CN105085620B - 一种靶向泛素化降解Smad3的化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向泛素化降解Smad3的化合物，所述靶向泛素化降解Smad3的化合物是由式(Ⅰ)所示的化合物和式(II)所示的泛素连接酶E3识别配体通过式(III)所示的连接两者的Linker连接而成。本发明将计算机模拟筛选与靶向泛素化降解蛋白质技术联合应用构建了一种能与Smad3特异结合的通过泛素化途径靶向降解Smad3蛋白的化合物，并证实其可以靶向泛素化降解Smad3蛋白。由于Smad3是已知致纤维化最主要的信号蛋白，因此该Protac理论上具有抗纤维化作用，并且由于其分子量小可以自由进出细胞，其很可能成为治疗纤维化的新药物，不仅具有科学价值还具有重要的社会价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物，具体涉及一种靶向泛素化降解Smad3的化合物。
背景技术
器官的纤维化是人体多种疾病的最终结局，其导致包括肺脏、肝脏、肾脏、皮肤等多种器官的功能衰竭。TGF-β是已知最重要的致纤维化因子，存在众多的下游信号通路，而且不同通路之间存在着交互和功能整合，形成了极为复杂的信号传导网络，其中Smads通路在调控TGF-β1介导的细胞外基质(ECM)积聚过程中处于核心地位。已有众多研究显示Smad3是介导TGF-β致纤维化作用的关键蛋白。Smad3基因敲除小鼠的单侧输尿管梗阻(UUO)模型中肾脏的纤维化、炎症和凋亡明显减轻(参见Inazaki K,Kanamaru Y,Kojima Y,SueyoshiN,Okumura K,Kaneko K,Yamashiro Y,Ogawa H,Nakao A.Smad3 deficiency attenuatesrenal fibrosis,inflammation,and apoptosis after unilateral ureteralobstruction.Kidney Int.2004；66(2):597-604)。虽然Smad2和Smad3高度同源，且同时激活入核，但我们以及他人的研究都显示：Smad3是TGF-β1和Ang II诱导的器官纤维化的主要信号通路(参见Flanders KC.Smad3 as a mediator of the fibrotic response.Int JExp Pathol 2004；85:47-64；Arabshahi A,Major C,Deng C,Russo A,Mitchell JB,Roberts AB.Mice lacking Smad3 are protected against cutaneous injury inducedby ionizing radiation.Am J Pathol 2002；160:1057-1068；Zhao J,Shi W,Wang YL,Chen H,Bringas P Jr,Datto MB,Frederick JP,Wang XF,Warburton D.Smad3deficiency attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice.Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol 2002；282:L585-L593；Bonniaud P,Kolb M,Galt T,Robertson J,Robbins C,Stampfli M,Lavery C,Margetts PJ,Roberts AB,GauldieJ.Smad3 null mice develop airspace enlargement and are resistant to TGF-beta-mediated pulmonary fibrosis.J Immunol 2004；173:2099-2108；Nakao A,Fujii M,Matsumura R,Kumano K,Saito Y,Miyazono K,Iwamoto I.Transient gene transfer andexpression of Smad7 prevents bleomycin-induced lung fibrosis in mice.J