15，16，这是因为在用ABT263孵育后SC活化半胱天冬酶3，但不激活半胱天冬酶8(图2D-F)。

由于如此前的研究^16，17所提示的抗或促凋亡蛋白的差异表达，我们提出了SC是否对ABT263比非衰老细胞更敏感的问题。WI-38细胞获得对ABT263的敏感性，因为它们在暴露于IR 7天后表达增加的水平的衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性(图2G)。ABT263敏感性与Bcl-x1和Bak的表达增加相关，而与Bcl-2、Bax、Bad、Bid、Bim和Noxa的表达增加无关(图2H-K；图7)。分别使用ABT199¹⁸和WEHI539¹⁹单独抑制Bcl-2或Bcl-x1没有选择性地杀死SC；然而，ABT199和WEHI539的组合是选择性的(图2L-M；图8)。该发现表明，Bcl-2和Bcl-x1在保护SC免于死亡方面是多余的，并且需要同时抑制Bcl-2和Bcl-x1以选择性诱导SC凋亡。与此想法一致，使用shRNA的Bcl-2或Bcl-x1的下调对SC存活具有最小的影响，但两种蛋白质的下调降低SC存活率(图2N)。

实施例3.与更昔洛韦一样，ABT263清除衰老细胞并抑制TBIp16-3MR小鼠中的衰老相关分泌表型(SASP)。

因为p16是广泛使用的SC生物标志物和干细胞老化的调节剂^20-22，所以可以使用在p16启动子的控制下携带含荧光素酶的三模态报告蛋白(3MR)的p16-3MR转基因小鼠通过生物发光在体内监测SC累积和清除(图9A)²³。我们将年轻(2月龄)p16-3MR小鼠暴露于亚致死性TBI(6Gy)。如通过发光测定的，经辐射的小鼠在TBI后6个月显示出SC的时间依赖性增加(图9B-D)，而未经辐射的p16-3MR小鼠在达8月龄时显示出很少的发光²³。这些发现与SC在40周龄之前在正常小鼠中罕见的观察一致^20，21，但是在暴露于促进老化或肿瘤发生的基因毒性损伤后迅速累积^20，21。肺在TBI后显示出最大的SC增加，随后是骨骼肌和脑；肝和心脏显示出最小的增加(图9E-F)。

p16-3MR转基因可以在体内选择性地杀死p16阳性SC，因为3MR还含有单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，其磷酸化更昔洛韦(GCV)，将其转化为毒性DNA链终止子；我们显示磷酸化GCV掺入线粒体DNA，引起凋亡细胞死亡²⁴，并且在所使用的剂量下对野生型或p16-3MR小鼠无毒²³。两个GCV治疗周期有效清除了p16-3MR小鼠中由IR诱导的SC；显然，ABT263类似地起作用(图3A-C)。通过分析肺确认了SC清除率。GCV和ABT263不仅减少IR诱导的SC(图3D-F)，而且抑制由TBI²⁵诱导的SASP(图3G-J)。因此，在经辐射的p16-3MR小鼠中，ABT263对于清除IR诱导的SC与GCV一样有效。

实施例4.ABT263可以在体内清除衰老的HSC以减轻TBI诱导的造血过早老化和LT-BM损伤。

HSC衰老被认为是IR诱导的LT-BM损伤的潜在原因²⁶。IR诱导的衰老HSC表现出类似于来自老年动物的HSC中所见的改变，包括降低的自我更新、克隆形成和长期再增殖能力以及骨髓斜移^4，26-29。因此，IR诱导的LT-BM损伤是造血系统过早老化的模型^4，26-32。此外，LT-BM损伤可以在经辐射患者中随时间推移或在额外的造血应激后促进再生障碍性贫血、骨髓发育不良综合征或白血病^33-35。

使用我们的亚致死TBI C57BL/6小鼠模型⁴，我们提出了ABT263是否可以有效地清除由IR诱导的衰老的HSC以及清除是否减少IR诱导的LT-BM损伤或造血过早老化的问题。与来自假辐射小鼠的HSC相比，来自经辐射对照(经载剂处理)小鼠的BM HSC显示出p16 mRNA和SA-□-gal水平显着增加(图4A-C)，表明亚致死TBI诱导HSC衰老。通过这些标志物，ABT263处理有效清除衰老的HSC。这种效应可能归因于ABT263对衰老HSC的选择性耗尽，因为体外ABT263显著降低来自经辐射小鼠的BM HSC的克隆形成，但对来自对照未经辐射小鼠的BM HSC的克隆形成几乎没有影响(图10)。ABT263对衰老HSC的清除未定量地减少BM HSC或造血祖细胞(HPC)(图11)，这可能是由于HSC的“正常”克隆的扩增而遗传或已经修复了IR诱导的损伤。这一建议得到以下发现的支持：ABT263处理显著改善了HSC的克隆形成和长期植入能力(图4D-O)。此外，ABT263减弱IR诱导的HSC骨髓斜移和HSC静息的破坏，并且减少具有持续性DNA损伤的HSC(图4D-O；图12)。髓样斜移的衰减可部分归因于增加的淋巴组织生成(图13)。这些研究结果表明，ABT263可以在体内清除IR诱导衰老的HSC，该清除可以减轻TBI诱导的LT-BM损伤或造血过早老化。

