KR20180034830A - 테트라스파닌-2를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법 - Google Patents

테트라스파닌-2를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 테트라스파닌-2를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 테트라스파닌- 2(TSPAN2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 (a) 시험 물질을 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 TSPAN2 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 세포와 비교하여 TSPAN2 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.
본 발명의 조성물과 스크리닝 방법은 고혈당 조건에서 JNK와 β-catenin을 통하여 췌장 베타 세포의 세포사멸을 촉진하는 TSPAN2의 역할에 기반하여, TSPAN2 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 전혀 새로운 작용기작의 당뇨병의 치료제를 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.

Description

테트라스파닌-2를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법{Composition for preventing or treating diabetes and method for screening antidiabetic agents using tetraspanin-2}
본 발명은 테트라스파닌-2를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 테트라스파닌-2(TSPAN2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과, (a) 시험 물질을 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계; (b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 TSPAN2 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 대조군 세포와 비교하여 TSPAN2 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법에 대한 것이다.
당뇨에서 글루코스 독성은 β-세포의 세포사멸(apoptosis)을 야기하고, 췌장을 포함한 다양한 장기 시스템에 영향을 미친다. 그러나 기본적인 메커니즘은 완전하게 알려져 있지는 않다. β-세포의 장애 및 손상된 인슐린 생산은 당뇨의 전형적인 특징이나(Xu, G et al., Nat . Med. 19, 11411146. 2013), 당뇨병의 급속한 확산에도 불구하고 β-세포의 세포사멸을 야기하는 글루코스 독성의 정확한 분자적 메커니즘은 여전히 알려지지 않았다(Chen, J et al., Diabetes 57, 938944. 2008).
테트라스파닌(tetraspanin)은 4개의 막관통(transmembrane) 도메인으로 구성된 막단백질로, 거의 모든 동물 세포에서 발견된다. 또한 테트라스파닌은 세포 성장, 접착 및 분화를 포함하는 근본적인 세포학적 과정에 관련되어 있다(Todd, S. C et al., Biochim . Biophys . Acta . 1399, 101104, 1998; Maecker, H. T et al., FASEB J. 11, 428442, 1997). 테트라스파닌 패밀리 멤버는 고도로 보존된 아미노산 서열을 갖는 경향이 있다(Hemler, M. E et at., J. Cell Biol. 155, 11031107. 2001). 그러나, 테트라스파닌-2(TSPAN2)의 기능 및 발현에 대해서 아직 본격적으로 연구된 바 없다.
세포사멸(apoptosis)은 특화된 세포 내 신호 전달이 활성화되어 세포를 소멸시키는 것으로, 체내에서 자연적으로 일어나는 과정이다. 이는 조직에서 세포 개체수를 유지하기 위한 항상성 메커니즘이기도 하다. 부적절한 세포사멸은 근본적으로 허혈성 손상, 자가면역질환 및 많은 종류의 암과 같은 대사성 스트레스, 신경퇴행성 질환, 글루코스 독성을 포함하는 다양한 병리 현상에서 공통적으로 나타난다(Elmore, S et al., Toxicol . Pathol. 35, 495516. 2007). c-Jun 프로모터에 C-Jun과 β-catenin/TCF4의 결합은 JNK 활성에 의존한다. 그러므로 이 복합체의 한 가지 역할은 세포 유지, 증식, 분화, 세포 사멸에 관여하는 것이며, 이 신호의 하향 조절은 암 발생에 기여한다(Saadeddin, A et al., Mol . Cancer Res. 7, 11891196. 2009). JNK는 척추동물의 장배형성(gastrulation)에서 수렴하는 확장 운동을 조절하기 위하여 Wnt 대사 과정에 작용한다(Yamanaka, H et al., EMBO Rep. 3, 6975. 2002). 또한 JNK는 핵 내의 β-catenin 축적을 억제하고, Xenopus 배아에서 축 형성을 조절한다(Liao, G et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 103, 1631316318. 2006). β-catenin은 세포 내에서 전구세포사멸(proapoptotic) 기능을 가지고 있는 BCL2에 매개된 X 단백질(Bax)을 억제함으로서 신장 상피 세포의 생존을 향상시킨다(Wang, Z et al., J. Am . Soc . Nephrol. 20, 19191928. 2009).
글루코스 독성이 β-세포의 기능 장애와 세포사멸에 미치는 효과는 자세하게 연구되었음에도 불구하고, 글루코스 독성의 정확한 분자적 메커니즘은 밝혀지지 않았다. JNK/β-catenin 신호전달계의 조절에 의하여 글루코스 독성으로 유도된 이자 β-세포의 세포사멸은 이해되지 않은 채로 남아 있다. 이에 따라, 췌장 β-세포의 세포사멸에서 TSPAN2에 연관된 JNK/β-catenin 신호전달계의 역할을 규명하여 당뇨병의 병리현상에 대한 이해를 높이고, 새로운 메커니즘의 당뇨병 치료제 후보를 발굴할 필요가 있다.
이에 본 발명자들은 TSPAN2이 췌장 베타 세포에서 고혈당 조건에서 JNK 인산화를 증가시키고 β-catenin의 핵 내 이동을 억제함으로써 caspase-3에 의한 세포사멸을 촉진시키는 기능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은
테트라스파닌-2(TSPAN2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은
(a) 시험 물질을 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 TSPAN2 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 TSPAN2 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
테트라스파닌-2(TSPAN2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 시험 물질을 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 TSPAN2 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 TSPAN2 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 테트라스파닌 2( TSPAN2 ) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서‘치료’는 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다. 본 발명에서 사용되는 용어 ‘예방’은 질환의 발병을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
'단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다.
본 발명에서 ‘폴리뉴클레오티드(polynucleotide)’ 또는 ‘핵산’은 단일 또는 이중 가닥의 형태로 된 데옥시리보핵산(deoxyribonucleic acid, DNA) 또는 리보핵산(ribonucleic acid, RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 일반적으로 DNA는 아데닌(adenine, A), 구아닌(guanine, G), 시토신(cytosine, C), 티민(thymine, T) 등 네 가지 염기로 구성되어 있으며, RNA는 티민 대신 우라실(Uracil, U)을 가지고 있다. 핵산 이중 가닥에서 A는 T 또는 U, C는 G 염기와 수소결합을 이루는데, 이러한 염기의 관계를 ‘상보적(complementary)'이라고 한다.
한편, 'mRNA(messenger RNA 또는 전령 RNA)'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 리보솜(ribosome)으로 전달하여 폴리펩티드 합성(단백질 번역, translation)의 청사진 역할을 하는 RNA이다. 유전자를 주형(template)으로 하여 단일 가닥의 mRNA가 전사(transcription) 과정을 통하여 합성된다.
본 발명에서 치료 또는 예방의 대상인 ‘당뇨병’은 췌장의 베타 세포에서 생성되는 인슐린 호르몬 부족 또는 인슐린 저항성의 이상과 나아가 이러한 두 가지 모두의 결함으로 발생하는 고혈당을 특징으로 하는 대사장애증후군이다. 이러한 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM, Type 1)과 인슐린 저항 및 인슐린 분비 손상에 의해 발생하는 인슐린 비의존형 당뇨병(NIDDM, Type 2)으로 나눌 수 있다. 제1형과 제2형 당뇨병 모두에서 심장 질환, 장 질환, 안과 질환, 신경 질환, 뇌졸중 등과 같은 다양한 합병증이 발생하게 되는데, 이는 장시간 동안 혈당과 인슐린 수준이 상승하여 만성신경질환과 심혈관질환이 발생하게 되고 단시간의 저혈당과 고혈당 반응으로 급성 합병증을 야기시키게 되는 것이다. 당뇨병은 고혈당이 만성으로 지속되면서 당질 대사뿐만 아니라 지질 및 단백질 대사 장애도 함께 일으킨다. 그 병태는 다양하며 직접 고혈당에 기인하는 것으로 망막, 신장, 신경, 심혈관계 등에서 당뇨병성 말초신경장해, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 백내장, 각막증, 당뇨병성 동맥경화증 등이 있다.
당뇨병을 일으키고 심화시키는 중요한 병리 현상의 하나는 고혈당에 의한 췌장 β세포의 사멸이다. 본 발명자들은 혈당이 높아진 상태에서 췌장을 비롯한 다양한 장기에 영향을 미치는 글루코스 독성(glucose toxicity 또는 glucotoxicity)에서 테트라스파닌-2가 인간의 췌장 β세포에서 JNK/β-catenin 신호체계를 조절하고 세포사멸을 촉진하는 역할을 하는 것을 규명하였다. 따라서 테트라스파닌-2 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 글루코스 독성에 의한 췌장, 특히 β세포의 사멸을 방지하여 당뇨병의 발생 또는 진행을 억제할 수 있음을 이해할 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서의 당뇨병은 글루코스 독성에 의하여 유발되는 당뇨병 또는 심화 또는 진행된 당뇨병이라면 그 대상이 될 수 있으며, 보다 구체적으로는 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 ‘테트라스파닌-2(tetraspanin-2)'는 transmembrane 4 superfamily　또는 tetraspanin family에 속하는 단백질로, 특징적인 4개의 소수성 도메인을 갖는 막단백질이며, 세포 발달, 활성화, 성장 및 운동성에 중요한 역할을 담당한다. 인간의 테트라스파닌-2는 염색체 1p13.2에 위치하며, 약 8개의 엑손으로 이루어져 있다. NET3, TSN2, TSPAN2, TSPAN-2 등으로도 알려져 있으며, 3개의 주요한 동형(isoform)이 알려져 있다.
본 발명에서의 TSPAN2 단백질은 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간에서 유래한 것이다. 가장 바람직하게, 본 발명에서의 TSPAN2 단백질은 서열번호 1로 표시되는 인간의 TSPAN2 isoform 1(NP_005716.2), 서열번호 2로 표시되는 인간의 TSPAN2 isoform 2(NP_001295244.1), 그리고 서열번호 3으로 표시되는 인간의 TSPAN2 isoform 3(NP_001295245.1) 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다(괄호 안은 NCBI Genbank accession number).
상기 TSPAN2 단백질의 발현 억제제는 TSPAN2 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 또한 상기 TSPAN2 mRNA는 가장 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 인간 TSPAN2 mRNA transcript variant 1(NM_005725.5), 서열번호 5로 표시되는 인간 TSPAN2 mRNA transcript variant 2(NM_001308315.1), 그리고 서열번호 6으로 표시되는 인간 TSPAN2 mRNA transcript variant 3(NM_001308316.1) 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것이다(괄호 안은 NCBI Genbank accession number). 상기한 인간의 TSPAN2 mRNA transcript variant들의 coding region(exon) 등의 특징 사항은 괄호 안에 기재된 Genbank accession number로 NCBI 데이터베이스를 검색하여 나오는 서열정보에서 확인된다.
나아가, 본 발명에 따른 TSPAN2 단백질 발현억제제는 바람직하게는 TSPAN2 mRNA에 상보적으로 결합하여 mRNA의 분해를 유발하는 siRNA일 수 있다. 상기 TSPAN2에 대한 siRNA는 구체적으로는 서열번호 7 내지 서열번호 33으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
