WO2022102984A1 - 다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법 - Google Patents

다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2022102984A1
WO2022102984A1 PCT/KR2021/013872 KR2021013872W WO2022102984A1 WO 2022102984 A1 WO2022102984 A1 WO 2022102984A1 KR 2021013872 W KR2021013872 W KR 2021013872W WO 2022102984 A1 WO2022102984 A1 WO 2022102984A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
taz
axin1
pkd1
kidney disease
polycystic kidney
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/013872
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김용균
박종훈
이은지
서은정
전재희
박민아
남선아
김진원
이종영
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Publication of WO2022102984A1 publication Critical patent/WO2022102984A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4709—Non-condensed quinolines and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5035—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on sub-cellular localization
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for polycystic kidney disease, a screening method thereof, and the like.
  • Polycystic kidney disease or polycystic kidney disease is a genetic disease in which the kidney is deformed into a honeycomb shape due to multiple fluid-filled cysts, and is classified into autosomal dominant polycystic kidney (ADPKD) and autosomal recessive polycystic kidney (ARPKD).
  • ADPKD autosomal dominant polycystic kidney
  • ARPKD autosomal recessive polycystic kidney
  • Autosomal dominant polycystic kidney (ADPKD, hereinafter referred to as "polycystic kidney") is the most common hereditary kidney disease in the kidney, with an incidence of 1 in 1,000 people.
  • ADPKD Autosomal dominant polycystic kidney
  • multiple cysts develop in both kidneys, and the size and number of cysts increase, eventually leading to death due to renal failure in the 50s and 60s.
  • the cyst progresses as the cyst epithelial cell proliferates and then the cyst fluid fills the cyst, causing the cyst to increase in size.
  • Polycystic kidney accounts for about 2% of domestic dialysis patients, and is the second most common cause after diabetes, hypertension, and glomerulonephritis.
  • Polycystic kidney not only causes structural and functional defects in both kidneys, but also can be accompanied by various kidney complications, so management is required from the relatively early stage of the disease.
  • the causative genes of polycystic kidney are PKD1 and PKD2 genes, which encode proteins called polycystin-1 and polycystin-2, respectively. It is known that 85% of patients diagnosed with polycystic kidney are due to a defect in the PKD1 gene and the remaining 15% to a defect in the PKD2 gene.
  • the technical object of the present invention is to provide a therapeutic agent for polycystic kidney disease and a screening method thereof. Inhibition was confirmed, and it was confirmed that the level of cyst formation was changed according to the expression level of TAZ and AXIN1.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of polycystic kidney disease comprising an inhibitor of the interaction of TAZ and AXIN1 as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is a Wnt inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • compositions for preventing or treating polycystic kidney disease comprising rapamycin, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a screening method for a preventive or therapeutic agent for polycystic kidney disease, comprising the following steps.
  • Another object of the present invention is to provide a screening method for a preventive or therapeutic agent for polycystic kidney disease, comprising the following steps.
  • test substance inhibits the interaction between the AXIN1 protein and the TAZ protein, when the interaction is reduced by contact with the test substance compared to a control not treated with the test substance, Selecting the test substance as a therapeutic candidate.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating polycystic kidney disease comprising an inhibitor of the interaction of TAZ and AXIN1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a use for preventing or treating polycystic kidney disease of a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of the interaction of TAZ and AXIN1 as an active ingredient.
  • the present invention provides the use of an inhibitor of the interaction of TAZ and AXIN1 for the manufacture of a medicament for polycystic kidney disease.
  • the present invention provides a method for preventing or treating polycystic kidney disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising a TAZ and AXIN1 interaction inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a Wnt inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • compositions for preventing or treating polycystic kidney disease comprising rapamycin, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a Wnt inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a use for preventing or treating polycystic kidney disease of a pharmaceutical composition comprising rapamycin, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a Wnt inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • rapamycin a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof for the manufacture of a medicament for polycystic kidney disease.
  • the present invention provides a Wnt inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • It provides a method for preventing or treating polycystic kidney disease, comprising administering to a subject a pharmaceutical composition comprising rapamycin, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a screening method for a preventive or therapeutic agent for polycystic kidney disease comprising the following steps.
  • the polycystic kidney disease may be autosomal dominant polycystic kidney disease, but is not limited thereto.
  • the TAZ and AXIN1 interaction inhibitor may inhibit renal cyst formation, but is not limited thereto.
  • the Wnt inhibitor may be EndoIWR1, but is not limited thereto.
  • the step (b) may further include the step of measuring the activity of ⁇ -catenin, but is not limited thereto.
  • the co-localization may be, but is not limited to, a nuclear-specific co-localization.
  • the present invention provides a screening method for a preventive or therapeutic agent for polycystic kidney disease comprising the following steps.
  • test substance inhibits the interaction between the AXIN1 protein and the TAZ protein, when the interaction is reduced by contact with the test substance compared to a control not treated with the test substance, Selecting the test substance as a therapeutic candidate.
  • the AXIN1 protein and the TAZ protein may be provided in the form of cells or tissues expressing them, but is not limited thereto.
  • the step (b) is a two-hybrid method, a co-immunoprecipitation assay, a co-localization assay, a scintillation proximity assay (SPA) ), UV or chemical crosslinking methods, bimolecular interaction analysis (BIA), mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), fluorescence polarization assays (FPA) and in vitro It may be performed by one or more methods selected from the group consisting of a pull-down assay, but is not limited thereto.
  • the present inventors confirmed that the interaction between TAZ and AXIN1 in PKD1-deficient cells causes the accumulation of ⁇ -catenin in the nucleus together with TAZ. By confirming that the formation of cysts is alleviated, an inhibitor of the interaction of TAZ and AXIN1 can be usefully used for the prevention or treatment of polycystic kidney disease.
  • Figure 1 confirms the high expression of TAZ, c-MYC and active ⁇ -catenin in the kidneys of Pkd1-deficient mice and ADPKD patients:
  • Figure 1a shows YAP/YAP/ The results of screening for basal levels of TAZ, c-MYC and active ⁇ -catenin are shown;
  • 1B shows increased c-Myc levels in mRNA samples in Pkd1-deleted kidneys;
  • 1c to 1h show the results of immunofluorescence (IF) staining of DBA, TAZ, c-MYC and active ⁇ -catenin (ABC) around the cyst-lined cells in the kidneys of Pkd1-deficient mice.
  • IF immunofluorescence
  • the fluorescence signals are Image Quantified by green histogram analysis using the J program;
  • Figure 1i shows the immunohistochemical results of normal and ADPKD human kidneys.
  • Immunohistochemical (IHC) staining results of TAZ, ⁇ -catenin, active ⁇ -catenin (ABC) and c-MYC, ADPKD patients compared to normal kidney. increased substantially around the cyst cells of Scale Bar 100 mm.
  • Two wild-type and four Pkd1-null mouse kidneys were used to test the basal expression levels of TAZ, c-MYC and active ⁇ -catenin.
  • Statistical analysis was performed using a two-tailed t-test. A value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant (*P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001).
  • FIG. 2 is a result of gene expression analysis of TAZ and its target gene in Pkd1-deficient kidneys based on RNA-seq data: FIG. 2a shows changes in Yap1, Taz and ⁇ -catenin levels in Pkd1-deficient kidneys compared to control.
  • Figure 2b is the result of GSEA analysis of 354 Yap/Taz target gene between Pkd1-deleted kidney and control
  • 2D is the log2-fold change value of the top 20 increased genes in Pkd1-deleted kidney compared to normal
  • Figure 2e shows the mRNA expression level of the upper gene including c-Myc. Statistics were analyzed by t-test and P ⁇ 0.05 was considered statistically significant (*P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001).
  • Figure 3 shows the improvement of the renal function-enhanced PKD phenotype in the kidneys of Pkd1-deficient mice from which Taz has been removed:
  • Figure 3a is hematoxylin of wild-type, Taz-null, Pkd1-null or Pkd1/Taz double-null kidneys.
  • eosin (H & E) staining the renal cyst area of Pkd1-null or Pkd1/Taz double null kidneys was quantified by Image J program and the change in size distribution was graphed.
  • Figure 3b shows the ratio of the two kidney weights to the total body weight and blood urea nitrogen (BUN) level of mice at 13 days of age (p13). The number of mice used to compare the 2KW/TBW ratio and BUN level was Each subject is marked with a dot; Fig.
  • 3c is a Western blot analysis result using whole kidney lysates from each group of mice at p13 to test for changes in c-MYC and ⁇ -catenin levels due to TAZ deficiency; 3D to 3F are results of immunofluorescence staining of TAZ, c-MYC or active ⁇ -catenin and quantitative analysis using Image J program; Figure 3g is the change of cell proliferation tested by Ki-67 staining, the fluorescence signal was quantified in the same way as above.
  • One wild, two Taz-null, three Pkd1-null and four double Pkd1-/Taz-null kidneys were used, and the number of images used for statistics is indicated by dots on the graph.
  • Figure 4 shows changes in c-MYC levels and in vitro cyst growth by TAZ regulation:
  • Figures 4a and 4b are the screening results of TAZ and c-MYC expression levels in Pkd1 silenced mouse internal medullary collecting duct (IMCD) cells;
  • Figure 4c is the effect of a TAZ modulator to enhance TAZ activity through translocation to the nucleus, cells were treated with drugs at different concentrations of 1 ⁇ 10 ⁇ M.
  • the level of TAZ increased at both low and high concentrations, and the expression of c-MYC was also increased;
  • 4d to 4f show the effect of TAZ level regulation on cyst formation in vitro by genetic regulation or treatment of TAZ regulatory factors. Overexpression resulted in increased expression of c-MYC.
  • FIG. 4g shows the change in c-MYC level due to Wnt inhibition, the result of treatment with either ExoIWR1 (Negative control of Endo IWR1) or Endo IWR1 (AXIN stabilizer) at 10 ⁇ M for 24 hours.
  • Figure 4h shows the effect of Wnt inhibitors on cysts in vitro stimulated by TAZ modulators. All data were obtained from at least three independent experiments, and statistical analysis was performed using a two-tailed t-test. A value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant (*P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001).
  • Figure 5 shows the regulation of ⁇ -catenin activation by PKD1 through TAZ and AXIN1: ) cells were transduced with a retroviral vector expressing shTAZ or the indicated siRNA and subjected to western analysis;
  • Figure 5b confirms the dose-dependent increase in the level of active ⁇ -catenin by overexpression of HA-TAZ in IMCD cells expressing Flag-PKD1.
  • IMCD cells were co-transfected with the indicated amounts of HA-TAZ plasmid and Flag-PKD1. infected;
  • 5c and 5d show the results of luciferase assay for ⁇ -catenin activity.
  • IMCD cells expressing the indicated vectors were transfected with pTOP flash and Renilla luciferase vectors;
  • Figure 5e shows the inhibition of the decrease in the level of active ⁇ -catenin protein, IMCD cells expressing siRNA for AXIN1 or a control transfected with the indicated plasmids were used;
  • 5f and 5g show the results of luciferase assay for active ⁇ -catenin in cells transfected or transduced with the indicated siRNA, plasmid, shTAZ or expression plasmid;
  • Fig. 5h shows the results of qRT-PCR analysis of ⁇ -catenin target genes, AXIN1, c-MYC and CCND2. Cells were transduced with the indicated siRNA or shTAZ retroviral vectors.
  • Figure 6 shows the result that the strong interaction between AXIN1 and TAZ causes activation of ⁇ -catenin in the absence of PKD1:
  • Figure 6a shows the interaction between HA-TAZ and AXIN1 in the absence of PKD1, wherein HA-TAZ Inner medullary collecting duct (IMCD) cells were co-transfected with si-control or si-PKD1, followed by immunoprecipitation with anti-HA antibody followed by immunoblotting with the indicated antibody;
  • Figure 6b shows the strong interaction between MYC-AXIN1 and HA-TAZ in PKD1 silenced cells.
  • IMCD Inner medullary collecting duct
  • Figure 7 shows the colocalization of AXIN1 and TAZ in the absence of PKD1.
  • Figure 7a shows siRNA against control or PKD1. After transfection of cells with HA-TAZ, immunostaining for HA-TAZ, and counterstaining of nuclei with DAPI, knockdown of PKD1 using siPKD1 increased the nuclear localization of HA-TAZ, and Distributions were graphically scored by cytoplasm (C) and cytoplasm and nucleus (CN).
  • Results are the average of three independent experiments, with a minimum of 100 cells used for each sample in all experiments;
  • Figure 7b is a schematic diagram showing that PKD1 knockdown increased the co-localization of HA-TAZ and MYC-AXIN1 in the cytoplasm after transfection of Pkd1-deficient cells with MYC-AXIN1 and HA-TAZ. Scale bar is 20 ⁇ m.
  • Fig. 8 shows the increase in the expression of c-MYC in Pkd1-deficient cells:
  • Fig. 8a shows the localization of active ⁇ -catenin and TAZ in the nucleus by PKD1 knockdown, and cells were treated with si-control or si-PKD1 RNA. After transfection, lysis with hypotonic buffer to prepare cytoplasmic fraction and nuclear pellet lysed with RIPA buffer; 8b and 8c show inhibition of increase in c-MYC mRNA and protein levels in co-deficient cells transfected with siPKD1 RNA or shTAZ retroviral vector, qRT-PCR and Western These are the results of performing blot analysis;
  • FIG. 8D shows the results of regulation of c-MYC protein level by TAZ and ⁇ -catenin, and Western blot analysis was performed on the protein.
  • FIG. 9 shows a schematic diagram of the regulation of the TAZ/Wnt- ⁇ -catenin/c-MYC axis by PKD1 in renal cystogenesis, where TAZ interacts with PKD1, and cytosolic ⁇ -catenin is AXIN1, APC and ⁇ -TrCP It is present in a destructive complex composed of In addition, in cells lacking PKD1, TAZ is induced to interact with AXIN1 and ⁇ -catenin is released from the disruption complex for localization in the nucleus. On the other hand, a part of TAZ is also present in the nucleus, which induces the expression of c-MYC mRNA.
  • Figure 10 shows the effect of rapamycin on the TAZ/Wnt- ⁇ -catenin/c-MYC axis and the synergistic effect of Wnt inhibition and cyst growth: TAZ, c-MYC and active ⁇ under rapamycin treatment.
