CN103265635A - 一种通用的靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种通用的靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法，目的在于通过靶向泛素化途径降解蛋白质来提供一种调节蛋白质水平的方法，主要包括如下步骤：1）查找和分析靶蛋白的三维结构，并预测活性位点；2）选择化合物数据库；3）计算机虚拟筛选与靶蛋白适配程度高的配体化合物；4）获取筛选出的配体化合物，并利用小分子与蛋白间相互作用的检测方法筛选出最优靶蛋白配体化合物；5）根据计算机模拟结合方式构建由最优靶蛋白配体化合物、泛素连接酶E3识别配体及连接两者的Linker组成的靶向蛋白嵌合型分子化合物；6）化学合成靶向蛋白嵌合型分子化合物。使用本方法可快速高效地制备靶向蛋白嵌合型分子化合物，实现特异性降解细胞内的靶蛋白。

Description

一种通用的靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法

技术领域

本发明涉及靶向泛素化降解蛋白质技术领域，尤其涉及一种靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法。

背景技术

泛素是一类低分子量的蛋白质，泛素化是指泛素分子在一系列酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。生物体将需要被降解的蛋白质进行泛素化标记，被标记的蛋白质继而在蛋白酶体中被降解。泛素化过程控制着人体细胞内绝大多数蛋白质的降解，参与细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。近年来在肿瘤、神经和心血管等方面对泛素-蛋白酶体降解系统（UPP）的研究显示其在疾病的发生发展中也起着十分重要的作用，成为研究、开发药物的新靶点。

UPP主要由泛素分子Ub、26S蛋白酶体、泛素激活酶E1、泛素转移酶E2、泛素连接酶E3构成。真核生物中通常仅有1种E1和数种E2，却有种类繁多的E3，E3决定了泛素化修饰的特异性，其在蛋白酶体降解蛋白质的过程中起极其重要的作用。E3主要由两个结构域构成：①功能结构域：能与E2相互作用，结构相对保守；②结合结构域：不同E3的结合结构域不同，介导与不同蛋白底物的特异性结合。

近年来，人们利用UPP具有特异性降解蛋白底物的功能特点，提出了靶向泛素化降解蛋白质技术，也称为蛋白质敲减技术，该技术路线主要有两种：

1）构建融合蛋白E3该方法是将能够与蛋白底物特异性结合的某个结合结构域，同E3的功能结构域融合表达，构建出在理论上既能够与蛋白底物相结合，又能够与E2相互作用的融合蛋白E3。

2）合成靶向蛋白嵌合型分子化合物该方法的关键是依靠化学法合成一种被称为靶向蛋白嵌合型分子化合物（protein-targeting chimeric molecule，Protac）的小分子。Protac包含两部分功能结构：可以与靶蛋白相结合的部分以及能够与E3相结合的部分。与融合蛋白E3不同的是，Protac本身不含E3的任何结构。

由于构建的融合蛋白E3分子较大，在真核细胞内多不稳定，容易被降解，而小分子化合物Protac结构简单，易于合成，能方便灵活地在体内穿行和进入细胞，且不存在异源蛋白相关问题，有转化为新药的价值和潜能，因此，从临床应用的角度来看，合成Protac比构建融合蛋白E3具有更广阔的实用价值。

在Protac的研究过程中，由于E3的功能结构域相对保守，目前能够与E3的功能结构域相结合的小分子多肽研究已有突破，但是要在不计其数的小分子化合物中寻找到能够与靶蛋白相结合的小分子配体化合物是一件极其繁琐、费时费力的工作，且要求研究者必须具有相当的化学合成的研究背景才能胜任，成为构建靶向蛋白嵌合型分子化合物的技术瓶颈。

发明内容

针对上述现有技术中的缺陷，本发明所解决的技术问题在于提供一种通用的靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法。本方法对应用者没有研究背景要求，可相对快速简单地批量制备靶向蛋白嵌合型分子化合物，从而实现特异性降解细胞内的靶蛋白。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种通用的靶向蛋白质嵌合型分子化合物的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

