CN112675310A - Ri7217与麝香酮共修饰dtx长循环脂质体、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，包括如下步骤：步骤1：先对麝香酮环进行氨基化修饰，再将氨基化的麝香酮与二硬脂酰磷脂酰乙酰胺‑N‑羟基丁二酰亚胺‑聚乙二醇反应以合成制备二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑麝香酮。步骤2：以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑马来酰亚胺马来酞亚胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑麝香酮共聚物，蛋黄卵磷脂和胆固醇为材料，采用薄膜分散法制备脂质体，然后通过其表面马来酰亚胺基与巯基化的RI7217共价连接而制备RI7217‑LP和RI7217‑LP‑M。

Description

RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及医药领域，尤其涉及一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体、制备方法及应用。

背景技术

胶质瘤是最常见的颅内肿瘤之一。术后化疗可延长患者生存期、改善患者生存质量，是必不可少的一种治疗手段。但是由于血脑屏障(BBB)的存在，使得常规化疗药物难以通过BBB在脑内达到有效治疗浓度，为了克服血脑屏障的选择性限制，现有技术尝试了各种方法以增加药物的脑内递药。以通过受体介导脑靶向的微粒递药系统的研究最具优势。发明一种能增强药物的BBB透过率、并高效地靶向脑胶质瘤细胞的主动脑靶向递送系统，提高化疗药物进入脑内的药量，对脑胶质瘤的术后化疗具有重要的现实意义。

本发明成功构建了RI7217和麝香酮共修饰多烯紫杉醇长循环脂质体脑靶向递药系统，该脂质体在溶血毒性的考察，体现较高的体内安全性；在细胞水平和动物水平，体现出明确的对胶质瘤细胞的靶向作用，跨血脑屏障能力，肿瘤组织穿透能力；提高了细胞和肿瘤组织DTX的蓄积，进而提高了抗胶质瘤治疗效果。

发明内容

为此，本发明提供一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体、制备方法及应用用以克服现有技术中未能增强药物的BBB透过率、并高效地靶向脑胶质瘤细胞的主动脑靶向递送系统及提高化疗药物进入脑内的药量的问题。

为实现上述目的，本发明提供一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：先对麝香酮环进行氨基化修饰，再将氨基化的麝香酮与二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇反应以合成制备二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-麝香酮；

步骤2：以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺马来酞亚胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-麝香酮共聚物，蛋黄卵磷脂和胆固醇为材料，采用薄膜分散法制备脂质体，然后通过其表面马来酰亚胺基与巯基化的RI7217共价连接而制备RI7217-LP和RI7217-LP-M。

进一步地，所述步骤1中，对麝香酮环进行氨基化修饰包括如下步骤：

步骤101：在30分钟内向搅拌的麝香酮C1的500mL甲醇溶液中加入Br₂，并于室温下搅拌反应过夜，反应的混合物用300mL饱和Na₂S₂O₃稀释并用300mL 乙酸乙酯分三次萃取，合并有机物并用水为300ml，并用300ml盐水洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，通过用石油醚洗脱，硅胶层析纯化残余物，得到产物为黄色油状物C2，其中，C1为100g，0.42mol，Br₂为100g， 0.63mol；

步骤102：在30分钟内向搅拌的C2的500mL的DMSO溶液中滴加NaN₃的100mL水溶液，并于室温下搅拌反应过夜，反应的混合物用300mL饱和 NaHCO₃稀释并用300mL乙酸乙酯分三次萃取，合并有机物并用水为300ml，5 次，并用300ml盐水300mL洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，得到产物为黄色油状物C3，其中，C2为100g，0.3mol，NaN₃为59g，0.9mol；

步骤103：向搅拌的C3的300mL甲醇溶液中加入10g的Pd/C溶液，反应的混合物用H₂脱气三次并在H₂下室温搅拌反应过夜，采用LCMS监测反应完成后过滤，将滤液浓缩旋干，得到产物为黄色油状物，将粗产物溶于HCl/二恶烷4M，100mL中并在室温下搅拌过夜，过滤混合物，滤饼用乙酸乙酯100mL 洗涤，得到产物为黄色固体C4，其中，C3为70g，0.3mol；

步骤104：向搅拌的C4的100mL DCM溶液中加入Et₃N和(Boc)₂O，并于室温下搅拌反应过夜，反应的混合物用水为50mL，并用盐水50mL洗涤，用无水 Na₂SO₄干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，通过用石油醚：乙酸乙酯＝10：1洗脱，层析纯化残余物，得到产物，为黄色油状物C5，其中，C4为10g，0.04mol，Et₃N 为16g，0.16mol，(Boc)₂O为13g，0.06mol；

步骤105：将C5在HCl/二恶烷中的混合物在室温下搅拌过夜，将反应混合物浓缩旋干，并在室温下用50mL乙酸乙酯研磨5小时，过滤混合物，将滤饼浓缩旋干，得到白色固体氨基麝香酮C6，其中，C5为5g，0.014mol，HCl/二恶烷为4M，50mL。

进一步地，所述氨基化的麝香酮C6与DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS反应合成制备 DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone过程为：将白色固体C6，DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS和三乙胺以摩尔比3：2：4的处方量溶于混合溶液，混合溶液为氯仿:甲醇＝2：1，于磁力搅拌器上30℃反应过夜℃，反应的混合物用水50mL，50mL盐水洗涤，用无水 Na₂SO₄干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，通过用石油醚：乙酸乙酯＝10：1洗脱，层析纯化残余物，得到产物为黄色油状物为DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone。

进一步地，所述长循环脂质体的制备为：将处方量的EPC，Chol， DSPE-PEG₂₀₀₀，DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL，DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone，DTX，按摩尔比 100：20：5：2.5：0.25：3.33溶于适量氯仿中，置50mL圆底瓶中减压旋蒸10min 成膜，后置真空干燥箱中37℃干燥2h，加入5mLPBS缓冲液，于旋转蒸发仪中水化30min，探头超声3min制备得到含药长循环脂质体。

进一步地，将RI7217-SH与载药长循环脂质体按照RI7217-SH： DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL：EPC摩尔比为1：10：1000的比例在恒温振荡器避光反应在125r/min，25℃下4h，后置于冰箱4℃过夜，以pH7.4的0.01mol/LPBS洗脱过琼脂糖CL-4B凝胶柱，除去未连接的抗体，将洗脱后的脂质体置于4℃超滤浓缩得RI7217-LP。

进一步地，所述RI7217-LP的包封率EE和载药量DLC表示为：

其中，C为多西紫杉醇总药量(μg)，C₀为包封于脂质体中多西紫杉醇的浓度μg/mL)，n为稀释倍数，M为RI7217-LP-DTX的总重量。

进一步地，假设每个LP的RI7217缀合数目是基于100nm脂质体含有10⁵个磷脂分子，则平均每个LP上接有RI7217的数目：

n＝N/N₀

其中，n为平均每个LP上接有RI7217的数目，N为每毫升RI7217-LP和 RI7217-LP-M溶液中脂质体表面的RI7217分子数，N₀为每毫升脂质体溶液中脂质体的分子数。

进一步地，一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体包括作为靶向药物载体的长循环脂质体、包裹在长循环脂质体内的多西紫杉醇、在长循环脂质体表面用以穿过BBB的麝香酮、在长循环脂质体表面用以脑靶向配体的RI7217 单克隆抗体和转铁蛋白受体。

进一步地，所述DTX长循环脂质体的RI7217-LP及RI7217-LP-M的平均粒径小于等于200nm，Zeta电位小于等于-18mV，采用RI7217摩尔比为40:1， EPC:RI7217摩尔比为1000:1进行脂质体修饰。

进一步地，一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的应用，其特征在于，所述RI7217-LP-M双重靶向脂质体能够透过BBB，并能够透过脑胶质瘤屏障，用以对脑胶质瘤治疗药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明通过脑胶质瘤细胞对共修饰脂质体的摄取效率远高于麝香酮脂质体和RI7217脂质体。脂质体通过EPR效应到达肿瘤组织后，麝香酮修饰脂质体通过麝香酮芳香开窍作用进入血脑屏障， RI7217修饰脂质体则是通过转铁蛋白受体介导的方式入脑。将麝香酮和RI7217 共修饰能够起到协同作用，显著增加进入脑内药量。

