WO2020017788A1 - Cd9를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

Cd9를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of diabetes mellitus using CD9 and a method for screening a diabetic agent. More specifically, the present invention relates to a method for diagnosing diabetes comprising an insulin secreting cell in which CD9 (A) contacting a test composition with a prophylactic or therapeutic pharmaceutical composition and a cell expressing a CD9 gene; (b) measuring the CD9 gene expression level in the control cells that did not contact the cells with the test substance; And (c) selecting a test substance that reduces CD9 gene expression level as compared to the control cell as a diabetes therapeutic candidate.
  • Glucose toxicity in diabetes causes apoptosis of ⁇ -cells and affects various organ systems, including the pancreas.
  • the basic mechanism is not completely known. Disruption of ⁇ -cells and impaired insulin production are typical features of diabetes (Xu, G et al., Nat. Med . 19, 1141-1146. 2013), but despite the rapid spread of diabetes, apoptosis of ⁇ -cells The exact molecular mechanism of causing glucose toxicity is still unknown (Chen, J et al., Diabetes 57, 938-944. 2008).
  • Apoptosis is a process that occurs naturally in the body by activating specialized intracellular signal transduction. It is also a homeostatic mechanism for maintaining cell populations in tissues. Inadequate apoptosis is common in a variety of pathologies, including metabolic stress, neurodegenerative diseases, and glucose toxicity, such as ischemic damage, autoimmune diseases and many types of cancers (Elmore, S et al., Toxicol . Pathol . 35, 495-516. 2007). Such apoptosis is caused by intrinsic pathways that activate caspase-9 and -3 by cytochrome c released from mitochondria, and caspase-8 and -10 by death receptors such as tumor nerosis factor- ⁇ (TNF- ⁇ ) and Fas ligand. It is divided into two pathways of extrinsic pathway that are activated. In addition, the activation of various proteins independent of caspase is known to be involved in apoptosis signaling.
  • TNF- ⁇ tumor nerosis factor- ⁇
  • Mitogen-activated protein kinases include three serine-threonine kinases: extracellular regulated protein kinase (ERK), p38 MAPK, and c-jun N-terminal protein kinase (JNK).
  • MAPK activated by external stimulation is involved in physiological phenomena of various cells such as cell survival, death and migration.
  • ERK is mainly involved in cell survival mechanisms such as cell division and survival and matrix-integrin interaction.
  • P38 MAPK and JNK are also known as stress-activated protein kinase (SAPK), and cytokine, high temperature, and osmotic shock. It is activated by endotoxin, ultraviolet rays, and the like. Therefore, they are mainly related to induction of apoptosis in various cell types but show various aspects according to the type and stimulation of cells or tissues. JNK is particularly involved in the intrinsic pathway of apoptosis.
  • CD9 is a tetraspanin cell membrane glycoprotein having a molecular weight of 24 to 27 kDa.
  • tetraspanins in mammals, 33 of which have been identified in humans.
  • Each tetraspanin is capable of cell attachment and migration, platelet activity and aggregation, fusion of eggs and sperm in the process of fertilization in mammals, the development and metastasis of cancer, humoral and allergic reactions, human immunodeficiency virus-1 (HIV) -1) and influenza virus is known to play an important role in the replication of viruses.
  • HIV human immunodeficiency virus-1
  • influenza virus HIV
  • cell aging regulation of CD9 antigens in humans, or aging regulation studies have only been reported to increase expression in aged human vascular endothelial cells, but no effects on CD9 apoptosis mechanism and insulin expression.
  • Exosomes are small vesicles with a membrane size of 50-200 nm that are secreted out of cells with proteins, DNA, RNA, etc. for intercellular signaling.
  • Exosomes contain a variety of proteins, DNA, RNA, etc. in the cell. Substances contained in these exosomes and secreted out of the cell are re-introduced into other cells by fusion or endocytosis with the cell membrane to act as a communicator between cells. In addition, it can be used in the diagnosis of a specific disease by analyzing the substances contained in these exosomes secreted out of the cell.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that p35MAPK and ERK phosphorylation are increased in the pancreatic beta cells when CD9 is inhibited, and the function of inhibiting cell death by cleaved caspase-3 is increased and insulin secretion is increased.
  • compositions for the prevention or treatment of diabetes mellitus comprising an inhibitor of the expression or activity of CD9 protein as an active ingredient.
  • compositions for the prevention or treatment of diabetes consisting of an active ingredient inhibitor or CD9 protein expression or activity.
  • compositions for the prevention or treatment of diabetes consisting essentially of CD9 protein expression or activity inhibitors as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a third object of the present invention.
  • (c) providing a method for screening a diabetes therapeutic agent, the method comprising selecting a test substance for reducing the CD9 gene expression level as a diabetes therapeutic candidate as compared to the control cell.
  • compositions for the prevention or treatment of diabetes consisting of an active ingredient in insulin secretion cells deleted from the CD9 gene.
  • compositions for the prevention or treatment of diabetes consisting essentially of the insulin secretion cells deleted from the CD9 gene as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating diabetes, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising an inhibitor of expression or activity of CD9 protein as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating diabetes, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising an insulin secreting cell deleted with the CD9 gene as an active ingredient.
  • compositions for the prevention or treatment of diabetes mellitus comprising an inhibitor of the expression or activity of CD9 protein as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes, consisting of an active ingredient inhibitor or CD9 protein expression or activity.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes consisting essentially of the CD9 protein expression or activity inhibitors as an active ingredient.
  • (c) a method for screening a diabetic agent comprising screening a test substance that reduces CD9 gene expression level as a control agent for diabetic agent compared to a control cell.
  • compositions for preventing or treating diabetes including an insulin secreting cell in which the CD9 gene is deleted as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, which comprises an insulin secreting cell from which the CD9 gene is deleted as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, which is essentially composed of an insulin secreting cell from which the CD9 gene is deleted as an active ingredient.
  • an inhibitor of CD9 protein expression or activity for the preparation of a formulation for the prophylaxis or treatment of diabetes.
  • a method for treating diabetes comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising an inhibitor of expression or activity of CD9 protein as an active ingredient.
  • an insulin secreting cell lacking the CD9 gene for the manufacture of a preparation for the prevention or treatment of diabetes.
  • a method for treating diabetes comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising an insulin secreting cell lacking the CD9 gene as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, including an inhibitor of CD9 protein expression or activity as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes, consisting of an active ingredient inhibitor or CD9 protein expression or activity.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diabetes consisting essentially of the CD9 protein expression or activity inhibitors as an active ingredient.
  • 'treatment' refers to inhibiting the occurrence or recurrence of a disease, alleviating symptoms, reducing the direct or indirect pathological consequences of the disease, decreasing the rate of disease progression, improving the disease state, improving, alleviating or improving the prognosis. do.
  • prevention refers to any action that inhibits the onset of a disease or delays its progression.
  • 'Protein' is used interchangeably with 'polypeptide' or 'peptide' and refers to a polymer of amino acid residues, for example as commonly found in natural proteins.
  • 'Fragment' of a CD9 protein refers to a peptide of a portion of the CD9 protein.
  • 'polynucleotide' or 'nucleic acid' refers to deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA) in the form of a single or double strand.
  • DNA is composed of four bases: adenine (A), guanine (G), cytosine (C), and thymine (T), and RNA is uracil (Uracil, U) instead of thymine.
  • A is a T or U
  • C is a hydrogen bond with the G base, the relationship of the base is called 'complementary'.
  • 'mRNA messenger RNA or messenger RNA
  • RNA messenger RNA or messenger RNA
  • 'mRNA is an RNA that serves as a blueprint for polypeptide synthesis (protein translation, translation) by transferring the genetic information of a nucleotide sequence of a specific gene to a ribosome during protein synthesis.
  • a single strand of mRNA is synthesized through transcription.
  • Diabetes which is the subject of treatment or prevention in the present invention, is a metabolic disorder syndrome characterized by hyperglycemia caused by insulin hormone deficiency or insulin resistance abnormality generated in the beta cells of the pancreas and furthermore, both defects. Diabetes can be divided into insulin dependent diabetes mellitus (IDDM, Type 1) and insulin independent diabetes mellitus (NIDDM, type 2) caused by insulin resistance and insulin secretion impairment, and type 3 diabetes which indicates insulin resistance in the brain. have.
  • IDDM insulin dependent diabetes mellitus
  • NIDDM insulin independent diabetes mellitus
  • diabetes In both type 1 and type 2 diabetes, various complications such as heart disease, intestinal disease, eye disease, neurological disease, stroke, etc. occur, which causes chronic nerve and cardiovascular disease due to elevated blood sugar and insulin levels for a long time. Short-term hypoglycemia and hyperglycemic reactions cause acute complications. Diabetes causes chronic hyperglycemia, leading to lipid and protein metabolic disorders as well as glucose metabolism. The conditions vary and are directly attributable to hyperglycemia and include diabetic peripheral neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic nephropathy, diabetic cataracts, keratosis and diabetic arteriosclerosis in the retina, kidney, nerve and cardiovascular system.
  • type 3 diabetes amyloid, which is a metabolite in the body, cannot be effectively removed due to a decrease in insulin function, resulting in accumulation of amyloid in the brain and pancreas, and thus type 3 diabetes is accompanied by dementia.
  • type 3 diabetes occurs due to various exocrine pancreatic diseases with various mechanisms of hyperglycemia. The most common causes of type 3 diabetes are chronic pancreatitis, pancreatic duct cancer, hemochromatosis, cystic fibrosis, and conventional pancreatic surgery (Lancet Gastroenterol Hepatol. 2016 Nov; 1 (3): 226-237).