我们的结果提供了SC的选择性清除在体内在药理学上可实现的概念的第一证据。ABT263是第一种senolytic药物，并且还具有作为新型辐射缓解剂以减少与SC相关的晚期IR作用的潜力。因为ABT263具有一些毒性副作用³⁶，而且不良药物作用是需要长治疗间隔的抗衰老疗法的障碍^5，37，所以仍然要确定ABT263是否可用于延迟正常老年动物和人类的衰老或年龄相关疾病。

实施例的材料和方法

细胞：人WI-38成纤维细胞(WI38细胞，#CCL-75^TM)、人IMR-90成纤维细胞(IMR90细胞，#CCL-186^TM)、人肾上皮细胞(REC细胞，#PCS-400-012^TM)获自ACTT(Manassas，VA，USA)。如所述，从小鼠胚胎分离小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)¹。所有细胞均在37℃和5％CO₂的潮湿培养箱中于完全培养基(CM)(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，补充有10％胎牛血清[FBS]，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素[全部来自Atlanta Biologicals，Norcross，USA])中培养。使用WI-38细胞(＜25)、IMR-90(＜25)、REC细胞(＜25)和MEF(＜3)的低传代作为非衰老对照或用于诱导衰老以避免复制性衰老。为了诱导复制性衰老，将WI-38细胞传代培养，直到在约38次传代或60次群体倍增后细胞分裂停止(图5)²。为了通过电离辐射(IR)诱导衰老，将70％汇合的细胞在具有旋转平台的JL Shepherd Model Mark I137Cyγγ-辐射器(JL Shepherd，Glendale，CA，USA)中以1.080Gy/min的剂量速率暴露于10Gy IR。细胞在3天后以1∶3稀释传代一次，并在IR后7天变得完全衰老，如图5所示²。为了通过致癌性Ras(Ras^V12)的表达诱导衰老，用逆转录病毒pBabe-H-Ras或pBabe-puro(对照)(Addgene，Cambridge，MA，UAS)^2，3感染WI-38细胞。在感染后两天，在嘌呤霉素(2μg/ml)(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)中选择细胞5天，之后它们变得衰老(图5)。将衰老细胞维持在培养物中几天，每3天更换培养基直到使用。对于体外细胞培养实验，我们通常重复实验至少三次以确保数据的重复性。此外，实验重复三次将允许我们获得3个独立的观察值用于统计分析。

细胞活力测定：如下所述，使用如下所述三种测定来测量细胞活力：

流式细胞术：将非衰老细胞和衰老细胞以约70％的汇合度接种到24孔或48孔的孔中。孵育过夜后，非衰老细胞在达到融合后变得静息。用载剂(0.1％DMSO或PBS)或增加浓度的表1中列出的化合物处理静息的非衰老细胞和永久生长停滞的衰老细胞不同的持续时间。用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA脱落，并获取在含有2％FBS的PBS中。在室温下用PBS中的碘化丙啶(PI 100ng/ml)孵育1分钟后，将细胞以1200rpm离心6分钟，然后重悬于含有2％FBS的PBS中，用于通过BD LSR II流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)分析。通过流式细胞术以恒定流速对活细胞(PI^-细胞)进行计数，并使用下式计算为用载剂处理的对照细胞的百分比：对照百分比＝(N_药物/Nc)×100，其中N_药物和Nc代表经药物处理和经载剂处理的细胞的PI-存活细胞的绝对数目。

MTT(3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴化物)测定：获取细胞，洗涤并重悬于CM中，并如上所述加入24-孔或48-孔板的孔中。在用载剂或递增浓度的ABT263孵育72小时后，从培养物中除去上清液，并将500μl MTT(5mg/ml，在PBS中)加入每个孔中。在37℃下4小时后，通过用300μl DMSO裂解细胞来溶解甲臜(formazan)。使用微量板读取仪(BioTek，Winooski，Vermont，USA)在595nm测量甲臜的吸光度。按照前述方法计算细胞活力。

台盼蓝排除测定法：获取细胞，洗涤并重悬于CM中，并如上所述加入的6孔板的孔中。用载剂或增加浓度的ABT263孵育72小时后，通过用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA消化获取，然后用0.1％台盼蓝(Sigma，St.Louis，MO，UAS)染色。活细胞对台盼蓝染色呈阴性，并在光学显微镜下计数。