进一步地，本发明通过将蛋白或抗体与脂质体相连，选用马来酰亚胺法将 RI7217与脂质体相连，通过将蛋白巯基化与马来酰亚胺反应而共价连接，该反应的反应条件温和，反应过程中不影响RI7217生物活性，并将抗体与脂质体在避光和N₂条件反应以提高抗体的连接效率。

进一步地，本发明通过采用薄膜分散法制备所得的脂质体粒径均小于200 nm，具有强渗透性，可渗透到脑肿瘤组织并蓄积达到治疗效果。通过对载药系统的包封率和载药量的研究，筛选出药脂比为1：30，包封率在90％以上的脂质体，由于脂质体的生物降解性和生物相容性好，在机体内很容易被网状内皮系统清除。本发明采用材料DSPE-PEG₂₀₀₀来延长体循环时间以达到长循环的目的。同时由于本发明所制备的脂质体本身带负电荷，再加上主动靶向配体RI7217的修饰，这使得脂质体在降低清除的同时降低了不良反应，进一步增加脑内用药，以便达到更好的治疗效果。

进一步地，本发明通过芳香中药的开窍作用和现代的受体靶向技术，首先进行载体材料的合成、靶向递药系统的制备和相关制剂学表征；其次利用胶质瘤细胞模型，脑血管内皮细胞模型研究体外摄取情况，并通过干预实验探讨其初步摄取机制；再次利用荧光标记及活体成像技术研究该靶向递药系统的整体动物脑靶向性；最后利用动物脑内胶质瘤模型评价该靶向递药系统体内抗胶质瘤效应，确定脂质体的传输路径，进一步增加脑内用药，确保了更好的治疗效果。

附图说明

图1为本发明实施例中功能性脂质体结构图；

图2为本发明实施例中构建麝香酮和RI7217修饰DTX的脑靶向示意图；

图3为本发明实施例中所述麝香酮的氨基化过程；

图4为本发明实施例中所述氨基麝香酮的质谱图；

图5为本发明实施例中所述氨基麝香酮的1H核磁共振谱谱图；

图6为本发明实施例中所述DSPE-PEG2000-Muscone的飞行质谱图；

图7为本发明实施例中所述DSPE-PEG2000-Muscone的1H核磁共振谱图；

图8为本发明实施例中所述RI7217紫外全波长扫描图；

图9为本发明实施例中所述多西紫杉醇的吸收曲线；

图10为本发明实施例中所述RI7217标准曲线；

图11为本发明实施例中所述多西紫杉醇的标准曲线；

图12为本发明实施例中所述脂质体粒径分布曲线图；

图13为本发明实施例中所述磷脂硫氰铁铵络合物吸收曲线；

图14为本发明实施例中所述磷脂的标准曲线；

图15为本发明实施例中所述血清白蛋白的标准曲线；

图16为本发明实施例中所述各组溶血实验结果；

图17为本发明实施例中所述不同制剂的红细胞凝集图片；

图18为本发明实施例中所述U87细胞24h存活率；

图19为本发明实施例中载香豆素6脂质体作用U87细胞4h的摄取情况；

图20为本发明实施例中所述在荧光显微镜下U87细胞摄取情况；

图21为本发明实施例中所述载香豆素6脂质体作用U87细胞的摄取机制；

图22为本发明实施例中载香豆素6脂质体作用脑血管内皮细胞4h摄取情况；

图23为本发明实施例中在荧光显微镜下脑血管内皮细胞的摄取情况；

图24为本发明实施例中裸鼠脑切片HE染色(20×)；

图25为本发明实施例中U87原位瘤建模8天鼠脑；

图26为本发明实施例中鼠体内实时成像；

图27为本发明实施例中24h裸鼠器官实时成像；

图28为本发明实施例中裸鼠的生存时间图；

图29为本发明实施例中裸鼠的体重图。

具体实施方式

为了使本发明的目的和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明作进一步描述；应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。

BBB：血脑屏障；RI7217：转铁蛋白受体单克隆抗体RI7217；TfR：转铁蛋白受体；M：麝香酮；DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-麝香酮；PEG-LP：长循环脂质体；M-LP：麝香酮修饰脂质体；RI7217-LP： RI7217修饰脂质体；RI7217-LP-M：麝香酮与RI7217共修饰脂质体；DTX：多西紫杉醇；PEG-LP-DTX：载多西紫杉醇长循环脂质体；M-LP-DTX：载多西紫杉醇麝香酮修饰脂质体；RI7217-LP-DTX：载多西紫杉醇RI7217修饰脂质体；RI7217-LP-M-DTX：载多西紫杉醇麝香酮与RI7217共修饰脂质体； PEG-LP-C6Coumarin-6：香豆素6标记长循环脂质体；M-LP-C6：香豆素6标记麝香酮修饰脂质体；RI7217-LP-C6：香豆素6标记RI7217修饰脂质体； RI7217-LP-M-C6：香豆素6标记麝香酮与RI7217共修饰脂质体；P-gp：P-糖蛋白；DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS：二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇； PBS：磷酸盐缓冲液；DTNB：5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)；EDTA：乙二胺四乙酸；Traut’s：2-亚氨基硫烷盐酸盐；EPC：蛋黄卵磷脂；Chol：胆固醇； DSPE-PEG₂₀₀₀：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇；DSPE-PEG₂₀₀₀-Mal：二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺；HLPC：高效液相色谱法；Triton X-100

：聚乙二醇辛基苯基醚；EE：包封率；DLC：载药量；MTT：噻唑蓝；DMEM： DMEM培养基；DMSO：二甲基亚砜；TEER：跨内皮细胞电阻。

本发明提供一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体、制备方法及应用。首先对载体材料进行合成、靶向递药系统的制备和相关制剂学表征；其次利用胶质瘤细胞模型，脑血管内皮细胞模型研究体外摄取情况，并通过干预实验确定其初步摄取机制；再次利用荧光标记及活体成像技术研究该靶向递药系统的整体动物脑靶向性；最后利用动物脑内胶质瘤模型评价该靶向递药系统体内抗胶质瘤效应。其中，所述RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，包括：

步骤1：制备DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone：先对麝香酮环进行氨基化修饰，再将氨基化的麝香酮与二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇 (DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS)反应以合成制备二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-麝香酮 (DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone)，DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone为配体修饰脂质体材料之一。

步骤2：以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺马来酞亚胺 (Mal-PEG₂₀₀₀-DSPE)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG₂₀₀₀)，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-麝香酮共聚物(DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone)，蛋黄卵磷脂(EPC)和胆固醇(Chol)为材料，采用薄膜分散法制备脂质体(LP)，然后通过其表面马来酰亚胺基与巯基化的RI7217共价连接而制备RI7217-LP和 RI7217-LP-M。

请参阅图1-2所示，所述RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体包括：作为靶向药物载体的长循环脂质体、包裹在长循环脂质体内的多西紫杉醇、在长循环脂质体表面用以穿过BBB的麝香酮、在长循环脂质体表面用以脑靶向配体的RI7217单克隆抗体和转铁蛋白受体。

请参阅图3所示：其表示为麝香酮的氨基化的过程，在所述步骤1中，对麝香酮环进行氨基化修饰包括如下步骤：步骤101：在30分钟内向搅拌的麝香酮 C1(100g，0.42mol)的甲醇(500mL)溶液中加入Br₂(100g，0.63mol)，并于室温下搅拌反应过夜。反应的混合物用饱和Na₂S₂O₃(300mL)稀释并用乙酸乙酯(300mL，三次)萃取。合并有机物并用水(300mL)，盐水(300mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液浓缩旋干。通过用石油醚洗脱，硅胶层析纯化残余物，得到产物，为黄色油状物C2。步骤102：在30分钟内向搅拌的C2 (100g，0.3mol)的DMSO(500mL)溶液中滴加NaN₃(59g，0.9mol)的水(100mL) 溶液。并于室温下搅拌反应过夜。反应的混合物用饱和NaHCO₃(300mL)稀释并用乙酸乙酯(300mL，三次)萃取。合并有机物并用水(300mL，5次)，盐水 (300mL)洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液浓缩旋干，得到产物，为黄色油状物C3。步骤103：向搅拌的C3(70g，0.3mol)的甲醇(300mL)溶液中加入Pd/C(10g)溶液。反应的混合物用H₂脱气三次并在H₂下室温搅拌反应过夜。采用LCMS监测反应完成后过滤。将滤液浓缩旋干，得到产物，为黄色油状物。将粗产物溶于HCl/二恶烷(4M，100mL)中并在室温下搅拌过夜。过滤混合物，滤饼用乙酸乙酯(100mL)洗涤，得到产物，为黄色固体C4。