  • CD9 modulates the p38MAPK / ERK signaling system in human pancreatic ⁇ cells and protects against cell death by inhibiting CD9. It was found to play a role. Therefore, it can be understood that by inhibiting the expression or activity of the CD9 protein, the death or progression of diabetes can be inhibited by preventing the death of the pancreas, in particular ⁇ cells by glucose toxicity.
  • the diabetes in the present invention may be the subject of diabetes mellitus or advanced or advanced diabetes caused by glucose toxicity, and more specifically, selected from the group consisting of type 1 diabetes, type 2 diabetes and gestational diabetes. It may be.
  • the term 'CD9' is a cell surface glycoprotein receptor of about 24 to 27 kDa belonging to the members of the tetraspanin family, a signal that plays an important role in regulating cell development, activity, growth and motility It is known to regulate signal transduction events. It can also regulate cell adhesion and cell migration and induce platelet activation and aggregation involved in platelet-induced endothelial cell proliferation. In addition, it is involved in various phenomena in cells, such as promoting muscle cell fusion and contributing to myotube maintenance.
  • CD9 protein in the present invention may be derived from a mammal, preferably from a human. Most preferably, the CD9 protein in the present invention comprises the amino acid sequence of human CD9 isoform 1 (NP_001760.1) represented by SEQ ID NO: 1 or human CD9 isoform 2 (NP_001317241.1) represented by SEQ ID NO: 2 (In parentheses NCBI Genbank accession number).
  • the expression inhibitor of the CD9 protein is any one selected from the group consisting of antisense oligonucleotides (sisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, crispr-cas9, DNAzyme and PNA (protein nucleic acid) complementary to CD9 mRNA It may be that.
  • the CD9 mRNA most preferably comprises the nucleotide sequence of human CD9 mRNA transcript variant 1 (NM_001769.3) represented by SEQ ID NO: 3 or human CD9 mRNA transcript variant 2 (NM_001330312.1) represented by SEQ ID NO: 4 (In parentheses NCBI Genbank accession number).
  • the characteristics of the coding region (exon) of the human CD9 mRNA transcript variants are identified in the sequence information obtained by searching the NCBI database with the Genbank accession number described in parentheses.
  • the CD9 protein expression inhibitor according to the present invention may preferably be shRNA that binds to CD9 mRNA complementarily to cause degradation of the mRNA.
  • the shRNA for CD9 may specifically include a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the 'siRNA small interfering RNA or short interfering RNA or silencing RNA
  • RNA gene expression
  • a short, double-stranded RNA that consists of 20 to 25 nucleotides complementary to a specific site of a target mRNA.
  • an antisense strand that is complementary to the target mRNA binds to the target mRNA by binding to the RNA-induced silencing complex (RISC) protein complex, and the argonaute protein in the RISC complex cleaves and degrades the target mRNA.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the shRNA according to the present invention is a substance that induces RNA interference, and includes at least one palindrome sequence in single-stranded RNA, and thus has a double-stranded structure in the molecule and has a hairpin-like structure of about 20 bases or more.
  • a plasmid for expressing shRNA is introduced into a cell and expressed, a siRNA of 21 to 23 base pairs is generated by an RNase III (ribonuclease III) enzyme called a dicer in the cell to induce RNAi.
  • RNase III ribonuclease III
  • the siRNA or shRNA according to the present invention may have various modifications for improving in vivo stability of oligonucleotides, imparting nucleic acid resistance, and reducing nonspecific immune responses.
  • Modifications of the oligonucleotides include those in which the OH group is at the 2 ′ carbon position of the sugar structure in one or more nucleotides, -CH3 (methyl), -OCH3 (methoxy), -NH2, -F, -O-2-methoxyethyl, -O- Propyl, -O-2-methylthioethyl, -O-3-aminopropyl, -O-3-dimethylaminopropyl, -ON-methylacetamido or -O-dimethylamidooxyethyl Modification by substitution with; Modification in which oxygen in a sugar structure in nucleotides is replaced with sulfur; Or a combination of one or more modifications selected from nucleotide-linked phosphoroth
  • the CD9 protein activity inhibitor may be any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide analogs (mimetics), aptamers, antibodies, natural extracts and synthetic compounds specifically binding to the CD9 protein.
  • compositions according to the invention can be formulated in a variety of routes depending on the route of administration by methods known in the art together with pharmaceutically acceptable carriers for the treatment of diabetes.
  • Such carriers include all kinds of solvents, dispersion media, oil-in-water or water-in-oil emulsions, aqueous compositions, liposomes, microbeads and microsomes.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered to a patient in a pharmaceutically effective amount, that is, in an amount sufficient to prevent diabetes or to alleviate and treat symptoms.
  • a typical daily dose may be administered in the range of about 0.01 to 1000 mg / kg, and preferably, in the range of about 1 to 100 mg / kg.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may be administered once or in divided doses within the desired dosage range.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention may be appropriately selected by those skilled in the art according to the route of administration, the subject of administration, age, gender, weight, individual difference, and disease state.
  • the route of administration may be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual, rectal, or pancreas. It may be internal administration, but is not limited thereto, most preferably is directly administered to the pancreas.
  • suitable carriers for oral administration It may be formulated in the form of.
  • suitable carriers include sugars, including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol and starch, cellulose, including starch, corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, and the like.
  • Fillers such as cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like, including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and the like.
  • crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate and the like may optionally be added as a disintegrant.
  • the pharmaceutical composition may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, a preservative, and the like.
  • compositions of the present invention when administered parenterally, may be formulated according to methods known in the art in the form of injections, transdermal and nasal inhalants with suitable parenteral carriers.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device in which the active agent may migrate to the target cell.
  • Preferred modes of administration and preparations are intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular or injectable. Injections include non-aqueous solvents such as aqueous solvents such as physiological saline or ring gel solution, vegetable oils, higher fatty acid esters (e.g., oleic acid, etc.), and alcohols (e.g., ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, or glycerin).
  • Stabilizers e.g., ascorbic acid, sodium bisulfite, sodium pyrosulfite, BHA, tocopherol, EDTA, etc.
  • emulsifiers e.g., buffers to adjust pH, to prevent microbial growth
  • Pharmaceutical carriers such as preservatives (eg, mercury nitrate, chimerosal, benzalkonium chloride, phenol, cresol, benzyl alcohol, etc.).
  • suitable carriers for injections include, but are not limited to, solvents or dispersion media comprising water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols, etc.), mixtures thereof and / or vegetable oils Can be. More preferably, suitable carriers are Hanks solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanol amine or sterile water for injection, isotonic solution such as 10% ethanol, 40% propylene glycol and 5% dextrose. Etc. can be used.
  • solvents or dispersion media comprising water, ethanol, polyols (e.g., glycerol, propylene glycol and liquid polyethylene glycols, etc.), mixtures thereof and / or vegetable oils Can be. More preferably, suitable carriers are Hanks solution, Ringer's solution, phosphate buffered saline (PBS) containing triethanol amine or sterile water for injection
  • the injection may further include various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like.
  • various antibacterial and antifungal agents such as parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid, thimerosal, and the like.
  • the injection may in most cases further comprise an isotonic agent, such as sugar or sodium chloride.
  • transdermal administration agents ointments, creams, lotions, gels, external solutions, pasta preparations, linen preparations, air rolls and the like forms are included.
  • 'transdermal administration' means a topical administration of the pharmaceutical composition to the skin to deliver an effective amount of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition into the skin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in an injectable formulation and administered by lightly pricking or directly applying the skin with a 30 gauge thin injection needle. These formulations are described in prescriptions generally known in pharmaceutical chemistry.
  • the compounds used according to the invention can be prepared by pressurized packs or by means of suitable propellants, for example dichlorofluoromethane, trichlorofluoromethane, dichlorotetrafluoroethane, carbon dioxide or other suitable gas. It can be delivered conveniently from the nebulizer in the form of an aerosol spray. In the case of a pressurized aerosol, the dosage unit can be determined by providing a valve to deliver a metered amount.
  • gelatin capsules and cartridges for use in inhalers or blowers may be formulated to contain a powder mixture of the compound and a suitable powder base such as lactose or starch.
  • compositions according to the present invention may comprise one or more buffers (eg saline or PBS), carbohydrates (eg glucose, mannose, sucrose or dextran), antioxidants, bacteriostatic agents, chelating agents (eg For example, EDTA or glutathione), adjuvants (eg, aluminum hydroxide), suspending agents, thickening agents and / or preservatives may be further included.
  • buffers eg saline or PBS
  • carbohydrates eg glucose, mannose, sucrose or dextran
  • antioxidants eg glucose, mannose, sucrose or dextran
  • bacteriostatic agents eg For example, EDTA or glutathione
  • adjuvants eg, aluminum hydroxide
  • suspending agents eg, thickening agents and / or preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • composition of the present invention may be administered alone or in combination with known compounds that protect pancreatic cells and are effective in treating diabetes.
  • (c) a method for screening a diabetic agent comprising screening a test substance that reduces CD9 gene expression level as a control agent for diabetic agent compared to a control cell.
  • Step (a) is a step of contacting a cell expressing the CD9 gene to determine whether the test substance to be analyzed has activity to inhibit the expression of the CD9 gene.
  • 'contacting' is a general meaning and is meant to bind two or more agents (e.g., two polypeptides) or to bind an agent and a cell (e.g., proteins and cells).
  • agents e.g., two polypeptides
  • a cell e.g., proteins and cells.
  • Contact can occur in vitro. For example, combining two or more agents in a test tube or other container, or combining a test agent with a cell or cell lysate and a test agent. Contact may also occur in cells or in situ.
