CN109785902B - 一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法，包括以步骤：A1、采用卷积神经网络方法预测蛋白亚基的相互作用；A2、构建泛素标记体系空间三维结构；A3、预测泛素化降解的目标蛋白质，先下载目标蛋白三维结构文件，使用同源建模的方法补全目标蛋白三维结构，利用上述的卷积神经网络方法预测目标蛋白与E3泛素标记体系的相互作用；然后，采用分子动力学方法优化E3泛素标记体系与目标蛋白相互作用的整体空间三维结构，根据体系的稳定性判断目标蛋白是否可能被该E3泛素标记体系标记，并通过泛素‑蛋白酶体降解。

Description

一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法

技术领域

本发明涉及一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法。

背景技术

使用药物治疗疾病的策略包括抗体、siRNA和小分子以阻断致病蛋白的活性。抗体具有非常有效的特异性，但在细胞渗透性方面仍然很困难。通过使用siRNA抑制基因表达是不错的选择，但其递送的困难和脱靶效应问题阻碍了其应用。化学小分子被广泛筛选并合成，用以结合特定蛋白质，旨在抑制蛋白质的功能。然而，当经常使用小分子药物时会发生耐药性，在某些特殊情况下，抑制剂甚至会导致蛋白质的积累。此外，对于某些蛋白质如Ras，其在肿瘤发生过程中具有关键突变，以及表面缺乏成药空腔，导致无法开发其小分子抑制剂。基于以上问题，药物开发者提出了诱导致病蛋白质降解的新策略，该策略使得人们可以设计小分子降解以前被认为“不可成药”的蛋白，还可以克服抗体和siRNA的渗透和递送性等问题，其中的技术之一是PROTAC，通过设计嵌合体分子降解目标蛋白质。

PROTAC是利用泛素化-蛋白酶途径诱导目标蛋白质在细胞中降解的策略。泛素-蛋白酶体途径是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80％以上蛋白质的降解。其由泛素、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、蛋白酶体及其底物构成。该途径降解蛋白质的过程分两个阶段：(1)泛素化目标蛋白质：泛素分子由ATP提供能量，被E1激活转移到E2，然后经E3与目标蛋白质结合；(2)降解目标蛋白质：被泛素化的目标蛋白质被蛋白酶体识别，并被其降解为多肽。许多研究表明，降解比抑制致癌蛋白质的抗癌活性更好。迄今为止，PROTAC技术可用于降解多种蛋白质只有不到40种，包括转录因子，骨架蛋白，酶和调节蛋白等，而人体的蛋白保守估计有超过2万种。

在泛素化-蛋白酶途径中，最重要的是泛素连接酶E3标记目标蛋白质泛素的系统。目前，已知的E3有600多种，可以分为四大类：1、HECT，2、RING-finger，3、U-box，4、PHD-finger。RING-finger E3连接酶是最大的家族，含有VHL、CRBN和SCF（Skp1-Cullin-F-box）等连接酶。由于E3连接酶标记目标蛋白质的过程非常复杂，涉及的蛋白亚基机构非常多，且目前只有VHL和CRBN部分的结构被解析，故E3如何标记致病蛋白质的完整过程还不清楚。基于已知的VHL和CRBN的Cullin体系，可以降解哪些目标蛋白质，这是药物化学家非常想了解的事情。但，目前只能先设计出PROTAC分子，然后用试验来证明该蛋白是否能被VHL和CRBN的Cullin体系降解。并且，现有的PROTACs设计方法仅能基于已有的E3和目标蛋白抑制剂，通过增加中间的Linker来实现目标蛋白的降解。目前，仅有CRBN、VHL与BRD4的三维复合物结构被解析。其它已知被VHL和CRBN降解的目标蛋白与PROTACs和E3的复合物体系结构并未知晓。这就是药物化学家的难题，如何预测三元复合物的正确三维空间结构，再基于此进行合理的药物设计。

