WO2019182370A1 - Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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sphk1
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진희경
이주연
한승훈
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising a COX2 acetylating agent as an active ingredient, and more particularly, inhibits amyloid- ⁇ deposition in brain neurons and SPM (specialized proresolving) in neurons. It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising a COX2 acetylating agent having an effect of promoting the secretion of mediator) as an active ingredient.
  • AD Alzheimer's disease
  • a ⁇ aggregated amyloid ⁇
  • SPMs specialized proresolving mediators
  • LxA4 Lipoxin A4
  • RvE1 Resolvin E1
  • RvD1 Resolvin D1
  • Sphingosine kinase (SphK) 1 and 2 are involved in the conversion of sphingosine into sphingosine-1-phosphate (S1P), a bioactive lipid known to modulate inflammatory responses. It is a key enzyme. Recently, the role of SphK in inflammatory reactions has been the subject of research on various diseases (asthma, rheumatoid arthritis, etc.). However, the role of SphK in neuroinflammatory responses in the brains of AD patients has not been fully studied.
  • SphK1 promotes the secretion of neuroinflammatory termination regulators by increasing the acetylation of cyclooxygenase 2 (COX2), and consequently M2-like. It was found that it is exerted by inducing the conversion of phenotype to microglia.
  • COX2 cyclooxygenase 2
  • increasing the SphK1 in the brain of AD increases the acetylation of COX2, resulting in improved A ⁇ expression through glial cells, thereby improving the cognitive impairment and completed the present invention.
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising a COX2 (cyclooxygenase-2) acetylating agent as an active ingredient.
  • COX2 cyclooxygenase-2
  • step (d) treating the test substance selected in step (c) to cells expressing COX2 protein;
  • Another object of the present invention is to provide a biological sample from a patient suspected of degenerative neurological disease
  • Another object of the present invention is to provide a use of a cyclooxygenase-2 acetylating agent for the preparation of a preparation for preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • Another object of the present invention is to provide a method for treating neurodegenerative disorders, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising a cyclooxygenase-2 acetylating agent.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising a COX2 (cyclooxygenase-2) acetylating agent as an active ingredient.
  • COX2 cyclooxygenase-2
  • the present invention provides a method for screening an agent for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising the following steps:
  • step (d) treating the test substance selected in step (c) to cells expressing COX2 protein;
  • the present invention comprises the steps of (a) providing a biological sample from a patient suspected of degenerative neurological disease;
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising a COX2 (cyclooxygenase-2) acetylating agent as an active ingredient.
  • COX2 cyclooxygenase-2
  • the inventors of the present invention when the expression of sphingosine kinase 1 (sphK1) in neurons is reduced, the secretion of neuroinflammatory termination regulators that eliminate COX2 acetylation and inflammatory response It has been confirmed that abnormal inflammatory reactions have occurred resulting in Alzheimer-like lesions.
  • increased expression of SphK1 increases the secretion of neuroinflammatory termination regulators that relieve COX2 acetylation and inflammatory responses in neurons, and improves the function of microglial cells and thereby enhances A ⁇ expression, resulting in Alzheimer-like It was confirmed that the lesion was alleviated.
  • the acetylation of COX2 is reduced in Alzheimer's neurons, and it was confirmed that COX2 acetylation in these neurons is specifically regulated by SphK1. That is, SphK1 of neurons exhibited acetyl-CoA dependent acetyltransferase activity in the presence of [14C] acetyl-CoA, resulting in an effect of increasing acetylation of COX2. SphK1 has also been shown to regulate the secretion of neuroinflammatory termination regulators via acetylation of COX2.
  • the acetylation of COX2 by SphK1 occurs in the 565th serine of the amino acid sequence of COX2.
  • the amino acid sequence of COX2 in the present invention is GeneBank accession No. AAR23927.1, No. AAA58433.1, No. It can be confirmed through AAA57317.1 and the like, and more specifically, may be composed of the following amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the acetylating agent of COX2 is an inflammatory neuron in Alzheimer's animal model, Nymanpic animal model, and Amyotrophic lateral sclerosis animal model. It was confirmed that the effect of reducing the cells, improving memory, restoring the ability to exercise.
  • the COX2 acetylating agent refers to a substance that induces acetylation of any one or more amino acids of the amino acid sequence of COX2, and preferably, enhances the activity or expression of SphK1 or induces COX2 acetylation to induce amyloid- It is characterized by suppressing the deposition of ⁇ and promoting the secretion of neuroinflammatory termination regulators in neurons.
  • COX2 acetylating agent in the present invention may be preferably characterized by acetylating the 565 th serine of COX2.
  • the COX2 acetylating agent may be preferably a compound represented by the following formula (1).
  • R 1 is hydrogen, substituted or unsubstituted C 1 -C 10 straight or branched alkyl or -H 2 PO 3 ;
  • R 2 is hydrogen or substituted or unsubstituted C 1 -C 10 straight or branched alkyl
  • N is an integer of 1 to 15.
  • the 'substituted' in the 'substituted or unsubstituted' is deuterium, cyano group, halogen group, hydroxy group, nitro group, alkyl group of 1 to 24 carbon atoms, halogenated alkyl group of 1 to 24 carbon atoms, alke of 2 to 24 carbon atoms Nyl group, C2-C24 alkynyl group, C1-C24 heteroalkyl group, C6-C24 aryl group, C6-C24 arylalkyl group, C2-C24 heteroaryl group, or C2-C24 heteroaryl Alkyl group, C1-C24 alkoxy group, C1-C24 alkylamino group, C6-C24 arylamino group, C1-C24 heteroarylamino group, C1-C24 alkylsilyl group, C6-C24 aryl It means to be substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a silyl group,
  • the range of carbon number of the alkyl group of C1 to C10 is a portion in which the substituent is substituted It means the total carbon number constituting the alkyl moiety when not considered to be unsubstituted.
  • R 1 is preferably hydrogen, C1 ⁇ C7 linear or branched alkyl or -H 2 PO 3 , more preferably hydrogen, C1 ⁇ C5 linear or branched alkyl or -H 2 PO 3 And most preferably hydrogen or -H 2 PO 3 .
  • R2 may preferably be hydrogen or substituted or unsubstituted C1 to C7 linear or branched alkyl, more preferably hydrogen or substituted or unsubstituted C1 to C5 linear or branched alkyl. More preferably, they may be C1-C3 linear or branched alkyl, and most preferably methyl.
  • n may preferably be an integer of 3 to 15, more preferably an integer of 7 to 15, even more preferably an integer of 9 to 13, most preferably 10 to 12 days Can be.
  • the degenerative neurological disease is Alzheimer's disease, Parkinson's disease, advanced nuclear palsy, multi-system atrophy, olive nucleus- glial-cerebellar atrophy (OPCA), Shin-Dragger syndrome, striatum-black degenerative disease, Huntington's disease, muscular dystrophy Selected from the group consisting of lateral sclerosis (ALS), essential tremor, cortical-basal nucleus degeneration, diffuse Lewis body disease, Parkin-ALS-dementia complications, Niemann-Pick disease, pick disease, cerebral ischemia and cerebral infarction It may be one or more, but is not limited thereto.
  • ALS lateral sclerosis
  • essential tremor cortical-basal nucleus degeneration
  • diffuse Lewis body disease Parkin-ALS-dementia complications
  • Niemann-Pick disease pick disease
  • cerebral ischemia and cerebral infarction It may be one or more, but is not limited thereto.
  • compositions according to the invention may contain a COX2 acetylating agent alone or further contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may further include, for example, carriers for oral administration or carriers for parenteral administration.
  • Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
  • carriers for parenteral administration may include water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid. Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following documents (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to any mammal, including humans.
  • it can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared in an injectable formulation and administered by lightly pricking the skin with a 30 gauge thin needle or by applying it directly to the skin.
  • composition of the present invention may be formulated into a preparation for oral or parenteral administration according to the route of administration as described above.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art as powders, granules, tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions and the like.
  • oral formulations can be obtained by tablets or dragees by combining the active ingredients with solid excipients, milling them, adding suitable auxiliaries and then processing them into granule mixtures.
  • excipients examples include sugars including lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol and maltitol and starch, cellulose, including starch, corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, etc. Fillers such as cellulose, gelatin, polyvinylpyrrolidone, and the like, including methyl cellulose, sodium carboxymethylcellulose, hydroxypropylmethyl-cellulose, and the like. In addition, crosslinked polyvinylpyrrolidone, agar, alginic acid or sodium alginate and the like may optionally be added as a disintegrant. Furthermore, the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, a preservative, and the like.
  • Formulations for parenteral administration may be formulated by methods known in the art in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, humectants, gels, aerosols and nasal inhalants. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour, a prescription generally known in all pharmaceutical chemistries.
  • the total effective amount of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to a patient in a single dose and may be administered by a fractionated treatment protocol which is administered in multiple doses for a long time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the extent of the disease.
  • the total dose of the pharmaceutical composition of the present invention may be about 0.01 ug to 1,000 mg, most preferably 0.1 ug to 100 mg per kg of patient body weight per day.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is effective for the patient in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion rate, as well as the route and frequency of treatment.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to its formulation, route of administration and method of administration as long as the effect of the present invention is shown.
  • the present invention also provides a method for screening an agent for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising the following steps:
  • step (d) treating the test substance selected in step (c) to cells expressing COX2 protein;
  • the cells expressing the mRNA or protein of SphK1 include cells in which endogenous expression or transiently high expression of the mRNA or protein of SphK1, or by introducing a nucleic acid encoding SphK1 into the cell, It can be used to be overexpressed by switching, but is not particularly limited thereto.
  • protein is used interchangeably with “polypeptide” or “peptide”, for example, refers to a polymer of amino acid residues as commonly found in natural proteins.
  • the 'polynucleotide' or 'nucleic acid' refers to a deoxyribonucleotide (DNA) or ribonucleotide (RNA) in the form of a single- or double-stranded.
  • DNA deoxyribonucleotide
  • RNA ribonucleotide
  • known analogues of natural nucleotides that hybridize to nucleic acids in a similar manner to naturally occurring nucleotides are also included.
  • 'mRNA' is an RNA that transfers genetic information of a nucleotide sequence of a specific gene to ribosomes forming a polypeptide during protein synthesis.
  • test substance refers to an unknown substance used in screening to examine whether it affects the acetylation of COX 2.
  • the test substance may be siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA), miRNA (microRNA), ribozyme (ribozyme), DNAzyme, peptide nucleic acids (PNA), antisense oligonucleotides, antibodies, aptamers, natural extracts or Including but not limited to chemicals.
  • the cells used in the step (a) may be provided in the form of a laboratory animal, in this case the screening method of the present invention further comprises the step of inducing a degenerative neurological disease in the experimental animal, and
  • the contact of parenteral includes, but is not limited to, parenteral or oral administration, stereotactic injection, and those skilled in the art will be able to select an appropriate method for testing the test substance in animals.
  • Treating a test substance means adding the test substance to a cell or tissue culture medium and then culturing the cells for some time.
  • contact with the test substance is not limited to those including parenteral or oral administration or stereotactic injection, and those skilled in the art can select an appropriate method for testing the test substance in the animal. will be.
  • the mRNA expression level of SphK1 is measured by RT-PCR, quantitative or semi-quantitative RT-PCR (Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), quantitative or semi-quantitative real time RT-PCR (Quentitative or Semi-Quentitative real-time RT-PCR), northern blot (northern blot) and may be measured using a DNA or RNA chip (chip), but is not limited thereto.
  • the protein expression level of SphK1 is measured by Western blot, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, Ochterlony immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation Analysis, complementary analysis, FACS and can be measured using any one method selected from the group consisting of protein chips, but is not limited thereto.
  • the cell expressing the COX2 protein includes cells in which the COX2 protein is endogenous or transiently expressed, or is transformed by introducing a nucleic acid encoding COX2 into the cell. It can be used to be overexpressed by, but is not particularly limited thereto.
