CN105801708A - 多肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种多肽及其用途，该多肽包括：第一多肽片段，所述第一多肽片段特异性识别并结合Tau蛋白；第二多肽片段，所述第二多肽片段特异性识别并结合泛素连接酶。利用本发明实施例所提出的多肽，可特异性识别并结合神经元细胞内的Tau蛋白，并且特异性识别并结合泛素连接酶，进而引起Tau蛋白的特异性多聚泛素化修饰，进而Tau蛋白被蛋白质质量控制系统特异性降解。

Description

多肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及多肽及其用途，更具体地，本发明涉及多肽、多肽的制备方法、多肽在制备药物中的用途及药物组合物。

背景技术

Tau蛋白是神经元纤维缠结(Neurofibrillarytangles,NFTs)双螺旋细丝(pairedhelicalfilaments,PHFs)的主要成分，Tau蛋白的病变、聚集以及表达异常是导致包括阿尔兹海默症、额颞叶痴呆、进行性核上麻痹、皮克病等20多种退行性疾病，统称为Tau分子病。Tau分子病导致不可逆的认知功能的损伤，包括记忆能力、推理能力以及人社会功能的丧失。该病的重要临床表征为病人在无外界伤害的情况下，会在较短的时间内逐渐丧失记忆能力、判断能力及思考能力，变成痴呆，并随着时间推移逐渐失去方向感、语言能力，直至丧失最基本的自理能力，如穿衣、吃饭等。Tau分子病给患者及其家庭带来极大的痛苦和负担，也成为社会的重大问题。但目前对于Tau分子病尚无有效的治疗方法和药物，对于Tau分子病药物的开发与研究是整个科研领域亟待解决的难题。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。发明人通过大量的实验研发出一种多肽，该多肽能够特异性引起Tau蛋白降解，而Tau蛋白病变、聚集以及表达异常是引起tau分子病的主要原因，进而本发明所提出的多肽为tau分子病药物的开发提供了基础。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，所述多肽包括：第一多肽片段，所述第一多肽片段特异性识别并结合Tau蛋白；第二多肽片段，所述第二多肽片段特异性识别并结合泛素连接酶。利用本发明实施例所提出的多肽，可特异性识别并结合神经元细胞内的Tau蛋白，并且特异性识别并结合泛素连接酶，进而使得Tau蛋白和泛素连接酶在无限接近的情况下，Tau蛋白可在泛素连接酶的催化下，贴上泛素标签，引起Tau蛋白的特异性多聚泛素化修饰，进而被蛋白质量控制系统特异性降解。

根据本发明的实施例，上述多肽还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述多肽进一步包括：连接肽。所述连接肽为柔性短肽，连接肽的引入增加了本发明实施例所提出多肽的柔韧性。

根据本发明的实施例，所述多肽进一步包括：穿膜肽。穿膜肽的引入使得本发明实施例所提出的多肽自身能够顺利通过血脑屏障或细胞膜而进入细胞，而无需通过外力。

根据本发明的实施例，所述穿膜肽的氨基酸为D型。发明人发现，D型氨基酸可防止细胞内胰蛋白酶对穿膜肽的降解，进而多肽自身顺利通过血脑屏障或细胞膜而进入细胞的效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述多肽中不同片段的连接顺序包括但不限于所述连接肽的N端与所述第一多肽片段的C端相连，所述连接肽的C端与所述第二多肽片段的N端相连，所述穿膜肽的N端与所述第二多肽片段的C端相连。本发明实施例所提出的具有上述连接顺序的多肽，多肽的柔韧性高、穿膜效率高。利用本发明实施例所提出的具有上述连接顺序的多肽，对Tau蛋白的特异性多聚泛素化修饰继而促进Tau蛋白特异性降解的效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述第一多肽片段具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

KDYEEVGVDSVE(SEQIDNO：1)。

YQQYQDATADEQG(SEQIDNO：2)。

SEQIDNO：1是α-微管蛋白亚基上的多肽片段，SEQIDNO：2是β-微管蛋白亚基上的多肽片段，这两个多肽片段具有与Tau蛋白特异性相结合的能力，其中SEQIDNO：2所示的氨基酸序列与Tau蛋白的结合能力更强。进而，本发明实施例所提出的第一多肽片段具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的氨基酸序列，使得本发明实施例所提出的多肽与Tau蛋白的特异性结合能力进一步提高。

根据本发明的实施例，所述第二多肽片段具有SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，其中，所述SEQIDNO：3所示的氨基酸序列的第5位和第9位氨基酸被磷酸化。

DRHDS(p)GLDS(p)M(SEQIDNO：3)。

ALAPYIP(SEQIDNO：4)。

其中，SEQIDNO：3所示的氨基酸序列是来自IκBα蛋白上的10个氨基酸多肽，它可特异性结合泛素连接酶(E3)Skp1-cullin-Fbox(SCF^β-TRCP)，其第5位和第9位氨基酸被磷酸化，可促使其与泛素连接酶结合。SEQIDNO：4所示的氨基酸序列是泛素连接酶vonHippel–Lindau肿瘤抑制蛋白(VHL)的底物。进而，本发明实施例所提出的第二多肽片段具有SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，使得本发明实施例所提出的多肽与泛素连接酶的特异性结合能力进一步提高。

根据本发明的实施例，所述穿膜肽具有SEQIDNO：5所示的氨基酸序列或SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。

RKKRRQRRR(SEQIDNO：5)。

RRRRRRRR(SEQIDNO：6)。

SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示的氨基酸序列的穿膜肽序列短，穿膜效率高，其中，优选SEQIDNO:6所示的氨基酸序列作为跨膜序列，其引导本发明实施例的多肽的跨膜效率显著高于SEQIDNO:5所示的氨基酸序列。引入具有上述序列的氨基酸片段作为穿膜肽，本发明实施例提出多肽的跨膜效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQIDNO：7或SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。

