CN101906146B - 一根Arg-Gly-Asp-Ser链通过Asp与两根脂肪醇链的偶联物、它们的合成及在医学中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一根Arg-Gly-Asp-Ser链通过Asp与两根脂肪醇链的偶联物、它们的合成及在医学中的应用。本发明偶联物的通式为Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)nCH₃]-OCH₂(CH₂)nCH₃，其中n＝6、8、10或12。本发明偶联物除具有优秀的口服抗血栓活性外，还具有优秀的自组装性能，可作为制备微乳、脂质体等药物载体的制剂材料。

Description

一根Arg-Gly-Asp-Ser链通过Asp与两根脂肪醇链的偶联物、它们的合成及在医学中的应用

技术领域

本发明涉及多肽-脂肪醇偶联物，尤其涉及饱和脂肪链醇通过甲氧基与五肽的羧端偶联而得的偶联物，本发明还涉及该偶联物的合成方法以及该偶联物作为抗血栓剂、药物载体材料的应用，属于生物医药领域。

背景技术

在未来的5年到10年基因治疗会有可把基因传送至细胞的理想载体。从生物制剂的立场看，基因转导系统就是药物释放系统(DDS)。有多种化学合成的小分子构建的基因转导系统受到关注，其中阳离子脂质构成的基因转导系统是关注热点。阳离子脂质在药学领域遍用于构建脂质体运载小分子(包括多肽)药物。与在DDS中一样，在基因转导系统中阳离子脂质体有明显好处，例如可通过电荷吸附与DNA形成复合物并有效避免被细胞内溶酶体降解、可将DNA高效导入细胞、对DNA的尺寸没有限制、操作简便等。阳离子脂质的基本构造如下：

阳离子脂质的基本构造

包括高级脂肪链构成的疏水臂和亲水的阳离子头。

细胞黏附在细胞黏附性疾病(癌转移、血栓形成、化学致炎和骨质疏松)的发展过程中起关键作用。调节性糖蛋白例如RGD肽与整合素受体有很强的结合能力，可参与细胞黏附过程。例如RGD肽与血小板、肿瘤细胞及骨基表面的GP IIb/IIIa受体特异性结合可干预血栓、癌转移和骨质疏松的发展过程。RGD肽的这种作用赋予了含RGD序列的化合物一种重要性质，即含RGD序列的化合物可以向血栓、癌转移和骨质疏松的患病部位富集。在这样一个前提下，把RGD肽与高级脂肪链偶联，便可以得到一根Arg-Gly-Asp-Ser链通过Asp与两根脂肪醇链的偶联物。

发明内容

本发明目的之一是提供以下通式的偶联物：Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)nCH₃]-OCH₂(CH₂)nCH₃，其中n＝6、8、10或12，。

本发明目的之二是提供一种合成上述偶联物的方法。

一种合成上述偶联物的方法，包括以下步骤：

把饱和脂肪链醇CH₃(CH₂)nCH₂OH通过甲氧基与Arg-Gly-Asp-Ser-Asp五肽的羧端偶联，即得；其中n选自6、8、10或12。

优选的，一种合成上述偶联物的方法，包括以下步骤：

(1)、将叔丁氧羰基保护的天冬氨酸分别与CH₃(CH₂)₆CH₂OH、CH₃(CH₂)₈CH₂OH、CH₃(CH₂)₁₀CH₂OH、CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH偶联；

(2)、脱去步骤(1)所得偶联物的叔丁氧羰基；

(3)、将叔丁氧羰基保护的丝氨酸与步骤(2)所得产物偶联；

(4)、脱去步骤(3)所得偶联物的叔丁氧羰基；

(5)、将N端叔丁氧羰基保护侧链苄氧基保护的天冬氨酸与步骤(4)所得产物偶联；

(6)、脱去步骤(5)所得偶联物的叔丁氧羰基；

(7)、将N端叔丁氧羰基保护侧链硝基保护的精氨酸与苄氧基保护的甘氨酸偶联；

(8)、将(6)与(7)所得产物偶联；脱除保护基，即得。

本发明结合了下述认识或依据完成了上述技术方案。把基因传送至细胞的理想载体(基因转导系统)是基因治疗的关键任务之一；从生物制剂的立场看基因转导系统与药物释放系统(DDS)具有等同性；虽然有多种化学合成的小分子构建的基因转导系统都受到关注但是阳离子脂质构成的基因转导系统应格外给予关注；阳离子脂质体可通过电荷吸附与DNA形成复合物并有效避免被细胞内溶酶体降解；阳离子脂质体可将DNA高效导入细胞、阳离子脂质体对DNA的尺寸没有限制；血小板、炎症组织、癌细胞和骨基质表明富含可识别RGD序列的细胞黏附受体，含RGD序列的化合物可以向血栓、炎症、癌转移和骨质疏松的患病部位富集。