  • the method for measuring the degree of acetylation of COX2 in the step (e) of the present invention may be selected from the group consisting of radiographs, liquid scintillation counting, molecular weight analysis and liquid chromatography mass analysis, but is not limited thereto. .
  • the COX2 protein of neurons reacted in the presence of [ 14 C] acetyl-CoA in the above method was isolated by immunoprecipitation method, and then the degree of acetylation of COX2 using liquid scintillation counting for [ 14 C]. was evaluated.
  • the activation of SphK1 promotes the acetylation of COX2 to induce the secretion of neuroinflammatory termination regulators in neurons, thereby exerting the effect of alleviating neuroinflammatory inflammation.
  • the activation of SphK1 has the effect of restoring the function of microglia, which exhibit the phagocytosis of A ⁇ , to alleviate the lesions of various degenerative neurological diseases caused by the accumulation of A ⁇ .
  • the screening method for preventing or treating neurodegenerative diseases in the present invention comprises a test substance for acetylating the 565th serine of COX2. It may be characterized by selecting.
  • the present invention also provides a method of preparing a biological sample comprising (a) providing a biological sample from a patient suspected of degenerative neurological disease;
  • the secretion of COX2 acetylation and neuroinflammatory terminating factor in the brain of Alzheimer's animal was significantly reduced compared to wild type. Therefore, if the expression of SphK1 mRNA or protein is reduced and the acetylation of COX2 is decreased in biological samples obtained from patients with suspected neurodegenerative disease, degenerative neuropathy can be determined in the patient. have.
  • the expression of the mRNA or protein of SphK1 and the acetylation of COX2 are not only lowered, and the expression level of the neuroinflammatory termination regulator is further reduced, it is possible to determine whether the neurodegenerative disease is progressing more accurately. have.
  • the biological sample includes, but is not limited to, samples such as brain tissue, brain cells, cerebrospinal fluid, whole blood, serum, plasma, saliva, sputum, urine, and the like, preferably brain tissue, brain cells or Cerebrospinal fluid.
  • step (b) The method for measuring the expression level of SphK1 mRNA or protein in step (b) and the method for measuring the degree of acetylation of COX2 are as described above.
  • the present invention also provides the use of a cyclooxygenase-2 acetylating agent for the preparation of a preparation for preventing or treating neurodegenerative diseases.
  • the present invention also provides a method for treating neurodegenerative disorders, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition comprising a COX2 (cyclooxygenase-2) acetylating agent.
  • a composition comprising a COX2 (cyclooxygenase-2) acetylating agent.
  • the term 'effective amount' of the present invention when administered to an individual, refers to an amount that exhibits an effect of improving, treating, preventing, detecting, diagnosing, or inhibiting a neurodegenerative disease or depressing or reducing the neurodegenerative disease. It may be a mammal, especially an animal including a human, and may be cells, tissues, organs or the like derived from the animal. The subject may be a patient in need of the effect.
  • treatment' of the present invention refers generically to ameliorating the symptoms of degenerative neurodegenerative or degenerative neurological diseases, which may include treating, substantially preventing, or improving the condition of degenerative neurological disease, It includes, but is not limited to, alleviating, healing or preventing one or most of the symptoms resulting from degenerative neurological disease.
  • the term 'comprising' of the present invention is used in the same way as 'containing' or 'characteristic', and does not exclude any additional component elements or method steps that are not mentioned in the composition or method. .
  • the term 'consisting of' means to exclude additional elements, steps or components, etc., unless otherwise noted.
  • the term “essentially consisting of” means within the scope of a composition or method, including the component elements or steps described, as well as the component elements or steps that do not substantially affect its basic properties, and the like.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative neurological disease comprising the COX2 acetylating agent of the present invention as an active ingredient, has an effect of promoting neuroinflammatory termination regulator secretion in neurons to alleviate neuroinflammation. It can be very useful for the development of prophylactic or therapeutic agents.
  • 1A to 1F show the result of acetylation of SphK1 to S565 of COX2 as an Acetyltransferase.
  • 1A and 1B show the results of evaluation of binding (a) and dissociation degree (b) of SphK1 and acetyl-CoA.
  • Figure 1c is the result of evaluating COX2 acetylation in the presence of SphK1, acetyl-CoA, sphingosine ([ 14 C] aspirin treated test group was set as a positive control).
  • Figure 1d is the result of confirming the molecular weight change by acetylation of COX2 in the presence of SphK1, acetyl-CoA and / or sphingosine using LC-MS / MS.
  • Figure 1e is a result confirming that acetylation occurs in the S565 residue of COX2 in the presence of SphK1, acetyl-CoA and / or sphingosine using LC-MS / MS.
  • Figure 1f is a result of confirming that when mutated to S565 of the COX2 protein, acetylation does not occur well.
  • 2A to 2D show that when SphK1 is inhibited, neuroinflammatory termination regulators are reduced by decreasing COX2 acetylation.
  • Figure 2a is the result of evaluating the expression of SphK1 and SphK2 when treated with SphK1 siRNA in wild-type (WT) neurons.
  • Figure 2b is a result of confirming the acetylation of COX2 protein when treated with SphK1 siRNA to neurons ([ 14 C] aspirin-treated wild-type neurons set as a positive control).
  • Figure 2c is the result of confirming the secretion of neuroinflammatory termination regulatory factors (SPMs), such as LxA4, RvE1 and RvD1 when treated with SphK1 siRNA in neurons.
  • SPMs neuroinflammatory termination regulatory factors
  • Figure 2d is a result of confirming the secretion of 15-R-LxA4 using LC-MS / MS when treated with SphK1 siRNA to neurons.
  • 3A to 3C show that APP / PS1 mice have reduced COX2 acetylation and neuroinflammatory termination regulatory factors (SPMs) secretion, and this reduction is ameliorated by overexpression of SphK1.
  • SPMs neuroinflammatory termination regulatory factors
  • Figure 3a is the result of performing the acetylation assay of COX2 protein in neurons derived from wild type, APP / PS1, APP / PS1 / SphK1 tg and SphK1 tg mice.
  • Aspirin-treated neurons were set as positive controls.
  • Figure 3b is the result of measuring the protein amount of LxA4 and RvE1 in CM of neurons derived from wild type, APP / PS1, APP / PS1 / SphK1 tg and SphK1 tg mice.
  • 3C is a specific result of the amount of 15-R-LxA4 using LC-MS / MS in neurons derived from wild-type, APP / PS1, APP / PS1 / SphK1 tg and SphK1 tg mice.
  • 4A to 4C show that neuroinflammatory termination regulators secreted by increased SphK1 in APP / PS1 mice reduce neuroinflammatory inflammation.
  • FIG. 4A shows immunofluorescent images (left) of microglia (Iba1) and the results of quantification thereof (right) in the cerebral cortex of wild type, APP / PS1, APP / PS1 / SphK1 tg and SphK1 tg mice.
  • Figure 4b is a result showing the immunofluorescence image of glial cells (GFAP) in the brain cortex of the mouse (left) and the result of quantification (right).
  • GFAP glial cells
  • Figure 4 is the result of evaluating the mRNA expression level of M1 and M2 inflammatory markers in the brain of the mouse (M1 marker: TNF-a, IL-1b, IL-6 and iNOS, immunomodulatory factor: IL10, M2 marker: IL- 4, TGF-b and Arg 1).
  • 5A to 5F show that neuroinflammatory termination regulators secreted by increased SphK1 improve the phagocytosis of microglia.
  • Figure 5a shows the results of microglia around A ⁇ plaques in the brain cortex of APP / PS1 and APP / PS1 / SphK1 tg mice.
  • Figure 5b is a result of confirming the phagocytosis ability of microglia in the brain cortex of wild type, APP / PS1, APP / PS1 / SphK1 tg and SphK1 tg mice.
  • Figure 5c is a result confirmed that A ⁇ plaques are digested in the lysosome of microglia in the brain cortex of APP / PS1 and APP / PS1 / SphK1 tg mice.
  • FIG. 5d e is a result of confirming the expression of ⁇ degradation enzymes (NEP, MMP9 and IDE) and phagocytic markers (CD36) in microglia of wild type, APP / PS1, APP / PS1 / SphK1 tg and SphK1 tg mice.
  • Figure 5f is the result of confirming the size of A ⁇ plaques phagocytosis occurred in the brain cortex of APP / PS1 and APP / PS1 / SphK1 tg mice.
  • 6A-6I show that neuroinflammatory termination regulators secreted by increased SphK1 reduce APP lesions in APP / PS1 mice.
  • Figure 6b, c is the result of analyzing the accumulation of A ⁇ 40 and A ⁇ 42 in the mouse brain by immunofluorescence staining (b) or ELISA kit (c).
  • Figure 6d is the result of vascular quantification.
  • Figure 6e is the result of tau protein quantification.
  • Figure 6f-i shows the results of immunofluorescence staining and quantification of synaptopycin (f), MAP2 (g), synapsin 1 (h) or PSD95 (i) in the brain cortex of each animal group.
  • 7b-d measure the time spent on the target platform on day 11 (b), the time spent on the other quadrant (c), and the length of the path, the swimming speed, and each animal in the small target area for 60 seconds. It is the result of measuring the number of times d entered.
  • Figure 7g is a result of measuring the time spent on the wall and the center during the open field test and the ratio showing the ratio of the center.
  • 7H shows the movement path of the mouse during the openfield test.
  • FIG. 8A shows the chemical structure of a COX2 acetylating agent.
  • Figure 8b is a result confirming the secretion of neuroinflammatory termination regulators (SPMs) by treatment with COX2 acetylating agent.
  • SPMs neuroinflammatory termination regulators
  • Figure 8d is a result confirming that acetylation occurs in the S565 residue of COX2 in the presence of N-acetyl sphingosine using LC-MS / MS.
  • 9A to 9D show that COX2 acetylating agents promote the secretion of neuroinflammatory termination regulators to reduce AD lesions in Alzheimer's animal models.
  • FIG. 9A shows immunofluorescence images (left) of microglia (Iba1) in the brain cortex of mice injected with N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine derivative) and S1P in wild-type, APP / PS1, APP / PS1 and quantified them The result (right) is shown.
  • Figure 9b is a result showing the immunofluorescence image of glial cells (GFAP) in the brain cortex of the mouse (left) and the result of quantification (right).
  • 9C shows immunofluorescence staining of thioflavin S (ThioS, A ⁇ plaques) in cerebral medulla and hippocampus of mice injected with N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine derivative) and S1P in APP / PS1 and APP / PS1 It is the result of quantifying the area occupied by (upper) and A ⁇ (bottom).
  • Figure 9d is a result of learning and memory evaluation through the Morris Water Maze test of mice injected with N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine derivative) and S1P in wild-type, APP / PS1, APP / PS1.
  • 10A to 10D confirm that the COX2 acetylating agent promotes the release of neuroinflammatory termination regulators, thereby reducing lesions in the Nimanpick (NP-C) animal model.
  • FIG. 10A shows immunofluorescence images (top) of microglia (Iba1) and the results of quantification thereof (bottom) in the cerebral cortex of wild-type mice, NP-C mice, and NP-C mice injected with N-acetyl sphingosine. will be.
  • FIG. 10B shows immunofluorescence images (top) and quantification results (GF) of glial cells (GFAP) in the cerebral cortex of wild-type mice, NP-C mice, and NP-C mice injected with N-acetyl sphingosine. to be.
  • Figure 10c is a result of Rota-rod experiments confirmed the locomotor ability of wild-type mice, NP-C mice, and NP-C mice injected with N-acetyl sphingosine.
  • Figure 10d is a result of confirming the exercise ability of wild-type mice, NP-C mice, and NP-C mice injected with N-acetyl sphingosine through the beam test.