  • two polypeptides are contacted in a cell or cell lysate by coexpression of a recombinant polynucleotide encoding the two polypeptides in a cell.
  • a protein chip or protein array in which the protein to be tested is arranged on the surface of the stationary phase may be used.
  • the 'test substance' may be used interchangeably with a test agent or an agent, and may include any substance, molecule, element, compound ( compounds, entities, or combinations thereof. Examples include proteins, polypeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and the like. It may also be a natural product, synthetic compound or chemical compound or a combination of two or more substances.
  • Test formulations may be synthetic or natural. The test formulations can be obtained from a wide variety of sources, including libraries of synthetic or natural compounds. Combinatorial libraries can be produced with a variety of compounds that can be synthesized in a step-by-step fashion.
  • ESL encoded synthetic libraries
  • Peptide libraries can be prepared by phage display method (WO91 / 18980).
  • Libraries of natural compounds in the form of bacterial, fungal, plant and animal extracts can be obtained from commercial sources or collected in the field.
  • Known pharmacological agents can be applied to direct or random chemical formulas such as acylation, alkylation, esterification, amidification to produce structural analogs.
  • the test agent may be a naturally occurring protein or fragment thereof. Such test preparations may be obtained from natural sources such as cell or tissue lysates. Libraries of polypeptide preparations can be obtained, for example, from cDNA libraries produced by conventional methods or commercially available.
  • the test agent may be a peptide such as a peptide having about 5-30, preferably about 5-20, more preferably about 7-15 amino acids.
  • the peptide may be a cleavage of a naturally occurring protein, random peptide or 'biased' random peptide.
  • the test agent may also be a nucleic acid. Nucleic acid test agents can be naturally occurring nucleic acids, random nucleic acids, or 'biased' random nucleic acids. For example, cleavage of the prokaryotic or eukaryotic genome can be used similarly as described above.
  • the test formulation may also be a small molecule (eg, a molecule having a molecular weight of about 1,000 Da or less).
  • the method for screening small molecule modulating agents may preferably be subjected to a high throughput assay. Many assays are useful for such screening.
  • the cell expressing CD9 may be a cell expressing CD9 intrinsically, or may be a cell transformed with a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding CD9 and overexpressing CD9.
  • the cell expressing the CD9 gene may be an insulin secreting cell, for example, a pancreatic ⁇ cell or a cell derived from pancreatic beta cells.
  • the inventors have used IPCs cell lines derived from human pancreatic beta cells as cells that express CD9 intrinsically.
  • Step (b) is a step of measuring the gene expression level of the CD9 in the cells expressing CD9 in contact with the test substance and the cell expressing CD9 did not contact the test substance.
  • the method for measuring the expression level of the CD9 gene can be carried out by measuring the mRNA or protein level of CD9.
  • Measurement of mRNA expression can be used without limitation the expression level determination method conventional in the art, and examples of the analysis method is reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), competitive RT-PCR (competitive RT-PCR) ), Real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), northern blotting, DNA microarray chip, RNA sequencing ), But is not limited to these.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • competitive RT-PCR competitive RT-PCR
  • RPA RNase protection assay
  • northern blotting DNA microarray chip
  • RNA sequencing RNA sequencing
  • methods for measuring the expression level of the protein can be used without limitation methods known in the art, such as western blotting, dot blotting, enzyme-linked immunosorbent assay Radioimmunoassay, radioimmunoassay, oukteroni immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation, complement fixation assay, flow cytometry (FACS) or protein chip methods There is, but is not limited to these.
  • Step (c) is a step of selecting a test substance for reducing the expression level of the CD9 gene as a candidate for treating diabetes compared with a control cell.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, including insulin secreting cells deleted from the CD9 gene as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, which comprises an insulin secreting cell from which the CD9 gene is deleted as an active ingredient.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating diabetes, which consists essentially of an insulin secreting cell deleted from the CD9 gene.
  • IPCs Insulin producing cells
  • the method for preparing the 'insulin secreting cell deleted with the CD9 gene' of the present invention is not limited thereto, and may include the following steps:
  • step (b) transfecting the exosome isolated in step (a) with an antibody that specifically binds to CD9;
  • step (c) transfecting the exosome prepared in step (c) to insulin secreting cells.
  • the exosomes may contain a target protein (an antibody in the present invention) therein and serve as a carrier for transporting the protein of interest to target cells or tissues of the protein of interest, carried by the exosomes
  • the desired protein can then be used to act on target cells or tissues to delete specific genes (inhibit the expression or activity of the gene).
  • exosomes transfected with the antibody When the antibody-transfected CD9 is deleted (inhibits the expression or activity of CD9) by using the exosomes transfected with the antibody according to the above method, phagocytosis caused by macrophages by incorporating the antibody in an unstable state into the exosomes. It can avoid action or degradation and can circulate for a long time in the body.
  • exosomes transfected with antibodies have the advantage of potentially avoiding endosomal pathways and lysosomal degradation, thereby delivering the antibodies directly to targets in insulin secreting cells (see WO2013084000A2, etc.).
  • the exosomes are isolated from the insulin secreting cells, the CD9 antibody is transfected into the exosomes, and the prepared CD9 antibody-transfected exosomes are transfected into the insulin secreting cells to form the CD9 of the insulin secreting cells.
  • the expression or activity of the protein was knocked out. Deletion of the CD9 gene of insulin secreting cells using exosomes was the first discovery of the present inventors.
  • the insulin secretion is increased, thereby reducing the blood sugar in the individual and controlling the blood glucose level. there was.
  • the 'insulin secreting cells' may be differentiated from stem cells, but is not limited thereto.
  • the method of differentiating insulin secreting cells from stem cells is not limited if it is known.
  • Soria et al. Soria B, Roche E, Berna G and Leon-Quinto T (2000) Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 49, 157-162, Assady et al. [Assady S, Maor G, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Skorecki KL, and Tzukerman M. (2001) Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 50, 1691-1707], Fujikawa et al.
  • the stem cells are undifferentiated cells having the ability to differentiate into various body tissues, which are classified into totipotent stem cells, pluripotent stem cells, and multipotent stem cells. Can be.
  • Stem cells in the present invention may be adult stem cells, embryonic stem cells, medial stem cells, tumor stem cells or induced pluripotent stem cells, depending on their origin or type.
  • the term 'mesenchymal stem cell (MSC)' has the ability to differentiate into ectoderm cells such as neurons or various mesodermal cells including bone, cartilage, fat, and muscle cells. It is a multipotent stem cell.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from those selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerves, skin, amniotic membrane, chorion, decidual membrane, and placenta.
  • the mesenchymal stem cells may be derived from humans, fetuses, or mammals except humans. Mammals other than the human may be more preferably canine, feline, ape, animal, cow, sheep, pig, horse, rat, mouse or guinea pig, and the like, without limitation.
  • the active ingredient is a concept including a cell culture solution containing the cell, a concentrate of a cell culture, and the like.
  • the present invention provides the use of a CD9 protein expression or activity inhibitor for the preparation of a preparation for the prevention or treatment of diabetes.
  • the present invention provides a method for treating diabetes comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising an inhibitor of the expression or activity of CD9 protein as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of insulin secreting cells lacking the CD9 gene for the preparation of a preparation for the prophylaxis or treatment of diabetes.
  • the present invention provides a method for treating diabetes, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising an insulin secreting cell lacking the CD9 gene as an active ingredient.
  • the term 'effective amount' of the present invention when administered to an individual, refers to an amount that exhibits an effect of improving, treating, preventing, detecting, diagnosing, or suppressing or reducing diabetes
  • the term 'individual' refers to an animal, preferably a mammal. It may be an animal, especially a human, and may be cells, tissues, organs and the like derived from the animal. The subject may be a patient in need of the effect.
  • treatment' of the present invention refers generically to ameliorating the symptoms of diabetes or diabetes, which may include treating, substantially preventing, or ameliorating the condition, one symptom resulting from diabetes Or alleviate, cure or prevent most of the symptoms.
  • the present invention can control cell death by regulating the expression of related factors upon CD9 inhibition in hyperglycemic conditions, reducing insulin resistance and increasing sensitivity through increased tyrosine phosphorylation, and increasing insulin secretion by inhibiting CD9. It can be usefully used to develop a therapeutic agent for diabetes of a novel mechanism of action that inhibits the expression or activity of CD9 protein.
  • CD9 plays a role in reducing ERK phosphorylation and promotes apoptosis by caspase-3 in pancreatic beta cells, lowering CD9 activity inhibits hyperglycemia and protects pancreatic beta cells. It is effective and can be used to screen for anti-diabetic candidates by screening for agents that inhibit the expression or activity of CD9.
  • the insulin secretion is increased when the insulin-secreting cells in which the CD9 gene is knocked-out are administered or transplanted to the individual, thereby reducing the blood sugar and controlling the blood glucose level in the individual.
  • Figure 1 shows the results of Western blotting on the protein level of cleaved caspase 3, apoptosis-related protein when CD9 is inhibited in insulin producing cells (IPCs) differentiated from mesenchymal stem cells. It was used as a loading control of.
  • IPCs insulin producing cells
  • FIG. 2 shows the results of Western blotting of phosphorylation of p38MAPK when CD9 is inhibited in IPCs cells. GAPDH was used as loading control of the protein.
  • FIG. 3 shows the results of Western blotting of phosphorylation of ERK when CD9 is inhibited in IPCs cells. ⁇ -actin was used as loading control of the protein.
  • Figure 5 shows the change in insulin secretion when CD9 inhibited in IPCs cells. PBS was used as a control.
  • mice 6 is divided into 5 weeks old mice into a normal diet (ND) and a high fat diet (HFD) group per group, CD9KO-IPCs transplanted at 1 week of breeding, blood glucose of diet-induced obese mice It is the result of measuring concentration.