①查找和分析靶蛋白的三维结构并预测其活性位点；

②选择化合物数据库，根据研究目的对数据库进行初步筛选；

③采用基于分子对接的计算机虚拟筛选方法获得一组候选的与靶蛋白适配程度高的配体化合物；

④进一步对候选的配体化合物进行人工筛选，从中选择出一组最适靶蛋白配体化合物；

⑤获取步骤④所筛选出的最适靶蛋白配体化合物；

⑥利用小分子与蛋白间相互作用检测方法进一步从所述最适靶蛋白配体化合物中筛选出与靶蛋白活性位点具有最佳结合力的最优靶蛋白配体化合物；

⑦参考计算机模拟的最优靶蛋白配体化合物与靶蛋白结合方式，构建由所述最优靶蛋白配体化合物、泛素连接酶E3识别配体及连接两者的Linker组成的靶向蛋白嵌合型分子化合物。

⑧用化学法合成步骤⑦所构建的靶向蛋白嵌合型分子化合物。

优选地，步骤⑦所述的泛素连接酶E3识别配体可以为但不限于来源于能够识别泛素连接酶E3的缺氧诱导因子-1α(hypoxia induciblefactor,HIF-1α)的五肽结构：NH-Leu-Ala-Pro（OH）Tyr-Ile-COOH。

优选地，步骤②所述的化合物数据库可以为但不限于Chemdiv、Chembridge、Enamine、Lifechemicals、Maybridge化合物数据库中的一个或多个。

优选地，步骤③所述的分子对接软件可以为但不限于Dock、AutoDock、Glide、Surflex、3D-Dock、Gold、Hex、ICM、MVD、Flex X软件中的一种或多种。

优选地，步骤⑥所述的小分子与蛋白间相互作用检测方法可以为但不限于表面等离子体共振、等温滴定量热法方法中的一种或多种。

一方面，本发明还提供了一种使用上述的方法构建成的靶向蛋白嵌合型分子化合物，用于通过泛素化途径降解靶蛋白，其特征在于：所述的靶向蛋白嵌合型分子化合物既包含能够与靶蛋白活性位点相结合的特异性配体，又包含能够与泛素连接酶E3相结合的识别配体，所述靶向蛋白嵌合型分子化合物能够使靶蛋白经过泛素蛋白酶体通路发生特异性降解。

随着后基因组时代的到来,科学家们的研究重心已经从解释生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。但是蛋白质功能研究的难题是不能够通过“基因组测序计划”等类似的大科学模式去集中有效地攻破，而需要不同研究背景的人从不同角度开展研究。以往人们对蛋白质的研究多局限于体外研究，但更重要的是了解蛋白质在体内的特征和行为。虽然有关体内研究蛋白质功能的方法手段在不断发展，但是调节体内蛋白质水平的方法还一直欠缺。蛋白质靶向泛素化降解技术为调节体内蛋白质水平提供了一种可行的方法，但该方法的核心部分即如何构建靶向蛋白嵌合型分子化合物成为该技术的应用瓶颈。本发明结合计算机虚拟筛选和小分子与蛋白相互作用检测方法提供了一种通用的构建靶向蛋白嵌合型分子化合物的方法，为不同研究背景的人们进行体内蛋白质功能研究提供了一种有效的调节蛋白质水平的方法。

由于本发明首先在计算机上对化合物分子进行筛选，大大降低了实际筛选化合物的数目，且提高了先导化合物的发现效率。本发明还采用了表面等离子共振技术（SPR）或等温滴定量热法（ITC）等方法来检测小分子化合物与蛋白间的相互作用，对计算机筛选出的配体化合物进行结合验证，从而保证了配体化合物与靶蛋白结合的特异性和高亲和性。由于分子对接技术能够自动模拟配体化合物与靶蛋白活性位点的结合方式，使得没有化学合成研究背景的人也可以顺利构建靶向蛋白嵌合型分子化合物。此外，本发明优选的来源于HIF-1α的五肽结构作为泛素连接酶E3的识别配体，具有分子量小，极性小的特点，据此构建的靶向蛋白嵌合型化合物将具有良好的渗透性，能方便灵活地在体内穿行和进入细胞，有成为新药物的潜能，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为基于本发明一种靶向蛋白嵌合型分子化合物介导的泛素化途径靶向降解靶蛋白的示意图。