  • FIG. 11A shows immunofluorescence images of microglia (Iba1) (top) and results of quantification thereof (bottom) in the cerebral cortex of wild-type mice, FUS mice, and FUS mice injected with N-acetyl sphingosine.
  • FIG. 11B shows immunofluorescence images of glial cells (top) and quantification of them (bottom) in the cerebral cortex of wild-type mice, FUS mice, and FUS mice injected with N-acetyl sphingosine.
  • Figure 11c is a result of confirming the locomotor ability of wild type mice, FUS mice, and FUS mice injected with N-acetyl sphingosine through the tail suspension test.
  • FIG. 11D shows the results of Rota-rod experiments on the motility of wild-type mice, FUS mice, and FUS mice injected with N-acetyl sphingosine.
  • Figure 11e is a result of confirming the mobility of the wild type mice, FUS mice, and FUS mice injected with N-acetyl sphingosine through the Hanging wired test.
  • mice The mouse experiment was approved by the Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
  • IACUC Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee
  • APP mouse mouse overexpressing APPswe
  • PS1 mouse presenilin Mice overexpressing -1M146V; GlaxoSmithKline.
  • APP / PS1 / SphK1 tg mice were prepared by crossing SphK1 tg (SphK1 gene overexpressing mouse) with APP mice and APP / PS1 mice as Alzheimer's (AD) animal models.
  • NPC mutant mice lacking Balb / C (Orient, Wild type), NPC1 genes (provided by RIKEN, Japan, NP-C mice); And from 4 to 6 weeks of age, severe motor failure occurred, tremors and seizures of the limbs, and life span of about 9 to 10 weeks.
  • ALS atrophic lateral sclerosis
  • FUS transgenic mouse
  • SphK1 siRNA (Dharmacon SMART pool) and siRNA control group (Dharmacon) were treated for 48 hours in neurons of E18 C57BL / 6 mice. Neurons were collected and analyzed for acetylation and neuroinflammatory termination regulators.
  • mice After fixing the cerebral and hippocampus of mice, anti-20G10 (mouse, 1: 1000) against amyloid- ⁇ (A ⁇ ) 42 and anti-G30 (rabbit, 1: 1000), anti-MAP2 (chicken, against A ⁇ 40) 1: 2000), anti-Synaptophysin (mouse, 1: 100), anti-Synapsin1 (rabbit, 1: 500), anti-PSD95 (mouse, 1: 100), anti-Iba-1 (rabbit, 1: 500) , Anti-GFAP (rabbit, 1: 500) were incubated together.
  • the sites were analyzed using a laser scanning confocal microscope or Olympus BX51 microscope equipped with Fluoview SV1000 imaging software (Olympus FV1000, Japan). Metamorph software (Molecular Devices) was used to quantify the percentage of area of stained area to area of total tissue.
  • ELISA kit Biosource
  • Biosource was used, and the hemispheres of the mice were homogenized and placed in a buffer containing 0.02M guanidine to prepare a sample for A ⁇ ELISA.
  • conditional media CM
  • ELISA was performed for A ⁇ and SPM according to the manufacturer's manual.
  • fear water experiments with fear water maze were performed.
  • MWM trained the mice 4 times a day for 10 days, removed the platform on day 11, and performed a probe trial.
  • Fear conditioning on the first day put the mouse in the conditioning chamber and gave sound stimulation (10 kHz, 70 dB) and electrical stimulation (0.3 mA, 1 s).
  • the memory of the room was confirmed without stimulation in the same conditioning chamber as on the first day.
  • the memory test of fear was performed when only the sound stimulation was given in the other conditioning chamber.
  • Open field tests were performed to assess motor performance and immediate activity. In the openfield test, the mouse was placed in a rectangular box for 10 minutes to measure the overall athleticism, time and distance.
  • Rota-rod tests Ugo Basile, Comerio, VA, Italy
  • Rota-rod tests are performed three times or more Rota-rod movements at a rotational speed of 4 rpm on machines equipped with properly machined rods of 3 cm diameter to provide grip.
  • the endurance time of the test animals was measured in seconds, and the average value was recorded.
  • Each Rota-rod exercise test did not exceed 5 minutes per session.
  • the beam test measured the time it took to move the mouse to the end point after placing the mouse at the start point of the 12mm wide bar.
  • the tail of the mouse was fixed with a tape at a distance of 20-25 cm from the floor, and then the time of withering the mouse was measured for 10 minutes.
  • the hanging wired test measures the time it takes for the mouse to fall after placing the grid 42cm away from the floor.
  • acetyl-CoA binding activity of sphK1 was analyzed by filter binding assay in the presence of 10 mM sphingosine. Vbinding of [ 3 H] acetyl-CoA to SphK1 is shown as acetyl-CoA concentration. Nonlinear regression analysis of saturation plots showed acetyl-CoA and SphK1 binding activity using K cat (catalyst constant) and K M (Michaelis-Menten constant).
  • neurons were isolated from 9-month-old WT, APP / PS1, APP / PS1 / SphK1 tg and SphK1 tg mice. Neurons were sonicated and incubated with 2.5 mM acetyl-CoA (Sigma) (24 hours, 37 ° C.). In addition, CM was harvested from neurons treated with SphK1 siRNA or control siRNA.
  • the COX2 enzyme was precipitated with trichroloacetic acid (Merck) and dried.
  • the dried extract was resuspended in 10 ⁇ L of 5M urea solution and incubated with 0.1 ⁇ g trypsin (Promega) at 37 ° C. for 16 hours at 0.1 ° C.
  • the samples were then treated with 1M DTT (GE Healthcare) for 1 hour at room temperature and then alkylated with 1M iodoacetamide (Sigma) for 1 hour.
  • Protein samples were loaded onto a ZORBAX 300SB-C18 column for sequencing. Peptides were identified with BioTools 3.2 SR5 (Bruker Daltonics).
  • CM was prepared by culturing neurons from the mouse cerebrum and treating 10 nM N-acetyl sphingosine 1 phsosphate (Toronto Research chemicals, C262710) and N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912).
  • N-acetyl sphingosine 1 phsosphate Toronto Research chemicals, C262710
  • N-acetyl sphingosine Sigma, 01912
  • COX2 acetylation analysis neurons were cultured from mouse cerebrum and then treated with 2 uCi [ 14 C] N-acetyl sphingosine (ARC, ARC1024).
  • mice 7 mg of APP / PS1 mice were injected with 5 mg / kg N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912), 1 mg / kg FTY720, and 3 uM S1P via intraperitoneal injection daily for 4 weeks. It was. 5 mg / kg N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912) was injected into 1 month-old NPC mice and 30 mg / kg N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912) was injected into subcutaneous injections daily for 4 weeks.
  • SphK1 is an acetyltransferase that induces acetylation of the S565 residue of COX2
  • SphK1, acetyl-CoA and sphingosine were treated with COX2 to identify the acetylation site of COX2 acetylated by SphK1.
  • Wild type COX2 was acetylated by SphK1 and sphingosine, but S565A mutated COX2 had decreased acetylation in the presence of SphK1, indicating that S565 of COX2 is the major target site for SphK1-mediated COX2 acetylation (FIG. 1F).
  • the acetylation of COX2 S565 by SphK1 is different from the position at which aspirin is acetylated (S516).
  • 15-R-LxA4 produced by COX2 acetylation was reduced in neurons treated with SphK1 siRNA when neuroinflammatory termination regulators were measured using LC-MS / MS (FIG. 2D). That is, when SphK1 was inhibited, it was confirmed that the neuroinflammatory termination regulator (particularly 15-R-LxA4) was decreased by the reduction of COX2 acetylation.
  • the Alzheimer's animal model has reduced COX2 acetylation and neuroinflammatory termination regulator secretion, which is improved by SphK1 overexpression.
  • the present inventors treated [ 14 C] acetyl-CoA in neurons isolated from 9-month-old mice and analyzed the degree of acetylation by treating the neurons isolated from 9-month-old mice to confirm whether the results after treatment with SphK1 siRNA also occur in an Alzheimer's animal model. .
  • low levels of COX2 acetylation were observed in neurons of APP / PS1 mice, and COX2 acetylation was increased in neurons of APP / PS1 / SphK1 tg mice (FIG. 3A).
  • LxA4 and RvE1 expression levels were significantly decreased in CM derived from APP / PS1 neurons than in CM derived from wild type neurons, and recovered in CM derived from APP / PS1 / SphK1 tg neurons (FIG. 3B). .
  • 15-R-LxA4 produced by COX2 acetylation was decreased in the Alzheimer's animal model and recovered when overexpressed SphK1 when the neuroinflammatory termination regulator was measured by LC-MS / MS. 3c). That is, the secretion of COX2 acetylation and neuroinflammatory termination regulators is reduced in the Alzheimer's animal model, which means that it can be improved by overexpression of SphK1.
  • the present inventors observed changes in microglia and astroglia to determine the effect of increased SphK1 on neuroinflammatory responses by secreting neuroinflammatory termination regulators.
  • APP / PS1 / SphK1 tg mice showed marked degradation of microglia and astroglia compared to APP / PS1 mice (FIGS. 4A, B).
  • APP / PS1 / SphK1 tg mice showed a decrease in pro-inflammatory M1 markers and immunomodulatory cytokines and increased expression of anti-inflammatory M2 markers compared to APP / PS1 mice (FIG. 4C).
  • the number of microglia around the plaques was quantified to determine whether the neuroinflammatory termination regulators secreted by increased SphKl restored Aglial recruitment to microglia. As a result, the recruitment of microglia was increased in APP / PS1 / SphK1 tg mice compared to APP / PS1 mice (FIG. 5A).
  • phagocytic assays were performed using brain sections.
  • the number of microglia showing phagocytosis was increased in APP / PS1 / SphK1 tg mice compared to APP / PS1 mice (FIG. 5B).
  • the ⁇ phagocytosis of microglia was evaluated in vivo.
  • APP / PS1 / SphK1 tg brains had an increased number of microglia stained with lysosomes and A ⁇ .
  • phagolysosomes in microglia were increased in the cortex of APP / PS1 / SphK1 tg mice compared to APP / PS1 mice.
  • Microglia analysis associated with plaques revealed an increase in the percentage of cells containing A ⁇ incorporated into pagososomes in APP / PS1 mice overexpressed SphK1.
  • the amount of A [beta] contained in pagososomes was increased in the brain of APP / PS1 / SphK1 tg mice (FIG. 5C).
  • a ⁇ degrading enzymes such as Neprilysin (NEP), matrix metallopeptidase 9 (MMP9), and insulin degrading enzyme (IDE) were analyzed. Although the expression levels of these enzymes did not change, CD36, which was known to increase when microglia phagocytosis occurred, was recovered in APP / PS1 / SphK1 tg mice (FIG. 5D, e).
  • a ⁇ profiles were first identified. Thioflavin S (ThioS) staining, immunofluorescence staining and ELISA experiments of A [beta] 40 and A [beta] 42 showed significantly lower A [beta] in APP / PS1 / SphK1 tg mice compared to APP / PS1 mice (FIGS. 6A-C). Amyloid angiopathy in the brain was also reduced in APP / PS1 / SphK1 tg mice (FIG. 6D).
  • Thioflavin S (ThioS) staining, immunofluorescence staining and ELISA experiments of A [beta] 40 and A [beta] 42 showed significantly lower A [beta] in APP / PS1 / SphK1 tg mice compared to APP / PS1 mice (FIGS. 6A-C). Amyloid angiopathy in the brain was also reduced in APP / PS1 / SphK1 tg mice (FIG.
  • the present inventors conducted a series of experiments to directly determine whether a compound capable of inducing acetylation of COX2 would have a prophylactic or therapeutic effect on neurodegenerative diseases.
  • N-acetyl sphingosine 1 phsosphate and N-acetyl sphingosine may induce acetylation of COX2, and the following experiment was performed using this (FIG. 8A).