LD₅₀值的计算：对于每种化合物生成剂量-响应曲线，并通过概率单位(Probit)分析计算50％致死剂量值(LD₅₀)。简而言之，概率单位(设置为y)通过查找其在Finney表中的响应％的对应来确定。化合物浓度的对数用作x。通过拟合回归线，我们生成公式y＝ax+b。通过计算概率单位为5.00的′x′，然后取浓度的反对数来确定LD₅₀值⁵。

衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色：使用商业试剂盒(Cat.#：9860)(CellSignaling Technology，Danvers，MA，USA)根据制造商的说明书测定SA-β-gal染色。简言之，将细胞在2％(v/v)甲醛/0.2％戊二醛中固定10分钟，然后在SA-β-gal染色溶液(1mg/ml5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-半乳糖苷酶，40mM柠檬酸，pH 6.0，40mM磷酸钠，pH 6.0，5mM亚铁氰化钾，5mM铁氰化钾，150mM氯化钠和2mM氯化镁)中在37℃下培养10小时。将衰老细胞鉴定为在光学显微镜下被染成蓝色的细胞。在载玻片上的20个随机视野中计数总共1000个细胞以确定SA-β-gal阳性细胞的百分比²。

使用来自Molecular Probes(Life Technologies，Carlsbad，CA)的ImaGeneGreen^TM C₁₂FDG lacZ基因表达试剂盒，根据制造商说明书和此前报道的具有以下修改的方案，通过流式细胞术进行流式SA-β-gal染色测定⁶。将WI-38细胞用补充有10％FBS的DMEM培养基中的150μM氯喹在37℃孵育3小时。用PBS洗涤两次以除去氯喹后，用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA使细胞脱落，并用预热的C₁₂FDG溶液(32μM在补充有10％FBS的DMEM培养基中的C₁₂FDG)在37℃水浴下孵育2小时。再次用PBS洗涤细胞，并立即用LSRII流动机(BDBiosciences)分析。通过PI染色从测定中排除死细胞。

BrdU掺八测定：按照此前所述并伴有小的修改⁷，利用BrdU掺入测定来测定细胞增殖。简言之，在含有10μM BrdU(Sigma，St.Louis，MO，USA)的CM中于4孔玻璃载玻片室(NalgeNunc Inc.，Naperville，IL，USA)中孵育细胞6小时。将它们用PBS洗涤两次并在-20℃下在70％乙醇中固定30分钟。用PBS洗涤3次后，将细胞在室温下于DNA变性溶液(2N HCl/0.1％Triton X-100在PBS中)中孵育1小时，随后在室温下在0.1M硼酸钠(pH8.5)中孵育10分钟。用PBS洗涤并在PBS/1％牛血清白蛋白中孵育60分钟后，将细胞在4℃下用2μg/ml小鼠抗BrdU单克隆抗体(克隆BU-33，来自Sigma)孵育过夜，然后用Texas红-缀合的山羊抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA，USA)孵育，在每个步骤之间进行充分洗涤。用Hoechst 33342(Molecular Probes，Eugene，OR，USA)复染核DNA。使用装配有100W水银光源的Axioplan研究显微镜(Carl Zeiss Inc，Jena，Germany)观察细胞并拍照。用DageCCD100集成照相机(Dage-MTI，Michigan，USA)和Flashpoint 128捕获板(IntegralTechnologies，Indianapolis，Indiana，USA)捕获图像。使用Image Pro Plus软件(MediaCybernetics，Rockville，Maryland，USA)处理捕获的图像，并用Adobe Photoshop V6.0显示。

细胞凋亡分析：将细胞以4至6×10⁵个细胞/孔接种到6孔板中。孵育过夜后，用载剂或含有或不含20μM Q-VD-OPh(APExBIO，Houston，TX，USA)的1.25μM ABT263处理细胞。处理后24小时获取细胞，并以1×10⁶个细胞/ml重悬于1×膜联蛋白V结合缓冲液(BDBiosciences)中。在室温下用5μl膜联蛋白V-FITC(BD Biosciences)或PI(1mg/ml)于黑暗中孵育细胞悬浮液的等分试样(100μl)15分钟。在加入400μl 1×结合缓冲液后，通过BDLSR II流式细胞仪(BD Biosciences)分析每个样品10,000个细胞。