GSGS(SEQIDNO：7)。

GGSGG(SEQIDNO：8)。

SEQIDNO：7和8所示的氨基酸序列为具有柔性的短肽序列，由SEQIDNO：7和8作为本发明实施例的多肽中第一多肽片段和第二多肽片段之间的连接肽，使得本发明实施例的多肽的柔性显著提高，更有利于本发明实施例的多肽识别和结合Tau蛋白和泛素连接酶。其中，SEQIDNO：7的柔性优于SEQIDNO：8。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种多肽，所述多肽具有SEQIDNO:12或9、10、11所示的氨基酸序列，其中，所述SEQIDNO:9的第22位和第26位氨基酸被磷酸化，所述SEQIDNO:10的第22位和第26位氨基酸被磷酸化。

YQQYQDATADEQGGSGSALAPYIPRRRRRRRR(SEQIDNO:12)。

KDYEEVGVDSVEGGSGGDRHDS(p)GLDS(p)MRRRRRRRR(SEQIDNO:9)。

YQQYQDATADEQGGSGSDRHDS(p)GLDS(p)MRRRRRRRR(SEQIDNO:10)。

KDYEEVGVDSVEGSGSALAPYIPRRRRRRRR(SEQIDNO:11)。

其中，发明人通过实验研究发现，SEQIDNO:9～12所示氨基酸序列的多肽能够引起Tau蛋白特异性多聚泛素化修饰，继而tau蛋白被蛋白质量控制系统特异性降解。本发明实施例所提出的多肽柔性好、穿膜效率高、能够引起神经细胞内Tau蛋白的特异性多聚泛素化修饰继而被蛋白质量控制系统特异性降解。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种制备前面所述多肽的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)使芴甲氧羰基-树脂进行活化反应，所述活化反应是通过使所述芴甲氧羰基-树脂与无水二氯甲烷进行接触实现的；(2)使活化的芴甲氧羰基-树脂进行第一脱芴甲氧羰基反应，所述第一脱芴甲氧羰基反应是通过使所述活化的芴甲氧羰基-树脂与含有20体积％哌啶的二甲基甲酰胺进行接触实现的；(3)使脱芴甲氧羰基的树脂与芴甲氧羰基-氨基酸进行缩合反应，所述缩合反应是在2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺和二甲基甲酰胺的混合溶液中进行40min,其中，所述树脂的负载量与所述芴甲氧羰基-氨基酸、所述2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、所述1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和所述N,N-二异丙基乙胺的用量比为1:4:3.6:4:8；(4)将缩合反应产物进行氨基封闭处理，继而进行第二脱芴甲氧羰基反应，所述氨基封闭处理是通过将所述缩合反应产物与乙酸酐、吡啶和二甲基甲酰胺的混合溶液进行接触实现的，所述乙酸酐、吡啶和二甲基甲酰胺的体积比是2：1：3；所述第二脱芴甲氧羰基反应是通过将所述缩合反应产物与含有20体积％哌啶的二甲基甲酰胺进行接触实现的；(5)重复步骤(3)和(4)，以便获得连接有树脂的目的多肽；以及(6)将所述连接有树脂的目的多肽进行切肽反应，以便获得所述目的多肽，所述切肽反应是通过将所述连接有树脂的所述目的多肽与三氟乙酸、纯水、苯甲硫醚、苯酚和乙二硫醇的混合溶液进行接触实现的，所述三氟乙酸、纯水、苯甲硫醚、苯酚和乙二硫醇的体积比为82.5：5：5：5：2.5。本发明实施例所述提出的制备前面所述多肽的方法操作简便、制备效率高。利用本发明实施例所提出的制备多肽的方法制备的多肽，可特异性引起神经元细胞内Tau蛋白的特异性泛素化降解。

根据本发明的实施例，上述制备前面所述多肽的方法还可以进一步包括如下附加技术特征的至少之一：

根据本发明的实施例，上述制备方法进一步包括：对所述目的多肽进行分离纯化，任选地，所述分离纯化是通过高效液相色谱进行的，所述高效液相色谱的条件是：系统为Waters-600E多通道系统，检测器为Waters-2487紫外检测器，检测波长为215nm和254nm，分离柱为C18半制备柱，所述柱子型号为DEVELOSILODS-UG-5，洗脱液为乙腈和水的混合溶液，流速为每分钟6毫升的流速，任选地，进一步包括：利用电喷雾质谱或MALDI-TOF质谱鉴定高效液相色谱峰样品，基于质谱鉴定结果，确定并收集所述目标多肽。根据本发明的实施例，经过上述高效液相色谱和质谱的纯化和鉴定，所获得目标多肽的纯度进一步显著提高。

在本发明的第四方面，本发明提出了前面所述多肽的在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防tau分子病。细胞内的Tau蛋白的大量表达、聚集或病变是引起tau分子病的主要原因，发明人通过实验发现，本发明实施例所述提出的多肽制备的药物，具有治疗或预防tau分子病的显著效果。

在本发明的第五方面，本发明提出了前面所述多肽在逆转线粒体的错误定位、减少淀粉样β(Aβ)蛋白毒性或降低Tau蛋白的含量中的用途。发明通过实验发现，利用本发明实施例所提出的多肽，可显著降低Tau蛋白过表达神经细胞内线粒体的错误定位、显著减少淀粉样β(Aβ)蛋白毒性和降低tau分子病患者神经细胞内Tau蛋白的含量。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物用于治疗或预防tau分子病、逆转线粒体的错误定位、减少淀粉样β(Aβ)蛋白的毒性或降低Tau蛋白含量，所述药物组合物含有：前面所述多肽作为活性成份。利用根据本发明实施例所提出的药物组合物，可有效治疗或预防tau分子病、逆转线粒体的错误定位、减少淀粉样β(Aβ)蛋白的毒性或降低Tau蛋白含量。

根据本发明的实施例，本发明所提出的药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可以接受的赋形剂或佐剂。所述药物组合物呈片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。