  • N-acetyl sphingosine 1 phsosphate or N-acetyl sphingosine was treated with APP / PS1 neurons, Expression level was confirmed. As a result, it was confirmed that LxA4 and RvE1 expression levels in neurons of APP / PS1 mice were recovered when N-acetyl sphingosine 1 phsosphate or N-acetyl sphingosine was treated (FIG. 8B).
  • the compounds induce COX2 acetylation to promote the secretion of neuroinflammatory termination regulators, and in particular, the S565 acetylation of COX2 in the treatment of degenerative neuropathy by directly confirming that this acetylation occurs in S565 of COX2.
  • the compounds could be a very important therapeutic target.
  • COX2 acetylating agent stimulates the release of neuroinflammatory termination regulators to reduce AD lesions in Alzheimer's animal models.
  • the present inventors confirmed the AD lesion by injecting N-acetyl sphingosine, one of the COX2 acetylating agents identified through the experiment, into an APP / PS1 animal model.
  • N-acetyl sphingosine one of the COX2 acetylating agents identified through the experiment
  • APP / PS1 animal model In order to determine the effects of N-acetyl sphingosine on neuroinflammatory responses by releasing neuroinflammatory termination regulators, microglial and astrocytic changes were observed.
  • APP / PS1 mice injected with N-acetyl sphingosine showed significant degradation of microglia and astroglia compared to APP / PS1 mice (FIGS. 9a, b).
  • COX2 acetylating agents unlike S1P and sphingosine derivatives such as FTY720, promote the secretion of neuroinflammatory termination regulators, thereby reducing AD lesions such as decreased neuroinflammatory, decreased A ⁇ deposition, and improved memory in APP / PS1 mice. It confirmed that the effect is shown.
  • COX2 acetylating agent ameliorates nimanic lesions in NP-C mice.
  • the present inventors injected N-acetyl sphingosine, one of the COX2 acetylating agents identified through the above experiment, into NP-C animal models to identify nematic lesions.
  • N-acetyl sphingosine one of the COX2 acetylating agents identified through the above experiment.
  • NP-C mice injected with N-acetyl sphingosine showed a marked decrease in microglia and astroglia compared with NP-C mice (Figs. 10a, b).
  • NP-C mice injected with N-acetyl sphingosinbe was confirmed to improve the motor capacity (Fig. 10c, d).
  • COX2 acetylating agent ameliorates ALS lesions in FUS mice.
  • the inventors of the present invention confirmed the ALS lesions by injecting N-acetyl sphingosine, one of the COX2 acetylating agents identified through the experiment, into an animal model of FUS R521C.
  • N-acetyl sphingosine one of the COX2 acetylating agents identified through the experiment
  • microglial and astrocytic changes were observed.
  • FUS R521C mice injected with N-acetyl sphingosine were found to decrease the activity of microglia and astroglia compared to FUS R521C mice (Fig. 11a, b).
  • FUS R521C mice injected with N-acetyl sphingosinbe was confirmed to improve the motor performance (Fig. 11c-e).
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative neurological diseases comprising the COX2 acetylating agent of the present invention as an active ingredient has the effect of relieving neuroinflammatory inflammation by promoting COX2 acetylation in neurons to secrete neuroinflammatory terminators. It can be very useful in the development of a preventive or therapeutic agent for neurological diseases, and thus has excellent industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 COX2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뇌 신경세포에서 아밀로이드-β의 침착을 억제하고, 과도한 신경염증 반응을 감소시키고, 미세아교세포의 아밀로이드-β에 대한 식작용을 증가시키는 효과를 나타내는 COX2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 COX2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 신경세포에서 COX2 아세틸화를 촉진하여 신경염증 종결 조절 인자(SPMs)를 분비함으로써 신경염증을 완화하는 효과가 있어, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

COX2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 출원은 2018년 3월 21일에 출원된 대한민국 특허출원 제10-2018-0032669호를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
본 발명은 COX2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 뇌 신경세포에서 아밀로이드-β의 침착을 억제하고, 뉴런에서 SPM(specialized proresolving mediator)의 분비를 촉진하는 효과가 있는 COX2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머(Alzheimer's disease, 이하 ‘AD'라 함)는 가장 일반적인 형태의 치매로서, 세포 밖 아밀로이드 플라그 및 응집된 아밀로이드 β(Aβ)로 이루어진 세포 내 신경섬유매듭의 축적이 특징적으로 나타나 결과적으로 인지 장애 및 치매 증상이 유발된다. 이러한 특징들 이외에도, 일반적으로 Aβ와 밀접하게 관련이 되어 있는 신경 아교세포(glia cell)(특히, 미세아교세포)의 조절장애 역시 관찰이 된다.
알츠하이머와 같은 퇴행성 신경질환 환자의 뇌에서 기능이 상실된 미세아교세포는 Aβ의 축적에 반응하거나 및/또는 감소된 Aβ 식작용에 의해 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인들을 분비함으로써 질환의 진행에 관여하고 있다. 미세아교세포의 기능 상실은 또한 만성적인 염증반응을 유발하기도 한다. 이러한 염증반응의 해결은 염증성 반응의 최종 단계에 있으며, Lipoxin A4(LxA4), Resolvin E1(RvE1) 및 Resolvin D1(RvD1)을 포함하는 SPMs(specialized proresolving mediator)라고 불리는 신경염증 종결 조절인자에 의해 염증성 반응이 해소될 수 있다. 이는 M1 표현형에서 M2로 편향되어 활성화된 표현형으로의 전환, 전-염증성 사이토카인의 하향조절(downregulation) 및 사멸세포 및 찌꺼지의 제거와 같은 신경아교세포의 기능을 회복시키는 결과를 가져온다. 최근 연구에 따르면, AD 환자에서 염증반응의 해소 기능 (SPMs)이 실조되어 있다는 것이 보고되고 있다.
스핑고신 카이나제(Sphingosine kinase, 이하 'SphK'라 함) 1 및 2는 스핑고신을 염증반응을 조절하는 것으로 알려져 있는 생리활성 지질인 스핑고신-1-포스페이트(S1P)로 전환하는데 관여하고 있는 핵심 효소이다. 최근, 염증반응에서 SphK의 역할이 다양한 질병(천식, 류마티스 관절염 등)에 관한 연구 주제가 되고 있다. 그러나, AD 환자의 뇌에서 신경염증반응에 대한 SphK의 역할은 충분히 연구가 되어 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 퇴행성 신경질환에서 SphK1의 역할을 밝히기 위해서 예의 노력을 기울인 결과, SphK1은 COX2(cyclooxygenase 2)의 아세틸화를 증가시킴으로써 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하고, 결과적으로 M2-유사한 표현형의 미세아교세포로의 전환을 유도함으로써 발휘된다는 것을 발견하였다. 또한, AD의 뇌에서 SphK1을 증가시키면 COX2의 아세틸화가 증가되고, 결과적으로 신경아교세포를 통한 Aβ 식작용이 개선되어 인지 장애를 개선할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 하기 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다:
(a) SphK1의 mRNA 또는 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
(c) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시킨 물질을 선별하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 시험물질을 COX2 단백질을 발현하는 세포에 처리하는 단계;
(e) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및
(f) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 COX2 단백질의 아세틸화 정도를 증가시킨 물질을 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
본 발명의 다른 목적은 (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료에서 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준 및 COX2의 아세틸화 정도를 정상인과 비교하여 그 정도가 감소된 환자를 퇴행성 신경질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 하기 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) SphK1의 mRNA 또는 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
(c) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시킨 물질을 선별하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 시험물질을 COX2 단백질을 발현하는 세포에 처리하는 단계;
(e) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및
(f) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 COX2 단백질의 아세틸화 정도를 증가시킨 물질을 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료에서 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준 및 COX2의 아세틸화 정도를 정상인과 비교하여 그 정도가 감소된 환자를 퇴행성 신경질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 신경세포에서 스핑고신 카이나제 1(sphingosine kinase 1, SphK1)의 발현이 저하되면 COX2 아세틸화 및 염증반응을 해소하는 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 저하되어 비정상적인 염증반응들이 일어나 알츠하이머-유사의 병변이 나타난다는 것을 확인하였다. 반면에, SphK1의 발현이 증가되면 신경세포에서 COX2 아세틸화 및 염증반응을 해소하는 신경염증 종결 조절 인자의 분비 증가되고, 미세아교세포의 기능 회복 및 이로 인한 Aβ 식작용이 향상되어 결과적으로 알츠하이머-유사 병변이 완화된다는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 알츠하이머성 신경세포에서는 COX2의 아세틸화가 저하되어 있으며, 이러한 신경세포에서의 COX2 아세틸화가 SphK1에 의해 특이적으로 조절된다는 것을 확인하였다. 즉, 신경세포의 SphK1은 [14C]acetyl-CoA의 존재하에서 acetyl-CoA 의존적인 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase) 활성을 나타냈으며, 결과적으로 COX2의 아세틸화를 증가시키는 작용을 나타냈다. 또한, SphK1는 COX2의 아세틸화를 통해 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 조절하는 것으로 확인되었다.
본 발명의 다른 일실시예에 따르면, SphK1에 의한 COX2의 아세틸화는 COX2의 아미노산 서열 중 565번째 세린에서 나타난다는 것을 확인하였다. 본 발명에서 상기 COX2의 아미노산 서열은 GeneBank accession No.AAR23927.1, No.AAA58433.1, No. AAA57317.1 등을 통해서 확인할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 1로 표시되는 하기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[서열번호 1]
mlaralllca vlalshtanp ccshpcqnrg vcmsvgfdqy kcdctrtgfy gencstpefl
triklflkpt pntvhyilth fkgfwnvvnn ipflrnaims yvltsrshli dspptynady
gyksweafsn lsyytralpp vpddcptplg vkgkkqlpds neiveklllr rkfipdpqgs
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aggrnvppav qkvsqasidq srqmkyqsfn eyrkrfmlkp yesfeeltge kemsaeleal
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gfqiintasi qslicnnvkg cpftsfsvpd peliktvtin asssrsgldd inptvllker
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특히, 본 발명의 일실시예에 따르면 COX2의 아세틸화제, 보다 구체적으로는 COX2 단백질의 565번째 아미노산인 세린을 아세틸화시키는 제제는 알츠하이머 동물모델, 니만픽 동물모델 및 근위축성 측색 경화증 동물모델에서 염증성 신경세포의 감소, 기억력 개선, 운동능력 회복 등의 효과를 나타내는 것으로 확인이 되었다.
이와 같이, (i) 신경세포에서 SphK1이 증가되면 COX2 아세틸화가 증가되어 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 촉진되며, 결과적으로 퇴행성 신경질환의 진행이 효과적으로 차단될 수 있다는 것 및 (ii) SphK1에 의한 COX2의 아세틸화는 COX2의 아미노산 서열 중 565번째 세린에서 나타난다는 것, 및 (iii) COX2의 아세틸화 제제, 보다 구체적으로는 COX2 단백질의 565번째 아미노산인 세린을 아세틸화 시키는 제제는 퇴행성 신경질환에 치료효과를 나타낼 수 있다는 것은 본 발명자가 본 발명을 통해서 처음으로 공개하는 것이다.
따라서, 본 발명에서 상기 COX2 아세틸화제란 COX2의 아미노산 서열 중 어느 하나 이상의 아미노산의 아세틸화를 유도하는 물질을 의미하며, 바람직하게는 SphK1의 활성 또는 발현을 증진시키거나 COX2 아세틸화를 유도하여 아밀로이드-β의 침착을 억제하고, 신경세포에서 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하는 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 COX2 아세틸화제는 바람직하게는 COX2의 565번째 세린을 아세틸화 시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 COX2 아세틸화제는 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 할 수 있다.
[화학식 1]
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상기 식에서,
R 1은 수소, 치환 또는 비치환의 C1~C10의 직쇄 또는 측쇄의 알킬 또는 -H 2PO 3이며;
R 2는 수소 또는 치환 또는 비치환의 C1~C10의 직쇄 또는 측쇄의 알킬이며;
상기 n은 1~15의 정수이다.