Western印迹分析：将细胞(1×10⁶)在100μl裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.4，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，10％甘油，1.0％NP-40，0.1M NaF，1mM DTT，1mM PMSF，1mM NaVO4，2μg/ml亮肽素和抑肽酶)中于冰上孵育30分钟，并使用超声波转换器(SonicDismembrator Ultrasonic Convertor)(型号F60，来自Fisher，Pittsburgh，PA，USA)在冰上将细胞提取物以25秒的间隔超声处理3次(每次5秒)。使用Bio-Rad Dc蛋白测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA，USA)对蛋白质浓度进行定量。将等量的来自每种提取物的蛋白质(25-50μg/泳道)在12％SDS-PAGE凝胶上分离。将蛋白质印迹到NOVEX NC膜(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)。用TBS-T(25mM Tris-HCl中的5％脱脂乳，pH7.4，3mM KCl，140mM NaCl和0.05％Tween)封闭膜，随后用初级抗体以预定的最佳浓度探测，如补充表3所示，在4℃下过夜或在室温下1小时。用TBS-T充分洗涤后，用适当的过氧化物酶缀合的二抗(Jackson ImmunoResearchEutope，Suffolk，CB8 1JX，UK)在室温下孵育膜1小时。用TBS-T洗涤三次后，使用ECL Western印迹检测试剂(Cat # WBKLS0100)(EMD MILLIPORE，Newmarket，Suffolk，UK)检测印迹，并通过将印迹暴露于X射线胶片(Pierce Biotech，Rockford，IL，USA)记录。用于Western印迹分析的所有抗体列于表3中。

慢病毒产生：慢病毒在根据Roche规程使用FuGEN6-HD(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)用单独的慢病毒载体以及包装质粒pCMV-VSV-G和psPAX2(Addgene，Cambridge，MA，USA)瞬时转染人胚肾(HEK)293T细胞后产生。48小时后收集含有病毒颗粒的上清液，并通过0.22mm过滤器过滤。使用来自System Biosciences(Mountain View，CA，UAS)的PEG-it TM病毒沉淀溶液试剂盒根据制造商的说明书浓缩病毒颗粒。

用短发夹RNA(shRNA)敲减Bcl-2和/或Bcl-XL：对照慢病毒pLKO.1载体和含有用于人Bcl-2(RHS4533-EG596)和Bcl-XL(RHS4533-EG598)的shRNA的pLKO.1载体获自ThermoFisher Scientific，Inc.(Waltham，MA，USA)。按照上述制备病毒颗粒。为了建立稳定的Bcl-2和/或Bcl-XL敲减WI-38细胞，在32℃于离心(900×g)下用病毒颗粒感染细胞两次30分钟。用嘌呤霉素(2mg/ml)选择稳定转导的细胞。在使用细胞前，通过Westem印迹分别确认WI-38/Bcl-2、WI-38/Bcl-XL和WI-38/Bcl-2/Bcl-XL细胞中Bcl-2和/或Bcl-XL的敲减。

小鼠：雄性C57BL/6J(或CD45.2)小鼠和B6.SJL-Ptprc^aPep3^b/BoyJ(或CD45.1)小鼠购自Jackson Lab(Bar Harbor，MA，USA)。p 16-3MR转基因小鼠由Judith Campisi博士(Buck Institute for Research on Aging，Novato CA)友情提供⁸。将小鼠随机分配至置于阿肯色医科大学(UAMS)AAALAC认证的动物设施中的每笼4至5只小鼠，然后随机分配给治疗组。对于动物研究，样品容量根据我们以前的经验估计。他们随意获得食物和水。UAMS的动物护理机构和使用委员会批准了本研究中使用的所有实验规程。

全身辐射(TBI)和ABT263和更昔洛韦(GCV)治疗：将2至3月龄的C57BL/6J和p16-3MR转基因小鼠暴露于作为对照的假辐射或亚致死剂量(6Gy)的在JL Shepherd ModelMark I 137铯γ-辐射器(JL Shepherd，Glendale，CA)中1.080Gy/min的剂量速率的TBI。在TBI后8或16周，用载剂(PBS或乙醇/聚乙二醇400/Phosal 50PG，10∶30∶60)、ABT263(乙醇/聚乙二醇400/Phosal 50PG载剂)或GCV(在PBS中)处理小鼠。通过管饲法以50mg/kg/d每周期给予ABT 7天，持续2个周期，间隔2周。通过腹膜内注射以25mg/kg/d每周期5天给予小鼠GCV，持续2个周期，间隔2周。如下所述，在最后一次用载剂、ABT263或GCV处理次日，对p16-3MR小鼠进行发光成像。在成像次日通过吸入CO₂并随后颈部脱臼使小鼠安乐死。获取组织用于如下所述的立即组织发光成像或RNA提取，以通过qRT-PCR分析p16、IL-1α、CCL-5和CXCL-10 mRNA水平。在载剂或ABT263处理后5周将C57BL/6小鼠安乐死以获取骨髓细胞(BMC)，用于下述测定。