根据本发明的一些实施例，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。

根据本发明的实施例，本发明的药物组合物能够逆转线粒体的错误定位、减少淀粉样β(Aβ)蛋白的毒性或降低Tau蛋白含量，因而，本发明的药物组合物可以在治疗或预防tau分子病、逆转线粒体的错误定位、减少淀粉样β(Aβ)蛋白的毒性或降低Tau蛋白含量时被给药。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在tau分子病治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病(主要指tau分子病)的治疗，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防tau分子病)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述t-BHQ的药物给予有需要的个体。

根据本发明的实施例，本发明的药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物或药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含本发明的多台、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂或佐剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。

根据本发明的实施例，本发明实施例所提出的多肽的作用浓度是0.1微摩尔/升～200微摩尔/升。发明人通过大量的研究实验发现，当多肽的作用浓度在0.1微摩尔/升～200微摩尔/升时，其作用于神经元细胞产生的Tau蛋白的特异性多聚泛素化修饰，继而被蛋白质量控制系统降解效果显著。

附图说明

图1是根据本发明实施例的多肽的高效液相色谱和质谱检测结果；

图2是根据本发明实施的TH006与Tau蛋白相互作用以及可进入细胞的结果图，

其中，A为合成各种多肽处理Tau-EGFP过表达的N2a细胞的流式细胞仪结果图，

B为Tau和CF-TH006相互作用的荧光极化结果图，

C为CF-TH006进入细胞的流式细胞结果图，

D为CF-TH006进入细胞的激光共聚焦显微镜结果图，

E和F分别为A与B的流式细胞结果的平均荧光值；

图3是根据本发明实施例的Tau与对照羧基荧光素(CF)以及羧基荧光素标记的CP1的荧光极化结果图；

图4是根据本发明实施例的TH006的细胞定位以及降解Tau的结果图，

其中，A为激光共聚焦显微镜显示的CF-TH006能够进入细胞质中，并且一部分分布在溶酶体中的结果图，

B为免疫印迹杂交结果显示的TH006能够降解Tau，但可以被MG132和BafilomycinA1所抑制的结果图；

图5是根据本发明实施例的TH006能够通过增加Tau蛋白的多聚泛素化从而诱导Tau蛋白的降解的结果图，

其中，A为流式细胞仪检测显示的随着TH006浓度增加，Tau-EGFP被降解增多的结果图，

B为流式细胞仪结果显示的在200μMTH006处理细胞时，随着处理时间增长，Tau-EGFP被降解的增多的结果图，

C和D分别为A和B的平均荧光强度统计结果，

E为免疫印迹杂交结果显示的随着TH006浓度增加，Tau-EGFP被降解的越多的结果图，F为免疫印迹杂交结果显示的随着处理时间越长，Tau-EGFP被降解的越多的结果图，