本发明人基于上述认识，把饱和脂肪链醇CH₃(CH₂)nCH₂OH(n选自6、8、10或12)通过甲氧基与Arg-Gly-Asp-Ser-Asp肽的羧端偶联，使制得的分子获得四种性能，即依赖于饱和脂肪链醇CH₃(CH₂)nCH₂OH(n选自6、8、10、12)的疏水性、依赖于RGD肽的胍基和α-氨基质子化形成的阳离子性质和亲水，依赖于RGD肽对GP IIb/IIIa受体特异亲和作用获得的靶向性。

在大鼠血栓形成模型上的评价表明，本发明偶联物具有优秀的口服抗血栓活性，可作为抗血栓剂应用；在水相检测了这4种偶联物自组装成为纳米颗粒的性能，试验结果表明，本发明偶联物具有优秀的自组装性能，可作为制备微乳、脂质体等的制剂材料。因为本发明偶联物的抗血栓活性来自RGD肽对GP IIb/IIIa受体特异亲和作用，所以这种抗血栓活性又表征了其靶向性，可作为靶向制剂材料。

本发明的又一目的是提供一种含有本发明偶联物的药物组合物，该药物组合物由治疗上有效剂量的本发明偶联物与药学上可接受的赋型剂或者辅加剂组成；即：将有效量的本发明偶联物与药学上可接受的载体或稀释剂配合后，按本领域常规的制剂方法将其制备成任意一种适宜的药物组合物。通常该组合物适合于口服给药和注射给药，也适合其他的给药方法。该组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂，或口服液等液体制剂形式。根据不同的给药方法，本发明药物组合物可以含有0.1％-99％重量，优选10-60％重量的本发明偶联物。

附图说明

图1本发明偶联物的合成路线图；i)DCC，HOBt，NMM；ii)4N HCl-EtOAc；iii)H₂，Pd/C；其中n＝6，8，10或12。

图2由透射电镜描述的本发明代表性化合物在水相组装的纳米球。

图3由扫描电镜描述的本发明代表性化合物在水相组装冻干后的纳米粒状态。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备

将Boc-Arg(NO₂)1.60g(5mmol)溶于20ml无水THF，冰浴条件下加入N-羟基苯并三氮唑(HOBt)0.68g(5mmol)，并使完全溶解，10分钟后加入二环己基羰二亚胺(DCC)1.07g(6mmol)，搅拌30min，得到反应液(i)。冰浴条件下将Gly-OMe 0.53(6mmol)悬浮于20ml无水THF中，加入1ml N-甲基吗啉(NMM)，调pH 8-9。搅拌30min，得到反应液(ii)，加至反应液(i)中，冰浴搅拌1h，再室温搅拌12h，TLC(氯仿∶甲醇＝10∶1)显示Boc-Arg(NO₂)消失。滤除二环己基脲(DCU)，减压蒸去THF。残留物用50ml乙酸乙酯溶解，所得溶液依次用5％NaHCO₃水溶液，饱和NaCl水溶液，5％KHSO₄水溶液洗，饱和NaCl水溶液，饱和NaHCO₃水溶液、饱和NaCl水溶液洗三次，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥，过滤除干燥剂，滤液减压浓缩至干，得到标题化合物1.78g(收率91.3％)。Rf＝0.39(氯仿∶甲醇＝10∶1).ESI-MS(m/z)：391[M+H]⁺.

Boc-Arg(NO₂)-Gly的制备

将Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe 1.95g(5mmol)溶于10ml甲醇。冰浴下将所得溶液用2N NaOH水溶液调pH12并搅拌2h，TLC(氯仿∶甲醇＝15∶1)显示Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe消失。反应混合物用饱和KHSO₄水溶液调pH7，减压浓缩除去甲醇。残留溶液用饱和KHSO₄水溶液调pH2，乙酸乙酯萃取(30ml×3)。合并的乙酸乙酯相用饱和NaCl水溶液洗至中性，无水Na₂SO₄干燥。过滤，滤液减压浓缩至干，得标题化合物无色固体1.80g(收率95.8％)。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-2.16(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ Rf＝0.12(氯仿∶甲醇＝2∶1).ESI-MS(m/z)：375[M-H]⁺.

