CN109851512A - 一种麝香酮衍生物、制备方法及其应用 - Google Patents
一种麝香酮衍生物、制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种麝香酮衍生物、制备方法及其应用，属于生物材料技术领域。所述麝香酮衍生物，具有如式(A)、式(B)所示结构及上述结构药学上可接受的盐，本发明还公开了上述麝香酮衍生物的制备方法及其应用。本发明的麝香酮衍生物，一是容易形成盐酸盐，能改善其溶解性能；二是其结构上的活性基团氨基能通过化学反应将其连接到载体材料上，三是能作为靶头修饰在载体材料的表面，仅需很少的剂量进行修饰即可促进载药的纳米递送系统进入脑内；四是可以用于制备麝香酮磷脂化合物，而麝香酮磷脂化合物生物相容性好，具有促进递送系统透过血脑屏障的优点，可用于制备脑靶向递送药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种麝香酮衍生物、制备方法及其应用，属于生物材料技术领域。
背景技术
现代研究发现，芳香开窍类中药(麝香酮、冰片等)促血脑屏障BBB的开放是一个物理过程，并且不损伤脑组织。麝香酮(Muscone，简称Mus)是从鹿科动物林麝(Moschusberezovskii Flerov)或原麝(Moschus moschiferus L)的成熟雄体香囊中的干燥分泌物麝香经蒸馏提取得到的活性成分之一，学名为3-甲基十五烷酮，是麝香的主要生理活性物质。由于野生动物麝的稀缺及社会需求的需要，近年来经过研究人员的努力，可以通过人工合成的方法合成。
麝香酮的化学式为C16H30O，分子量为238，脂溶性强，可透过正常的BBB进入脑组织内，很快达到峰浓度，而在脑内代谢较其在他组织器官缓慢。由于BBB屏障的选择性通透作用，除一些脂溶性药物以及与脑内相关受体相互作用的药物以外，因药物自身化学结构的特殊性，药物很难透过血脑屏障。近年研究报道芳香开窍中药自身能透过血脑屏障并能促进一些药物透过BBB，增加进入脑内药量，在脑内药物递送中有潜在的应用前景。然而利用麝香酮的芳香开窍作用促进这些药物透过BBB，需要多次使用麝香酮，而麝香酮在脑内代谢较慢，造成蓄积，而产生一定的毒副作用。
鉴于此，有必要研究一种需要很少的剂量进行麝香酮修饰即可促进载药的纳米递送系统进入脑内的新化合物。
发明内容
本发明的目的之一，是提供一种麝香酮衍生物。本发明的麝香酮衍生物，一是其结构上的活性基团氨基能通过化学反应将其连接到载体材料上，二是容易形成盐酸盐，能改善其溶解性能；三是能作为靶头修饰在载体材料的表面，仅需很少的剂量进行修饰即可促进载药的纳米递送系统进入脑内；四是可以用于制备麝香酮磷脂化合物，而麝香酮磷脂化合物生物相容性好，具有促进递送系统透过血脑屏障的优点，可用于制备脑靶向递送药物。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种麝香酮衍生物，具有如式(A)、式(B)所示结构及上述结构药学上可接受的盐，
上述式(A)、式(B)，为氨基麝香酮，其分子量为253.4，1HNMR谱图中，位于0.95处和1.05处的峰为甲基峰，位于1.29处的峰为大环上的亚甲基峰，位于1.84处和2.05处的峰为与甲基相连接的次亚甲基峰，位于2.328处和2.754处的峰为环上羰基及环上甲基连接部分的亚甲基峰，位于4.102处的峰为环上与氨基相连接的次甲基峰，位于8.37处和8.48处的峰为氨基质子峰。
本发明的目的之二，是提供上述麝香酮衍生物的制备方法。本发明通过将麝香酮氨基化，制备麝香酮衍生物，产物以盐酸盐形式存在，溶解性能好，有利于控制产品的质量，市场前景广阔，适合工业化生产。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种麝香酮衍生物的制备方法，所述制备方法涉及的反应路线为：
上述反应路线的具体反应步骤为：
步骤1：化合物C2的合成
边搅拌，边向盛有100g麝香酮C1的500mL甲醇溶液中加入100g的Br2，并于室温下搅拌反应过夜，反应得到的混合物用300mL饱和Na2S2O3溶液稀释并用300mL乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液并洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，洗脱，硅胶层析纯化残余物，得到化合物C2；