生物发光测定：为了进行体内发光，对小鼠腹膜内注射250ul的XenolightRediJect腔肠素h(100μg/mL，Calipers-PerkinElmer，Waltham，MA，USA)。在注射后5分钟，用4％异氟烷气体以1L/分钟的氧气流量麻醉小鼠。使用配备有Living Image Version4.3.1(Caliper Life Sciences，Hopkinton MA，USA)的Xenogen IVIS-200光学体内成像系统获得发光图像。小鼠在扫描器中处于仰卧位置。将感兴趣的区域仔细地放置在所有生物发光信号周围，同时最小化包含的散射信号。在注射后15-20分钟时用E视野获取所有图像扫描，同时将小鼠保持在1L/分钟氧气流下的1.5％异氟烷气体下。

对于组织发光成像，从安乐死的小鼠获取组织后，立即将组织浸泡在含有2％FBS和1∶10稀释的Xenolight RediJect腔肠素h的预热(37℃)PBS中10分钟。将它们转移到新的35-mm培养皿中，在浸泡在底物溶液中后12-15分钟使用Xenogen IVIS-200光学体内成像系统拍摄发光图像。

骨髓单核细胞(BM-MNC)、谱系阴性造血细胞

和HSC的分离：在小鼠安乐死后立即从小鼠获取股骨和胫骨。使用21号针和注射器将BM细胞从骨中冲洗到含有2％FCS的HBSS中。汇集来自3至10只小鼠的细胞，并通过Histopaque 1083(Sigma，St.Louis，MO，UAS)离心以分离BM-M[NC。为了分离Lin-细胞，用对鼠CD5、Mac-1、CD45R/B220、Ter-119和Gr-1具有特异性的缀合生物素的大鼠抗体孵育BM-MNC。通过用山羊抗大鼠IgG顺磁珠(Dynal Inc，Lake Success，NY，USA)以约4∶1的珠子∶细胞比例孵育来将标记的成熟淋巴样细胞和骨髓细胞耗尽两次。用磁场除去结合顺磁珠的细胞。用2％FCS/HBSS洗涤阴性分离的Lin^-细胞两次并以1×10⁶/ml重悬于完全培养基(补充有10％FCS、2mM L-谷氨酰胺、10μMHEPES缓冲液和100U/ml青霉素和链霉素的RPMI1640培养基)中。在用抗CD16/32抗体预孵育Lin^-细胞以阻断Fcγ受体之后，通过BD FACSAria II细胞分选仪(BD Biosciences，SanJose，CA)分选HSC(CD150⁺CD48^-LSK⁺细胞)，然后用-Scal-PE、c-Kit-APC-Cy7、CD150^-APC和CD48^-太平洋蓝色抗体染色。通过门控出用PI染色阳性的细胞排除死细胞。染色中使用的所有抗体的信息提供在表4中。

B细胞分析：用FITC标记的抗CD93、APC标记的IgM和PE标记的B220将来自每只小鼠的BM-MNC(1×10⁶)在4℃孵育30分钟，然后用含0.25μg/ml PI的PBS洗涤。通过BD LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)分析B细胞群。

单细胞培养：将来自经辐射和经假辐照小鼠的60个单HSC直接分选入圆底96孔板的孔中。在不存在或存在1.25μM ABT263的情况下，将它们培养在补充有10％FCS、50ng/mlSCF、Flt3、TPO和GM-CSF、20ng/ml IL-3、5U/ml EPO的RPMI 1640培养基中。每3天加入新鲜制备的培养基。两周后，对由每个HSC产生的细胞数进行计数。

鹅卵石区形成细胞(CAFC)测定：通过在平底96孔板(Falcon，Lincoln Park，NJ)的每个孔中接种10³/孔FBMD-1基质细胞来制备饲养细胞基质层。一周后，将经历上述各种处理的重悬于CAFC培养基(补充有20％马血清、10^-5M氢化可的松、10^-5M 2-巯基乙醇、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Iscove′s MDM)中BM-MNC以以3倍的间隔、6次稀释覆盖在这些基质层上。将每种稀释液布板于20个孔，以允许对在基质层下形成造血细胞克隆的前体细胞进行有限稀释分析。通过更换一半培养基以每周培育培养物。在第14天和第35天测定CAFC的频率。如果观察到至少一个相-黑造血克隆(含有5个或更多个细胞)，则将孔记分为阳性。然后如先前所述利用泊松统计(Poisson statistic)来计算CAFC的频率^9，10。

竞争性再增殖测定(CRA)：将来自CD45.2小鼠的BM细胞在暴露于亚致死性TBI剂量(6Gy)或用载剂或ABT263处理进行假辐射后17周与2×10⁵个从3只CD45.1小鼠汇集的竞争性BM细胞混合，然后通过静脉窦的眼眶后注射移植入致死性辐射的(9.5Gy TBI)CD45.1受者(6个受体/组)。如前所述在移植后不同时间分析受体中的供体细胞植入^9，10。

