CN102250205A - 脂肪酰-rgd引导多西紫杉醇靶向脂质体的制备及其抗肿瘤活性 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了脂肪酰-RGD引导多西紫杉醇靶向脂质体的制备及其抗肿瘤活性，本发明将不同碳数烷基脂肪酸与RGD肽的氨基端相缀合，对其进行疏水性修饰，合成了具备两亲性的不同烷基脂肪链和RGD肽缀合物：CnH2n+1CO-Arg-Gly-Asp，其中，n代表不同长链脂肪酸的碳数，分别为7，9，11，13，15，另外本发明还包括含有本发明缀合物和多西紫杉醇的脂质体制剂，用于抗肿瘤。
Description
技术领域
本发明涉及整合素靶向载体材料的制备，尤其涉及针对脂溶性药物靶向给药体系的构建方法，本发明还涉及药物载体在制备靶向给药制剂中的应用，属于生物医药领域。
背景技术
许多恶性肿瘤的生长和转移均与整合素表达异常或分子结构改变相关。整合素是一跨膜蛋白大家族，由α、β两种亚基构成异二聚体。目前发现α约有18种，β约有8种，至少有24种异二聚体的整合素形式。整合素在肿瘤的进展可能具有两重性：1)肿瘤发生早期，整合素表达降低可致瘤细胞与基底膜或ECM成分的粘附作用减弱，从而有利于肿瘤在局部生长与扩散；2)瘤细胞进入血循环后，整合素表达增高有利于瘤细胞粘附于血管内皮，继而定位增殖。整合素在肿瘤细胞表面的表达高于正常细胞是公认的事实。
精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽序列(Arg-Gly-Asp，RGD)是整合素特异识别序列片段，外源性的RGD肽竞争性与肿瘤细胞表面整合素特异性结合后，不仅表现出阻止肿瘤细胞定位增殖、抗肿瘤新生血管生成的作用，还具有靶向性标记肿瘤和输送抗肿瘤药物的作用。
纳米载药系统是直径50～1000nm的球型脂质双层，组成成分灵活，可以制成种类、大小、表面特征不同的多种类型，作为生物活性物质的有效运输载体。
普通纳米载药系统不具有靶向性。可以在纳米级载药系统表面结合抗体、配体，利用肿瘤细胞与正常细胞表面表达的抗原或受体的差异，通过抗原、抗体和受体、配体的特异性作用增加脂质体的主动靶向性，从而提高治疗指数。
抗肿瘤药物的主动靶向性制剂将是改进抗肿瘤药物制剂的新趋向。为了使载体系统具有特异靶向性，可将各种活性物质耦联到载体表面。受体介导的靶向策略是解决载体系统靶向性途径之一。借助这种特异性相互作用可将载有各种抗肿瘤药物的载体系统靶向到含有特异性受体的器官、组织或细胞；同时受体与配体结合可促进载体系统内药物释放到细胞内。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种具有两亲性的整合素受体靶向锚点化合物及其制备方法；
本发明的目的之二是提供一种含有上述整合素受体靶向锚点化合物的靶向药物载体及其制备方法；
本发明的目的之三是将上述的整合素受体靶向药物载体应用于装载脂溶性的抗肿瘤药物，制备得到主动靶向性的抗肿瘤药物制剂。
本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种具下式结构的两亲性靶向锚点化合物，
其中n＝6，8，10，12，14。
其中的化合物，选自：CH3(CH2)6CORGD，CH3(CH2)8CORGD，CH3(CH2)10CORGD，CH3(CH2)12CORGD，CH3(CH2)14CORGD。
将Arg-Gly-Asp分别与不同烷基脂肪链进行缀合，即制备得到上述系列化合物。
本发明的化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)按照常规液接肽技术合成保护基保护的RG；
(2)将保护基保护的Arg-Gly分别与CH3(CH2)6COOH、CH3(CH2)8COOH、CH3(CH2)10COOH、CH3(CH2)12COOH、CH3(CH2)14COOH偶联；
(3)将上述化合物与保护基保护的Asp按照常规液相接肽技术合成，脱去保护基，既得。
本发明的含有整合素受体靶向锚点化合物的靶向药物载体，选自脂质体、纳米粒或微乳。优选脂质体。
本发明的含有靶向药物载体的药物制剂，其中所述药物选自脂溶性药物，优选多西紫杉醇。