상기 ‘siRNA(small interfering RNA 또는 short interfering RNA 또는 silencing RNA)'는 세포 안에 인위적으로 도입되어 특정 유전자의 mRNA의 분해를 유도하여 단백질 번역(translation)이 일어나지 않도록 함으로써 유전자 발현을 억제하는 RNA 간섭(RNA interference) 현상을 일으키는 짧은 이중가닥의 RNA이다. siRNA는 통상 표적 mRNA의 특정 부위에 상보적인 20 내지 25개의 뉴클레오티드로 구성되어 있다. 세포 내에서 siRNA의 이중 가닥 중 표적 mRNA에 상보적인 가닥(antisense strand)이 RISC(RNA-induced silencing complex) 단백질 복합체와 결합하여 표적 mRNA에 결합하고, RISC 복합체 안의 argonaute 단백질이 표적 mRNA를 절단하여 분해시키거나, 단백질 번역에 중요한 단백질과 리보솜이 mRNA와 결합하는 것을 억제하는 등의 기작으로 특정 유전자의 발현을 억제한다.
본 발명에 따른 siRNA는 올리고뉴클레오티드의 생체 내 안정성 향상, 핵산 분해효소 저항성 부여 및 비특이적 면역반응 감소를 위한 다양한 변형(modification)을 가한 것일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드 내 당 구조의 2´ 탄소 위치에서 OH기가 -CH3(메틸), -OCH3(methoxy), -NH2, -F, -O-2-메톡시에틸, -O-프로필(propyl), -O-2-메틸티오에틸(methylthioethyl), -O-3-아미노프로필, -O-3-디메틸아미노프로필, -O-N-메틸아세트아미도 또는 -O-디메틸아미도옥시에틸로의 치환에 의한 변형; 뉴클레오티드 내 당(sugar) 구조 내의 산소가 황으로 치환된 변형; 또는 뉴클레오티드결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트(boranophosphate), 메틸포스포네이트(methyl phosphonate) 결합으로의 변형에서 선택된 하나 이상의 변형이 조합되어 사용될 수 있으며, PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid) 또는 UNA(unlocked nucleic acid) 형태로의 변형도 사용이 가능하다.
또한 상기 TSPAN2 단백질 활성 억제제는 TSPAN2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 유사체(mimetics), 앱타머, 항체, 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수도 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 당뇨병 치료를 위해 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법으로 투여 경로에 따라 다양하게 제형화될 수 있다. 상기 담체로는 모든 종류의 용매, 분산매질, 수중유 또는 유중수 에멀젼, 수성 조성물, 리포좀, 마이크로비드 및 마이크로좀이 포함된다.
상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양, 즉 당뇨병을 예방하거나 증상을 완화하고 치료하기 충분한 양으로 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어 일반적인 1일 투여량으로는 약 0.01 내지 1000㎎/㎏의 범위로 투여될 수 있으며, 바람직하게는, 약 1 내지 100mg/kg의 범위로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 바람직한 투여량 범위 내에서 1회 또는 수회로 분할 투여할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 통상의 기술자가 적절하게 선택할 수 있다.
투여 경로로는 경구적 또는 비경구적으로 투여될 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 경막 내, 심장 내, 경피, 피하, 복강 내, 비강 내, 장관, 국소, 설하 또는 직장 내 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우, 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 형태로 제형화할 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 상기 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 비경구적으로 투여하는 경우, 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 주사제, 경피투여제 및 비강 흡입제의 형태로 당 업계에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS(phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피투여제의 경우, 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 ‘경피투여’는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하거나 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 이들 제형은 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania)에 기술되어 있다.
흡입투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 락토오즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 카보하이트레이트(예를 들어, 글루코스, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 및/또는 보존제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 단독으로 투여하거나, 췌장 세포를 보호하고 당뇨병 치료의 효과가 있는 공지의 화합물과 병용하여 투여할 수 있다.
또한 본 발명은
(a) 시험 물질을 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
(b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 TSPAN2 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(c) 대조군 세포와 비교하여 TSPAN2 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계는 분석의 대상인 시험 물질이 TSPAN2 유전자의 발현을 억제하는 활성이 있는지 확인하기 위하여 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계이다.
본 발명의 방법에서 ‘접촉(contacting)’은 일반적인 의미이며, 2개 이상의 제제(예를 들어, 2개의 폴리펩티드)를 결합시키거나, 제제와 세포(예를 들어, 단백질과 세포)를 결합시키는 것을 말한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 예컨대, 시험관(test tube) 또는 다른 컨테이너(container)에서 2개 이상의 제제를 결합시키거나 시험 제제와 세포 또는 세포 용해물과 시험 제제를 결합시키는 것이다. 또한 접촉은 세포 또는 인 시투(in situ)에서 일어날 수도 있다. 예컨대, 2개의 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 세포 내에서 공동발현(coexpression)시킴으로써 세포 또는 세포 용해물에서 2개의 폴리펩티드를 접촉시키는 것이다. 또한 테스트하고자 하는 단백질이 고정상의 표면에 배열된 단백질 칩(protein chip)이나 단백질 어레이(protein array)를 이용할 수도 있다.
또한 본 발명의 방법에서 ‘시험 물질’은 시험 제제(test agent) 또는 제제(agent)와 호환가능하게 사용할 수 있는 것으로, 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어 단백질, 폴리펩티드, 저분자 유기화합물(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.
보다 구체적으로 본 발명의 방법으로 스크리닝할 수 있는 시험 제제는, 폴리펩티드, 베타-턴 유도체(beta-turn mimetics), 다당류, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 화합물, 헤테로사이클릭 화합물, 벤조디아제핀(benzodiazepines), 올리고머릭 N-치환 글리신(oligomeric N-substituted glycines), 올리고카르바메이트(oligocarbamates), 당류(saccharides), 지방산, 퓨린, 피리미딘 또는 이들의 유도체, 구조적 아날로그 또는 이들의 조합을 포함한다. 시험 제제는 합성 물질 또는 천연물질일 수 있다. 상기 시험 제제는 합성 또는 자연 화합물의 라이브러리를 포함하는 광범위하고 다양한 출처로부터 얻어질 수 있다. 조합(combinatorial) 라이브러리는 스텝-바이-스텝 방식으로 합성될 수 있는 여러 종류의 화합물로 생산될 수 있다. 다수의 조합 라이브러리의 화합물들은 ESL(encoded synthetic libraries) 방법(WO 95/12608, WO93/06121, WO 94/08051, WO 95/395503 및 WO 95/30642)에 의해 제조될 수 있다. 펩티드 라이브러리는 파지 디스플레이 방법(WO91/18980)에 의해 제조될 수 있다. 박테리아, 곰팡이, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는 상업적인 출처로부터 얻거나 또는 필드(field)에서 수집될 수 있다. 공지된 약리학적(pharmacological) 제제가 구조적 아날로그를 제조하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화 반응(esterification), 아미드화 반응(amidification)과 같이 지시되거나(direct) 무작위한 화학적 수식에 적용될 수 있다.
상기 시험 제제는 자연적으로 생성되는 단백질 또는 이의 단편일 수 있다. 이런 시험 제제는 자연 출처(natural source), 예컨대, 세포 또는 조직 용해물로부터 수득될 수 있다. 폴리펩티드 제제의 라이브러리는 예컨대, 통상적인 방법에 의해 생성되거나 상업적으로 입수할 수 있는 cDNA 라이브러리로부터 수득될 수 있다. 상기 시험 제제는 펩티드, 예컨대, 약 5~30개, 바람직하게는 약 5~20개, 보다 바람직하게는 약 7~15개의 아미노산을 가지는 펩티드일 수 있다. 상기 펩티드는 자연적으로 생성되는 단백질, 랜덤 펩티드 또는 ‘바이어스(biased)’ 랜덤 펩티드의 절단물일 수 있다. 또한 상기 시험 제제는 핵산일 수 있다. 핵산 시험 제제는 자연적으로 생성되는 핵산, 랜덤 핵산, 또는 ‘바이어스(biased)’ 랜덤 핵산일 수 있다. 예컨대, 원핵 또는 진핵 게놈의 절단물을 위에서 기재한 바와 유사하게 사용할 수 있다.
또한 상기 시험 제제는 소분자(small molecule; 예를 들어, 약 1,000Da이하의 분자량을 갖는 분자)일 수 있다. 소분자의 조절 제제를 스크리닝하기 위한 방법에는 바람직하게는 고속 분석 어세이(high throughput assay)가 적용될 수 있다. 많은 어세이가 상기 스크리닝에 유용하다(Shultz, Bioorg. Med. Chem. Lett., 8:2409-2414, 1998; Weller, Mol. Drivers., 3:61-70, 1997; Fernandes, Curr. Opin. Chem. Biol., 2:597-603, 1998; and Sittampalam, Curr. Opin. Chem. Biol., 1:384-91, 1997).
본 명세서에서 ‘발현(expression)’이라 함은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. 상기 TSPAN2를 발현하는 세포는 TSPAN2를 내재적으로 발현하는 세포일 수도 있고, TSPAN2를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 TSPAN2를 과발현하는 세포일 수도 있다. 바람직하게는 상기 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포는 췌장 베타 세포(pancreatic β cell) 또는 췌장 베타 세포에서 유래한 세포일 수 있다. 본 발명자들은 TSPAN2를 내재적으로 발현하는 세포로서 인간의 췌장 베타 세포에서 유래한 RNAKT-15 세포주를 사용한 바 있다.
상기 (b) 단계는 시험 물질을 접촉시킨 TSPAN2를 발현하는 세포와 시험 물질을 접촉시키지 않은 TSPAN2를 발현하는 세포에서 TSPAN2의 유전자 발현 수준을 측정하는 단계이다.
상기 TSPAN2 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 TSPAN2의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하여 실시할 수 있다.
mRNA 발현의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩(microarray chip), RNA 염기서열분석(RNA sequencing) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한 단백질의 발현 수준 측정 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계는 대조군 세포와 비교하여 TSPAN2 유전자의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계이다.
본 발명자들이 규명한 바와 같이, TSPAN2는 고혈당 상태에서 췌장 β 세포의 세포사멸을 촉진하는 역할을 한다. 따라서 TSPAN2의 유전자의 발현 수준을 감소시키는 시험 물질은 TSPAN2의 단백질 수준 및 단백질의 활성 수준을 떨어뜨려 췌장 β 세포에서 글루코스 독성으로 유발되는 세포사멸을 방지하고 따라서 이로 인하여 유발되는 당뇨병을 지연시키거나 증상을 완화할 수 있음을 알 수 있다.
따라서 본 발명은 테트라스파닌-2(TSPAN2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물과 TSPAN2 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법을 제공한다. TSPAN2는 췌장 베타 세포에서 고혈당 조건에서 JNK 인산화를 증가시키고 β-catenin의 핵 내 이동을 억제함으로써 caspase-3에 의한 세포사멸을 촉진시키는 역할을 한다. 반대로 TSPAN2의 발현을 억제하는 등으로 TSPAN2의 활성을 낮추면, 고혈당에 의한 세포사멸을 억제하고 췌장 베타 세포를 보호하는 효과가 있다. 이와 같은 기작을 바탕으로 TSPAN2의 발현 또는 활성을 억제하는 제제를 스크리닝하여 항당뇨병 후보 물질을 선별할 수 있다.
도 1은 글루코스 자극에 반응하는 유전자를 확인하기 위한 microarray를 이용한 gene ontology 분석 결과를 나타낸다. NG 또는 HG 조건에서 48시간 동안 배양한 RNAKT-15 세포에서 2배 상향 조절(up-regulation; 도 1의 A) 또는 하향 조절(down-regulation; 도 1의 B)된 유전자의 리스트는 gene ontology 분석을 위한 DAVID로 제작하였다.