  • ND normal diet
  • HFD high fat diet
  • FIG. 7 is divided into 5 week-old mice into a normal diet group (ND) and a high fat diet group (HFD), and transplanted CD9KO-IPCs at 1 week of breeding. This is the result of measuring sensitivity.
  • ND normal diet group
  • HFD high fat diet group
  • mice 8 is divided into 5 weeks old mice into a normal diet (ND) and a high fat diet (HFD) group per group to transplant CD9KO-IPCs at 1 week, glucose tolerance of diet-induced obese mice Is the result of measuring.
  • ND normal diet
  • HFD high fat diet
  • Figure 9 shows the effect of anti-CD9 antibody on the third diabetes.
  • IPCs cells which are insulin secreting cell lines, were differentiated from mesenchymal stem cells. Incubated at 37 ° C., 5% CO 2 , using low glucose (5 mM glucose DMEM) containing 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 10 uM troglitazone, and 16.7 ⁇ M zinc sulfate. . Glucose toxicity was induced by treating 33 mM glucose for 48 hours. 10 ⁇ M CD9 antibody (ST pharm) was then treated for 48 hours.
  • Pancreatic cancer cells MIA PaCa-2 cells, were cultured in RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum (Thermo, Rockville, MD, USA).
  • Cells were lysed using RIPA buffer (50mMTris-HCl, 150mMNaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS) containing protease inhibitor cocktail (Roche Diagnostics). Protein lysates were quantified by BCA protein assay kit (Roche Diagnostics) and cell lysates containing the same amount of protein were separated by SDS-PAGE. The protein was then transferred to Immobilon NC membranes. Blocking was performed with TBS containing 5% skim milk or 5% BSV (bovine albumin serum) and Tween 20 solution (0.05% Tween 20) for 1 hour.
  • RIPA buffer 50mMTris-HCl, 150mMNaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS
  • BCA protein assay kit Roche Diagnostics
  • Tween 20 solution 0.05% Tween 20
  • Antibodies and probes were reacted overnight at 4 ° C with CD9 (Abnova, Taiwan), GAPDH (Santa Cruz Biotechnology), p38MAPK (pMAPK, Santa Cruz), and phosphated ERK (pERK, cell signaling), and peroxidase bound for 1 hour. Secondary antibodies were reacted. Membranes were washed three times with TBS and Tween 20 three times, and bands were observed with a ChemiDoc MP system (Bio-Rad) using a chemiluminescence system (Thermo Fisher Scientific). The intensity of the band was measured using the Image J program.
  • PcDNA 3.1 (Invitrogen) was used as a general expression vector, and antibodies were purchased from ST Pharm.
  • the base sequence of the sHRNA used is as described in SEQ ID NO: 5 (5'-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACC AACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT-3 ') of the Sequence Listing herein.
  • IPCs cells were transfected with antibodies using Lipofectamine RNAiMAX reagent (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • BD-MSCs bone marrow derived mesenchyma stem cells
  • IPCs Insulin secreting ⁇ cells
  • mice Five-week-old mice were reared in groups of 8 per group in the normal diet (ND) and high fat diet (HFD) groups. At 1 week of breeding, 3 ⁇ 10 6 CD9KO-IPCs were implanted into the mouse pancreas.
  • Exosome is isolated from ExoQuick kt (SBI bio) in 10 ml of culture media of IPCs.
  • the exosomes in 500ul of sterile PBS is approximately 50 ⁇ 300ug.
  • 10ul Exo-Fect solution, 10ul PBS solution, 50ul purified exosomes, CD9 antibody (20ul) in a sterile 1.5ml tube was mixed three times and mixed well.
  • Incubate the mixed exosome transfection solution with a shaker at 37 ° C. for 1 hour and immediately place the tube on ice.
  • 30 ⁇ l of ExoQuickTC reagent is transfected into the exosome sample suspension and mixed well for 6 times. The transfection sample is again stabilized on ice or 4 ° C. for 30 minutes.
  • transfected exosomes To obtain transfected exosomes, centrifuge the sample at 13,000-14,000 rpm at microfuge (maximum speed) for 3 minutes, remove the supernatant and freeze the transfected exosome pellets in 300ul 1x PBS. Add 6-well transfected exosomes (300ul) to IPCs grown to about 1x10 5 and incubate in 37 ° C incubation for 24 hours.
  • Type 3 diabetes is caused by the pancreatic ductal adenocarcinoma as follows.
  • Pancreatic cancer cells MIA PaCa-2 cells, were harvested from culture plates and centrifuged for 3 minutes at 13,000 rpm. The supernatant was then removed and resuspended in fresh culture medium. Resuspended cells were plated in 6-well plates or in ultra low adhesion surface 96-well round bottom plates for two-dimensional (2D) monolayer culture. Subsequently, centrifugation at 1,800 rpm for 3 minutes to form a three-dimensional (3D) spheroid culture. It was incubated in a 37 ° C. incubator for 3 days. In addition, each cell was incubated as a control. 100 ul was then incised into the abdominal wall and injected with orthotopic injection.
  • Diabetes induction results were confirmed by measuring blood glucose at 7, 14, 21 and 28 days, respectively.
  • IPCs cells transfected with exosomes were incubated for 2 days under conditions of normal glucose (NG) or high glucose (HG: 33 mM), respectively.
  • NG normal glucose
  • HG high glucose
  • ⁇ -actin was used as loading control of the protein.
  • CD9 antibody was inhibited and the cleaved caspase 3 expression level was measured under high glucose conditions.
  • Phosphorylation of p38 mitogen-activated protein kinase (p38) and extracellular-signal-regulated kinase (ERK) is required to protect the death of pancreatic beta cells and to maximize glucose-dependent activation of the insulin gene promoter.
  • IPCs cells transfected with exosomes were cultured in 48 well plates (Corning, Life Sciences) at a concentration of 5 ⁇ 10 3 cells / well. Expression levels of p38MAPK and phosphorylated ERK1 / 2 were measured. PBS treatment group was used as a control, ⁇ -actin or GAPDH was used as a loading control of the protein.
  • CD9 protects the death of pancreatic beta cells and increases the expression and secretion of insulin genes by regulating the signaling pathways associated with p38MAPK and ERK1 / 2 phosphorylation.
  • IRS-1-associated PI3K activity is regulated by the tyrosine phosphorylation of IRS-1 or the amount of IRS-1 protein itself, and a reduction in the amount of tyrosine phosphorylation protein of IRS-1 is observed in various diabetic animal models or diabetic environments.
  • Tyrosine phosphorylation was measured by Western blot by treatment with or without 100 nm insulin for 10 minutes in IPCs cells. [Beta] -actin was used as a loading control of the protein.
  • IPCs cells were incubated in 48 well plates (Corning, Life Sciences) at a concentration of 5 ⁇ 10 3 cells / well. Deletion of CD9 with an exosome transfected with an antibody against CD9, and insulin secretion was measured. PBS treatment group was used as a control.
  • mice Five-week-old mice were reared in groups of 8 per group in the normal diet (ND) and high fat diet (HFD) groups.
  • CD9KO-IPCs transfected with exosomes at 1 week of breeding were transplanted and blood glucose levels and insulin concentrations (FIG. 6) of diet-induced obese mice were measured.
  • blood glucose levels were measured using a kit ACCU-CHECK Compact Plus (Roche Diagnostics, Japan), which measures blood glucose levels, respectively. The content was found to be lower.
  • the CD9KO-IPCs of the present invention has an excellent hypoglycemic effect.
  • mice Five-week-old mice were reared in groups of 8 per group in the normal diet (ND) and high fat diet (HFD) groups.
  • CD9KO-IPCs transfected with exosomes at 1 week of breeding were implanted and measured insulin sensitivity (FIG. 7) and glucose tolerance (FIG. 8) of diet-induced obese mice.
  • HFD high-fat diet group
  • IPGTT intraperitoneally
  • Insulin 0.5 U kg-1 in body weight
  • IP intraperitoneal
  • Example 7 Effect of anti-CD9 antibody on tertiary diabetes
  • Pancreatic cancer cells MIA PaCa-2 cells
  • type 3 diabetes was induced due to a rapid increase in blood glucose levels in mice.
  • the anti-CD9 antibody was injected subcutaneously and blood glucose was measured. As shown in FIG. 9, it was confirmed that blood glucose was reduced to a normal level in the number of days.
  • PDAC-DM type 3C diabetes
  • T3cDM type 3C diabetes
  • the present invention can screen for anti-diabetic candidates by screening for agents that inhibit the expression or activity of CD9, and increase insulin secretion when administering or implanting insulin-secreting cells with a knocked-out CD9 gene to a subject.
  • the blood sugar in the individual is reduced and the blood glucose control ability is very excellent, so there is industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 CD9를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제 또는 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 (a) 시험 물질을 CD9 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CD9 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.

Description

CD9를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법
본 출원은 2018년 7월 20일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0084845호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 CD9를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제 또는 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 (a) 시험 물질을 CD9 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CD9 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.
당뇨에서 글루코스 독성은 β-세포의 세포사멸(apoptosis)을 야기하고, 췌장을 포함한 다양한 장기 시스템에 영향을 미친다. 그러나 기본적인 메커니즘은 완전하게 알려져 있지는 않다. β-세포의 장애 및 손상된 인슐린 생산은 당뇨의 전형적인 특징이나(Xu, G et al., Nat. Med. 19, 1141-1146. 2013), 당뇨병의 급속한 확산에도 불구하고 β-세포의 세포사멸을 야기하는 글루코스 독성의 정확한 분자적 메커니즘은 여전히 알려지지 않았다(Chen, J et al., Diabetes 57, 938-944. 2008).