将上述具有两亲性的整合素受体靶向锚点系列化合物按照药物制剂的方法制备，即可得到含有该整合素靶向锚点系列化合物的靶向药物载体，其中，在该靶向药物载体中，优选的，各组分按照不同摩尔百分比组成：一般载体材料80-99％，整合素受体靶向锚点化合物1-20％。
将脂溶性药物(例如：抗肿瘤药物多西紫杉醇等)与一般载体材料、整合素受体靶向锚点化合物按照不同制剂技术进行制备，可得到靶向给药制剂(例如抗肿瘤药物多西紫杉醇靶向脂质体)；优选的，脂溶性药物占靶向药物载体(天然卵磷脂和整合素受体靶向锚点化合物)的摩尔百分含量为1-30％。
优选的，一种制备抗肿瘤药物靶向制剂的方法，包括：
(1)按以下摩尔百分比取各组分：如脂溶性药物1-30％；普通药物载体(磷脂)和整合素受体靶向锚点化合物的混合物70-99％，该混合物中，普通药物载体(天然卵磷脂)80-99％(摩尔百分比)，整合素受体靶向锚点化合物1-20％(摩尔百分比)；
(2)将上述各组分按药物制剂的不同方法制备，得到肿瘤靶向给药体系。
所制备的靶向药物制剂的粒径为100-200nm，Zeta电位为-20～-35mV。
RGD肽具有优秀的靶向性能，在药物传递系统中引入RGD肽，可将药物导向肿瘤局部。整合素分子主要通过识别RGD三肽序列来介导细胞之间及细胞与细胞外基质之间的黏附反应。但是RGD肽存在易被酶解，半衰期短等缺点。为了克服这些缺点，本发明将不同碳数烷基脂肪链与RGD肽段相缀合，对其进行疏水性修饰，合成了具备两亲性的不同烷基脂肪链和RGD肽缀合物，即：CH3(CH2)6CORGD，CH3(CH2)8CORGD，CH3(CH2)10CORGD，CH3(CH2)12CORGD，CH3(CH2)14CORGD，该缀合物稳定性强，不易被酶降解。
多西紫杉醇抗肿瘤疗效显著，但其水溶性低，口服生物利用度差，现有的多西紫杉醇注射液易引起过敏反应。由于不同碳数烷基脂肪链与RGD肽段的缀合物具有疏水脂肪链，可插于质膜上，对药物载体进行修饰，制成靶向药物载体。因此本发明将两亲性RGD偶联物引入含有抗肿瘤药物(如多西紫杉醇)的药物传递系统制备得到多西紫杉醇靶向制剂(如多西紫杉醇靶向脂质体)。该靶向制剂系统可以增加抗肿瘤药物在靶部位的浓度并可减少其在非靶部位的毒副作用，提高药物的治疗指数。
本发明以荷肉瘤S180小鼠为模型，采用种瘤后1，3，5，7天尾静脉给药的治疗方案评价了本发明所制备的多西紫杉醇靶向脂质体制剂的抗肿瘤活性，结果显示多西紫杉醇靶向脂质体比各对照组具有更优异的抗肿瘤活性。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
实施例1Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl的制备
将Boc-Arg(NO2)-OH1.675g(5.25mmol)溶于适量无水DMF中，在冰浴的条件下，加入N-羟基苯并三氮唑(HOBt)0.675g(5mmol)，并使完全溶解。10分钟后加入1.337g(5.75mmol)二环己基羰二亚胺(DCC)。得到反应液(I)，待用。冰浴下把1.685g(5.0mmol)Tos·Gly-OBzl悬浮于适量无水THF中，然后加入数滴N-甲基吗啉(NMM)，调pH 8-9。搅拌35分钟，得到反应液(II)，待用。冰浴下把反应液(I)加入反应液(II)中，先冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示Tos·Gly-OBzl消失。滤除二环己基脲(DCU)，滤液吹去DMF。残留物用适量乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5％NaHCO3水溶液、饱和NaCl水溶液、5％KHSO4水溶液和饱和NaCl水溶液各洗三遍。乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥、过滤、滤液减压浓缩至干，得到2.02g(86.7％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)467.1[M+H]+.