도 2는 세포사멸 관련 유전자와 글루코스 자극에 반응하는 계층적 클러스터링(hierarchial clustering) 분석 결과를 나타낸다. 적색과 녹색은 발현 수준이 2배 이상 변화한 유전자를 나타낸다.

도 3은 NG 또는 HG 조건 하에서 배양한 RNAKT-15 세포에서 TSPAN2의 발현 수준을 확인하는 microarray 결과(도 3의 A), 단백질 발현 수준을 확인하는 웨스턴 블롯(도 3의 B)과 mRNA 발현 수준을 확인하는 RT-PCR(도 3의 C) 결과를 나타낸다.

도 4는 NG 또는 HG 조건에서 배양한 RNAKT-15 세포의 Annexin V 염색 결과(도 4의 A)와 caspase-3, cleaved caspase-3, Bax의 단백질 수준의 변화(도 4의 B) 그리고 웨스턴 블롯 결과(도 4의 C)를 나타낸다. 도 4의 B에서 “***”표시는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.

도 5는 HG 조건 또는 TSPAN2를 과발현시킨 RNAKT-15 세포에서 p-JNK, JNK, caspase 3, cleaved caspase 3, Bcl-2, t-Bid, Bax, PARP, cleaved PARP, β-catenin의 단백질의 수준을 확인하는 웨스턴 블롯(도 5의 A)과 단백질 발현 수준 비교(도 5의 B)를 나타낸다. 도 5의 B에서 “***”표시는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.

도 6은 HG 조건 또는 TSPAN2의 발현을 siRNA로 억제시킨 RNAKT-15 세포에서 E-cadherin, TSPAN2, β-catenin, n-β-catenin, Bax의 단백질 수준을 확인하는 웨스턴 블롯(도 6의 A)과 단백질 발현 수준 비교(도 6의 B)를 나타낸다. 도 6의 B에서 “***”표시는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.

도 7은 HG 조건에서 RNAKT-15 세포에서 β-catenin의 핵 내 이동에 Dkk1이 미치는 영향을 확인하는 형광현미경 사진이다. si-Dkk1은 Dkk1의 발현을 억제하기 위한 siRNA이다. 청색은 DAPI, 녹색은 β-catenin 단백질을 표시한다.

도 8은 HG 또는 SP600125 조건에서의 RNAKT-15 세포에서 Dkk1, p-JNK, JNK의 단백질 발현 수준을 확인하는 웨스턴 블롯(도 8의 A)과 단백질 발현 수준 비교(도 8의 B)를 나타낸다. 도 8의 B에서 “***”표시는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.

도 9는 TSPAN2이 β-catenin의 핵 내 이동에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험으로, HG, TSPAN2 과발현, 또는 HG와 si-Dkk1 처리한 RNAKT-15 세포에서 nuclear β-catenin(N-β-catenin), 전체 β-catenin(total β-catenin), p-Akt, Akt의 단백질 수준을 확인하는 웨스턴 블롯(도 9의 A)과 단백질 발현 수준 비교(도 9의 B)를 나타낸다. 도 9의 B에서 “***”표시는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.

도 10은 TSPAN2가 JNK/β-catenin에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험으로, HG, si-TSPAN2, SP600125, si-β-catenin 처리 조건의 다양한 조합으로 자극한 RNAKT-15 세포에서의 E-cadherin, p-β-catenin, n-β-catenin, TSPAN2, p-JNK, JNK, Bax의 단백질 수준을 확인하는 웨스턴 블롯(도 10의 A)과 단백질 발현 수준 비교(도 10의 B)를 나타낸다. 도 10의 B에서 “***”표시는 통계적으로 유의한 차이를 나타낸다.

