CN114288422B - 一种化学靶向降解目标蛋白的脂质体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种化学靶向降解目标蛋白的脂质体及其制备方法，按照摩尔百分比计，原料包括：30％‑99.8％的磷脂，0‑40％的胆固醇，0％‑10％的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇，0.1％‑20％的靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或功能化聚合物，0.1％‑20％的E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或功能化聚合物。与PROTAC相比，本发明化学靶向降解目标蛋白的脂质体水溶性好，细胞内化效率高，方便优化靶蛋白药物和E3连接酶配体的比例，提高体内降解靶蛋白效果。

Description

一种化学靶向降解目标蛋白的脂质体及其制备方法

技术领域

本发明涉及药物制剂领域和蛋白降解靶向嵌合体领域，具体涉及一种化学靶向降解目标蛋白的脂质体及其制备方法。

背景技术

蛋白降解靶向嵌合体(proteolysis-targeting chimeras,PROTAC)是一种双功能靶向杂合化合物，通过连接基团将靶蛋白配体与E3连接酶配体化学偶连，诱导靶蛋白泛素化，靶蛋白被蛋白酶体识别而降解，进而产生抗肿瘤治疗效应。

研发初期的PROTAC的E3连接酶配体为多肽，多肽化学稳定性差和体内易被降解，限制了PROTAC的临床应用。

为提高PROTAC的细胞渗透性和体内稳定性，小分子E3连接酶配体(MDM2，cIAP1，CRBN和VHL)应运而生，促进了PROTAC平台技术的发展，加快了PROTAC被开发成为药物的脚步。

但是，PROTAC具有靶蛋白配体和E3连接酶配体两大模块，分子量远大于500，另外，两大模块大部分疏水性较强，不符合“成药五定律”，因而PROTAC的水溶性差，细胞膜通透性低，生物利用度也较低。

发明内容

为了克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种化学靶向降解目标蛋白的脂质体及其制备方法，与PROTAC相比，本发明化学靶向降解目标蛋白的脂质体水溶性好，细胞内化效率高，方便优化靶蛋白药物和E3连接酶配体的比例，提高体内降解靶蛋白效果。

本发明通过以下技术方案实现：

一种化学靶向降解目标蛋白的脂质体，按照摩尔百分比计，原料包括：30％-99.8％的磷脂，0-40％的胆固醇，0％-10％的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，0.1％-20％的靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或功能化聚合物，0.1％-20％的E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或功能化聚合物。

优选的，靶向蛋白药物的结构中包含羧基、酚羟基、醇羟基、氨基、氟、氯和磺酸基中的一种或几种。

进一步的，靶向蛋白药物为JQ-1、氯尼达明、NLG-8189、NLG919、3-溴丙酮酸、二氯乙酸、吉非替尼、雷复尼特和BMS-1中的一种或多种。

优选的，E3连接酶配体为肽类蛋白配体、MDM2蛋白配体、cIAP1蛋白配体、VHL蛋白配体和CRBN配体中的一种或多种。

进一步的，CRBN配体为沙利度胺、来那度胺或泊马度胺。

优选的，所述靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂是采用靶向蛋白药物修饰功能化磷脂得到，所述功能化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基。

优选的，所述靶向蛋白药物修饰的功能化聚合物是采用靶向蛋白药物修饰功能化聚合物得到，所述功能化聚合物为聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)-聚乙二醇、聚己内酯-聚乙二醇或聚氨基酸-聚乙二醇。

优选的，所述靶向蛋白药物包括靶向一种蛋白或多种不同蛋白的药物，所述E3连接酶配体包括一种E3连接酶配体或多种不同的E3连接酶配体。

优选的，所述磷脂为大豆磷脂、蛋黄磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、氢化豆磷脂、二油酰基卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、溶血卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

所述的化学靶向降解目标蛋白的脂质体的制备方法，取靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或功能化聚合物、E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或功能化聚合物、磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，按脂质体制备方法，制备得到脂质体；