步骤2：化合物C3的合成
边搅拌，边向盛有100g化合物C2的500mL DMSO溶液中滴加盛有59g NaN3的100mL水溶液，并于室温下搅拌反应过夜，反应得到的混合物用300mL饱和NaHCO3溶液稀释并用300mL乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液并洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，得到化合物C3；
步骤3：化合物C4的合成
室温下，边搅拌，边向盛有70g化合物C3的300mL甲醇溶液中加入10g含钯Pd量为10％的Pd/C催化剂，脱气，并在H2下室温搅拌反应过夜，采用LCMS监测反应完成后过滤，将滤液浓缩旋干，得到粗产物，将上述粗产物溶于100mL 4mol/L氯化氢的1,4-二氧六环溶液中，并在室温下搅拌过夜，过滤，滤饼用100mL乙酸乙酯洗涤，得到化合物C4，即为权利要求1中式(A)、式(B)所示结构的麝香酮衍生物；
步骤4：化合物C5的合成
边搅拌，边向盛有10g化合物C4的100mL DCM溶液中加入16g Et3N和13g(Boc)2O，并于室温下搅拌反应过夜，洗涤反应的混合物，用无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，洗脱，柱层析纯化残余物，得到化合物C5；
步骤5：化合物C6的合成
将5g化合物C5置于50mL 4mol/L氯化氢的1,4-二氧六环溶液中，在室温下搅拌过夜，将反应混合物浓缩旋干，并在室温下用50mL乙酸乙酯研磨5小时，过滤混合物，将滤饼浓缩旋干，得到化合物C6，即为权利要求1中式(A)、式(B)所示结构的药学上可接受的盐的麝香酮衍生物。
上述麝香酮衍生物的制备方法的原理是：
本发明的步骤1为溴化反应，得到的化合物C2为黄色油状物。
步骤2为叠氮化反应，得到的化合物C3为黄色油状物。
步骤3为还原反应，得到的粗产物为黄色油状物；得到的化合物C4为黄色固体，质谱图如图1所示，ESI-MS m/z:254.4[M+H]+，276.4[M+Na]+。
步骤4为Boc保护氨基反应，得到的化合物C5为黄色油状物。
步骤5为脱Boc氨基保护基反应，得到的化合物C6，即为氨基麝香酮盐酸盐，为白色固体，质谱图如图2所示。ESI-MS m/z:254.5[M+H]+。1HNMR谱图如图3所示，位于0.95处和1.05处的峰为甲基峰，位于1.29处的峰为大环上的亚甲基峰，位于1.84处和2.05处的峰为与甲基相连接的次亚甲基峰，位于2.328处和2.754处的峰为环上羰基及环上甲基连接部分的亚甲基峰，位于4.102处的峰为环上与氨基相连接的次甲基峰，位于8.37处和8.48处的峰为氨基质子峰。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1中，所述洗脱采用石油醚。
采用上述进一步的有益效果是：采用石油醚，洗脱效果更好。
进一步，步骤1和步骤2中，所述洗涤均依次采用300mL水和300mL饱和NaCl水溶液。
采用上述进一步的有益效果是：水主要洗涤掉体系里面的水溶性杂质，饱和NaCl水溶液主要是洗涤掉体系里面的水以及一些水溶性杂质。采用水和饱和NaCl水溶液依次洗涤，可以分别洗掉不同的杂质，洗涤效果更好。
进一步，步骤3中，所述脱气采用H2，次数为3次。
采用上述进一步的有益效果是：采用H2效果好，操作容易。
进一步，步骤4中，所述洗涤为依次采用50mL水和50mL饱和NaCl水溶液。
采用上述进一步的有益效果是：水主要洗涤掉体系里面的水溶性杂质，饱和NaCl水溶液主要是洗涤掉体系里面的水以及一些水溶性杂质。采用水和饱和NaCl水溶液依次洗涤，可以分别洗掉不同的杂质，洗涤效果更好。
进一步，步骤4中，所述洗脱采用石油醚和乙酸乙酯按体积比为10:1的混合溶剂。
采用上述进一步的有益效果是：采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱效果更好。
本发明的目的之三，是提供上述麝香酮衍生物的应用。本发明将麝香酮衍生物用于制备麝香酮磷脂化合物，得到的麝香酮磷脂化合物生物相容性好，具有促进递送系统透过血脑屏障的优点，在脑靶向递送药物的制备中具有广阔的应用前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：如上所述的麝香酮衍生物在制备麝香酮磷脂化合物中的应用。