基于药物化学家的需求，本发明的目的在于提供一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法，以促进基于结构的降解致病蛋白的PROTAC、多肽、单体小分子、嵌合分子和抗体耦联分子的新药开发。

发明内容

本发明供了一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法。

一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法，包括如下步骤：

A1、采用卷积神经网络方法预测蛋白亚基的相互作用，包括以下步骤：

Step1：从PDB蛋白质数据库中收集蛋白-蛋白复合体的空间三维结构；

Step2：依据所述具有空间结构分辨率的蛋白-蛋白复合物作为模型，计算蛋白-蛋白相互作用界面上氨基酸残基的类型和频次，生成蛋白-蛋白相互作用氨基酸残基的数据库；

Ste:3：利用卷积神经网络提取所述相互作用氨基酸残基的特征，随机分为80%的训练集和20%的测试集，将训练集用于训练模型的识别训练，然后利用测试集对所述训练模型进行蛋白-蛋白相互作用方式的识别预测。

在其中一个实施例中，从所述蛋白-蛋白相互作用晶体复合物中选取结构的标准为：具有空间三维结构分辨率≤3埃的蛋白-蛋白复合体结构。

A2、构建E3泛素标记体系空间三维结构，包括以下步骤：

Step1：对文献进行检索，确定并获得构成E3泛素化标记体系的亚基和蛋白；

Step2：采用分段同源模建的方法补全E3泛素化标记体系组成蛋白的结构缺失；

Step3：采用分子动力学方法，在生理环境中产生不同E3泛素化标记体系组成蛋白的三维空间结构；

Step4：利用上述的卷积神经网络方法预测E3泛素标记体系各组成部分亚基的蛋白空间三维结构相互作用；

Step5：采用分子动力学方法在体液环境中整体优化E3泛素标记体系；

A3、预测泛素化降解的目标蛋白质。下载目标蛋白三维结构文件，使用同源建模的方法补全目标蛋白三维结构。利用上述的卷积神经网络方法预测目标蛋白与E3泛素标记体系的相互作用。然后，采用分子动力学方法优化E3泛素标记体系与目标蛋白相互作用的整体空间三维结构。根据体系的稳定性判断目标蛋白是否可能被该E3泛素标记体系标记，并通过泛素-蛋白酶体降解。

本发明的有益效果是：

与传统蛋白结晶试验所产生的泛素连接酶E3、目标蛋白和PROTAC三元复合物的三维结构相比，本发明的三元复合物预测方法可以在更短时间、更低花费的获得更多三元复合物的三维空间结构，并且弥补了蛋白结晶试验无法获得的一些三元复合物晶体结构。使得药物化学家可以直接根据预测的结构进行基于空间结构的药物设计，实现“不可成药”蛋白的可药性，使得基于结构改造PROTAC成为可能，让缩短和改造PROTAC的Linker成为可能，大大提高了PROTAC双功能嵌合分子的PK/PD改造性。

附图说明

图1为实施方式的泛素化降解目标蛋白的预测方法流程示意图。

图2为实施例1的E3泛素标记体系与目标蛋白质纤维化蛋白Smad3相互作用方式的三维空间结构模型。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

参照图1，一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法，其中包含以下步骤：

A1、采用卷积神经网络方法预测蛋白亚基的相互作用，包括以下步骤：

Step1：从PDB蛋白质数据库中选取空间三维结构分辨率≤3埃的蛋白-蛋白复合物三维结构并下载pdb或cif文件，然后使用python编程截取pdb或cif文件中包含蛋白质原子三维坐标的数据，保存成一个新的pbd或cif文件；

Step2：使用python编程计算上一步得到的蛋白-蛋白复合物三维结构中蛋白-蛋白相互作用界面上的氨基酸残基的类型和频次，从而生成蛋白-蛋白相互作用氨基酸残基的数据库；

