CN111569082B - 一种包载蛋白多肽类药物外泌体的口服递送系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种包载蛋白多肽类药物的外泌体口服递送系统及其应用。研究发现，通过超声方法可将蛋白多肽类药物导入外泌体中，外泌体无需任何修饰即能较快地穿过黏液层，通过主动靶向作用高效进入细胞，在胞内实现药物的内涵体‑溶酶体逃逸，并具有较高的上皮细胞基底侧出胞效率，最终表现出良好的体内递药效率。本发明展示了一种简单、高效且安全的口服递药系统，在医药领域具有良好的研究和开发应用前景。

Description

一种包载蛋白多肽类药物外泌体的口服递送系统

技术领域

本发明涉及一种包载蛋白多肽类药物的外泌体的制备方法及口服递送中的应用，属于药物制剂领域。

背景技术

蛋白多肽类药物具有胃肠道稳定性差、透膜性低等特点，难以实现口服给药。纳米递药系统能够有效提高大分子蛋白多肽类药物的胃肠道稳定性，并能有效控制药物的释放，因而被广泛用于口服递药的研究。为将药物高效递送至血液循环，纳米递药系统需跨过肠道多重吸收屏障，包括黏液扩散屏障、肠上皮细胞顶侧膜入胞屏障和基底侧出胞屏障(Adv Drug Deliv Rev2018,124,1-2)。目前，针对克服黏液扩散屏障与入胞屏障的手段较多，但纳米递药系统从基底侧出胞的效率往往较低，极大地限制了蛋白多肽类药物的口服生物利用度(Drug Discov Today2016,21,856-863)。

纳米递药系统由肠上皮细胞基底侧“出胞难”的原因主要包括：(1)纳米粒入胞后进入内涵体/溶酶体，其中的酸性环境和大量水解酶使药物稳定性降低，并且一定程度降低了纳米粒的出胞速率；(2)受肠上皮细胞极性的影响，较大部分药物由顶侧膜外排返回肠腔，而非由基底侧转运至血液循环。为解决上述问题，有研究者利用内涵体逃逸肽或阳离子材料帮助纳米粒与药物实现内涵体逃逸(ACS Appl Mater Interfaces 2018,10,9315-9324；J Control Release,2011,151,220-228)。然而经典的逃逸肽在胃肠道的稳定性较差，限制了逃逸作用的发挥；而帮助逃逸的阳离子材料的毒性和免疫原性较大，不利于长期口服给药。为提高基底侧出胞效率，有研究者将靶向低密度脂蛋白受体(LDLR)的纳米粒与LDLR信号通路调节剂共同给药(Nanoscale 2018,10,1494-1507)，但仍未解决安全性问题，且递药体系较为复杂。

天然来源的生物材料具有免疫原性低、生物相容高的优点。外泌体是一类细胞外囊泡，被认为是天然的“特洛伊木马”，其中包载着多种内源性、具有生理活性的大分子物质(如DNA、miRNA、mRNA和蛋白)(Adv Mater 2019,31,e1802896)。外泌体与受体细胞之间可以进行有效的物质交换，将其中的大分子物质递送至胞内，实现细胞间信号传导。在注射给药途径中，外泌体被用作核酸类药物的新型递送载体，外泌体的包载可显著提高siRNA、mRNA等药物的治疗效果(J Control Release 2019,308,119-129；Nat Biomed Eng2020,4,69-83)。近年来的研究表明，外泌体中内源性或导入的外源性大分子物质，如CD63、存活蛋白siRNA等，能够实现溶酶体逃逸，进入受体细胞的胞质中(J Control Release2019,311,43–49；J Virol 2018,92,e01578-18；ACS Nano 2020,14,4,4444-4455)。但上述基于外泌体的递送系统是通过注射途径给药。此外，采用传统的电致孔法或药物外泌体共孵育方法，将蛋白多肽类药物包载入外泌体中的效率较低。因此，将外泌体作为蛋白多肽类药物的口服递送载体还未见报道。