세포사멸(apoptosis)은 특화된 세포 내 신호 전달이 활성화되어 세포를 소멸시키는 것으로, 체내에서 자연적으로 일어나는 과정이다. 이는 조직에서 세포 개체수를 유지하기 위한 항상성 메커니즘이기도 하다. 부적절한 세포사멸은 근본적으로 허혈성 손상, 자가면역질환 및 많은 종류의 암과 같은 대사성 스트레스, 신경퇴행성 질환, 글루코스 독성을 포함하는 다양한 병리 현상에서 공통적으로 나타난다(Elmore, S et al., Toxicol . Pathol. 35, 495-516. 2007). 이러한 세포사멸은 mitochondria에서 배출된 cytochrome c에 의해 caspase-9, -3을 활성화시키는 intrinsic pathway와, TNF-α(tumor nerosis factor-α)와 Fas ligand 등의death receptor에 의하여 caspase-8과 -10이 활성화되는 extrinsic pathway의 두 가지 경로로 나뉜다. 이외에도 caspase와는 무관한 다양한 단백의 활성화가 세포사멸 신호전달에 관여하는 것으로 알려져 있다.
Mitogen-activated protein kinases(MAPK)에는 extracellular regulated protein kinase (ERK), p38 MAPK 그리고 c-jun N-terminal protein kinase (JNK) 등의 세 가지 serine-threonine kinases가 있다. 외부자극에 의하여 활성화된 MAPK는 세포의 생존, 사멸, 이동 등 다양한 세포의 생리현상에 관여한다. ERK는 세포의 분열과 생존, matrix-integrin interaction 등 주로 세포의 생존과 관련된 기전에 관여하며, p38 MAPK와 JNK는 stress-activated protein kinase (SAPK)라고도 하며 사이토카인, 고온, 삼투압 충격(osmotic shock), 내독소(endotoxin), 자외선 등에 의해 활성화된다. 따라서 이들은 주로 여러 세포 형태에서 세포 사멸 유도와 관련되어있으나 세포나 조직의 종류 및 자극에 따라 다양한 양상을 나타낸다. 특히 JNK의 경우는 apoptosis의 intrinsic pathway에 일부 관여한다.
CD9은 분자량이 24 내지 27 kDa의 테트라스파닌(tetraspanin)계 세포막 당단백질로 포유 동물에는 34개의 테트라스파닌이 있으며, 그 중 33개가 인간에서 확인되었다. 각각의 테트라스파닌은 세포 부착 및 이동, 혈소판 활성 및 응집, 포유동물의 수정 과정에서 난자와 정자의 융합, 암의 발생 및 전이, 체액성 면역 반응 및 알러지 반응, 인간 면역 결핍 바이러스-1(HIV-1)과 인플루엔자 바이러스 복제 등에 중요한 역할을 하는 항원으로 알려져 있다. 그러나, 인간에서 CD9 항원의 세포 노화 조절이나, 노화 조절 연구는 단순히 노화된 사람 혈관 내피세포에서 발현이 증가되는 것이 보고되었을 뿐, CD9의 세포사멸 기전 및 인슐린 발현에 미치는 영향은 보고되지 않았다.
엑소좀(Exosome)은 세포 간 신호전달을 하기 위하여, 단백질, DNA, RNA 등을 가지고 세포 밖으로 분비되어지는 50 - 200 nm 크기의 막구조의 작은 소낭을 가리킨다.
엑소좀에는 세포 내의 다양한 단백질, DNA, RNA 등이 포함되어 있다. 이러한 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들은 세포막과의 융합 (fusion) 혹은 내포작용 (endocytosis)에 의해 다른 세포 내로 다시 유입되어 세포 간의 통신자로서의 역할을 하기도 한다. 또한, 이러한 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들을 분석하여 특정 질환의 진단에 이용될 수 있다.
그러나, 본 발명과 같이 엑소좀을 세포내로 주입하여 유전자를 결실하는 방법 및 그러한 방법으로 CD9 유전자가 결실된 세포의 당뇨병 치료 효과에 대해서는 종래에 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 CD9 억제시 췌장 베타 세포에서 p35MAPK 및 ERK 인산화가 증가되며, cleaved caspase-3에 의한 세포사멸을 억제하는 기능이 있으며, 인슐린 분비량이 증가되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
(a) 시험 물질을 CD9 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CD9 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 시험 물질을 CD9 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CD9 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
당뇨병의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
당뇨병의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포의 용도를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 '치료'는 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 '예방'은 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
'단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. CD9 단백질의 '단편(fragment)'은 CD9 단백질의 일부분의 펩타이드를 말한다.
본 발명에서 '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 '상보적(complementary)'이라고 한다.
한편, 'mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.
본 발명에서 치료 또는 예방의 대상인 '당뇨병'은 췌장의 베타 세포에서 생성되는 인슐린 호르몬 부족 또는 인슐린 저항성의 이상과 나아가 이러한 두 가지 모두의 결함으로 발생하는 고혈당을 특징으로 하는 대사장애증후군이다. 이러한 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM, Type 1)과 인슐린 저항 및 인슐린 분비 손상에 의해 발생하는 인슐린 비의존형 당뇨병(NIDDM, Type 2), 그리고, 뇌에서의 인슐린 저항성을 나타내는 제3형 당뇨병으로 나눌 수 있다.
제1형과 제2형 당뇨병 모두에서 심장 질환, 장 질환, 안과 질환, 신경 질환, 뇌졸중 등과 같은 다양한 합병증이 발생하게 되는데, 이는 장시간 동안 혈당과 인슐린 수준이 상승하여 만성신경질환과 심혈관질환이 발생하게 되고 단시간의 저혈당과 고혈당 반응으로 급성 합병증을 야기시키게 되는 것이다. 당뇨병은 고혈당이 만성으로 지속되면서 당질 대사뿐만 아니라 지질 및 단백질 대사 장애도 함께 일으킨다. 그 병태는 다양하며 직접 고혈당에 기인하는 것으로 망막, 신장, 신경, 심혈관계 등에서 당뇨병성 말초신경장해, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 백내장, 각막증, 당뇨병성 동맥경화증 등이 있다.
또한, 제3형 당뇨병의 경우, 인슐린 기능의 저하로 인해서 몸 속에서 생기는 대사산물인 아밀로이드가 효과적으로 제거되지 못하게 되어 뇌, 췌장에서의 아밀로이드 축적이 발생하며, 이로 인해서 3형 당뇨병은 치매가 함께 동반될 수 있다. 즉, 아밀로이드가 뇌에 쌓이면 그 부분의 뇌 기능이 떨어지면서 알츠하이머치매가 발생할 수 있다. 아울러, 제3형 당뇨병은 고혈당의 다양한 메커니즘을 가진 다양한 외분비 췌장 질환 때문에 발생한다. 제3형 당뇨병의 가장 흔한 원인은 만성 췌장염, 췌관 관암, 혈색소 침착증, 낭포 성 섬유증 및 기존에 받은 췌장 수술이다 (Lancet Gastroenterol Hepatol. 2016 Nov;1(3):226-237).
당뇨병을 일으키고 심화시키는 중요한 병리 현상의 하나는 고혈당에 의한 췌장 β세포의 사멸이다. 본 발명자들은 혈당이 높아진 상태에서 췌장을 비롯한 다양한 장기에 영향을 미치는 글루코스 독성(glucose toxicity 또는 glucotoxicity)에서 CD9가 인간의 췌장 β세포에서 p38MAPK/ERK 신호체계를 조절하고 CD9을 억제함으로써 세포사멸을 방어하는 역할을 하는 것을 규명하였다. 따라서 CD9 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 글루코스 독성에 의한 췌장, 특히 β세포의 사멸을 방지하여 당뇨병의 발생 또는 진행을 억제할 수 있음을 이해할 수 있다.
이에 따라, 본 발명에서의 당뇨병은 글루코스 독성에 의하여 유발되는 당뇨병 또는 심화 또는 진행된 당뇨병이라면 그 대상이 될 수 있으며, 보다 구체적으로는 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 'CD9'는 테트라스파닌계(tetraspanin family)의 멤버에 속하는 약 24~27 kDa의 세포표면 당단백질 수용체로서, 세포 발달, 활성, 성장 및 운동성을 조절하는데 중요한 역할을 하는 신호전달 작용(signal transduction events)을 조절한다고 알려져 있다. 또한, 세포 부착 및 세포 이동을 조절할 수 있고, 혈소판-유발 내피세포 증식(platelet-induced endothelial cell proliferation)에 관여하는 혈소판활성화(platelet activation)와 집성(aggregation)을 유도한다. 아울러, 근육세포 융합(muscle cell fusion)을 촉진하고 근관 유지(myotube maintenance)에 기여하는 등 세포 내의 다양한 현상에 관여한다.
본 발명에서의 CD9 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명에서의 CD9 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간의 CD9 isoform 1(NP_001760.1) 또는 서열번호 2로 표시되는 인간의 CD9 isoform 2(NP_001317241.1)의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다(괄호 안은 NCBI Genbank accession number).
상기 CD9 단백질의 발현 억제제는 CD9 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, crispr-cas9, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 또한 상기 CD9 mRNA는 가장 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 인간 CD9 mRNA transcript variant 1(NM_001769.3) 또는 서열번호 4로 표시되는 인간 CD9 mRNA transcript variant 2(NM_001330312.1)의 염기서열을 포함하는 것이다(괄호 안은 NCBI Genbank accession number). 상기한 인간의 CD9 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genbank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.