本发明得到的麝香酮磷脂化合物，将其作为载体材料制备成的递送系统能提高脑血管内皮细胞的摄取，此外，将其作为载体材料制备成麝香酮和抗体(蛋白或多肽等)双靶头修饰的递送系统，脑血管内皮细胞摄取效率优于DSPE-PEG2000-麝香酮作为载体材料制备成的递送系统，同时活体成像结果显示，麝香酮和抗体(蛋白或多肽等)双靶头修饰的递送系统还可以明显提高该递送系统脑靶向效应。
本发明的目的之四，是提供一种麝香酮磷脂化合物的制备方法。本发明采用麝香酮衍生物和DSPE-PEG2000-NHS制备麝香酮磷脂化合物，制备方法简单，减少副产物的发生，市场前景广阔，适合规模化生产。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备方法，包括如下步骤：
将上述的麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物，按照8mg:1mL的比例，溶于氯仿和甲醇的混合溶剂中，于30℃磁力搅拌反应过夜，洗涤反应的混合物，洗涤产物用无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，洗脱，层析纯化残余物，即得到麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮，其结构式为:
本发明的原理：
DSPE-PEG2000-NHS，化学名为1,2-二硬脂酰-SN-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000，通用名为二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-N-羟基丁二酰亚胺-聚乙二醇2000，分子式为C137H266O58N3P，结构式为：
本制备方法涉及的反应方程式为：
DSPE-PEG2000-NHS的分子量为2900，连接麝香酮后DSPE-PEG2000-麝香酮总的分子量是3005，在进行飞行质谱图检测的时候，显示化合物的分子量为2257，其中DSPE的分子量是748.07，DSPE与PEG2000之间是酰胺键连接，酰胺键不稳定，推测DSPE-PEG2000-麝香酮的飞行质谱图中酰胺键断裂，DSPE片段被打掉。进一步通过1HNMR谱对DSPE-PEG2000-麝香酮各官能团的归属解析如下：位于0.86处和0.90处的峰属于甲基峰(CH3-)，1.20～1.34处的峰属于此化合物上多个亚甲基峰(-CH2-)，3.46处的峰属于PEG2000部分的亚甲基峰(-CH2-0-)，2.0处的峰属于麝香酮酰胺键旁边相邻的亚甲基是DSPE-PEG2000-麝香酮特有的峰，结合飞行质谱证实麝香酮分子连接到DSPE-PEG2000上。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物中，麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的摩尔比为(3～5)：(2～3)：(4～6)，所述氯仿和甲醇的混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为(2～3)：1，且所述麝香酮衍生物为上述式(A)、式(B)所示结构的药学上可接受的盐。
进一步，所述洗涤为依次采用50mL水和50mL饱和NaCl水溶液。
采用上述进一步的有益效果是：水主要洗涤掉体系里面的水溶性杂质，饱和NaCl水溶液主要是洗涤掉体系里面的水以及一些水溶性杂质。采用水和饱和NaCl水溶液依次洗涤，可以分别洗掉不同的杂质，洗涤效果更好。
进一步，所述洗脱采用石油醚和乙酸乙酯按体积比为10：1的混合溶剂。
采用上述进一步的有益效果是：采用石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，洗脱效果更好。
本发明的有益效果是：
1.本发明的麝香酮衍生物，一是其结构上的活性基团氨基能通过化学反应将其连接到载体材料上，二是容易形成盐酸盐，能改善其溶解性能；三是能作为靶头修饰在载体材料的表面，仅需很少的剂量进行修饰即可促进载药的纳米递送系统进入脑内；四是可以用于制备麝香酮磷脂化合物，而麝香酮磷脂化合物生物相容性好，具有促进递送系统透过血脑屏障的优点，可用于制备脑靶向递送药物。