도 11은 NG 또는 HG 조건 그리고 HG 조건에서 si-TSPAN으로 1일(siTS2 1d) 또는 2일(siTS2 2d) 동안 TSPAN2의 발현을 억제한 RNAKT-15 세포에서 세포사멸을 확인하기 위한 PI 염색의 유세포분석 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험 방법>
세포 배양
인간 췌장 β-세포주인 RNAKT-15 세포를 가천대학교에서 얻었다. 5mM 글루코스, 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10mM 니코티나마이드(nicotinamide), 10uM 트로글리타존(troglitazone) 및 16.7μM 황산아연(zinc sulfate)을 함유하는 DMEM을 이용하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 48시간 동안 33mM 글루코스를 처리하여 글루코스 독성(glucose toxicity)을 유도하였다. 그 후 10μM JNK 억제제(SP600125, Sigma)를 48시간 동안 처리하였다.
마이크로어레이 분석
인간 전체 유전체 마이크로어레이(microarray)는 전사 프로파일 분석을 위해 사용된다. 대조군 및 시험 RNA에 대하여, 제조사 지침에 따라 Low RNA 키트(Low RNA Input Linear Amplification kit, Agilent)를 사용하여 표적 cRNA 프로브 및 hybridization의 합성을 실시하였다. 간략하게, 각 샘플에서 추출한 1μg total RNA를 T7 프로모터 프라이머 믹스(promoter primer mix)와 혼합한 뒤 10분 동안 65℃에서 반응시켰다. 5×first stand buffer, 0.1M DTT, 10mM dNTP mix, RNase-Out으로 이루어진 cDNA 마스터 믹스(cDNA master mix)를 반응 혼합물에 추가한 뒤, 40℃에서 2시간 동안 반응시켰다. dsDNA 합성은 15분 동안 65℃에서 반응시켜 종료하였다. 2시간 동안 40℃에서 반응시킨 후, dsDNA 반응 샘플에 전사 마스터 믹스(transcription master mix)를 첨가하여 dsDNA의 전사를 실시하였다. 증폭 표지된 cRNA를 제조사의 지침에 따라 cRNA Cleanup Module(Agilent)을 사용하여 정제하였고, 표지된 cRNA는 ND-100 스펙트로미터(Nano Drop Technologies)를 사용하여 정량하였다. cRNA에 10×blocking agent와 25×fragmentation buffer를 첨가한 뒤 30분 동안 60℃에서 반응하여 단편화시켰다. 단편화된 cRNA는 2× 혼성화 버퍼에 재분산하고, 마이크로어레이(44K)에 직접 피펫팅으로 집적하였다. Agilet Hybridizaition Oven(Agilent)를 사용하여 65℃에서 17 시간 동안 어레이를 혼합하였다. 제조사의 지침에 따라 혼합된 마이크로 어레이를 세척하고, 상기에 기재한 바와 같이 형광 이미지를 정량화 및 표준화하였다. 마이크로어레이 데이터는 Gene Expression Omnibus database(GEO assession number GSE76189)에 제출하였다.
데이터 분석
혼합된 이미지는 Agilent DNA microarray scanner를 사용하여 스캔하여 Feature Extraction software(Agilent)를 사용하여 정량하였다. 유전자 발현 수준의 변화(fold change)의 데이터 표준화 및 결정은 Gene-SpringGX 7.3(Agilent)을 사용하여 실시하였다. 간단하게, 표준화된 수치의 평균은 표준화된 대조군 채널 빈도(normalized signal channel intensity)의 평균으로 표준화된 신호 채널 빈도(normalized control channel intensity)의 평균을 나누는 것으로 계산하였다. 유전자의 기능적 주석은 GeneSpringGX 7.3과 함께 Gene Ontology Consortium data (http://www.geneontology.org/index.shtml)를 사용하였고, 유전자 분류는 BioCarta(http://www.biocarta.com/), GenMAPP(http://www.genmapp.org/), DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/), 및 Medline databases(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에 등록된 사항을 기반으로 하였다.
유전자 온톨로지 관련 네트워크 분석
세포사멸(apoptosis) 신호, ontology 관련된 상호작용 네트워크를 포함하는 단백질과 구별하여 조절된 유전자들의 생물학적 기능을 검사하기 위해, Ingenuity pathway analysis(http://www.ingenuity.com)를 사용하여 생물정보학 유전자 네트워크 분석을 실시하였다. Ingenuity pathway 분석은 정기적으로 업데이트되는 “ingenuity pathways knowledgebase”를 기반으로 단백질 상호작용 네트워크를 제공한다. 그 네트워크는 상당하게 연결된 네트워크를 생성하기 위한 목적과 가능한 입력 표현 프로파일로부터 많은 단백질을 포함하는 것으로 최적화되어 있다.
유세포분석과 Annexin V 염색
세포사멸을 검출하기 위해, annexin V-FLUOS 염색 키트(Roche)로 염색하여 annexin Ⅴ와 propidium iodide(PI)를 분석하였다. 48시간 동안 정상 글루코스(nomal glucose, NG, 15mM)와 고농도 글루코스(high glucose, HG, 33mM)를 처리한 세포를 PBS로 두 번 세척한 뒤 수득하였다. 수득한 세포 현탁액을 2분 동안 2000g로 원심분리하였고, 15분 동안 실온에서 0.2mg/ml annexin Ⅴ 형광 또는 1.4mg/ml의 PI를 처리하였다. annexin Ⅴ 검출을 위한 530/30nm band pass 필터와 함께 488nm 자극에서 MoFlo Astrios 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 분석하였다. 데이터는 Summit 6.0 프로그램을 이용하여 분석하였다.
세포핵 분획
RNAKT-15 세포를 2일 동안 HG 배지에서 배양하여 준비하였다. 세포를 수득하고 2ml homogenization buffer A(25mM Tris pH7.5, 2mM EDTA, 0.5mM EGTA, 1mM DTT, 단백질 분해효소 억제제, 1mM PMSF 및 0.02% Triton X-100)를 첨가한 다음, 막자와 15ml Dounce homogenizer를 사용하여 15회 균질화하였고, 3분 동안 100,000g에서 원심분리하였다. 상층부 세포질 단편을 새 튜브에 옮기고, 500μl homogenization buffer B(1% triton X-100을 함유하는 homogenization buffer A)를 펠렛에 첨가하였다. 소니케이션으로 펠렛을 재분산했고, 30분 동안 4℃에서 배양했다. 세포질 및 핵 단편의 단백질 구성물을 BCA assay kit(Thermo)를 사용하여 정량한 뒤 western blot 방법으로 분석하였다.
웨스턴 블롯 분석
세포를 protease inhibitor cocktail(Roche Diagnostics)을 포함하는 RIPA buffer(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를 이용하여 용해하였다. 세포 용해물의 단백질 구성물은 BCA protein assay kit(Roche Diagnostics)로 정량한 뒤 같은 양의 단백질을 함유하는 세포 용해물을 SDS-PAGE로 분리하였다. 그 다음 Immobilon NC membranes으로 단백질을 이동시켰다. 5% skim milk 또는 5% BSA(bovine albumin serum)를 포함하는 TBS와 Tween 20 용액(0.05% Tween 20)으로 1시간 동안 블라킹하였다. TSPAN2(1:1000; Abnova,), GAPDH(1:5000; Santa Cruz Biotechnology), E-cadherin(1:1000; Cell Signaling Technology), caspase-3(1:800; Cell Signaling), b-catenin(1:1000; Santa Cruz), phosphorylated(p) b-catenin(Ser33/37/Thr41, 1:200; Cell Signaling), JNK(1:1000; Santa Cruz), phosphorylated JNK(p-JNK; 1:500; Santa Cruz), truncated Bid(t-Bid; 1:1000; Santa Cruz), poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase(PARP; 1:2000; SantaCruz), Bax(1:1000; Abcam), Akt(1:1000; Cell Signaling), phosphorylated Akt(p-Akt; 1:500; Cell Signaling), B-cell CLL/lymphoma 2(Bcl-2; 1:6000; Cell Signaling), 그리고 Dickkopf-1(Dkk1; 1:500;Cell Signaling)에 대한 항체와 프로브를 4℃에서 밤새 반응시켰고, 1시간 동안 peroxidase가 결합된 2차 항체를 반응시켰다. 멤브레인을 TBS와 Tween 20으로 5분씩 3번 세척하였고, chemiluminescence system(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 ChemiDoc MP system (Bio-Rad)으로 밴드를 관찰하였다. Image J 프로그램을 이용하여 밴드의 세기를 측정하였다.
플라스미드, RNA 간섭, 정량적 RT - PCT
TSPAN2 플라스미드 구성 키트는 GenScript에서 구입하였다. 일반적인 발현 벡터로서 pcDNA 3.1(Invitrogen)을 사용하였고, siRNA는 ST Pharm에서 구입하였다. TSPAN2 siRNA의 염기서열은 본 명세서의 서열목록의 서열번호 7 내지 서열번호 33에 기재되어 있는 바와 같다. Dkk1 siRNA의 염기서열은 본 명세서의 서열목록의 서열번호 34 내지 서열번호 43에 기재되어 있는 바와 같다. 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine RNAiMAX reagent(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 RNAKT-15 세포에 siRNA로 형질전환시켰다. RT-PCR은 NG 배지와 HG 배지에서 배양한 세포의 mRNA의 상대적인 양을 비교하기 위해 실시하였다. 제조사의 지침에 따라 Superscript III reverse transcriptase(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 20μl의 총량으로 RT를 실시하였다. 그 다음, 4μl의 최종 RT product mix로 PCR 증폭시켰다. 표준으로는 GAPDH를 사용하였고, 사용한 프라이머쌍의 서열은 본 명세서 서열목록에 기재된 바와 같다.
면역형광염색법
12웰 플레이트에 커버슬립을 넣고, RNAKT-15 세포를 4×104cells/well의 농도로 접종하였다. 24시간 후 대조군 세포에는 48시간 동안 고농도 글루코스(HG, 33mM)을 처리하였다. TSPAN2 siRNA(25μg)를 처리한 세포는 24시간 동안 배양한 후에 고농도 글루코스(HG, 33mM)을 48시간 동안 처리하였다. 세포를 PBS로 세척한 후 4% 포름알데하이드로 15분 동안 고정시켰다. 15분 동안 0.1% Triton X-100을 처리한 다음 3% BSA로 1시간 동안 블로킹하였다. 세포에 1차 항체인 β-catenin monoclonal purified mouse IgG1(Abnova)를 3% BSA 용액 1:100으로 희석시켜 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후 PBS로 5분씩 5번 씻은 다음, 어두운 곳에서 2차 항체 FITC anti-mouse(Thermo Fisher Scientific)를 3% BSA에 1:200으로 희석시켜 1시간 동안 반응시켰다. 커버슬립의 세포의 이미지는 C-Apochromat 403/1.2 water immersion lens(488nm argon laser/505~550nm detection range)가 설치된 공초점 현미경(LSM710; Carl Zeiss GmbH)으로 획득하였다. 데이터는 ZEN 2009 Light Edition 프로그램(Carl Zeiss)을 이용하여 분석하였다.
통계 분석
모든 결과는 최소 3번의 독립적인 실험의 평균±표준편차(means±SD)로 표시했다. 통계적 유의성은 Prism 5.0 프로그램(GraphPad Software) 프로그램의 Student’s t-test로 검증하였으며, p≤0.05를 통계적 유의성의 기준으로 하였다.
< 실시예 1>
글루코스 농도에 따른 유전자의 발현량 차이
글루코스 농도에 따라서 발현 수준이 변하는 유전자를 동정하기 위하여 마이크로어레이 실험을 실시하였다.
RNAKT-15 세포를 각각 정상 글루코스(NG) 또는 고농도 글루코스(HG)의 조건으로 2일 동안 배양하고, 마이크로어레이 방법을 통해 유전자 발현의 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 도시한 바와 같이, 고농도 글루코스를 처리한 RNAKT-15 세포에서 발현 수준이 상향 조절된 유전자와 하향 조절된 유전자가 관찰되었다. 상향조절된 유전자들의 순위는 다음과 같다: 탄수화물 대사(carbohydrate metabolism) > 세포주기(cell cycle) > 대조군(control) > 세포사멸 과정(apoptotic processes) > 활성산소종에 대한 반응(response to reactive oxygen species). 하향 조절된 유전자들의 순위는 다음과 같다: 세포 내 단백질 수송(intracellular protein trafficking) > 세포주기(cell cycle) > 세포 접착-매개 신호(cell adhesion-mediated signaling) > 세포주기조절(cell cycle control) > 활성산소종에 대한 반응(response to reactive oxygen species > apoptotic process).