具体实施方式

本实施例提供一种靶向泛素化降解蛋白质嵌合型分子化合物的构建方法，包括如下步骤：

①查找和分析靶蛋白的三维结构，并据此确定其活性位点

了解靶蛋白与小分子配体化合物的相互作用位点是计算机虚拟筛选中一个基础的步骤，而如何准确地寻找靶蛋白活性位点是虚拟筛选配体化合物的前提。通过对文献及数据库的查询，如美国的蛋白质结构数据库(ProteinData Bank,简称PDB)，可以获得绝大部分蛋白质的三级结构。此外，蛋白质三维结构的预测方法也已非常成熟，如同源建模、从头预测、折叠识别等。对于不能获得明确三级结构的蛋白或者多肽，也可以通过预测的方法得到，使得虚拟筛选成为可能。

由蛋白质的三级结构可知，配体结合位点通常位于蛋白质表面口袋区域(Pool)或者裂缝(Gap)的地方，找出靶蛋白表面这些凹陷的地方已经成为蛋白质活性位点预测研究领域中首先需要解决的问题，也是最常用的手段。

目前，已经有一系列的算法以及工具可用于预测并分析蛋白质活性位点，主要有以下几种：1）基于Grid的方法；2）基于Sphere的方法；3)基于Alpha-shape的方法；4)基于结合自由能的方法。

②选择一个合适的化合物数据库

根据研究目的以及准备获得的化合物数量的不同，结合化合物库自身特点选择最适合的一个或多个化合物数据库作为筛选对象。目前常用的化合物数据库主要有Chemdiv、Chembridge、Enamine、Lifechemicals、Maybridge等。

③利用分子对接软件中的不同对接模式，进行逐级筛选，筛选出与靶蛋白活性位点结合力较高的配体化合物

分子对接(molecular docking)技术是通过研究小分子配体与受体生物大分子相互作用，预测其结合模式和亲和力进而实现基于结构的配体筛选的一种重要的方法。根据配体与受体作用的“锁钥原理”(lock and keyprinciple)，分子对接可以有效地确定与靶受体活性部位空间和电性特征互补匹配的小分子化合物，为探讨相关小分子与蛋白间作用提供了一种有效的研究手段。分子对接软件中的不同对接模式，如快速对接模式（HTVS）、标准对接模式（SP）和精细对接模式（XP），可对化合物进行逐级筛选。

分子对接评分函数主要分为以下三类:基于物理的能量函数；经验函数；基于知识的函数。基于物理的能量函数是利用“热力学主方程”进行自由能预测。经验函数法则考虑了多种因素的贡献，如残基成对偏好性、几何互补性及静电、氢键、疏水相互作用能等。基于知识的函数是利用波尔兹曼（Boltzmann）分布对已有的蛋白质结构数据库进行统计分析而获得的，诸如残基-残基接触势、残基成对偏好性和原子-原子接触势等。

配体和靶蛋白对接结果的好坏是由结合自由能来判断的。一般来说，最低的结合自由能对应与靶蛋白的结合较稳定的配体，可以利用如MMGBSA（Generalized Born model，普适波恩模型）等算法来计算筛选出的配体化合物的结合自由能。