发明内容

为了解决上述现有研究中口服递药系统存在的问题，本发明人通过创造性的研究首次将外泌体作为蛋白多肽类药物的纳米递送载体。

本发明的目的之一是提供，一种基于载蛋白多肽类药物外泌体的口服递药系统，在克服肠道吸收屏障的药物组合物/药物制剂中的应用。

作为具体的实施方案之一，所述载药外泌体平均粒径范围约50-200nm；所述蛋白多肽类药物质量占载药外泌体总质量的0.1％～90％(w/w)。

外泌体来源包括但不限于：牛奶、羊奶、乳汁、血液、体液、组织、体外培养的细胞的一种或多种的组合。

本发明的实施例中进一步优选牛奶来源的外泌体作为蛋白多肽类药物的载体。

作为优选的实施方案之一，所述蛋白多肽类药物质量占载药外泌体总质量的0.1％～90％(w/w)，优选1％～80％(w/w)；

所述蛋白多肽类药物包括但不限于：胰岛素、胰岛素类似物、奥曲肽醋酸亮丙瑞林、降钙素、胸腺五肽、促黄体生成素释放激素、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普瑞林、白细胞生长因子、红细胞生长因子、巨噬细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、白细胞介素、血管生成抑制素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状旁腺素、生长激素、生长抑素、干扰素、单克隆抗体和疫苗。

作为本发明具体实施方案之一，优选胰岛素作为活性成分。

本发明目的之一是提供一种可用于制备口服给药的载药外泌体的方法，包括以下步骤：

(1)通过超高速离心法提取外泌体；

(2)将药物溶液与外泌体分散液按一定比例混合均匀；

(3)通过超声法将药物包载于外泌体中，并采用超滤法除去未包裹的游离药物。

作为具体的实施方案之一，包括以下步骤：

(1)通过超高速离心法提取低脂牛奶中的外泌体；

(2)将胰岛素水溶液与外泌体分散液按一定比例混合均匀，其中胰岛素与外泌体的质量比为1:99～95:5(w/w)；

(3)通过超声法将胰岛素包载于牛奶来源外泌体中，其中超声功率为10～200W，超声时间为0.1～10min；

本发明目的之一是提供一种可克服胃肠道吸收屏障的纳米制剂，主要是由本发明的载药外泌体与药学上可以接受的辅料制备成溶液型液体制剂、高分子溶液剂、乳剂、混悬剂、糖浆剂、滴剂、散剂、颗粒剂、片剂及胶囊剂等口服给药制剂。

有益效果

1.本发明中的蛋白多肽类药物包载于外泌体中，其在胰蛋白酶中稳定性显著提高，在人工胃液与人工肠液中释放较为缓慢，无明显突释。

2.本发明中的外泌体可快速穿过肠道黏液层，到达上皮细胞表面，并通过靶向肠道上皮细胞多种转运体，有效提高细胞摄取与跨膜转运效率。

3.本发明中的外泌体能够有效从内涵体和溶酶体中逃逸，将蛋白多肽类药物递送至胞质，提高了药物稳定性。

4.本发明中的外泌体具有较高的上皮细胞基底侧出胞效率，有助于提高所包载的蛋白多肽类药物跨过肠上皮细胞单层，进入血液循环。

5.本发明中的外泌体的体内递药效率高，显著提高蛋白多肽类药物的口服生物利用度。

6.本发明中的外泌体无需其他修饰即可跨过肠道多重吸收屏障，包括黏液扩散屏障、上皮细胞顶侧膜入胞屏障、内涵体-溶酶体屏障和基底侧出胞屏障，有效改善蛋白多肽类药物的口服治疗效果。该递药体系制备简便，且生物相容性良好，有利于实现大规模生产与临床转化。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1表示牛奶来源外泌体(EXO)与载胰岛素牛奶来源外泌体(EXO@INS)的表征。

图2表示与胰蛋白酶孵育时EXO@INS中胰岛素含量变化图。

图3表示EXO在肠道黏膜的覆盖率研究图。

图4表示EXO与传统穿黏液型纳米粒的跨膜效率研究图。

图5表示EXO主动靶向肠上皮细胞能力的研究图。

图6表示EXO使其包载的荧光标记胰岛素实现内涵体和溶酶体逃逸的研究图。

图7表示EXO由肠上皮细胞顶侧和基底侧出胞速率的研究图。

图8表示I型糖尿病大鼠口服EXO@INS、EXO与胰岛素原药后的药效学研究图。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1牛奶来源外泌体(EXO)与载胰岛素牛奶来源外泌体(EXO@INS)的制备与表 征