잠재적으로 세포사멸(apoptosis)에 관련된 유전자들을 분석하기 위하여, 세포사멸과 NG와 비교하여 HG에서 2배 이상 증가한 유전자 사이의 연관성을 별도로 분석하였다(도 2). 계층적 클리스터링(hierarchical clustering)으로 도출된 교차점은 도 2의 리스트에 기재한 바와 같다. 나아가 글루코스에 반응하는 유전자들의 신호전달체계를 분석한 결과, 세포사멸 관련 유전자들의 발현 수준도 글루코스에 의하여 조절되는 것으로 나타났다(데이터 미도시). 마이크로어레이 분석은 TSPAN2의 발현이 HG 조건에서 3배 이상 증가하며, 신호전달 네트워크 분석은 TSPAN2가 세포사멸에 관련되었을 가능성을 제시하였다.
< 실시예 2>
고농도 글루코스가 TSPAN2 발현 및 세포사멸에 미치는 영향
글루코스 독성(glucose toxicity)으로 유발되는 췌장 β-세포의 세포사멸에 TSPAN2이 미치는 역할을 알아보았다.
<2-1> 고농도 글루코스가 TSPAN2 발현에 미치는 영향
고농도 글루코스가 세포에서 TSPAN2의 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
RNAKT-15 세포를 각각 정상 글루코스(NG) 또는 고농도 글루코스(HG)의 조건으로 2일 동안 배양하고, 세포에서 RNA를 추출하여 마이크로어레이를 이용하여 전사 프로파일링을 하였다. 마이크로어레이 실험은 3번 반복하였고, 데이터를 분석하였다. 또한 유전자 발현을 분석하기 위하여 RNAKT-15 세포를 2일 동안 정상 글루코스 또는 고농도 글루코스 배지에서 각각 배양한 뒤, 세포 용해물로 anti-TSPAN2 항체를 사용하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. TSPAN2 mRNA의 발현량을 측정하기 위하여 RT-PCR을 실시하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, TSPAN2의 발현량이 고농도 글루코스 조건에서 지속적으로 증가하는 것으로 나타났다. 고농도 글루코스의 조건에서 TSPAN2 단백질의 발현량은 3배까지 상승하였으며, mRNA의 발현량은 4배까지 증가하는 것으로 나타났다.
<2-2> TSPAN2 가 세포사멸에 미치는 영향
TSPAN2와 세포사멸의 연관성을 알아보았다.
RNAKT-15 세포를 각각 정상 글루코스(NG) 또는 고농도 글루코스(HG)의 조건으로 2일 동안 배양하였다. 이후 annexin Ⅴ 염색하고, 세포를 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 고농도 글루코스에서 배양한 세포의 경우 세포사멸이 증가하는 것으로 나타났고, 세포사멸에 중요한 Bax와 cleaved caspase 3가 증가하는 것으로 나타났다. 이를 통해, TSPAN2는 전사 수준에서 고농도 글루코스에 의해 발현이 유도되었다는 것을 확인할 수 있었다. 또한 고농도 글루코스에 의해 세포사멸이 증가하는 것으로 보아, TSPAN2의 발현량이 증가하면 세포사멸에 영향을 미친다는 것을 확인할 수 있었다.
< 실시예 3>
TSPAN2 의 발현량이 Bax 발현량에 미치는 영향
고농도 글루코스에 의해 TSPAN2의 발현량이 증가하는 세포 신호기작을 알아보았다. TSPAN2의 수준의 증가가 세포 신호 전달계에 미치는 영향을 확인하였다.
RNAKT-15 세포를 각각 정상 글루코스(NG) 또는 고농도 글루코스(HG)의 조건으로 2일 동안 배양하고, TSPAN2를 과발현하는 플라스미드로 형질전환하였다. 상기 세포 용해물을 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 5에서 보이는 바와 같이, 고농도 글루코스에서 p-JNK, Bax, t-Bid 및 절단된 PARP가 증가하는 것으로 나타났다. 또한 정상 농도 글루코스에서 TSPAN2를 과발현시킨 경우에도 동일하게 p-JNK, Bax, t-Bid 및 절단된 PARP가 증가하는 것으로 나타났다. 반면, 고농도 글루코스와 정상 농도 글루코스에서 TSPAN2를 과발현 시킨 경우에는 Bcl-2와 PARP의 발현은 감소하는 것으로 나타났다. 이를 통해 고농도 글루코스는 글루코스 독성으로 유발되는 세포사멸을 유도하고, TSPAN2의 과발현이 이와 유사한 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
또한, TSPAN2의 과발현이 글루코스 독성으로 유발되는 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 고농도 글루코스 조건에서 TSPAN2 siRNA로 TSPAN2의 발현을 억제하고 Bax의 발현량을 측정하였다.
그 결과, 도 6에서 보이는 바와 같이, TSPAN2 siRNA는 TSPAN2 단백질의 발현을 효율적으로 억제하였다. 고농도 글루코스는 Bax 단백질의 발현량을 증가시키는 반면, TSPAN2는 Bax의 발현량을 감소시키는 것으로 나타났다. 이를 통해, TSPAN2의 발현은 고농도 글루코스 조건 하에서 Bax 발현 수준의 감소에 기여하는 것을 알 수 있었다. 나아가, 또한, TSPAN2 발현 억제에 의해 핵 내 β-catenin이 증가하는 것도 확인할 수 있었다.
< 실시예 4>
JNK 가 β- catenin 에 미치는 영향
β-catenin 신호 조절에서 JNK의 잠재적인 역할을 알아보았다.
RNAKT-15 세포를 배양하여 JNK와 DKK에 대한 siRNA로 형질전환시킨 뒤, JNK 억제제인 SP600125로 처리하였다. 12웰 플레이트에 배양한 RNAKT-15 세포에 β-catenin 항체를 반응시키고 DAPI로 염색한 뒤 공초점 현미경으로 관찰하였다. 또한 RNAKT-15 세포를 각각 정상 글루코스(NG) 또는 고농도 글루코스(HG)의 조건으로 2일 동안 배양하여 수득한 뒤 웨스턴 블랏을 실시하였다.
그 결과, 도 8과 도 9에 나타난 바와 같이, JNK 억제제(SP600125)를 처리한 RNAKT-15 세포에서 Dkk1의 발현 수준은 감소하는 것으로 나타났고, HG 조건에서 Dkk1 siRNA를 처리한 경우, β-catenin 단백질과 p-Akt의 발현 수준은 증가시키는 것으로 나타났다. 이와 유사하게, HG 조건에서 β-catenin의 핵 내 이동은 억제된 반면, Dkk1 siRNA를 처리한 세포에서는 세포질과 핵 내에서 β-catenin을 모두 증가시키는 것으로 관찰되었다(도 7). 또한 HG로 유도된 p-JNK는 p-β-catenin과 Dkk1을 증가시켰고, 그리고 Dkk1 siRNA는 β-catenin의 핵 내 이동을 촉진시켰다(도 7). 이상의 결과는 TSPAN2가 JNK-Dkk1의 신호 전달 경로를 조절함으로서 β-catenin 핵 내 이동을 효과적으로 약화시키는 것을 보여준다.
< 실시예 5>
TSPAN2 가 JNK 를 통하여 Bax 를 활성화하는 기작
TSPAN2가 JNK 신호전달계에 기능적으로 연결되어 있는지를 조사하기 위하여 HG 조건에서 JNK 신호전달계의 변화를 확인하였다.
HG 조건에서 p-JNK이 증가하는 것으로 관찰되었다(도 8).
이어, siRNA로 TSPAN2의 발현을 억제하여 기능상실 분석(loss of function)을 실시하였다.
TSPAN2 siRNA는 p-JNK를 억제하였고, 선택적인 JNK 억제제(SP600125)는 JNK와 Bax의 활성을 억제하였다. 면역블롯 실험 결과(도 10)를 통하여 RNAKT-15 세포에서 p-JNK 단백질이 감소하는 것을 재확인하였으며, TSPAN2을 과발현시킴으로써 p-JNK 단백질로 매개된 Bax의 증가가 더욱 향상되는 것으로 나타났다. 나아가 β-catenin siRNA는 핵 내 β-catenin을 큰 폭으로 감소시켰고, Bax는 증가시킨 반면, JNK 억제제(SP600125)는 핵 내 β-catenin 수준을 증가시켰고, Bax를 감소시켰다(도 10). 이는 β-catenin 신호전달은 RNAKT-15 세포에서 Bax를 억제함으로써 췌장 β-세포 생존을 촉진시키는 것임을 나타낸다. 이상의 결과는 고농도 글루코스 조건에서 TSPAN2가 과발현되면, p-JNK 수준과 p-JNK로 완화된 핵 내 β-catenin 이동이 증가하여 Bax가 상향 조절되는 것을 보여준다.
< 실시예 6>
TSPAN2 과 JNK /β- catenin 신호전달계
앞선 실시예의 결과는 HG 조건에서 JNK의 인산화가 증가하여 HG가 JNK를 활성화시키는 것을 시사하였다. TSPAN2의 발현도 HG 조건에서 증가하므로, JNK가 Bax의 발현에 미치는 영향을 알아보았다.
세포를 mock처리하거나 TSPAN2 siRNA 또는 β-catenin siRNA로 형절전환하였다. 이후, 세포에 mock 처리하거나 또는 JNK 억제제(SP600125)를 처리하고, 세포 용해물로 웨스턴 블롯을 실시하였다.
그 결과, siRNA에 의한 TSPAN2의 발현 억제 또는 SP600125 처리가 JNK 활성을 억제하였으며, Bax의 발현 수준도 유사한 경향으로 감소하였다. 이러한 결과는 JNK의 활성화가 Bax의 발현에 관련되어 있음을 제시한다. 나아가 핵 내 β-catenin 수준은 siRNA를 이용한 TSPAN2의 발현 억제 또는 JNK 억제제에 의하여 증가하였다. 이상의 결과는 JNK에 의한 β-catenin 신호전달계의 억제는 Bax를 활성화시키는 것을 보여준다(도 10).
< 실시예 7>
글루코스 독성으로 유도되는 세포사멸에서의 TSPAN2 의 역할
고농도 글루코스 자극이 RNAKT-15 세포의 세포사멸을 유도하므로, TSPAN2이 세포사멸에 미치는 역할을 조사하였다.
HG 조건은 TSPAN2의 발현을 현저하게 자극하여 p-JNK를 과도하게 생성되도록 하였으며, 그 결과 핵 내 β-catenin의 수준과 전사 활성을 감소시켰다. JNK에 의한 β-catenin 신호전달의 억제는 세포사멸을 억제하는 Bcl-2과 역상관관계에 있는 JNK/β-catenin 신호전달계를 조절하여 세포사멸을 촉진하는 Bax 단백질의 수준을 증가시켰다. 최종적으로 caspase 3를 활성화하여 핵 내 PARP가 분해되도록 하고, RNAKT-15 세포의 세포사멸을 유도하게 된다. 뿐만 아니라, β-catenin의 핵 내 이동을 억제하는 TSPAN2를 siRNA를 이용하여 발현을 억제하면 HG로 유도되는 세포사멸을 효과적으로 방지할 수 있었다(도 11). 따라서 TSPAN2는 RNAKT-15 세포에서 세포사멸을 촉진하는 역할을 하며, 글루코스 독성에 의한 세포사멸에 중요하게 관여한다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 조성물과 스크리닝 방법은 고혈당 조건에서 JNK와 β-catenin을 통하여 췌장 베타 세포의 세포사멸을 촉진하는 TSPAN2의 역할을 이용하여 TSPAN2 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 전혀 새로운 작용기작의 당뇨병의 치료제를 개발하는 데 유용하게 이용될 수 있다.
<110> KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Composition for preventing or treating diabetes and method for screening antidiabetic agents using tetraspanin-2 <130> NP16-0062 <160> 89 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 221 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens tetraspanin-2 isoform 1 (NP_005716.2) <400> 1 Met Gly Arg Phe Arg Gly Gly Leu Arg Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Phe Asn Leu Leu Phe Trp Leu Ala Gly Ser Ala Val Ile Ala Phe 20 25 30 Gly Leu Trp Phe Arg Phe Gly Gly Ala Ile Lys Glu Leu Ser Ser Glu 35 40 45 Asp Lys Ser Pro Glu Tyr Phe Tyr Val Gly Leu Tyr Val Leu Val Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Leu Met Met Ala Val Gly Phe Phe Gly Cys Cys Gly Ala 65 70 75 80 Met Arg Glu Ser Gln Cys Val Leu Gly Ser Phe Phe Thr Cys Leu Leu 85 90 95 Val Ile Phe Ala Ala Glu Val Thr Thr Gly Val Phe Ala Phe Ile Gly 100 105 110 Lys Gly Val Ala Ile Arg His Val Gln Thr Met Tyr Glu Glu Ala Tyr 115 120 125 Asn Asp Tyr Leu Lys Asp Arg Gly Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ile Thr 130 135 140 Phe His Ser Thr Phe Gln Cys Cys Gly Lys Glu Ser Ser Glu Gln Val 145 150 155 160 Gln Pro Thr Cys Pro Lys Glu Leu Leu Gly His Lys Asn Cys Ile Asp 165 170 175 Glu Ile Glu Thr Ile Ile Ser Val Lys Leu Gln Leu Ile Gly Ile Val 180 185 190 Gly Ile Gly Ile Ala Gly Leu Thr Ile Phe Gly Met Ile Phe Ser Met 195 200 205 Val Leu Cys