步骤104：向搅拌的C4(10g，0.04mol)的DCM(100mL)溶液中加入Et₃N (16g，0.16mol)和(Boc)₂O(13g，0.06mol)，并于室温下搅拌反应过夜。反应的混合物用水(50mL)，盐水(50mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液浓缩旋干。通过用石油醚：乙酸乙酯＝10：1洗脱，层析纯化残余物，得到产物，为黄色油状物C5。步骤105：将C5(5g，0.014mol)在HCl/二恶烷(4M， 50mL)中的混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物浓缩旋干，并在室温下用乙酸乙酯(50mL)研磨5小时。过滤混合物，将滤饼浓缩旋干，得到白色固体氨基麝香酮C6。

请参阅图4-5所示，所述氨基麝香酮分子量是253.4，而LC MS 254.5[M⁺H]⁺，是正模式显示的分子量，可得所述化合物是目标化合物。通过¹H核磁共振谱对氨基麝香酮各官能团的归属解析如下位于0.95和1.05处的峰属于甲基峰(CH₃-)， 1.28处的峰属于大环上多个亚甲基峰(-CH₂-)，1.84和2.05处的峰属于与甲基相连接的次亚甲基峰(-CH-)，2.328和2.754处的峰属于环上羰基及环上甲基连接部分的亚甲基峰(-CH₂-)，4.102处的峰属于环上与氨基相连接的次甲基峰 (-CH-)甲基峰，8.37和8.48处的峰属于部分的氨基质子峰，证实合成反应过程中麝香酮氨基的结构已经接上。

具体而言，本发明实施例中，所述步骤1中，将所述氨基化的麝香酮C6与 DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS反应合成制备DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone的制备工艺为：将白色固体C6，DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS和三乙胺以摩尔比3：2：4的处方量溶于混合溶液 (氯仿:甲醇＝2：1)，于磁力搅拌器上30℃反应过夜。反应的混合物用水(50mL)，盐水(50mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤。将滤液浓缩旋干。通过用石油醚：乙酸乙酯＝10：1洗脱，层析纯化残余物，得到产物为黄色油状物为 DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone。

请参阅图6-7所示，所述DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone总的分子量是3005，DSPE 的分子量是748.07，DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone的飞行质谱图中DSPE片段被打掉，其分子量为2257。而¹H核磁共振图谱显示原本存在的氨基质子峰消失，说明键合反应发生，目标产物生成。通过¹H核磁共振谱对DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone各官能团的归属解析为位于0.86和0.90处的峰属于甲基峰(CH3-)，1.20～1.34处的峰属于此化合物上多个亚甲基峰(-CH2-)，3.46处的峰属于PEG₂₀₀₀部分的亚甲基峰(-CH2-0-)，结合飞行质谱证实麝香酮分子连接到DSPE-PEG₂₀₀₀上。

具体而言，本发明实施例中，所述步骤2中，首先制备溶液，其中，pH 7.0 和pH 7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液制备如下：溶液A：将1.56g NaH₂PO₄·2H₂O 溶解于50mL超纯水得到0.2mol/LNaH₂PO₄溶液。溶液B：将7.16g Na₂HPO₄·12H₂O溶解于100mL超纯水得0.2mol/LNa₂HPO₄溶液。将11.875mL 溶液A与50.625mL溶液B混匀，加超纯水至500mL可得pH 7.4的0.01mol/L PBS；将23.75mL溶液A与38.75mL溶液B混匀，加超纯水至500mL可得pH 7.4的0.01mol/L PBS。

具体而言，本发明实施例中，精密称取1.56mg Traut′s reagent同样以100mL PBS(0.01M，pH 7.0)缓冲液溶解成浓度15.6ug/mL的溶液为Traut′s试剂。

具体而言，本发明实施例中，称取0.0396g DTNB，加pH 7.0的0.01mol/L PBS溶解并定容至10mL即得，4℃冰箱避光保存。其中，精密称取0.6070g溶于超纯水至50ml，用浓HCl调pH至8.0可得pH＝8.0的0.1M Tris-HCl缓冲液；准确称取0.0032g N-乙酰半胱氨酸，加超纯水溶解，定容至10mL可得2mM N- 乙酰半胱氨酸标准溶液；精密称取0.1796g Na2HPO4·12H2O加超纯水溶解，定容至10ml，用浓HCl调pH至7即得pH 7.0的50mM Na2HPO4溶液；准确称取 0.0082gDTNB溶于pH7.0的50m的Na2HPO4配制成10ml溶液可得2mM的 DTNB标准溶液，存放于棕色瓶中，于暗处低温保存备用。

具体而言，本发明实施例中，精密称取0.0074g EDTA-2Na·2H₂O加超纯水溶解，定容至200ml即得0.1mM的EDTA缓冲液；精密称取0.0074g NaB₄O₇·10H₂O溶解于0.1mM的EDTA缓冲液定容至25ml即得pH 8.5的0.15 mol/L的硼酸钠/0.1mmol/L的EDTA缓冲液。

具体而言，本发明实施例中，准确称取10mg考马斯亮兰G-250溶于5ml 的95％乙醇溶液中，与10ml 85％磷酸(W/V)混合，加水至100ml，过滤所得试剂各组分为：0.01％(W/V)考马斯亮蓝G-250，4.7％(W/V)乙醇，8.5％(W/V) H₃PO₄。

具体而言，本发明实施例中，所述脂质体通过脂质体药脂比筛选的方式制备，采用薄膜分散法。将处方量的EPC，Chol，DTX(药脂比分别为1:15，1:20，1:25，1:30，1:40)溶于适量氯仿中，置250mL圆底瓶中减压旋蒸10min成膜(120r/min)，后置真空干燥箱中37℃干燥2h。加入5mL PBS缓冲液(pH7.4，0.01M)，于旋转蒸发仪中水化30min(37℃，90r/min)，探头超声(180W)3min制备得到含药普通脂质体。

具体而言，本发明实施例中，所述长循环脂质体的制备为：将处方量的EPC， Chol，DSPE-PEG₂₀₀₀，DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL，DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone，DTX，按摩尔比100：20：5：2.5：0.25：3.33溶于适量氯仿中，置50mL圆底瓶中减压旋蒸10min成膜(120r/min)，后置真空干燥箱中37℃干燥2h。加入5mL PBS缓冲液(pH7.4，0.01M)，于旋转蒸发仪中水化30min(37℃，90r/min)，探头超声 (180W)3min制备得到含药长循环脂质体。其中，空白脂质体不加药。

具体而言，本发明实施例中，所述RI7217-LP的制备如下：首先，用移液枪量取RI7217原液(0.5mg/ml)，用PBS(pH 7.0，0.01M)稀释至2ml，以PBS(pH 7.0，0.01M)为参比液在190-800nm波长范围内紫外全波长扫描。其次，将扫描完的RI7217溶液精密量取1.5ml用PBS(pH 7.0，0.01M)稀释至2ml测吸光度，后采用相同的方法逐步稀释RI7217，测A₁₉₇值绘制标准曲线。然后，精密量取 0.5ml的RI7217溶液，溶于1mL 0.15mol/L的硼酸钠/0.1mmol/L的EDTA缓冲液(pH 8.5)，加Traut’s试剂(RI7217：Traut′s试剂摩尔比为1：40)，充氮、避光、在微型振荡器中反应(125r/min，25℃)2h，过葡聚糖G-50凝胶柱，以pH 7.0的 0.01mol/LPBS为洗脱液洗脱除去过量的Traut’s试剂，于紫外分光光度计测A₁₉₇收集抗体组分,得RI7217-SH。将洗脱后的RI7217-SH的A₁₉₇值代入RI7217标准曲线方程，计算RI7217收集量。最后，将RI7217-SH与载药长循环脂质体按照 RI7217-SH：DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL：EPC摩尔比为1：10：1000的比例在恒温振荡器避光反应(125r/min，25℃)4h，后置于冰箱4℃过夜。以pH7.4的0.01 mol/LPBS洗脱过琼脂糖CL-4B凝胶柱，除去未连接的抗体。将洗脱后的脂质体置于4℃超滤浓缩(截留分子量：10kD)得RI7217-LP。