  • TAZ time to rapamycin
  • c-MYC active ⁇ under rapamycin treatment.
  • 10B shows the results of observation of cysts in vitro after Pkd1-silencing with or without drug treatment at the indicated concentrations. All data were obtained from at least three independent experiments. Statistical analysis was performed using a two-tailed t-test, and a value of P ⁇ 0.05 was considered statistically significant (*P ⁇ 0.05, **P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001).
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that inhibiting the interaction of TAZ and AXIN1 inhibits cyst formation in the kidney through the Examples (see Examples of the present invention).
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating polycystic kidney disease comprising an inhibitor of the interaction of TAZ and AXIN1 as an active ingredient.
  • the present invention provides a Wnt inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • compositions for preventing or treating polycystic kidney disease comprising rapamycin, a derivative thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • TAZ Transcriptional Coactivator with PDZ-binding motif
  • WWTR1 transcription regulator 1
  • WWTR1 transcription regulator 1
  • the TAZ protein which has migrated to the cell nucleus, binds to various transcription factor proteins through protein structural properties and regulates transcription factor activity.
  • the TAZ may include or consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • AXIN1 is an isoform of the Axin gene, and Axin1 and Axin2 genes are known to regulate protein phosphorylation through different transcriptional regulatory processes.
  • Axin gene acts as a negative regulator of Wnt signaling by promoting phosphorylation of ⁇ -catenin by GSK3 to reduce half-life.
  • the AXIN1 may include or consist of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • reaction means that TAZ and AXIN1 both directly or indirectly bind to increase the activity of ⁇ -catenin, and TAZ regulates the function of AXIN1 at a higher level.
  • PKD1 is deficient, TAZ interacting with PKD1 is separated and separated and the activity of ⁇ -catenin interacting with the AXIN1-containing complex is increased by interacting with AXIN1.
  • the term "therapeutic agent for polycystic kidney disease that inhibits interaction” refers to TAZ interacting with AXIN1 to inhibit the increase in the activity of ⁇ -catenin, thereby inhibiting the formation of renal cysts to treat polycystic kidney disease. means to treat and prevent.
  • inhibiting interaction includes both inhibiting, alleviating, and eliminating the interaction between TAZ and AXIN1. Interaction inhibition may inhibit the interaction between TAZ and AXIN1 itself, but TAZ Inhibiting the interaction between TAZ and AXIN1 by reducing activity is also included.
  • the polycystic kidney disease may be an autosomal dominant polycystic kidney disease, but is not limited thereto.
  • the polycystic kidney disease may include juvenile polycystic kidney disease and adult polycystic kidney disease, preferably adult polycystic kidney disease, but is not limited thereto.
  • the TAZ and AXIN1 interaction inhibitor may be one or more selected from the group consisting of compounds, peptides, peptidomimetics, matrix analogues, aptamers and antibodies that specifically bind to TAZ and / or AXIN1 protein. , but is not limited thereto.
  • the Wnt inhibitor may be EndoIWR1, but is not limited thereto.
  • the TAZ and AXIN1 interaction inhibitor is EndoIWR1; and rapamycin or a derivative thereof, but is not limited thereto.
  • EndoIWR1 identified by the present inventors; And the effect of inhibiting renal cyst formation by concurrent administration of rapamycin or a derivative thereof is as follows.
  • cyst growth is significantly inhibited by rapamycin treatment, and combined with a Wnt inhibitor It was confirmed that the treatment significantly reduced cyst growth compared to the single treatment group (see Example 9 and FIG. 10 of the present invention).
  • EndoIWR1 may be represented by the following Chemical Formula 1, but is not limited thereto.
  • the rapamycin is also called sirolimus, and is a macrolide lactone compound having a structure of the following formula (C 51 H 79 NO 13 ) and having a molecular weight of 914.2 Da. Rapamycin binds with FK-binding protein 12 (FKBP12) in the cytoplasm to form a complex and inhibits mTOR activity. In the immune system, rapamycin inhibits IL-2 and other cytokine receptor-related signaling and prevents the proliferation and activation of T and B cells in the immune system.
  • FKBP12 FK-binding protein 12
  • rapamycin is widely used as an immunosuppressive agent for organ transplantation or autoimmune diseases, especially compared to immunosuppressive agents that inhibit calcineurin such as cyclosporin or tacrolimus. Because of the advantage of low toxicity, it is used in the field of kidney transplantation.
  • rapalogs that are analogs of rapamycin include temsirolimus, everolimus, and deforolimus.
  • Temsirolimus is an mTOR-specific inhibitor, also known as Torisel or CCI-779 (formula C 56 H 87 NO 16 , molecular weight 1030.3 Da).
  • Everolimus is a 40-O-(2-hydroxyethyl) derivative of rapamycin, known as RAD001 or trademarks of Zortress, Certican, Afinitor, etc., and acts similarly to rapamycin (formula C 53 H 83 NO 14 , molecular weight 958.2 Da). It is currently used as an immunosuppressant for organ transplantation.
  • Deforolimus is an mTOR inhibitor also known as ridaforolimus or AP23573, MK-8669, etc. (Formula C 53 H 84 NO 14 P, molecular weight 990.22 Da).
  • rapamycin may be represented by the following Chemical Formula 2, but is not limited thereto.
  • EndoIWR1; And rapamycin or its derivatives may be isolated from nature or prepared by chemical synthesis known in the art.
  • the TAZ and AXIN1 interaction inhibitor may inhibit renal cyst formation, but is not limited thereto.
  • composition may be provided in the form of a pharmaceutical composition or a food composition, but is not limited thereto.
  • the present invention may also include the active ingredient in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • pharmaceutically acceptable salt includes salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases.
  • food pharmaceutically acceptable salt includes salts derived from pharmaceutically acceptable organic acids, inorganic acids, or bases.
  • veterinary acceptable salt includes salts derived from veterinary acceptable inorganic acids, organic acids, or bases.
  • acids examples include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, gluconic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example, by dissolving the compound in an aqueous solution of an excess of acid, and precipitating the salt using a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. It can also be prepared by heating an equimolar amount of the compound and an acid or alcohol in water and then evaporating the mixture to dryness, or by suction filtration of the precipitated salt.
  • a water-miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Salts derived from suitable bases may include, but are not limited to, alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • the alkali metal or alkaline earth metal salt can be obtained, for example, by dissolving the compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the undissolved compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is pharmaceutically suitable to prepare a sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt can be obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • the content of the inhibitor in the composition of the present invention can be appropriately adjusted according to the symptoms of the disease, the degree of progression of the symptoms, the condition of the patient, etc., for example, 0.0001 to 99.9% by weight, or 0.001 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
  • the content ratio is a value based on the dry amount from which the solvent is removed.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, at least one selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a humectant, a film-coating material, and a controlled-release additive.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared according to a conventional method, respectively, in powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, liquids, eye drops, elsilic, emulsions, suspensions, alcohols, troches, fragrances, and limonaade.
  • tablets, sustained release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusates, Warnings, lotions, pasta, sprays, inhalants, patches, sterile injection solutions, or external preparations such as aerosols can be formulated and used, and the external preparations are creams, gels, patches, sprays, ointments, warning agents , lotion, liniment, pasta, or cataplasma.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • formulation it is prepared using commonly used diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • water diluted hydrochloric acid, diluted sulfuric acid, sodium citrate, monostearate sucrose, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (Twinester), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, etc.
  • water diluted hydrochloric acid, diluted sulfuric acid, sodium citrate, monostearate sucrose, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (Twinester), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone,
  • sucrose solution other sugars or sweeteners may be used, and if necessary, a fragrance, colorant, preservative, stabilizer, suspending agent, emulsifying agent, thickening agent, etc. may be used.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and if necessary, an emulsifier, preservative, stabilizer, fragrance, etc. may be used.
  • Suspension agents according to the present invention include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc.
  • An agent may be used, and a surfactant, a preservative, a stabilizer, a colorant, and a fragrance may be used as needed.
  • the injection according to the present invention includes distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection solution, ring gel injection solution, dextrose injection solution, dextrose + sodium chloride injection solution, PEG (PEG), lactated ring gel injection solution, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil-sesame oil , solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; Solubilizing aids such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethyl acetamide, butazolidine, propylene glycol, tweens, nijeongtinamide, hexamine, and dimethyl acetamide; Weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, buffers such
  • the suppository according to the present invention includes cacao fat, lanolin, witepsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methyl cellulose, carboxymethyl cellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, Subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, Lecithin, Lanet Wax, Glycerol Monostearate, Tween or Span, Imhausen, Monolene (Propylene Glycol Monostearate), Glycerin, Adeps Solidus, Butyrum Tego -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydroxote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Hydro Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T, Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the extract, for example, starch, calcium carbonate, sucrose ) or lactose, gelatin, etc.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose ) or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid formulations for oral administration include suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, drug activity, and type of the patient's disease; Sensitivity to the drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs and other factors well known in the medical field may be determined.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to an individual by various routes. All modes of administration can be contemplated, for example, oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, rectal insertion, vaginal It can be administered according to internal insertion, ocular administration, ear administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, skin administration, transdermal administration, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient along with several related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, sex, weight, and the severity of the disease.
  • "individual” means a subject in need of treatment for a disease, and is not limited if it is a vertebrate, specifically, a human, a mouse, a rat, a guinea pig, a rabbit, a monkey, a pig, a horse, a cow, Applicable to sheep, antelopes, dogs, cats, fish and reptiles.
  • administration means providing a predetermined composition of the present invention to an individual by any suitable method.
  • prevention means any action that suppresses or delays the onset of a target disease
  • treatment means that the target disease and its metabolic abnormalities are improved or It means all actions that are beneficially changed
  • improvement means all actions that reduce the desired disease-related parameters, for example, the degree of symptoms by administration of the composition according to the present invention.
  • food includes functional food and health functional food.
  • the inhibitor of the present invention When the inhibitor of the present invention is used as a food additive, the inhibitor may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the inhibitor of the present invention is added in an amount of 15% by weight or less, preferably 10% by weight or less, based on the raw material.
  • the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount above the above range.
  • Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in the ordinary sense.
  • the health beverage composition according to the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients, as in a conventional beverage.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural sweeteners such as taumartin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.20 g, preferably about 0.04-0.10 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, Carbonating agents used in carbonated beverages, etc. may be contained.
  • the composition of the present invention may contain the pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, and vegetable beverage. These components may be used independently or in combination. The proportion of these additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01-0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a screening method for a preventive or therapeutic agent for polycystic kidney disease comprising the following steps.
  • the step (b) may further include the step of measuring the activity of ⁇ -catenin, but is not limited thereto.
  • the step (b) may be performed by measuring the protein expression levels of AXIN1 and TAZ, but is not limited thereto.
  • the co-localization may be a nuclear-specific co-localization, but is not limited thereto.
  • test substance used while referring to the screening method of the present invention means an unknown substance used in screening to test whether it affects the co-localization of AXIN1 and TAZ of the present invention.
  • the test substance is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme, DNAzyme, PNA (peptide nucleic acids), antisense oligonucleotide, antibody, aptamer, natural extract or including, but not limited to, chemicals.
  • the cells used in step (a) may be provided in the form of an experimental animal.
  • the screening method of the present invention further comprises the step of deleting PKD1 in the experimental animal, and contacting the test substance includes, but is not limited to, parenteral or oral administration and stereotaxic injection, and those skilled in the art will be able to select an appropriate method for testing the test substance in animals.
  • Treatment of the test substance means culturing the cells for a certain period of time after adding the test substance to the cell or tissue culture medium.
  • contact with the test substance is not limited thereto, including parenteral or oral administration, or stereotaxic injection, and those skilled in the art can select an appropriate method for testing the test substance in animals. will be.
  • the step (b) is a two-hybrid method, a co-immunoprecipitation assay, a co-localization assay, a scintillation proximity assay (SPA), UV or Chemical crosslinking methods, bimolecular interaction analysis (BIA), mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), fluorescence polarization assays (FPA) and in vitro pull-down assays (In vitro pull-down assay) may be performed by one or more methods selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the protein expression level is measured by Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, and immunoprecipitation analysis. , complement fixation analysis, FACS, and may be measured using one or more methods selected from the group consisting of a protein chip, but is not limited thereto.
  • the step (c) is a step of selecting a substance having reduced co-localization compared to control cells as a polycystic kidney disease therapeutic agent candidate.
  • the control cell may be a cell or an animal model that has not been treated with a test substance, but is not limited thereto.
  • the candidate material when the expression level of the TAZ or AXIN1 protein in the cell or animal model contacted with the test material is reduced than the expression level of the protein not contacted with the candidate material, the candidate material is polycystic kidney disease prevention or treatment. It may include a step.
  • the present invention provides a screening method for a preventive or therapeutic agent for polycystic kidney disease comprising the following steps.
  • test substance inhibits the interaction between the AXIN1 protein and the TAZ protein, when the interaction is reduced by contact with the test substance compared to a control not treated with the test substance, Selecting the test substance as a therapeutic candidate.
  • the AXIN1 protein and the TAZ protein may be provided in the form of cells or tissues expressing them, but is not limited thereto.
  • the step (b) is a two-hybrid method, a co-immunoprecipitation assay, a co-localization assay, a scintillation proximity assay (SPA) ), UV or chemical crosslinking methods, bimolecular interaction analysis (BIA), mass spectrometry (MS), nuclear magnetic resonance (NMR), fluorescence polarization assays (FPA) and in vitro It may be performed by one or more methods selected from the group consisting of a pull-down assay, but is not limited thereto.
  • Pkd1-floxed mice containing the loxP region flanking exons 2-5 of the Pkd1 gene were obtained from Dr. Stefam Somlo of Yale University, USA.
  • Taz-floxed mice containing a Taz mutant allele in which exon 3 was replaced with a single loxP site established at the Korea Advanced Institute of Science and Technology, were obtained from Dr. Lim Lim and bred in a pathogen-free animal facility at Sookmyung Women's University.