Cys Ala Ile Arg Asn Ser Arg Asp Val Ile 210 215 220 <210> 2 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens tetraspanin-2 isoform 2 (NP_001295244.1) <400> 2 Met Gly Arg Phe Arg Gly Gly Leu Arg Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Phe Asn Leu Leu Phe Trp Leu Ala Gly Ser Ala Val Ile Ala Phe 20 25 30 Gly Leu Trp Phe Arg Phe Gly Gly Ala Ile Lys Glu Leu Ser Ser Glu 35 40 45 Asp Lys Ser Pro Glu Tyr Phe Tyr Val Gly Leu Tyr Val Leu Val Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Leu Met Met Ala Val Gly Phe Phe Gly Cys Cys Gly Ala 65 70 75 80 Met Arg Glu Ser Gln Cys Val Leu Gly Ser Ala Ile Arg His Val Gln 85 90 95 Thr Met Tyr Glu Glu Ala Tyr Asn Asp Tyr Leu Lys Asp Arg Gly Lys 100 105 110 Gly Asn Gly Thr Leu Ile Thr Phe His Ser Thr Phe Gln Cys Cys Gly 115 120 125 Lys Glu Ser Ser Glu Gln Val Gln Pro Thr Cys Pro Lys Glu Leu Leu 130 135 140 Gly His Lys Asn Cys Ile Asp Glu Ile Glu Thr Ile Ile Ser Val Lys 145 150 155 160 Leu Gln Leu Ile Gly Ile Val Gly Ile Gly Ile Ala Gly Leu Thr Ile 165 170 175 Phe Gly Met Ile Phe Ser Met Val Leu Cys Cys Ala Ile Arg Asn Ser 180 185 190 Arg Asp Val Ile 195 <210> 3 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens tetraspanin-2 isoform 3 (NP_001295245.1) <400> 3 Met Gly Arg Phe Arg Gly Gly Leu Arg Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Leu 1 5 10 15 Gly Phe Asn Leu Leu Phe Trp Leu Ala Gly Ser Ala Val Ile Ala Phe 20 25 30 Gly Leu Trp Phe Arg Phe Gly Gly Ala Ile Lys Glu Leu Ser Ser Glu 35 40 45 Asp Lys Ser Pro Glu Tyr Phe Tyr Val Gly Leu Tyr Val Leu Val Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Leu Met Met Ala Val Gly Phe Phe Gly Cys Cys Gly Ala 65 70 75 80 Met Arg Glu Ser Gln Cys Val Leu Gly Ser Phe Phe Thr Cys Leu Leu 85 90 95 Val Ile Phe Ala Ala Glu Val Thr Thr Gly Val Phe Ala Phe Ile Gly 100 105 110 Lys Gly Val Ala Ile Arg His Val Gln Thr Met Tyr Glu Glu Ala Tyr 115 120 125 Asn Asp Tyr Leu Lys Asp Arg Gly Lys Gly Asn Gly Thr Leu Ile Thr 130 135 140 Phe His Ser Thr Phe Gln Cys Cys Gly Lys Glu Ser Ser Glu Gln Val 145 150 155 160 Gln Pro Thr Cys Pro Lys Glu Leu Leu Gly His Lys Ile Phe Gly Met 165 170 175 Ile Phe Ser Met Val Leu Cys Cys Ala Ile Arg Asn Ser Arg Asp Val 180 185 190 Ile <210> 4 <211> 3227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens tetraspanin-2 mRNA transcript variant 1 (NM_005725.5) <400> 4 ggagcctgcc gctccccgcg ctcgtagcgc gggcctgggg actggggatc ccgccgccgg 60 gccgcagcat ggggcgcttc cgcgggggcc tgcggtgcat caagtacctg ctgcttggct 120 tcaacctgct cttctggctg gctggatcgg ccgtcattgc ttttggacta tggtttcggt 180 tcggaggtgc cataaaggag ttatcatcag aggacaagtc cccagagtat ttctatgtgg 240 ggctgtatgt tctggttgga gccggggccc tgatgatggc cgtggggttc ttcgggtgct 300 gcggagccat gcgggagtcg caatgtgtgc ttggatcatt 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gtaagaattg 1200 agagatcaca atggagtgtt aaaactgact gtgtctaagt tgggtgtaag ggtttcctgg 1260 gtttttttat atacatgctc tccccagaat acagtaaacc acagttttag aactaaacac 1320 atctgtaaaa ctaaatatag catggaaaat ccaatttgaa taagtcatgc tttcctagaa 1380 tttaaaaata aaaaagtctt cctctggaaa gagaagtcac acagacaatc atgtgcccta 1440 taaaagtgag tgtttatagg actaaaaaac ttttaacaac tttttaagga aatatttttg 1500 ttcttataca aaaacatgta aatattgctt tattactttc attttctgac cctgctgtaa 1560 actactgcaa ccctcacatc ctcaaaggga cttttatgtc aaactcttct gtttctccaa 1620 atataaggaa aaaagactaa agcaagagat ctggcagttg aaaattgtgg gaaagagaat 1680 ttgtatgggc actgtatcta tgaaatacct cataacttac gtttacatgt tttcctaact 1740 ttttgtattt ttcttgtata gccacctaga gaattcttca tagattaaga actacagttt 1800 tcaccactta acataagtaa aacaaagtcc ttcataattt aaccattagc atctttggcc 1860 aaaccaaaat aaagaaaagc atcttctcct agttgtgtgt gggcaacaga aacaagttaa 1920 ggaaacaaaa atacttatat atacacagaa caaaaataat gttcttttta tgcaaatccc 1980 ctgtgaaaat aaaattttca atgttttttt ggtcttaacg cttcatttta acttagtaaa 2040 cccaaattta ggatttacat tggcaaattt ttcagtgatt tttaacgtgt tacatttagt 2100 aaaccataga ttttttaaaa actacatttt gtaaggccac acataagtga aaatacggaa 2160 ggctttggaa acccccagat gaacttctat acatgtgaaa acacaagtct ttgagtgtgc 2220 actaaaagtg tcacactccc aaaaaactca caaaacattt tgctaaaaag atatgactgc 2280 ttgaaatagt ctctctccca tggagaacca catttctctt tctgccatac ttgctactgc 2340 tactgatttt ggaggaaatt tttctagaag aacaaaggtc atatttgagg caagctaaaa 2400 acttaattat acatggctac tttactgtgt ctgtagctaa agaaaaatta ttttacaaaa 2460 attacttcat gaaatatagt ttgtacccca gtagttgaga aatgtgacct tttaggcaaa 2520 gaacaggcag tccatctctc ttagctttag tttatctctc tgcctgaaga caggaaacag 2580 gcccaagtgc atactcgggt tctttccaac tcagaatcat ctctgattcc acaaaagtga 2640 gtttagtttc ctatctgaat taacaacttt aaaggagact ataatagtta aaagtggaag 2700 aatagaaata aataaattta aaatgaaatt aattaaagta gaagagaagg gttctgttcc 2760 atgtacgatt aatgtgcccc ttttggagat aagctttcca aaatatgcgt atgagtaaaa 2820 ttagagaatt ccaccactaa gcaacaatag attttatatg tgtgtgtgga 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attttgtaag gccacacata agtgaaaata cggaaggctt tggaaacccc 2100 cagatgaact tctatacatg tgaaaacaca agtctttgag tgtgcactaa aagtgtcaca 2160 ctcccaaaaa actcacaaaa cattttgcta aaaagatatg actgcttgaa atagtctctc 2220 tcccatggag aaccacattt ctctttctgc catacttgct actgctactg attttggagg 2280 aaatttttct agaagaacaa aggtcatatt tgaggcaagc taaaaactta attatacatg 2340 gctactttac tgtgtctgta gctaaagaaa aattatttta caaaaattac ttcatgaaat 2400 atagtttgta ccccagtagt tgagaaatgt gaccttttag gcaaagaaca ggcagtccat 2460 ctctcttagc tttagtttat ctctctgcct gaagacagga aacaggccca agtgcatact 2520 cgggttcttt ccaactcaga atcatctctg attccacaaa agtgagttta gtttcctatc 2580 tgaattaaca actttaaagg agactataat agttaaaagt ggaagaatag aaataaataa 2640 atttaaaatg aaattaatta aagtagaaga gaagggttct gttccatgta cgattaatgt 2700 gccccttttg gagataagct ttccaaaata tgcgtatgag taaaattaga gaattccacc 2760 actaagcaac aatagatttt atatgtgtgt gtggatatat atacacacac acacagaaag 2820 atgaatatat atatatatat atctgtatag acacacatat aatatatata gatatataat 2880 ccctatatat cttgaatcta caaatatctt tatatgtata taatttgaat atatacatgt 2940 atgtatatac agatgtgtgt gtatatatat atatacatac acatatacat aaattttcag 3000 ctatttctgt tcccctgaac taatttgaga ttagacccaa acatgctttt aaatgtctca 3060 tgccaaggca ctgaattaag acttcttaat gttgaaatat tttaagtgat ttcatattaa 3120 attttctata tactgaaaaa aaaaaaaaaa aa 3152 <210> 6 <211> 3143 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Homo sapiens tetraspanin-2 mRNA transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 6 ggagcctgcc gctccccgcg ctcgtagcgc gggcctgggg actggggatc ccgccgccgg 60 gccgcagcat ggggcgcttc cgcgggggcc tgcggtgcat caagtacctg ctgcttggct 120 tcaacctgct cttctggctg gctggatcgg ccgtcattgc ttttggacta tggtttcggt 180 tcggaggtgc cataaaggag ttatcatcag aggacaagtc cccagagtat ttctatgtgg 240 ggctgtatgt tctggttgga gccggggccc tgatgatggc cgtggggttc ttcgggtgct 300 gcggagccat gcgggagtcg caatgtgtgc ttggatcatt ttttacctgc ctcctggtga 360 tatttgctgc tgaagtaacc actggagtat ttgcttttat aggcaagggg gtagctatcc 420 gacatgttca gaccatgtat gaagaggctt acaatgatta ccttaaagac aggggaaaag 480 gcaatgggac actcatcacc ttccactcaa catttcagtg ctgtggaaaa gaaagctccg 540 aacaggtcca acctacatgc ccaaaggagc ttctaggaca caagatcttt ggcatgatat 600 tcagcatggt cctctgctgt