2.本发明通过将麝香酮氨基化，制备麝香酮衍生物，产物以盐酸盐形式存在，溶解性能好，有利于控制产品的质量，市场前景广阔，适合工业化生产。
3.本发明将麝香酮衍生物用于制备麝香酮磷脂化合物，得到的麝香酮磷脂化合物生物相容性好，具有促进递送系统透过血脑屏障的优点，在脑靶向递送药物的制备中具有广阔的应用前景。
4.本发明采用麝香酮衍生物和DSPE-PEG2000-NHS制备麝香酮磷脂化合物，制备方法简单，减少副产物的发生，市场前景广阔，适合规模化生产。
附图说明
图1为本发明的化合物C4的质谱图。
图2为本发明的化合物C6的质谱图。
图3为本发明的化合物C6的1HNMR谱图。
图4为本发明的DSPE-PEG2000-麝香酮的飞行质谱图。
图5为本发明的DSPE-PEG2000-麝香酮的1HNMR谱图。
图6为本发明包载香豆素6的脂质体在4h对hCMEC/D3细胞的摄取图。
图7为本发明的裸鼠体内注射PEG-Lp-DiR后2h的活体成像图。
图8为本发明的裸鼠体内注射RI-Lp-DiR后2h的活体成像图。
图9为本发明的裸鼠体内注射RI-LP-M-DiR后2h的活体成像图。
图10为本发明的裸鼠体内注射PEG-Lp-DiR后24h的活体成像图。
图11为本发明的裸鼠体内注射RI-Lp-DiR后24h的活体成像图。
图12为本发明的裸鼠体内注射RI-LP-M-DiR后24h的活体成像图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：麝香酮衍生物的制备
麝香酮衍生物的制备方法，所述制备方法涉及的反应路线为：
上述反应路线的具体反应步骤为：
步骤1：化合物C2的合成
边搅拌，边向盛有100g(0.42mol)麝香酮C1的500mL甲醇溶液中加入100g(0.63mol)的Br2，并于室温下搅拌反应过夜，反应得到的混合物用300mL饱和Na2S2O3溶液稀释并用300mL乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液并依次采用300mL水和300mL饱和NaCl水溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，采用石油醚洗脱，硅胶层析纯化残余物，得到黄色油状物的化合物C2。
步骤2：化合物C3的合成
边搅拌，边向盛有100g(0.3mol)化合物C2的500mL DMSO溶液中滴加盛有59g(0.9mol)NaN3的100mL水溶液，并于室温下搅拌反应过夜，反应得到的混合物用300mL饱和NaHCO3溶液稀释并用300mL乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液并依次采用300mL水和300mL饱和NaCl水溶液洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，得到黄色油状物的化合物C3。
步骤3：化合物C4的合成
室温下，边搅拌，边向盛有70g化合物C3(0.3mol)的300mL甲醇溶液中加入10g含Pd为10％的Pd/C催化剂，采用H2脱气3次，并在H2下室温搅拌反应过夜，采用LCMS监测反应完成后过滤，将滤液浓缩旋干，得到黄色油状物粗产物，将上述粗产物溶于100mL 4mol/L氯化氢的1,4-二氧六环溶液中，并在室温下搅拌过夜，过滤，滤饼用100mL乙酸乙酯洗涤，得到黄色固体化合物C4。化合物C4的质谱图如图1所示，ESI-MS m/z:254.4[M+H]+，276.4[M+Na]+。
步骤4：化合物C5的合成
边搅拌，边向盛有10g(0.04mol)化合物C4的100mL DCM溶液中加入16g(0.16mol)Et3N和13g(0.06mol)(Boc)2O，并于室温下搅拌反应过夜，依次采用50mL水和50mL饱和NaCl水溶液洗涤反应的混合物，用无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，采用石油醚和乙酸乙酯按体积比为10：1的混合溶剂洗脱，柱层析纯化残余物，得到黄色油状物化合物C5。
步骤5：化合物C6的合成
将5g(0.014mol)化合物C5置于50mL 4mol/L氯化氢的1,4-二氧六环溶液中，在室温下搅拌过夜，将反应混合物浓缩旋干，并在室温下用50mL乙酸乙酯研磨5小时，过滤混合物，将滤饼浓缩旋干，得到白色固体化合物C6。