  • HoxB7Cre transgenic mice that specifically induce cre-recombinant enzyme activity in the renal collecting duct were used. All mice were bred in an animal facility under optimal conditions (light-dark cycle at 20 °C for 12 hours) in accordance with the approval of the Animal Care and Use Committee of Sookmyung Women's University.
  • Human renal cortical tissue surrounding the cyst was obtained from an ADPKD patient who underwent nephrectomy.
  • a normal part of a human kidney confirmed by histological examination was obtained from a renal cell carcinoma patient who had undergone surgical treatment and was used.
  • Paraffin-embedded mouse kidneys were cut into 6 ⁇ m sections and stained with hematoxylin and eosin (H & E) for histological analysis.
  • Tissue slides were prepared using TAZ (Abcam), c-MYC (Santa Cruz, sc-764), ⁇ -catenin (Millipore, #05-665), DBA (Vector, FL-1031), Ki-67 (Abcam, ab16667) and The expression of each target protein was monitored using an antibody against collagen IV (Southern Biotrch, 1340-01).
  • Primary antibodies (anti-HA mouse monoantibody and anti-Myc rabbit poly antibody) were treated for 1 h at room temperature, washed at least 3 times with PBST and Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse or anti-rabbit 568-conjugated 2
  • the primary antibody (Invitrogen) was visualized using a ratio of 1:200.
  • the prepared cells were mounted on Dako mounting medium containing DAPI (Vector Laboratories).
  • IMCD Mouse inner medullary collecting duct
  • Drugs including forskolin (Sigma-Aldrich, F3917), TAZ modulator (Merck, 530959), Exo IWR1 (Tocris, 3947) and Endo IWR1 (Tocris, 3532) were used at optimal concentrations. Exo- and Endo-IWR1 were provided by Dr. Ik-Hoon Cho.
  • drugs were added to the medium at least 2 days after cell division and the treatment was continued until the in vitro cysts grew sufficiently.
  • Protein lysates from mouse tissues were purified using NucleoSpin RNA/Protein column (Macherey-Nagel) or Nucleus/Cytosol fractionation (Thermo) kit. Then, a cell fraction was obtained using a homogenizer. Western blot and immunoprecipitation (IP) using cell lysates were performed in two independent experiments. Pkd1 f/f and Pkd1 f/f ; HoxB7cre mouse kidneys were used for Axin- or Taz-immunoprecipitation. Mouse kidney tissue fragments were homogenized using a pestle in 200 ⁇ l of cold lysis buffer containing 1% Triton-X100.
  • the homogenate was centrifuged at 12,000 rpm (20 min, 4° C.) and the supernatant was used for pre-removal in IP buffer usually containing rabbit IgG and A/G agarose beads. The supernatant previously removed for IP was used.
  • the sources and catalog numbers of the antibodies used were as follows: PC1 (sc-130554), c-MYC (sc-40), HA (sc-7392), AXIN1 (sc-293190), ⁇ -catenin (sc-7963) , p-TAZ (Ser89) (sc-17610), alpha tubulin (sc-5286) (all from SCBT, Santacruz, CA); HA (ab969110), Myc (ab9106), Flag (ab1257) (all from Abcam); YAP/TAZ (#8418), ⁇ -tubulin (#2144), AXIN1 (#2087), c-MYC (#9402), phospho-CREB (#9198), Histone H3 (#60538), LSD1 (Lysine-specific demethylase 1 #2139) (all from Cell Signaling); ⁇ -actin (A2228 from Sigma); ⁇ -catenin (610153), TAZ (560235) (both from
  • Pkd1 F: 5′-GGGAGCCCTGCCACCTACCTA-3′, R: 5′-CCTCACTACGGCTCACCTCATTCC-3′
  • TAZ F: 5′-AGTTCCTGCGCTTCAAATGGG-3′, R: 5′-GTAGGGTGGGCTGTTAGGGAG-3 ′
  • AXIN2 F: 5′-TACACTCCTTATTGGGCGATCA-3′, R: 5′-TTGGCTACTCGTAAAGTTTTGGT-3′
  • c-MYC F: 5′-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3′, R: 5′-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3′
  • CCND2 F: 5′-ACCTTCCGCAGTGCTCCTA-3′, R: 5′-CCCAGCCAAGAAACGGTCC-3′
  • Ankrd1 F: 5′-GCTGCGCTGGAACAAACTG-3′, R: 5′-AGCCTCCATTAACT
  • GSEA Gene set enrichment analysis
  • the pTOP reporter construct and pTk-renilla (transfection control) (the ratio of the amount of DNA is 1:10) were co-transfected into IMCD cells expressing the plasmid or siRNA oligonucleotides. Luciferase activity was measured using Promega luciferase assay reagents according to the manufacturer's instructions.
  • an shRNA vector for TAZ or b-catenin was delivered using a retroviral vector containing a puromycin resistance cassette. Viral particles are described in Azzolin L, et al. (2014) YAP/TAZ incorporation in the ⁇ -catenin destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell 158(1):157-170.] was prepared as prepared in the literature.
  • shRNA retroviral vectors for b-catenin or TAZ were provided by Ik-Hun Cho and Dr. Lim Lim Lim.
  • Fig. 1a to determine whether the expression of TAZ correlates with the expression of ⁇ -catenin and c-MYC in Pkd1-null kidney, first, proteins of TAZ and c-MYC in the kidney of Pkd1-deleted mice. Levels were assessed and found to be highly upregulated with active ⁇ -catenin protein levels.
  • the mRNA level of c-Myc known as a target of ⁇ -catenin or YAP1/TAZ, was improved in the kidneys of Pkd1-null mice.
  • the target protein and the collecting duct specific marker (DBA) were co-stained.
  • TAZ active- ⁇ -catenin
  • total ⁇ -catenin c-MYC expression were investigated in the kidneys of normal humans and ADPKD patients.
  • these proteins were highly expressed in the cystic lining cells of the kidneys of ADPKD patients compared to normal human kidney tissues.
  • TAZ overexpression is positively correlated with overexpression of ⁇ -catenin and c-MYC in the kidneys of both Pkd1-deficient mice and ADPKD patients.
  • 129 of the Yap/Taz target genes were defined as the leading-edge subset genes that showed significantly higher expression levels in Pkd1-deficient polycystic nephropathy, and less than 0.795.
  • the top 20 genes differentially expressed with large log2-fold changes were marked.
  • the upper genes including c-Myc were verified using quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and it was confirmed that the expression level of these genes actually increased.
  • Pkd1-targeted mice collecting duct-specific double Pkd1-/Taz- knockout mice (Pkd1 f/f ; Taz f/f ; HoxB7Cre) were constructed. These mice were sacrificed 13 days after birth. Pkd1-deficient mice lacking Taz showed greatly reduced cyst development.
  • the height-to-total body weight (2KW/TBW) ratio and blood urea nitrogen (BUN) level of the Pkd1/Taz double knockout mice were significantly reduced compared to the Pkd1-deleted mice. function was improved.
  • TAZ mutation in Pkd1 deletion mice reduced active ⁇ -catenin and c-MYC levels in the kidney.
  • TAZ is one of the upstream regulators of c-MYC expression, both of which are involved in renal cystic formation.
  • TAZ and c-MYC levels were increased in the kidneys of Pkd1-null mice, we checked whether the increase in TAZ upregulates the expression of c-MYC in Pkd1-null cells.
  • Pkd1 silencing increased TAZ and c-MYC levels in IMCD cells.
  • TAZ protein expression was increased in a concentration-dependent manner together with c-MYC expression in cells treated with imidazole-[4, 5-b] pyridine derivatives.
  • TAZ modulator a drug that modulates TAZ activity
  • PKD1 deficiency slightly increased TAZ levels and significantly increased active ⁇ -catenin levels. Moreover, this increase was reduced to a similar level upon transfection of PKD1 siRNA in TAZ shRNA-expressing cells compared to control cells. Conversely, weak expression of active ⁇ -catenin in control cells was abolished by overexpressed Flag-PKD1.
  • PKD1 deficiency re-induced the transcriptional activity of ⁇ -catenin, which was reduced by TAZ knockdown in PKD1-deficient cells.
  • PKD1 expression slightly decreased the transcriptional activity of ⁇ -catenin, which was improved to a level similar to that of TAZ-expressing cells upon co-expression of PKD1 and TAZ.
  • AXIN1 deficiency prevented the decrease in the transcriptional activity of ⁇ -catenin in PKD1-expressing cells.
  • AXIN1 may be a downstream mediator of PKD1 in regulating ⁇ -catenin activity in PKD1-deficient cells.
  • TAZ shRNA decreased the transcriptional activity of ⁇ -catenin, and was greatly increased by AXIN1 deficiency.
  • AXIN1 expression greatly reduced ⁇ -catenin activation induced by TAZ expression.
  • TAZ acts upstream of AXIN1 to regulate transcriptional activation of ⁇ -catenin.
  • TAZ-dependent PKD1 expression affects target gene expression of ⁇ -catenin
  • PKD1 alone silencing or PKD1 and TAZ co-silencing on the expression of AXIN, c-MYC and CCND2 mRNA
  • ⁇ -catenin activation is regulated by PKD1, which was shown to be dependent on TAZ and AXIN1.
  • PKD1 depletion did not change the amount of total HA-TAZ that appeared to be saturated in the cells.
  • HA-TAZ co-precipitated with endogenous PKD1, whereas in the absence of PKD1 it interacted with AXIN1.
  • IP was performed with HA-TAZ-expressing cells.
  • ⁇ -catenin was observed in the nuclear fraction of HA-TAZ expressing cells.
  • HA-TAZ was also present in the same fraction.
  • TAZ or AXIN1 was immunoprecipitated and then blotted for AXIN1, PKD1, and active- ⁇ -catenin.
  • PKD1 leads to a strong interaction of TAZ with AXIN1, whereby ⁇ -catenin is released from the disruption complex and is transcriptionally activated.
  • TAZ localization is regulated by the PKD1 aspect of a role in mechanosensing.
  • TAZ was mostly localized to the cytoplasm and some was localized to the nucleus.
  • PKD1-silencing cells showed an increase in nuclear TAZ. This suggests that the presence of PKD1 maintains TAZ in the cytoplasm.
  • ectopic expressed HA-TAZ was detected in the cytoplasm of control cells, whereas PKD1-silencing cells showed increased HA-TAZ nuclear translocation, indicating PKD1-dependent cytoplasmic localization of TAZ.
  • PKD1 knockdown increased the interaction between TAZ and AXIN1. Accordingly, we investigated whether HA-TAZ expression co-localized with Myc-AXIN1 in PKD1 silenced cells.
  • c-MYC is known as a target gene for ⁇ -catenin or YAP/TAZ, and has been associated with the pathogenesis of polycystic nephropathy. Therefore, it was expected that deletion of PKD1 contributed to the induction of c-MYC expression during cyst formation.
  • PKD1 deficiency induces nuclear translocation of active ⁇ -catenin or TAZ, which may participate in increased expression of c-MYC.
  • qRT-PCR was performed to evaluate the expression of c-MYC mRNA in PKD1-/ or TAZ-deficient cells or in cells co-deficient for PKD1 and TAZ.
  • silencing of PKD1 increased the expression of c-MYC mRNA, which was significantly decreased in PKD1/TAZ-co-deficient cells and TAZ-deficient cells.
  • c-MYC levels were significantly higher in PKD1 silenced cells but decreased in co-deleted cells or TAZ-deleted cells.
  • TAZ is responsible for the expression of c-MYC in PKD1-deficient cells.
  • the c-MYC expression increased in the PKD1-deficient state was decreased by the knockdown of ⁇ -catenin.
  • the effect of ⁇ -catenin knockdown on c-MYC expression was less than that of TAZ depletion, indicating that the expression of c-MYC mRNA remains regulated by TAZ.
  • TAZ deficiency in PKD1 silenced cells reduces c-MYC mRNA expression through TAZ-mediated regulation of ⁇ -catenin or TAZ.
  • the present inventors confirmed that the interaction between TAZ and AXIN1 in PKD1-deficient cells causes nuclear accumulation of ⁇ -catenin together with TAZ. By confirming that the cyst formation is alleviated, it was confirmed that the TAZ and AXIN1 interaction inhibitor can be usefully used for the prevention or treatment of polycystic kidney disease, and the present invention has industrial applicability.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)

Abstract

본 발명은 다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법 등에 관한 것으로, 본 발명자들은 PKD1 결핍 세포에서 TAZ와 AXIN1의 상호작용이 TAZ와 함께 β-카테닌의 핵 내 축적을 유발함을 확인하고, PKD1 결핍 세포 또는 동물모델에서 TAZ와 AXIN1의 상호작용을 억제하는 경우, 신장의 낭포 형성이 완화됨을 확인함으로써, TAZ와 AXIN1의 상호작용 억제제를 다낭성 신장 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법
본 발명은 다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법 등에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 11월 12일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0151308호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
다낭신 또는 다낭포성 신장 질환은 액체로 채워진 여러 개의 낭종으로 인해 신장이 벌집 모양으로 변형되는 유전 질환으로, 상염색체 우성 다낭신(ADPKD), 상염색체 열성 다낭신(ARPKD) 등으로 분류된다.
상염색체 우성 다낭신(ADPKD, 이하 "다낭신"이라 한다)은 신장에서 가장 흔한 유전성 신장질환으로, 1000명당 1명 꼴의 발병률을 보인다. 다낭신 환자는 양쪽 콩팥에 다수의 낭종이 발생하고, 낭종의 크기와 수가 증가하여 결국에는 50-60대에 신장 기능이 정지하여 죽음에 이르게 된다. 낭종의 진행은 낭종 표피 세포의 증식이 일어난 후 낭종 안으로 낭종액이 차게 되면서 낭종의 크기가 커지게 되며 진행된다.
다낭신은 국내 투석 환자의 원인 중 약 2%를 차지하여, 당뇨, 고혈압, 사구체 신염 다음으로 흔하게 나타난다.
다낭신은 양쪽 콩팥의 구조적, 기능적 결함을 가져올 뿐만 아니라, 각종 신장의 합병증을 동반할 수 있기 때문에 비교적 질환의 초기 단계에서부터 관리가 필요하다.