ClinInvest 1999；104:5-11；Roberts AB,Tian F,Byfield SD,Stuelten C,Ooshima A,SaikaS,Flanders KC.Smad3 is key to TGF-beta-mediated epithelialto-mesenchymaltransition,fibrosis,tumor suppression and metastasis.Cytokine Growth FactorRev 2006；17:19-27；Inazaki K,Kanamaru Y,Kojima Y,et,al.Smad3 deficiencyattenuates renal fibrosis,inflammation,and apoptosis after unilateralureteral obstruction.Kidney Int.2004Aug；66(2):597-604)，而Smad2则具有肾保护作用(参见Meng XM,Huang XR,Chung AC,Qin W,Shao X,Igarashi P,Ju W,Bottinger EP,Lan HY.Smad2 Protects against TGF-β/Smad3-Mediated Renal Fibrosis.J Am SocNephrol.2010；21(2):1477-1487)。
作为致纤维化的关键信号蛋白，Smad3活性的调控可以分为两大类：正向调控和负向调控。TGF-β通过与受体结合进而磷酸化Smad2/3是最重要的Smad3活性的正向调控。其它致纤维化因子，如蛋白质糖基化修饰终产物(AGE)、血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)和高糖等通过MAPK途径也可以对Smad3信号进行正向调控。而Smads的泛素化降解是Smad通路负向调控的一个至关重要的方面。
泛素是一类低分量的蛋白质，泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。生物体将需要被降解的蛋白质进行泛素化标记，被标记的蛋白质继而在蛋白酶体中被降解(参见Pickart CM.Mechanisms underlyingubiquitination.Annu Rev Biochem.2001；70:503-533.)。泛素-蛋白质结合物的形成需要3种酶，分别为泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。真核生物中通常仅有1种E1和数种E2，却有种类繁多的E3。E3主要由两个结构域构成：①功能结构域：能与E2相互作用，结构相对保守；②结合结构域：不同E3的结合结构域不同，介导与不同蛋白底物的特异性结合。由于E3决定了泛素化修饰的特异性，其在蛋白酶体降解蛋白质的过程中起极其重要的作用。依据E3功能结构域的不同，可将E3分为HECT家族、RING-finger家族和U-Box家族。SCF/Rocl是由Roc1、Skpl(S期激酶相关蛋白1)、Cullinl(CUL1)和13TRCP1/Fbwla组成的SCF(Skpl/Cdc53-cullin/F-box)泛素连接酶，其是特异性降解Smad3的E3连接酶(参见Fukuchi M,Imamura T,Chiba T,Ebisawa T,Kawabata M,Tanaka K,Miyazono K.Ligand-dependent Degradation of Smad3 by a Ubiquitin Ligase Complex of ROC1 andAssociated Proteins.Mol Biol Cell.2001；12(5):1431-1443)，属于RING-finger家族。磷酸化的Smad3完成核内转录激活使命后，在共刺激因子p300和SCF/Rocl的辅助下转运出核，在胞质中被泛素蛋白酶体通路(UPP)降解。由于SCF/Rocl是在Smad3磷酸化入核之后才对活化的Smad3发生作用，因此不是理想的抗纤维化治疗靶点。
近年来，人们利用UPP具有特异性降解蛋白底物的功能特点，提出了靶向泛素化降解蛋白质技术，也称为蛋白质敲减技术。目前，该技术路线主要有两种。