实施例2HCl·H-Arg(NO2)-Gly-OBzl的制备
将2.33g(5mmol)Boc-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶解在适量4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨得1.91g(95％)粗产品，为无色固体，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)367.1[M+H]+，733.1[2M+H]+.
实施例3
1)C7H15CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，0.855g(5.95mmol)C7H15COOH和2.17g(5.4mmol)HCl·H-Arg(NO2)-Gly-OBzl制得2.44g(92.1％)粗产品，为黄色固体。经硅胶柱纯化得2.12g(80％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)515.3[M+Na]+，1007.5[2M+Na]+；Mp.146.9～147.5℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1)
2)C7H15CO-Arg(NO2)-Gly-OH的制备
将2.46g(5mmol)C7H15CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C7H15CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO4水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO4水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.81g(90.0％)粗产品，为白色固体。ESI-MS(m/z)401.2[M-H]-，803.4[2M-H]-；Mp.163.6～164.8℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
3)C7H15CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)2和2.11g(5.25mmol)C7H15CO-Arg(NO2)-Gly-OH制得3.24g(93％)黄色固体。经硅胶纯化得2.84(81.5％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)698.3[M+H]+，720.3[M+Na]+；Mp.101.9～103.0℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
4)C7H15CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备
将0.69g(1mmol)C7H15CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2置于100ml茄形瓶中、用乙醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.45g(96％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)471.1[M-H]-，943.5[2M-H]-；Mp.146.8～147.9℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
实施例4
1)C9H19CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，0.946g(5.5mmol)C9H19COOH和2.01g(5mmol)HCl·H-Arg(NO2)-Gly-OBzl制得2.42g(93.2％)粗产品，为黄色固体。经硅胶柱纯化得2.21g(85.1％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)543.3[M+Na]+，1063.9[2M+Na]+；Mp.151.9～152.8℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
2)C9H19CO-Arg(NO2)-Gly-OH的制备
将2.60g(5mmol)C9H19CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C9H19CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO4水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO4水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.98g(92.0％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)453.2[M+Na]+，883.4[2M+Na]+；Mp.171.3～172.9℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1)；
3)C9H19CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)2和2.26g(5.25mmol)C9H19CO-Arg(NO2)-Gly-OH制得3.44g(95％)黄色固体。经硅胶柱纯化得2.83g(78.1％)白色固体。ESI-MS(m/z)726.4[M+H]+，748.5[M+Na]+；Mp.93.2～95.3℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1)
4)C9H19CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备
将0..73g(1mmol)C9H19CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.46g(93％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)499.1[M-H]-，999.5[2M-H]-；Mp.150.0～151.3℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
实施例5
1)C11H23CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，1.1g(5.5mmol)C11H23COOH和2.01g(5mmol)HCl·H-Arg(NO2)-Gly-OBzl制得2.46g(90.1％)粗产品，为黄色固体。经硅胶柱纯化得2.30g(84.0％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)571.3[M+Na]+，1120.0[2M+Na]+；Mp.151.2～152.1℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
2)C11H23CO-Arg(NO2)-Gly-OH的制备
将2.74g(5mmol)C11H23CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C11H23CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO4水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO4水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.94g(84.6％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)481.3[M+Na]+，939.4[2M+Na]+；Mp.173.9～175.7℃；(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
3)C11H23CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)2和2.40g(5.25mmol)C11H23CO-Arg(NO2)-Gly-OH制得3.42g(91％)黄色固体。经硅胶柱纯化得2.86g(76.1％)白色固体。ESI-MS(m/z)754.4[M+H]+，776.4[M+Na]+；Mp.103.9～105.2℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1)