请参阅图8-9所示，精密称取多西紫杉醇10.2mg于10mL容量瓶中，用无水甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得1.02mg/mL的多西紫杉醇贮备液，以无水甲醇为背景在200-400nm波长范围内紫外全波长扫描。RI7217在190-800nm 波长范围内紫外全波长扫描。结果显示，RI7217在197nm有最大吸收峰，因此，确定RI7217测定波长为197nm。多西紫杉醇在190-800nm波长范围内紫外全波长扫描。结果显示，多西紫杉醇在218nm有最大吸收峰，因此，确定多西紫杉醇测定波长为218nm。

请参阅图10所示，精密量取1.02mg/mL多西紫杉醇贮备液0.2，0.4，0.6， 0.8，1.0，2.0mL分别于10mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀，得到浓度分别为20.4，40.8，61.2，81.6，102，204μg/mL的多西紫杉醇溶液,经微孔滤膜(0.22μm)过滤后分别进样20μL，以峰面积对质量浓度进行线性回归。紫外分光光度法测定RI7217浓度的标准曲线为:A＝0.4585c-0.0089，R²＝0.9994，其中A为紫外吸光度，C为巯基浓度(mmol/L)，线性范围0-0.8mmol/L，在此范围内线性关系良好。

请参阅图11所示，紫外分光光度法测定RI7217浓度的标准曲线为:A＝12770 c-19700，R²＝0.9997，其中A为峰面积，C为多西紫杉醇浓度(μg/ml)，线性范围0-204μg/ml，在此范围内线性关系良好。

请参阅图12所示，通过采用粒度/电位分析仪测定载多西紫杉醇的PEG-LP、RI7217-LP、M-LP和RI7217-LP-M光散射粒径及Zeta电位。同时对PEG-LP、 RI7217-LP、M-LP和RI7217-LP-M经2％(W/V，pH7.0)磷钨酸负染色后，透射电镜下观察形态。经过麝香酮修饰的脂质体在接RI7217后粒径粒径明显增加 20nm。但经麝香酮修饰的脂质体接RI7217后其粒径未发生明显改变，均在120 nm左右。多分散性(polydispersity，PDI)<0.3，脂质体经RI7217修饰后电位出现明显变化，但均小于-18mV，脂质体粒径和电位结果见表1。

表1系列脂质体粒径和电位(n＝3，

)

取PEG-LP-DTX、M-LP-DTX、RI7217-LP-DTX和RI7217-LP-M-DTX溶液各200μL，加入甲醇至1ml，超声破乳，过微孔滤膜(0.22μm)进液相小瓶备用。采用透析法分离游离多西紫杉醇。量取制备好的RI7217-LP溶液1mL于透析袋中，放入PBS(pH 7.4,0.01M)中透析8h。根据“2.2.3.1.3方法”处理样品，将测得的峰面积代入标准曲线，计算得到的浓度代入下式计算RI7217-LP的包封率(Entrapping efficiency，EE)和载药量(Drug loading capacity，DLC)。

其中，C为多西紫杉醇总药量(μg)，C₀为包封于脂质体中多西紫杉醇的浓度μg/mL)，n为稀释倍数，M为RI7217-LP-DTX的总重量(mg)。不同药脂比所制得脂质体的包封率和载药量见表2，其中，药脂比为1:30时包封率和载药量均最高，分别为91.07％，2.29％。

表2脂质体药脂比筛选

Drug lipid ratio	EE(％)	DLC(％)
			1:15	51.96	1.93
1:20	52.63	1.83
			1:30	91.07	2.29
1:40	73.2	1.25

具体而言，本发明实施例中，所述长循环脂质体的包封率可达87.6％，载药量为2.06％，但连接抗体RI7217后包封率和载药量均显著降低，不同脂质体的包封率和载药量结果见表3。

表3不同脂质体的包封率和载药量

Sample	EE(％)	DLC(％)
			PEG-LP	87.56	2.06
M-LP	73.80	1.73
			RI7217-LP	68.33	1.61
RI7217-LP-M	65.37	1.53

请参阅图13所示，采用硫氰铁铵法对脂质体磷脂浓度进行测定：首先，制作显色剂：准确称取六水合三氯化铁2.70g、硫氰酸铵3.04g，置于100mL容量瓶中，加超纯水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成显色剂。其次，进行全波长扫描：精密称取卵磷脂5mg，置于10mL容量瓶中，氯仿溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.5mg·mL^-1的卵磷脂标准溶液，精密吸取1mL，置于试管中，加硫氰铵溶液5.0mL，再补加氯仿，使试管中氯仿的最终体积为5.0mL。旋涡振荡混匀1min，静置20min，小心移去上层液，取下层，以氯仿为空白，于300～ 700nm波长内进行扫描。然后，绘制标准曲线：精密吸取0.5mg/ml的卵磷脂标准溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6ml，加硫氰铁铵溶液5.0ml，加氯仿至其最终体积为5ml。旋涡振荡混匀5min，静置5min，小心移去上层液，取下层，以氯仿为空白，在最大吸收波长处(λ＝472nm)测定吸光度(A)。最后，样品测定：取400μL PEG-LP溶液(与RI7217-LP浓度相同)，加同体积无水乙醇超声破乳后加800μL氯仿溶解，加硫氰铁铵溶液5.0ml，加氯仿至其最终体积为5ml。旋涡振荡混匀1min，静置20min，小心移去上层液，取下层，以氯仿为空白吸光度A₄₇₂。根据磷脂硫氰铁铵络合物氯仿溶液在300-700nm波长范围内紫外全波长扫描的结果可得，硫氰铁铵在472nm有最大吸收峰，因此，确定硫氰铁铵测定波长为472nm。

请参阅图14-15所示，对脂质体RI7217浓度的测定：首先，Bradford法测定脂质体RI7217的浓度：采用BSA制备标准曲线，标准溶液一系列不同浓度分别为0，10，25，50，75，100μg/mL。精密吸取50μL标准品溶液于96孔板中，补加200μL考马斯亮蓝染色液，37℃震荡10min混匀反应完全后用酶标仪测定 A₅₉₅。其次，精密吸取RI7217-LP和RI7217-LP-M溶液各50μL于96孔板中，采用标准曲线制备方法，用酶标仪测定A₅₉₅。扣除PEG-LP的A₅₉₅背景吸收，代入回归方程计算RI7217的浓度。

假设每个LP的RI7217缀合数目是基于100nm脂质体含有10⁵个磷脂分子，则平均每个LP上接有RI7217的数目：

n＝N/N₀

其中，n为平均每个LP上接有RI7217的数目，N为每毫升RI7217-LP和 RI7217-LP-M溶液中脂质体表面的RI7217分子数，N₀为每毫升脂质体溶液中脂质体的分子数。磷脂硫氰铁铵络合物线性回归方程为：A＝10.674c+0.0125(R²＝ 0.9956)。根据粒径为100nm的脂质体，每个脂质体分子含100000个磷脂分子的假设计算出每1ml脂质体制剂含有的磷脂分子数从计算出脂质体分子数。而 Bradford法以血清白蛋白为标准品，其线性回归方程为：A＝0.004c+0.1552(R²＝0.9981)，浓度范围为0-100μg/ml。将测定RI7217-LP表面的RI7217的吸光度之代入标准曲线中，求得其浓度计算出每1ml脂质体的RI7217分子数N，与磷脂浓度曲线所测每1ml脂质体的脂质体分子数N₀，可得RI7217平均每个脂质体分子连接30个RI7217，根据制备脂质体RI7217投入量算得RI7217连接效率 52.68％。