Step3：利用卷积神经网络提取所述相互作用的氨基酸残基的特征，随机分为80%的训练集和20%的测试集，将训练集用于训练模型的识别训练，然后利用测试集对所述训练模型进行蛋白-蛋白相互作用方式的识别预测。具体地，使用卷积层和池化层从相互作用的氨基酸数据库中提取特征，特征输出结果经Leaky ReLU函数转化，全连接层将特征整合，输入至softmax函数，即得训练模型。卷积神经网络包括3个卷积、池化层及3个全连接层。卷积层和全连接层输出结果经Leaky ReLU函数转化，最后将特征映射图输入至softmax函数，确定蛋白-蛋白的氨基酸残基作用方式。同样地，使用20%的测试集去预测产生的训练模型。依据测试后的模型对蛋白-蛋白相互作用界面氨基酸残基接触图谱进行识别，根据不同类别相对概率大小确定蛋白-蛋白相互作用方式，形成具有方向性及选择性的蛋白-蛋白相互作用模式。

A2、构建泛素标记体系空间三维结构，包括以下步骤：

Step1：对文献进行检索，确定并获得构成泛素化标记体系的亚基和蛋白。从PDB蛋白质数据库下载构成泛素标记体系的亚基蛋白三维结构pdb或cif文件，然后使用python编程截取pdb或cif文件中包含蛋白质原子三维坐标的数据，并保存为新的pbd或cif文件；

Step2：采用分段同源模建的方法补全泛素化标记体系组成蛋白的结构缺失。从PDB蛋白质数据库下载组成泛素标记体系的亚基和蛋白的FAST序列，使用分段同源模建方法补全泛素化标记体系组成各亚基和蛋白的三维空间结构；

Step3：采用分子动力学方法，在生理溶液环境中分别针对不同产生不同泛素化标记体系组成的蛋白进行1μs的分子动力学优化。从结果中选取100种低能三维空间结构，用于接下来的泛素标记体系整体三维结构的构建；

Step4：将上一步产生的结果利用卷积神经网络方法，用来预测泛素标记体系各组成部分蛋白空间三维结构的相互作用。选出疏水残基接触最多的模型作为优选结构模型；

Step5：采用分子动力学方法在体液环境中整体优化泛素标记体系。将构建的泛素标记体系采用分子动力学方法进行优化。先加入溶剂和离子进行1μs的分子动力学优化，选择能量最低的泛素标记体系三维复合物，获得整体空间三维结构。

A3、预测泛素化降解的目标蛋白质，步骤如下：

从PDB蛋白质数据库下载目标蛋白三维结构文件，使用同源建模的方法补全目标蛋白三维结构。利用上述的卷积神经网络方法预测目标蛋白与泛素标记体系的相互作用。从结果中选取目标蛋白上Lys朝向E2和Ub结合的位点，且距离最近的模型。然后，采用分子动力学方法优化泛素标记体系与目标蛋白相互作用的整体空间三维结构。根据体系的稳定性判断目标蛋白是否可能被该泛素标记体系标记，并通过泛素-蛋白酶体降解。对于已有PROTAC的泛素标记体系与目标蛋白，我们使用分子对接软件，先将PROTAC分子对接进入蛋白-蛋白复合物中，然后再进行1μs的分子动力学，选择能量最低的泛素标记体系、目标蛋白和PROTAC三元复合物，获得整体空间三维结构，并基于此三元复合物构建的三维空腔结构进行小分子新药的设计。

与传统蛋白结晶试验所产生的泛素连接酶E3、目标蛋白和PROTAC三元复合物的三维结构相比，本发明的三元复合物预测方法可以在更短时间、更低花费的获得更多三元复合物的三维空间结构，并且弥补了蛋白结晶试验无法获得的一些三元复合物晶体结构。使得药物化学家可以直接根据预测的结构进行基于空间结构的药物设计，实现“不可成药”蛋白的可药性，使得基于结构改造PROTAC成为可能，让缩短和改造PROTAC的Linker成为可能，大大提高了PROTAC双功能嵌合分子的PK/PD改造性。