实施例1Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(9a)的制备

1)Boc-Asp[-OCH₂(CH₂)₆]-OCH₂(CH2)₆(1a)CH₃的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由1.165g(5mmol)Boc-Asp和1.430g(11mmol)正辛醇得标题化合物2.158(94.45％)，为无色油状液体。ESI-MS(m/z)：459[M+H]⁺。

2)Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(2a)的制备

将0.458g(1.0mmol)Boc-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃溶解在8ml 4mol/L氯化氢-乙酸乙酯溶液中，冰浴条件下搅拌2小时，TLC显示原料点消失，减压浓缩除去乙酸乙酯，残留物反复加少量乙醚进行减压浓缩以除去氯化氢气体。最后加少量乙醚将残留物研磨即得标题化合物0.390g(98.78％)，为固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：359[M+H]⁺。

3)Boc-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(3a)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由1.490g(5.05mmol)Boc-Ser(Bzl)和1.968g(5mmol)Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃得标题化合物2.862g(90.19％)，为无色油状液体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=11.41(C=0.9,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ ESI-MS(m/z)：636[M+H]⁺.

4)Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(4a)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，由0.635g(1mmol)Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃制得标题化合物0.559g(97.87％)，为淡黄色固体。ESI-MS(m/z)：535[M+H]⁺.

5)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(5a)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMel的制备方法由0.323g(1mmol)Boc-Asp(OBzl)和0.571g(1mmol)Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃为原料，得标题化合物0.690g(82.10％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=15.80(C=0.85,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ ESI-MS(m/z)：841[M+H]⁺.

6)Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂[CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(6a)的制备

按照Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，0.840g(1mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃制得标题化合物0.759g(97.63％)，为无色粉末状固体。ESI-MS(m/z)：741[M+H]⁺.

7)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH3]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(7a)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe制备方法由1.880g(5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH3]-OCH₂(CH₂)₆CH₃3.530g(4.54mmol)制得标题化合物粗品，干法拌样后柱层析分离，再经板层析分离得标题化合物2.935g(58.83％)，为无色固体。ESI-MS(m/z)：1099[M+H]⁺. ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-5.75(C=1.75,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ M.p.122-123℃.

8)Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH3]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(8a)的制备

Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃1.098g(1mmol)置于50ml茄形瓶中，用甲醇溶解，加20mgPd/C(5％)、通H₂，室温搅拌至原料点消失。滤除Pd/C、滤液减压浓缩至干，残留物反复用乙醚研磨得标题化合物0.80g(91.64％)，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)：874[M-H]⁺.

9)Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃(9a)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，从Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH3]-OCH₂(CH₂)₆CH₃0.875g(1mmol)制得Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃0.702g(90.76％)，为无色粉末状固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-9.02(C=0.75,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ M.p.：110-111℃.ESI-MS(m/z)：774[M+H]⁺.

实施例2Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(9b)的制备

1)Boc-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(1b)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由1.165g(5mmol)Boc-Asp和1.738g(11mmol)正十醇得标题化合物2.534(98.79％)，为无色油状液体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-14.80(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ Rf＝0.53(石油醚∶丙酮＝7∶1).ESI-MS(m/z)：514[M+H]⁺.

2)Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(2b)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，0.513g(1mmol)Boc-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃制得到标题化合物0.448g(99.77％)，为固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：414[M+H]⁺。

3)Boc-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(3b)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由0.325g(1.1mmol)Boc-Ser(Bzl)和0.449g(1mmol)Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃得标题化合物0.685g(99.28％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=1.97(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ Rf＝0.49(石油醚∶丙酮＝4∶1).ESI-MS(m/z)：691[M+H]⁺.

4)Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(4b)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，由0.690g(1mmol)Boc-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃制得标题化合物0.604g(96.47％)，为淡黄色固体。ESI-MS(m/z)：591[M+H]⁺.

5)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(5b)的制备按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由0.485g(1.5mmol)Boc-Asp(OBzl)和1.774g(1.36mmol)Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃为原料，得标题化合物1.195g(98.20％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-11.37(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ m.p.：44-46℃.Rf＝0.22(石油醚∶丙酮＝4∶1).ESI-MS(m/z)：918[M+Na]⁺.