化合物C6质谱图如图2所示。ESI-MS m/z:254.5[M+H]+。1HNMR谱图如图3所示，位于0.95处和1.05处的峰为甲基峰，位于1.29处的峰为大环上的亚甲基峰，位于1.84处和2.05处的峰为与甲基相连接的次亚甲基峰，位于2.328处和2.754处的峰为环上羰基及环上甲基连接部分的亚甲基峰，位于4.102处的峰为环上与氨基相连接的次甲基峰，位于8.37处和8.48处的峰为氨基质子峰。
化合物C4的分子量是253.4，而LC MS 254.5[M+H]+，是正模式显示的分子量，通过质谱图确定的分子量再1HNMR谱图的化学位移确定各个基团的连接关系及根据各H峰积分面积定出各基团质子比，即可确定这个化合物是目标化合物。
本发明的麝香酮衍生物，一是容易形成盐酸盐，能改善其溶解性能；二是其结构上的活性基团氨基能通过化学反应将其连接到载体材料上，三是能作为靶头修饰在载体材料的表面，仅需很少的剂量进行修饰即可促进载药的纳米递送系统进入脑内；四是可以用于制备麝香酮磷脂化合物。
实施例2：麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备
本实施例的麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备方法，包括如下步骤：
将实施例1得到的化合物C6、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物，按照8mg:1mL的比例，溶于氯仿和甲醇的混合溶剂中，于30℃磁力搅拌反应过夜，依次采用50mL水和50mL饱和NaCl水溶液洗涤反应的混合物，用无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，采用石油醚和乙酸乙酯按体积比为10：1的混合溶剂洗脱，层析纯化残余物，即得到麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮，其结构式为：
其中，所述化合物C6、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物中，麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的摩尔比为3：2：4，所述氯仿和甲醇的混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为2：1。
DSPE-PEG2000-NHS的分子量2900左右，连接麝香酮后DSPE-PEG2000-麝香酮总的分子量是3005，飞行质谱图检测显示化合物的分子量为2257，其中DSPE的分子量是748.07，DSPE与PEG2000之间是酰胺键连接，酰胺键不稳定，推测DSPE-PEG2000-麝香酮的飞行质谱图中酰胺键断裂，DSPE片段被打掉，具体如图4所示。进一步通过1HNMR谱对DSPE-PEG2000-麝香酮各官能团的归属解析如下：位于0.86处和0.90处的峰属于甲基峰(CH3-)，1.20～1.34处的峰属于此化合物上多个亚甲基峰(-CH2-)，3.46处的峰属于PEG2000部分的亚甲基峰(-CH2-0-)，2.0处的峰属于麝香酮酰胺键旁边相邻的亚甲基是DSPE-PEG2000-麝香酮特有的峰，结合飞行质谱证实麝香酮分子连接到DSPE-PEG2000上。
实施例3：麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备
本实施例的麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备方法，包括如下步骤：
将实施例1得到的化合物C6、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物，按照8mg:1mL的比例，溶于氯仿和甲醇的混合溶剂中，于30℃磁力搅拌反应过夜，依次采用50mL水和50mL饱和NaCl水溶液洗涤反应的混合物，用无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，采用石油醚和乙酸乙酯按体积比为10:1的混合溶剂洗脱，层析纯化残余物，即得到麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮，其结构式为：