第一种技术路线为构建融合蛋白E3，该方法是将能够与蛋白底物特异性结合的某个结合结构域，同E3的一种功能结构域融合表达，构建出在理论上既能够与蛋白底物相结合，又能够与E2相互作用的融合蛋白E3。
第二种技术路线为合成靶向蛋白嵌合型分子化合物，该方法的关键是依靠化学法合成一种被称为靶向蛋白嵌合型分子化合物(protein-targeting chimeric molecule，Protac)的小分子。Protac包含两部分功能结构：可以与蛋白底物相结合的部分以及能够与E3相结合的部分。与融合蛋白E3不同的是，Protac本身不含E3的任何结构。由于小分子化合物Protac结构简单，易于合成，能方便灵活地在体内穿行和进入细胞，因此从临床应用的角度来看，其具有更广阔的实用价值。
虚拟筛选也称计算机虚拟筛选，即在进行生物活性筛选之前，在计算机上对化合物分子进行预筛选，以降低实际筛选化合物数目，同时提高先导化合物发现效率。虚拟筛选主要有2种筛选策略：①.基于靶点结构的虚拟筛选，其需要应用分子对接技术；②.基于配体的虚拟筛选，即通过药效基团的搜索进行筛选。分子对接技术是指在分子模拟环境中，两个或两个以上的分子模型通过几何形状、化学环境以及能量的匹配形成最佳结合的技术。基于分子对接的筛选方法就是基于一个靶点(酶、受体、离子通道、核酸等)的三维结构，采用分子对接的虚拟筛选方法从小分子数据库中找到能与之匹配的候选化合物。Dock是目前最广泛应用的对接软件之一，它能自动模拟配体在受体活性位点的作用情况，并记录下最佳相互作用方式。而且该软件能对配体的三维数据库进行搜索，因此被广泛应用于基于靶点结构的对接筛选。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供了一种靶向泛素化降解Smad3的化合物。
为实现上述目的，所采取的技术方案：一种靶向泛素化降解Smad3的化合物，所述靶向泛素化降解Smad3的化合物是由式(Ⅰ)所示的化合物和泛素连接酶E3识别配体通过连接两者的Linker连接而成，所述式(Ⅰ)所示的化合物的结构式如下：
本发明首先通过基于分子对接技术的虚拟筛选方法，寻找到了一组能够与Smad3特异结合的小分子，并进一步通过表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术对小分子进一步筛选，选出了与Smad3具有最佳结合的小分子作为本发明所述靶向泛素化降解Smad3的化合物Protac的靶蛋白配体，并通过化学合成的方法用Linker将这个小分子和泛素连接酶E3识别配体连在一起，合成了新的Protac。然后，在体外证实了所构建的Protac能够以浓度依赖的方式泛素化Smad3；并且还证实了该Protac能够特异性泛素化途径降解细胞内Smad3蛋白。
优选地，所述泛素连接酶E3识别配体为式(Ⅱ)所示的化合物，所述式(Ⅱ)的结构式如下：
实际上，上述所述泛素连接酶E3识别配体为能够特异性识别泛素连接酶E3的缺氧诱导因子-1α的五肽结构，其五肽结构为NH2-Leu-Ala-Pro(OH)Tyr-Ile-COOH。
优选地，所述Linker为含有至少2个羧基的有机化合物。
优选地，所述Linker为式(Ⅲ)所示的化合物，所述式(Ⅲ)的结构式如下：
优选地，所述靶向泛素化降解Smad3的化合物为式(Ⅳ)所示的化合物，所述式(Ⅳ)的结构式如下：
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种靶向泛素化降解Smad3的化合物，本发明将计算机模拟筛选与靶向泛素化降解蛋白质技术联合应用构建了一种能与Smad3特异结合的靶向泛素化降解Smad3的化合物(即靶向蛋白嵌合型分子化合物，Protac)，并证实其可以靶向泛素化降解Smad3，由于Smad3是已知致纤维化最主要的信号蛋白，因此该Protac理论上具有抗纤维化作用，并且由于其分子量小可以自由进出细胞，其很可能成为治疗纤维化的新药物，不仅具有科学价值还具有重要的社会价值。
附图说明
图1为本发明的实施例1中c-Ski的三维结构(a)以及模型的Ramachandran图(b)；
图2为本发明的实施例1中Smad3与c-Ski模拟结合模式(a)：c-Ski的结构以黄色显示，Smad3的MH2结构域以青色显示，Smad3与c-Ski相互作用的残基部分以红色细棍结构表示；Smad3表面图(b)：Phe247和His248残基以青色表示；在pH＝7的环境下Smad3的静电势图(c)；