或将磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇按脂质体制备方法制备得到脂质体，将靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或聚合物和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或聚合物插入到制备好的脂质体中形成脂质体。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明所述的脂质体药物递送系统，将靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或聚合物和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或聚合物插入至脂质体磷脂双分子层中，通过脂质体的媒介作用将E3连接酶“募集”到靶蛋白附近，利用细胞内的泛素-蛋白酶体系统实现靶蛋白的泛素化标记和降解，抑制肿瘤的生长和转移，用于相关疾病的治疗。本发明利用纳米脂质体代替PROTAC中的linker，将靶向蛋白药物和E3连接酶配体化学修饰在脂质体上面。脂质体因其独特的纳米尺度，可以通过肿瘤的高渗透和滞留效应(Enhanced Permeability andRetention effect,EPR effect)被动蓄积于肿瘤组织，亦可修饰肿瘤部位高表达的蛋白或多肽于脂质体表面，通过主动靶向作用增加脂质体在肿瘤区域的蓄积。脂质体通过内吞和膜融合的方式被细胞摄取，增强药物的膜通透性，改善PROTAC细胞摄取率低的问题。本发明的脂质体与PROTAC相比，水溶性好，可跨细胞膜入胞，方便优化靶蛋白药物和E3连接酶配体的比例，提高体内降解靶蛋白的效果。

附图说明

图1为“化学靶向降解”BET新型脂质体的粒径。

图2为“化学靶向降解”BET新型脂质体对4T1细胞毒测定。

图3为“化学靶向降解”BET新型脂质体对4T1细胞BRD4蛋白表达量的影响。

图4为“化学靶向降解”BET新型脂质体对CT26细胞PD-L1蛋白表达量的影响。

图5为“化学靶向降解”IDO新型脂质体的粒径。

图6为“化学靶向降解”IDO新型脂质体对4T1和CT26细胞毒测定。

图7为“化学靶向降解”IDO新型脂质体对B16-F10细胞IDO蛋白表达量的影响。

图8为“化学靶向降解”IDO新型脂质体对CT26细胞IDO蛋白表达量的影响。

图9为“化学靶向降解”HK-2新型脂质体的粒径。

图10为“化学靶向降解”HK-2新型脂质体对CT26细胞毒测定。

图11为“化学靶向降解”HK-2新型脂质体对B16-F10细胞毒测定。

图12为“化学靶向降解”HK-2新型脂质体对4T1细胞HK-2蛋白表达量的影响。

图13为“化学靶向降解”HK-2新型脂质体对B16-F10细胞HK-2蛋白表达量的影响。

图14为“化学靶向降解”PDL1新型脂质体对B16-F10细胞PDL1蛋白表达量的影响。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行描述，这些描述只是进一步解释本发明的特征和优点，并非用于限制本发明的权利要求。

本发明化学靶向降解目的蛋白的脂质体，原料包括：磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或功能化聚合物和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或功能化聚合物。所述脂质体为单室或多室脂质体，是以磷脂和胆固醇为材料制成的脂质双分子层囊泡。脂质体的粒径为纳米或微米，优选粒径为纳米级别，例如10-500nm。

按照摩尔百分比计，磷脂、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或功能化聚合物和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或功能化聚合物的摩尔百分比分别为：30％-99.8％、0-40％、0％-10％、0.1％-20％和0.1％-20％。

所述磷脂选自：大豆磷脂、蛋黄磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、氢化豆磷脂、二油酰基卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、溶血卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

在本发明中，作为用于形成本发明所述的脂质体的原料，例如磷脂(中性磷脂、负电荷磷脂、正电荷磷脂)，磷脂衍生物，功能化基团修饰的磷脂，胆固醇，功能化基团修饰的胆固醇，胆固醇衍生物，神经节苷酯及其衍生物，聚乙二醇及其衍生物等修饰的长循环脂材、功能化聚合物包含功能化聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)-聚乙二醇、功能化聚己内酯-聚乙二醇、功能化聚氨基酸-聚乙二醇(聚氨基酸包含聚天冬氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酸)以及各种调控脂质体功能的其他材料，或以上脂材或聚合物的多种复合物。进一步优选地，例如，蛋黄卵磷脂(EPC)、胆固醇(Chol)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基(DSPE-PEG-NH₂)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯(DSPE-PEG-NHS)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-Mal)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-硫醇/巯基(DSPE-PEG-SH)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基(DSPE-PEG-COOH)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、溶血卵磷脂(Lyso-PC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。进一步优选地，所述DSPE-PEG中PEG分子量范围是1000-5000，更优选地，所述DSPE-PEG中PEG的分子量是2000。