4)C11H23CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备
将0.76g(1mmol)C11H23CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.49g(94％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)527.7[M-H]-，528.6[M]-，1056.1[2M]-；Mp.156.9～158.3℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
实施例6
1)C13H27CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，1.25g(5.5mmol)C13H27COOH和2.01g(5mmol)HCl·H-Arg(NO2)-Gly-OBzl制得2.51g(87.2％)粗产品，为黄色固体。经硅胶柱纯化得2.31g(80.2％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)599.3[M+Na]+，176.0[2M+Na]+；Mp.156.8～157.6℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
2)C13H27CO-Arg(NO2)-Gly-OH的制备
将2.88g(5mmol)C13H27CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C13H27CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO4水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO4水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.94g(89％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)509.2[M+Na]+，995.8[2M+Na]+；Mp.178.0～179.2℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
3)C13H27CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)2和2.55g(5.25mmol)C13H27CO-Arg(NO2)-Gly-OH制得3.59g(92％)黄色固体。经硅胶柱纯化得2.84g(72.9％)，为白色固体。ESI-MS(m/z)782.3[M+H]+，804.5[M+Na]+；Mp.100.3～101.5℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1)
4)C13H27CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备
将0.79g(1mmol)C13H27CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.51g(93％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)555.8[M-H]-，1112.0[2M]-；Mp.163.1～164.0℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
实施例7
1)C15H31CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，1.40g(5.5mmol)C15H31COOH和2.01g(5mmol)HCl·H-Arg(NO2)-Gly-OBzl制得2.58g(85.7％)粗产品，为黄色固体。经硅胶柱纯化得2.46g(81.5％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)627.4[M+Na]+，1232.0[2M+Na]+；Mp.157.5～158.6℃；(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
2)C15H31CO-Arg(NO2)-Gly-OH的制备
将3.02g(5mmol)C15H31CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C15H31CO-Arg(NO2)-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO4水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO4水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到2.24g(87％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)537.3[M+Na]+，1051.7[2M+Na]+；Mp.178.0～178.8℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
3)C15H31CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)2和2.70g(5.25mmol)C15H31CO-Arg(NO2)-Gly-OH制得3.72g(92％)黄色固体。经硅胶柱纯化得2.94g(72.9％)，为白色固体。ESI-MS(m/z)810.5[M+H]+，832.5[M+Na]+；Mp.105.2～106.3℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
4)C15H31CO-Arg-Gly-Asp-OH的制备
将0.81g(1mmol)C15H31CO-Arg(NO2)-Gly-Asp(OBzl)2置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.14gPd/C(20％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.52g(90％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)583.7[M-H]-，584.7[M]-，1168.6[2M]-；Mp.163.3～164.5℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
实施例8
1)Boc-Gly-Gly-OBzl的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，由0.875g(5.0mmol)Boc-Gly-OH和1.685g(5.0mmol)ToSH·H-Gly-OBzl制得2.430g(94.8％)粗品，淡黄色油状物。经硅胶柱纯化得1.211g标题化合物，为白色粉末状固体。ESI-MS(m/z)345.4[M+Na]+，667.8[2M+Na]+.
2)HCl·H-Gly-Gly-OBzl的制备
将1.61g(5mmol)Boc-Gly-Gly-OBzl溶解在适量4mol/l氯化氢-乙酸乙酯溶液中，室温搅拌2小时，TLC(氯仿/甲醇)显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气。最后加少量乙醚将残留物研磨得1.05g(95％)粗产品，为无色固体，直接用于下一步反应。
3)C11H23CO-Gly-Gly-OBzl的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，1.1g(5.5mmol)C11H23COOH和1.29g(5mmol)HCl·H-Gly-Gly-OBzl制得1.874g(92.8％)粗产品，为黄色固体。经硅胶柱纯化得1.771g(87.7％)标题化合物，为白色固体。ESI-MS(m/z)427.6[M+Na]+，832.2[2M+Na+H]+.
4)C11H23CO-Gly-Gly-OH的制备
将2.02g(5mmol)C11H23CO-Gly-Gly-OBzl溶于10ml甲醇。冰浴下将得到的溶液用NaOH(2N)水溶液调pH至12并搅拌2h，TLC(氯仿/甲醇，10∶1)显示C11H23CO-Gly-Gly-OBzl消失。反应混合物用饱和KHSO4水溶液调pH至7，减压浓缩除甲醇。残留物用饱和KHSO4水溶液调pH至2，过滤不溶物。得到1.34g(85.6％)粗产品，为无色固体。ESI-MS(m/z)313.6[M-H]-，628.0[2M]-.