G为免疫印迹杂交结果显示的对照肽CP1和CP2不能降解Tau的结果图，

H为在SH-SY5Y细胞中TH006能够降解Tau的结果图，

I为TH006能够降解三转基因AD鼠原代神经元细胞中的Tau蛋白的结果图，

J为TH006能够增加Tau蛋白的多聚泛素化修饰的结果图，

K为TH006促进Tau蛋白降解与蛋白酶体途径以及自噬途径相关的结果图，

L为免疫沉淀耦联免疫印迹杂交结果显示的TH006促进Tau蛋白泛素化是依赖于VHLE3泛素连接酶的结果图；

图6是根据本发明实施例的对westernblotting的结果进行定量的结果图，

其中，A为5E的定量的定量结果图，B为5F的定量结果图；

图7是根据本发明实施例的TH006能够恢复由于Tau蛋白过表达所导致的线粒体分布不均的结果图，

其中，A为野生型N2a细胞的免疫荧光的结果图；

B为过表达Tau的N2a细胞的免疫荧光的结果图；

C为过表达Tau的N2a细胞加入TH006处理后的免疫荧光的结果图，

其中第一栏为DAPI染色，染细胞核，第二栏为Tau蛋白的荧光，第三栏为线粒体的染色，第四栏是合并图，标尺为10微米；

图8是根据本发明实施例的TH006能够减少Aβ对细胞的神经毒性，并且减少转基因鼠皮质中的Tau蛋白的水平的结果图，

其中，A为TH006能够减少Aβ对野生型N2a细胞的毒性的结果图，

B为TH006能够减少Aβ对过表达Tau蛋白的N2a细胞的毒性的结果图，

C为TH006能够减少Aβ对原代神经元细胞的毒性的结果图，

D图为TH006对野生型N2a细胞的毒性实验的结果图，

E图为免疫印迹杂交结果表明TH006能够减少小鼠皮质中Tau蛋白的含量的结果图；以及

图9是根据本发明实施例的TH006能减少Tau蛋白的水平的结果图，

其中，A为AD模型鼠CA3区的Tau蛋白水平的免疫组化图，

B为以及皮质区中的Tau蛋白水平的免疫组化图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

在本实施例中，发明人对实施例2～7所用实验方法和技术进行详细描述：

多肽合成及分离

多肽合成采用Fmoc(芴甲氧羰基)固相合成策略，将0.4mmolRink-amide树脂(吉尔生化，中国)，在无水二氯甲烷(DCM)浸泡溶胀树脂约0.5小时，待树脂完全溶胀后，抽去溶剂DCM。后用二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF)润洗树脂3遍后，抽去溶剂。加入含20％哌啶的DMF溶剂脱去Fmoc保护基。称取4倍当量的Fmoc保护的氨基酸，3.6倍当量的HATU(2-(7-氮杂-1H-苯并三氮唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯)，和4倍当量的HOAt(1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑)，用DMF充分溶解，后加入8倍当量的DIEA(二异丙基乙胺)。充分溶解后，吸入合肽器中。室温下，振荡反应40分钟，水泵抽去反应溶剂后，吸取10mLDMF清洗树脂3次，后用10mLDCM清洗树脂3次，后再用10mLDMF清洗3次。挑取少量树脂于1.5mL离心管中，用滴管加入Kaiser’s试剂在加热套中加热约1分钟，观察树脂及溶液的颜色变化。如果树脂不变蓝，溶液呈现乳黄色，表明氨基酸已成功耦合到树脂上，如果树脂变蓝色，则表明氨基酸没有完全耦合到树脂上，需要重复耦合此氨基酸。待树脂耦合完全后，可加入Capping试剂(乙酸酐：吡啶：DMF体积比为2：1：3)约10mL，在常温下先摇荡反应30分钟，用来封闭树脂上未反应完全的氨基。而后依次用溶剂DMF(10.0mL洗3次)，DCM(10.0mL洗3次)和DMF(10.0mL洗3次)洗涤树脂，再用20％派啶/DMF脱除保护基Fmoc(10.0mL2次)，时间分别为5分钟和20分钟。然后再依次用溶剂DMF(10.0mL洗3次)，DCM(10.0mL洗3次)和DMF(10.0mL洗3次)洗涤树脂。再用Kaiser’s检测法，检测Fmoc是否脱除完全。之后进行下一个氨基酸的耦合。多肽合成完毕后，将合肽器中的树脂用DCM洗涤至少8-10次，在油泵下充分抽干，然后将抽干的含有目标多肽的树脂放入干净的50.0mL圆底烧瓶中，室温下缓慢加入切肽试剂(三氟乙酸：纯水：苯甲硫醚：苯酚：EDT比例为82.5：5：5：5：2.5(v/v))溶液10.0mL，密封后，室温下摇荡反应3小时。将反应完的切肽混合物过滤，取过滤后的液体，用旋蒸仪除去大部分的三氟乙酸后，将残留的液体用滴管逐滴滴入20.0mL的无水乙醚中，出现白色絮状沉淀，用超声仪超声10分钟，而后用低温高速离心机以10000转每分钟的转速，4℃条件下离心10分钟，倒去溶剂乙醚，向沉淀中再次加入无水乙醚20.0mL，超声10分钟，同样条件下离心10分钟，再重复一次，以除去大部分的杂质。最后倒去乙醚，沉淀用真空干燥24小时。用乙醚洗涤过的固体沉淀用去离子水和少量乙腈充分溶解，而后冷冻干燥得到白色絮状固体，–20℃密封保存，用于后期分离纯化。将冻干的多肽粗品，溶于一定配比的乙腈/水溶液中过滤后利用高效液相色谱(HPLC)进行分离纯化。所用HPLC仪器为Waters-600E多通道系统，检测器为Waters-2487紫外检测器(检测波长为215nm和254nm)，选用的分离柱子为C18半制备柱，柱子型号为DEVELOSILODS-UG-5(10.0250mm)。洗脱液选用不同配比的乙腈(含有0.06％TFA)和水(含有0.06％TFA)，按照一定的浓度梯度，以每分钟6毫升的流速进行洗脱。收集主要峰产物，进行电喷雾(ESI)质谱或MALDI-TOF质谱鉴定。根据质谱结果收集HPLC的样品峰。将收得的样品通过减压旋蒸除去乙腈。在低温冷冻干燥机上进行冷冻干燥，获得目标多肽，样品置于–20℃保存，并可以通过C18分析柱进行样品纯度分析。将经HPLC分离纯化的样品冻干，溶解于去离子水或乙腈中。将样品滴加到样品板上，在室温下用空气吹干。应用MALDI-TOF-MS(美国ABI公司)，采用线性(Linear)模式或反射(Reflection)模式进行分析。质谱条件为337nm的氮气激光，20.0kV的加速电压，扫描次数为100次。

质粒的构建

人源的全长Tau蛋白的基因合成于泰合生物科技有限公司，通过PCR扩增得到含有NdeI和XhoI酶切位点的Tau基因，通过特异性NdeI和XhoI酶切pET-28a(+)，连接反应，将Tau基因连接到原核表达质粒pET-28a(+)上。通过XhoI和BamHI酶切位点，将Tau基因连接到哺乳动物细胞表达质粒pEGFP-N3上。

表达纯化重组Tau蛋白

将构建好的原核表达载体转化到能用于蛋白表达的大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中。先将菌斑挑取置于含有卡那霉素的LB培养基的三角瓶中进行小量培养。待培养基浑浊后，吸取1mL的菌液到1L含有卡那霉素的LB培养基中进行扩增培养，37℃培养至OD值达0.6，加入终浓度为1mM的IPTG诱导蛋白表达，诱导温度为16℃培养20h以上。将诱导表达的细菌，通过离心，进行收集，用预冷的蛋白提取缓冲液(20mMTris-HCl，500mMNaCl，10％甘油，pH7.4)重旋菌体。将重旋的菌体加入1/100体积的10％Triton，和1/100体积的蛋白酶抑制剂PMSF。混合均匀，在冰浴的条件下利用细胞超声破碎仪进行超声破碎。超声结束后，装入离心管中，进行高速离心，20000rpm，4℃离心15min。离心结束后，取上清进行过滤，过滤至新的烧杯中，加入1/100体积的2M咪唑。混合均匀后，即可进行挂柱。此蛋白的提取采用镍柱亲和层析的方法。待蛋白反复挂柱后，用含有咪唑的缓冲液(20mMTris，500mMNaCl，10％甘油，pH7.4)进行梯度洗脱。咪唑的洗脱梯度分别为35mM，40mM，60mM，80mM，100mM，200mM，300mM。将梯度洗脱的蛋白进行收集，并通过蛋白质电泳进行检测。