下面结合具体实施例，对本发明的一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法进行举例说明。

实施例1

本实施例提供一种泛素化降解信号传导蛋白Smad3的预测方法，包括如下步骤：

A1、采用卷积神经网络方法预测蛋白-蛋白相互作用，包括以下步骤：

Step1：从PDB蛋白质数据库中选取智人，且空间三维结构分辨率≤3埃的蛋白-蛋白复合物三维结构并下载pdb或cif文件，然后使用YASARA软件python编程截取pdb或cif文件中包含蛋白质原子三维坐标的数据，保存成一个新的pbd或cif文件；

Step2：使用YASARA软件的python编程计算上一步得到的蛋白-蛋白复合物三维结构中蛋白-蛋白相互作用位点及界面上氨基酸残基的类型和频次，从而生成蛋白-蛋白相互作用氨基酸残基的数据库；

Step3：利用卷积神经网络获取所述相互作用的氨基酸残基特征，随机分为80%的训练集和20%的测试集，将训练集用于训练模型的识别训练，然后利用测试集对所述训练模型进行蛋白-蛋白相互作用方式的识别预测。上述信息转换成蛋白-蛋白相互作用界面氨基酸残基的矩阵，该矩阵是20×20整数矩阵，行与列分别代表两个相互作用蛋白接触界面上的20种氨基酸，其中正整数表示两个对应界面残基的接触频率，零表示在蛋白-蛋白没有对应的氨基酸接触。具体地，使用paddlepaddle库和Python编程进行卷积神经网络计算。卷积神经网络包括3个卷积、池化层及3个全连接层。3个卷积层分别使用64、128和526的三个大小均为5×5的卷积核从蛋白亚基相互作用界面氨基酸残基接触图谱中提取特征；池化层紧接着卷积层分别对结果进行2×2的最大池化操作。卷积层和全连接层输出结果经LeakyReLU函数转化后输入至softmax函数进行分类，最后给出蛋白-蛋白相互作用的3种分类结果，分别为：蛋白A与蛋白B结合很好、蛋白A与蛋白质B结合不好、蛋白A与蛋白质B结合一般。在训练过程中，采用最小梯度法训练模型，并在全连接层输出中采用30%的dropout，以避免过拟合现象产生。同样地，使用20%的测试集去预测产生的训练模型。

A2、构建含VHL和CRBN的泛素标记体系，包括以下步骤：

Step1：对文献进行检索，获得构成Cullin-Ring泛素化标记体系的十大亚基，分别是Cullin4B（Cullin4A）、Cullin2、NEDD8、E2、Ub、Rbx、DBB1、VHL、CRBN。从PDB蛋白质数据库下载构成泛素标记体系的十大亚基蛋白三维结构pdb或cif文件，然后使用python编程截取pdb或cif文件中包含蛋白质原子三维坐标的数据，并保存为新的pbd或cif文件；

Step2：从PDB蛋白质数据库下载组成泛素标记体系的亚基和蛋白的FAST序列，使用YASARA软件中的分段同源模建方法，补全泛素化标记体系组成蛋白的三维结构。YASARA软件自动对输入的蛋白序列进行模板比对，分段选择序列一致性最高的前3种蛋白进行多模版建模，最后选择打分值最高的模型；

Step3：使用YASARA软件中的分子动力学模块，在生理溶液环境中分别针对不同泛素化标记体系组成的蛋白进行1μs的分子动力学优化。从结果中选取100种低能三维空间结构，用于接下来的泛素标记体系整体三维结构的构建；