다낭신의 원인 유전자는 PKD1과 PKD2 유전자로, 각각 polycystin-1과 polycystin-2라는 단백질을 코딩한다. 다낭신 진단 환자의 85%는 PKD1 유전자의 결함, 나머지 15%는 PKD2 유전자의 결함이 원인인 것으로 알려져 있다.
현재 다낭신의 완치 방법은 알려져 있지 않으며, 많은 다낭신 치료제들이 개발되고 있으나, 부정적인 피드백으로 인하여 실망스러운 임상결과들이 보고되었다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법을 제공하는 것으로서, 본 발명자들은 TAZ(Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 및 AXIN1 상호작용 억제제가 다낭성 신장질환에서의 낭포 형성을 억제함을 확인하고, TAZ 및 AXIN1의 발현 수준에 따라 낭포 형성 수준이 변화함을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
(a) PKD1 결핍 세포 또는 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포 또는 동물모델에서 AXIN1 및 TAZ의 공동 국소화(co-localization)를 확인하는 단계; 및
(c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포 또는 동물모델과 비교해 공동 국소화를 감소시킨 물질을 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
(a) 시험물질을 분리된 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험물질이 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 치료 후보물질로 선별하는 단계.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 다낭성 신장질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제의 다낭성 신장질환 약제 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 다낭성 신장질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 다낭성 신장질환 약제 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) PKD1 결핍 세포 또는 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포 또는 동물모델에서 AXIN1 및 TAZ의 공동 국소화(co-localization)를 확인하는 단계; 및
(c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포 또는 동물모델과 비교해 공동 국소화를 감소시킨 물질을 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 다낭성 신장질환은 상염색체 우성 다낭성 신장질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제는 신장 낭포 형성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 Wnt 억제제는 EndoIWR1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 단계 (b)는 β-카테닌의 활성을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 공동 국소화는 핵 특이적 공동 국소화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) 시험물질을 분리된 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험물질이 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 치료 후보물질로 선별하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질은 이를 발현하는 세포 또는 조직의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 단계 (b)는 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 PKD1 결핍 세포에서 TAZ와 AXIN1의 상호작용이 TAZ와 함께 β-카테닌의 핵 내 축적을 유발함을 확인하고, PKD1 결핍 세포 또는 동물모델에서 TAZ와 AXIN1의 상호작용을 억제하는 경우, 신장의 낭포 형성이 완화됨을 확인함으로써, TAZ와 AXIN1의 상호작용 억제제를 다낭성 신장 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 Pkd1 결손 마우스 및 ADPKD 환자의 신장에서 TAZ, c-MYC 및 활성 β-카테닌의 고발현을 확인한 것이다 : 도 1a는 출생 후 13 일 (p13)에 Pkd1-결실 된 마우스의 신장에서 YAP/TAZ, c-MYC 및 활성 β-카테닌의 기저 수준의 스크리닝 결과를 나타낸 것이다; 도 1b는 Pkd1-결실된 신장에서 mRNA 샘플의 c-Myc 수준 증가를 나타낸 것이다; 도 1c 내지 도 1h는 Pkd1-결실된 마우스의 신장에서 낭종 라이닝 세포 주변의 DBA, TAZ, c-MYC 및 활성 β-카테닌 (ABC)의 면역 형광 (IF) 염색 결과를 나타낸 것으로, 형광 신호는 Image J 프로그램을 사용하여 녹색 히스토그램 분석에 의해 정량화하였다; 도 1i는 정상 및 ADPKD 인간 신장의 면역 조직 화학 결과를 나타낸 것으로, TAZ, β-카테닌, 활성 β-카테닌 (ABC) 및 c-MYC의 면역 조직 화학 (IHC) 염색 결과, 정상 신장에 비해 ADPKD 환자의 낭종 세포 주변에서 실질적으로 증가하였다. Scale Bar = 100 mm. 2 개의 야생형 및 4 개의 Pkd1-null 마우스 신장을 사용하여 TAZ, c-MYC 및 활성 β-카테닌의 기본 발현 수준을 테스트하였다. 양측 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. P <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다 (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
도 2는 RNA-seq 데이터를 기반으로 한 Pkd1 결손 신장에서 TAZ와 그 표적 유전자의 유전자 발현 분석 결과이다 : 도 2a는 대조군과 비교하여 Pkd1 결실 신장에서 Yap1, Taz 및 β-카테닌 수준의 변화를 나타낸 것이다; 도 2b는 Pkd1-결실된 신장과 대조군 사이의 354 Yap/Taz 표적 유전자의 GSEA 분석 결과이다; 도 2c는 Pkd1-결실된 신장에서 유의하게 증가된 129 개의 첨단 서브 세트 유전자를 보여주는 히트 맵으로, 그룹당 n = 3 개별 샘플의 결과이다; 도 2d는 정상에 비해 Pkd1-결실 신장에서 상위 20 개 증가된 유전자의 log2 배 변화 값이다; 도 2e는 c-Myc를 포함하는 상위 유전자의 mRNA 발현 수준을 나타낸 것이다. 통계는 t-검정으로 분석되었으며 P <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다 (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
도 3은 Taz가 제거된 Pkd1 결핍 마우스의 신장에서 신장 기능이 강화된 PKD 표현형의 개선 결과를 나타낸 것이다 : 도 3a는 야생형, Taz-null, Pkd1-null 또는 Pkd1/Taz 이중 null 신장의 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색 결과로, Pkd1-null 또는 Pkd1/Taz 이중 null 신장의 신장 낭포 영역을 Image J 프로그램으로 정량화하고 크기 분포의 변화를 그래프로 나타내었다. 1 개의 야생형, 2 개의 Taz-null, 11 개의 Pkd1-null 및 6 개의 이중 Pkd1-/Taz-null 신장을 정량화에 사용하였고, 각 개별 신장에 대해서 적어도 70 개의 낭종을 크기를 정하고 정량화하였다; 도 3b는 생후 13 일 (p13)에서 마우스의 총 체중 및 혈액 요소 질소(BUN) 수준에 대한 두 신장 무게의 비율을 나타낸 것으로, 2KW/TBW 비율과 BUN 수준을 비교하기 위해 사용된 마우스의 수는 각 개체에 대해 점으로 표시하였다; 도 3c는 TAZ 결핍으로 인한 c-MYC 및 β-카테닌 수준의 변화를 테스트하기 위해 p13에서 각 마우스 그룹의 전체 신장 용해물을 사용한 웨스턴 블롯 분석 결과이다; 도 3d 내지 도 3f는 TAZ, c-MYC 또는 활성 β-카테닌의 면역 형광 염색 및 Image J 프로그램을 사용한 정량 분석 결과이다; 도 3g는 Ki-67 염색에 의해 시험된 세포 증식의 변화로, 형광 신호는 상기와 같은 방법으로 정량화하였다. 하나의 wild, 2 개의 Taz-null, 3 개의 Pkd1-null 및 4 개의 이중 Pkd1-/Taz-null 신장을 사용하였고, 통계에 사용된 이미지 수는 그래프에서 점으로 표시하였다. 패널 A에서 G에 대한 통계 분석은 양측 t-검정을 사용하여 수행하였고, P <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다(* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001). 도 3h는 Masson의 trichrome 조직학 및 유전자형 신장의 콜라겐 IV에 대한 면역 염색 결과로, Pkd1 녹아웃 신장은 섬유증의 증가를 나타내었으며, 이는 Pkd1/Taz 이중 녹아웃 신장에서 감소하였다. 모든 결과는 두 번의 독립적 인 실험에서 유전자형 당 최소 3 마리의 마우스로 수행하였다. 각 막대는 평균 ± SEM을 나타내며, * P <0.05, 야생형 마우스와 비교; # P <0.05, Pkdf/f; HoxB7 cre 마우스와 비교. scale bar = 100μm.
도 4는 TAZ 조절에 의한 c-MYC 수준의 변화 및 체외 낭포 성장을 나타낸 것이다 : 도 4a 및 도 4b는 Pkd1 침묵 마우스 내부 수질 집합관(IMCD) 세포에서 TAZ 및 c-MYC 발현 수준의 스크리닝 결과이다; 도 4c는 핵으로의 전좌를 통해 TAZ 활성을 향상시키는 TAZ 조절제의 효과로, 세포는 1 ~ 10 μM의 다른 농도로 약물로 처리하였다. TAZ의 수준은 저농도 및 고농도 모두에서 증가했으며 c-MYC의 발현 또한 증가하였다; 도 4d 내지 도 4f는 TAZ 조절 인자의 유전적 조절 또는 처리에 의해 시험관 내 낭포 형성에 대한 TAZ 수준 조절의 효과를 나타낸 것으로, siRNA는 성공적으로 TAZ를 표적으로 삼았고, 반대로 TAZ 발현 벡터는 TAZ 단백질을 과발현하여 결과적으로 c-MYC의 발현을 증가시켰다. Taz 침묵은 낭포의 비대를 감소시킨 반면, TAZ 활성의 과발현 또는 증가는 낭포 형성을 자극하였다; 도 4g는 Wnt 억제에 의한 c-MYC 수준의 변화를 나타낸 것으로, ExoIWR1 (Endo IWR1의 음성 대조군) 또는 Endo IWR1 (AXIN 안정제) 중 하나를 10μM에서 24 시간 동안 처리한 결과이다. 도 4h는 TAZ 조절제에 의해 자극된 시험관 내 낭포에 대한 Wnt 억제제의 효과를 나타낸 것이다. 모든 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험으로부터 얻었으며, 양측 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. P <0.05의 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다 (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
도 5는 TAZ 및 AXIN1을 통해 PKD1에 의한 β-카테닌 활성화 조절을 나타낸 것이다 : 도 5a는 shTAZ 바이러스 벡터를 발현하는 PKD1 침묵 세포에서 증가된 활성 β-카테닌의 억제를 확인한 것으로, 내부 수질 집합관 (IMCD) 세포를 shTAZ를 발현하는 레트로 바이러스 벡터 또는 표시된 siRNA로 형질 도입하고 웨스턴 분석을 수행하였다; 도 5b는 Flag-PKD1을 발현하는 IMCD 세포에서 HA-TAZ의 과발현에 의해 용량 의존적으로 활성 β-카테닌 수준의 증가를 확인한 것으로, IMCD 세포는 표시된 양의 HA-TAZ 플라스미드 및 Flag-PKD1로 공동 형질 감염되었다; 도 5c 및 도 5d는 β-카테닌 활성에 대한 루시페라제 분석 결과로, 표시된 벡터를 발현하는 IMCD 세포를 pTOP 플래시 및 레닐라 루시퍼라제 벡터로 형질 감염시켰다; 도 5e는 활성 β-카테닌 단백질 수준 감소의 억제를 나타낸 것으로, AXIN1에 대한 siRNA를 발현하는 IMCD 세포 또는 표시된 플라스미드로 형질 감염된 대조군을 사용하였다; 도 5f 및 도 5g는 표시된 siRNA, 플라스미드, shTAZ 또는 발현 플라스미드로 형질 감염 또는 형질 도입된 세포에서 활성 β-카테닌에 대한 루시페라제 분석 결과이다; 도 5h는 β-카테닌 표적 유전자, AXIN1, c-MYC 및 CCND2의 qRT-PCR 분석 결과로, 세포는 표시된 siRNA 또는 shTAZ 레트로 바이러스 벡터로 형질 도입되었다.
도 6은 PKD1이 부재시 AXIN1과 TAZ의 강력한 상호 작용이 β-카테닌의 활성화를 유발하는 결과를 나타낸 것이다 : 도 6a는 PKD1의 부재 하에 HA-TAZ와 AXIN1의 상호 작용을 나타낸 것으로, HA-TAZ를 si-control 또는 si-PKD1과 함께 내부 수질 집합관 (IMCD) 세포로 공동 형질 감염시키고 항-HA 항체로 면역 침강을 수행한 다음 표시된 항체로 면역 블롯팅을 수행하였다; 도 6b는 PKD1 침묵 세포에서 MYC-AXIN1과 HA-TAZ의 강한 상호 작용을 나타낸 것으로, 실험은 도 6a과 동일하게 수행하였으며, MYC-AXIN1은 표시된 siRNA로 공동 형질 감염되었다; 도 6c는 PKD1의 과발현시 MYC-AXIN1과 HA-TAZ의 약한 상호 작용을 나타낸 것으로, Flag-PKD1 또는 대조군 벡터를 형질 감염시키고 내인성 AXIN1을 항-AXIN1 항체로 면역 침전시켰다; 도 6d 및 도 6e는 HA-TAZ의 강제 발현에 의한 AXIN1과 β-카테닌의 약한 상호 작용을 나타낸 것으로, HA-TAZ-형질 감염된 세포의 절반은 도 6c에 설명 된대로 면역 침강에 사용되었고 나머지 세포는 핵 분획 도 6e에 사용되었다. 세포 용해물을 사용한 모든 면역 침전은 적어도 두 번의 독립적인 실험으로 수행하였다; 도 6f 및 도 6g는 Pkd1-null 신장에서 AXIN1과 TAZ의 강력한 상호 작용을 나타낸 것으로, Pkd1f/f 마우스 신장 또는 Pkd1f/f;HoxB7 cre 신장으로부터 준비된 용해물은 TAZ- 또는 AXIN1- 특이적 항체 및 대조군 IgG를 사용하여 면역 침강시켰다.
도 7은 PKD1 부재시 AXIN1 및 TAZ의 공동 국소화를 나타낸 것으로, PKD1 녹다운 IMCD 세포에서 MYC-AXIN1 (적색) 및 HA-TAZ (녹색)의 면역 형광 염색 결과이다 : 도 7a는 대조군 또는 PKD1에 대한 siRNA를 세포에 전달한 다음 HA-TAZ를 형질 감염시키고 HA-TAZ에 대해 면역 염색하고 핵을 DAPI로 카운터 염색한 결과, siPKD1을 사용한 PKD1의 녹다운은 HA-TAZ의 핵 국소화를 증가시켰으며, HA-TAZ의 분포는 세포질 (C)과 세포질 및 핵 (CN)으로 점수를 매겨 그래프로 표시하였다. 결과는 세 번의 독립적인 실험의 평균이며, 모든 실험에서 각 샘플에 대해 최소 100 개의 세포가 사용되었다; 도 7b는 Pkd1-결핍된 세포를 MYC-AXIN1 및 HA-TAZ로 형질 감염시킨 결과, PKD1 녹다운이 세포질에서 HA-TAZ 및 MYC-AXIN1의 공동 국소화를 증가시켰음을 나타내는 개략도이다. 스케일 바는 20μm이다.