6)Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(6b)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，1.195g(1.3mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃制得到标题化合物1.081g(100.00％)，为无色粉末状固体。ESI-MS(m/z)：796[M+H]⁺。

7)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(7b)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe制备方法由0.564g(1.5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃1.080g(1.3mmol)制得标题化合物粗品，干法拌样后柱层析分离，再经板层析分离得标题化合物1.152g(76.88％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-18.43(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ M.p 112-114℃.Rf＝0.35(氯仿∶甲醇＝20∶1).ESI-MS(m/z)：1176[M+Na]⁺.

8)Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(8b)的制备

按照Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃制备方法由Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃0.577g(0.5mmol)得标题化合物0.431g(92.89％)，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)：927[M-H]⁺

9)Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃(9b)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，由Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH₃0.400g(0.4mmol)制得Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₈CH₃]-OCH₂(CH₂)₈CH 0.295g(89.12％)，为无色粉末状固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-16.60(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ M.p.：164-165℃.Rf＝0.21(正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶1).ESI-MS(m/z)：829[M+H]⁺.

实施例3Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(9c)的制备

1)Boc-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(1c)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由1.165g(5mmol)Boc-Asp和2.046g(11mmol)正十二醇得标题化合物2.803(98.52％)，为无色油状液体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-8.93(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ Rf＝0.45(石油醚∶丙酮＝5∶1).ESI-MS(m/z)：592[M+H]⁺.

2)Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(2c)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，0.569g(1mmol)Boc-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得到标题化合物0.500g(98.81％)，为固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：470[M+H]⁺.

3)Boc-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(3c)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由0.325g(1.1mmol)Boc-Ser(Bzl)和0.506g(1mmol)Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃得标题化合物0.685g(99.28％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=3.37(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ M.p.：48-51℃.Rf＝0.50(石油醚∶丙酮＝3∶1).ESI-MS(m/z)：770[M+Na]⁺.

4)Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(4c)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，由0.747g(1_mmol)Boc-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得标题化合物0.654g(95.75％)，为淡黄色固体。ESI-MS(m/z)：647[M+H]⁺.

5)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(5c)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由0.485g(1.5mmol)Boc-Asp(OBzl)和0.930g(1.36mmol)Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃为原料，得标题化合物1.281g(98.92％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-6.77(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ M.p.：40-41℃.Rf＝0.50(石油醚∶丙酮＝2∶1).ESI-MS(m/z)：975[M+Na]⁺.

6)Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(6c)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃，从1.005g(1.06mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃制得到标题化合物0.940g(99.79％)，为无色粉末状固体。ESI-MS(m/z)：853[M+H]⁺

7)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(7c)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe制备方法由0.564g(1.5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃1.156g(1.3mmol)制得标题化合物粗品，干法拌样后柱层析分离，再经板层析分离得标题化合物1.269g(80.67％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-8.90(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ M.p.：106-108℃.Rf＝0.47(氯仿∶甲醇＝10∶1).ESI-MS(m/z)：1233[M+Na]⁺.

8)Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(8c)的制备

按照Asp[-OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法由Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃0.605g(0.5mmol)得标题化合物0.444g(90.06％)，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)：984[M-H]⁺.

9)Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃(9c)的制备

按照Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，从Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃0.591g(0.6mmol)制得Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₀CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₀CH₃0.478g(90.02％)，为无色粉末状固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-12.17(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ m.p.：188-190℃，Rf＝0.22(正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶1).ESI-MS(m/z)：886[M+H]⁺.

实施例4Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(9d)的制备

1)Boc-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(1d)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMel的制备方法由1.165g(5mmol)Boc-Asp和2.354g(11mmol)正十四醇得标题化合物2.998(95.94％)，为无色固体。M.p.28-30℃ ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-5.67(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ Rf＝0.57(石油醚∶丙酮＝7∶1).ESI-MS(m/z)：648[M+Na]⁺.

2)Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(2d)的制备

按照Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，0.625g(1mmol)Boc-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得到标题化合物0.561g(99.85％)，为固体粉末，直接用于下一步反应。ESI-MS(m/z)：526[M+H]⁺。

3)Boc-Ser(Bzl)-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(3d)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由0.325g(1.1mmol)Boc-Ser(Bzl)和0.562g(1mmol)Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃得标题化合物0.685g(99.28％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=1.63(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ Mp 35-37℃.Rf＝0.51(石油醚∶丙酮＝4∶1).ESI-MS(m/z)：826[M+Na]⁺.