细胞培养和基因转染

鼠神经母细胞瘤(Neuro-2a，N2a)细胞，细胞培养所用培养基为：45％的DMEM培养基(Dulbecco'sModifiedEagle'sMedium；Gibco),45％α-MEM培养基(α-MinimumEssentialMedium),加10％FBS胎牛血清(FetalBovineSerum),双抗青霉素(Penicillin,100U/mL)及链霉素(Streptomycin，100μg/ml)。在37℃，5％CO₂的无菌培养箱中进行培养。人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)所用培养基为：15％胎牛血清，85％RPMI1640培养基，双抗青霉素(Penicillin,100U/mL)及链霉素(Streptomycin，100μg/ml)。将30μLpEGFP-N3-Tau质粒与250μL不含血清的Opti-MEM培养基混匀，同时将20μL脂质体Lipofactermin2000与250μL不含血清的Opti-MEM培养基混合均匀，静置5分钟后将含有质粒的培养基与含有脂质体的培养基轻轻混合，上下翻转数次后静置20分钟。与此同时，用不含血清的Opti-MEM培养基轻轻洗涤细胞3次，以除去血清。当质粒和脂质体混合20分钟后，吸取500μL的混合培养轻轻加到1个孔中，再加入500μL不加血清的Opti-MEM培养基，37℃的恒温箱含5％CO₂培养4-6小时后，吸除含脂质体的培养基，轻轻洗涤2遍后，缓慢加入全培养基，37℃下含5％CO₂的恒温培养箱里培养24小时后，用荧光显微镜观察细胞的转染效率。

流式细胞仪检测

为了检测细胞内绿色荧光信号的减少，采用流式细胞分析仪(BDCaliburFlowCytometer美国BD公司)检测。将待测细胞悬浮于灭菌的PBS缓冲液中，根据说明调节流式细胞仪的参数，细胞计数为10000个，计算细胞平均荧光强度(MeanFluorescenceIntensity,MFI)，并利用软件中的Overlay功能，重叠各个实验样品的积分图，观察是否有荧光回迁。

荧光极化实验

在黑色的96孔板中，加入一定浓度的标记荧光的小分子，将不同浓度梯度的目标蛋白加入到含有荧光小分子的孔中，并用PBS溶液补加到200μL，避光孵育一定时间后，利用多功能酶标仪的荧光极化模块程序(FluorescencePlorization)进行检测，激发光为440nm/40，发射光为485nm/20。每个样品设置3个对照。记录测得的平行光方向的读值I_||和垂直光方向的读值I┴。并用公式计算荧光极化率F，

$F=\frac{I_{//}-I_{\⊥}}{I_{//}+I_{\⊥}}$

并通过公式，得到Tau蛋白与CF-TH006的K_D值：

$F=F_{\min }+(K_D+A_0+E_0-\sqrt{{(K_D+A_0+E_0)}^2-4A_0{E}_0})*\frac{F_{max}-F_{min}}{2A_0}$

F代表荧光极化值；F_max，代表最大荧光极化值；F_min，代表最小荧光极化值；E₀，代表Tau蛋白的总浓度；A₀，代表CF-TH006；K_D，代表解离常数。

免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)及免疫印迹杂交(WesternBllotting)实验

细胞裂解液进行蛋白浓度定量后，取相同总量的蛋白进行免疫沉淀实验(Immunoprecipitation，IP)。将蛋白总量相同的样品，加入一定量的PBS缓冲液，与相同量的抗体进行共孵育，4℃轻轻摇晃过夜。然后加入等量的ProteinA+G的小珠，进行共孵育，4℃轻轻摇晃约8小时。孵育完毕后2500rpm，4℃离心10分钟，轻轻弃掉上清。用预冷的PBS缓冲液轻轻洗涤ProteinA+G的小珠5次，轻轻弃掉上清。最后将20μL上样缓冲液加入到吸附抗体和蛋白的小珠中，加热煮沸10分钟后，将所有样品全部上样到SDS-PAGE胶中，进行电泳，然后转膜，进行WesternBlotting实验。将含有一抗的缓冲液加入到包被膜的塑封袋中，4℃轻轻摇晃过夜。后用TBST缓冲液洗涤4遍，每次15分钟。加入耦联辣根过氧化物酶的二抗，抗体按照一定比例加入到稀释的TBST缓冲液中，二抗与膜4℃下孵育8h。二抗孵育完后，将膜置于TBST缓冲液中洗涤4-6遍，然后用pH7.5的50mMTris-HCl缓冲液平衡膜。将耦联化学发光基团的辣根过氧化物酶的底物，均匀加到膜上，盖上保鲜膜，在暗室中，利用医用胶卷，在X光胶片显影仪下进行显影。所用抗体如下：Tau抗体(sc-21796，SantaCruz)，β-actin抗体(A1978，Sigma-Aldrich)，GAPDH抗体(sc-32233，SantaCruz)，K48-连接多聚泛素化抗体(4289S，CellSignalingTechnology)，抗-Flag抗体(SigmaF-1804)，抗-VHLE3ligase抗体(Santacruze,sc-5575)，辣根过氧化物酶耦联抗兔IgG(A6154,Sigma-Aldrich)，辣根过氧化物酶耦联抗鼠IgG(SAB3701023,Sigma-Aldrich)。

原代神经元细胞培养

取三转AD鼠的新生鼠(24小时以内)或Sprague-Dawley大鼠18天的胎鼠脑中的海马组织。将海马组织在D-Hank’s溶液中吹打散后，用含有0.125％D-Hank’s缓冲液37℃消化20分钟，然后过滤，除去大的未消化的组织块，1000rpm离心5分钟，细胞用DMEM/F12培养基重悬，以1～3x10⁶细胞/ml的浓度，种在多聚L赖氨酸包被的盖玻片上。用含10％胎牛血清，2％B27的DMEM/F12培养基在5％CO₂，37℃培养24小时后，更换成不含血清的培养基。在细胞接种48小时后，加入终浓度为10mM的阿糖胞苷，用以抑制小胶质细胞的生长。

免疫荧光实验

细胞种植在0.1mg/ml多聚赖氨酸包被的玻片上，TH006处理后，用PBS缓冲液漂洗细胞，加入4％多聚甲醛固定细胞20分钟，后用含0.2％TritonX100的PBS缓冲液穿透细胞10分钟，加入含有抗Tau抗体的0.02％TritonX100的PBS缓冲液共孵育1小时，PBS洗涤后，加入含有FITC-耦联的二抗的0.02％TritonX100的PBS缓冲液共孵育1小时，后漂洗细胞3次，用1μg/mlDAPI孵育细胞1分钟，漂洗干净细胞，用抗淬灭的封片剂进行封片，在激光共聚焦显微镜下观察。样品在Zeiss780倒置共聚焦显微镜ObServer.Z1(德国Zeiss)上进行观察。将载玻片倒置在镜头上，63倍油镜下观察，根据需要调节到需要的激发光波段，如Ar激光器458nm、488nm、514nm。HeNe绿色激光器543nm。HeNe橙色激光器594nm。HeNe红色激光器633nm。