细胞周期和DNA损伤分新：首先用针对各种细胞表面标志物的抗体对Lin^-细胞进行染色，并使用来自BD-Pharmingen(San Diego，CA)的固定/渗透溶液固定和通透化。随后，用抗Ki67-FITC抗体、抗磷酸组蛋白-H2AX(γH2AX)(Ser139)-Alex 647和7-AAD对其进行染色，然后如前所述通过流式细胞仪进行分析⁹。

定量PCR(qPCR)：使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN，Gaithersburg，MD)从非衰老和衰老的WI-38细胞和各种组织提取总细胞RNA。使用Applied Biosystems的高容量cDNA反转录试剂盒(Life Technologies，Grand Island，NY，USA)根据制造商的说明立即进行逆转录。

使用Zymo研究Quick-RNA微量制备试剂盒(The Epigenetics Company，Irvine，CA，USA)根据制造商的说明书从约5000个分选的HSC中提取总细胞RNA。使用Fluidigm方案(Fluidigm，South San Francisco，CA，USA)立即进行逆转录：将1μl RNA加入含有2.5μlCells Direct 2×反应混合物(Invitrogen，Grand Island，NY，USA)、0.15μl无核酸酶水、0.1μl Superscript III/Platinum Taq混合物(Invitrogen)和1.25μl 0.2×TaqMan测定混合物的96孔板各孔中，所述测定混合物包含用于小鼠p16和p21和HPRT mRNA(Invitrogen)的1∶100稀释的TaqMan测定合并物，如表5所示。

为了测量WI-38细胞和小鼠组织中的p16 mRNA表达，使用来自Applied Biosystem的TaqMan qPCR试剂和引物(表5)进行qPCR。人GAPDH和小鼠HPRT用作内部对照。简言之，将1μl cDNA与10μl TaqMan Universal Mastermix(Invitrogen)和1μlTaqman引物混合。向样品中加入8μl H₂O，得到总共20μl，并进行qPCR(50℃2分钟，95℃10分钟，40×(95℃15秒和60℃1分钟)。所有反应在ABI一步加实时PCR系统(Applied Biosystems)上一式三份进行。

为了测量WI-38细胞中的p21和GAPDH mRNA水平以及小鼠组织中的IL-1α、TNFα、CCL-5和CXCL-10 mRNA水平，使用SYBR测定试剂盒(Applied biosystems in lifetechnologies)。简言之，将1μl cDNA与7.5μl SYBR Green PCR Master Mix和0.2μl引物混合(表5)。然后向样品中加入6.30μl H₂O，得到总共15μl混合物。qPCR条件如下：95℃10分钟，40×(95℃15秒和60℃1分钟)，95℃15分钟，60℃60分钟，95℃15分钟。所有反应在ABI一步加实时PCR系统上一式三份进行。

统计分新：数据显示正常方差。没有使用统计方法来预先确定样品容量。实验不是随机的，除了如小鼠部分中描述的使用小鼠的体内动物研究。研究者在实验和结果评估过程中没有分配盲目性。使用来自GraphPad Software(San Diego，CA)的GraphPad Prism通过方差分析(ANOVA)分析数据。在方差分析证明组平均值之间的事后比较的情况下，这些使用Neuman-Keuls或Tukey的多重比较试验进行。P＜0.05被认为是显著的。

实施例的参考文献

1.Le，O.N.et al.lonizing radiation-induced long-term expression ofsenescence markers in mice is independent of p53 and immune status.Aging Cell9，398-409(2010).

2.Munoz-Espin，D.&Serrano，M.Cellular senescence：from physiology topathology.Nat Rev Mol Cell Biol 15，482-496(2014).

3.Richardson，R.B.lonizing radiation and aging：rejuvenating an oldidea.Aging (Albany.NY)1，887-902(2009).

4.Shao，L.et al.Total body irradiation causes long-term mouse BMinjury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a-and Arf-independent manner.Blood 123，3105-3115(2014).

5.Tchkonia，T.，Zhu，Y.，van，D.J.，Campisi，J.，&Kirkland，J.L.Cellularsenescence and the senescent secretory phenotype：therapeutic opportunities.JClin Invest 123，966-972(2013).

6.van Deursen，J.M.The role of senescent cells in ageing.Nature 509，439-446(2014).

7.Baksr，D.J.et al.Clearance of p16Ink4a-positive senescent cellsdelays ageing-associated disorders.Nature 479，232-236(2011).

8.Campisi，J.Aging，cellular senescence，and cancer.Annu Rev Physiol 75，685-705(2013).

9.Marcotte，R.&Wang，E.Replicative senescence revisited.J Gerontol ABiol Sci Med Sci 57，B257-B269(2002).

10.Serrano，M.&Blasco，M.A.Putting the stress on senescence.Curr OpinCell Biol 13，748-753(2001).

11.Citrin，D.E.et al.Role of type || pneumocyte senescence inradiation-induced lung fibrosis.J Natl Cancer Inst 105，1474-1484(2013).