gcgatacgaa actcacgaga tgtgatatga agctacttct 660 acatgaaaat tgcaatctaa agctttcata ccaaatgtca caggagctgt ctcccagctc 720 atttttaaca ctgaaatgac attaggatct aaaataattt gctgtcaatt gtacatttgc 780 atgagtacgt atgtttggct cattactggt ttaccccttg agtgaatgcc tgtttatgat 840 gactgagagc atattcatgt gtgatctgcg tgtttctgga atatgcttta tacgtaatga 900 aatctgtttg ctgggaattc ctgattcttg ttatataaga agaacaacct atttcgctcc 960 cagaaaaaaa agatcaaaga gctttcagaa actttgagaa cttggctatt tagaaaaagt 1020 gataatgggt cagtttctca gactgtagcc attgaaaatt agatgcagag aattcagaga 1080 tttcttctta atggaagtaa taagctgtaa gaattgagag atcacaatgg agtgttaaaa 1140 ctgactgtgt ctaagttggg tgtaagggtt tcctgggttt ttttatatac atgctctccc 1200 cagaatacag taaaccacag ttttagaact aaacacatct gtaaaactaa atatagcatg 1260 gaaaatccaa tttgaataag tcatgctttc ctagaattta aaaataaaaa agtcttcctc 1320 tggaaagaga agtcacacag acaatcatgt gccctataaa agtgagtgtt tataggacta 1380 aaaaactttt aacaactttt taaggaaata tttttgttct tatacaaaaa catgtaaata 1440 ttgctttatt actttcattt tctgaccctg ctgtaaacta ctgcaaccct cacatcctca 1500 aagggacttt tatgtcaaac tcttctgttt ctccaaatat aaggaaaaaa gactaaagca 1560 agagatctgg cagttgaaaa ttgtgggaaa gagaatttgt atgggcactg tatctatgaa 1620 atacctcata acttacgttt acatgttttc ctaacttttt gtatttttct tgtatagcca 1680 cctagagaat tcttcataga ttaagaacta cagttttcac cacttaacat aagtaaaaca 1740 aagtccttca taatttaacc attagcatct ttggccaaac caaaataaag aaaagcatct 1800 tctcctagtt gtgtgtgggc aacagaaaca agttaaggaa acaaaaatac ttatatatac 1860 acagaacaaa aataatgttc tttttatgca aatcccctgt gaaaataaaa ttttcaatgt 1920 ttttttggtc ttaacgcttc attttaactt agtaaaccca aatttaggat ttacattggc 1980 aaatttttca gtgattttta acgtgttaca tttagtaaac catagatttt ttaaaaacta 2040 cattttgtaa ggccacacat aagtgaaaat acggaaggct ttggaaaccc ccagatgaac 2100 ttctatacat gtgaaaacac aagtctttga gtgtgcacta aaagtgtcac actcccaaaa 2160 aactcacaaa acattttgct aaaaagatat gactgcttga aatagtctct ctcccatgga 2220 gaaccacatt tctctttctg ccatacttgc tactgctact gattttggag gaaatttttc 2280 tagaagaaca aaggtcatat ttgaggcaag ctaaaaactt aattatacat ggctacttta 2340 ctgtgtctgt agctaaagaa aaattatttt acaaaaatta cttcatgaaa tatagtttgt 2400 accccagtag ttgagaaatg tgacctttta ggcaaagaac aggcagtcca tctctcttag 2460 ctttagttta tctctctgcc tgaagacagg aaacaggccc aagtgcatac tcgggttctt 2520 tccaactcag aatcatctct gattccacaa aagtgagttt agtttcctat ctgaattaac 2580 aactttaaag gagactataa tagttaaaag tggaagaata gaaataaata aatttaaaat 2640 gaaattaatt aaagtagaag agaagggttc tgttccatgt acgattaatg tgcccctttt 2700 ggagataagc tttccaaaat atgcgtatga gtaaaattag agaattccac cactaagcaa 2760 caatagattt tatatgtgtg tgtggatata tatacacaca cacacagaaa gatgaatata 2820 tatatatata tatctgtata gacacacata taatatatat agatatataa tccctatata 2880 tcttgaatct acaaatatct ttatatgtat ataatttgaa tatatacatg tatgtatata 2940 cagatgtgtg tgtatatata tatatacata cacatataca taaattttca 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(NM_001308315.1) <400> 17 aagaacaggc agtccatctc t 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#3 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 18 aagtcttcct ctggaaagag a 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#4 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 19 aagcaagaga tctggcagtt g 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#5 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 20 aaggagttat catcagagga c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#6 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 21 aagagctttc agaaactttg a 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#7 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 22 aagaggctta caatgattac c 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#8 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 23 aagtctttga gtgtgcacta a 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#9 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 24 aaggcactga attaagactt c 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#1 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 25 aagctttcat accaaatgtc a 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#2 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 26 aagaacaggc agtccatctc t 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#3 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 27 aagtcttcct ctggaaagag a 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#4 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 28 aagcaagaga tctggcagtt g 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#5 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 29 aaggagttat catcagagga c 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#6 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 30 aagagctttc agaaactttg a 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#7 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 31 aagaggctta caatgattac c 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#8 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 32 aagtctttga gtgtgcacta a 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA#9 for tetraspanin-2 mRNA, transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 33 aaggcactga attaagactt c 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#1 <400> 34 aagaaccacc ttgtcttcaa a 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#2 <400> 35 aaggctctca tggactagaa a 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#3 <400> 36 aagtaccaga ccattgacaa c 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#4 <400> 37 aagaaggtca agtgtgtacc a 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#5 <400> 38 aagcattcca ataacacctt c 21 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#6 <400> 39 aagccagtaa ttcttctagg c 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#7 <400> 40 aagatcacca tcaagccagt a 21 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#8 <400> 41 aagtgtgtac caagcatagg a 21 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#9 <400> 42 aaggatctct tggaatgaca a 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DKK1 siRNA#10 <400> 43 aaggttctgt ttgtctccgg t 21 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 1 forward for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 44 ttggaattgt cggtattgga 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 1 reverse for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 45 tctcgtgagt ttcgtatcgc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 2 forward for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 46 aacctacatg cccaaaggag 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 2 reverse for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 47 atcatgccaa agatcgtcag 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 3 forward for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 48 ctgacgatct ttggcatgat 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 3 reverse for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 49 acagctcctg tgacatttgg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 4 forward for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 