其中，所述化合物C6、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物中，麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的摩尔比为4：3：6，所述氯仿和甲醇的混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为3：1。
实施例4：麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备
本实施例的麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备方法，包括如下步骤：
将实施例1得到的化合物C6、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物，按照8mg:1mL的比例，溶于氯仿和甲醇的混合溶剂中，于30℃磁力搅拌反应过夜，依次采用50mL水和50mL饱和NaCl水溶液洗涤反应的混合物，用无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，采用石油醚和乙酸乙酯按体积比为10:1的混合溶剂洗脱，层析纯化残余物，即得到麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮，其结构式为:
其中，所述化合物C6、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物中，麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的摩尔比为5：2：5，所述氯仿和甲醇的混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为2：1。
实施例5：体外hCMEC/D3细胞对各组脂质体的定量摄取
抗体RI7217与麝香酮双重修饰载香豆素长循环脂质体的制备：采用薄膜分散法制备脂质体。取处方量的EPC(0.02254g)、Chol(0.00221g)、DSPE-PEG2000(0.00402g)、DSPE-PEG2000-MAL(0.00083g)、DSPE-PEG2000-麝香酮(0.000086g)和香豆素C6(0.000176g)，六者的摩尔比为100:20:5:1:0.1:1.77，溶于5mL氯仿中，置于50mL圆底瓶中于旋转蒸发仪上减压成膜，后置真空干燥箱中37℃干燥2h。加入5mL 0.01M的pH值为7.4的PBS缓冲液，于旋转蒸发仪中37℃水化30min，探头超声3min制备得到含药长循环脂质体。
将巯基化抗体RI7217-SH与5mL载香豆素(C6)长循环脂质体在恒温振荡器避光反应(125r/min，25℃)4h，后置于冰箱4℃过夜。以pH值为7.4的0.01mol/L PBS洗脱过琼脂糖CL-4B凝胶柱，除去未连接的抗体。将洗脱后的脂质体置于4℃超滤浓缩，即制备得到载香豆素(C6)的RI-LP-M长循环脂质体。载香豆素(C6)的RI-LP制备方法同上；载香豆素(C6)的PEG-LP制备不需连接抗体的步骤。
取常规培养的hCMEC/D3细胞(永生化人脑微血管内皮细胞)接种96孔板(104/孔)，每孔100μL，在5％CO2，37℃条件下培养24h，使细胞完全贴壁，且处于对数生长期，分别将含有游离香豆素(C6)浓度均为10μM的PEG化脂质体(PEG-LP)、麝香酮修饰的脂质体(M-LP)、抗体修饰的脂质体(RI-LP)和麝香酮和抗体双重修饰的脂质体(RI-LP-M)加入完全培养液中，再将各组培养液加入含有细胞的96孔板中，37℃孵育4h，PBS洗细胞3次，加100μL的1％TritonX-100裂解细胞，4℃避光裂解0.5h以上。待裂解完全后，用荧光酶标仪(Ex＝466nm，Em＝504nm)测定荧光强度，每组设5个副孔。
结果：各组的脂质体作用于hCMEC/D3细胞4h后被摄取的情况见图6，其中hCMEC/D3细胞摄取M-LP摄取效率高于PEG-LP，p＜0.05，这表明麝香酮单独修饰脂质体对hCMEC/D3细胞摄取较PEG-LP明显增加；经抗体RI修饰后，hCMEC/D3细胞摄取RI-LP效率明显增加，优于PEG-LP，p＜0.05；RI-LP-M摄取效率明显高于RI-LP，p＜0.05。