④选出结合自由能较优的一组配体化合物进行人工的蛋白-配体结合模式和化学合成方面的分析，从中选择出最适的配体化合物

通过分子对接逐级筛选及评分函数打分获得一批理论上与靶蛋白活性位点结合力较高的配体化合物，然后由人工根据研究目的进行筛选，如去除有毒基团、满足合成化学的标准等。筛选的配体化合物还需考虑以下问题：①分子必须含有胺基、羟基末端，易于与Linker发生酯化或者酰化反应，或者含有苯环，容易被取代添加上氨基或羟基。②极性太大的分子（如含羧基）不考虑，因为其会使Protac极性大，导致配体化合物的细胞渗透性不好。③为了避免考虑区域选择性问题，多羟基和氨基同时存在时不考虑（氨基和酰胺中的氨基在合成中具有选择性，对缩合反应无影响）。④杂环中仲胺的反应活性不如伯胺，所以该类结构化合物不考虑。⑤优选含吡啶结构的化合物，这样的结构有助于吸收。⑥脂肪胺相比芳胺会更有利于与Linker连接，另外脂肪胺的柔性好，与linker连接后有足够的扭转可能，可使配体化合物分子链接上Linker后仍保持活性。

⑤获取步骤④所筛选出的最适配体化合物

若筛选出的适配程度高的配体化合物来自于商购化合物数据库，则可以直接购买。若筛选出的适配程度高的配体化合物来自于公共数据库，则可通过化学合成的方法来合成这些配体化合物。推荐采用商购化合物数据库，可以大大缩短研究时间。

⑥利用小分子与蛋白间相互作用检测方法进一步筛选出与靶蛋白活性位点具有最佳结合力的最优对接配体化合物

通过计算机虚拟筛选出一组适配程度高的化合物后，由于目前评分函数可能存在“假阴性”(false negative)现象，这与由该函数评价得到的候选分子多数为类似结构相关。为了弥补评分函数在分辨分子相似性方面的不足，需要通过小分子与蛋白间相互作用的方法，如表面等离子共振技术（SPR）或等温滴定量热法（ITC）等方法，进一步从这些适配程度高的化合物中筛选出与靶蛋白活性位点具有最佳结合力的最优对接配体化合物。

⑦通过计算机模拟配体化合物与靶蛋白的结合方式，构建由所述最优靶蛋白配体化合物、所述泛素连接酶E3识别配体及连接两者的Linker组成的靶向蛋白嵌合型分子化合物。其中Linker的选择不是一成不变的,可以根据最优对接配体化合物与靶蛋白结合方式来决定。

⑧用化学法合成靶向蛋白嵌合型分子化合物

目前的化学合成技术已非常成熟，只需构建出Protac的化学结构图，很多多肽合成厂家均可以合成所需要的能够特异性降解靶蛋白的Protac。

步骤①～④、步骤⑥和步骤⑧均可以委托专业的公司进行，一般总过程需要2～4个月。

泛素连接酶E3的功能结构域虽然保守，但也存在一定的不同，根据功能结构域的不同，可将E3分为HECT家族、RING-finger家族和U-Box家族。相应地，泛素连接酶E3的识别配体也必然存在多个。基于pVHL泛素连接酶E3天然配体低氧诱导因子1α（Hypoxia-inducible factor，HIF-1α）与E3结合部位的氨基酸序列构成的五肽结构，是目前最先进的用于合成Protac的泛素连接酶E3识别配体，具有分子量小，穿透性好，易于合成等优点。本发明推荐但不限于该五肽结构的E3识别配体。

本发明方法中的化合物数据库可选自Chemdiv、Chembridge、Enamine、Lifechemicals、Maybridge等化合物库中的任何一种，根据研究目的以及准备获得的化合物的数量不同，结合化合物库自身特点选择最适合的一个或多个化合物库作为筛选对象。推荐选择商业化的数据库，如Enamine化合物数据库，因为此类数据库中的化合物均可直接从公司购买，可大大节省实验时间。

目前已开发的分子对接软件有几十种，最常用且准确度相对高的分子对接软件主要有Dock、Glide、AutoDock、Surflex、3D-Dock、Hex、Flex X等，这些软件采用了不同的搜索算法和评分函数来筛选化合物。可组合使用这些对接软件，然后对不同软件的筛选结果进行比较分析，以进一步过滤适配度低的配体化合物，筛选出适配度高的配体化合物。