Step4：将上一步产生的结果利用卷积神经网络方法，用来预测泛素标记体系各组成部分蛋白空间三维结构的相互作用。选出疏水残基接触最多的模型作为优选结构模型；

Step5：采用分子动力学方法在体液环境中整体优化泛素标记体系。使用YASARA软件的分子动力学模块将上述获得的泛素标记体系进行结构优化。设置周期化边界条件，并选择YASARA力场，同时设置pH=7.0，加入离子平衡电荷，进行1μs的分子动力学。选择能量最低的泛素标记体系三维复合物，获得含VHL和CRBN的泛素标记体系整体空间三维结构。

A3、预测泛素化降解Smad3蛋白，步骤如下：

从PDB蛋白质数据库下载信号蛋白Smad3三维结构的pdb或cif文件，使用YASARA的分段同源建模模块补全目标蛋白三维结构。利用上述的卷积神经网络方法预测Smad3蛋白与含VHL和CRBN泛素标记体系的相互作用。从结果中选取Smad3蛋白上Lys朝向E2和Ub结合位点，且距离最近的模型。然后，使用YASARA软件的限制性分子动力学模块，将VHL和CRBN与Smad3的相对位置固定，然后在生理溶液环境中优化含VHL和CRBN泛素标记体系与Smad3蛋白相互作用的整体空间三维结构。结果表明该目标蛋白Smad3的Lys可以一直保持与含VHL和CRBN的泛素标记体系中E2和Ub结合位点的最近距离。故，预测Smad3可以被含VHL和CRBN的泛素标记体系降解。

基于上述的预测结果，我们获得了Smad3与VHL相互作用的空间三维结构，中间形成了一个空腔，据此空腔的三维结构，利用BiosolveIT的SeeSAR软件进行PROTAC分子设计。将设计好的三元复合物再进行1μs的分子动力学优化，结果显示三元复合物稳定。后续试验证明该分子可通过含VHL的泛素标记体系泛素化Smad3蛋白，并通过泛素-蛋白酶体途径降解Smad3蛋白，与我们的预测一致。该降解Smad3蛋白的PROTAC分子已获专利授权，专利授权号：CN 105085620 B。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简沽，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (1)

1.一种泛素化降解目标蛋白质的预测方法，其特征在于，包括如下步骤：

A1、采用卷积神经网络方法预测蛋白-蛋白相互作用，包括以下步骤：

Step1：从PDB蛋白质数据库中收集蛋白-蛋白复合物的空间三维结构文件；

Step2：依据Step1所收集的蛋白-蛋白复合物作为模型，计算蛋白-蛋白相互作用界面上氨基酸残基的类型和频次，生成蛋白-蛋白相互作用氨基酸残基的数据库；

Step3：利用卷积神经网络提取所述相互作用氨基酸残基的特征，随机分为80％的训练集和20％的测试集，将训练集用于训练模型的识别训练，然后利用测试集对所述训练模型进行蛋白-蛋白相互作用方式的识别预测；

A2、构建泛素化标记体系空间三维结构，包括以下步骤：

Step1：对文献进行检索，确定并获得构成泛素化标记体系的亚基和蛋白；

Step2：采用分段同源模建的方法补全泛素化标记体系组成蛋白的结构缺失；Step3：采用分子动力学方法，在生理环境中产生不同泛素化标记体系组成蛋白的三维空间结构；

Step4：利用上述的卷积神经网络方法预测泛素化标记体系各组成部分蛋白空间三维结构的相互作用；

Step5：采用分子动力学方法在体液环境中整体优化泛素化标记体系；

A3、预测泛素化标记体系可降解的目标蛋白；

下载目标蛋白三维结构文件，使用同源建模的方法补全目标蛋白三维结构；利用上述的卷积神经网络方法预测目标蛋白与泛素化标记体系的相互作用；然后，采用分子动力学方法优化泛素化标记体系与目标蛋白相互作用的整体空间三维结构；根据体系的稳定性判断目标蛋白是否可能被该泛素化标记体系标记，并通过泛素-蛋白酶体降解。