12.Wang，Y.，Schulte，B.A.，LaRue，A.C.，Ogawa，M.，&Zhou，D.Total bodyirradiation selectively induces murine hematopoietic stem cellsenescence.Blood 107，358-366(2006).

13.Tse，C.et al.ABT-263：a potent and orally bioavailable Bcl-2 familyinhibitor.Cancer Res 68，3421-3428(2008).

14.Caserta，T.M.，Smith，A.N.，Gultice，A.D.，Reedy，M.A.，&Brown，T.L.Q-VD-OPh，a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptoticproperties.Apopiosis8，345-352(2003).

15.Cory，S.&Adams，J.M.The Bcl2 family：regulators of the cellular life-or-death switch.Nat Rev Cancer 2，647-656(2002).

16.Czabotar，P.E.，Lessene，G.，Strasser，A.，&Adams，J.M.Control ofapoptosis by the BCL-2 protein family：implications for physiology andtherapy.Nat Rev Mol Cell Biol 15，49-63(2014).

17.Childs，B.G.，Baker，D.J.，Kirkland，J.L.，Campisi，J.，&van Deursen，J.M.Senescence and apoptosis：dueling or complementary cell fates？EMBO Rep 15，1139-1153(2014).

18.Souers，A.J.et al.ABT-199，a potent and selective BCL-2 inhibitor，achieves antitumor activity whlie sparing platelets.Nat Med 19，202-208(2013).

19.Lessene，G.et al.Structure-guided design of a selective BCL-X(L)inhibitor.Nat Chem.Biol 9，390-397(2013).

20.Burd，C.E.et al.Monitoring tumorigenesis and senescence in vivowith a p16(INK4a)-luciferase model.Cell 152，340-351(2013).

21.Sorrentino，J.A.et al.p16INK4a reporter mice reveal age-promotingeffects of environmental toxicants.J Clin Invest 124，169-173(2014).

22.Janzen，V.et al.Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependentkinase inhibitor p16INK4a.Nature 443，421-426(2006).

23.Demaria，M.et al.An Essential Role for Senescent Cells in OptimalWound Healing through Secretion of PDGF-AA.Dev Cell 31，722-733(2014).

24.Laberge，R.M.et al，Mitochondrial DNA damage induces apoptosis insenescent cells.Cell Death Dis 4，e727(2013).

25.Coppe，J.P.，Desprez，P.Y.，Krtolica，A.，&Campisi，J.The senescence-associated secretory phenotype：the dark side of tumor suppression.Annu RevPathol 5，99-118(2010).

26.Shao，L.，Luo，Y.，&Zhou，D.Hematopoietic stem cell injury induced byionizing radiation.Antioxid.Redox Signal.20，1447-1462(2014).

27.Beerman，l.，Maloney，W.J.，Weissmann，l.L.，&Rossi，D.J.Stem cells andthe aging hematopoietic system.Curr Opin lmmunol 22，500-506(2010).

28.Dykstra，B.，Olthof，S.，Schreuder，J.，Ritsema，M.，&de，H.G.Clonalanalysis reveals multiple functional defects of aged murine hematopoieticstem cells.J Exp Med 208，2691-2703(2011).

29.Geiger，H.，de，H.G.，&Florian，M.C.The ageing haematopoietic stem cellcompartment.Nat Rev Immunol 13，376-389(2013).

30.Fleenor，C.J.，Marusyk，A.，&DeGregori，J.lonizing radiation andhematopoietic malignancies：altering the adaptive landscape.Cell Cycle 9，3005-3011(2010).

31.Geiger，H.，Rennebeck，G.，&Van，Z.G.Regulation of hematopoietic stemcell aging in vivo by a distinct genetic element.Proc Natl Acad Sci U S A102，5102-5107(2005).

32.Harfouche，G.&Martin，M.T.Response of normal stem cells to ionizingradiation：a balance between homeostasis and genomic stability.Mutat.Res 704，167-174(2010).

33.Testa，N.G.，Hendry，J.H.，&Molineux，G.Long-term bone marrow damage inexperimental systems and in patients after radiation orchemotherapy.Anticancer Res.5，101-110(1985).

34.Gale，R.P.Myelosuppressive effects of antineoplastic chemotherapyin Hematopoiesis：Long-term effects of chemotherapy and radiation(eds.Testa，N.G.&Gale，R.P.)63-73(Marcel Dekker，Inc，New York，1988).

35.Lohrmann，H.P.E.&Schreml，W.Long-term hematopoietic damage aftercytotoxic drug therapy for solid tumors in Hematopoiesis：Long-term effects ofchemotherapy and radiation(eds.Testa，N.G.&Gale，R.P.)325-337(Marcel Dekker，Inc，New York，1988).

36.Rudin，C.M.et al.Phase Il study of single-agent navitoclax(ABT-263)and biomarker correlates in patients with relapsed small cell lungcancer.Clin Cancer Res 18，3163-3169(2012).