由此可见，将麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮作为载体材料制备成麝香酮和抗体双靶头修饰的递送系统，脑血管内皮细胞摄取效率明显优于抗体修饰的递送系统。
实施例6：裸鼠原位脑胶质瘤模型的建立
取BALB/c裸鼠，用10％水合氯醛，0.06mL/只,麻醉后定于脑立体定位仪上，75％酒精消毒后于额部中线处纵向头皮切开1cm，在前囟位置，矢状缝右侧2mm处用圆头牙钻钻孔，深达硬脑膜表面，再用微量注射器垂直进针穿刺脑膜和脑组织，进针3mm(在右侧尾状核附近)，注射速度1μL/min,共注射细胞悬液5×104个。注射完后，留针5min缓慢拔出针管。酒精擦拭手术视野，并以骨蜡封住颅骨手术钻孔口处，用可降解缝合线缝合切口后消毒皮肤。术后定期观察裸小鼠状态。
实施例7：抗体RI7217与麝香酮双重修饰载荧光探针DiR长循环脂质体的制备
采用薄膜分散法制备脂质体。将处方量的EPC(0.01127g)、Chol(0.00111g)、DSPE-PEG2000(0.00201g)、DSPE-PEG2000-MAL(0.00041g)、DSPE-PEG2000-麝香酮(0.000044g)和DiR(0.00048g)，六者的摩尔比为100:20:5:1:0.1:3.33，溶于5mL氯仿中，置50mL圆底瓶中于旋转蒸发仪上减压成膜，后置真空干燥箱中37℃干燥2h。加入5mL 0.01M的pH值为7.4的PBS缓冲液，于旋转蒸发仪中37℃水化30min，探头超声3min制备得到含药长循环脂质体。
将巯基化抗体RI7217-SH与5mL载DiR长循环脂质体在恒温振荡器避光反应(125r/min，25℃)4h，后置于冰箱4℃过夜。以pH值为7.4的0.01mol/L PBS洗脱过琼脂糖CL-4B凝胶柱，除去未连接的抗体。将洗脱后的脂质体置于4℃超滤浓缩，即制备得到DiR标记的RI-LP-M长循环脂质体。RI-LP制备方法同上；PEG-LP制备不需连接抗体的步骤。
实施例8：活体成像
BALB/c裸鼠原位脑胶质瘤模型建立8天后，尾静脉分别注射DiR标记的PEG-LP、RI-LP和RI-LP-M三组脂质体，脂质体中DiR浓度为0.1mg/mL,注射剂量200μL/只。裸鼠异氟烷吸入麻醉，于给予脂质体后2h、24h置于活体荧光成像仪中观察含有荧光探针的脂质体在小鼠体内的滞留情况(Ex/Em748-780nm)。
实施例9：活体成像观察DiR标记的脂质体在荷原位胶质瘤裸鼠体内分布
由图7-图12可知，在2h和24h,PEG-LP-DiR组脑部荧光强度强于RI-LP-DiR组，说明RI可增加制剂的脑胶质瘤靶向性；然而RI-LP-M-DiR组脑部荧光强度在2h到24h逐渐增强，呈时间依赖性变化，且强于RI-LP-DiR组和PEG-LP-DiR组。
由此可见，经过麝香酮和RI双重修饰的靶向脂质体的脑靶向作用优于RI修饰的靶向脂质体，推测麝香酮和RI双重修饰的靶向脂质体能促进血脑屏障的通透，提高递送系统进入脑内，增强脑靶向性。进而可以推论，麝香酮和RI双重修饰的靶向脂质体可透过BBB，有利于脑内疾病的靶向治疗。
由此可见，本发明的氨基麝香酮，一是容易形成盐酸盐，能改善其溶解性能；二是其结构上的活性基团氨基能通过化学反应将其连接到载体材料上，三是能作为靶头修饰在载体材料的表面，仅需很少的剂量进行修饰即可促进载药的纳米递送系统进入脑内；四是可以用于制备麝香酮磷脂化合物，且麝香酮磷脂化合物生物相容性好，具有促进递送系统透过血脑屏障的优点，可用于制备脑靶向递送药物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种麝香酮衍生物，其特征在于，包括式(A)、式(B)所示结构及上述结构药学上可接受的盐，
2.一种麝香酮衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法涉及的反应路线为：
上述反应路线的具体反应步骤为：
步骤1：化合物C2的合成
边搅拌，边向盛有100g麝香酮C1的500mL甲醇溶液中加入100g的Br2，并于室温下搅拌反应过夜，反应得到的混合物用300mL饱和Na2S2O3溶液稀释并用300mL乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液并洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，洗脱，硅胶层析纯化残余物，得到化合物C2；