50 aagaaagctc cgaacaggtc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 4 reverse for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 51 cgatgcaatt cttgtgtcct 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 5 forward for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 52 aaaggcaatg ggacactcat 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 5 reverse for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 53 gacctgttcg gagctttctt 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 6 forward for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 54 tcaacatttc agtgctgtgg 20 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 6 reverse for TSPAN2 transcript variant 1(NM_005725.5) <400> 55 aagctccttt gggcatgta 19 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 1 forward for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 56 ttggaattgt cggtattgga 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 1 reverse for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 57 tctcgtgagt ttcgtatcgc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 2 forward for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 58 aacctacatg cccaaaggag 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 2 reverse for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 59 atcatgccaa agatcgtcag 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 3 forward for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 60 ctgacgatct ttggcatgat 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 3 reverse for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 61 acagctcctg tgacatttgg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 4 forward for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 62 aagaaagctc cgaacaggtc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 4 reverse for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 63 cgatgcaatt cttgtgtcct 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 5 forward for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 64 aaaggcaatg ggacactcat 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 5 reverse for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 65 gacctgttcg gagctttctt 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 6 forward for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 66 tcaacatttc agtgctgtgg 20 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 6 reverse for TSPAN2 transcript variant 2 (NM_001308315.1) <400> 67 aagctccttt gggcatgta 19 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 1 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 68 aacctacatg cccaaaggag 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 1 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 69 tctcgtgagt ttcgtatcgc 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 2 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 70 tattcagcat ggtcctctgc 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 2 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 71 cagctcctgt gacatttggt 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 3 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 72 tcatgtgtga tctgcgtgtt 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 3 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 73 ctgggagcga aataggttgt 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 4 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 74 aagaaagctc cgaacaggtc 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 4 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 75 gcagaggacc atgctgaata 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 5 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 76 aaaggcaatg ggacactcat 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 5 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 77 gacctgttcg gagctttctt 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 6 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 78 ggctgtatgt tctggttgga 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 6 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 79 aatatcacca ggaggcaggt 20 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 7 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 80 tggctcatta ctggtttacc c 21 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 7 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 81 atcaggaatt cccagcaaac 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 8 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 82 aagtacctgc tgcttggctt 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 8 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 83 tccgaaccga aaccatagtc 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 9 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 84 tcaacatttc agtgctgtgg 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 9 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 85 ctagaagctc ctttgggcat 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 10 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 86 gcaatgtgtg cttggatcat 20 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 10 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 87 tggtctgaac atgtcggata g 21 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 11 forward for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 88 caaagaacag gcagtccatc 20 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT-PCR primer set 11 reverse for TSPAN2 transcript variant 3 (NM_001308316.1) <400> 89 gagttggaaa gaacccgagt a 21

Claims (10)

  1. 테트라스파닌-2(TSPAN2) 단백질의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 TSPAN2 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열로 표시되는 아미노선 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 TSPAN2 단백질 발현 억제제는 TSPAN2 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide), siRNA, shRNA, miRNA, ribozyme, DNAzyme 및 PNA(protein nucleic acid)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 TSPAN2 mRNA는 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 TSPAN2 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA는 서열번호 7 내지 서열번호 33으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 서열로 표시되는 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 TSPAN2 단백질 활성 억제제는 TSPAN2 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 유사체(mimetics), 앱타머, 항체, 천연추출물 및 합성화합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. (a) 시험 물질을 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포에 접촉시키는 단계;
    (b) 상기 세포와 시험 물질을 접촉하지 않은 대조군 세포에서 TSPAN2 유전자 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 대조군 세포와 비교하여 TSPAN2 유전자 발현 수준을 감소시키는 시험 물질을 당뇨병 치료제 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 당뇨병 치료제 스크리닝 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 TSPAN2 유전자를 발현하는 세포는 췌장 베타 세포(pancreatic β cell) 또는 췌장 베타 세포에서 유래한 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 TSPAN2 유전자 발현 수준의 측정은 TSPAN2 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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