作为本发明所述的脂质体，可以包括一种、两种、三种或更多上述载体成分，各组分的比例没有特别限定。

作为本发明的所述脂质体，其中，靶向蛋白药物的结构中包括但不限于羧基、酚羟基、醇羟基、氨基、氟、氯和磺酸基中的基团。

作为本发明的所述脂质体，所述靶向蛋白药物包括靶向一种蛋白或多种不同蛋白的药物。靶向蛋白药物可选自小分子抑制剂、多肽和蛋白类抗体药物。其中，小分子抑制剂可选自所述的免疫治疗药物，例如吲哚胺-(2,3)-双加氧酶抑制剂(IDOi，如Indoximod(NLG-8189)、Navoximod(NLG919))、PD-1/PD-L1表达抑制剂(如JQ-1、BMS-1)、肿瘤糖酵解相关通路调节剂(如氯尼达明、3-溴丙酮酸、二氯乙酸)、肿瘤激酶抑制剂(如吉非替尼(gefitinib)、雷复尼特(Rafoxanide))，包括但不限于以上靶向蛋白药物。其具体结构如下。

作为本发明的所述脂质体，所述E3连接酶配体包括一种E3连接酶配体或多种不同的E3连接酶配体，E3连接酶配体为小分子药物和多肽。多肽包括三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽以及环肽。可选自肽类蛋白配体、MDM2蛋白配体、cIAP1蛋白配体、VHL蛋白配体和CRBN配体(沙利度胺(Thalidomide)、来那度胺(lenalidomide)和泊马度胺(pomalidomide))，包括但不限于以上E3连接酶配体。其具体结构如下。

作为本发明的所述脂质体，功能化磷脂可选自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-硫醇/巯基和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基，包括但不限于以上功能化磷脂，所述功能化磷脂的分子量为1000-5000。具体结构如下。

其中R结构选自如下结构：

作为本发明的所述脂质体，靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或聚合物和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或聚合物包括但不限于以下结构。具体结构如下。

其中R1结构选自如下结构：

作为本发明的所述脂质体，功能化聚合物可选自功能化聚(D,L-丙交酯-co-乙交酯)-聚乙二醇、功能化聚己内酯-聚乙二醇、功能化聚氨基酸-聚乙二醇(聚氨基酸包含聚天冬氨酸、聚赖氨酸、聚谷氨酸)，包括但不限于以上聚合物，所述功能化聚合物的分子量为1000-30000。

制备所述的脂质体的方法，该方法包括：薄膜分散法、逆相蒸发法和有机溶剂(乙醇、乙醚等)注入法等。以薄膜分散法为例，称取制备脂质体的原料，置圆底烧瓶中，加入有机溶剂溶解后，按脂质体制备方法，制备含靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或聚合物和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或聚合物的长循环脂质体；或先制备长循环脂质体，将含靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或聚合物和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或聚合物插入到制备好的脂质体中形成长循环靶向降解脂质体；用挤压过聚碳酸酯膜或者超声等方法将脂质体的粒径控制在50-200nm；含靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂或聚合物和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂或聚合物在制备前直接加入或者通过其他方法装载至已制备好的脂质体中。

本发明的脂质体，靶向蛋白药物和E3连接酶配体的载药量分别包括但不限于0.01％～20％，优选0.1％～10％。载药量的计算方法为：载药量＝脂质体中靶向蛋白药物或E3连接酶配体的质量/(脂质体中靶向蛋白药物或E3连接酶配体的质量+总脂材的质量)×100％。

本发明的脂质体可以进一步通过冷冻干燥、喷雾干燥或喷雾冷冻干燥等固化。冻干保护剂可以是甘露醇、半乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡萄糖、PVP中的一种或两种及两种以上的组合。根据需要也可不用任何冻干保护剂，使用时，加等渗溶液即可重构。

本发明的脂质体可以根据本领域常规的方法，任选地适当加入适宜的辅料制备成制剂，例如口服、注射等非胃肠道制剂。优选地，可以为注射给药制剂，例如静脉注射剂型、肌肉注射剂型、皮下注射剂型或喷枪注射剂型。所述注射剂包括注射液和无菌粉针。本发明的脂质体分散介质可用5％葡萄糖、生理盐水或其他等渗体系，适应临床应用。本发明的脂质体的冻干粉可加入适量的5％葡萄糖溶液、生理盐水或其他等渗溶液，重建成供注射给药的分散体系，适应临床使用。

本发明的脂质体可用于以下疾病的治疗：包括肿瘤治疗、免疫治疗、代谢性疾病治疗、消化道类疾病和神经退行性疾病。

实施例1

选择沙利度胺为E3连接酶配体，选择JQ-1作为靶向溴结构域和额外末端结构域(BET)的药物，构建“化学靶向降解”BET的新型脂质体(nano-PROTACbased liposome-JQ-1,Pro-lipo-JQ-1)。脂质体的处方分别为：EPC:CHOL:DSPE-PEG:DSPE-PEG-thalidomide:DSPE-PEG-JQ-1(10:2.5:2:2:2)(单位：mg)。精密称取上述处方量的样品，置于茄形瓶中，加适量氯仿溶解。37℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入pH 7.4磷酸盐缓冲液水化，探头超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酸酯10次，即得本品。