图3为本发明的实施例1中基于分子对接的Glide逐级筛选流程图；
图4为本发明的实施例1中小分子化合物1～13号(无7号)与靶蛋白Smad3结合水平(SPR)坐标图，其中:横坐标表示实验循环数，纵坐标表示各小分子与蛋白Smad3的结合信号；Fc＝4-3通道耦联水平为10800RU(Smad3蛋白浓度50μg/ml)。循环数9～20为低浓度(小分子浓度为50μmol/L)，循环数23～34为高浓度(小分子浓度为100μmol/L)，以PBS缓冲液为阴性对照；
图5为本发明的实施例1中8号小分子与Smad3样品动力学分析实验结果图；
图6为本发明的实施例1中8号小分子与Smad3蛋白的结合模式图；
图7为本发明的实施例1中所述Protac的一级质谱测试图谱；
图8为本发明的实施例1中所述Protac的二级质谱测试图谱；
图9为本发明的实施例2中786-0、ACHN、NRK-49F以及HMC细胞中VHL蛋白表达的Western电泳图；
图10为本发明的实施例2中不同浓度Protac在ACHN细胞裂解液反应体系中降解Smad3蛋白的Smad3蛋白Western电泳图；
图11为本发明的实施例2中Protac通过蛋白酶体途径降解Smad3蛋白的Western电泳图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：本发明所述靶向泛素化降解Smad3的化合物(将这里所述的化合物称为Protac)的构建方法
1、本发明所述靶向泛素化降解Smad3的化合物Protac的构建方法
①Smad3活性位点的确定及Smad3蛋白的准备；
②Enamine化合物库准备；
③基于分子对接的Glide逐级筛选；
④Hits结果及分析；
⑤以表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术对小分子进一步筛选；
⑥Protac的构建与化学合成；
⑦Protac多肽结构的验证。
2、构建结果
(1)Smad3活性位点的确定及准备
Smad3活性位点的确立是进行分子模拟的前提。ROC1-SCFFbw1a复合物是一种Smad3泛素连接酶E3。有研究显示转录共调节因子p300/CBP可以大大加速Smad3的泛素化进程。目前已知p300可与Smad3的MH2域结合，但具体结合位点尚未得到证实。由于共阻遏因子c-Ski可与p300竞争性结合Smad3，表明两者具有相似的结合位点。因此，我们采用Z-Dock软件进行c-Ski与Smad3的对接研究，从而寻找到Smad3上的结合位点。具体过程包括：
①c-Ski的同源模型构建：由于目前c-Ski并没有解析出的晶体结构，我们首先需要构建c-Ski的三级结构模型。考虑到c-Ski已报道的结合残基均位于其序列的前80位，因此通过同源模建方式直接构建其前80位氨基酸所组成的部分三级结构即可。同源模建采用Modeller 9v9实现，建模得到的c-Ski的部分三级结构见图1(a)。利用Ramachandran图对模建的质量进行评价，见图1(b)。所有的残基中有88.5％的处于最适区，6.6％处于较合适区域，4.9％处于允许区，没有残基位于禁阻区，表明模建的c-Ski结构理想，可以进行下一步的对接研究。
②c-Ski与Smad3蛋白对接模拟：在模建出c-Ski的三级结构后，利用对接程序Z-Dock寻找最理想的c-Ski和Smad3的结合构象。我们选择采用2000次无限制对接(即不指定必须结合的残基以及肯定不能结合的残基)，从中挑选能量最低的构象(图2a)作为最有可能结合的构象，其结合能为-868Kcal/mol。从图2a中可以看出c-Ski主要与Smad3的β-三明治结构区结合，涉及的Smad3上的结合残基包括三段集中的序列，分别是Phe247,His248；Gln251,Pro252,Ser253,Met 254,Thr255；以及Ser265,Glu 266。其中第一段序列主要稳定c-Ski结构中的两个β-折叠，后两段序列涉及结合c-Ski的一个α-螺旋结构。根据文献报道，c-Ski的残基16-40涉及与Smad3的结合。而这段区域在结构中紧邻β-折叠，因此，Smad3上的Phe247和His248所在的区域对于结合c-Ski具有重要的意义。图2b和图2c分别展示的是Smad3的表面图以及静电势图。通过两图的对比可以看出，Phe247以及His248所处的位置为蛋白表面的一个凹陷处，且His248位于该凹陷的出口上。整个凹陷在生理条件下带有强烈的负电荷，这就表明该部分区域可能通过静电相互作用与外源的蛋白质或者小分子进行结合。综上，我们选定了Phe247以及His248所在的区域作为活性位点，进行后续的虚拟筛选。