도 8은 Pkd1-결핍 세포에서 c-MYC의 발현 증가를 나타낸 것이다 : 도 8a는 PKD1 녹다운에 의한 핵에서 활성 β-카테닌 및 TAZ의 국소화를 나타낸 것으로, 세포를 si-control 또는 si-PKD1 RNA로 형질 감염시킨 후 저장성 완충액으로 용해하여 RIPA 완충액으로 용해된 세포질 분획 및 핵 펠릿을 제조하였다; 도 8b 및 도 8c는 siPKD1 RNA 또는 shTAZ 레트로 바이러스 벡터로 형질 감염된 공동 결핍된 세포에서 c-MYC mRNA 및 단백질 수준의 증가 억제를 확인한 것으로, shTAZ 레트로 바이러스 벡터 또는 siPKD1 RNA 형질 도입 후 qRT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 수행한 결과이다; 도 8d는 TAZ 및 β-카테닌에 의한 c-MYC 단백질 수준의 조절 결과로, 상기 단백질에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
도 9는 신장 낭포 형성에서 PKD1에 의한 TAZ/Wnt-β-카테닌/c-MYC 축의 조절에 대한 개략도를 나타낸 것으로, TAZ는 PKD1과 상호 작용하며, Cytosolic β-카테닌은 AXIN1, APC 및 β-TrCP로 구성된 파괴 복합체에 존재한다. 또한, PKD1이 결실된 세포에서 TAZ는 AXIN1과 상호 작용하도록 유도되고 β-카테닌은 핵에 위치하기 위해 파괴 복합체에서 방출된다. 한편, TAZ의 일부는 c-MYC mRNA의 발현을 유도하는 핵에도 존재한다.
도 10은 TAZ/Wnt-β-카테닌/c-MYC 축에 대한 라파마이신의 효과 및 Wnt 억제와 낭포 성장에 미치는 시너지 효과를 나타낸 것이다 : 도 10a는 라파마이신 처리 하에 TAZ, c-MYC 및 활성 β-카테닌의 스크리닝 결과로, 5, 10, 30 nM의 라파마이신을 3 시간 동안 처리하였으며, 인산화된 S6K 수준의 변화로 그 효율을 확인하였다; 도 10b는 지시된 농도에서 약물을 처리하거나 처리하지 않고 Pkd1-침묵 후 체외 낭포를 관찰한 결과이다. 모든 데이터는 최소 세 번의 독립적인 실험으로 얻었다. 양측 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하였으며, P <0.05의 값은 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다 (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 실시예를 통하여, TAZ와 AXIN1의 상호작용을 억제하는 경우 신장에서의 낭포 형성을 억제시키는 것을 확인하였는 바, 본 발명을 완성하였다(본 발명의 실시예 참조).
본 발명은 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, TAZ(Transcriptional Coactivator with PDZ-binding motif)단백질은 WW 도메인(domain)을 포함하는 WWTR1(WWdomain containing transcription regulator 1, Wwtr1)이며, 전사조절 보조인자이다. 14-3-3 펩티드와 결합된 상태로 세포의 세포질에 위치해 있다가 외부 자극에 의하여 14-3-3 펩티드와 결합이 억제되면서 세포핵으로의 이동이 일어난다. 세포핵으로 이동한 TAZ 단백질은 단백질 구조적 특성을 통해 다양한 전사인자 단백질과 결합하고, 전사인자의 활성을 조절한다.
본 명세서에서, 상기 TAZ는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, AXIN1은 Axin 유전자의 isoform 형태로, Axin1 및 Axin2 유전자는 서로 다른 전사 조절 과정을 통해 단백질 인산화를 조절하는 것으로 알려져 있다. Axin 유전자는 GSK3에 의한 β-catenin의 인산화를 촉진하여 반감기를 감소시킴으로써 Wnt signaling의 음성 조절자 (negative regulator)로서의 역할을 한다.
본 명세서에서, 상기 AXIN1은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하거나 그로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 "상호작용"이라는 용어는 TAZ와 AXIN1 두 단백질이 직접적 또는 간접적으로 결합하여 β-카테닌의 활성을 증가시키는 것으로, TAZ가 AXIN1의 기능을 상위에서 조절하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, PKD1 결핍시 PKD1과 상호작용하던 TAZ가 분리되어 떨어져나와 AXIN1과 상호작용함으로써 AXIN1 포함 복합체와 상호작용하던 β-카테닌의 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.
본 발명에서 사용하는 "상호작용을 억제하는 다낭성 신장질환 치료제"라는 용어는 TAZ가 AXIN1과 상호작용하여 β-카테닌의 활성을 증가시키는 것을 억제하고, 그에 따라 신장 낭포 형성을 억제시킴으로써 다낭성 신장질환을 치료 및 예방하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용하는 "상호작용을 억제한다“는 용어는 TAZ와 AXIN1 간의 상호작용을 억제, 경감, 제거하는 것을 모두 포함한다. 상호작용 저해에는 TAZ와 AXIN1 상호간의 작용 자체를 저해할 수도 있으나 TAZ 활성을 감소시킴으로써 TAZ와 AXIN1 상호간의 결합을 저해하는 것도 포함된다.
본 발명에서, 상기 다낭성 신장질환은 상염색체 우성 다낭성 신장질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 다낭성 신장질환은 소아형 다낭성 신장질환 및 성인형 다낭성 신장질환을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 성인형 다낭성 신장 질환일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제는 TAZ 및/또는 AXIN1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드모방체, 기질유사체, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 Wnt 억제제는 EndoIWR1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제는 EndoIWR1; 및 라파마이신 또는 이의 유도체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들이 확인한 EndoIWR1; 및 라파마이신 또는 이의 유도체의 병용 투여에 의한 신장 낭포 형성 억제 효과는 다음과 같다.
본 발명의 일 실시예에서는 mTOR 억제제인 라파마이신이 TAZ/Wnt-β-catenin/c-MYC 축에 영향을 미치는지 여부를 조사한 결과, 라파마이신 처리에 의해 낭포 성장이 현저히 억제되며, Wnt 억제제와 병용 처리시 단독 처리군과 비교하여 낭포 성장을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다 (본 발명의 실시예 9 및 도 10 참조).
이상의 실시예에서는 EndoIWR1; 및 라파마이신 또는 이의 유도체를 동시 또는 병용투여하면 각각 단독으로 투여한 경우보다 다낭성 신장질환을 효과적으로 조절할 수 있음을 보여준다. 따라서, EndoIWR1; 및 라파마이신 또는 이의 유도체의 병용투여는 다낭성 신장질환에 효과적으로 이용될 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에서, 상기 EndoIWR1은 하기 화학식 1로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021013872-appb-img-000001
본 발명에서, 상기 라파마이신은 시롤리무스(sirolimus)라고도 불리우며, 하기의 화학식(C51H79NO13)의 구조를 갖는 분자량이 914.2Da인 마크로라이드 락톤(macrolide lactone) 화합물이다. 라파마이신은 세포질 내 FK-binding protein 12(FKBP12)와 결합하여 복합체를 형성하고, mTOR 활성을 억제한다. 면역계에서 라파마이신은 IL-2와 다른 사이토카인 수용체 관련 신호전달을 저해하고 면역계의 T 세포와 B 세포의 증식과 활성화를 막는다. 이 같은 면역 억제효과로 인해 라파마이신은 장기 이식 또는 자가면역 질환을 위한 면역억제제로 널리 사용되고 있으며, 특히 사이클로스포린(cyclosporin)이나 타크로리무스(tacrolimus)와 같은 칼시뉴린 (calcineurin)을 억제하는 면역억제제에 비해 신장 독성이 낮다는 장점이 있어서 신장 이식 분야에 활용되고 있다.
라파마이신의 유사체인 라파로그(rapalog)로는 템시롤리무스, 에버롤리무스, 데포롤리무스 등이 있다. 템시롤리무스(temsirolimus)는 Torisel 또는 CCI-779로도 알려져 있는 mTOR 특이적 억제제이다(화학식C56H87NO16, 분자량1030.3Da). 에버롤리무스(everolimus)는 라파마이신의 40-O-(2-hydroxyethyl) 유도체로, RAD001 또는 Zortress, Certican, Afinitor 등의 트레이드마크로 알려져 있으며, 라파마이신과 유사하게 작용한다(화학식 C53H83NO14, 분자량 958.2Da). 현재 장기 이식의 면역억제제로 사용되고 있다. 데포롤리무스(deforolimus)는 리다포롤리무스(ridaforolimus) 또는 AP23573, MK-8669 등으로도 알려져 있는 mTOR 억제제이다(화학식 C53H84NO14P, 분자량 990.22Da).
본 발명에서, 라파마이신은 하기 화학식 2로 표시될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2021013872-appb-img-000002
본 발명에서, EndoIWR1; 및 라파마이신 또는 그 유도체들은 천연으로부터 분리되거나 당업계에서 공지된 화학적 합성법으로 제조된 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제는 신장 낭포 형성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물의 형태로 제공되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 유효성분을 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 본 발명에서 용어, “식품학적으로 허용 가능한 염”이란 식품학적으로 허용되는 유기산, 무기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 본 발명에서 용어, "수의학적으로 허용 가능한 염"이란 수의학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 억제제의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩 톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3)이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5),아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개, 고양이, 어류 및 파충류에 적용될 수 있다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 식품은 기능성 식품 및 건강기능성 식품을 포함한다.
본 발명의 억제제를 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 억제제를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시 본 발명의 억제제는 원료에 대하여 15 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 바람직하게는 약 0.04-0.10g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) PKD1 결핍 세포 또는 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포 또는 동물모델에서 AXIN1 및 TAZ의 공동 국소화(co-localization)를 확인하는 단계; 및
(c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포 또는 동물모델과 비교해 공동 국소화를 감소시킨 물질을 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
본 발명에서, 상기 단계 (b)는 β-카테닌의 활성을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 단계 (b)는 AXIN1 및 TAZ의 단백질 발현 수준을 측정함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 공동 국소화는 핵 특이적 공동 국소화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 본 발명의 AXIN1 및 TAZ의 공동 국소화에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계에서 사용되는 세포는 실험동물의 형태로 제공될 수 있으며, 이 경우 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 실험동물에게 PKD1을 결실시키는 단계를 추가로 포함하며, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구투여, 정위주사를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
시험물질을 처리하는 것은 시험물질을 세포 또는 조직 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 상기 세포가 실험동물 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명에서, 상기 단계 (b)는 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 상기 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 방법을 이용하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계는 대조군 세포와 비교하여 상기 공동 국소화를 감소시킨 물질을 다낭성 신장질환 치료제 후보 물질로 선별하는 단계이다.
상기 대조군 세포는 시험물질을 처리하지 않은 세포 또는 동물모델일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 시험 물질이 접촉된 세포 또는 동물모델에서의 TAZ 또는 AXIN1의 단백질의 발현 정도가 후보물질 접촉되지 않은 단백질의 발현 정도보다 감소된 경우, 상기 후보물질을 다낭성 신장질환 예방 또는 치료제 판단하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
(a) 시험물질을 분리된 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질과 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험물질이 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 치료 후보물질로 선별하는 단계.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질은 이를 발현하는 세포 또는 조직의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 단계 (b)는 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험방법
1. 실험동물
Pkd1 유전자의 엑손 2-5 옆에 있는 loxP 부위를 포함하는 Pkd1-floxed 마우스는 미국 예일대 학교의 Stefam Somlo 박사로부터 입수하였다. 한국 과학 기술원에 설립된 엑손 3이 하나의 loxP 부위로 대체 된 Taz 돌연변이 대립 유전자를 포함하는 Taz-floxed 마우스를 임대식 박사로부터 입수하여, 숙명 여자 대학교의 병원체가 없는 동물 시설에서 사육하였다. 또한, 신장 집합관에서 특이적으로 cre-재조합 효소 활성을 유도하는 HoxB7Cre 형질 전환 마우스를 사용하였다. 모든 마우스는 숙명 여자 대학교 동물 관리 및 사용위원회의 승인에 따라 최적의 조건 (20 ℃에서 12 시간 명암주기)의 동물 시설에서 사육하였다.
2. 인간 신장 표본
낭포를 둘러싼 인간의 신장 피질 조직은 신장 절제술을 받은 ADPKD 환자로부터 얻었다. 대조군으로는 외과적 치료를 받은 신장 세포 암종 환자로부터 조직학적 검사로 확인된 인간 신장의 정상 부위를 수득하여 사용하였다.
3. 조직학 및 면역 형광 분석
파라핀이 내장된 마우스 신장을 6 μm 섹션으로 절단하고 조직학적 분석을 위해 헤마톡실린 및 에오신 (H & E)으로 염색하였다.
조직 슬라이드는 TAZ (Abcam), c-MYC (Santa Cruz, sc-764), β-카테닌 (Millipore, #05-665), DBA (Vector, FL-1031), Ki-67 (Abcam, ab16667) 및collagen IV (SouthernBiotrch, 1340-01)에 대한 항체를 사용하여 각 표적 단백질의 발현을 모니터링하였다.
4. IMCD 세포의 면역 형광
세포를 20 분 동안 고정하고 0.4 % Triton X-100/PBS로 20 분 동안 투과시키고 PBST (PBS-0.05 % tween20) 중 5 % BSA로 실온에서 30 분 동안 차단하였다.
1 차 항체 (항-HA 마우스 모노항체 및 항-Myc 토끼 폴리 항체)를 실온에서 1 시간 동안 처리하고, PBST로 3 회 이상 세척하고 Alexa Fluor 488 당나귀 항-마우스 또는 항-토끼 568-접합된 2 차 항체(Invitrogen)를 1 : 200의 비율로 사용하여 시각화하였다. 준비한 세포는 DAPI (Vector Laboratories)를 포함하는 Dako 장착 배지에 장착하였다.