나아가, 본 발명에 따른 CD9 단백질 발현억제제는 바람직하게는 CD9 mRNA에 상보적으로 결합하여 mRNA의 분해를 유발하는 shRNA일 수 있다. 상기 CD9에 대한 shRNA는 구체적으로는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 'siRNA(small interfering RNA 또는 short interfering RNA 또는 silencing RNA)'는 세포 안에 인위적으로 도입되어 특정 유전자의 mRNA의 분해를 유도하여 단백질 번역(translation)이 나지 않도록 하여 유전자 발현을 억제하는 RNA 간섭(RNA interference) 현상을 일으키는 짧은 이중가닥의 RNA로, 표적 mRNA의 특정 부위에 상보적인 20 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 세포 내에서 siRNA의 이중 가닥 중 표적 mRNA에 상보적인 가닥(antisense strand)이 RISC(RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체와 결합하여 표적 mRNA에 결합하고, RISC 복합체 안의 argonaute 단백질이 표적 mRNA를 절단하여 분해시키거나, 단백질 번역에 중요한 단백질과 리보솜이 mRNA와 결합하는 것을 억제하는 등의 기작으로 특정 유전자의 발현을 억제한다.
본 발명에 따른 shRNA는 RNA 간섭을 유도하는 물질로서, 1본쇄 RNA에서 부분적으로 회문상의 염기서열을 포함함으로써, 분자 내에서 2본쇄 구조를 가지고 헤어핀과 같은 구조가 되는 약 20염기 이상의 분자이다. 또한, shRNA 발현용 플라스미드(plasmid)를 세포 내로 도입시켜 발현하게 되면, 세포 내의 다이서(dicer)라는 RNaseⅢ(ribonucleaseⅢ) 효소에 의해 21~23개 염기쌍의 siRNA가 생성되어 RNAi를 유도한다.
본 발명에 따른 siRNA 또는 shRNA는 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 가한 것일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F, -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다.
또한 상기 CD9 단백질 활성 억제제는 CD9 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 유사체(mimetics), 앱타머, 항체, 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수도 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 당뇨병 치료를 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양, 즉 당뇨병을 예방하거나 증상을 완화하고 치료하기 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.01 내지 1000㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있으며, 바람직하게는, 약 1 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하, 직장, 또는 췌장 내 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 가장 바람직하게는 췌장으로 직접 투여된다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우, 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화할 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다.
또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제 또는 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액 또는 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르 (예로, 올레인산에칠 등), 알코올류(예로, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜 또는 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제 (예로, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예로, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약제학적 담체를 포함할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피투여제의 경우, 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 '경피투여'는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서에 기술되어 있다.
흡입투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 당업계에 공지되어 있는 것을 참고로 할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나, 췌장 세포를 보호하고 당뇨병 치료의 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.
또한 본 발명은
(a) 시험 물질을 CD9 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CD9 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계는 분석의 대상인 시험 물질이 CD9 유전자의 발현을 억제하는 활성이 있는지 확인하기 위하여 CD9 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계이다.
본 발명의 방법에서 '접촉(contacting)'은 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예를 들어, 2개의 폴리펩티드)를 결합시키거나, 제제와 세포(예를 들어, 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다. 또한 테스트하고자 하는 단백질이 고정상의 표면에 배열된 단백질 칩(protein chip)이나 단백질 어레이(protein array)를 이용할 수도 있다.
또한 본 발명의 방법에서 '시험 물질'은 시험 제제(test agent) 또는 제제(agent)와 호환가능하게 사용할 수 있는 것으로, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 방법으로 스크리닝할 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 유도체(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 이들의 조합을 포함한다. 시험 제제는 합성 물질 또는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같이 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.
상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5~30개, 바람직하게는 약 5~20개, 보다 바람직하게는 약 7~15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 '바이어스(biased)' 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다. 또한 상기 시험 제제는 핵산일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 '바이어스(biased)' 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용할 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 소분자(small molecule; 예를 들어, 약 1,000Da이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다.
본 명세서에서 '발현(expression)'이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. 상기 CD9를 발현하는 세포는 CD9를 내재적으로 발현하는 세포일 수도 있고, CD9를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 CD9를 과발현하는 세포일 수도 있다. 바람직하게는 상기 CD9 유전자를 발현하는 세포는 인슐린 분비세포일 수 있으며, 예를 들어, 췌장 베타 세포(pancreatic β cell) 또는 췌장 베타 세포에서 유래한 세포일 수 있다. 본 발명자들은 CD9를 내재적으로 발현하는 세포로서 인간의 췌장 베타 세포에서 유래한 IPCs 세포주를 사용한 바 있다.
상기 (b) 단계는 시험 물질을 접촉시킨 CD9를 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키지 않은 CD9를 발현하는 세포에서 CD9의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계이다.
상기 CD9 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 CD9의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하여 실시할 수 있다.
mRNA 발현의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩(microarray chip), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한 단백질의 발현 수준 측정 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계는 대조군 세포와 비교하여 CD9 유전자의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계이다.
본 발명자들이 규명한 바와 같이, CD9 억제시 인슐린 분비가 증가되고, 세포 사멸을 방어하는 역할을 한다. 따라서 CD9의 유전자의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질은 CD9의 단백질 수준 및 단백질의 활성 수준을 떨어뜨려 췌장 β 세포에서 글루코스 독성으로 유발되는 세포사멸을 방지하고 따라서 이로 인하여 유발되는 당뇨병을 지연시키거나 증상을 완화할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명은 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 필수적으로 구성되는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 '인슐린 분비 세포(insulin producing cells; IPCs)'란 인슐린을 분비할 수 있는 세포로 인슐린 분비능이 있으면 그 종류가 제한되지 않으나, 일반적으로는 췌장 베타 세포를 의미한다.
본 발명의 'CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포'를 제조하는 방법은 이에 제한되지 않으나, 다음의 단계를 포함할 수 있다:
(a) 인슐린 분비 세포에서 엑소좀을 분리하는 단계;
(b) 상기 단계(a)에서 분리된 엑소좀에 CD9에 특이적으로 결합하는 항체를 형질주입(transfection)하는 단계; 및
(c) 상기 (c)단계에서 제조된 엑소좀을 인슐린 분비 세포에 형질주입하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 엑소좀은 목적 단백질(본 발명에서는 항체)을 내부에 포함하여 목적 단백질의 표적 세포 또는 조직으로 목적단백질을 운반하는 운반체로서 역할을 수행할 수 있는데, 상기 엑소좀에 의하여 운반된 목적 단백질은 표적 세포 또는 조직에 작용하여 특정 유전자를 결실(유전자의 발현 또는 활성을 억제)시키는데 사용될 수 있다.
상기 제조방법에 따라 항체가 형질주입된 엑소좀을 이용하여 인슐린 분비 세포 내 CD9을 결실(CD9의 발현 또는 활성을 억제)시키는 경우, 불안정한 상태인 항체를 엑소좀 안에 내재함으로써, 대식세포에 의한 식균작용이나 분해를 피할 수 있으며 신체 내에서 장시간 순환할 수 있다. 또한, 항체가 형질주입된 엑소좀은 잠재적으로 엔도솜 경로 및 리소좀 분해를 피할 수 있어, 항체를 인슐린 분비세포 내 표적에 직접적으로 전달할 수 있다는 장점이 있다(WO2013084000A2 등 참조).
본 발명의 일실시예에서는 인슐린 분비세포에서 엑소좀을 분리하고, CD9 항체를 엑소좀에 형질주입한 뒤, 제조된 CD9 항체 형질주입된 엑소좀을 인슐린 분비세포에 형질주입하여 인슐린 분비세포의 CD9 단백질의 발현 또는 활성을 제거(knock-out)하였다. 엑소좀을 이용하여 인슐린 분비세포의 CD9 유전자를 결실시키는 것은 본 발명자들이 최초로 발견한 것이다.
또한, 본 발명의 일실시예에서는 CD9 유전자가 제거(knock-out)된 인슐린 분비 세포를 개체에 투여 또는 이식하는 경우 인슐린 분비가 증가되어, 개체내 혈당이 감소하고 혈당량 조절능이 매우 우수함을 확인할 수 있었다.
상기 '인슐린 분비 세포'는 줄기세포에서 분화된 것일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 줄기세포에서 인슐린 분비 세포를 분화하는 방법은 공지된 것이라면 그 방법이 제한되지 않으나, 그 예로 Soria 등[Soria B, Roche E, Berna G and Leon-Quinto T (2000) Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streptozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 49, 157-162], Assady 등[Assady S, Maor G, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Skorecki KL, and Tzukerman M. (2001) Insulin production by human embryonic stem cells. Diabetes 50, 1691-1707], Fujikawa 등[Fujikawa T, Oh SH, Pi L, Hatch HM, Shupe T, and Petersen BE (2005) Teratoma formation leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cell-derived insulin-producing cells. Am J Pathol 166, 1781-1791] 등의 문헌을 참조할 수 있다.
상기 줄기세포는 다양한 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서, 이는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기 세포(multipotent stem cell)로 분류될 수 있다.
본 발명에서 줄기세포는 그 유래 또는 유형에 따라, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간옆 줄기세포, 종양줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 '중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)'는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)이다. 상기 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 융모막, 탈락막, 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 것으로부터 유래될 수 있다. 또한, 상기 중간엽 줄기세포는 인간, 태아, 또는 인간을 제외한 포유동물로부터 유래될 수 있다. 상기 인간을 제외한 포유동물은 보다 바람직하게는 개과 동물, 고양이과 동물, 원숭이과 동물, 소, 양, 돼지, 말, 랫트, 마우스 또는 기니피그 등일 수 있으며, 그 유래를 제한하지 않는다.