CellTiter-GloLuminescent细胞存活率实验

为了检测药物对于细胞生长状况的影响，采用了基于检测细胞中ATP水平的化学发光法实验，用于反映细胞的存活率。细胞中ATP的水平反映了细胞的生活状态，ATP水平越高，表明细胞存活的越多。

选用侧壁不透光，底板透光的无菌96孔细胞板，每孔加入100μL细胞悬液,铺板使得每孔细胞约为1000-10000个/孔。将铺好的细胞置于含5％CO₂，37℃恒温培养箱中孵育，至细胞贴壁后4小时加入一定浓度梯度的药物,药物浓度梯度一般为5-7个梯度,每孔加含有药物的培养基100μL，每个药物梯度设5个重复孔。并且注意阳性对照和阴性对照的设置。加入药物后，将细胞继续在含5％CO₂，37℃恒温培养箱中孵育一定时间后，在倒置显微镜下观察细胞的生长状况。将试剂盒中CellTiter-Glo(Promega,美国)缓冲液和CellTiter-Glo底物在室温下融化回温，待回温到室温下，将10mLCellTiter-Glo缓冲液加入到CellTiter-Glo底物中，将两者混合均匀后，避光保存待用。药物加入细胞培养基中，孵育完后，用排枪快速吸取100μL混合好的CellTiter-Glo试剂加入到每个孔中。并避光在室温下轻轻摇荡10min，以保证化学发光信号稳定。将酶标仪调到Luminescence模式，读取数据。

MTT实验

为了检测小分子对于细胞的毒性，采用MTT实验，具体步骤如下：将铺好的细胞培养在含5％CO₂，37℃恒温培养箱中，等到细胞贴壁后两小时后就可以加入一定浓度梯度的药物，药物浓度梯度一般为5-7个梯度,每孔加含有药物的培养基100μL，每个药物梯度设5个重复孔。并且注意阳性对照和阴性对照的设置。加入药物后，将细胞继续在含5％CO₂，37℃恒温培养箱中孵育16-36个小时，在倒置显微镜下观察细胞的生长状况。待细胞与药物共孵育一段时间后，每孔加入20μLMTT溶液(浓度为5mg/mL，经过滤除菌MTT，一般现配现用，注意避光保存)，继续在含5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养4h。MTT与细胞孵育4小时后，即可终止培养，用1mL的注射器小心吸去孔内培养液。每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。使用酶联免疫检测仪测490nm处的吸光值。

小鼠实验

TH006溶解在无菌的生理盐水中，尾静脉注射结合鼻腔给药5只6个月大的转基因小鼠B6；129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,TauP301L)1Lfa/Mmjax，15mg/kg10天。对照组5只6个月大的转基因小鼠B6；129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,TauP301L)1Lfa/Mmjax注射无菌生理盐水。野生型对照鼠为5B6129SF2/J鼠。给药鼠，一半脑用于免疫组化实验，另一半脑用于免疫印迹杂交实验。

免疫组化实验

解剖的鼠的半脑浸泡在4％多聚甲醛中，4℃放置24小时。将脑组织用二甲苯脱水，后用石蜡包埋，将包埋的石蜡切成厚5μm的含海马组织的切片。将石蜡切片复水后，进行抗原修复，用10％BSA进行孵育后，加入抗Tau的一抗(abcam,ab32057)，4℃过夜，洗涤后，加入耦联AlexaFluor488的二抗，室温孵育1小时，PBS洗涤后，用含有DAPI的ProlongGoldAntifadeReagent抗淬灭封片剂进行封片。免疫组化样品在ZeissLSM780激光共聚焦显微镜20倍物镜下进行观察。

实施例2多肽的设计、合成和功能性评估

为了能够特异性识别Tau,发明人选择了α-和β-微管蛋白与Tau蛋白特异性结合的两段肽段α(430-441):KDYEEVGVDSVE(SEQIDNO：1)和(422-434):YQQYQDATADEQG(SEQIDNO：2)。同时，发明人选择了作为泛素连接酶E3的配体的两段多肽，以此来结合E3泛素连接酶。一段是DRHDS(p)GLDS(p)M(SEQIDNO：3)，来自IκBα蛋白上的10个氨基酸多肽，它可特异性结合泛素连接酶(E3)Skp1-cullin-Fbox(SCF^β-TRCP)。另一段是ALAPYIP(SEQIDNO：4),泛素连接酶vonHippel–Lindau肿瘤抑制蛋白(VHL)的底物。Tau蛋白识别片段与E3泛素连接酶结合片段通过短肽相连，GSGS(SEQIDNO：7)或GGSGG(SEQIDNO：8),以此来增加合成多肽的弹性。多聚精氨酸被设计到肽段的羧基末端，进而可使合成多肽易于跨膜，并且选用D型精氨酸，进而防止细胞内胰蛋白酶对多聚精氨酸的降解。设计出的多肽如表1的TH001～TH006所示：表1

备注：(p)^a代表磷酸化，b代表多聚精氨酸，^c(CF)代表5(6)-羧基荧光素。

进而发明人根据实施例1所述的方法合成多肽，其中，TH001化学结构如式I所示，TH002化学结构如式II所示,TH003化学结构如式III所示,TH004化学结构如式IV所示,TH005化学结构如式V所示,TH006化学结构如式VI所示。

TH001～TH006的高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)检测结果如图1所示，其中A、B是TH001的HPLC和MS检测结果，C、D是TH002的HPLC和MS检测结果,E、F是TH003的HPLC和MS检测结果,G、H是TH004的HPLC和MS检测结果,I、J是TH005的HPLC和MS检测结果,K、L是TH006的HPLC和MS检测结果。