5. 세포 배양 및 시약
마우스 내수질 집합관 (IMCD, inner medullary collecting duct) 세포를 10 % 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 둘베코 수정된 이글 배지 F/12 (DMEM F/12; Welgene)에서 배양하였다. 낭포의 체외 분석을 위해 2.0-3.0 × 105 세포/mL의 DMEM F/12를 Matrigel (Corning, 354230)에 1 : 1 비율로 플레이팅하고 5-6 일 동안 FBS 없이 DMEM F/12를 첨가하여 배양하였다.
포스콜린 (Sigma-Aldrich, F3917), TAZ 조절제 (Merck, 530959), Exo IWR1 (Tocris, 3947) 및 Endo IWR1 (Tocris, 3532)을 포함한 약물은 최적의 농도로 사용하였다. Exo- 및 Endo-IWR1은 조익훈 박사로부터 제공받았다.
3D 배양의 경우, 세포 분주 후 최소 2 일 후에 배지에 약물을 첨가하고 시험관 내 낭포가 충분히 성장할 때까지 처리를 계속하였다.
6. 유전자 녹다운, 발현 작제물 및 형질 감염
세포는 스크램블된 siRNA (Santa Cruz) 또는 Pkd1 (Santa Cruz, sc-40862), TAZ (Santa Cruz, sc-38569) 또는 AXIN1 (Santa Cruz, sc-41449)을 표적으로 하는 siRNA로 리포펙타민 RNAiMAZ (Invitrogen)을 사용하여 적어도 24 시간 동안 형질감염하였다. Flag-PKD1은 Addgene (Cat. 31793)에서 구입하였다. HA-TAZ 플라스미드는 임대식 박사로부터 제공받았다. HA-β-카테닌과 Myc-AXIN1은 조익훈 박사가 제공하였다. 세포를 리포펙타민 2000을 사용하여 24 시간 동안 상기 발현 플라스미드로 형질 감염시켰다.
7. 웨스턴 블롯 분석 및 면역 침전
NucleoSpin RNA/Protein 컬럼 (Macherey-Nagel) 또는 Nucleus/Cytosol fractionation (Thermo) 키트를 사용하여 마우스 조직의 단백질 용해물을 정제하였다. 이어 균질기를 사용하여 세포 분획을 얻었다. 세포 용해물을 이용한 웨스턴 블롯 및 면역 침전 (IP)은 두 번의 독립적인 실험으로 수행하였다. Pkd1f/f 및 Pkd1f/f; HoxB7cre 마우스 신장은 Axin- 또는 Taz- 면역 침전물에 사용되었다. 마우스 신장 조직 단편은 1 % 트리톤-X100을 함유하는 200 ㎕의 저온 용해 완충액에서 막봉(pestle)을 사용하여 균질화하였다. 균질물을 12,000 rpm (20 분, 4 ℃)에서 원심 분리하고 상등액을 보통 토끼 IgG 및 A/G 아가로스 비드를 포함하는 IP 완충액에서 사전 제거에 사용하였다. IP를 위해 미리 제거된 상청액을 사용하였다.
8. 항체
사용한 항체의 출처 및 카탈로그 번호는 다음과 같다 : PC1 (sc-130554), c-MYC (sc-40), HA (sc-7392), AXIN1 (sc-293190), β-카테닌 (sc-7963), p-TAZ (Ser89) (sc-17610), alpha tubulin (sc-5286) (all from SCBT, Santacruz, CA); HA (ab969110), Myc (ab9106), Flag (ab1257) (all from Abcam); YAP/TAZ (#8418), α-tubulin (#2144), AXIN1 (#2087), c-MYC (#9402), phospho-CREB (#9198), Histone H3 (#60538), LSD1 (Lysine-specific demethylase 1 #2139) (all from Cell Signaling); β-actin (A2228 from Sigma); β-카테닌 (610153), TAZ (560235) (both from BD Biosciences), anti-Active-β-카테닌 (ABC #05-665) (from Millipore). 면역 형광의 경우, Anti-HA 태그 항체 (abcam의 ab18181) 및 Anti-Myc 태그 토끼 (Cell Signaling의 sc-2278)를 사용하였다.
9. qRT-PCR
NucleoSpin RNA/Protein 컬럼 (Macherey-Nagel)을 사용하여 세포 용해물 및 마우스 신장 샘플에서 RNA를 추출하고 제조업체의 프로토콜에 따라 M-MLV 역전사 효소 (Promega)로 역전사했다. 상보적 DNA는 SYBR Green 및 표적 유전자 용 프라이머와 혼합하였다. 다음의 프라이머를 사용하였다 : Pkd1 (F: 5′-GGGAGCCCTGCCACCTACCTA-3′, R: 5′-CCTCACTACGGCTCACCTCATTCC-3′), TAZ (F: 5′-AGTTCCTGCGCTTCAAATGGG-3′, R: 5′-GTAGGGTGGGCTGTTAGGGAG-3′), AXIN2 (F: 5′-TACACTCCTTATTGGGCGATCA-3′, R: 5′-TTGGCTACTCGTAAAGTTTTGGT-3′), c-MYC (F: 5′-GGCTCCTGGCAAAAGGTCA-3′, R: 5′-CTGCGTAGTTGTGCTGATGT-3′), CCND2 (F: 5′-ACCTTCCGCAGTGCTCCTA-3′, R: 5′-CCCAGCCAAGAAACGGTCC-3′), Ankrd1 (F: 5’-GCTGCGCTGGAGAACAAACTG-3’, R: 5’-AGCCTCCATTAACTTCTCCACGAT-3’), Fgf5 (F: 5’-TTTTCTTCGTCTTCTGCCTCCTCA-3’, R: 5’-GAAACCGATGCCCACTCTGC), Foxf2 (F: 5’-CGGCGCCTCTGGGTTGC-3’, R: 5’-GGTGGTGGTGGAGGTGGTGTG-3’), Gadd45d (F: 5’-GCACTGCCTCCTGGTCACGAA-3’, R: 5’-CCCATTGGTTATTGCCTCTGCTCT-3’) 및 Serpine1 (F: 5’-GCAACCCTGGCCGACTTCA-3’, R: 5’-ACGCCACTGTGCCGCTCTC-3’).
10. RNA-Seq 데이터 분석
대조군과 비교하여 Pkd1-결실된 신장의 전사체 수준을 확인하기 위해 GSE86509의 RNA 시퀀싱 데이터를 재분석하여 수행했으며 GEO 공개 데이터베이스에 게시하였다 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Pkd1-결실된 신장 조직과 대조군 사이에 차별적으로 발현된 유전자 수준을 확인하기 위해 GSEA (유전자 세트 농축 분석, Gene set enrichment analysis)을 수행하였다.
11. 루시퍼라제 어세이
pTOP 리포터 작제물 및 pTk-레닐라(형질감염 대조군)(DNA 양의 비율은 1 : 10)을 플라스미드 또는 siRNA 올리고뉴클레오티드를 발현하는 IMCD 세포에 공동형질감염하였다. 루시퍼라제 활성은 제조사의 지시에 따라 Promega 루시퍼라제 어세이 reagents를 사용하여 측정하였다.
12. 바이러스 벡터
인간 TAZ 또는 인간 b-카테닌을 넉다운하기 위하여, TAZ 또는 b-카테닌에 대한 shRNA 벡터를 퓨로마이신 저항성 카세트를 포함하는 레트로바이러스 벡터를 사용하여 전달하였다. 바이러스 입자는 [Azzolin L, et al. (2014) YAP/TAZ incorporation in the β-카테닌 destruction complex orchestrates the Wnt response. Cell 158(1):157-170.] 문헌에 제조된 바에 따라 제조하였다. b-카테닌 또는 TAZ에 대한 shRNA 레트로바이러스 벡터는 조익훈 및 임대식 박사로부터 제공받았다.
13. 통계적 분석
모든 데이터는 3번 이상의 독립적인 실험을 통해 얻었으며, 평균±표준편차(S.D.)로 통계적으로 분석하였다. GraphPad Prism 5.0 (GraphPad 소프트웨어)을 사용하여 Unpaired t-test를 수행하였다. P 값이 0.05 미만 (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001) 인 결과를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 1. YAP1/TAZ 및 c-MYC의 Pkd1-표적 마우스와 ADPKD 환자의 신장에서의 증가 확인
YAP1/TAZ 및 c-MYC의 Pkd1-표적 마우스와 ADPKD 환자의 신장에서의 증가를 확인위하여, 신장 집합관 특이적 Pkd1 녹아웃 마우스를 사용하였다.
도 1a에 나타난 바와 같이, TAZ의 발현이 Pkd1-null 신장에서 β-카테닌 및 c-MYC의 발현과 상관 관계가 있는지 확인하기 위해, 먼저 Pkd1- 결실된 마우스의 신장에서 TAZ 및 c-MYC의 단백질 수준을 평가하였고, 그 수준이 활성 β-카테닌 단백질 수준과 함께 고도로 상향 조절되었음을 확인하였다.
도 1b에 나타난 바와 같이, β-카테닌 또는 YAP1/TAZ의 표적으로 알려진 c-Myc의 mRNA 수준은 Pkd1-null 마우스의 신장에서 향상된 것으로 나타났다.
이에 더하여, 신장 낭포의 발달이 뒤 따르는 Pkd1의 집합관 특이적인 녹아웃을 확인하기 위해, 표적 단백질과 집합관 특정 마커 (DBA)를 공동 염색하였다.
도 1c 내지 도 1f에 나타난 바와 같이, 모든 낭포가 늘어선 세포가 DBA로 염색되었음을 확인했으며, 또한 Pkd1이 결실된 신장에서 TAZ 및 c-MYC의 축적이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 1g 내지 도 1h에 나타난 바와 같이, β-카테닌은 낭포가 늘어선 상피와 낭포 주변의 말초 세포 모두에서 활성화되었음을 확인하였다.
또한, 상기 실험 결과에 따라 정상 인간 및 ADPKD 환자의 신장에서 TAZ, 활성-β-카테닌, 총 β-카테닌 및 c-MYC 발현을 조사하였다.
도 1i에 나타난 바와 같이, 상기 단백질들은 정상 인간 신장 조직에 비해 ADPKD 환자 신장의 낭성 내벽 세포에서 고도로 발현되었다.
이러한 결과는 TAZ의 과발현이 Pkd1 결손 마우스와 ADPKD 환자 모두의 신장에서 β-카테닌 및 c-MYC의 과발현과 양의 상관 관계가 있음을 나타낸다.
실시예 2. Pkd1 결실 신장에서 Yap/Taz 표적 유전자 발현의 유의한 증가 확인
보다 심층적인 분석을 위해 상기 마우스 모델의 신장 조직을 사용하여 얻은 RNA-seq 데이터를 기반으로 mRNA 수준에서 표적 유전자 발현의 변화를 확인하였다.
도 2a에 나타난 바와 같이, Yap, Taz 및 β-카테닌 수준의 변화를 스크리닝하고 해당 유전자의 발현이 Pkd1 결손된 신장에서 미미하게 변화하였음을 확인하였다.
한편 Yap/Taz 표적 유전자에서는 354 개의 유전자를 포함하는 공개 출처에서 다양한 발현 패턴이 관찰되었다.
도 2b에 나타난 바와 같이, 순위 순 Yap/Taz 표적 유전자의 농축 점수 (ES, enrichment score)는 GSEA 분석에 의해 매우 증가된 패턴을 나타냄을 발견하였다.
도 2c 및 도 2d에 나타난 바와 같이, Yap/Taz 표적 유전자 중 129 개 유전자가 Pkd1 결손 다낭성 신증에서 현저하게 더 높은 발현 수준을 보인 가장 중요한 유전자군(leading-edge subset genes)으로 정의되었으며, 0.795보다 큰 log2 배 변화로 차별적으로 발현되는 상위 20 개 유전자를 표시하였다.
도 2e에 나타난 바와 같이, c-Myc를 포함한 상위 유전자들은 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 사용하여 검증하였으며, 이러한 유전자의 발현 수준이 실제로 증가함을 확인하였다.
이러한 결과는 Yap/Taz 활성화가 Pkd1 결실에 의해 자극된 신장 낭포의 성장에 양성적으로 관련될 수 있음을 나타낸다.
실시예 3. Taz 결실로 인한 신장 기능 향상 및 낭포 성장 억제 효과 확인
Pkd1 표적화 된 마우스의 신장에서 신장 낭포 성장에 대한 TAZ의 역할을 설명하기 위해, 집합관 특이적 이중 Pkd1-/Taz- 녹아웃 마우스 (Pkd1f/f; Tazf/f; HoxB7Cre)를 제작하였다. 이들 마우스는 출생 후 13 일 째에 희생되었다. Taz가 결실된 Pkd1-결핍 마우스는 매우 감소된 낭포 발달을 나타냈다.
도 3a에 나타난 바와 같이, 낭포 영역의 크기 분포의 변화를 나타내기 위해 정량화한 결과, 실제로 Pkd1/Taz 이중 녹아웃 신장에서 큰 낭포의 수가 현저하게 감소한 것으로 나타났다.
또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, Pkd1/Taz 이중 녹아웃 마우스의 신장 대 총 체중 (2KW/TBW) 비율과 혈중 요소 질소 (BUN) 수준이 Pkd1 결실 마우스에 비해 현저히 감소하였는 바, TAZ 발현 감소가 신장 기능을 향상시켰다.
다음으로, Pkd1-null 마우스의 신장에서 활성 β-카테닌 및 c-MYC의 증가 된 발현이 TAZ 수준의 감소에 의해 조절되는지 여부를 평가하였다.
도 3c에 나타난 바와 같이, Pkd1 결실 마우스의 TAZ 돌연변이는 신장에서 활성 β-카테닌 및 c-MYC 수준을 감소시켰다.
또한, 도 3d 내지 도 3f에 나타난 바와 같이, 면역 형광 분석 결과 증가된 신호가 Pkd1/Taz 이중 녹아웃 신장에서 크게 감소했음을 밝혔다.
또한, 도 3g에 나타난 바와 같이, Pkd1 결실에 의해 유도 낭포 주변에서 과활성화된 세포 증식은 이중 녹아웃 신장에서 억제되었다.