5)C11H23CO-Gly-Gly-Asp(OBzl)2的制备
按照Boc-Arg(NO2)Gly-OBzl的制备方法，2.43g(5mmol)HCl·H-Asp(OBzl)2和1.65g(5.25mmol)C11H23CO-Gly-Gly-OH制得2.78g(91.6％)黄色固体。经硅胶柱纯化得2.43g(80.0％)白色固体。ESI-MS(m/z)633.0[M+Na+H]+.
6)C11H23CO-Gly-Gly-Asp-OH的制备
将0.61g(1mmol)C11H23CO-Gly-Gly-Asp(OBzl)2置于100ml茄形瓶中、用甲醇溶解、加0.12gPd/C(20％)、通H2(0.02Mba)，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用石油醚研磨，得0.39g(92.1％)标题化合物，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)429.1[M]-；Mp.139.6～140.2℃；
(c1，MeOH∶CHCl3＝1∶1).
实施例9含CH3(CH2)10CORGD脂质体(D)的制备
薄膜分散法制备，取磷脂(80-99％，n/n)及所需RGD缀合物CH3(CH2)10CORGD(1-20％，n/n)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入所需量的PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径100～200nm，Zeta-Potential-20～-35mV。
实施例10含多西紫杉醇脂质体(F)的制备
薄膜分散法制备，取磷脂(70-99％，n/n)和所需多西紫杉醇(1-30％，n/n)至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入所需量的PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径100～200nm，Zeta-Potential-20～-35mV。
实施例11含CH3(CH2)6CORGD与多西紫杉醇脂质体(H)的制备
各组分的用量：多西紫杉醇1-30％；天然卵磷脂和CH3(CH2)6CORGD的混合物70-99％，该混合物中，天然卵磷脂80-99％(摩尔百分比)，整合素受体靶向锚点化合物1-20％(摩尔百分比)；
参照实施例1的制备方法，取磷脂和CH3(CH2)6CORGD及所需多西紫杉醇至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入所需量的PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径100～200nm，Zeta-Potential-20～-35mV。
实施例12含CH3(CH2)8CORGD与多西紫杉醇脂质体(I)的制备
各组分的用量：多西紫杉醇1-30％；天然卵磷脂和CH3(CH2)8CORGD的混合物70-99％，该混合物中，天然卵磷脂80-99％(摩尔百分比)，整合素受体靶向锚点化合物1-20％(摩尔百分比)；
参照实施例1的制备方法，取磷脂和CH3(CH2)8CORGD及所需多西紫杉醇至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入所需量的PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径100～200nm，Zeta-Potential-20～-35mV。
实施例13含CH3(CH2)10CORGD与多西紫杉醇脂质体(J)的制备
各组分的用量：多西紫杉醇1-30％；天然卵磷脂和CH3(CH2)10CORGD的混合物70-99％，该混合物中，天然卵磷脂80-99％(摩尔百分比)，整合素受体靶向锚点化合物1-20％(摩尔百分比)；
参照实施例1的制备方法，取磷脂和CH3(CH2)10CORGD及所需多西紫杉醇至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入所需量的PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径100～200nm，Zeta-Potential-20～-35mV。