为了进一步从适配程度高的化合物中筛选出与靶蛋白活性位点具有最佳结合力的最优对接配体化合物，可采用小分子与蛋白相互作用的检测方法对靶蛋白与配体化合物间的相互作用进行验证。本发明推荐但不限于采用表面等离子共振技术（SPR）或等温滴定量热法（ITC）方法。这两种检测方法成熟可靠，应用简单便捷，可批量进行验证，是高筛选成功率的保证。

采用上述方法构建成的靶向蛋白嵌合型分子化合物（Protac），既包含能够与靶蛋白活性位点相结合的特异性配体又包含能够与泛素连接酶E3相结合的识别配体，从而能够介导靶蛋白经过泛素蛋白酶体通路发生特异性降解。Protac介导靶蛋白降解过程如图1所示：在Protac的作用下，靶蛋白与泛素连接酶E3结合；靶蛋白被泛素分子Ub进行了泛素化标记，被泛素化的靶蛋白能够被26S蛋白酶体识别，被降解成短链的多肽分子。

使用本发明所述的方法构建成的能靶向泛素化降解蛋白质的Protac，结构简单，易于合成，并且作为小分子化合物，能方便灵活地在体内穿行和进入细胞，且不存在异源蛋白相关问题，具有转化为新药物的价值和潜能。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，对于本领域的一般技术人员，依据本发明内容的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制，凡依本发明设计思想所作的任何改变都在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

①查找和分析靶蛋白的三维结构并预测其活性位点；

②选择化合物数据库，根据研究目的对数据库进行初步筛选；

③采用基于分子对接的计算机虚拟筛选方法获得一组候选的与靶蛋白适配程度高的配体化合物；

④进一步对候选的配体化合物进行人工筛选，从中选择出一组最适靶蛋白配体化合物；

⑤获取步骤④所筛选出的最适靶蛋白配体化合物；

⑥利用小分子与蛋白间相互作用检测方法进一步从所述最适靶蛋白配体化合物中筛选出与靶蛋白活性位点具有最佳结合力的最优靶蛋白配体化合物；

⑦参考计算机模拟的最优靶蛋白配体化合物与靶蛋白结合方式，构建由所述最优靶蛋白配体化合物、泛素连接酶E3识别配体及连接两者的Linker组成的靶向蛋白嵌合型分子化合物；

⑧用化学法合成步骤⑦所构建的靶向蛋白嵌合型分子化合物。

2.如权利要求1所述的靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法，其特征在于：步骤⑦所述的泛素连接酶E3识别配体来源于能够特异性识别泛素连接酶E3的缺氧诱导因子-1α的五肽结构：NH-Leu-Ala-Pro（OH）Tyr-Ile-COOH。

3.如权利要求1所述的靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法，其特征在于：步骤②所述的化合物数据库可以为Chemdiv、Chembridge、Enamine、Lifechemicals、Maybridge化合物数据库中的一个或多个。

4.如权利要求1所述的靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法，其特征在于：步骤③所述的分子对接软件可为Dock、AutoDock、Glide、Surflex、3D-Dock、Gold、Hex、ICM、MVD、Flex X软件中的一种或多种。

5.如权利要求1所述的靶向蛋白嵌合型分子化合物的构建方法，其特征在于：步骤⑥所述的小分子与蛋白间相互作用检测方法为表面等离子体共振或等温滴定量热法方法中的一种或多种。

6.一种使用如权利要求1所述的方法构建成的靶向蛋白嵌合型分子化合物，用于通过泛素化途径降解靶蛋白，其特征在于：所述的靶向蛋白嵌合型分子化合物既包含能够与靶蛋白活性位点相结合的特异性配体，又包含能够与泛素连接酶E3相结合的识别配体，所述靶向蛋白嵌合型分子化合物能够使靶蛋白通过泛素蛋白酶体通路发生特异性降解。

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