首先，采用超高速离心法分离低脂牛奶中的EXO。具体方法为，将低脂牛奶离心(13,000×g，30min)，上清液与500mM的乙二胺四乙酸水溶液(调pH至7.0)混合均匀(3:1,v/v)，冰浴静置15min，高速离心(100,000×g，60min，4℃)除去脂肪颗粒，沉淀蛋白质与较大囊泡。将上清液继续离心(135,000×g，90min，4℃)，向沉淀中加入磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)，吹打分散，0.22μm无菌滤器过滤，得到EXO分散液。采用BCA法定量EXO总蛋白浓度，分装置于-80℃待用。

接下来，采用超声法制备EXO@INS。具体方法为，将INS溶于0.1M盐酸，加入NaOH调节pH至7左右，配制INS储备液(8mg/ml)。INS溶液与EXO(1mg/ml)等体积混合，探头超声。超声功率为100W，时间为3min(2s/2s,开/关)。采用超滤法除去未包裹的INS，向EXO@INS中加入适宜溶剂分散。向EXO@INS分散液中加入等体积1％Triton X-100，利用高效液相色谱(HPLC)法测定INS含量，按如下公式计算载药量：

结果表明，EXO@INS的载药量为57.7％，能够满足口服给药的要求。

采用纳米颗粒跟踪分析仪考察EXO的粒径，发现其平均粒径为83.2nm，与文献报道的外泌体粒径(30-150nm)一致；透射电镜结果显示其形态圆整，具有外泌体特征的“杯托状”结构，结果如说明书附图1A所示；通过WesternBlot实验检测到外泌体特征蛋白CD63的富集。以上实验表明牛奶来源外泌体的成功分离。将EXO和EXO@INS分散于PBS中，采用粒径仪测定其动态光散射(DLS)粒径与zeta电位，结果如说明书附图1B所示。

图1B显示EXO与EXO@INS的粒径分别为72.9nm与71.9nm，zeta电位分别为-9.8mV与-12.4mV，表明包载胰岛素的过程未对外泌体的粒径造成明显影响。zeta电位略有降低，可能是由于荷负电胰岛素的包载增加了体系的负电性。

实施例2EXO@INS在胰蛋白酶中稳定性考察

本实验考察EXO包载INS后，能否提高INS在胰蛋白酶中的稳定性。以含胰蛋白酶(10mg/ml)的模拟肠液分散EXO@INS，37℃振荡孵育，在指定时间点取样，加入盐酸(0.1M)终止酶活性，通过HPLC法测定INS浓度。将游离INS作为对照组，同法考察其稳定性，分别计算两组INS剩余量的变化情况，结果如说明书附图2所示。

图2显示在胰蛋白酶溶液中孵育30min后，EXO@INS组INS剩余70％，而游离INS组几乎降解完；在2h后，EXO@INS组INS仍有9.2％剩余，表明EXO包裹有效提高了INS在胰蛋白酶中的稳定性，有助于其体内递药效率的提升。

实施例3EXO肠道黏膜的覆盖率的考察

首先，制备穿黏液型与黏液黏附型纳米粒。配制储备液，将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)和荧光染料DiI溶于DMSO，浓度分别为20、40和1mg/ml。采用纳米沉淀法制备穿黏液型纳米粒(MPPs)和黏液黏附型纳米粒(MAPs)，将DSPE-PEG、PLGA和染料储备液分别按质量比5：2：0.05(MPPs)和1：10：0.25(MAPs)混合均匀，缓慢滴入快速搅拌的去离子水中(600rpm，搅拌5min)，有机相与水相比例为1:20(v/v)。采用超滤法除去纳米粒(NPs)分散液中的有机溶剂及游离材料，加入PBS(pH 7.4)分散。MAPs与MPPs的DLS粒径分别为179.6nm与132.9nm，zeta电位分别为-19.53mV与-10.47mV。接下来，制备DiI标记的EXO(EXO@DiI)，将1mg/ml的荧光染料DiI的DMSO溶液与EXO分散液混合均匀(染料：EXO＝1:20，w/w)，37℃孵育20min，采用超滤法除去游离染料，加入PBS(pH 7.4)分散。

将雄性C57BL/6J小鼠(20-22g)禁食过夜，自由饮水，随机分为3组，每组5只。分别口服灌胃DiI标记的EXO,MPPs和MAPs，2h后处死小鼠。取小鼠回肠段，采用生理盐水清洗，纵向剪开肠段，置于载破片，采用激光共聚焦显微镜(CLSM)拍摄外泌体与纳米粒的分布情况，计算黏液覆盖率，结果见说明书附图3。