具体而言，本发明实施例中，2％红细胞混悬液的配制为：正常家兔饲养3d 后，颈总动脉取血取20mL，用缠有脱脂棉的木棒不断搅动血液，除去纤维蛋白原，使之成为脱纤血液。加入0.9％生理盐水约10倍量，摇匀，1000～1500r·min^-1离心15min，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9％生理盐水洗涤2～3次至上清不呈红色为止。将所得红细胞用0.9％氯化钠溶液配成2％的红细胞混悬液(2 ml红细胞用0.9％生理盐水稀释至100ml)，4℃冰箱保存备用。其中，将100μL 血细胞悬液和100μL的PBS分别与20μL的PBS(阴性对照)、1％TritonX-100 (阳性对照)以及不同的脂质体，置于2ml Epp管中混合(每组3个副孔)，在37℃水浴孵育3h。将混悬液于12000r·min^-1离心去除完整的血红细胞，取上清加入 96孔板，酶标仪测定550nm处吸光度值。将100μL 2％的红细胞悬液和100μL 的PBS以分别与20μL的PBS(阴性对照)、1％Triton X-100(阳性对照)以及不同的脂质体混合，于37℃水浴孵育30min后，各取20μL样品置于载玻片上，分别在显微镜下观察，拍照记录。其中PBS均为PH 7.4(0.1mol/ml)，具体结果见表4。

表4溶血试验结果

请参阅图16所示，通过知阳性对照组出现溶血现象，其他组溶液澄清无色透明，均无溶血现象。其中，溶血判断标准见表5。

表5溶血试验判断标准

级别	外观描述
		全溶血	溶液澄明、红色，底部无细胞残留，用(+)表示
部分溶血	溶液澄明、红色或棕色，底部有少量红细胞残留，用(±)表示
		不溶血	红细胞全部下沉，上层液体无色透明，用(-)表示
凝集	红细胞凝集成块，振摇后不能分散

所述PEG-LP、PEG-LP-M、RI7217-LP和RI7217-LP-M组中均无溶血现象和凝集反应，试验结果见表6。

表6各组脂质体注射液体外溶血试验结果

组别	溶血率(％)	目测法
			PEG-LP	8.0	-
M-LP	6.1	-
			RI7217-LP	10.7	-
RI7217-LP-M	9.95	-

请参阅图17所示，其为不同脂质体与血红细胞孵育后的形态。其中，A表示PBS，B表示PEG-LP，C表示RI-LP，D表示RI-LP-Mu各组与对照组PBS 相比，均没有引起凝集也没有发生细胞异形。

具体而言，本发明实施例中，通过采用薄膜分散发制备了RI7217和麝香酮共修饰脑靶向脂质体载药系统。以包封率和载药量为指标，进行药脂比考察，得出最优药脂比为1：30。最终所制得的RI7217-LP及RI7217-LP-M的平均粒径小于等于200nm，Zeta电位小于等于-18mV。采用Traut′s试剂:RI7217摩尔比为 40:1，EPC:RI7217摩尔比为1000:1进行脂质体修饰，Bradford法测得每个 RI7217-LP分子表面连接的RI7217约为30个。体外溶血实验结果表明，PEG-LP、 M-LP、RI7217-LP和RI7217-LP-M组均未出现溶血和凝集现象，溶血率满足静脉注射的要求。

RI7217与麝香酮共修饰的长循环脂质体的体外评论实验：U87细胞的培养，首先经过细胞复苏：从液氮罐中取出含有细胞的冻存管快速放入37℃水浴中迅速解冻，直至冻存液完全融化。取出冻存管，酒精消毒瓶盖后打开，吸出细胞液转移到事先装有5mL DMEM培养液的离心管中，用吸管轻轻吹打3-5次，使细胞与培养液混匀。1000r/min离心5min，吸弃上清液并加入1mL培养液，细胞沉淀经培液吹打分散后转入装有5mL含有10％胎牛血清的DMEM培养液的培养瓶中，并置于CO2培养箱，在5％CO2，37℃条件下培养，每两天更换一次培养液。其次细胞传代：细胞密度达到70～80％时进行传代。用吸管吸弃旧的培养液，加入PBS清洗两次，滴加3～5滴0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA混合消化液 (25T-1ml)，不停地轻轻摇晃培养瓶，使消化液与细胞充分接触，消化2min后可见瓶底细胞脱落(显微镜下观察，当细胞质回缩、细胞间隙增大，且细胞的形态变圆形时将胰酶吸出)，加入适量含有10％胎牛血清的新鲜DMEM培养液终止消化反应，并用吸管轻轻吹打使细胞均匀分散。将细胞悬液转移至离心管中，1000 r/min离心5min，吸弃上清液并加入1mL培养液，细胞沉淀经培养液吹打分散后转移适量体积至装有新鲜培养液的培养瓶中，摇匀后放入培养箱中培养。如此传代培养三次后U87细胞活力恢复，方可用于后续的毒性实验和摄取实验。最后细胞冻存：标记细胞名称和冻存时间。冻存液，血清：DMEM:DMSO＝7:2:1；冻存程序:-20℃，2h；-80℃过夜后，次晨投入液氮中。

多西紫杉醇对体外U87细胞的细胞毒性：活细胞线粒体中存在的琉拍酸脱氢酶可以使外源性的MTT还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲攒沉积在细胞中，而死细胞不具有此功能。二甲基亚飒可以溶解沉积在活细胞中的甲瓒结晶，通过酶标仪在490nm波长处测定其吸光度值，从而间接反映出活细胞的数量。一定细胞数内，甲攒结晶量与细胞数成正比。采用MTT法测定各组脂质体对U87细胞的IC₅₀值，比较它们对胶质瘤的抑制效果。U87细胞以10⁴/孔的密度接种于96 孔板，每组三个副孔，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时(24h-80％， 48＜70％，72h＜50％)。弃去培养液，DMEM孵育15min后弃去，分别加入含一系列浓度10，20，40，50，70μg/ml的RI7217-LP-DTX，RI7217-LP-M-DTX， PEG-LP-DTX和游离DTX溶液的10％胎牛血清-DMEM培养液200μL，设定空白孔(不接种细胞，仅加培养基)、对照孔(以等体积生理盐水替代DTX溶液，其他操作相同)以及空白脂质体组(加入与RI7217-LP-DTX，PEG-LP-DTX， RI7217-LP-M-DTX组磷脂浓度相同的不含DTX药物的空白脂质体)，37℃分别连续培养24h，48h，72h后。去除培养基，用Hank′s平衡盐溶液孵育15min 后吸去，每孔加入150uL MTT溶液(0.5mg/ml，避光)，37℃孵育4h。弃去上清液，每孔加入100μL DMSO溶液，37℃避光震荡15min溶解甲瓒晶体，用酶标仪在490nm处测定各孔的OD值，绘制细胞存活率曲线，并用IC₅₀计算出各组的IC₅₀值^[1,2]。(96孔板最外围一圈加100-150uL的PBS防止边缘效应)。

请参阅图18所示，通过使用MTT法测定细胞的存活率，显示了U87细胞与各种浓度的游离DTX温育24h后的U87细胞的活力。对体外U87细胞对LP 的细胞摄取：定量：取常规培养的U87细胞接种96孔板中(10⁴/孔)，每孔100L，在5％CO₂，37℃条件下培养培养24h(完全贴壁，且处于对数生长期)，分别将含有游离C6，PEG-LP-C6，M-LP-C6，RI7217-LP-C6，RI7217-LP-M-C6 RI7217-LP-C6+M溶液(麝香酮0.4μg/mL)完全培养液替换96孔板中培液(每组设5个副孔)，37℃孵育4h。PBS冲洗细胞3次，加100L的1％TritonX-100 裂解细胞，4℃避光裂解0.5h以上。待裂解完全后，用荧光酶标仪(Ex＝466nm， Em＝504nm)测定荧光强度。定性：U87细胞以10⁴/孔的密度接种于盖玻片上，于24孔板中，在5％CO₂，37℃条件下培养培养24h(完全贴壁，且处于对数生长期)，细胞用Hank’s孵育15min后分别将含有有游离C6，PEG-LP-C6，M-LP-C6，RI7217-LP-C6，RI7217-LP-M-C6 RI7217-LP-C6+M溶液(麝香酮0.4 μg/mL)加入培液中，37℃孵育4h。加4％多聚甲醛固定15min，弃去多聚甲醛，加PBS漂洗3次，细胞用0.5％TritonX-100的PBS透化5分钟，加PBS漂洗3次，然加200μL的80nM鬼笔环肽溶液避光室温孵育30min，加PBS漂洗 3次，然后加200μL的5μg/ml的Hoechst33342避光室温孵育5min，PBS冲洗 3次，封片。采用反相共焦激光扫描显微镜，以评估LIP的细胞摄取。机制：将 u87细胞以10⁴/孔种板，待细胞贴壁将不同抑制剂与不同的抑制剂阿米洛利 (15μg/mL)，氯丙嗪(10μg/mL)，菲律平(5μg/mL)，秋水仙碱(5μg/mL) 在37℃预温育30min。然后弃去含有抑制剂的培养基，并且将载香豆素6的 RI7217-LP-C6和RI7217-LP-M-C6的培养基孵育4小时。用PBS冲洗细胞3次，加100μL的1％TritonX-100裂解细胞，4℃避光裂解0.5h以上。待裂解完全后，用荧光酶标仪(Ex＝466nm，Em＝504nm)测定荧光强度。