상기 유효성분은 상기 세포를 포함하는 세포 배양액, 세포 배양물의 농축물 등을 포함하는 개념이다.
본 발명은 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명은 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 당뇨병의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단 또는 당뇨병의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기 ‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 당뇨병 또는 당뇨병의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 당뇨병을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 당뇨병으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는’ 또는 ‘특징으로 하는’과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ‘~로 구성되는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(consisting essentially of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명은 고혈당 조건에서 CD9 억제시 관련 인자의 발현을 조절하여 세포 사멸을 방어할 수 있고, 티로신 인산화 증가를 통해 인슐린 저항성을 감소시키고 감수성을 증가시킬 뿐만 아니라, CD9 억제로 인슐린 분비량이 증가된 점을 통하여 CD9 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 전혀 새로운 작용기작의 당뇨병의 치료제를 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다. 또한, CD9는 췌장 베타 세포에서 고혈당 조건에서 ERK 인산화를 감소시키고 caspase-3에 의한 세포사멸을 촉진시키는 역할을 하므로, CD9의 활성을 낮추면, 고혈당에 의한 세포사멸을 억제하고 췌장 베타 세포를 보호하는 효과가 있으며, 이를 이용하여 CD9의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 스크리닝하여 항당뇨병 후보 물질을 선별할 수 있다. 또한, CD9 유전자가 제거(knock-out)된 인슐린 분비 세포를 개체에 투여 또는 이식하는 경우 인슐린 분비가 증가되어, 개체내 혈당이 감소하고 혈당량 조절능이 매우 우수하다.
도 1은 중간엽줄기세포로부터 분화시킨 인슐린 분비 세포(insulin producing cells; IPCs)에서 CD9 억제된 경우 세포사멸 관련 단백질인 cleaved caspase 3의 단백질 수준을 웨스턴 블랏팅으로 조사한 결과이다.β-actin를 단백질의 로딩컨트롤로서 사용하였다.
도 2는 IPCs 세포에서 CD9 억제된 경우 p38MAPK의 인산화 결과를 웨스턴 블랏팅으로 조사한 결과이다. GAPDH를 단백질의 로딩컨트롤로서 사용하였다.
도 3은 IPCs 세포에서 CD9 억제된 경우 ERK의 인산화 결과를 웨스턴 블랏팅으로 조사한 결과이다. β-actin를 단백질의 로딩컨트롤로서 사용하였다.
도 4는 IPCs 세포에서 CD9 억제된 경우 티로신 인산화 결과를 웨스턴 블랏팅으로 조사한 결과이다. β-actin를 단백질의 로딩컨트롤로서 사용하였다.
도 5는 IPCs 세포에 CD9 억제된 경우 인슐린 분비량 변화를 나타낸 것이다. PBS를 대조군으로 사용하였다.
도 6은 5주령 마우스를 정상식이군(normal diet, ND)과 고지방식이군(high fat diet, HFD)으로 군당 8마리씩 나누어 사육 1주에 CD9KO-IPCs는 이식하고, 식이-유발성 비만마우스의 혈당 농도를 측정한 결과이다.
도 7은 5주령 마우스를 정상식이군(normal diet, ND)과 고지방식이군(high fat diet, HFD)으로 군당 8마리씩 나누어 사육 1주에 CD9KO-IPCs를 이식하고, 식이-유발성 비만마우스의 인슐린 감수성을 측정한 결과이다.
도 8은 5주령 마우스를 정상식이군(normal diet, ND)과 고지방식이군(high fat diet, HFD)으로 군당 8마리씩 나누어 사육 1주에 CD9KO-IPCs를 이식하고, 식이-유발성 비만마우스의 내당능을 측정한 결과이다.
도 9는 항-CD9 항체의 제3당뇨병에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험 방법
1. 세포 배양
중간엽줄기세포로부터 인슐린분비 세포주인 IPCs 세포를 분화시켰다. 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10uM 트로글리타존(troglitazone) 및 16.7μM 황산아연(zinc sulfate)을 함유하는 저포도당(5mM glucose) DMEM을 이용하고, 37℃, 5% CO 2 조건에서 배양하였다. 48시간 동안 33mM 글루코스를 처리하여 글루코스 독성(glucose toxicity)을 유도하였다. 그 후 10μM CD9 항체(ST pharm)를 48시간 동안 처리하였다.
췌장암 세포인 MIA PaCa-2 세포는 10 % 소태아 혈청(Thermo, Rockville, MD, USA)이 보충된 RPMI 1640에서 배양하였다.
2. 웨스턴 블롯 분석
세포를 protease inhibitor cocktail(Roche Diagnostics)을 포함하는 RIPA buffer(50mMTris-HCl, 150mMNaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 이용하여 용해하였다. 세포 용해물의 단백질 구성물은 BCA protein assay kit(Roche Diagnostics)로 정량한 뒤 같은 양의 단백질을 함유하는 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하였다. 그 다음 Immobilon NC membranes으로 단백질을 이동시켰다. 5% 스킴 밀크 또는 5% BSV(bovine albumin serum)를 포함하는 TBS와 Tween 20 용액(0.05% Tween 20)으로 1시간 동안 블라킹하였다. CD9(Abnova, Taiwan), GAPDH(Santa Cruz Biotechnology), p38MAPK(pMAPK, Santa Cruz), 그리고 phosphated ERK(pERK, cell Signaling)에 대한 항체와 프로브를 4℃에서 밤새 반응시켰고, 1시간 동안 peroxidase가 결합된 2차 항체를 반응시켰다. 멤브레인을 TBS와 Tween 20으로 5분씩 3번 세척하였고, chemiluminescence system(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 ChemiDoc MP system (Bio-Rad)으로 밴드를 관찰하였다. Image J 프로그램을 이용하여 밴드의 세기를 측정하였다.
3. 플라스미드 제조 및 RNA 간섭
일반적인 발현 벡터로서 pcDNA 3.1(Invitrogen)을 사용하였고, 항체는 ST Pharm에서 구입하였다. 사용한 sHRNA의 염기서열은 본 명세서의 서열목록의 서열번호 5(5'-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACC AACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTT-3')에 기재되어 있는 바와 같다. 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine RNAiMAX reagent(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 IPCs 세포에 항체로 트랜스펙션시켰다.
4. 골수 중간엽줄기세포 인슐린 분비 세포 유도
골수로부터 중간엽줄기세포(bone marrow derived mesenchyma stem cells; BD-MSC)를 분리하기 위해 암컷 비당뇨병성 C57BL/6 mouse의 bone marrow에서 얻어낸 골수세포를 alpha-MEM(15% fbs) media에서 8~12일간 배양을 한다. 3일마다 media 교체를 하고 이후 5% FBS high DMEM 15일 배양을 진행하여 MSC를 분리하였다. 다음 단계에서 BD-MSC를 5% FBS, 20μmol/L 니코틴 아미드를 함유한 Low DMEM 배지에서 7일간 배양하고 마지막 3단계에서 10 μmol/L의 Exclusive-4를 첨가한 Low DMEM 배지에서 7일간 더 배양하여 인슐린 분비 β 세포(insulin producing cells; IPCs)를 유도하였다. 세포에서 엑소좀에 CD9 항체를 넣어 다시 엑소좀을 IPCs에 트랜스펙션하여 CD9 유전자를 제거하여 CD9-KO IPCs(CD9KO-IPCs) 세포주를 생성하였다.
5주령 마우스를 정상식이군(normal diet, ND)과 고지방식이군(high fat diet, HFD)으로 군당 8마리씩 나누어 사육하였다. 사육 1주에 3x10 6개의 CD9KO-IPCs를 마우스 췌장에 이식하였다.
5. 엑소좀 트랜스펙션 (exosome transfection)
IPCs 의 배양 media 10ml에서 ExoQuick kt (SBI bio)를 이용하여 엑소좀을 분리한다. 멸균된 PBS 500ul에 엑소좀은 대략 50~300ug 이다. 멸균된 1.5ml 튜브에 10ul Exo-Fect 용액과 10ul PBS용액, 50ul 정제된 엑소좀, CD9 안티바디(20ul)를 함께 넣어 3번 반복하여 잘 혼합한다. 혼합된 엑소좀 트랜스펙션 솔루션을 37 ℃에서 1시간 동안 쉐이커로 인큐베이트하고 즉시 얼음에 튜브를 놓는다. ExoQuickTC 시약 30ul를 엑소좀 샘플 현탄액에 트랜스펙션하고 6번 잘 혼합하여 섞는다. 다시 트랜스펙션 샘플을 얼음 또는 4 ℃에 30분간 안정화시킨다. 트랜스펙션된 엑소좀을 얻기 위해 microfuge (최고 속도)에서 13,000-14,000 rpm으로 3분 동안 시료를 원심 분리한 후 상등액을 제거하고 transfected exosome 펠렛을 300ul 1x PBS에 풀어준다. 6-well에 약 1X10 5개로 성장한 IPCs에 트랜스펙션된 엑소좀(300ul)를 첨가해주고 24시간동안 37 ℃ 인큐베이션에서 배양해준다.
6. 제3형 당뇨병 유도
제3형 당뇨병은 췌장 ductal adenocarcinoma에 의해 다음과 같이 유발되었다. 췌장암 세포인 MIA PaCa-2 세포를 배양 플레이트에서 수확하고 13,000 rpm으로 3 분간 원심 분리하였다. 그 후 상등액을 제거하고, 새로운 배양 배지에 재현탁시켰다. 재차 현탁된 세포를 2차원 (2D) 단층 배양을 위해 6-웰 플레이트로, 또는 초 저부착 표면 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 도말하였다. 이어서, 1,800 rpm에서 3 분간 원심 분리하여 3 차원(3D) 회전 타원체 배양을 형성시켰다. 이를 3일간 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 더불어 대조군으로 각 세포를 평면 배양하였다. 이어서 100ul를 복벽을 절개후 췌장내 (orthotopic injection)주입하였다.