③Smad3蛋白的准备：使用Schrodinger的Protein preparation模块检查蛋白三维结构是否有残缺，然后为Smad3蛋白添加氢原子和Amber电荷，并用Amber99SB力场优化蛋白结构，最后保存为.maegz格式。
(2)Enamine化合物库准备
本次虚拟筛选采用Enamine公司的化合物库，含有1368424个可购买到的小分子，且分子多样性好，纯度>90％，均有NMR(核磁谱)和LC/MC(质谱)。考虑到Protac的透膜生物利用度及毒性等问题，我们根据Lipinski五规则(类药性五规则：1、化合物的分子量小于500道尔顿；2、化合物结构中的氢键给体(包括羟基、氨基等)的数量不超过5个；3、化合物中氢键受体的数量不超过10个；4、化合物的脂水分配系数的对数值(logP)在-2到5之间；5、化合物中可旋转键的数量不超过10个)，并且设定分子量小于等于250，开始第一步筛选，得到328 453个满足条件小分子，建立一个筛选库，以.sdf格式保存。使用Schrodinger的Ligandpreparation模块为筛选库的分子添加氢和电荷，并使用opls2005力场优化小分子，最后得到一个准备好的对接筛选分子库。
(3)基于分子对接的Glide逐级筛选，如图3所示
Glide对接软件是业界最认可，筛选和对接最可靠的软件。此次基于对接的虚拟筛选，使用了Glide软件的3个不同精度的对接：快速对接模式(HTVS)，标准对接模式(SP)和精细对接模式(XP)。首先采用快速对接模式，从328453个分子中得到打分函数(结合自由能)最好的前10％(共计32845个分子)，再使用标准对接模式对得到的分子进行第二次筛选，同样取前10％(共计3284个分子)，然后使用精细对接模式，取结果中的前10％(共计328个分子)使用Schrodinger中Prime模块的MM/GBSA(molecular mechanics combined withgeneralized Born and surface-area solvation)方法更精细地计算Smad3与化合物在溶液环境下的结合自由能。
最后我们取MMGBSA计算结果中结合自由能最优的前100个分子进行人工的蛋白-配体结合模式的挑选及化学合成方面的分析。
(4)Hits结果及分析
上述得到的100个分子，我们根据其蛋白-配体的结合模式(氢键、疏水相互作用，静电相互作用)进行人工目筛，得到30个结合模式良好的化合物。因考虑最后要合成Protac,结合合成化学分析，从中挑选出13个最优的化合物进行购买(见表1)。合成化学分析标准如下：
①分子必须含有胺基、羟基末端(易于与Linker发生酯化或者酰化反应)，或者含有苯环可以容易取代添加上氨基或羟基。②极性太大的分子(含羧基)不考虑，因为肽部分就会使Protac极性很大致使细胞渗透性不好。③为了避免考虑区域选择性问题，多羟基和氨基同时存在时不考虑(氨基和酰胺中的氨基在合成中具有选择性，对缩合反应应该无影响)。④杂环中仲胺的反应活性不如伯胺，所以该类结构化合物不考虑。⑤优选含吡啶结构的化合物，这样的结构有助于吸收。⑥脂肪胺相比芳胺会有利于与Linker连接，另外因为脂肪胺的柔性好，与linker连接后有足够的扭转可能，可使配体分子链接上Linker后仍保持活性。
表1筛选得到的13个化合物
注：Glide打分越低或MM/GBSA结合自由能越低，则说明结合强度越大，结合得越稳定。
(5)应用表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技术对小分子进一步筛选
SPR技术是用于检测小分子与蛋白质结合的经典方法，其优点在于不需要对样品进行分子标记即不改变小分子的性质、灵敏度高、并且适合批量筛选。基本原理就是先将靶蛋白固定到分子芯片表面，将需要检测的小分子以溶液的形式连续流过芯片表面，通过记录小分子与蛋白的结合和解离过程中传感芯片表面分子浓度发生的变化，从而实时监测小分子与蛋白的相互作用。