由图3所示，MAPs黏膜覆盖率仅为40.0％，表明其在黏液中运动性较差，而MPPs在肠道黏液中均匀分布，黏液覆盖率高达83.8％。EXO在肠道中也显示出较为均匀的分布，黏液覆盖率为84.2％，与MPPs相当，显著高于MAPs(p<0.01)，表明外泌体在肠道黏液中运动性较高，分布较广，有利于与肠上皮细胞接触。

实施例4EXO跨肠上皮细胞单层效率的考察

将Caco-2细胞消化后，按照3×10⁴个/孔的密度接种到Transwell小室中(上室)，接收室(下室)中加入0.6mL的完全培养基。小室的膜面积为0.33cm²，聚碳酸酯半透膜的孔径大小为3μm。前12天，每隔一天换一次培养基，后面每天换一次培养基。同时，从第8天起，每两天用电阻仪测定细胞单层的跨膜电阻值(TEER)，检测细胞的生长情况以及细胞单层的完整性。

取TEER值大于300Ω·cm²的Transwell小室测定EXO@DiI与MPPs的跨膜转运。实验前移除上室和下室中的培养基，加入等体积预热的空白培养基平衡30min，而后移除空白培养基。上室中分别加入200μl分散在空白培养基中的EXO@DiI与MPPs，下室中加入800μl空白培养基。于特定时间点，从接收室取样50μl进行荧光分析，并立即向接收室中补充等体积的空白培养基。表观渗透系数(Papp)值按下述式计算：Papp＝(dQ/dt)×[1/(A×C₀)](dQ/dt表示纳米粒的扩散速度，A为膜面积，C₀为药物初始浓度)，结果见说明书附图4。

从附图4中可以看出，EXO@DiI的Papp值是MPPs的4.5倍，说明EXO具有较好的跨膜转运能力，有助于其克服肠上皮细胞吸收屏障。

实施例5EXO主动靶向能力的研究

将Caco-2细胞消化后，按照1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板，待细胞生长4天出现分化后，移去培养基，用新鲜PBS润洗细胞。加入EXO@DiI与抑制剂，与细胞共同孵育3h，移去，用新鲜的PBS润洗细胞三次，加入DMSO(100μl/孔)，用酶标仪测定DiI荧光值。采用刃天青法对每孔细胞数量进行校正，得到相对细胞摄取的量，结果如说明书附图5所示。

如图5所示，寡肽转运体(PEPT1)抑制剂甘氨酰肌氨酸(Gly-Sar)显著降低EXO摄取(p<0.01)；谷氨酸显著降低EXO摄取(p<0.05)，表明EXO可能经历氨基酸转运体介导的摄取；EXO的摄取也受到果糖(p<0.05)与葡萄糖(p<0.001)的显著抑制，表明EXO可能经历葡萄糖转运体介导的摄取。因此，通过靶向PEPT1、氨基酸转运体与葡萄糖转运体，EXO与肠上皮细胞亲和力增强，有助于提高其跨细胞转运效率。

实施例6EXO内涵体/溶酶体逃逸能力的考察

首先，合成异硫氰酸荧光素标记的INS(FITC-INS)，具体方法为配制INS水溶液，将FITC溶于丙酮，INS与FITC按摩尔比1:1.5混合，4℃避光搅拌过夜。盐酸调节pH至等电点，离心除去上清，将沉淀溶于去离子水，透析除去游离FITC，冻干得到FITC-INS。接下来，将FITC-INS溶于PBS，浓度为8mg/ml，参照实施例1中方法，将INS替换为FITC-INS，制备载FITC-INS的EXO(EXO@FITC-INS)。

将Caco-2细胞消化，按照1×10⁵个/孔的密度接种于玻底培养皿，3天后去除培养基，用预热的PBS润洗，加入EXO@FITC-INS的样品孵育2h。移去样品，加入溶酶体红色染料对溶酶体进行染色；利用兔抗人Rab5、鼠抗人Rab7和兔抗人Rab11，分别对早期内涵体、晚期内涵体和循环内涵体进行标记，通过CLSM观察并采集图像，利用Image-Pro Plus计算FITC-INS与上述各细胞器的共定位系数(Rr)，结果如附图6所示。