여기서, 상기 '치환 또는 비치환'에서의 '치환'은 중수소, 시아노기, 할로겐기, 히드록시기, 니트로기, 탄소수 1 내지 24의 알킬기, 탄소수 1 내지 24의 할로겐화된 알킬기, 탄소수 2 내지 24의 알케닐기, 탄소수 2 내지 24의 알키닐기, 탄소수 1 내지 24의 헤테로알킬기, 탄소수 6 내지 24의 아릴기, 탄소수 7 내지 24의 아릴알킬기, 탄소수 2 내지 24의 헤테로아릴기 또는 탄소수 2 내지 24의 헤테로아릴알킬기, 탄소수 1 내지 24의 알콕시기, 탄소수 1 내지 24의 알킬아미노기, 탄소수 6 내지 24의 아릴아미노기, 탄소수 1 내지 24의 헤테로아릴아미노기, 탄소수 1 내지 24의 알킬실릴기, 탄소수 6 내지 24의 아릴실릴기, 탄소수 6 내지 24의 아릴옥시기로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 치환기로 치환되는 것을 의미한다.
한편, 본 발명에서의 상기 "치환 또는 비치환된 C1~C10의 직쇄 또는 측쇄 알킬기"에서 상기 알킬기의 범위를 고려하여 보면, 상기 C1~C10의 알킬기의 탄소수의 범위는 각각 상기 치환기가 치환된 부분을 고려하지 않고 비치환된 것으로 보았을 때의 알킬 부분을 구성하는 전체 탄소수를 의미하는 것이다.
본 발명에서 상기 R 1은 바람직하게는 수소, C1~C7의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 -H 2PO 3 일 수 있으며, 더 바람직하게는 수소, C1~C5의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 -H 2PO 3 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 수소 또는 -H 2PO 3 일 수 있다.
본 발명에서 상기 R2는 바람직하게는 수소 또는 치환 또는 비치환의 C1~C7의 직쇄 또는 측쇄의 알킬일 수 있으며, 더 바람직하게는 수소 또는 치환 또는 비치환의 C1~C5의 직쇄 또는 측쇄의 알킬일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 C1~C3의 직쇄 또는 측쇄의 알킬일 수 있으며, 가장 바람직하게는 메틸일 수 있다.
본 발명에서 상기 n은 바람직하게는 3~15의 정수일 수 있으며, 더 바람직하게는 7~15의 정수일 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 9~13의 정수일 수 있으며, 가장 바람직하게는 10~12일 수 있다.
본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽 병(Niemann-Pick disease), 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 COX2 아세틸화제를 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.
약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경구투여될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자(prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.
경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물의 전체 용량은 1일당 환자 체중 1㎏ 당 약 0.01ug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 약학적 조성물의 투여 용량은 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 약학적 조성물을 퇴행성 신경질환 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) SphK1의 mRNA 또는 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
(b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
(c) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시킨 물질을 선별하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 선별된 시험물질을 COX2 단백질을 발현하는 세포에 처리하는 단계;
(e) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및
(f) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 COX2 단백질의 아세틸화 정도를 증가시킨 물질을 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
본 발명에서 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질을 발현하는 세포는 SphK1의 mRNA 또는 단백질이 내인적으로(endogenous) 발현 또는 일시적으로 고발현된 세포를 포함하며, 또는 SphK1을 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하여 형질전환시킴으로써 과발현되도록 하여 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 ‘단백질’은 ‘폴리펩타이드(polypeptide)’ 또는 ‘펩타이드(peptide)’와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 상기 ‘폴리뉴클레오티드(polynucleotide)’ 또는 ‘핵산’은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자의 염기서열의 유전 정보를 폴리펩티드를 형성하는 리보솜으로 전달하는 RNA이다.
본 발명 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시험물질”은 COX2의 아세틸화에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 (a) 단계에서 사용되는 세포는 실험동물의 형태로 제공될 수 있으며, 이 경우 본 발명의 스크리닝 방법은 상기 실험동물에게 퇴행성 신경질환을 유도하는 단계를 추가로 포함하며, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구투여, 정위주사를 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
시험물질을 처리하는 것은 시험물질을 세포 또는 조직 배양 배지에 추가한 후 세포를 일정 시간 배양하는 것을 의미한다. 상기 세포가 실험동물 형태로 제공될 때, 시험물질과의 접촉은 비경구 또는 경구 투여, 정위주사를 포함하는 이로 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 시험물질을 동물에게 테스트하기 위해 적절한 방법을 선택할 수 있을 것이다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 SphK1의 mRNA 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time RT-PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 SphK1의 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 방법을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 (c) 단계에서 COX2 단백질을 발현하는 세포는 COX2 단백질이 내인적으로(endogenous) 발현 또는 일시적으로 고발현된 세포를 포함하며, 또는 COX2를 암호화하는 핵산을 세포 내에 도입하여 형질전환시킴으로써 과발현 되도록 하여 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 (e) 단계에서 COX2의 아세틸화정도를 측정하는 방법은 방사선자동사진법, liquid scintillation counting, 분자량 분석 및 액체 색층 분석 매스 분석법으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는 위의 방법 중 [ 14C]acetyl-CoA 존재 하에서 반응시킨 신경세포의 COX2 단백질을 면역침강 법을 이용하여 분리 후, [ 14C]에 대해 liquid scintillation counting을 사용하여 COX2의 아세틸화 정도를 평가하였다.
본 발명의 일실시예에 따르면, SphK1의 활성화는 COX2의 아세틸화를 촉진하여 신경세포에서 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 유도함으로써 신경염증을 완화하는 효과가 발휘된다. 또한, SphK1의 활성화는 Aβ의 식작용을 나타내는 미세아교세포의 기능을 회복시켜 Aβ의 축적에 의해 나타나는 다양한 퇴행성 신경질환의 병변을 완화하는 효과가 있다.
따라서, 상기 (a) 내지 (c) 단계를 통해 SphK1의 발현, 또는 효소의 활성을 증진시키는 물질을 선별한 후, 상기 (d) 내지 (f) 단계를 통해 COX2의 아세틸화 및/또는 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 시키는 물질을 다시 한번 선별한다면, 퇴행성 신경질환에 대해 더 우수한 예방 또는 치료효과를 나타내는 물질을 스크리닝 할 수 있다.
전술한 바와 같이, SphK1에 의한 COX2의 아세틸화는 COX2의 아미노산 서열 중 565번째 세린에서 나타나는 것이므로, 본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제 스크리닝 방법은 COX2의 565번째 세린을 아세틸화 시키는 시험물질을 선별하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계;
(b) 상기 시료에서 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및
(c) 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준 및 COX2의 아세틸화 정도를 정상인과 비교하여 그 정도가 감소된 환자를 퇴행성 신경질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 알츠하이머 동물의 뇌에서 COX2의 아세틸화 및 신경염증 종결 인자의 분비가 야생형과 비교해 현저히 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 수득한 생물학적 시료에서 정상인과 비교해 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현이 감소되어 있고 COX2의 아세틸화가 저하되어 있다면 해당 환자에게서 퇴행성 신경질환이 진행되고 있는 것으로 판정할 수 있다.
또한, SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현 및 COX2의 아세틸화가 저하되어 있을 뿐만 아니라, 신경염증 종결 조절 인자의 발현량이 감소되어 있는 것을 추가로 확인한다면 보다 정확하게 퇴행성 신경질환이 진행되고 있는지 여부를 판정할 수 있다.
본 발명에서 상기 생물학적 시료란 뇌 조직, 뇌 세포, 뇌 척수액, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 뇌 조직, 뇌 세포 또는 뇌 척수액일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 SphK1 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법 및 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 방법에 대해서는 전술한 바와 같다.
또한, 본 발명은 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 상기 ‘유효량’이란 개체에게 투여하였을 때, 퇴행성 신경질환의 개선, 치료, 예방, 검출, 진단 또는 퇴행성 신경질환의 억제 또는 감소 효과를 나타내는 양을 말하며, 상기‘개체’란 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.
본 발명의 상기 ‘치료’는 퇴행성 신경질환 또는 퇴행성 신경질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고, 이는 퇴행성 신경질환을 치유하거나, 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 퇴행성 신경질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나, 치유하거나 예방하는 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 ‘~을 포함하는(comprising)’이란 ‘함유하는’ 또는‘특징으로 하는’과 동일하게 사용되며, 조성물 또는 방법에 있어서, 언급되지 않은 추가적인 성분 요소 또는 방법 단계 등을 배제하지 않는다. 용어 ‘~로 구성되는(consisting of)’이란 별도로 기재되지 않은 추가적인 요소, 단계 또는 성분 등을 제외하는 것을 의미한다. 용어 ‘필수적으로 구성되는(essentially consisting of)’이란 조성물 또는 방법의 범위에 있어서, 기재된 성분 요소 또는 단계와 더불어 이의 기본적인 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 성분 요소 또는 단계 등을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 COX2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 신경세포에서의 신경염증종결 조절 인자 분비를 촉진하여 신경염증을 완화하는 효과가 있어, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 1f는 SphK1이 Acetyltransferase로서 COX2의 S565에 아세틸화 시키는 것을 나타내는 결과이다.
도 1a, b는 SphK1과 acetyl-CoA의 결합(a) 및 해리도(b)를 평가한 결과이다.
도 1c는 SphK1, acetyl-CoA, sphingosine의 존재하에 COX2 아세틸화를 평가한 결과이다([ 14C] 아스피린을 처리한 시험군을 양성 대조군으로 설정).
도 1d는 LC-MS/MS를 이용해 SphK1, acetyl-CoA 및/또는 sphingosine의 존재하에 COX2의 아세틸화에 의한 분자량 변화를 확인한 결과이다.
도 1e는 LC-MS/MS를 이용해 SphK1, acetyl-CoA 및/또는 sphingosine의 존재하에 COX2의 S565 잔기에 아세틸화가 일어나는 것을 확인한 결과이다.
도 1f는 COX2단백질의 S565에 돌연변이를 일으켰을 때, 아세틸화가 잘 일어나지 않는 것을 확인한 결과이다.
도 2a 내지 2d는 SphK1을 억제하였을 때, COX2 아세틸화의 감소에 의해 신경염증 종결 조절 인자가 감소됨을 나타내는 결과이다.
도 2a는 야생형(WT) 신경세포에 SphK1 siRNA를 처리 하였을 때, SphK1 및 SphK2의 발현을 평가한 결과이다.
도 2b는 신경세포에 SphK1 siRNA를 처리 하였을 때, COX2 단백질의 아세틸화를 확인한 결과이다([ 14C] 아스피린을 처리한 야생형 신경세포을 양성 대조군으로 설정).
도 2c는 신경세포에 SphK1 siRNA를 처리 하였을 때, LxA4, RvE1 및 RvD1 등 신경염증 종결 조절 인자(SPMs) 분비를 확인한 결과이다.
도 2d는 신경세포에 SphK1 siRNA를 처리 하였을 때, LC-MS/MS를 이용하여 15-R-LxA4의 분비를 확인한 결과이다.
도 3a 내지 3c는 APP/PS1 마우스는 COX2 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자(SPMs) 분비가 감소되어 있고, 이러한 감소는 SphK1의 과발현에 의해 개선된다는 것을 확인한 결과이다.
도 3a는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스에서 유래한 신경세포에서 COX2 단백질의 아세틸화 어세이를 수행한 결과이다. [ 14C] 아스피린을 처리한 신경세포을 양성 대조군으로 설정했다.
도 3b는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스에서 래한 신경세포의 CM에서 LxA4 및 RvE1의 단백질량을 측정한 결과이다.
도 3c는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스에서 래한 신경세포에서 LC-MS/MS를 이용하여 15-R-LxA4의 양을 특정한 결과이다.