为了进一步检测上述合成多肽能否诱导细胞内的Tau蛋白降解，首先利用基因转染细胞技术构建了过表达Tau-EGFP蛋白的N2a细胞系，将上述合成多肽100μM分别作用于过表达Tau-EGFP的细胞(制备方法如实施例1所述)共孵育24小时，利用流式细胞术，检测细胞里的荧光数值，检测到TH003,TH004,TH005，TH006能够减少过表达Tau-EGFP的细胞里的荧光强度，而多肽(TH001和TH002)基本没有效果，实验结果如图2的A和E所示。在以下实施例中，以TH006为例做进一步研究。

实施例3验证TH006可与Tau蛋白相互作用并可进入细胞

首先，采用荧光极化实验，将0.1μM羧基荧光素标记的TH006(CF-TH006，见表1)与浓度逐渐升高的Tau蛋白(采用原核表达人全长Tau蛋白)进行共孵育半小时后，采用酶标仪检测其荧光极化值，通过公式计算得到Tau蛋白与CF-TH006的解离常数K_D值为0.3944±0.1589μM,结果如图2的B所示，而羧基荧光素标记的对照肽CF-CP1不能与Tau相互作用，结果如图3所示。为了检测TH006能否进入细胞，将羧基荧光素标记的TH006，(CF-TH006，200μM)与野生型的N2a细胞进行共孵育不同时间，流式细胞仪检测结果显示，随着孵育时间延长，CF-TH006逐渐进入细胞，细胞中的荧光信号值逐渐增加，结果如图2的C和F所示。激光共聚焦显微镜结果同样表明，CF-TH006能够进入细胞，并且分布在胞质中，还有部分分布在溶酶体中，结果如图2的D和图4的A所示。

实施例4TH006诱导Tau蛋白降解

为了进一步证实TH006能够诱导细胞内Tau蛋白降解，发明人将不同浓度的TH006与过表达Tau-EGFP的N2a细胞进行共孵育24小时，流式细胞术结果表明随着TH006浓度的升高，荧光信号逐渐减少。利用流式细胞术检测表明随着TH006浓度升高，Tau蛋白的含量逐渐减少，结果如图5的A和C所示，表明TH006降解细胞中的Tau具有浓度依赖性。另外，将200μMTH006与过表达Tau-EGFP的N2a细胞共孵育不同的时间，结果表明随着孵育时间的延长，TH006诱导Tau蛋白降解的量逐渐增加，结果如图5的B和D所示，表明TH006降解细胞中的Tau具有时间依赖性。利用蛋白免疫印迹杂交实验(westernblot)，也证明TH006降解Tau蛋白具有浓度和时间依赖性，结果如图5的E和F以及图6所示。而突变了Tau结合序列和VHLE3泛素连接酶结合序列的对照肽(CP1,CP2,CP1和CP2的序列参照表1，突变位点下划线示出)不具有结合Tau蛋白或泛素连接酶的功能，并且不能降解Tau蛋白，结果如图5G所示，这表明同时存在Tau结合序列和VHLE3泛素连接酶识别序列是实验Tau蛋白降解的充分必要条件。

同时，发明构建了过表达Tau-EGFP的SH-SY5Y细胞(构建方法如实施例1所述)。将50μMTH006与该细胞共孵育18小时，通过蛋白免疫印迹杂交(WesternBlotting)实验表明TH006也能够降解SH-SY5Y细胞细胞中的Tau蛋白，结果如图5H所示。另外，从AD模型鼠(过表达Tau、APP、PS1的三转基因小鼠，简称“三转鼠”)新生鼠的海马组织内取出海马神经元细胞，将50μMTH006与该海马神经元细胞共孵育18小时，免疫印迹杂交(WesternBlotting)实验表明TH006也能够降解三转基因AD模型鼠海马神经元细胞中的Tau蛋白，结果如图5I所示。

实施例5TH006依赖VHLE3泛素连接酶的催化增加Tau蛋白的泛素化

发明人进一步证实TH006能否增加Tau蛋白的多聚泛素化，进而促进Tau蛋白的降解。蛋白酶体抑制剂MG132和自噬途径抑制剂BafilomycinA1是常用的阻止蛋白降解的两种抑制剂，并且MG132和自噬途径抑制剂BafilomycinA1能够抵抗TH006引起的Tau蛋白降解(结果如图4B所示)，在此用这两种抑制剂阻断Tau蛋白被降解，从而观察Tau蛋白的多聚泛素化水平。其中K48连接的多聚泛素化是促进蛋白降解的主要信号，因此检测TH006能否增加Tau蛋白的K48连接的多聚泛素化水平。将过表达Tau的细胞，与TH006共孵育24小时，在MG132和BafilomycinA1同时存在的情况下，可以检测到加入TH006，相对于没有TH006处理时，能诱导Tau蛋白发生更多的多聚泛素化修饰，结果如图5J所示。表明TH006是通过将Tau蛋白连接到VHLE3连接酶后，在细胞体系中，增加了Tau蛋白的多聚泛素化修饰，从而促进了Tau蛋白的降解。为了进一步证明TH006增加Tau蛋白的泛素化是通过VHLE3连接酶进行的，合成了突变了识别E3泛素连接酶的序列的对照肽CP2，将TH006和CP2与Flag标签进行连接，得到Flag-TH006和Flag-CP2(参照表1)，将这两种多肽分别与过表达Tau的细胞裂解液进行共孵育，通过免疫共沉淀耦联免疫印迹杂交(Immunoprecipitation-WesternBlotting)的方法表明TH006能够和VHLE3泛素连接酶相互作用，而对照肽则不能与VHL-E3连接酶相互作用，表明TH006通过VHL增加了Tau蛋白的多聚泛素化修饰，结果如图5L所示。

实施例6在Tau蛋白过表达的细胞中，TH006能够逆转线粒体的错误定位

发明人在过表达Tau蛋白的N2a细胞中发现，过表达Tau会导致线粒体的错位定位，由均匀分布在胞质中变成集中在细胞核外某一端，而且使神经细胞的突起减少，细胞形态发生改变。而当加入200μMTH006处理24小时后，发现TH006能够减少Tau蛋白的含量，并且恢复由于Tau过表达所导致的线粒体的错误定位，结果如图7所示。