请参阅图19所示，其为相同浓度香豆素6不同类型的脂质体作用于U87细胞4h后被摄取的情况，其中PEG-LP-C6和M-LP-C6被U87细胞摄取作用相当，这表明麝香酮单独修饰脂质体对U87细胞摄取无明显增加。经RI7217修饰后， U87细胞摄取RI7217-LP-C6效率是PEG-LP-C6的1.7倍，M-LP-C6的1.6倍这表明仅RI7217修饰的脂质体能够明显增加U87细胞摄取量，而且增加摄取的效果比麝香酮单独修饰要显著。在麝香酮与RI7217联合作用后，U87细胞摄取 RI7217-LP-M-C6效率是RI7217-LP-C6的2.2倍，RI7217-LP-C6+M效率是 RI7217-LP-C6的2倍，RI7217-LP-M-C6摄取效率稍高于RI7217-LP-C6+M，这表明麝香酮与RI7217合用比任意一者单独使用的摄取效果都明显，处于游离状态的麝香酮加强摄取效果稍弱于修饰于脂质体的麝香酮。对于体外hCMEC/D3 细胞对LP的细胞摄取：定量：取常规培养的hCMEC/D3细胞接种96孔板(10⁴ /孔)，每孔100μL，在5％CO₂，37℃条件下培养培养24h(完全贴壁，且处于对数生长期)，分别将含有有游离C6，PEG-LP-C6，M-LP-C6，RI7217-LP-C6，RI7217-LP-M-C6 RI7217-LP-C6+M溶液(麝香酮浓度0.4μg/mL，香豆素6浓度为10μM)完全培养液替换96孔板中培液(每组设5个副孔)，37℃孵育4h。 PBS洗细胞3次，加100μL的1％TritonX-100裂解细胞，4℃避光裂解0.5h 以上。待裂解完全后，用荧光酶标仪(Ex＝466nm，Em＝504nm)测定荧光强度。定性：hCMEC/D3细胞以10⁴/孔的密度接种于盖玻片上，于24孔板中，在 5％CO₂，37℃条件下培养培养24h(完全贴壁，且处于对数生长期)，细胞用 Hank’s孵育15min后分别将含有RI7217-LP-C6，PEG-LP-C6和游离C6溶液加入培液中，37℃孵育4h。加4％多聚甲醛固定15min，弃去多聚甲醛，加PBS 漂洗3次，细胞用0.5％TritonX-100的PBS透化5min，加PBS漂洗3次，然加200μL的80nM鬼笔环肽溶液避光室温孵育30min，加PBS漂洗3次，然后加200μL的5μg/ml的Hoechst33342避光室温孵育5min，PBS冲洗3次，封片。采用反相共焦激光扫描显微镜，以评估LP的细胞摄取及初步摄取机制。

请参阅图20所示，为考察PEG-LP-C6、RI7217-LP-C6以及RI7217-LP-M-C6 对U87细胞的摄取情况，在37℃时，香豆素-6脂质体作用U87细胞4h后，U87 细胞对不同脂质体的摄取情况是有明显差别。在荧光显微镜观察下：PEG-LP-C6 组，可见微弱荧光，表明U87细胞对PEG-LP-C6摄取较少；RI7217-LP-C6组， U87细胞内荧光明显强于PEG-LP-C6组，表明RI7217-LP-C6可增加U87细胞的摄取；RI7217-LP-M-C6组，U87细胞内荧光又明显强于RI7217-LP-C6组，表明 RI7217-LP-M-C6与RI7217-LP-C6相比，能够更进一步增加U87细胞的摄取。

请参阅图21所示，机制：内吞作用的不同抑制剂预孵育后，U87细胞摄取 RI7217-LP-M-C6的量均有所下降。网格蛋白抑制剂氯丙嗪摄取量下降26.75％； Na⁺/H⁺交换体抑制剂阿米洛利摄取量下降19.43％；肌动蛋白聚合抑制剂秋水仙碱摄取量下降23.58％；小窝蛋白抑制剂菲律平摄取量下降30.34％。

请参阅图22所示，其相同浓度香豆素6不同类型的脂质体作用于hCMEC/D3 细胞4h后被摄取的情况，其中PEG-LP-C6和M-LP-C6被hCMEC/D3细胞摄取作用相当，这表明麝香酮单独修饰脂质体对hCMEC/D3细胞摄取无明显增加。经RI7217修饰后，hCMEC/D3细胞摄取RI7217-LP-C6效率明显增加， RI7217-LP+M-C6摄取效率高于RI7217-LP-C6，RI7217-LP-M-C6摄取效率低于 RI7217-LP-C6。

请参阅图23所示，考察长循环脂质体(PEG-LP)、RI7217修饰的长循环脂质体(RI7217-LP)以及RI7217和麝香酮双重修饰的长循环脂质体(RI7217-LP+M) 对脑血管内皮细胞的摄取情况，在37℃时脑血管内皮细胞对不同长循环脂质体的摄取情况是明显不同的。当加入PEG-LP-C6时，在荧光显微镜下可见较微弱的荧光，表明细胞摄取较少。而在加入RI7217-LP-C6后，细胞内呈现较强的荧光，显示RI7217-LP-C6可增加细胞摄取；含香豆素的RI7217-LP+M-C6荧光显微镜下呈现清晰且最强的黄绿荧光，显示RI7217-LP+M-C6能明显增加脑血管内皮细胞的摄取。这表明不同靶向递送系统对hCMEC/D3和U87细胞的摄取效果不同，处于游离状态的麝香酮和RI7217-LP共同作用对hCMEC/D3细胞的摄取效果最强。

具体而言，本发明实施例中，通过采用脑内纹状体定位注射细胞的方法建立裸鼠脑胶质瘤模型，利用小动物在体荧光成像系统观察抗体修饰脂质体制剂在荷瘤裸鼠大脑内的分布，设计多次给药方案从荷瘤裸鼠生存率、胶质瘤凋亡情况、肿瘤体积变化等多方面指标评价配体修饰的脂质体在荷脑胶质瘤模型裸鼠上的靶向性及药效。通过BALB/c裸鼠体内U87-MG原位脑胶质瘤模型的建立，首先进行细胞培养，U87细胞培养在含10％FBS、1％青-链霉素的DMEM培养基中。细胞复苏后置于37℃、5％CO₂(相对湿度90％)培养箱中培养，每2-3天更换一次培养液。取对数生长期的细胞接种于培养瓶中，生长至80-90％融合度时传代或铺板，进行后续细胞实验。在细胞处于对数生长期约80％覆盖培养瓶时，以 0.25％胰酶-EDTA消化，离心(1000rpm，5min)，弃上清，用Hanks液调成浓度为4×105/5μL的单细胞悬液(计数)，置于37℃恒温摇床中备用(苔盼蓝排斥实验检测细胞活力﹥95％)。其次，建立裸鼠原位脑胶质瘤模型：取裸小鼠，用10％水合氯醛，0.06ml/只,麻醉后定于脑立体定位仪上，常规消毒(75％酒精)后于额部中线处纵向头皮切开1cm，在前囟位置，矢状缝右侧2mm处用圆头牙钻钻孔，深达硬脑膜表面(内眦连线与头部矢状中线交汇处纵向1cm长头皮切口，分离暴露颅骨，于前囟右侧1.8mm处颅骨钻孔。)，再用微量注射器垂直进针穿刺脑膜和脑组织，进针3mm(在右侧尾状核附近)，注射速度1μL/min,共注射细胞悬液5μL(1×10⁴个/μL)。注射完后，留针5min缓慢拔出针管^[3]。酒精擦拭手术野，并以骨蜡封住脑膜处手术口，可降解缝合线缝合切口后消毒皮肤。术后定期观察裸小鼠状态。然后，对肿瘤标本的组织病理学检查：在接种细胞后10天任意挑选3只裸小鼠，生理盐水、4％多聚甲醛心内灌流固定后取全脑，观察肿瘤生长情况，分别在组织水平和细胞水平上进行病理学方面的验证。其中，病理解剖学检查包括肉眼观察肿瘤的形状、边界、颜色、血管生长等情况；组织病理学检查包括将全脑做适当修剪后，分别在4％多聚甲酸、15％蔗糖、30％蔗糖浸泡24h，O.C.T包埋后冰冻切片15μm进行H&E染色，在光镜下观察染色切片。最后，进行RI7217与麝香酮共修饰载DiR长循环脂质体的制备：采用薄膜分散法制备脂质体。将处方量的EPC，Chol，DSPE-PEG₂₀₀₀，DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL， DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone，DiR(按摩尔比160：32：8：2：0.2：5)溶于适量氯仿中，置50mL圆底瓶中减压旋蒸10min成膜后(100r/min)，后置真空干燥箱中37℃干燥2h。加入5mL PBS缓冲液(pH7.4，0.01M)，于旋转蒸发仪中水化 30min(37℃，转速5档)，探头超声(180W，3秒停1秒)3min制备得到含药长循环脂质体。将洗脱后的RI7217-SH与5ml载DiR长循环脂质体在恒温振荡器避光反应(125r/min，25℃)4h，后置于冰箱4℃过夜。以pH 7.4的0.01mol/LPBS 洗脱过琼脂糖CL-4B凝胶柱，除去未连接的抗体。将洗脱后的脂质体置于4℃超滤浓缩。