①小分子化合物的准备：通过上海陶素公司购买筛选到的Enamine化合物库的小分子1～13号(7号小分子无货)，共12个。所有小分子均溶于100％DMSO中，并以1.02×PBS-P缓冲液稀释为含2％DMSO的10mmol/L的储存液。
②Smad3蛋白的合成：为不影响Smad3的立体构象，我们决定采用不带任何标签的Smad3蛋白进行SPR的检测。目前可以购买的商品化Smad3多是带标签的蛋白，且绝大部分溶于含Tris的溶液中保存，不适于进行SPR检测。所以我们通过江苏普罗赛生物技术有限公司自行纯化了溶于PBS的Smad3用于实验。Smad3蛋白等电点为6.73，分子量48kD，浓度1mg/ml，纯度为90％。
③采用GE公司的Biacore T200进行SPR检测：以CM5芯片(瑞士GE公司)固定Smad3蛋白，进行双偶联水平(通道FC-2：Smad3蛋白浓度20μg/ml，偶联水平3800RU；通道FC-4:Smad3蛋白浓度50μg/ml，偶联水平10800RU)双浓度筛选(小分子浓度分别为100mg/ml和50mg/ml)。双耦连水平结果一致，各样品与Smad3结合的响应值高低顺序均为：#8>#1>#3>#9>#2>#11>#12>#10>#6>#13>#5>#4，各组实验的响应值与Smad3的偶联水平或小分子的浓度均呈现浓度相关效应，表明各高于阴性对照的小分子样品与Smad3有特异性结合，其中8号小分子与Smad3蛋白结合信号最高，见图4。
依据上述筛选实验结果选择8号小分子进一步分析其与Smad3蛋白的亲和力和动力学特征。在高耦连通道Fc＝4-3配置如下梯度浓度的8号小分子样品：50、25、12.5、6.25、3.125、0μmol/L，在Biacore T200 control软件中，选择动力学分析模板，设置流速30μl/min，进样时间60s，解离时间180s。按软件提示，将各浓度样品置于样品架相应孔位后，运行程序，待自动分析完成后，以Biacore T200 Evaluation分析数据，结果见图5，以1:1结合模式，拟合实时传感图，获得亲和力和动力学特征数据为：解离平衡常数(即亲和力)KD＝4.547×10-5M；结合速率常数ka＝1679M-1s-1；解离速率常数kd＝0.07633s-1。
表明8号小分子与Smad3有较强的特异性结合，并呈现出典型的动力学行为，并且8号小分子与Smad3的解离速率慢，使之与Smad3结合后有更长的在靶时间。
(6)Protac的构建与化学合成
将筛选到的8号小分子与Smad3进行分子对接，见图6。可以看到8号小分子上部的胺基(-NH3 +)与Smad3的Glu-245残基末端的羧基形成了氢键，分子吡啶环上的N与残基His-248主链上的-NH形成了氢键，此二氢键将小分子固定在此处；其次，小分子右部分的吡啶环与Phe-247残基末端的苯环形成π-π相互作用，左部分的苯并呋喃环与Phe-268残基末端的苯环也形成π-π相互作用。由相互作用图可以观察到，小分子的苯并呋喃环及吡啶环伸向蛋白的内部，适应于蛋白的活性口袋，而上部的氨基则朝向蛋白的外部空间，因此氨基的修饰对8号小分子与Smad3蛋白的结合活性将影响不大。此外，氨基为化学反应的活性基团，也易于实现与Linker的链接。综上所述，基于8号小分子的Protac结构式如下：
其中上述结构式中a、b用于指示酰胺键，左边部分为与Smad3作用的配体(8号小分子)，右边部分为E3识别配体，即HIF-1α羟基化五肽化合物，中间部分为连接左边部分与右边部分的Linker，左边部分和右边部分分别与Linker通过酰胺键a、b连接。
上述Protac的化学合成由上海科肽生物科技有限公司完成，分子量996.5，纯度>98％，水溶性白色冻干粉。
(7)Protac多肽结构的验证
合成的Protac由上海中科新生命生物科技有限公司进行质谱法全序列分析验证(4800 MALDI-TOF/TOF,AB SCIEX)，分析结果见图7、图8。
根据Protac结构的理论序列建立数据库，提交Protac二级质谱数据至MolecularWeight Calculator搜索引擎进行二级检索分析，二级质谱数据对应匹配列表见表2。
表2 Protac二级质谱数据匹配列表
注：1、8#小分子化合物分子量：224.09，结构式如下：
2、8#小分子化合物加linker分子量：437.20，结构式如下：