实施例7TH006在AD小鼠模型中能够降低Aβ毒性和Tau蛋白的表达

发明人在本实施例中，通过实验发现，将10μMAβ42分别处理野生型N2a细胞以及过表达Tau蛋白的N2a细胞都能对细胞产生较大毒性，而当用Aβ42处理细胞的同时，加入75μMTH006处理24小时，则能够减少Aβ42产生的神经毒性，结果如图8的A和B所示。对于海马原代神经元细胞，3μMAβ42处理18h对神经元细胞产生较大毒性，而用15μMTH006同时处理时，则会减少Aβ42产生的神经毒性，结果如图8的C所示。利用MTT实验检测TH006对于野生型的N2a细胞具有较小的毒性，即使在浓度为200μM时，毒性也不是很大，结果如图8D所示。

发明人进一步通过鼻腔给药结合尾静脉注射的方法，对三转基因的AD模型鼠(B6；129-Psen1tm1MpmTg(APPSwe,TauP301L)1Lfa/Mmjax)进行TH006的给药。给药量按每千克小鼠给药量计为15mgkg^-1，共计10天，每天给2次。给药结束后，取给药模型鼠脑的皮质和海马组织匀浆进行检测，通过蛋白免疫印迹杂交实验表明TH006能够减少小鼠皮质中的Tau蛋白，结果如图8E所示。同时，取脑皮质和海马组织进行石蜡切片和免疫组化实验，结果表明在小鼠的皮质区，参见图9B，以及海马的CA3区域，参见图9A，Tau蛋白能够被TH006降解。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (16)

1.一种多肽，其特征在于，包括：

第一多肽片段，所述第一多肽片段特异性识别并结合Tau蛋白；

第二多肽片段，所述第二多肽片段特异性识别并结合泛素连接酶。

2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，进一步包括：连接肽。

3.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，进一步包括：穿膜肽。

4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述穿膜肽的氨基酸为D型。

5.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第一多肽片段具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：2所示的氨基酸序列。

6.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述第二多肽片段具有SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示的氨基酸序列，其中，所述SEQIDNO：3所示的氨基酸序列的第5位和第9位氨基酸被磷酸化。

7.根据权利要3所述的多肽，其特征在于，所述穿膜肽具有SEQIDNO：5或SEQIDNO：6所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述连接肽具有SEQIDNO：7或SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。

9.一种多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQIDNO:12或9、10、11所示的氨基酸序列，其中，所述SEQIDNO:9的第22位和第26位氨基酸被磷酸化，所述SEQIDNO:10的第22位和第26位氨基酸被磷酸化。

10.一种制备权利要求1～9任一项所述多肽的方法，其特征在于，

(1)使芴甲氧羰基-树脂进行活化反应，所述活化反应是通过使所述芴甲氧羰基-树脂与无水二氯甲烷进行接触实现的；

(2)使活化的芴甲氧羰基-树脂进行第一脱芴甲氧羰基反应，所述第一脱芴甲氧羰基反应是通过使所述活化的芴甲氧羰基-树脂与含有20体积％哌啶的二甲基甲酰胺进行接触实现的；

(3)使脱芴甲氧羰基的树脂与芴甲氧羰基-氨基酸进行缩合反应，所述缩合反应是在2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和N,N-二异丙基乙胺和二甲基甲酰胺的混合溶液中进行40min,

其中，所述树脂的负载量与所述芴甲氧羰基-氨基酸、所述2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、所述1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑和所述N,N-二异丙基乙胺的用量比为1:4:3.6:4:8；

(4)将缩合反应产物进行氨基封闭处理，继而进行第二脱芴甲氧羰基反应，所述氨基封闭处理是通过将所述缩合反应产物与乙酸酐、吡啶和二甲基甲酰胺的混合溶液进行接触实现的，所述乙酸酐、吡啶和二甲基甲酰胺的体积比是2：1：3；所述第二脱芴甲氧羰基反应是通过将所述缩合反应产物与含有20体积％哌啶的二甲基甲酰胺进行接触实现的；

(5)重复步骤(3)和(4)，以便获得连接有树脂的目的多肽；以及

(6)将所述连接有树脂的目的多肽进行切肽反应，以便获得目的多肽，所述切肽反应是通过将所述连接有树脂的目的多肽与三氟乙酸、纯水、苯甲硫醚、苯酚和乙二硫醇的混合溶液进行接触实现的，所述三氟乙酸、纯水、苯甲硫醚、苯酚和乙二硫醇的体积比为82.5：5：5：5：2.5，

任选地，进一步包括：对所述目的多肽进行分离纯化，

任选地，所述分离纯化是通过高效液相色谱进行的，所述高效液相色谱的条件是：

系统为Waters-600E多通道系统，

检测器为Waters-2487紫外检测器，

检测波长为215nm和254nm，

分离柱为C18半制备柱，所述柱子型号为DEVELOSILODS-UG-5，

洗脱液为乙腈和水的混合溶液，

流速为每分钟6毫升的流速，

任选地，进一步包括：利用电喷雾质谱或MALDI-TOF质谱鉴定高效液相色谱峰样品，基于质谱鉴定结果，确定并收集所述目标多肽。

11.权利要求1～9任一项所述多肽在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防tau分子病。

12.权利要求1～9任一项所述多肽的在逆转线粒体的错误定位、减少淀粉样β蛋白毒性或降低Tau蛋白含量中的用途。

13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗或预防tau分子病、逆转线粒体的错误定位、减少淀粉样β蛋白毒性或降低Tau蛋白含量，所述药物组合物含有：

权利要求1～9任一项所述多肽作为活性成份。

14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，进一步包括：

药学上可以接受的赋形剂或佐剂。

15.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物呈片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。

16.根据前面任一项所述的用途或药物组合物，其特征在于，权利要求1～9任一项所述多肽的作用浓度是0.1微摩尔/升～200微摩尔/升。