由附图6A可见，FITC-INS的绿色荧光在胞内与早期内涵体、晚期内涵体、循环内涵体和溶酶体的红色荧光均无明显共定位；由图6B可知，各组Rr均小于0.5，进一步表明FITC-INS与上述各细胞器无明显共定位。这表明EXO能够使其包载的蛋白药物实现内涵体和溶酶体逃逸，有利于保证药物稳定性。

实施例7EXO由肠上皮细胞顶侧和基底侧出胞速率的考察

按照实施例4中方法培养Caco-2细胞单层，实验前，采用无血清空白培养基平衡30min，而后向A室加入DiI标记的EXO或MPPs(DiI：10μg/ml)，2h后将A室和B室替换为空白培养基，并于指定时间点在A室和B室分别取样，加入等体积DMSO，利用酶标仪测定DiI荧光值(激发波长：549nm；发射波长：575nm)。按如下公式计算出胞速率：出胞速率＝dQ/dt，其中，dQ/dt为单位时间内转运至A或B室的DiI的量，结果如附图7所示。

由附图7可见，MPPs的基底侧出胞速率仅为顶侧出胞的78％，而EXO基底侧出胞速率是顶侧出胞速率的1.8倍(p<0.001)，表明EXO能够一定程度克服纳米递药系统基底侧出胞难的困境，有利于将药物由肠腔递送至血液循环。

实施例8EXO@INS在I型糖尿病大鼠体内的药效学与药动学考察

随机取已禁食12h的糖尿病大鼠35只，随机分为7组，每组5只，测定给药前血糖。皮下注射游离INS(5IU/kg)，口服灌胃给予生理盐水、游离INS(50IU/kg)、未载药EXO、EXO@INS(18IU/kg)、EXO@INS(30IU/kg)和EXO@INS(50IU/kg)。在给药后1、2、4、6、8、10h，测定大鼠血糖，并收集尾静脉血，离心(5000rpm，3min)分离血浆。采用猪胰岛素ELISA试剂盒测定血浆INS浓度，计算相对生物利用度(Fr％)。以给药前大鼠的血糖值作为100％，各时间点降血糖百分数按下述公式计算：血糖变化百分数％＝Gt/G0×100(Gt和G0分别表示t时间点的大鼠血糖值和给药前大鼠的血糖值)，以血糖变化百分数％对时间t做曲线得血糖百分数-时间曲线，结果见说明书附图8。

由图8可见口服给药游离INS与空白EXO不具有明显降糖效果。与高剂量游离INS组(50IU/kg)相比，低剂量的EXO@INS(18IU/kg)可以显著降低血糖，且随着剂量增高，EXO@INS的降糖效果不断提高；当剂量为50IU/kg时，大鼠的血糖可降至初始值的30％左右，且降糖效果较皮下注射INS组更加持久。当剂量为30IU/kg时，EXO@INS的相对生物利用度为15.39％。因此，EXO@INS口服后具有剂量依赖的降糖效果，有效提高了模型药物胰岛素的口服生物利用度。

Claims (5)

1.一种用于克服胃肠道多重吸收屏障的制剂，其特征在于，由包载蛋白多肽类药物的载药外泌体与药学上可以接受的辅料制备成口服给药制剂，所述外泌体来源于牛奶，载药外泌体是将蛋白多肽类药物包载于外泌体内获得。

2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述蛋白多肽类药物选自胰岛素、胰岛素类似物、奥曲肽、醋酸亮丙瑞林、降钙素、胸腺五肽、促黄体生成素释放激素、醋酸替可克肽、布舍瑞林、艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、醋酸曲普瑞林、白细胞生长因子、红细胞生长因子、巨噬细胞生长因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、白细胞介素、血管生成抑制素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、甲状旁腺素、生长激素、生长抑素、干扰素和单克隆抗体中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于，所述蛋白多肽类药物质量占载药外泌体总质量的0.1％～90％(w/w)。

4.一种根据权利要求1-3任一项用于克服胃肠道多重吸收屏障的制剂，其特征在于，所述的载药外泌体的制备方法，包括以下步骤：

(1)通过超高速离心法提取外泌体；

(2)将药物溶液与外泌体分散液按一定比例混合均匀；

(3)通过超声法将药物包载于外泌体中，并采用超滤法除去未包裹的游离药物。

5.权利要求1-4任一项制剂在制备用于克服胃肠道多重吸收屏障的制剂中的用途。

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