4)Ser(Bzl)-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(4d)的制备

按照Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，由0.803g(1mmol)Boc-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得标题化合物0.704g(95.26％)，为淡黄色固体。ESI-MS(m/z)：703[M+H]⁺.

5)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(5d)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe的制备方法由0.485g(1.5mmol)Boc-Asp(OBzl)和0.955g(1.36mmol)Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃为原料，得标题化合物1.351g(98.54％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-6.07(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ M.p.43-45℃.Rf＝0.43(石油醚∶丙酮＝3∶1).ESI-MS(m/z)：1031[M+Na]⁺.

6)Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(6d)的制备

按照Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，1.109g(1.1mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃制得到标题化合物1.031g(99.04％)，为无色粉末状固体。ESI-MS(m/z)：909[M+H]⁺.

7)Boc-Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(7d)的制备

按照Boc-Arg(NO₂)-Gly-OMe制备方法由0.564g(1.5mmol)Boc-Arg(NO₂)-Gly和Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃1.156g(1.3mmol)制得标题化合物粗品，干法拌样后柱层析分离，再经板层析分离得标题化合物1.247g(75.76％)，为无色固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-9.60(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}).$ Mp：115-116℃.Rf＝0.47(氯仿∶甲醇＝20∶1).ESI-MS(m/z)：1267[M+H]⁺.

8)Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(8d)的制备

按照Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法由Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃0.760g(0.6mmol)得标题化合物0.5984g(95.83％)，为无色固体粉末。ESI-MS(m/z)：1039[M-H]⁺.

9)Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃(9d)的制备

按照Asp[OCH₂(CH₂)₆CH₃]-OCH₂(CH₂)₆CH₃的制备方法，从Boc-Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃0.312g(0.3mmol)制得Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH 0.257g(91.04％)，为无色粉末状固体。 ${\left[\mathrm{\α}\right]}_D^{20}=-20.90(C=1,{\mathrm{CH}}_3\mathrm{OH}),$ M.p.：192-194℃.Rf＝0.23(正丁醇∶冰醋酸∶水＝4∶1∶1).ESI-MS(m/z)：942[M+H]⁺.

试验例1本发明化合物口服给药的抗血栓活性试验

1)给药剂量

阿司匹林和本发明化合物在给药前分别配制成生理盐水溶液。分为三组，空无对照组、阿司匹林组和试验组，其中，空无对照组口服给予生理盐水(剂量为3ml/kg)、阿司匹林组口服给予阿司匹林的生理盐水溶液(剂量为12mg/kg，66umol/kg)、试验组口服给予本发明化合物的生理盐水溶液(剂量为1nmol/kg)。

2)大鼠手术与器械

Wistar大鼠(雄性，190～210g)按1.2g/kg剂量腹腔注射乌拉坦溶液进行麻醉。麻醉大鼠仰卧位固定，分离右颈总动脉，左侧静脉端，各自于近心端夹动脉夹，近心端和远心端分别穿入手术线，将远心端的手术线结扎，准备插管。

3)插管

插管为硅烷化过的聚乙烯胶管，分三段，中段为聚乙烯胶管，长60.0mm，内径3.5mm；两端为相同的聚乙烯管，管长100.0mm，内径1.0mm，外径2.0mm该管的一端拉成尖管(用于插入大鼠颈动脉或静脉)，外径为1.0mm。将编好号的EP管中分别装入6cm长的黑色手术线，称重；然后取出丝线，按照编号放入准备好的插管的中段较粗的插管中。

灌胃给药30分钟后，大鼠用20％乌拉坦溶液(0.7ml/100g)麻醉后分离右颈动脉和左颈静脉，夹闭右侧颈动脉，动脉远心端结扎，将插管充满肝素钠的生理盐水溶液(84mg/200ml生理盐水)，一端插入左侧静脉，另一端用注射器加入定量肝素钠抗凝后，插入右侧动脉，打开动脉夹，使血液开始循环。15分钟后取出附有血栓的丝线放回相应EP管并记录重量，以生理盐水(NS，3ml/kg)作空白对照，以阿司匹林(60mg/15ml，3ml/kg)作阳性对照。此过程中插管中央的粗管中的丝线上会因为血液循环而产生血栓。