도 4a 내지 4c는 APP/PS1 마우스에서 증가된 SphK1에 의해 분비된 신경염증 종결조절 인자는 신경염증을 감소시킨다는 것을 확인한 결과이다.
도 4a는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포(Iba1)의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 이를 정량화한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 4b는 마우스의 뇌 피질에서 별아교세포(GFAP)의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 이를 정량화한 결과(오른쪽)을 나타낸 결과이다.
도 4는 마우스의 뇌에서 M1 및 M2 염증성 마커의 mRNA 발현수준을 평가한 결과이다(M1 마커: TNF-a, IL-1b, IL-6 and iNOS, 면역조절 인자 : IL10, M2 마커: IL-4, TGF-b and Arg1).
도 5a 내지 5f는 증가된 SphK1에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자가 미세아교세포의 식작용을 개선시킨다는 것을 확인한 결과이다.
도 5a는 APP/PS1 및 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 Aβ 플라크 주위의 미세아교세포를 확인한 결과이다.
도 5b는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 미세아교포의 식작용 능력을 확인한 결과이다.
도 5c는 APP/PS1 및 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포의 리소좀 내에서 Aβ 플라크가 소화되는 것으로 확인한 결과이다.
도 5d, e는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스의 미세아교세포에서 Aβ 분해 효소 (NEP, MMP9 및 IDE) 및 식작용 마커 (CD36)의 발현을 확인한 결과이다.
도 5f는 APP/PS1 및 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 식작용이 일어난 Aβ 플라크의 크기를 확인한 결과이다.
도 6a 내지 6i는 APP/PS1 마우스에서 증가된 SphK1에 의해 분비된 신경염증 종결 조절인자가 AD 병변을 감소시킨다는 것을 나타낸 결과이다.
도 6a는 APP/PS1 및 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌 수질 및 해마에서 티오플라빈 S(ThioS, Aβ 플라크)의 면역형광염색을 나타내는 도면과(왼쪽), Aβ가 차지하고 있는 면적을 정량한 결과이다(오른쪽, n=6/그룹).
도 6b, c는 마우스 뇌에서 Aβ40 및 Aβ42의 축적을 면역형광염색(b) 또는 ELISA 키트(c)로 분석한 결과이다.
도 6d는 맥관장애 정량화한 결과이다.
도 6e는 타우 단백질 정량화한 결과이다.
도 6f-i는 각 동물군의 뇌 피질에서 시냅토파이신(f), MAP2(g), 시냅신1 (h) 또는 PSD95 (i)를 면역형광염색 및 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 7a 내지 7h는 APP/PS1 마우스에서 SphK1 과발현에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자의 증가가 인지 기능을 회복시켰음을 나타낸 도면이다.
도 7a는 야생형 (n = 14), APP/PS1 (n = 12), APP/PS1/SphK1 tg (n = 12), 및 SphK1 tg (n = 13) 마우스의 모리스 워터 메이즈 테스트를 통한 학습 및 기억력 평가 결과이다.
도 7b~d는 시험 11일째에 표적 플랫폼에서 소요된 시간(b), 다른 사분면에서 소요된 시간(c)을 측정하고, 경로의 길이, 수영속도 및 60초 동안에 각각의 동물이 작은 타겟 지역으로 들어간 횟수(d)를 측정한 결과이다.
도 7e는 테스트 10일째에 수영 경로를 나타낸다.
도 7f는 fear conditioning 시험 동안에 contextual 및 tone task 결과를 나타낸 것이다.
도 7g는 오픈필드 테스트 동안에 벽면 및 중심부에서 소요된 시간을 측정한 결과와 중심부의 비율을 나타낸 결과이다.
도 7h는 오픈필드 테스트 동안에 마우스의 이동 경로를 나타낸 것이다.
도 8a 내지 8d는 SphK1에 의해 생성된 COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비 촉진한다는 것을 나타낸 도면이다.
도 8a는 COX2 아세틸화제의 화학구조를 나타낸 도면이다.
도 8b는 COX2 아세틸화제 처리에 의한 신경염증 종결 조절 인자(SPMs) 분비를 확인한 결과이다.
도 8c는 N-acetyl sphingosine이 COX2 아세틸화를 일으키는 것을 확인한 결과이다.
도 8d는 LC-MS/MS를 이용해 N-acetyl sphingosine의 존재하에 COX2의 S565 잔기에 아세틸화가 일어나는 것을 확인한 결과이다.
도 9a 내지 9d는 COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비 촉진하여 알츠하이머 동물모델의 AD 병변을 감소한다는 것을 나타낸 도면이다.
도 9a는 야생형, APP/PS1, APP/PS1에 N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine 유도체) 및 S1P를 주사한 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포(Iba1)의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 이를 정량화한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 9b는 마우스의 뇌 피질에서 별아교세포(GFAP)의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 이를 정량화한 결과(오른쪽)을 나타낸 결과이다.
도 9c는 APP/PS1 및 APP/PS1에 N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine 유도체) 및 S1P를 주사한 마우스의 뇌 수질 및 해마에서 티오플라빈 S(ThioS, Aβ 플라크)의 면역형광염색을 나타내는 도면과(위쪽), Aβ가 차지하고 있는 면적을 정량(아래쪽)한 결과이다.
도 9d는 야생형, APP/PS1, APP/PS1에 N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine 유도체) 및 S1P를 주사한 마우스의 모리스 워터 메이즈 테스트를 통한 학습 및 기억력 평가 결과이다.
도 10a 내지 10d는 COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진하여 니만픽(NP-C) 동물모델의 병변을 감소한다는 것을 확인한 도면이다.
도 10a는 야생형 마우스, NP-C 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 NP-C 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포(Iba1)의 면역형광 이미지(위) 및 이를 정량화한 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 10b는 야생형 마우스, NP-C 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 NP-C 마우스의 뇌 피질에서 별아교세포(GFAP)의 면역형광 이미지(위) 및 이를 정량화한 결과(아래)를 나타낸 결과이다.
도 10c는 야생형 마우스, NP-C 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 NP-C 마우스의 운동능력을 Rota-rod 실험을 통해 확인한 결과이다.
도 10d는 야생형 마우스, NP-C 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 NP-C 마우스의 운동능력을 Beam test를 통해 확인한 결과이다.
도 11a 내지 11e는 COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진하여 근위축성 측색 경화증 동물모델(FUS)의 병변을 감소한다는 것을 확인한 도면이다.
도 11a는 야생형 마우스, FUS 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 FUS 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포(Iba1)의 면역형광 이미지(위) 및 이를 정량화한 결과(아래)를 나타낸 것이다.
도 11b는 야생형 마우스, FUS 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 FUS 마우스의 뇌 피질에서 별아교세포(GFAP)의 면역형광 이미지(위) 및 이를 정량화한 결과(아래)를 나타낸 결과이다.
도 11c는 야생형 마우스, FUS 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 FUS 마우스의 운동능력을 Tail suspension test를 통해 확인한 결과이다.
도 11d는 야생형 마우스, FUS 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 FUS 마우스의 운동능력을 Rota-rod 실험을 통해 확인한 결과이다.
도 11e는 야생형 마우스, FUS 마우스, 및 N-acetyl sphingosine을 주사한 FUS 마우스의 운동능력을 Hanging wired test를 통해 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실험방법>
1. 마우스
IACUC(Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 마우스 실험에 대한 승인을 받았다. C57BL/6 마우스(Charles River, UK)를 바탕으로 APPswe(hAPP695swe) 또는 PS1(presenilin-1M146V)를 과발현시킨 형질전환 마우스 라인을 이용하였다[이하, APP 마우스: APPswe를 과발현하는 마우스, PS1 마우스: presenilin-1M146V를 과발현하는 마우스; GlaxoSmithKline].
알츠하이머(AD) 동물모델로서 SphK1 tg (SphK1 유전자 과발현 마우스)와 APP 마우스 및 APP/PS1 마우스와 교배시켜 APP/PS1/SphK1 tg 마우스를 제조하였다.
니만픽(NP-C) 동물모델로서 Balb/C(오리엔트, Wild type), NPC1 유전자가 결손된 NPC mutant 마우스(RIKEN, Japan로부터 제공받음, NP-C 마우스; 같은 주령의 정상 마우스에 비해 체중이 적으며, 4~6주령에서부터 심각한 운동기능상실이 나타나 사지의 떨림과 발작이 나타나고 수명이 대략 9~10주이다)를 이용하였다.
근위축성 측색 경화증(ALS) 동물모델로서 C57BL/6 마우스(Charles River, UK)를 바탕으로 RUS R521C를 과발현시킨 형질전환 마우스(FUS) 라인을 이용하였다.
2. SphK siRNA 처리
SphK1 siRNA (Dharmacon SMART pool) 및 siRNA 대조군 (Dharmacon)을 E18 C57BL/6 마우스의 신경세포에 48시간 동안 처리 하였다. 신경세포를 수집하여 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자를 분석 하였다.
3. 면역형광법
마우스의 대뇌 및 해마를 고정 후, 아밀로이드-β(Aβ) 42에 대한 항-20G10(마우스, 1:1000) 및 Aβ 40에 대한 항-G30(토끼, 1:1000), 항-MAP2(닭, 1:2000), 항-Synaptophysin(마우스, 1:100), 항-Synapsin1(토끼, 1:500), 항-PSD95(마우스, 1:100), 항-Iba-1(토끼, 1:500), 항-GFAP(토끼, 1:500)을 함께 배양하였다. 상기 부위를 Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어(Olympus FV1000, Japan)를 장착한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용하여 분석하였다. Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓이의 퍼센트를 정량화 하였다.
4. 정량적 리얼타임 PCR
상업적으로 이용 가능한 RNeasy 키트 (QIAGEN)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 RNA를 추출하였다. cDNA는 상업적으로 이용 가능한 cDNA 키트 (Takara Bio Inc.)를 이용하여 전체 RNA 5μg 으로부터 합성되었다. 정량적 리얼타임 PCR은 Corbett research RG-6000 real-time PCR instrument을 이용하여 수행했다.
5. 웨스턴블롯
웨스턴 블롯팅을 이용하여 상기 단백질들의 발현을 분석하였다. 우선CD36(Novus biolobicals) 및 β-액틴(Santa Cruz)에 대한 항체를 이용하였고, 밀도 정량화(densitometric quantification)는 ImageJ 소프트웨어(US National Institutes of Health)를 이용하여 수행하였다.
6. 면역효소검사법
상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(Biosource)를 이용하였고, 마우스의 반구를 균질화하여 0.02M의 구아니딘(guanidine)을 포함하는 완충액에 넣어 Aβ ELISA를 위한 시료를 준비 하였다. 신경염증 종결조절 인자 측정을 위해서는 마우스 대뇌로부터 신경세포를 배양 후 Conditioned media (CM)를 준비하였다. 이 후, 제조사의 메뉴얼에 따라, Aβ 및 SPM에 대한 ELISA를 수행하였다.
7. 행동실험
학습 및 기억에 대한 잠재적 효과를 확인하기 위하여, MWM(Morris water maze)와 fear conditioning 실험을 수행하였다. MWM는 마우스에 대하여 10일 동안 하루에 4번씩 과제를 학습시켰고, 11일째 되는 날에 플랫폼을 제거하고, 탐침시험(probe trial)을 수행하였다. Fear conditioning은 첫째 날은 마우스를 conditioning chamber에 넣고, 소리 자극(10 kHz, 70 dB) 및 전기자극(0.3 mA, 1 s)을 주었다. 둘째 날은 첫째 날과 같은 conditioning chamber에서 자극 없이 공간에 대한 기억력을 확인했고, 셋째 날은 다른 conditioning chamber에서 소리자극만 주었을 때 두려움에 대한 기억력 테스트를 수행하였다. 운동능력과 즉각적인 활동력을 평가하기 위한 오픈필드 테스트를 수행하였다. 오픈필드 테스트는 마우스를 10분 동안 사각형의 박스에 넣어 전반적인 운동은력과 시간 및 거리를 측정하였다.
