CN105687137A - 叶酸受体靶向的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物及其制备方法和应用 - Google Patents

叶酸受体靶向的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉药物制剂领域，具体涉及叶酸受体靶向的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物及其制备方法和应用。5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物组成包括药物脂质体和叶酸，其中药物脂质体包括5-氟尿嘧啶、阳离子类脂和胆固醇，阳离子类脂与5-氟尿嘧啶的质量比为5:1～20:1；药物脂质体和叶酸的质量比为10:1～40:1。本发明的5-氟尿嘧啶/叶酸复合脂质体具有对药物的高包封率，脂质体的粒径范围在100～250nm，有效提高药物的转运效率。本发明的5-氟尿嘧啶/叶酸复合脂质体药物的制备方法简单、高效，制备出的复合脂质体毒性低、转染率高，在物理学表征和体外生物学研究中均已得到了良好的评价效果，安全高效、靶向性强、可用于联合转运，为抗癌药物的研究开发提供了新的途径。

Description

叶酸受体靶向的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉药物制剂领域，具体涉及叶酸受体靶向的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物及其制备方法和应用。
背景技术
以5-氟尿嘧啶(5-Fu)为代表的氟尿嘧啶类药物在临床上应用了40多年，对消化道癌及其它实体肿瘤有较好疗效[1]。5-Fu一般通过静脉注射给药，但5-Fu经静脉注入血液后半衰期短，且有较严重的骨髓抑制及胃肠反应的毒副作用[2]。因此，对5-Fu进行修饰改性及用脂质体包封缓释释放等方面的研究也较多。
脂质体作为一种非病毒载纳米载体材料具有适合体内降解、毒性低和无免疫原性、提高药物生物利用度、降低药物毒副作用等优点[3-4]。其作为药物载体已有30多年的历史，脂质体作为给药载体可以有效的实现药物的靶向，提高药物的局部保存浓度，延长药物作用时间，增强对肿瘤的杀伤力，减少对正常细胞的毒副作用等。
目前，抗肿瘤药物的靶向细胞递送受到广泛关注，大量研究结果表明，多数肿瘤细胞表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞[5-6]，并且叶酸(folicacid，FA)对叶酸受体具有高度亲和性，因此可将抗肿瘤药物与FA偶联，经叶酸受体介导靶向递送到这些肿瘤细胞中。而且FA作为靶向分子具有许多独特的优点，如相对分子质量小、无免疫原性、价廉易得、稳定性好、与药物分子或载体之间的化学键合简单易行，靶向应用范围广泛等[7]。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种叶酸受体靶向的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物及其制备方法和应用。本发明的复合脂质体药物毒性低，转染率高，能有效克服肿瘤细胞的耐受性。
发明构思是：本发明以氨基甲酸酯型阳离子类脂为主要材料制备脂质体，采用薄膜分散超声方法实现阳离子脂质体对5-氟尿嘧啶的有效包封，经过叶酸靶向修饰制备成靶向脂质体药物，最终得到5-氟尿嘧啶脂质体与叶酸的纳米尺寸的新型复合药物制剂。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物，其组成包括药物脂质体和叶酸，其中药物脂质体包括5-氟尿嘧啶、阳离子类脂和胆固醇，阳离子类脂与5-氟尿嘧啶的质量比为5:1～20:1；药物脂质体和叶酸的质量比为10:1～40:1。
优选的，所述的阳离子类脂与药物脂质体的质量比为10:1～20:1，更优选的，阳离子类脂与5-氟尿嘧啶的质量比为10:1。
优选的，所述的药物脂质体和叶酸的质量比为20:1。
所述阳离子类脂为氨基甲酸酯型阳离子类脂。
进一步的，所述氨基甲酸酯型阳离子类脂具有通式Ⅰ的结构:
其中，R1为(CH2)11CH3；
R2为CH3、CH2CH3；
X为Cl、Br、I。
优选的，所述氨基甲酸酯型阳离子类脂为：N-[1-(2,3-含氧十二烷基氨基甲酰)丙基]-N,N,N-三甲基色氨酸铵碘化物。
本发明的第二个目的是请求保护上述5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物的制备方法，具体包括如下步骤：
①5-氟尿嘧啶脂质体的制备：将阳离子类脂和胆固醇溶解在有机溶剂中，超声充分溶解，用氮气吹膜，真空干燥过夜；按阳离子类脂与5-氟尿嘧啶的质量比为5:1～20:1称取5-氟尿嘧啶，溶于磷酸盐缓冲液，加入到附有干燥薄膜的管内，常压水浴，得脂质体混悬液；将脂质体混悬液反复超声震荡至澄清，制得5-氟尿嘧啶脂质体；阳离子类脂和胆固醇可以按照摩尔比1:1～6:1的比例制得，优选方式下阳离子类脂和胆固醇的摩尔比3:1。