37.Le Couteur，D.G.，McLachlan，A.J.，Quinn，R.J.，Simpson，S.J.，&de，C.R.Aging biology and novel targets for drug discovery.J Gerontol A Biol SciMed Sci 67，168-174(2012).

材料和方法的参考文献

1.Jozefczuk，J.，Drews，K.，&Adjaye，J.Preparation of mouse embryonicfibroblast cells suitable for culturing human embryonic and inducedpluripotent stem cells.J Vis.Exp(2012).

2.Wang，Y.，Scheiber，M.N.，Neumann，C.，Calin，G.A.，&Zhou，D.MicroRNAregulation of ionizing radiation-induced premature senescence.Int J RadiatOncol Biol Phys 81，839-848(2011).

3.Serrano，M.，Lin，A.W.，McCurrach，M.E.，Beach，D.，&Lowe，S.W.Oncogenic rasprovokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 andp16INK4a.Cell 88，593-602(1997).

4.Meng，A.et al.Sphingomyelin synthase as a potential target for D609-induced apoptosis in U937 human monocytic leukemia cells.Exp Cell Res 292，385-392(2004).

5.Finney DJ Probit Analysis(Cambridge University Press，England，1952).

6.Debacq-Chainiaux，F.，Erusalimsky，J.D.，Campisi，J.，&Toussaint，O.Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase(SA-betagal)activity，a biomarker of senescent cells in culture and in vivo.Nat Protoc.4，1798-1806(2009).

7.Wang，Y.，Meng，A.，&Zhou，D.Inhibition of phosphatidylinostol 3-kinaseuncouples H2O2-induced senescent phenotype and cell cycle arrest in normalhuman diploid fibroblasts.Exp Cell Res 298，188-196(2004).

8.Demaria，M.et al.An Essential Role for Senescent Cells in OptimalWound Healing through Secretion of PDGF-AA.Dev Cell 31，722-733(2014).

9.Shao，L.et al.Total body irradiation causes long-term mouse BMinjury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a-and Arf-independent manner.Blood 123，3105-3115(2014).

10.Wang，Y.，Schulte，B.A.，LaRue，A.C.，Ogawa，M.，&Zhou，D.Total bodyirradiation selectively induces murine hematopoietic stem cellsenescence.Blood 107，358-366(2006).

Claims (17)

1.一种选择性地杀死细胞样品中的衰老细胞的方法，所述方法包括：

a)检测细胞样品中的衰老细胞，其中所述衰老细胞由于复制性细胞衰老、早熟细胞衰老或治疗诱导的衰老而衰老；

b)将包含Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂的组合物施用于所述细胞，其中所述组合物抑制Bcl-2和Bcl-xl并且选择性地杀死衰老细胞；和

c)测量衰老细胞的细胞死亡。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞样品来自年龄相关病理。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞样品来自DNA损伤治疗后的正常和/或肿瘤组织。

4.根据权利要求1所述的方法，其中用衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色来检测衰老细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是Bcl-2和Bcl-x1抑制剂。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是ABT263。

7.根据权利要求1所述的方法，其中通过所述抑制剂的LD50评估选择性地杀死衰老细胞，其中所述抑制剂在非衰老细胞中的LD50是所述抑制剂在衰老细胞中的LD50的10倍。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞死亡是由于凋亡的诱导。

9.根据权利要求1所述的方法，其中将细胞死亡测量为活细胞的减少。

10.根据权利要求9所述的方法，其中活细胞的减少大于15％。

11.Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂在制备用于延迟受试者老化的至少一个特征的药物中的用途，其中所述Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂选择性地杀死衰老细胞，其中所述抑制剂是Bcl-2和Bcl-xl抑制剂，其中所述衰老细胞由于复制性细胞衰老、早熟细胞衰老或治疗诱导的衰老而衰老。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述受试者已经接受DNA损伤治疗。

13.根据权利要求11所述的用途，其中所述抑制剂是ABT263。

14.Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂在制备用于治疗有此需要的受试者中年龄相关疾病或病状的药物中的用途，其中所述年龄相关疾病或病状是变性疾病或功能减退性病症，而不是癌症，其中所述Bcl-2家族中一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂选择性地杀死衰老细胞，其中所述抑制剂是Bcl-2和Bcl-xl抑制剂，其中所述衰老细胞由于复制性细胞衰老、早熟细胞衰老或治疗诱导的衰老而衰老。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述抑制剂是ABT263。

16.Bcl-2家族中的一种或多种抗凋亡蛋白的至少一种抑制剂在制备用于在已经接受DNA损伤治疗的受试者正常组织和肿瘤组织中杀死治疗诱导的衰老细胞的药物中的用途，其中所述抑制剂是Bcl-2和Bcl-xl抑制剂。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述抑制剂是ABT263。

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