각 실험군 마우스의 운동 능력을 확인하기 위해, Rota-rod, Beam 테스트, Tail suspension test, Hanging wired test를 실시하였다. Rota-rod 테스트 (Ugo Basile, Comerio, VA,Italy)는 그립을 제공하기 위해 적절하게 가공된 직경 3cm의 막대가 설치되어 있는 기계를 4rpm의 회전속도로, 3회 이상 Rota-rod 운동을 실시하여 실험 동물의 유지시간(endurance time)을 초단위로 측정하고, 그 평균값을 기록하였다. 상기 각 Rota-rod 운동시험은 회당 5분을 초과하지 않도록 하였다. Beam 테스트는 12mm 너비의 막대의 시작지점에 마우스를 올려놓은 후 끝 지점까지 이동하는 데에 걸리는 시간을 측정하였다. Tail suspension test는 마우스의 꼬리를 바닥으로부터 20-25cm 떨어진 위치에 테이프로 고정한 후, 10분 간 마우스의 움츠리는 시간을 측정하였다. Hanging wired test는 바닥으로부터 42cm 떨어진 위치에 grid를 설치한 후, 마우스가 떨어질때까지 걸리는 시간을 측정하였다.
8. COX2 아세틸화 정도 측정 방법
[ 14C]acetyl-CoA 존재 하에서 37℃ 1시간 반응시킨 신경세포의 COX2 단백질을 면역침강법을 이용하여 분리한 후, [ 14C]에 대해 liquid scintillation counting을 수행하였다.
9. Acetyltransferase의 효소학적 분석
SphK1의 acetyl-CoA 결합 활성을 10mM sphingosine의 존재 하에서 필터 결합 분석으로 분석 하였다. SphK1에 대한 [ 3H] acetyl-CoA의 결합 속도 (Vbinding)를 acetyl-CoA 농도로 나타내었다. 포화 플롯의 비선형 회귀 분석은 K cat (촉매 상수) 및 K M (Michaelis-Menten 상수)를 이용하여 acetyl-CoA 및 SphK1 결합 활성을 나타내었다.
10. LC-MS/MS
신경세포에서 SphK1과 신경염증 종결조절 인자의 분비의 관계를 확인하기 위해, 9개월 된 WT, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스로부터 신경세포를 분리하였다. 신경세포를 초음파 처리하고 2.5mM acetyl-CoA (Sigma) (24시간, 37℃)와 함께 배양하였다. 또한, CM은 SphK1 siRNA 또는 대조군 siRNA로 처리한 신경세포로부터 수확 하였다. 각각의 세포 용해물 또는 CM의 200㎕ 분액을 15-S-LxA4-d5 (내부 표준, Cayman chemical) 용액 100㎍/㎖ 100㎕, 1% 포름산 용액 100μl 및 600μl의 물을 혼합 한 후, 에틸아세테이트 4ml를 첨가 하였다. vortexing과 centrifuging (13,200 rpm) 후 각각 10 분 동안, 혼합물을 2 시간 동안 deep freezer에서 동결시켰다. 유기 상층액을 분리하고, 질소 기류 하에서 건조시켰다. 남은 용액을 LC-MS/MS 시스템에 주입 된 60% 아세토니트릴 용액으로 재구성 하였다. 이 샘플은 Agilent 1290 HPLC 시스템에 연결된 Agilent 6470 Triple Quad LC-MS/MS 시스템 (Agilent, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 15-R-LxA4 농도 분석을 수행하였다.
COX2의 아세틸화 부위를 확인하기 위해 trichroloacetic acid (Merck)로 COX2 효소를 침전시키고 건조시켰다. 건조 된 추출물을 10μL의 5M 우레아 용액에 재현탁하고 37℃에서 0.1M 암모늄바이카보네이트 완충액을 1μg 트립신 (Promega)과 함께 16시간 동안 배양했다. 그런 다음 샘플을 1M DTT (GE Healthcare)로 실온에서 1시간 동안 처리 한 다음 1M iodoacetamide (Sigma)로 1시간 동안 알킬화시켰다. 시퀀싱을 위해 단백질 샘플을 ZORBAX 300SB-C18 컬럼에 로드했다. BioTools 3.2 SR5 (Bruker Daltonics)로 펩타이드를 확인하였다.
11. COX2 아세틸화제 처리
신경염증 종결조절 인자 측정을 위해서는 마우스 대뇌로부터 신경세포를 배양 후 10nM N-acetyl sphingosine 1 phsosphate (Toronto Research chemicals, C262710) 및 N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912)를 처리하여 CM을 준비하였다. COX2 아세틸화 분석을 위해서는 마우스 대뇌로부터 신경세포를 배양 후 2uCi [ 14C]N-acetyl sphingosine (ARC, ARC1024) 처리하여 준비하였다. 또한, 인 비보(In vivo) 실험을 위하여는 7개월령의 APP/PS1 마우스에 5mg/kg N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912), 1mg/kg FTY720 및 3uM S1P를 4주 동안 매일 복강주사를 통해 주입하였다. 1개월령의 NPC 마우스에 5mg/kg N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912)과 2개월령의 FUS 마우스에 30mg/kg N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912)을 4주 동안 매일 피하주사를 통해 주입하였다.
<실험결과>
1. SphK1는 acetyltransferase로서 COX2의 S565 잔기에 아세틸화를 유도함
SphK1의 acetyltransferase 활성을 확인하기 위해, 효소로부터의 아세틸기의 결합 및 해리 분석을 수행 하였다. SphK1에 아세틸기의 결합은 acetyl-CoA의 농도가 증가함에 따라 포화되어 K M 및 K cat 값은 각각 58.2㎛ 및 0.0185min -1이었다 (도 1a). 평형 투석 실험 후, 결합된 아세틸기는 또한 농도 의존적으로 경쟁적인 유리 acetyl-CoA의 존재하에 acetyl-CoA:SphK1 복합체로부터 해리되었다. acetyl-CoA와 SphK1의 이러한 해리는 높은 억제제 농도로 포화되어 6.8㎛의 K D 값을 나타내었다 (도 1b). K M 값 (즉, 결합 친화성)과 비교하여 더 낮은 K D (즉, 해리 상수) 값은 SphK1의 acetyltransferase 특성을 제시 하였다.
다음으로, COX2와 관련하여 SphK1의 acetyltransferase 활성을 확인하기 위해, 정제된 SphK1을 sphingosine의 존재 또는 부재하에 COX2 및 [ 14C] acetyl-CoA와 함께 배양 후 아세틸화를 측정하였다. 또한 COX2 S516 잔기에 아세틸화를 일으킨다고 알려진 아스피린을 양성대조군으로 사용하여 아세틸화 정도를 확인하였다. 도 1c의 결과를 참고하면, SphK1이 Sphingosine 존재 하에서 COX2에 대해 아스피린보다 더 높은 수준의 아세틸화를 유도하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 SphK1이 acetyltransferase 활성을 나타내어 sphingosine 또는 sphingosine 중간체를 통해 COX2에 아세틸화를 유도할 수 있음을 나타낸다(도 1c).
마지막으로, SphK1에 의해 아세틸화된 COX2의 아세틸화 위치를 확인하기 위해 SphK1, acetyl-CoA 및 sphingosine을 COX2에 처리하였다.
위와 같이, SphK1, acetyl-CoA 및 sphingosine을 처리한 COX2는 아세틸기를 갖고, sphingosine 없이 처리한 COX2는 아세틸기를 갖고 있지 않았다. 또한, SphK1의 존재 하에서 COX2의 펩타이드 560-GCPFTSFSVPDPELIK-575에 대한 세린 565 (S565)가 아세틸화 된 것으로 확인되었다 (도 1d,e). 이의 인과 관계를 확립하기 위해 본 발명자는 COX2의 S565를 Ala 565 잔기 (S565A)로 돌연변이 시킨 후, 아세틸화 분석을 수행했다. 야생형의 COX2는 SphK1과 sphingosine에 의해 아세틸화되었지만 S565A 돌연변이된 COX2는 SphK1 존재 하에서 아세틸화가 감소되었으며, 이러한 결과는 COX2의 S565가 SphK1 매개 COX2 아세틸화의 주요 표적 부위임을 나타낸다(도 1f). 특히 SphK1에 의한 COX2 S565의 아세틸화는 아스피린이 아세틸화 시키는 위치(S516)와는 다른 위치임을 확인 하였다.
2. 신경세포에서 SphK1을 억제하였을 때, COX2 아세틸화의 감소에 의해 신경염증 종결 조절 인자 분비 감소를 초래함
신경세포에서 SphK1과 COX2 아세틸화의 상관관계를 보다 직접적으로 확인하기 위해, 야생형 신경세포에 SphK1 siRNA로 처리하고 COX2 아세틸화를 확인하였다. SphK1 siRNA를 처리한 신경세포에서 COX2 아세틸화가 감소하는 것을 확인 하였다 (도 2b).
다음으로 COX2 아세틸화에 의한 신경염증 종결 조절인자의 변화를 관찰하였다. SphK1 siRNA를 처리한 신경세포로부터 유래한 CM에서 신경염증 종결 조절 인자인 LxA4 및 RvE1이 감소되어 있음을 확인하였다(도 2c).
또한, LC-MS/MS를 이용하여 신경염증 종결 조절 인자를 측정하였을 때, COX2 아세틸화에 의해 생성되는 15-R-LxA4가 SphK1 siRNA를 처리한 신경세포에서 감소되어 있었다(도 2d). 즉, SphK1을 억제하였을 때, COX2 아세틸화의 감소에 의해 신경염증 종결 조절 인자(특히 15-R-LxA4)가 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.
3. 알츠하이머 동물모델은 COX2 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자 분비가 감소되어 있고, 이는 SphK1 과발현에 의해 개선됨
본 발명자들은 SphK1 siRNA 처리한 후 나타나는 상기 결과들이 알츠하이머 동물 모델에서도 일어나는지 확인하기 위해 9개월령 마우스에서 분리한 신경세포에 [ 14C]acetyl-CoA을 처리하고, COX2를 정제하여 아세틸화 정도를 분석하였다. 야생형 마우스와 비교해, APP/PS1 마우스의 신경세포에서는 낮은 정도의 COX2 아세틸화가 나타났고, APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 신경세포에서는 COX2의 아세틸화가 증가되어 있었다(도 3a).
LxA4 및 RvE1 발현량은 야생형 신경세포로부터 유래한 CM에서보다 APP/PS1 신경세포로부터 유래한 CM에서 현저히 감소되어 있었으며, APP/PS1/SphK1 tg 신경세포로부터 유래한 CM에서는 회복되어 있었다(도 3b). 또한, LC-MS/MS를 이용하여 신경염증 종결 조절 인자를 측정 하였을 때, COX2 아세틸화에 의해 생성되는 15-R-LxA4가 알츠하이머 동물모델에서 감소되어 있었으며, SphK1을 과발현 하였을 때 회복되어 있었다(도 3c). 즉, 알츠하이머 동물모델에서 COX2 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 감소되어 있고, 이는 SphK1의 과발현에 의해 개선될 수 있음을 의미한다.
4. 증가된 SphK1이 APP/PS1 마우스에서 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경 염증을 조절함
본 발명자들은 증가된 SphK1이 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서, 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 관찰하였다. APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 미세아교세포와 별아교세포의 현저한 저하를 나타내었다(도 4a,b). 게다가, APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 전-염증성 M1 마커들과 면역 조절 사이토카인들의 감소를 나타냈으며, 항-염증성 M2 마커들의 발현이 증가되어 있었다(도 4c).
종합적으로, 이러한 결과들은 SphK1 과발현은 COX2의 아세틸화를 유도함으로써 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하여 AD 뇌에서 염증 반응을 개선할 수 있음을 나타낸다.