采用动态光散射粒度仪(Dynamic light scattering,DLS)测定其粒径、分布和Zeta电位。Malvern Zetasizer ZS型激光粒度仪的激光波长设为633nm，入射光束与散射光束夹角为90°。每个样品循环测定10次，平衡时间设定为20s，测定温度设定为25℃。

将小鼠乳腺癌4T1细胞、小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10分别按照5×10³个/mL的密度接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中过夜培养，待细胞贴壁完全，弃去原培养液，PBS缓冲液清洗3次后，加入200μL以含10％血清的培养液稀释的一系列浓度的JQ-1溶液和Pro-lipo-JQ-1，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育72h；弃去药物溶液，PBS缓冲液清洗3次，每孔加入200μL新鲜配置的MTT溶液(浓度为500μg/mL)，于细胞孵箱中孵育2h；弃去药液，每孔加入150μL DMSO，放置于摇床中振摇15min以使胞内的甲臜完全溶解；通过酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度，计算细胞存活率。

进一步，考察靶向BET降解的新型脂质体细胞毒机制。测定前，将4T1细胞以5×10³个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔加入1mL RPMI1640完全培养液，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中培养过夜，待细胞汇合度达到40％左右时，弃去原培养液，PBS缓冲液清洗3次后，加入200μL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释的一系列浓度的脂质体，其中，在抑制剂组的每孔培养液中加入20nM蛋白酶体抑制剂硼替佐米(BTZ)，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育72h；弃去制剂，PBS缓冲液清洗3次，每孔加入500μL新鲜配制的MTT溶液，于细胞孵箱中继续孵育3h；弃去药液，每孔加入150μL DMSO，放置于摇床中振摇15min以使胞内的甲臜完全溶解，通过酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度，计算细胞存活率。

将小鼠乳腺癌4T1细胞、小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10分别按照2×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，在37℃、5％CO₂恒温孵箱中过夜培养，待细胞贴壁完全，加入1mL含10％胎牛血清的RPMI1640培养液稀释的JQ-1药物溶液和Pro-lipo-JQ-1，JQ-1最终浓度为5μg/mL，其中以加入10％胎牛血清的RPMI 1640培养液作为空白对照，抑制剂组的每孔培养液中加入10μM硼替佐米(BTZ)预孵育1h，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育72h，提取总蛋白，通过BCA法测定总蛋白浓度，计算50μg蛋白需要的上样体积，按照WesternBlot标准方法对各组BRD4和PD-L1蛋白的表达量进行检测。

结果：粒径测定结果显示靶向BET降解的新型脂质体的粒径在100nm左右(图1)。细胞毒实验结果显示靶向BET降解的新型脂质体与游离药物JQ-1细胞毒作用相当，其细胞毒作用呈浓度依赖性，并且，BTZ能够有效抑制靶向BET降解的新型脂质体的细胞杀伤作用(图2)。WB实验结果显示，与游离药物JQ-1相比，靶向BET降解的新型脂质体能够有效降低BRD4蛋白的表达量；加入BTZ后BET下游蛋白PD-L1降解量被显著抑制(图3和图4)。上述实验结果表明，靶向BET降解的新型脂质体通过蛋白酶体介导的泛素化作用下调BRD4和PD-L1蛋白的表达，有效抑制肿瘤细胞的生长。

实施例2

选择沙利度胺为E3连接酶配体，选择NLG-919和IND作为靶向吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)的药物，构建“化学靶向降解”IDO的新型脂质体(nano-PROTAC based liposome-IDO,Pro-lipo-IDO)。脂质体的处方分别为：EPC:CHOL:DSPE-PEG:DSPE-PEG-thalidomide:DSPE-PEG-IDOi(10:2.5:2:2:2)(单位：mg)。精密称取上述处方量的样品，置于茄形瓶中，加适量氯仿溶解。37℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入pH 7.4磷酸盐缓冲液水化，探头超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酸酯10次，即得本品。

采用动态光散射粒度仪(Dynamic light scattering,DLS)测定其粒径、分布和Zeta电位。Malvern Zetasizer ZS型激光粒度仪的激光波长设为633nm，入射光束与散射光束夹角为90°。每个样品循环测定10次，平衡时间设定为20s，测定温度设定为25℃。