3、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的五肽结构：NH2-Leu-Ala-Pro(OH)Tyr-Ile-COOH，分子量：577.31，残基信息如表3，结构式如下：
表3 HIF-α羟基化五肽上的残基信息
实施例2：本发明所述靶向泛素化降解Smad3的化合物靶向泛素化途径降解Smad3作用的验证
细胞培养：人肾癌细胞株(ACHN)和大鼠正常肾成纤维细胞株(NRK-49F)用DMEM培养基，人肾透明细胞腺癌细胞株(786-0)和人肾小球系膜细胞株(HMC)用1640培养基，均含10％小牛血清，50×103U/L青霉素和50mg/L链霉素，于37℃、5％CO2条件下进行常规传代培养。
Western检测VHL蛋白表达：.收集100mm细胞培养皿中的786-0、ACHN、NRK-49F以及HMC细胞，冰浴PBS漂洗两次，加入1ml RIPA细胞裂解液(美国Millipore公司)，冰上裂解20min，13000rpm离心15min，取50μl上清加入25μl的3×SDS上样缓冲液煮沸8min。13000rpm离心15min，取上清20μl进行SDS-PAGE电泳，分别以VHL一抗抗体(美国CST公司，1:1000)和GAPDH抗体(美国Santa Cruz公司，1:2500)常规Western检测，如图9，图9是检测不同细胞株中E3连接酶VHL的表达水平，由于本发明所述Protac设计的E3结合部位是针对VHL设计的，采用了VHL天然底物HIF-α1的五肽结构，所以细胞中必须存在VHL才可能发挥作用。从图中可以看出786-0细胞中不含有VHL，ACHN、NRK-49F以及HMC细胞中均含有VHL，并且ACHN细胞中的VHL含量比其他细胞中高。
本发明所述靶向泛素化降解Smad3的化合物Protac浓度依赖降解Smad3蛋白：培养ACHN细胞，收集3个100mm细胞培养皿中的细胞，裂解方式同前。细胞裂解液等分为6份(每份约500μl),每份裂解液中均加入Smad3蛋白(江苏普罗赛公司合成)10μg和不同剂量的Protac(上海科肽生物科技有限公司合成)0、0.1、0.5、1.0、2.5、10μg。在37℃水浴锅中反应30min,取100μl反应混合物，加入25μl的3×上样缓冲液煮沸10min，常规Western检测Smad3蛋白，如图10，图10是所述靶向泛素化降解Smad3的化合物Protac可以浓度依赖地降解Smad3的Western结果，可以看到，随着Protac浓度的增加，在富含VHL的ACHN细胞裂解液提供的泛素化降解所需的酶及蛋白酶体等反应体系中，Smad3的含量逐渐减低。。
所述靶向泛素化降解Smad3的化合物Protac通过蛋白酶体途径降解Smad3:培养并收集786-0和ACHN细胞，在裂解过程中加或不加蛋白酶体抑制剂MG132(美国CST公司，5μM)，15min后各取500μl细胞裂解液分别加入Smad3蛋白10μg和Protac 10μg，37℃水浴锅中反应30min，各取100μl反应混合物，加入25μl的3×上样缓冲液煮沸10min,常规Western检测Smad3蛋白，其检测结果如图11所示，这里是为了进一步证实图9中Smad3的含量的减低是通过蛋白酶体途径，我们选取了786-0(不含VHL E3连接酶)和ACHN(富含VHL E3连接酶)两种细胞株的裂解液作为Protac降解Smad3的反应体系，并分别加入蛋白酶体阻断剂MG132，可以看到不含VHL的786-0细胞株裂解液反应体系中Protac不能降解Smad3，而富含VHL的ACHN细胞裂解液反应体系中，Protac能够降解Smad3，并且在加入蛋白酶体阻断剂MG132阻断蛋白酶体途径的降解后，Smad3仅能被Protac泛素化，表明Protac是通过靶向泛素化蛋白酶体途径降解靶蛋白Smad3的。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (1)
1.一种靶向泛素化降解Smad3的化合物，其特征在于，所述靶向泛素化降解Smad3的化合物是由式(Ⅰ)所示的化合物和泛素连接酶E3识别配体通过连接两者的Linker连接而成，所述式(Ⅰ)所示的化合物的结构式如下：
所述靶向泛素化降解Smad3的化合物为式(Ⅳ)所示的化合物，所述式(Ⅳ)的结构式如下：
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