实施例14含CH3(CH2)12CORGD与多西紫杉醇脂质体(K)的制备
各组分的用量：多西紫杉醇1-30％；天然卵磷脂和CH3(CH2)12CORGD的混合物70-99％，该混合物中，天然卵磷脂80-99％(摩尔百分比)，整合素受体靶向锚点化合物1-20％(摩尔百分比)；
参照实施例1的制备方法，取磷脂和CH3(CH2)12CORGD及所需多西紫杉醇至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入所需量的PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径100～200nm，Zeta-Potential-20～-35mV。
实施例15含CH3(CH2)14CORGD与多西紫杉醇脂质体(L)的制备
各组分的用量：多西紫杉醇1-30％；天然卵磷脂和CH3(CH2)14CORGD的混合物70-99％，该混合物中，天然卵磷脂80-99％(摩尔百分比)，整合素受体靶向锚点化合物1-20％(摩尔百分比)；
参照实施例1的制备方法，取磷脂和CH3(CH2)14CORGD及所需多西紫杉醇至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入所需量的PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径100～200nm，Zeta-Potential-20～-35mV。
实施例16含CH3(CH2)10COGGD与多西紫杉醇脂质体(M)的制备
各组分的用量：多西紫杉醇1-30％；天然卵磷脂和CH3(CH2)10CORGD的混合物70-99％，该混合物中，天然卵磷脂80-99％(摩尔百分比)，整合素受体靶向锚点化合物1-20％(摩尔百分比)；
参照实施例1的制备方法，取磷脂和CH3(CH2)10CORGD及所需多西紫杉醇至圆底烧瓶中以氯仿溶解，旋转蒸发去除溶剂，在瓶壁形成一层干燥透明的质膜，加入所需量的PBS磷酸盐缓冲液(0.01mol/L)，30℃超声分散20min。得具乳光的脂质体溶液，粒径100～200nm，Zeta-Potential-20～-35mV。
实验例17含CnH2n+1CO-RGD(n＝7，9，11，13，15)与多西紫杉醇脂质体的对S180腹水小鼠的治疗作用
取腹腔接种S180腹水瘤第八天的ICR种小鼠一只，脱颈椎处死，用75％酒精消毒后置于超净台内，用镊子夹起腹部中线偏右的皮肤并用小剪刀剪一小口至可见乳白色腹水流出。将吸管由开口处轻轻插入腹腔吸出腹水。吸得的腹水加到装有约3ml灭菌生理盐水的15ml的离心管中，使体积增至约10ml。用吸管轻轻吹气，使腹水与生理盐水混匀。试管加盖，1000转/分离心5分钟。弃去上清液后，加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀浮起，试管加盖，1000转/分离心5分钟，弃去上清液。试管底部有的乳白色的胶状物。往试管底部的乳白色胶状物中加9ml灭菌生理盐水，用吸管轻轻吹气，使瘤细胞均匀浮起。取100μl该悬浮液加至9.9ml灭菌生理盐水中，混匀，得100倍稀释液，混匀，加盖，放入冰中待用。取100μl上述瘤细胞稀释液置入Eppendoff小管中，加100μl台盼兰染液，混匀。取少许该混匀液加至计数板的计数池内，于显微镜下计算4个大格中被染上蓝色的存活瘤细胞的个数。将原液中的存活瘤细胞稀释成2.0×107个/ml，用于接种。在无菌条件下用1ml腹水瘤细胞接种液，用2％碘酒棉球和75％酒精棉球在雄性昆明种小鼠右侧腋下消毒。并注入0.2ml瘤细胞液，缓缓抽出针头。按此方法给每批昆明种小鼠接种，随机分组，放入动物室饲养。
药物配制：本实验共设15组：A：PBS溶液组；B：0.5M CMC-Na的PBS组；C：空白脂质体组；D：含RGD的空白脂质体组(实施例9所制备)；E：多西紫杉醇混悬液组；F：多西紫杉醇脂质体(实施例10所制备)组；G：多西紫杉醇注射液组；H：膜材中含有CH3(CH2)6CORGD的多西紫杉醇脂质体(实施例11所制备)组；I：膜材中含有CH3(CH2)8CORGD的多西紫杉醇脂质体(实施例12所制备)组；J：膜材中含有CH3(CH2)10CORGD的多西紫杉醇脂质体(实施例13所制备)组；K：膜材中含有CH3(CH2)12CORGD的多西紫杉醇脂质体(实施例14所制备)组；L：膜材中含有CH3(CH2)14CORGD的多西紫杉醇脂质体(实施例15所制备)组；M：膜材中含有CH3(CH2)10COGGD的多西紫杉醇脂质体(实施例16所制备)组；N：膜材中含有CH3(CH2)10CORGD的小剂量多西紫杉醇脂质体(实施例12所制备)组；O：膜材中含有CH3(CH2)10CORGD的大剂量多西紫杉醇脂质体(实施例12所制备)组；