步骤2：化合物C3的合成
边搅拌，边向盛有100g化合物C2的500mL DMSO溶液中滴加盛有59g NaN3的100mL水溶液，并于室温下搅拌反应过夜，反应得到的混合物用300mL饱和NaHCO3溶液稀释并用300mL乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液并洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，得到化合物C3；
步骤3：化合物C4的合成
室温下，边搅拌，边向盛有70g化合物C3的300mL甲醇溶液中加入10g含钯Pd量为10％的Pd/C催化剂，脱气，并在H2下室温搅拌反应过夜，采用LCMS监测反应完成后过滤，将滤液浓缩旋干，得到粗产物，将上述粗产物溶于100mL4mol/L氯化氢的1,4-二氧六环溶液中，并在室温下搅拌过夜，过滤，滤饼用100mL乙酸乙酯洗涤，得到化合物C4，即为权利要求1中式(A)、式(B)所示结构的麝香酮衍生物；
步骤4：化合物C5的合成
边搅拌，边向盛有10g化合物C4的100mL DCM溶液中加入16g Et3N和13g(Boc)2O，并于室温下搅拌反应过夜，洗涤反应的混合物，用无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，洗脱，柱层析纯化残余物，得到化合物C5；
步骤5：化合物C6的合成
将5g化合物C5置于50mL4mol/L氯化氢的1,4-二氧六环溶液中，在室温下搅拌过夜，将反应混合物浓缩旋干，并在室温下用50mL乙酸乙酯研磨5小时，过滤混合物，将滤饼浓缩旋干，得到化合物C6，即为权利要求1中式(A)、式(B)所示结构的药学上可接受的盐的麝香酮衍生物。
3.根据权利要求2所述的麝香酮衍生物的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述洗脱采用石油醚。
4.根据权利要求2所述的麝香酮衍生物的制备方法，其特征在于，步骤1和步骤2中，所述洗涤均依次采用300mL水和300mL饱和NaCl水溶液。
5.根据权利要求2所述的麝香酮衍生物的制备方法，其特征在于，步骤3中，所述脱气采用H2，次数为3次。
6.根据权利要求2所述的麝香酮衍生物的制备方法，其特征在于，步骤4中，所述洗涤为依次采用50mL水和50mL饱和NaCl水溶液；所述洗脱采用石油醚和乙酸乙酯按体积比为10：1的混合溶剂。
7.一种如权利要求1所述的麝香酮衍生物在制备麝香酮磷脂化合物中的应用。
8.一种麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将权利要求1所述的麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物，按照8mg:1mL的比例，溶于氯仿和甲醇的混合溶剂中，于30℃磁力搅拌反应过夜，洗涤反应的混合物，洗涤产物用无水Na2SO4干燥并过滤，将滤液浓缩旋干，洗脱，层析纯化残余物，即得到麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮，其结构式为：
9.根据权利要求8所述的氨基麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备方法，其特征在于，所述麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的混合物中，麝香酮衍生物、DSPE-PEG2000-NHS和三乙胺的摩尔比为(3～5)：(2～3)：(4～6)，所述氯仿和甲醇的混合溶剂中，氯仿和甲醇的体积比为(2～3)：1，且所述麝香酮衍生物为权利要求1中式(A)、式(B)所示结构的药学上可接受的盐。
10.根据权利要求8所述的氨基麝香酮磷脂化合物DSPE-PEG2000-麝香酮的制备方法，其特征在于，所述洗涤为依次采用50mL水和50mL饱和NaCl水溶液；所述洗脱采用石油醚和乙酸乙酯按体积比为10:1的混合溶剂。
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