당뇨병 유도 결과는 7일, 14일, 21일, 28일에 각각 혈당을 측정하여 확인하였다.
실시예 1: CD9의 발현량이 세포사멸에 미치는 영향
CD9 억제와 세포사멸의 연관성을 알아보았다.
엑소좀으로 트랜스펙션된 IPCs 세포를 각각 정상 글루코스(NG) 또는 고농도 글루코스(HG: 33mM)의 조건으로 2일 동안 배양하였다. β-actin을 단백질의 로딩컨트롤로서 사용하였다. CD9의 발현량이 글루코스 독성으로 유발되는 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 고농도 글루코오스 조건에서 CD9 항체로 CD9의 발현을 억제하고 cleaved caspase 3의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 항체로 CD9 억제시 세포사멸에 중요한 cleaved caspase 3가 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해, 고농도 글루코스에 의해 세포사멸이 증가하는 반면, CD9의 발현량이 감소하면 고농도의 포도당에 기인한 세포자살로부터 세포사멸을 방어할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2: CD9 발현량이 MAPK에 미치는 영향
p38 MAPK(p38 mitogen-activated protein kinase) 및 ERK(extracellular-signal-regulated kinase)의 인산화는 췌장베타세포의 사멸을 보호하고 인슐린 유전자 프로모터의 최대 포도당 의존성 활성화에 필요하다.
이에, MAPK 시그널링에 미치는 CD9의 잠재적인 역할을 알아보았다.
엑소좀으로 트랜스펙션된 IPCs 세포를 48 well plate(코닝, 생명과학)에 5×10 3 cell/well의 농도로 배양하였다. p38MAPK 및 인산화된 ERK1/2의 발현량을 측정하였다. 대조군으로 PBS 처리군을 사용하였으며, β-actin 또는 GAPDH을 단백질의 로딩컨트롤로서 사용하였다
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타난 바와 같이, CD9 발현을 억제한 경우, 대조군과 비교하여 인산화된 p38 MAPK 및 ERK 1/2의 발현 수준은 증가시키는 것으로 나타났다.
이상의 결과는 CD9가 p38MAPK 및 ERK1/2 인산화와 관련된 신호 전달 경로를 조절함으로서 췌장 베타세포의 사멸을 보호하고, 인슐린 유전자의 발현 및 분비를 증가시키는 것을 보여준다.
실시예 3: 인슐린과 티로신 인산화의 관계
인슐린 수용체(insulin receptor; IR) 자체의 결함보다는 수용체 하위 신호전달의 이상, 특히 IRS-1(insulin receptor substrate-1)-associated PI3K 활성의 저해가 주된 원인으로 알려져 있다. 이러한 IRS-1-associated PI3K 활성은 IRS-1의 티로신 인산화 혹은 IRS-1 단백질양 자체에 의해 조절되며 여러 당뇨 동물 모델 혹은 당뇨 환경에서 IRS-1의 티로신 인산화 단백질양의 감소가 관찰된다.
이에, 췌장 베타 세포에서 인슐린 유도 티로신 인산화가 증가되는지 확인하였다.
IPCs 세포에 10분간 100nm의 인슐린을 처리하지 않거나 처리하여 티로신 인산화를 웨스턴 블랏 측정하였다.β-actin을 단백질의 로딩컨트롤로서 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 인슐린을 처리한 경우 티로신 인산화가 증가함을 확인하였다. 따라서, 티로신 인산화의 증가가 인슐린 저항성은 감소시키고, 감수성을 증가시킴을 확인하였다.
실시예 4: CD9 억제가 인슐린 분비에 미치는 영향
IPCs 세포를 48 well plate(코닝, 생명과학)에 5×10 3 cell/well의 농도로 배양하였다. CD9에 대한 항체가 형질주입된 엑소좀으로 CD9을 결실시키고, 인슐린 분비량을 측정하였다. 대조군으로 PBS 처리군을 사용하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, CD9 발현을 억제한 경우, 대조군과 비교하여 인슐린 분비량이 현저히 증가하는 것으로 나타났다.
이상의 결과는 CD9을 억제함으로써 인슐린 유전자의 발현 및 분비를 증가시키는 것을 보여주는 것으로, CD9을 억제하는 다양한 물질을 당뇨병 치료제로 사용할 수 있음을 시사한다.
실시예 5: 당뇨병에 CD9KO - IPCs가 미치는 영향
5주령 마우스를 정상식이군(normal diet, ND)과 고지방식이군(high fat diet, HFD)으로 군당 8마리씩 나누어 사육하였다. 사육 1주에 엑소좀으로 트랜스펙션된 CD9KO-IPCs는 이식하고, 식이-유발성 비만마우스의 혈당 농도 및 인슐린 농도(도 6)을 측정하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 혈당 농도는 각각 혈당 도를 측정하는 키트ACCU-CHECK Compact Plus　(Roche Diagnostics, Japan)를 사용하여 측정하였으며, 혈당 농도 및 인슐린 농도 모두 대조군에 비해 CD9KO-IPCs 투여군에서 현격히 혈중 함량이 더 낮아지는 것으로 나타났다.
이를 통해, 본 발명의 CD9KO-IPCs가 우수한 혈당강하 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 인슐린 감수성 및 내당능에 미치는 영향
5주령 마우스를 정상식이군(normal diet, ND)과 고지방식이군(high fat diet, HFD)으로 군당 8마리씩 나누어 사육하였다. 사육 1주에 엑소좀으로 트랜스펙션된 CD9KO-IPCs는 이식하고, 식이-유발성 비만마우스의 인슐린 감수성(도 7) 및 내당능(도 8)을 측정하였다.
이를 위하여 고지방식이군(HFD) (60 kcal% fat) 및 정상식이군으로서 표준 chow 식이군(18 kcal% fat)에서 경구 포도당 내성 검사 및 인슐린 내성 검사를 수행하였다. 포도당(체중의 2g kg-1)은 10주령에 복강내 투여(IPGTT)하였다. 글루코스 수준은 테일 블리드법에 의해 검사 후 30, 60, 및 120 분에서 모니터링하였다.
인슐린 (체중의 0.5U kg-1)은 14주령에 복강내(IP) 주사로 투여하였다. 글루코스 수준은 테일 블리드법에 의해 검사 후 10, 20, 40, 및 60분에 모니터링하였다.
그 결과 도 8에서 보듯이 인슐린 투여 후 혈당량을 측정한 결과 비만 마우스 대조군(Obese-no injection)에 비하여 CD9KO-IPCs군의 경우 혈당이 혈액에서 빨리 제거되는 것으로 나타남을 확인할 수 있었다.
또한, 도 7에서 보듯이, 포도당 투여 후 시간에 따른 혈당량의 변화를 측정한 결과 비만 마우스 대조군에 비해 CD9KO-IPCs를 병용하여 투여한 군에서는 혈당이 현격히 조절되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 항-CD9 항체의 제3당뇨병에 미치는 영향
췌장암 세포인 MIA PaCa-2 세포를 마우스의 췌장에 주입하였다. 4주 후 마우스에서 혈당이 급격히 증가되면서 제3형 당뇨병을 유도되었다. 2일 후에 항-CD9 항체를 피하에 주사하고 혈당을 측정한 결과, 도 9에서 보듯이, 1일 수에 정상 수치로 혈당이 감소되는 것을 확인하였다.
이를 통해, 항-CD9 항체가 PDAC-관련 당뇨병 (PDAC-DM, T3cDM)으로 알려진 3C 형 당뇨병의 완전한 관해(remission)를 효과적으로 유도함을 알 수 있었다.
본 발명은 CD9의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 스크리닝하여 항당뇨병 후보 물질을 선별할 수 있고, CD9 유전자가 제거(knock-out)된 인슐린 분비 세포를 개체에 투여 또는 이식하는 경우 인슐린 분비가 증가되어, 개체내 혈당이 감소하고 혈당량 조절능이 매우 우수하므로 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (20)

  1. CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병, 제3형 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CD9 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CD9 단백질 발현 억제제는 CD9 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, crispr-cas9, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 CD9 mRNA는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 CD9 mRNA에 상보적으로 결합하는 shRNA는 서열번호 5로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 CD9 단백질 활성 억제제는 CD9 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 유사체(mimetics), 앱타머, 항체, 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. (a) 시험 물질을 CD9 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 CD9 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군 세포와 비교하여 CD9 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 CD9 유전자를 발현하는 세포는 췌장 베타 세포(pancreatic β cell) 또는 췌장 베타 세포에서 유래한 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 CD9 유전자 발현 수준은 CD9 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 CD9 유전자의 결실은 CD9에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 엑소좀으로 형질주입된 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 조성물은 비경구투여 제제로 제제화된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 비경구투여 제제는 주사제 또는 주입제인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 주사제 또는 주입제는 췌장으로 상기 조성물을 주입하기 위한 것인 약학적 조성물.
  16. 제11항에 있어서, 상기 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비세포는
    (a) 인슐린 분비 세포에서 엑소좀을 분리하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)에서 분리된 엑소좀에 CD9에 특이적으로 결합하는 항체를 형질주입(transfection)하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 제조된 엑소좀을 인슐린 분비 세포에 형질주입하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 조성물.
  17. 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제의 용도.
  18. CD9 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법.
  19. 당뇨병의 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포의 용도.
  20. CD9 유전자가 결실된 인슐린 분비 세포를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병의 치료 방법.
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