具体而言，本发明实施例中，活体成像：Balb/c裸鼠原位脑胶质瘤模型建立8天后，尾静脉分别注射DiR标记的PEG-LP，RI7217-LP，RI7217-LP-M， RI7217-LP+M(灌胃)四组制剂，注射剂量为含20μg DiR制剂，200uL/只。裸鼠异氟烷吸入麻醉，于给予制剂后2，6，12，24h置于活体荧光成像仪中荧光扫描(Ex/Em740-790nm)。于给药后24h处死小鼠，心脏灌流(打开胸腔，经左心室前端灌注生理盐水，待观察到肺、肝等变白后)，取出脑，心，肝，脾，肺，肾，血液并以生理盐水反复冲洗3遍，置于活体荧光成像仪中荧光扫描(Ex/Em 740-790nm)。

请参阅图24-25所示，BALB/c裸小鼠脑形成肿瘤，HE染色可见肿瘤组织和正常脑组织的明显界限，说明BALB/c裸小鼠体内U87-MG脑胶质瘤模型(原位瘤)的建立成功。

请参阅图26所示，PEG-LP组2只信号强度差别较大，左边较弱，右边较强，但都弱于RI7217-LP-DiR和RI7217-M-LP-DiR组，说明RI7217可增加制剂的脑胶质瘤靶向性；RI7217-M组脑部荧光强度2h～24h逐渐增强，呈时间依赖性变化；RI7217+M(灌胃)组头部信号较强，取脑后发现脑部信号不强，说明 RI7217-LP进入脑胶质瘤较少且左脑也有分布(脑胶质瘤位于右脑)；由于M灌胃增加了RI721-LP-DiR制剂脑内的循环时间，24h后荧光强度依然未减。

请参阅图27所示，24h后离体器官荧光成像，如图和所示，裸鼠脑的胶质瘤部位的荧光信号最强，并且在右侧大脑的脑胶质瘤部位荧光强度强于左侧大脑 (RI7217-LP+M灌胃组除外)，PEG-LP组信号都弱于RI7217-LP-DiR和 RI7217-LP-M-DiR组，说明RI7217可增加制剂的脑胶质瘤靶向性， RI7217-LP-M-DiR组荧光信号强于RI7217-LP-DiR组，而麝香酮与RI7217单独修饰的靶向脂质体共同给药组此时脑肿瘤部位药量较少，表明经过麝香酮和RI7217双重修饰的靶向脂质体的脑靶向作用优于RI7217单独修饰的靶向脂质体，推测麝香酮和RI7217双重修饰的靶向脂质体能通过促进血脑屏障及脑肿瘤屏障的通透，提高含药递送系统进入脑内肿瘤部位的靶向性。可得，麝香酮和RI7217 双重修饰的靶向脂质体既可透过BBB，又可靶向胶质瘤，具有体内双级靶向作用，因此可能会更有利于脑胶质瘤的靶向治疗。

具体而言，本发明实施例中，针对RI7217与麝香酮共修饰DTX脂质体的脑内药效研究为采用脑内纹状体定位注射细胞的方法建立裸鼠脑胶质瘤模型，设计多次给药方案观察荷瘤裸鼠生存率、体重变化多方面指标评价配体修饰的脂质体在荷脑胶质瘤模型裸鼠上的药效，对人体应用胶脑质瘤的治疗有很大的应用前景。

具体而言，本发明实施例中，建立BALB/c裸小鼠体内U87-MG脑胶质瘤模型(原位瘤)，先配置溶液：3.5％水合氯醛：称取3.5g水合氯醛，以0.9％生理盐水溶解并定容至100ml。再对细胞进行培养：将细胞培养在含10％FBS、1％青-链霉素的DMEM培养基中。细胞复苏后置于37℃、5％CO₂(相对湿度90％) 培养箱中培养，每2-3天更换一次培养液。取对数生长期的细胞接种于培养瓶中，生长至80-90％融合度时传代或铺板，进行后续细胞实验。在细胞处于对数生长期约80％覆盖培养瓶时，以0.25％胰酶-EDTA消化，离心(1000rpm，5min)，弃上清，用Hanks液调成浓度为4×10⁵/5μL的单细胞悬液(计数)，置于37℃恒温摇床中备用(苔盼蓝排斥实验检测细胞活力﹥95％)。最后建立荷脑胶质瘤裸小鼠模型，取裸小鼠，用3.5％水合氯醛，1ml/100g，麻醉后定于脑立体定位仪上(图1)，常规消毒(75％酒精)后于额部中线处纵向头皮切开1cm，在前囟位置，矢状缝右侧2cm处用圆头牙钻钻孔，深达硬脑膜表面(内眦连线与头部矢状中线交汇处纵向1cm长头皮切口，用棉棒沾少量双氧水破坏头骨表面组织，分离暴露颅骨，于前囟右侧1.8mm处颅骨钻孔)，再用微量注射器垂直进针穿刺脑膜和脑组织，进针3mm(在右侧尾状核附近,退针会加重损伤)，注射速度 1μL/min,共注射细胞悬液5μL。注射完后，留针5min缓慢拔出针管^[3]。酒精擦拭手术野，并以骨蜡封住脑膜处手术口，可降解缝合线缝合切口后消毒皮肤并肌注青霉素(1万单位/只)。术后定期观察裸小鼠状态。

具体而言，本发明实施例中，对RI7217与麝香酮共修饰的载多西紫杉醇长循环脂质体的脑内药效验证，首先，将治疗分组，本实施例中分为5组，每组8 只，第一组为生理盐水，第二组为PEG-LP-DTX，第三组为RI7217-LP，第四组为RI7217-LP+Mu(灌胃)，第五组为RI7217-LP-Mu。其次，将种瘤10天后的荷瘤裸鼠随机分为5组，每组8只，于种瘤后的第8，11，14及17天经尾静脉注射给药。记录荷瘤裸小鼠的生存时间、体重。以生存时间(天数)为横坐标，各组的生存百分数为纵坐标绘制生存曲线及体重变化曲线。最后，荷瘤后8，11， 14及17天，以含2mg/kg的DTX剂量的靶向脂质体尾静脉给药。记录不同治疗组的老鼠的生存情况和体重变化，以生存时间(天数)为横坐标，各组的生存百分数为纵坐标绘制Kaplan-Meier生存曲线，以时间(天数)为横坐标，各组的体重变化为纵坐标绘制裸鼠的体重变化曲线。