药物混悬液制备：称取药物并研碎，加入两滴吐温80润湿，然后用0.5％CMC-Na制成混悬液。脂质体的分散体系为高温高压灭菌后的PBS缓冲溶液，阳性对照是多西紫杉醇的脂质体，阴性对照为空白脂质体。各组药物除第N组(膜材中含有膜材中含有CH3(CH2)10CORGD的小剂量多西紫杉醇脂质体组)以0.3mg/ml配制和第O组(膜材中含有膜材中含有CH3(CH2)10CORGD的大剂量多西紫杉醇脂质体组)以0.7mg/ml配制外，其余均以0.5mg/mL配制。
实验方法：将静息饲养两天的小鼠，右侧腋下接种腹水瘤后，随机分为15组，每组10只。接种后，于第1，3，5，7天尾静脉给药，每天尾静脉注射上述各组药物0.2ml。7天后将各组荷瘤小鼠处死，称体重和瘤重，按抑瘤率＝[(阴性对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重]×100％计算抑瘤率。获得的数据以(X±SD)表示，并做t检验。
结果见表1。结果D组的平均瘤重与C组相当，且无统计学意义，证明单纯的RGD膜材不能起到抑瘤的作用，而实际起作用的是以RGD为膜材所达到的靶向效果。E、F、G组抗肿瘤作用相当，但两两比较均无统计学意义。对H、I、J、K、L组进行统计学分析可以看出，其抗肿瘤活性高于F组多西紫杉醇脂质体组，且J、K、L组有极显著性差异(P＜0.01)，H、I组有显著性差异(P＜0.05)；H、I、J、K、L组的抗肿瘤活性高于G组多西紫杉醇注射液组，且J、K、L组有极显著性差异(P＜0.01)，H、I组有显著性差异(P＜0.05)，结果显示，含有脂肪酸RGD缀合物的多西紫杉醇靶向脂质体组具有优越的抗肿瘤活性。膜材中含有脂肪酸RGD缀合物的多西紫杉醇靶向脂质体组J组的抗肿瘤活性优于膜材中含有脂肪酸GGD对照化合物的脂质体组M组，且有极显著性差异(P＜0.01)，并且M组与F组多西紫杉醇脂质体组无统计学差异，表明脂质体M组没有靶向性，说明RGD肽缀合物作为整合素受体锚点化合物的必要性。含多西紫杉醇的小剂量组N组与大剂量组O组的抗肿瘤作用高于多西紫杉醇脂质体组，O组相对于多西紫杉醇脂质体组有极显著性差异(P＜0.01)，大、小剂量组与5mg/kg的剂量组虽有差异，但无统计学意义，说明在等量的RGD肽存在的情况下，多西紫杉醇靶向脂质体的给药剂量为3mg/kg时已具备很好的抗肿瘤活性。
表1不同制剂组对荷肉瘤S180小鼠的作用
*对比于多西紫杉醇脂质体对照组有显著性意义(P＜0.05)，**对比于多西紫杉醇脂质体组有极显著性意义(P＜0.01)。#对比于多西紫杉醇注射液组有显著性意义(P＜0.05)，##对比于多西紫杉醇注射液组有极显著性意义(P＜0.01)。
Claims (7)
1.一种具下式结构的两亲性靶向锚点化合物，
其中n＝6，8，10，12，14。
2.根据权利要求1的化合物，选自：CH3(CH2)6CORGD，CH3(CH2)8CORGD，CH3(CH2)10CORGD，CH3(CH2)12CORGD，CH3(CH2)14CORGD。
3.权利要求1的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按照常规液接肽技术合成保护基保护的RG；
(2)将保护基保护的Arg-Gly分别与CH3(CH2)6COOH、CH3(CH2)8COOH、CH3(CH2)10COOH、CH3(CH2)12COOH、CH3(CH2)14COOH偶联；
(3)将上述化合物与保护基保护的Asp按照常规液相接肽技术合成，脱去保护基，既得。
4.含有权利要求1的化合物的药物制剂组合物。
5.根据权利要求4的组合物，是含有磷脂的脂质体药物组合物。
6.根据权利要求4的组合物，其中含有多西紫杉醇。
7.权利要求4的组合物，其组成为，药物多西紫杉醇占摩尔百分比1-30％；药物载体和权利要求1化合物的混合物占摩尔百分比70-99％，该混合物中，药物载体占摩尔百分比80-99％，权利要求1化合物占摩尔百分比1-20％。
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