또한, 도 3h에 나타난 바와 같이, Pkd1-null 신장에서 섬유증 점수의 강한 증가는 Masson의 trichrome 염색 또는 콜라겐 IV에 대한 면역 조직 화학적 염색으로 표시되었으며 Pkd/Taz 이중 녹아웃 마우스에서는 오히려 회복되었다.
종합컨대, 이러한 결과는 TAZ 발현의 감소가 PKD 표현형을 완화시키고 활성 β-카테닌 및 c-MYC의 발현 감소를 동반함을 시사한다.
실시예 4. in vitro 낭포 생성이 TAZ 수준의 증가에 의해 자극되고 Wnt 억제에 의해 약화됨을 확인
TAZ는 c-MYC 발현의 상류 조절자 중 하나로, 둘 다 신장 낭포 형성과 관련되어 있다.
Pkd1-null 마우스의 신장에서 TAZ 및 c-MYC 수준이 증가했기 때문에 TAZ의 증가가 Pkd1-null 세포에서 c-MYC의 발현을 상향 조절하는지 여부를 확인하였다.
도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, Pkd1 침묵은 IMCD 세포에서 TAZ 및 c-MYC 수준을 증가시켰다.
다음으로, TAZ의 핵 국소화를 향상시키는 TAZ 핵 촉진 화학 물질인 세포 투과성 이미다졸-[4, 5-b] 피리딘 유도체로 처리된 세포에서 c-MYC의 단백질 수준을 평가하였다.
도 4c에 나타난 바와 같이, 이미다졸-[4, 5-b] 피리딘 유도체로 처리된 세포에서 c-MYC 발현과 함께 농도 의존적으로 TAZ 단백질 발현이 증가되었다.
또한, 유전자 발현 또는 TAZ의 활성의 변화가 시험관 내 낭포 성장에 영향을 미치는지 여부를 추가로 확인하기 위해 IMCD 세포의 3D 배양을 수행하였다.
세포를 24 시간 동안 Pkd1 또는 Taz를 표적으로하는 siRNA로 전처리하고 Matrigel에 포함시켰다 (배양 배지와 1 : 1 비율로). 그 후, 5μM 포스콜린을 함유한 DMEM F/12 배지를 첨가하고 배양 5 일째에 낭포가 관찰되었다. 포스콜린은 세포 내 cAMP 수준을 증가시켜 PKD 모방 조건을 제공하고 낭포 성장을 자극하였다.
도 4d 에 나타난 바와 같이, 포스콜린 처리 후 2 ~ 3 일 후에 점진적으로 낭포가 발생하는 것을 관찰 한 반면, Pkd1 침묵이 낭포 영역을 증가시키는 것으로 나타났다. 이에 반해, Pkd1 및 Taz를 표적으로 하는 siRNA로 침묵된 세포에서 낭포가 다시 감소한 것으로 나타났다.
또한, 시험관 내 낭포의 성장에 대한 TAZ 과발현의 효과를 관찰하였다.
도 4e에 나타난 바와 같이, TAZ의 강제 발현은 Pkd1-표적 siRNA 단독으로 형질 감염된 세포와 비교하여, 낭포 영역의 증가를 나타냈으며, Pkd1 침묵 세포의 낭포 형성을 증가시켰다.
다음으로, TAZ 활성을 조절하는 약물 (TAZ 조절제) 처리가 낭포 성장에 영향을 미치는지 평가하였다.
도 4f에 나타난 바와 같이, in vitro에서 낭포가 약물 처리에 의해 크게 증가했으며 이는 향상된 c-MYC 수준과 관련이 있음을 나타내는 것이다.
또한, β-카테닌 활성의 억제가 TAZ 조절제의 낭포 자극 효과를 약화시킬 수 있는지 여부를 추가로 평가하였다. AXIN 안정제인 Endo IWR1을 사용하여 β-카테닌 활성을 하향 조절하였다.
도 4g에 나타난 바와 같이, Endo IWR1의 처리는 활성 β-카테닌을 유의하게 억제하고, c-MYC 수준을 감소시켰다. 도 4h에 나타난 바와 같이, 음성 대조군인 Exo IWR1는 영향을 미치지 않았다.
도 4h에 나타난 바와 같이, 3D 배양에서의 관찰은 TAZ 조절자에 의해 자극 된 시험관 내 낭포가 Endo IWR1 처리에 의해 상당히 감소된 것으로 나타났다.
실시예 5. TAZ 및 AXIN1을 통한 PKD1에 의한 β-카테닌 활성화 조절 확인
도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, Pkd1 결손 마우스의 신장에서 높은 수준의 활성 β-카테닌 및 c-MYC 단백질과 함께 TAZ 수준의 증가를 보여 주었다는 것을 관찰한 바 있다. 그 다음으로, PKD1의 TAZ-β-카테닌-c-MYC 다운 스트림 신호를 자세히 확인하였다.
먼저, PKD1 또는 TAZ 결핍 또는 공동 결핍이 활성 β-카테닌의 발현에 영향을 미치는지 조사하였다.
도 5a에 나타난 바와 같이, PKD1 결핍은 TAZ 수준을 약간 증가시키고 활성 β-카테닌 수준을 상당히 증가시켰다. 또한, 이러한 증가는 TAZ shRNA-발현 세포에서 PKD1 siRNA의 형질 감염시 대조군 세포에서와 비교하여 유사한 수준으로 감소되었다. 반대로, 대조군 세포에서 활성 β-카테닌의 미약한 발현은 과발현된 Flag-PKD1에 의해 사라졌다.
도 5b에 나타난 바와 같이, HA-TAZ의 발현은 Flag-PKD1의 강제 발현에 관계없이 용량 의존적으로 활성 β-카테닌 수준을 현저하게 증가시켰다.
이러한 결과에 따라 β-카테닌의 전사 활성이 도 5a에 제시된 것과 동일한 조건에서 조절되는지 여부를 추가로 확인하였다.
도 5c에 나타난 바와 같이, PKD1의 결핍은 PKD1 결핍 세포에서 TAZ의 녹다운에 의해 감소되었던 β-카테닌의 전사 활성을 다시 유도시켰다.
반면, 도 5d에 나타난 바와 같이, PKD1 발현은 β-카테닌의 전사 활성을 약간 감소시켰는데, 이는 PKD1 및 TAZ의 공동 발현시 TAZ-발현 세포와 유사한 수준으로 향상되었다.
종합적으로, 이러한 결과는 TAZ 의존성 PKD1 발현이 β-카테닌의 활성화를 음성적으로 조절함을 시사한다. β-카테닌은 파괴 복합체를 포함하는 AXIN1에 의해 분해되었다. 따라서 AXIN1이 β-카테닌 활성화의 PKD1 매개 조절에 참여하는지 여부를 조사하였다.
도 5e에 나타난 바와 같이, AXIN1 결핍이 PKD1 발현 세포에서 활성 β-카테닌 수준을 회복했음을 보여주었다.
또한, 도 5f에 나타난 바와 같이, AXIN1 결핍은 PKD1 발현 세포에서 β-카테닌의 전사 활성의 감소를 방해하였다.
이러한 결과는 AXIN1이 PKD1이 결핍된 세포에서 β-카테닌 활성을 조절하는 데 있어 PKD1의 하류 매개체 일 수 있음을 나타낸다.
이어서, β-카테닌의 전사 활성 조절에서 PKD1 기능의 기초가 되는 TAZ와 AXIN1 사이의 상위적(epistatic) 관계를 추가로 평가하였다.
도 5g에 나타난 바와 같이, TAZ shRNA의 발현은 β-카테닌의 전사 활성을 감소시켰으며, AXIN1 결핍에 의해 크게 증가하였다. 또한, AXIN1 발현은 TAZ 발현에 의해 유도된 β-카테닌 활성화를 크게 감소시켰다.
이러한 결과는 TAZ가 AXIN1의 상류에서 작용하여 β-카테닌의 전사 활성화를 조절함을 시사한다.
TAZ 의존성 PKD1 발현이 β-카테닌의 표적 유전자 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위해, AXIN, c-MYC 및 CCND2 mRNA의 발현에 대한 PKD1 단독 침묵 또는 PKD1 및 TAZ 공동 침묵의 효과를 조사했다;
도 5h에 나타난 바와 같이, PKD1이 고갈된 세포에서 상기 유전자들의 발현이 상승했지만 PKD1을 발현하는 TAZ-결핍 세포에서는 상승하지 않았다.
이러한 데이터는 PKD1에 의한 AXIN2, c-MYC 및 CCND2의 β-카테닌 매개 전사 활성화 조절이 TAZ에 의존한다는 것을 나타낸다.
실시예 6. PKD1 결핍 상태에서 AXIN1과 TAZ의 강한 상호 작용이 β-카테닌의 활성화를 유발함을 확인
도 5a 내지 5h에 나타난 바와 같이, β-카테닌 활성화는 PKD1에 의해 조절되며, 이는 TAZ 및 AXIN1에 의존하는 것으로 나타났다.
따라서, HA-TAZ로 형질 감염된 PKD1 침묵 세포를 사용하여 TAZ와 AXIN1 및 PKD1의 상호 작용을 시험하였다.
도 6a에 나타난 바와 같이, PKD1 고갈이 세포에서 포화된 것으로 보이는 총 HA-TAZ의 양을 변화시키지 않았음을 보여주었다. HA-TAZ는 내인성 PKD1과 공침전된 반면, PKD1이 없는 상태에서는 AXIN1과 상호 작용하였다.
이러한 결과는 TAZ가 AXIN1보다 PKD1과 더 강하게 상호 작용하는 반면, PKD1이 없으면 TAZ와 AXIN1의 상호 작용을 유발한다는 것을 시사한다.
이에, PKD1이 결핍된 경우, TAZ와 AXIN1의 상호 작용이 AXIN1과 β-카테닌의 연관성에 영향을 미친다고 가정하였다. 이를 확인하기 위해, si-PKD1 및 si-control로 형질 감염된 Myc-AXIN1 발현 세포의 용해물로부터 Myc-AXIN1을 Myc-항체와 함께 풀다운(pull down)하였다.
도 6b에 나타난 바와 같이, 항-β-카테닌 항체로 면역 침전된 Myc-AXIN1의 면역 블롯팅은 β-카테닌이 si-control 세포에서 Myc-AXIN1과 공침전된 반면, PKD1 결핍된 세포에서는 β-카테닌과 AXIN1의 공침전이 관찰되는 것으로 나타났다. 또한, Myc-AXIN1은 si-control 세포에서 TAZ를 약간 공침전 시켰지만 PKD1 결핍시에는 TAZ와 강하게 상호 작용하는 것으로 나타났다.
또한 PKD1이 과다한 경우, AXIN1과 β-카테닌 또는 TAZ의 연관성에 대한 효과를 시험하였다.
도 6c에 나타난 바와 같이, AXIN1이 대조군 세포에서 TAZ 또는 β-카테닌과 잘 공침전되었지만 TAZ와 비교적 약하게 상호 작용하고 β-카테닌과 더 강한 상호 작용을 가짐을 확인하였다. 이러한 결과는 PKD1 결핍이 TAZ를 AXIN1과 상호 작용하기 쉽게 만들어 β-카테닌과 AXIN1의 약한 상호 작용을 초래함을 나타낸다.
반대로, 과도한 PKD1은 TAZ가 AXIN1과 상호 작용하는 것을 허용하지 않아 결과적으로 β-카테닌과 AXIN1과의 상호 작용을 향상시켰다.
또한, TAZ이 풍부한 경우 AXIN1과 β-카테닌의 상호 작용에 영향을 미치는지 여부를 추가로 평가하기 위해, HA-TAZ 발현 세포로 IP를 수행하였다.
도 6d에 나타난 바와 같이, 내인성 AXIN1의 면역 침전은 β-카테닌을 나타냈지만, HA-TAZ의 강제 발현은 대조군과 비교하여 AXIN1과 β-카테닌의 약한 상호 작용을 유도하였다. 파괴 복합체에서 방출된 β-카테닌은 표적 유전자를 활성화하기 위해 핵에 국한되었다.
따라서 우리는 AXIN1에서 결합되지 않은 β-카테닌이 HA-TAZ 발현 세포의 핵에 존재하는지 여부를 평가하였다. 도 6d에 제시된 실험에 사용된 세포를 핵 분별에도 사용하였다.
도 6e에 나타난 바와 같이, β-카테닌은 HA-TAZ 발현 세포의 핵 분획에서 관찰되었다. 특히, HA-TAZ는 동일한 분획에도 존재하였다.
TAZ가 Pkd1-null 마우스 신장에서 손상되지 않은 AXIN1과 상호 작용하는지 여부를 확인하기 위해, Pkd1f/f 또는 Pkd1f/f; HoxB7cre 마우스 신장 조직 용해물을 준비하였다.
도 6f 및 도 6g에 나타난 바와 같이, TAZ 또는 AXIN1은 면역 침전된 다음 AXIN1, PKD1, 활성-β-카테닌에 대해 블롯팅하였다.
도 6f에 나타난 바와 같이, 야생형 마우스 신장에서는 TAZ와 AXIN1의 약한 상호 작용이 나타난 반면, Pkd1f/f; HoxB7cre 마우스 신장에서는 AXIN1과 TAZ 사이의 증가된 상호 작용을 나타냈다. 반대로, Pkd1 녹아웃 마우스 신장의 AXIN1 면역 침전물은 야생형 신장과 비교하여 TAZ와 유의한 상호 작용을 나타냈다.
도 6g에 나타난 바와 같이, β-카테닌과 AXIN1 사이의 상호 작용은 Pkd1 돌연변이 마우스 신장에서 비교적 덜 감소하였다.
종합하면, PKD1의 결핍은 TAZ와 AXIN1의 강한 상호 작용으로 이어지며, 이에 따라 β-카테닌은 파괴 복합체에서 방출되어 전사적으로 활성화된다.
실시예 7. Pkd1 침묵 세포에서 TAZ 및 AXIN1의 공동 국소화 확인
TAZ 국소화가 기계 감지(mechanosensing)에서 역할의 PKD1 측면에 의해 규제된다는 가설을 세웠다.
먼저, 도 7a에 나타난 바와 같이, 50 % 세포 밀도에서 TAZ는 대부분 세포질에 국한되고 일부는 핵에 국한된 것으로 나타났다. 반면, PKD1 침묵 세포는 핵 TAZ의 증가를 나타냈다. 이는 PKD1의 존재가 세포질에서 TAZ를 유지함을 시사하는 것이다.