②5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物的制备：将步骤①得到的5-氟尿嘧啶脂质体与叶酸按质量比10:1～40:1混合，室温超声混匀，孵育，制得5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物。
优选的，步骤①所述的水浴条件为：45～55℃水浴1.5～2h；步骤②所述孵育条件为：45～55℃孵育15～20min。
优选的，所述的磷酸盐缓冲液pH值为7.4。
本发明第三个目的是请求保护上述5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物在抗癌、抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供一种新的能同时装载药物和复合叶酸的复合靶向脂质体，本发明的复合脂质体采用新型阳离子类脂，极好的降低了构建脂质体的细胞毒性。在制备5-氟尿嘧啶脂质体时通过优化阳离子类脂与胆固醇的配比，减小了5-氟尿嘧啶脂质体的粒径。再经过叶酸对5-氟尿嘧啶脂质体的靶向修饰后，还可实现对肿瘤细胞的靶向性。
本发明的5-氟尿嘧啶/叶酸复合脂质体具有对药物的高包封率，实验结果表明，本发明的复合脂质体对5-氟尿嘧啶包封率均大于70％。另外本发明的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体的粒径范围100-250nm，有利于通过胞饮作用进入细胞，有效提高药物的转运效率，是现有技术未能达到的效果。本发明的5-氟尿嘧啶/叶酸复合脂质体药物的制备方法简单、高效，制备出的复合脂质体毒性低、转染率高，在物理学表征和体外生物学研究中均已得到了良好的评价效果，安全高效、靶向性强、可用于联合转运，为抗癌药物的研究开发提供了新的途径。
附图说明
图1为5-氟尿嘧啶/叶酸复合脂质体粒径检测图；
图2为5-氟尿嘧啶/叶酸复合脂质体物zeta电位检测图；
图3为5-氟尿嘧啶标准品、5-氟尿嘧啶脂质体和空白脂质体共有最大吸收波长扫描图；
图4为标准曲线；
图5为紫外分光光度计–透析法测定DDCTMA-5-Fu10/1最大吸收波长处吸光值(A)扫描图，其中I为DDCTMA空白脂质体扫描曲线；II为DDCTMA-5-Fu10/1扫描曲线；
图6为TEM检测分析图，其中A为DDCTMA脂质体TEM检测分析图；B为DDCTMA-5-Fu10/1TEM检测分析图；C为10FA-DDCDMA-5-Fu10/1TEM检测分析图；
图7为5-氟尿嘧啶/叶酸复合脂质体转染过程中对叶酸受体(FR)阳性表达率较高的人非小细胞肺癌细胞系(H460)细胞毒性的测定结果；
图8为流式细胞仪检测细胞凋亡结果分析图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做详细描述，但不用于限制本发明的保护范围，如无特殊说明，本发明所涉及化学试剂及药品均市售可得，如无特殊说明，所涉及的方法均为常规方法。
一、制备5-Fu脂质体
实施例1
称量一定质量的新型阳离子类脂DDCTMA，DDCTMA与胆固醇摩尔比3/1溶于1mL三氯甲烷中，室温超声5min～10min使其充分溶解，氮气吹膜，真空干燥过夜。按DDCTMA与5-Fu质量比为5:1称取5-Fu，溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，加入到附有干燥薄膜的管内，常压下45～55℃水浴1.5～2h，制得脂质体混悬液。55℃反复超声震荡至澄清，制得5-Fu脂质体(DDCTMA-5-Fu5/1)。
实施例2
称量一定质量的新型阳离子类脂DDCTMA，DDCTMA与胆固醇摩尔比3/1溶于1mL三氯甲烷中，室温超声5～10min使其充分溶解，氮气吹膜，真空干燥过夜。按DDCTMA与5-Fu质量比为10:1称取5-Fu，溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，加入到附有干燥薄膜的管内，常压下45～55℃水浴1.5～2h，制得脂质体混悬液。55℃反复超声震荡至澄清，制得5-Fu脂质体(DDCTMA-5-Fu10/1)。
实施例3
称量一定质量的新型阳离子类脂DDCTMA，DDCTMA与胆固醇摩尔比3/1溶于1mL三氯甲烷中，室温超声5～10min使其充分溶解，氮气吹膜，真空干燥过夜。按DDCTMA与5-Fu质量比为15:1称取5-Fu，溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，加入到附有干燥薄膜的管内，常压下45～55℃水浴1.5～2h，制得脂质体混悬液。55℃反复超声震荡至澄清，制得5-Fu脂质体(DDCTMA-5-Fu15/1)。
实施例4
称量一定质量的新型阳离子类脂DDCTMA，DDCTMA与胆固醇摩尔比3/1溶于1mL三氯甲烷中，室温超声5min～10min使其充分溶解，氮气吹膜，真空干燥过夜。按DDCTMA与5-Fu质量比为20:1称取5-Fu，溶于pH值为7.4的磷酸盐缓冲液，加入到附有干燥薄膜的管内，常压下45～55℃水浴1.5～2h，制得脂质体混悬液。55℃反复超声震荡至澄清，制得5-Fu脂质体(DDCTMA-5-Fu20/1)。
二、5-Fu脂质体包封率的测定