5. SphK1 과발현에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자는 미세아교세포의 Aβ식작용을 조절함
증가된 SphK1에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자가 Aβ로 미세아교세포의 모집(recruitment)를 회복시키는지 여부를 판단하기 위해, 플라크 주변의 미세아교세포의 숫자를 정량화했다. 그 결과, APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 미세아교세포의 모집이 증가되어 있었다(도 5a).
그 다음으로, 뇌 절편을 이용하여 식세포 어세이를 수행하였다. APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 식세포 작용을 나타내는 미세아교세포의 수가 증가되어 있었다(도 5b). 이러한 효과를 더 알아보기 위하여, 미세아교세포의 Aβ 식작용성을 in vivo로 평가하였다. APP/PS1/SphK1 tg 뇌는 리소좀 및 Aβ와 함께 염색되는 미세아교세포의 수가 증가되어 있었다. 중요한 것은, 미세아교세포 내의 파고리소좀(phagolysosome)은 APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 피질에서 증가되어 있었다. 플라크와 연관된 미세아교세포 분석 결과, SphK1이 과발현된 APP/PS1 마우스에서 파고리소좀에 함입된 Aβ를 포함하고 있는 세포의 비율이 증가한 것으로 나타났다. 파고리소좀에 포함된 Aβ의 양이 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌에서 증가되어 있었다(도 5c).
다음으로, Neprilysin(NEP), matrix metallopeptidase 9(MMP9), 인슐린 분해 효소(IDE) 등 Aβ 분해 효소의 발현을 분석 하였다. 이러한 효소들의 발현량은 변하지 않았지만, 미세아교세포의 식작용이 일어날 때 증가하는 것으로 알려진 CD36은 APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 회복되었다(도 5d,e).
한편, 미세아교세포의 식자용은 Aβ 플라크의 core 보다 Aβ의 외부 부분의 감소를 유도한다고 알려져 있다. 이에 따른 Aβ 플라크 형태 분석에서 APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 작은 (<25 ㎛) 플라크를 유의하게 증가시켰고, 중형 (25-50 ㎛) 및 대형 (> 50 ㎛) 플라크는 유의하게 감소되어 Aβ의 외측 부분이 미세 아교에 의해 식작용 되었다는 것을 확인하였다(도 5f).
이상의 결과를 통해, 증가된 신경세포의 SphK1은 COX2의 아세틸화를 증가시킴으로써 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 증가되어, 결과적으로 APP/PS1 마우스에서 미세아교세포의 Aβ 식작용이 증대 되었음을 알 수 있었다.
6. SphK1 과발현에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자는 마우스의 AD 병변을 완화함
APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 증가된 SphK1 활성에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자가 AD의 병변에 어떠한 영향을 끼치는지를 알아보기 위하여, 첫 번째로 Aβ 프로파일을 규명하였다. Aβ40 및 Aβ42의 티오플라빈 S(ThioS)염색, 면역형광 염색 및 ELISA 실험 결과, APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 Aβ가 현저히 낮은 것으로 나타났다(도 6a~c). APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 뇌의 아밀로이드 맥관장애(angiopathy) 역시 감소되어 있었다(도 6d). 야생형 마우스와 비교해 APP/PS1 마우스에서 시냅토파이신, MAP2, 시냅신1 및 PSD95 라벨 밀도가 감소되어 있었다. 그러나, APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서는 야생형의 그것과 유사한 정도로 라벨 밀도가 회복되어 있었다(도 6f~i).
7. SphK1 과발현에 의해 분비된 신경염증 조절 인자는 알츠하이머 동물모델의 인지기능을 회복시킴
본 발명자들은 또한 학습과 기억의 변화를 평가하기 위하여 모리스 워터 메이즈 실험 및 fear conditioning 실험을 수행하였다. 주령이 오래된 APP/PS1 마우스는 기억 형성에서 심각한 문제를 나타낸 반면에, APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 이러한 문제가 어느 정도 완화되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 7a~f).
운동능력과 즉각적인 활동력을 평가하기 위하여, 오픈필드 테스트를 수행하였다. APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 향상된 운동능력 및 즉각적인 활동력을 나타내었다 (도 7g~h).
종합적으로, 이러한 결과들은 APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 신경세포에서 SphK1의 발현이 증가되어 있고, 이로 인해 COX2의 아세틸화가 증가되어, 결과적으로 Aβ의 축적이 감소되고 학습 및 기억능력이 향상되었다는 것을 나타낸다.
8. SphK1에 의해 생성된 COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진시킴
본 발명자는 상기 실험결과들을 바탕으로 COX2의 아세틸화를 유도할 수 있는 화합물이 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료효과를 나타낼 것인지 여부를 직접적으로 확인하기 위해 일련의 실험을 진행하였다.
구체적으로, 본 발명자는 N-acetyl sphingosine 1 phsosphate 및 N-acetyl sphingosine이 COX2의 아세틸화를 유도할 수 있을 것으로 예상하였고, 이를 이용하여 이하 실험을 진행하였다(도 8a).
우선, 상기 선정된 화합물들이 신경세포에서 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진하는지 확인하기 위해서, APP/PS1 신경세포에 N-acetyl sphingosine 1 phsosphate 또는 N-acetyl sphingosine을 처리한 후 신경염증 종결 조절 인자의 발현량을 확인 하였다. 그 결과, APP/PS1 마우스의 신경세포에서 LxA4 및 RvE1 발현량이 N-acetyl sphingosine 1 phsosphate 또는 N-acetyl sphingosine을 처리 하였을 때 회복되는 것을 확인하였다(도 8b).
다음으로는 상기 화합물들에 의한 신경염증 종결 조절 인자 분비가 COX2 아세틸화 증가에 의한 것인지 확인하기 위해서 C 14이 부착된 N-acetyl sphingosine을 이용하여 확인하였고, C 14 N-acetyl sphingosine은 위에서 확인한 SphK1, acetyl-CoA 및 sphingosine을 혼합한 샘플보다도 더 많은 아세틸화가 일어나는 것을 확인하였다(도 8c). 또한, N-acetyl sphingosine의 존재 하에서 COX2의 펩타이드 560-GCPFTSFSVPDPELIK-575에 대한 세린 565 (S565)가 아세틸화된 것으로 확인되었다 (도 8d).
즉, 상기 화합물들은 COX2 아세틸화를 유도하여 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하며, 특히 이러한 아세틸화는 COX2의 S565에서 나타난다는 것을 직접적으로 확인함으로써 퇴행성 신경질환의 치료에 있어서 COX2의 S565 아세틸화가 매우 핵심적인 치료 타겟이 될 수 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.
9. COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진하여 알츠하이머 동물모델의 AD 병변을 감소시킴.
본 발명자들은 상기 실험을 통해 확인한 COX2 아세틸화제 중 하나인 N-acetyl sphingosine을 APP/PS1 동물모델에 주사하여 AD 병변을 확인 하였다. 먼저 N-acetyl sphingosine가 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서, 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 관찰하였다. N-acetyl sphingosine을 주사한 APP/PS1 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 미세아교세포와 별아교세포의 현저한 저하를 나타내었다(도 9a,b). 또한 APP/PS1 마우스와 비교해 N-acetyl sphingosine을 주사한 APP/PS1 마우스에서 Aβ의 양이 현저히 낮은 것으로 나타났고, 기억력 및 인지력이 개선되는 것을 확인 하였다(도 9c,d). 그러나 sphingosine 유도체인 FTY720 및 S1P를 주사하였을 때에는 알츠하이머 동물 모델과 비교하여 미세아교세포와 별아교세포의 활성에 차이를 보이지 않았고, Aβ 침착 감소 및 기억력 개선 효과도 나타나지 않았다(도 9a, b).
이상의 결과를 통해, COX2 아세틸화제는 FTY720과 같은 sphingosine 유도체 및 S1P와 달리 신경염증 종결 조절 인자를 분비를 촉진하여 APP/PS1 마우스에서 신경염증 감소, Aβ 침착 감소 및 기억력 개선 등과 같이 AD 병변을 감소시키는 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
10. COX2 아세틸화제는 NP-C 마우스의 니만픽 병변을 개선시킴.
본 발명자들은 상기 실험을 통해 확인한 COX2 아세틸화제 중 하나인 N-acetyl sphingosine을 NP-C 동물모델에 주사하여 니만픽 병변을 확인하였다. 먼저 N-acetyl sphingosine가 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서, 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 관찰하였다. N-acetyl sphingosine을 주사한 NP-C 마우스는 NP-C 마우스와 비교해 미세아교세포와 별아교세포의 현저한 저하를 나타내었다(도 10a, b). 또한 NP-C 마우스와 비교해 N-acetyl sphingosinbe을 주사한 NP-C 마우스에서 운동능력이 개선되는 것을 확인하였다 (도 10c, d).
11. COX2 아세틸화제는 FUS 마우스의 ALS 병변을 개선시킴.
본 발명자들은 상기 실험을 통해 확인한 COX2 아세틸화제 중 하나인 N-acetyl sphingosine을 FUS R521C 동물모델에 주사하여 ALS 병변을 확인하였다. 먼저 N-acetyl sphingosine가 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서, 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 관찰하였다. N-acetyl sphingosine을 주사한 FUS R521C 마우스는 FUS R521C 마우스와 비교해 미세아교세포와 별아교세포의 활성이 감소하는 것을 확인 하였다(도 11a, b). 또한 FUS R521C 마우스와 비교해 N-acetyl sphingosinbe을 주사한 FUS R521C 마우스에서 운동능력이 개선되는 것을 확인하였다 (도 11c-e).
본 발명의 COX2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물은, 신경세포에서 COX2 아세틸화를 촉진하여 신경염증 종결인자를 분비함으로써 신경염증을 완화하는 효과가 있어, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 사용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 우수하다.

Claims (14)

  1. COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 COX2 아세틸화제는 COX2의 565번째 세린을 아세틸화 시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 COX2 아세틸화제는 스핑고신 카이나제 1(sphingosine kinase 1)의 활성 또는 발현을 증진시키는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 COX2아세틸화제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2019003283-appb-img-000002
    상기 식에서,
    R 1은 수소, 치환 또는 비치환의 C1~C10의 직쇄 또는 측쇄의 알킬 또는 -H 2PO 3이며;
    R 2는 수소 또는 치환 또는 비치환의 C1~C10의 직쇄 또는 측쇄의 알킬이며;
    상기 n은 1~15의 정수이다.
  5. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽 병(Niemann-Pick disease), 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 하기 단계를 포함하는 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법:
    (a) SphK1의 mRNA 또는 단백질을 발현하는 세포에 시험물질을 처리하는 단계;
    (b) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
    (c) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현량을 증가시킨 물질을 선별하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 선별된 시험물질을 COX2 단백질을 발현하는 세포에 처리하는 단계;
    (e) 시험물질을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포에서 상기 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및
    (f) 시험물질을 처리하지 않은 세포와 비교해 상기 COX2 단백질의 아세틸화 정도를 증가시킨 물질을 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료제로 선별하는 단계.
  7. 제6항에 있어서, 상기 mRNA의 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time RT-PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 방법은 방사선자동사진법, liquid scintillation counting,분자량 분석 및 액체 색층 분석 매스 분석법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 방법을 이용하여 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 COX2의 아세틸화는 565번째 세린의 아세틸화인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계;
    (b) 상기 시료에서 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정하고 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현수준 및 COX2의 아세틸화 정도를 정상인과 비교하여 그 정도가 감소된 환자를 퇴행성 신경질환에 걸린 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 COX2의 아세틸화는 565번째 세린의 아세틸화인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 퇴행성 신경질환 예방 또는 치료용 제제를 제조하기 위한 COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제의 용도.
  14. COX2(cyclooxygenase-2) 아세틸화제를 포함하는 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환 치료 방법.
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