将小鼠乳腺癌4T1细胞、小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10分别按照5×10³个/mL的密度接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中过夜培养，待细胞贴壁完全，弃去原培养液，PBS缓冲液清洗3次后，加入200μL以含10％血清的培养液稀释的一系列浓度的IDOi溶液和Pro-lipo-IDOi，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育72h；弃去药物溶液，PBS缓冲液清洗3次，每孔加入200μL新鲜配置的MTT溶液(浓度为500μg/mL)，于细胞孵箱中孵育2h；弃去药液，每孔加入150μL DMSO，放置于摇床中振摇15min以使胞内的甲臜完全溶解；通过酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度，计算细胞存活率。

进一步，考察靶向IDO降解的新型脂质体细胞毒机制。测定前，将4T1细胞以5×10³个/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔加入1mL RPMI1640完全培养液，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中培养过夜，待细胞汇合度达到40％左右时，弃去原培养液，PBS缓冲液清洗3次后，加入200μL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释的一系列浓度的脂质体，其中，在抑制剂组的每孔培养液中加入20nM蛋白酶体抑制剂BTZ，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育72h；弃去制剂，PBS缓冲液清洗3次，每孔加入500μL新鲜配制的MTT溶液，于细胞孵箱中继续孵育3h；弃去药液，每孔加入150μL DMSO，放置于摇床中振摇15min以使胞内的甲臜完全溶解，通过酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度，计算细胞存活率。

将小鼠乳腺癌4T1细胞、小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10分别按照2×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，在37℃、5％CO₂恒温孵箱中过夜培养，待细胞贴壁完全，加入1mL含10％胎牛血清的RPMI1640培养液稀释的IDOi药物溶液和Pro-lipo-IDOi，IDOi最终浓度为5μg/mL，其中以加入10％胎牛血清的RPMI 1640培养液作为空白对照，抑制剂组的每孔培养液中加入10μM BTZ预孵育1h，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育72h，提取总蛋白，通过BCA法测定总蛋白浓度，计算50μg蛋白需要的上样体积，按照Western Blot标准方法对各组IDO蛋白的表达量进行检测。

结果：粒径测定结果显示靶向IDO降解的新型脂质体的粒径在100nm左右(图5)。细胞毒实验结果显示靶向IDO降解的新型脂质体细胞毒作用优于游离IDOi，其细胞毒作用呈浓度依赖性(图6)。WB实验结果显示，与游离药物IDOi相比，靶向IDO降解的新型脂质体能够有效降低IDO蛋白的表达量，加入蛋白酶体抑制剂BTZ后IDO降解量被显著抑制(图7和图8)。上述实验结果表明，靶向IDO降解的新型脂质体通过蛋白酶体介导的泛素化作用下调IDO蛋白的表达，有效抑制肿瘤细胞的生长。

实施例3

选择沙利度胺为E3连接酶配体，选择Lonidamine(LND)作为靶向己糖激酶-2(HK-2)的药物，构建“化学靶向降解”HK-2的新型脂质体(nano-PROTAC based liposome-LND,Pro-lipo-LND)。脂质体的处方分别为：EPC:CHOL:DSPE-PEG:DSPE-PEG-thalidomide:DSPE-PEG-LND(10:2.5:2:2:2)(单位：mg)。精密称取上述处方量的样品，置于茄形瓶中，加适量氯仿溶解。37℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入pH 7.4磷酸盐缓冲液水化，探头超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酸酯10次，即得本品。

采用动态光散射粒度仪(Dynamic light scattering,DLS)测定其粒径、分布和Zeta电位。Malvern Zetasizer ZS型激光粒度仪的激光波长设为633nm，入射光束与散射光束夹角为90°。每个样品循环测定10次，平衡时间设定为20s，测定温度设定为25℃。

将小鼠乳腺癌4T1细胞、小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10分别按照5×10³个/mL的密度接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中过夜培养，待细胞贴壁完全，弃去原培养液，PBS缓冲液清洗3次后，加入200μL含10％血清的培养液稀释的一系列浓度的LND溶液和Pro-lipo-LND，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育72h；弃去药物溶液，PBS缓冲液清洗3次，每孔加入200μL新鲜配置的MTT溶液(浓度为500μg/mL)，于细胞孵箱中孵育2h；弃去药液，每孔加入150μL DMSO，放置于摇床中振摇15min以使胞内的甲臜完全溶解；通过酶标仪检测各孔在490nm处的吸光度，计算细胞存活率。