请参阅图28所示，将种瘤8天后的荷瘤裸鼠随机分为5组，每组8只，于种瘤后的第8，11，14及17天经尾静脉注射给药含20μgDTX各组制剂。记录荷瘤裸小鼠的生存时间。以生存时间(天数)为横坐标，各组的生存百分数为纵坐标绘制生存曲线。通过尾经脉注射，分别给予RI7217-LP+M(灌胃)组、 RI7217-LP-M组、RI7217-LP组、PEG-LP组，以生理盐水组为阴性对照组。实验结果表明：RI7217-LP-M组裸鼠终止死亡的时间均晚于其他各组。通过计算得到各个制剂组的中位生存时间分别为：生理盐水组15天、PEG-LP组17天、 RI7217-LP组19天、RI7217-LP+M(灌胃)组20天、RI7217-LP-M组22天。 RI7217-LP-M组可延长原位肿瘤模型裸鼠的生存时间。

请参阅图29所示，记录各组制剂的U87荷瘤裸鼠体重，绘制出Kaplane Meier 生存曲线和裸鼠体重变化曲线，以评价脂质体对脑胶质瘤的体内治疗的毒副作用。结果各组裸鼠体重变化不明显，无明显的毒副作用。通过裸鼠体重与其生存质量具有一定的相关性。裸鼠体重在连续几天内急剧下降，裸鼠不久后就会发生死亡，通常这些小鼠伴有意志消沉、偏瘫的症状。这主要是由于脑胶质瘤在脑内的“占位效应”、对部分中枢神经的压迫、引起中枢神经的病变。对于晚期的脑胶质瘤，由于肿瘤体积快速增大，也就导致了疾病的进行性加重，裸鼠短期内发生死亡。结合前期体内外靶向性结果分析，RI7217-LP-M组具有更高的BBB穿透、脑胶质瘤靶向、肿瘤组织穿透能力。表明经过麝香酮和RI7217双重修饰的靶向脂质体的脑靶向及胶质瘤的治疗作用优于RI7217单独修饰的靶向脂质体、麝香酮与 RI7217单独修饰的靶向脂质体共同给药，推测麝香酮和RI7217双重修饰的靶向脂质体能通过促进血脑屏障及脑肿瘤屏障的通透，增加含药递送系统进入脑内肿瘤部位的药量。因此，体内结果显示：RI7217-LP-M组能够提高脑胶质瘤的体内治疗效应，延长生存时间，具有最强的脑胶质瘤生长抑制作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明；对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：先对麝香酮环进行氨基化修饰，再将氨基化的麝香酮与二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇反应以合成制备二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-麝香酮；

步骤2：以二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺马来酞亚胺，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-麝香酮共聚物，蛋黄卵磷脂和胆固醇为材料，采用薄膜分散法制备脂质体，然后通过其表面马来酰亚胺基与巯基化的RI7217共价连接而制备RI7217-LP和RI7217-LP-M。

2.根据权利要求1所述的RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，对麝香酮环进行氨基化修饰包括如下步骤：

步骤101：在30分钟内向搅拌的麝香酮C1的500mL甲醇溶液中加入Br₂，并于室温下搅拌反应过夜，反应的混合物用300mL饱和Na₂S₂O₃稀释并用300mL乙酸乙酯分三次萃取，合并有机物并用水为300ml，并用300ml盐水洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，通过用石油醚洗脱，硅胶层析纯化残余物，得到产物为黄色油状物C2，其中，C1为100g，0.42mol，Br₂为100g，0.63mol；

步骤102：在30分钟内向搅拌的C2的500mL的DMSO溶液中滴加NaN₃的100mL水溶液，并于室温下搅拌反应过夜，反应的混合物用300mL饱和NaHCO₃稀释并用300mL乙酸乙酯分三次萃取，合并有机物并用水为300ml，5次，并用300ml盐水300mL洗涤，经无水Na₂SO₄干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，得到产物为黄色油状物C3，其中，C2为100g，0.3mol，NaN₃为59g，0.9mol；

步骤103：向搅拌的C3的300mL甲醇溶液中加入10g的Pd/C溶液，反应的混合物用H₂脱气三次并在H₂下室温搅拌反应过夜，采用LCMS监测反应完成后过滤，将滤液浓缩旋干，得到产物为黄色油状物，将粗产物溶于HCl/二恶烷4M，100mL中并在室温下搅拌过夜，过滤混合物，滤饼用乙酸乙酯100mL洗涤，得到产物为黄色固体C4，其中，C3为70g，0.3mol；

步骤104：向搅拌的C4的100mL DCM溶液中加入Et₃N和(Boc)₂O，并于室温下搅拌反应过夜，反应的混合物用水为50mL，并用盐水50mL洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，通过用石油醚：乙酸乙酯＝10：1洗脱，层析纯化残余物，得到产物，为黄色油状物C5，其中，C4为10g，0.04mol，Et₃N为16g，0.16mol，(Boc)₂O为13g，0.06mol；

步骤105：将C5在HCl/二恶烷中的混合物在室温下搅拌过夜，将反应混合物浓缩旋干，并在室温下用50mL乙酸乙酯研磨5小时，过滤混合物，将滤饼浓缩旋干，得到白色固体氨基麝香酮C6，其中，C5为5g，0.014mol，HCl/二恶烷为4M，50mL。

3.根据权利要求2所述的RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，其特征在于，所述氨基化的麝香酮C6与DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS反应合成制备DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone过程为：将白色固体C6，DSPE-PEG₂₀₀₀-NHS和三乙胺以摩尔比3：2：4的处方量溶于混合溶液，混合溶液为氯仿:甲醇＝2：1，于磁力搅拌器上30℃反应过夜℃，反应的混合物用水50mL，50mL盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，通过用石油醚：乙酸乙酯＝10：1洗脱，层析纯化残余物，得到产物为黄色油状物为DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone。

4.根据权利要求1所述的RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，其特征在于，所述长循环脂质体的制备为：将处方量的EPC，Chol，DSPE-PEG₂₀₀₀，DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL，DSPE-PEG₂₀₀₀-Muscone，DTX，按摩尔比100：20：5：2.5：0.25：3.33溶于适量氯仿中，置50mL圆底瓶中减压旋蒸10min成膜，后置真空干燥箱中37℃干燥2h，加入5mL PBS缓冲液，于旋转蒸发仪中水化30min，探头超声3min制备得到含药长循环脂质体。

5.根据权利要求4所述的RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，其特征在于，将RI7217-SH与载药长循环脂质体按照RI7217-SH：DSPE-PEG₂₀₀₀-MAL：EPC摩尔比为1：10：1000的比例在恒温振荡器避光反应在125r/min，25℃下4h，后置于冰箱4℃过夜，以pH7.4的0.01mol/LPBS洗脱过琼脂糖CL-4B凝胶柱，除去未连接的抗体，将洗脱后的脂质体置于4℃超滤浓缩得RI7217-LP。

6.根据权利要求5所述的RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，其特征在于，所述RI7217-LP的包封率EE和载药量DLC表示为：

其中，C为多西紫杉醇总药量(μg)，C₀为包封于脂质体中多西紫杉醇的浓度μg/mL)，n为稀释倍数，M为RI7217-LP-DTX的总重量。

7.根据权利要求5所述的RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的制备方法，其特征在于，假设每个LP的RI7217缀合数目是基于100nm脂质体含有10⁵个磷脂分子，则平均每个LP上接有RI7217的数目：

n＝N/N₀

其中，n为平均每个LP上接有RI7217的数目，N为每毫升RI7217-LP和RI7217-LP-M溶液中脂质体表面的RI7217分子数，N₀为每毫升脂质体溶液中脂质体的分子数。

8.一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体，其特征在于，所述DTX长循环脂质体包括作为靶向药物载体的长循环脂质体、包裹在长循环脂质体内的多西紫杉醇、在长循环脂质体表面用以穿过BBB的麝香酮、在长循环脂质体表面用以脑靶向配体的RI7217单克隆抗体和转铁蛋白受体。

9.根据权利要求8所述的RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体，其特征在于，所述DTX长循环脂质体的RI7217-LP及RI7217-LP-M的平均粒径小于等于200nm，Zeta电位小于等于-18mV，采用RI7217摩尔比为40:1，EPC:RI7217摩尔比为1000:1进行脂质体修饰。

10.一种RI7217与麝香酮共修饰DTX长循环脂质体的应用，其特征在于，所述RI7217-LP-M双重靶向脂质体能够透过BBB，并能够透过脑胶质瘤屏障，用以对脑胶质瘤治疗药物中的用途。

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