实施例5
①测定波长的选择
以超纯水作为参比，用紫外分光光度计分别对5-Fu标准液(100μg·mL-1)、5-Fu检测液(100μg·mL-1)和空白对照液(100μg·mL-1)进行波长扫描，并确定最佳测定波长。从图3可以看出5-Fu标准品和5-Fu脂质体在265nm处有共有最大吸收波长，而空白脂质体对照液在此波长范围内吸收较小，可忽略其对5-Fu的最大吸收波长的影响，故选择的测定波长为265nm。
②标准曲线的建立
配制浓度分别为2μg·mL-1、4μg·mL-1、6μg·mL-1、8μg·mL-1、10μg·mL-1、12μg·mL-1、14μg·mL-1、16μg·mL-1的5-Fu标准液。用紫外分光光度计在最大吸收波长处以超纯水为参比测定各溶液的吸光值(A)，并作出标准曲线。由图4可以得到标准曲线为C＝16.957A+0.2183(R2＝0.9996)。
③测定5-Fu脂质体中药物含量
选择空白脂质体透析外液为参比，用紫外-可见分光光度计在最大吸收波长下测定游离药物溶液的吸光值(A)，然后根据标准曲线求出其浓度，再根据公式包封率＝(1－游离药物的量/脂质体混悬液中药物的总量)×100％算出脂质体的包封率。实验测得在265nm波长处，5-Fu脂质体的吸光值为0.057，计算得到5-Fu脂质体包封率为70.38％。
三、5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物的制备
实施例6
将实施例2制备的DDCTMA-5-Fu10/1脂质体进一步修饰得到靶向复合载体5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物，具体方法为：所述复合载体中总脂质与叶酸(FA)按质量比为10:1～40:1混合，漩涡震荡混匀，在55℃孵育20min，即得叶酸靶向复合物(FA-DDCDMA-5-Fu10/1)。
实施例7复合物粒径和Zeta电位检测
采用激光散射粒度仪(HORIBA纳米粒度仪SZ-100)在25℃，光散射角度90度条件下测定所制复合物的粒径及Zeta电位。用移液枪取20μL实施例6制备的叶酸靶向复合物(FA-DDCDMA-5-Fu10/1)稀释于1mL超纯水中分别进行粒径和Zeta电位检测，结果见图1和图2。
图1的结果显示，不同的复合物粒径范围在100-250nm，在转染的有效粒径(<1μm)范围之内。图2的结果显示，FA-DDCTMA-5-Fu带负电荷，且电位随着加入叶酸量的增多呈现出减小趋势，考虑到复合物与质粒的静电作用，加入叶酸的浓度不宜过高。
实施例8复合物形态检测
①滴样：用镊子夹取铜网，用移液枪取制备好的样品各8μL，分别滴加一滴样品于铜网上，静置25-30min。
②染色：用吸水纸或滤纸沿铜网边缘吸去多余的液体，用移液枪滴加8μL2％的磷钨酸负染液，染色时间30s，然后用吸水纸吸去染色液。
③检测：用透射电子显微镜(TEM)检测样品形态。
实施例9体外细胞实验
①毒性检测(MTT比色法)
将H460细胞种植于96孔细胞培养板中，每孔种植约1.5×105个细胞，RPMI1640培养液总体积100μL将细胞放置在37℃，5％CO2孵育16～24h，细胞密度约80～90％。移去生长培养基，用等量(100μL)RPMI1640(无血清)培养基清洗，再用50μLRPMI1640(无血清)培养基替换。
将实施例2制备的5-Fu脂质体和实施例6制备的叶酸靶向复合物稀释液50μL分别加入96孔细胞培养板孔中，轻轻摇匀，并设有空白细胞对照，以及空白脂质体和5-Fu溶液作为对照组，置于37℃，5％CO2孵育24h，每孔细胞中加入20μLMTT(Sigma，5mg/mL)，37℃，5％CO2孵育培养4h。小心弃去所有培养液，晾干，加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，将96孔细胞培养板放入SUNRISE酶标仪中设置震荡10min，使结晶物溶解，然后继续在SUNRISE酶标仪中测定各孔在570nm处的吸光值，读出原始数据。
基于MTT比色法的检测原理为：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲攒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲攒，用酶标仪在570nm波长处测定其吸光值，可间接反映活细胞数量。故此，以空白对照(未转染细胞)的吸光值为100％，计算转染后细胞存活的百分率(％)。计算公式为：
细胞存活率(％)＝[A]样品/[A]对照×100％
[A]样品为测试孔的吸光值，[A]对照为阴性空白对照孔的吸光值。
实验结果如图7所示，结果表明，空白脂质体对细胞存活率影响较小，在80％-95％之间，证明了脂质体是一种安全、可靠的载体。DDCTMA-5-Fu脂质体作用于H460细胞时，随浓度的增加细胞存活率下降，在相同浓度下，DDCTMA-5-Fu脂质体作用下的细胞存活率高于5-Fu单独作用下的细胞存活率，说明将5-Fu制备成脂质体药物后，能有效降低其对细胞产生的毒性。而DDCTMA-5-Fu脂质体复合叶酸后，癌细胞存活率降低，说明复合叶酸能够有效提高DDCTMA-5-Fu脂质体对癌细胞的靶向性，增强药物疗效，具有实际意义。②流式细胞仪检测细胞凋亡