将小鼠乳腺癌4T1细胞、小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠黑色素瘤细胞B16-F10分别按照2×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，在37℃、5％CO₂恒温孵箱中过夜培养，待细胞贴壁完全，加入1mL含10％胎牛血清的RPMI1640培养液稀释的LND药物溶液和Pro-lipo-LND，LND最终浓度为5μg/mL，其中以加入10％胎牛血清的RPMI 1640培养液作为空白对照，抑制剂组的每孔培养液中加入10μM BTZ预孵育1h，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育24h，提取总蛋白，通过BCA法测定总蛋白浓度，计算50μg蛋白需要的上样体积，按照Western Blot标准方法对各组HK-2蛋白的表达量进行检测。

结果：粒径测定结果显示靶向HK-2降解的新型脂质体的粒径在100nm左右(图9)。细胞毒实验结果显示靶向HK-2降解的新型脂质体细胞毒作用相当优于游离LND，其细胞毒作用呈浓度依赖性(图10和图11)。WB实验结果显示，与游离药物LND相比，靶向HK-2降解的新型脂质体能够有效降低HK-2蛋白的表达量，加入蛋白酶体抑制剂BTZ后HK-2降解量被显著抑制(图12和图13)。上述实验结果表明，靶向HK-2降解的新型脂质体通过蛋白酶体介导的泛素化作用下调HK-2蛋白的表达，有效抑制肿瘤细胞的生长。

实施例4

选择沙利度胺为E3连接酶配体，选择BMS-1作为靶向PDL1的药物，构建“化学靶向降解”PDL1的新型脂质体(nano-PROTAC basedliposome-BMS-1,Pro-lipo-BMS-1)。脂质体的处方分别为：EPC:CHOL:DSPE-PEG:DSPE-PEG-thalidomide:DSPE-PEG-BMS-1(10:2.5:2:2:2)(单位：mg)。精密称取上述处方量的样品，置于茄形瓶中，加适量氯仿溶解。37℃减压旋转蒸发成均匀的透明薄膜。加入pH 7.4磷酸盐缓冲液水化，探头超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酸酯10次，即得本品。

将小鼠黑色素瘤细胞B16-F10分别按照2×10⁵个/mL的密度接种于6孔板中，在37℃、5％CO₂恒温孵箱中过夜培养，待细胞贴壁完全，加入1mL含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释的不同浓度的Pro-lipo-BMS-1，其中以加入10％胎牛血清的RPMI 1640培养液作为空白对照，于37℃、5％CO₂恒温孵箱中孵育24h，提取总蛋白，通过BCA法测定总蛋白浓度，计算50μg蛋白需要的上样体积，按照Western Blot标准方法对各组PDL1蛋白的表达量进行检测。

结果：如图14，WB实验结果显示，靶向PDL1降解的新型脂质体能够有效降低细胞膜蛋白PDL1的表达量，PDL1表达量随着制剂浓度的提高而降低。

Claims (3)

1.一种化学靶向降解目标蛋白的脂质体，其特征在于，按照摩尔百分比计，原料包括：30%-99.8%的磷脂，0-40%的胆固醇，0%-10%的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，0.1%-20%的靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂，0.1%-20%的E3连接酶配体修饰的功能化磷脂；

所述靶向蛋白药物为JQ-1、氯尼达明、NLG-8189、NLG919和BMS-1中的一种：

所述E3连接酶配体为CRBN配体；所述CRBN配体为沙利度胺、来那度胺或泊马度胺；

所述靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂是采用靶向蛋白药物修饰功能化磷脂得到，所述功能化磷脂为二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-氨基、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-活性酯、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-巯基或二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羧基。

2.根据权利要求1所述的化学靶向降解目标蛋白的脂质体，其特征在于，所述磷脂为大豆磷脂、蛋黄磷脂、二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、氢化豆磷脂、二油酰基卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、溶血卵磷脂和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺中的一种或多种。

3.权利要求1-2任一项所述的化学靶向降解目标蛋白的脂质体的制备方法，其特征在于，取靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂、E3连接酶配体修饰的功能化磷脂、磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，按脂质体制备方法，制备得到脂质体；

或将磷脂、胆固醇和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇按脂质体制备方法制备得到脂质体，将靶向蛋白药物修饰的功能化磷脂和E3连接酶配体修饰的功能化磷脂插入到制备好的脂质体中形成脂质体。

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