또한, 상기 실시예들로부터 PKD1 결핍시 TAZ와 AXIN1의 상호 작용이 증가한다는 것을 확인하였다.
이에 PKD1이 없을 때 TAZ가 AXIN1과 공동 국소화되는지 여부를 평가하였다.
도 7a에 나타난 바와 같이, 이소성 발현된 HA-TAZ는 대조군 세포의 세포질에서 검출된 반면, PKD1 침묵 세포는 증가된 HA-TAZ 핵 전좌를 보였으며, 이는 TAZ의 PKD1 의존성 세포질 국소화를 의미한다.
상기 실시예에서 확인한 바와 같이, PKD1 녹다운은 TAZ와 AXIN1의 상호 작용을 증가시켰다. 이에 HA-TAZ 발현이 PKD1 침묵 세포에서 Myc-AXIN1과 공동 국소화되었는지 여부를 조사하였다.
도 7b에 나타난 바와 같이, PKD1 녹다운은 세포질에서 Myc-AXIN1과 HA-TAZ의 공동 국소화를 유도하였고, 이는 PKD1 결핍이 Myc-AXIN1과 HA-TAZ의 공동 국소화를 유도했음을 시사한다.
실시예 8. PKD1 결핍 세포에서 TAZ 및 β-카테닌에 의한 c-MYC 전사 증가 확인
상기 실시예들에서 세포에서 PKD1의 침묵이 β-카테닌의 전사 활성화를 유도하고 Pkd1-null 마우스의 신장에서 c-MYC의 발현이 증가한다는 것을 확인하였다. 또한, c-MYC는 β-카테닌 또는 YAP/TAZ의 표적 유전자로 알려져 있으며, 다낭성 신증의 병인과도 관련이 있었다. 따라서, PKD1의 결실이 낭포를 형성하는 동안 c-MYC 발현 유도에 기여한 것으로 예상하였다.
먼저 β-카테닌 또는 TAZ가 c-MYC 유전자의 전사를 조절하기 위해 핵에 국한되었는지 여부를 조사하였다.
도 8a에 나타난 바와 같이, PKD1 결핍 세포의 세포 분별을 수행한 결과, 예상대로 활성 β-카테닌 단백질의 양은 PKD1 결핍 세포의 핵 분획에서 높게 나타났다. 흥미롭게도, TAZ는 PKD1 결핍된 세포의 핵 분획에 부분적으로 존재했으며 세린 89가 인산화된 TAZ는 이들 세포의 세포질 분획에서 약간 감소한 것으로 나타났다.
이러한 결과는 PKD1 결핍이 활성 β-카테닌 또는 TAZ의 핵으로의 전위를 유도하여 이것이 c-MYC의 발현 증가에 참여할 수 있음을 나타낸다.
상기 결과를 보다 검증하기 위해 qRT-PCR을 수행하여 PKD1-/ 또는 TAZ- 결핍 세포 또는 PKD1 및 TAZ에 대해 공동 결핍 세포에서 c-MYC mRNA의 발현을 평가하였다.
도 8b에 나타난 바와 같이, PKD1의 침묵은 c-MYC mRNA의 발현을 증가시켰으며, 이는 PKD1/TAZ-공동 결핍된 세포 및 TAZ-결핍된 세포에서 현저하게 감소하였다.
또한, 도 8c에 나타난 바와 같이, c-MYC 수준은 PKD1 침묵 세포에서 상당히 높았지만 공동 결실 세포 또는 TAZ-결실 세포에서는 감소하였다.
상기 결과는 TAZ가 PKD1 결핍 세포에서 c-MYC의 발현을 담당함을 시사한다.
이에 더하여, PKD1 침묵 세포에서 증가된 β-카테닌 활성이 c-MYC 유전자의 발현에 기여했는지 여부를 추가로 테스트하였다.
도 8d에 나타난 바와 같이, PKD1 결핍 상태에서 증가된 c-MYC 발현은 β-카테닌의 녹다운에 의해 감소되었다. 더욱이, c-MYC 발현에 대한 β-카테닌 녹다운의 효과는 TAZ 고갈의 효과보다 적었으며, 이는 c-MYC mRNA의 발현이 TAZ에 의해 조절된 상태로 남아 있음을 나타내는 것이다.
종합컨대, 상기 결과들을 바탕으로 PKD1 침묵 세포에서 TAZ의 결핍은 β-카테닌 또는 TAZ의 TAZ 매개 조절을 통해 c-MYC mRNA의 발현을 감소시킨다.
실시예 9. Wnt 억제제 및 mTOR 억제제의 병용 처리의 낭포 형성 억제 효과 확인
여러 전임상 모델에서 낭포 성장을 감소시키는 것으로 보고되었던 mTOR 억제제가 TAZ/β-카테닌/c-MYC 경로에 미치는 영향을 실시예 4의 실험방법을 기초로 추가로 확인하였다.
도 10a 및 도 10b에 나타난 바와 같이, mTOR 억제제인 라파마이신이 TAZ/Wnt-β-카테닌/c-MYC 축에 영향을 미치는지 여부를 조사한 결과 약물 치료에 의해 현저하게 억제되는 것으로 나타났다. 또한, Wnt 억제제와 라파마이신의 병용 처리는 라파마이신 단독 처리 군과 비교하여 시험관 내 낭포 성장을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다.
따라서, c-MYC에 의해 매개되는 TAZ 및 그 하류 신호 경로가 낭포 발달 및 PKD 진행에 부정적인 영향을 미친다는 것을 명확히 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명자들은 PKD1 결핍 세포에서 TAZ와 AXIN1의 상호작용이 TAZ와 함께 β-카테닌의 핵 내 축적을 유발함을 확인하고, PKD1 결핍 세포 또는 동물모델에서 TAZ와 AXIN1의 상호작용을 억제하는 경우, 신장의 낭포 형성이 완화됨을 확인함으로써, TAZ와 AXIN1의 상호작용 억제제를 다낭성 신장 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였는 바, 본 발명은 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (18)

  1. TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 다낭성 신장질환은 상염색체 우성 다낭성 신장질환인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제는 신장 낭포 형성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 Wnt 억제제는 EndoIWR1인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  6. 하기 단계를 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) PKD1 결핍 세포 또는 동물모델에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 시험물질을 처리한 세포 또는 동물모델에서 AXIN1 및 TAZ의 공동 국소화(co-localization)를 확인하는 단계; 및
    (c) 시험물질을 처리하지 않은 대조군 세포 또는 동물모델과 비교해 공동 국소화를 감소시킨 물질을 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 다낭성 신장질환은 상염색체 우성 다낭성 신장질환인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 β-카테닌의 활성을 측정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 공동 국소화는 핵 특이적 공동 국소화인 것을 특징으로 하는, 방법.
  10. 하기 단계를 포함하는 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) 시험물질을 분리된 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질과 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 시험물질이 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질의 상호작용을 억제하는지 여부를 측정하는 단계로, 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교했을 때 상기 시험물질과 접촉하여 상호작용이 감소된 경우, 상기 시험물질을 치료 후보물질로 선별하는 단계.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 AXIN1 단백질 및 TAZ 단백질은 이를 발현하는 세포 또는 조직의 형태로 제공되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays, FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  13. TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 다낭성 신장질환 예방 또는 치료 용도.
  14. TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제의 다낭성 신장질환 치료 약제 제조를 위한 용도.
  15. TAZ 및 AXIN1의 상호작용 억제제를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료 방법.
  16. Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 다낭성 신장질환 예방 또는 치료 용도.
  17. Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 다낭성 신장질환 치료 약제 제조를 위한 용도.
  18. Wnt 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    라파마이신, 이의 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 다낭성 신장질환의 예방 또는 치료 방법.
PCT/KR2021/013872 2020-11-12 2021-10-08 다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법 WO2022102984A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0151308 2020-11-12
KR1020200151308A KR102608039B1 (ko) 2020-11-12 2020-11-12 다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2022102984A1 true WO2022102984A1 (ko) 2022-05-19

Family

ID=81601470

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/013872 WO2022102984A1 (ko) 2020-11-12 2021-10-08 다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102608039B1 (ko)
WO (1) WO2022102984A1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105343096A (zh) * 2014-08-19 2016-02-24 北京仕林伟业生物科技有限公司 Wnt信号通路抑制剂的新用途
US9403812B2 (en) * 2010-12-08 2016-08-02 Oslo University Hospital Hf Triazole derivatives as Wnt signaling pathway inhibitors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101486248B1 (ko) 2013-04-29 2015-01-27 숙명여자대학교산학협력단 Ｄｎａ 메틸화 저해제를 포함하는 상염색체 우성 다낭신 개선 또는 치료용 약학 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9403812B2 (en) * 2010-12-08 2016-08-02 Oslo University Hospital Hf Triazole derivatives as Wnt signaling pathway inhibitors
CN105343096A (zh) * 2014-08-19 2016-02-24 北京仕林伟业生物科技有限公司 Wnt信号通路抑制剂的新用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HE JINZHAO; ZHOU HONG; MENG JIA; ZHANG SHUN; LI XIAOWEI; WANG SHUYUAN; SHAO GUANGYING; JIN WILLIAM; GENG XIAOQIANG; ZHU SHUAI; YAN: "Cardamonin retards progression of autosomal dominant polycystic kidney disease via inhibiting renal cyst growth and interstitial fibrosis", PHARMACOLOGICAL RESEARCH, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 155, 6 March 2020 (2020-03-06), AMSTERDAM, NL, XP086137583, ISSN: 1043-6618, DOI: 10.1016/j.phrs.2020.104751 *
LEE EUN JI, SEO EUNJEONG, KIM JIN WON, NAM SUN AH, LEE JONG YOUNG, JUN JAEHEE, OH SUMIN, PARK MINAH, JHO EEK-HOON, YOO KYUNG HYUN,: "TAZ/Wnt-β-catenin/c-MYC axis regulates cystogenesis in polycystic kidney disease", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES, vol. 117, no. 46, 17 November 2020 (2020-11-17), pages 29001 - 29012, XP055929972, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.2009334117 *
MORRIS SAINT-AARON L., HUANG SUYUN: "Crosstalk of the Wnt/β-catenin pathway with other pathways in cancer cells", GENES & DISEASES, ELSEVIER BV, NL, vol. 3, no. 1, 1 March 2016 (2016-03-01), NL , pages 41 - 47, XP055929976, ISSN: 2352-3042, DOI: 10.1016/j.gendis.2015.12.003 *
RYSZ JACEK, GLUBA-BRZÓZKA ANNA, FRANCZYK BEATA, BANACH MACIEJ, BARTNICKI PIOTR: "Combination drug versus monotherapy for the treatment of autosomal dominant polycystic kidney disease", EXPERT OPIN PHARMACOTHER, vol. 17, no. 15, 12 October 2016 (2016-10-12), London, UK , pages 2049 - 2056, XP009536676, ISSN: 1465-6566, DOI: 10.1080/14656566.2016.1232394 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR102608039B1 (ko) 2023-12-01
KR20220064798A (ko) 2022-05-19
KR102608039B9 (ko) 2024-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019182370A1 (ko) Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022102984A1 (ko) 다낭성 신장질환 치료제 및 이의 스크리닝 방법
WO2020017788A1 (ko) Cd9를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법
WO2021177518A1 (ko) 혈중 콜레스테롤 저하용, 심혈관 대사질환의 예방 또는 치료용 및 항염용 약학적 조성물
WO2023140664A1 (ko) 리포칼린 2 또는 이의 수용체의 발현 억제제를 유효성분으로 함유하는 비알코올성지방간염에 의해 유도된 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2014157965A1 (ko) P34의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 전이 억제용 조성물
WO2022014975A1 (ko) Bi-1 길항제 및 그의 용도
WO2022045775A1 (ko) 알츠하이머 치매 예방 또는 치료용 펩타이드 조성물
WO2022055334A1 (ko) 폐 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2017048069A1 (ko) 신규한 피라졸린 유도체 및 이의 용도
WO2022065968A1 (ko) 에보디아민을 유효성분으로 포함하는 비소세포폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2020197332A1 (ko) 봉독 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2021015419A1 (ko) 인산화된 베타-카테닌에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
WO2017164486A1 (ko) Tesk1 억제제를 포함하는 항암제 내성 억제용 조성물 및 tesk1 억제제의 스크리닝 방법
WO2022225359A1 (ko) 오토파지 활성화제를 유효성분으로 포함하는 비증후군성 상염색제-우성 난청의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023167544A1 (ko) Fam167a를 포함하는 bcr-abl 비의존성 타이로신 키나아제 억제제 내성을 진단하기 위한 바이오마커 및 fam167a를 타겟으로 하는 만성 골수성 백혈병 예방 또는 치료용 조성물
WO2020197367A1 (ko) St8sia1를 이용한 당뇨병의 예방 또는 치료용 조성물과 당뇨병 치료제 스크리닝 방법
WO2018038539A2 (ko) Eprs 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 항rna-바이러스용 조성물
WO2020262983A1 (ko) 신규한 에이디피-라이보실 사이클라아제 및 이의 저해제
WO2021125847A1 (ko) N-데그론 경로의 n-말단 아르기닐화에 의한 펙소파지의 조절, pbd 의 예방, 개선 또는 치료하는 물질의 스크리닝 방법, pbd를 진단하는 방법 및 펙소파지 조절, 또는 pbd 의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2011068260A1 (ko) 인슐린신호경로를 조절하는 마이크로알엔에이 및 그 표적의 작용을 제어하는 물질의 스크리닝 방법
WO2023038416A1 (ko) 폐 섬유증의 바이오마커 및 치료 표적으로서 csf3r
WO2024039196A1 (ko) 암의 진단, 전이가능성 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 이의 용도
WO2024085603A1 (ko) USP47 (Ubiquitin-specific protease 47) 발현 억제를 통한 c-Myc 관련 질병의 예방 또는 치료용 조성물 및 이의 용도
WO2023090971A1 (ko) 직접교차분화 유도용 조성물 및 이로 처리된 줄기세포

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21892154

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21892154

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1