将H460细胞种植于6孔细胞培养板中，RPMI1640培养液总体积2000μL将细胞放置在37℃，5％CO2培养16～24h，细胞密度达到80～90％时移去生长培养基，用1000μLRPMI1640(无血清)培养基清洗一次。按实施例2制备的5-Fu脂质体和实施例6制备的叶酸靶向复合物，用RPMI1640(无血清)分别稀释至600μL，并加入6孔细胞培养板孔中，轻轻摇匀，并设有空白细胞对照，以及空白脂质体和5-Fu溶液作为对照组，并保证复合载体、空白脂质体、5-Fu脂质体和5-Fu溶液的浓度一致，均为0.08mg/mL，于37℃，5％CO2孵育24h。
在完成细胞转染后，1000rpm离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5-10万重悬的细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，加入195μLAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。加入5μLAnnexinV-FITC，轻轻混匀。加入10μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟，随后置于冰浴中。随即进行流式细胞仪检测。结果如图8所示。结果显示，所制备的FA-DDCTMA-5-Fu复合物诱导细胞凋亡能力较DDCTMA-5-Fu脂质体有所提高，说明经过叶酸修饰后增加了药物对癌细胞的靶向性，可为癌症或肿瘤的治疗提供依据，具有实际意义。
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Claims (10)

1.一种5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物，其组成包括药物脂质体和叶酸，其中药物脂质体包括5-氟尿嘧啶、阳离子类脂和胆固醇，阳离子类脂与5-氟尿嘧啶的质量比为5:1～20:1；药物脂质体和叶酸的质量比为10:1～40:1。
2.根据权利要求1所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物，其特征在于，所述的阳离子类脂与5-氟尿嘧啶的质量比为10:1～20:1。
3.根据权利要求1所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物，其特征在于，所述的药物脂质体和叶酸的质量比为20:1。
4.根据权利要求1所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物，其特征在于，所述阳离子类脂为氨基甲酸酯型阳离子类脂。
5.根据权利要求1所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物，其特征在于，所述氨基甲酸酯型阳离子类脂具有通式Ⅰ的结构：
其中，R1为(CH2)11CH3；
R2为CH3、CH2CH3；
X为Cl、Br、I。
6.根据权利要求5所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物，其特征在于，所述氨基甲酸酯型阳离子类脂为：N-[1-(2,3-含氧十二烷基氨基甲酰)丙基]-N,N,N-三甲基色氨酸铵碘化物。
7.一种如权利要求1所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物的制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
①5-氟尿嘧啶脂质体的制备：将阳离子类脂和胆固醇按照摩尔比1:1～6:1溶解在有机溶剂中，超声充分溶解，用氮气吹膜，真空干燥过夜；按阳离子类脂与5-氟尿嘧啶的质量比为5:1～20:1称取5-氟尿嘧啶，溶于磷酸盐缓冲液，加入到附有干燥薄膜的管内，常压水浴，得脂质体混悬液；将脂质体混悬液反复超声震荡至澄清，制得5-氟尿嘧啶脂质体；
②5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物的制备：将步骤①得到的5-氟尿嘧啶脂质体与叶酸按质量比10:1～40:1混合，室温超声混匀，孵育，制得5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物。
8.根据权利要求7所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物的制备方法，其特征在于，步骤①所述的水浴条件为：45～55℃水浴1.5～2h；步骤②所述孵育条件为：45～55℃孵育15～20min。
9.根据权利要求7所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物的制备方法，其特征在于，步骤①所述的磷酸盐缓冲液pH值为7.4。
10.一种如权利要求1所述的5-氟尿嘧啶/叶酸脂质体药物在抗癌、抗肿瘤药物中的应用。
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