4)血栓称重

计时开始15分钟后，剪断动静脉插管，停止循环，用眼科镊小心取出丝线，在滤纸上轻轻蘸掉血滴，放入事先称重好的EP管中，精确称重并记录。计算出血栓的湿重。每个药品重复10次给药。统计各组的血栓湿重(X±SD)，并做t检验。

5)结果

结果列入表1。结果表明，在1nmol/kg剂量下本发明的化合物有很好的抗血栓活性。可见，本发明化合物都是优秀的抗血栓剂。

表1本发明化合物经口服给药的抗血栓活性评价

化合物	血栓湿重( ±SD mg)
		NS	32.74±2.98
阿司匹林	14.43±2.90a
		9a	22.57±3.67a
9b	20.97±3.87a
		9c	20.06±4.72a
9d	18.35±4.19a

n＝10；NS＝生理盐水；a与生理盐水组相比，P＜0.01；

试验例2本发明化合物在水相中组装成为纳米球试验

1)本发明4种阳离子药质体按照10^-3mol/L的浓度配置成为水溶液，在激光散射纳米粒度仪(ZetaPlus JEM-1230)上连续测定8天，观察粒径大小及其稳定性，结果见表2和表3。得到的数据表明，这4种阳离子药质体在水相中可以自组装成为稳定的纳米球，因而是优秀的微乳和脂质体药物的制备材料。

表2本发明的4种阳离子药质体在水中自组装成为纳米球的粒径

化合物	粒径(nm)
		9a	157
9b	119
		9c	210
9d	123

表3本发明的4种阳离子药质体在水中自组装成为纳米球的粒径稳定性

2)按照透射电镜的测定要求，配置4种偶联物的水溶液，置于铜网上挥发干后测定本发明的化合物在水相组装的纳米球的图。结果表明，由这4种偶联物组装的纳米球在透射电镜下可以看到均匀的粒状态。这里给出的是代表性化合物Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃的透射电镜图(图2)

3)按照扫描电镜的测定要求，配置4种偶联物的水溶液，冷冻干燥后测定本发明的化合物的微观结构和粒径。结果表明，由这4种偶联物组装的纳米粒在扫描电镜下可以看到均匀的棒状态。这里给出的是代表性化合物Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃]-OCH₂(CH₂)₁₂CH₃的扫描电镜图(图3)

Claims (6)

1.下述通式的偶联物：Arg-Gly-Asp-Ser-Asp[OCH₂(CH₂)nCH₃]-OCH₂(CH₂)nCH₃，其中n＝6、8、10或12。

2.一种合成权利要求1所述的偶联物的方法，包括以下步骤：把饱和脂肪链醇CH₃(CH₂)nCH₂OH中的CH₃(CH₂)n基团通过其后的CH₂OH与Arg-Gly-Asp-Ser-Asp五肽羧端通过形成甲氧基进行偶联，即得；其中n选自6、8、10或12。

3.一种合成权利要求1所述的偶联物的方法，包括以下步骤：

(1)、将叔丁氧羰基保护的天冬氨酸分别与CH₃(CH₂)₆CH₂OH、CH₃(CH₂)₈CH₂OH、CH₃(CH₂)₁₀CH₂OH、CH₃(CH₂)₁₂CH₂OH偶联；

(2)、脱去步骤(1)所得偶联物的叔丁氧羰基；

(3)、将叔丁氧羰基保护的丝氨酸与步骤(2)所得产物偶联；

(4)、脱去步骤(3)所得偶联物的叔丁氧羰基；

(5)、将N端叔丁氧羰基保护侧链苄氧基保护的天冬氨酸与步骤(4)所得产物偶联；

(6)、脱去步骤(5)所得偶联物的叔丁氧羰基；

(7)、将N端叔丁氧羰基保护侧链硝基保护的精氨酸与苄氧基保护的甘氨酸偶联；

(8)、将(6)与(7)所得产物偶联；脱除保护基，即得。

4.一种抗血栓药物组合物，其特征在于：由治疗或预防上有效量的权利要求1所述的偶联物和药学上可接受的载体或辅料所组成。

5.权利要求1所述的偶联物在制备抗血栓药物中的用途。

6.权利要求1所述的偶联物制备微乳、脂质体药物的制剂材料中的用途。

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