JPH08113535A - 神経細胞の変性または死滅抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 Ｎ−アシルスフィンゴシンまたはスフィンゴ
エリミナーゼを含有する神経細胞の変性又は死滅抑制
剤。 【効果】 例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、
筋萎縮性側索硬化症、末梢性神経ニューロパチー、外傷
性神経障害等における神経細胞の変性又は死滅を抑制す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、神経細胞の変性又は死
滅を伴う疾患の治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】神経細胞死を抑制する蛋白性因子として
下記のものが公知である。 ・NGF(nerve growth factor)：レヴィ モンタルチーニ
他、サイエンス、２３７巻、１１５４〜１１６２頁、１
９８７年。 ・BDNF(brain derived growth factor) ：レイブロック
他、ネイチャー、３４１巻、１４９〜１５２頁、１９８
９年。 ・NT3(neurotrophin 3) ：メイソンピエール他、サイエ
ンス、２４７巻、１４４６〜１４５１頁、１９９０年。 ・CNTF(ciliary neurotrophic factor) ：リン他、サイ
エンス、２４６巻、１０２３〜１０２５頁、１９８９
年。 ・NT4/5(neurotrophin 4/5) ：ベルケマイアー他、ニュ
ーロン、７巻、８５７〜８６６頁、１９９１年。 ・FGF(fibroblast growth factor) ：モリソン他、プロ
シーディングス オブナショナル アカデミー オブ
サイエンス、８３巻、７５３７〜７５４１頁、１９８６
年。 ・IL-3(interleukin 3) ：カメガイ他、ニューロン、４
巻、４２９〜４３６頁、１９９０年。 ・IL-3(interleukin 6) ：ハマ他、ニューロサイエンス
レターサ、１０４巻、３４０〜３４４頁、１９８９年。 ・GM-CSF(granulocyte/macrophage-colony stimulating
factor)：カメガイ他、ブレインリサーチ、５３２巻、
３２３〜３２５頁、１９９０年。

【０００３】また、低分子化合物で神経細胞死を抑制す
るものとして、下記のものが報告されている。 ・cAMP(cyclic adenosine monophosphate)：マーチン
他、ジャーナル オブ ニューロバイオロジー、２３
巻、１２０５〜１２２０頁、１９９２年。 ・diphenylpiperazine：アイクラー他、ジャーナル オ
ブ ニューロケミストリー、６２巻、２１４８〜２１５
７頁、１９９４年。 ・カリウムイオン：コイケ他、プロシーディングス オ
ブ ナショナル アカデミー オブ サイエンス、８６
巻、６４２１〜６４２５頁、１９８９年。 ・ATA(aurintricarboxylic acid)：バチスタトー他、ジ
ャーナル オブ セルビオロジー、１１５巻、４６１〜
４７１頁、１９９１年。 ・asialo GM1(asialo-ganglioside GM1)：フェラーリ
他、ジャーナル オブ ニューロサイエンス、１３巻、
１８７９〜１８８７頁、１９９３年。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上述のごとく、従来よ
り多くの物質が神経細胞死を抑制することが示されてい
る。しかし、これらを神経細胞の変性・死滅を伴う疾患
の治療に利用しようとした場合、蛋白性因子は生体内に
おける安定性および効率的に生体内に投与することが困
難な場合が多いなどの問題を持つ。また、低分子化合物
についてはいずれもその作用の特異性が問題となる。本
発明は、神経栄養因子除去により惹起される神経細胞死
を抑制する方法に関するものであり、神経細胞の変性・
死滅を伴う疾患の治療剤を提供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、研究の課
程において神経細胞死を抑制する活性を有する神経栄養
因子(NGF: nerve growth factor)の受容体と腫瘍壊死因
子(TNF: tumor necrosis factor)の受容体の構造上の類
似性、及び、ＴＮＦの生物活性発現の過程で細胞内セラ
ミド濃度が上昇することに注目した。そこで、ＮＧＦの
生物活性、即ち神経細胞死を抑制する活性、の発現にも
同様の細胞内変化が関与している可能性を着想し、これ
を実験的に実証して本発明を完成した。

【０００６】即ち本発明は、Ｎ−アシルスフィンゴシン
又はスフィンゴミエリナーゼを投与することにより神経
細胞内セラミド濃度を上昇させ、神経細胞の変性および
死滅を抑制することを特徴とする、神経系の疾患又は障
害の治療剤に関するものである。Ｎ−アシルスフィンゴ
シンは式

【化１】 （式中、Ｒ−ＣＯ−はアシル基を表す）で表すことがで
きる。上記式において、アシル基の好ましい例はアルカ
ノイル基およびアルケノイル基であり、具体的には、例
えばアセチル、プロパノイル、ブタノイル、ペンタノイ
ル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、オクタノイル、デカ
ノイル、ドデカノイル等の炭素原子数３０以下の直鎖状
又は分枝鎖状のアルカノイル基およびアルケノイル基を
挙げることができる。本発明のＮ−アシルスフィンゴシ
ンの代表例としては、例えばＮ−アセチルスフィンゴシ
ン、Ｎ−ヘキサノイルスフィンゴシン、Ｎ−オクタノイ
ルスフィンゴシン等が挙げられる。また、例えばＮ−パ
ルミトイルスフィンゴシン、Ｎ−ステアロイルスフィン
ゴシン、Ｎ−オレオイルスフィンゴシン、Ｎ−ネルボノ
イルスフィンゴシンのようなセラミドと総称される生体
由来の化合物群に属するＮ−アシルスフィンゴシンを用
いることもできる。スフィンゴミエリナーゼとは、スフ
ィンゴミエリンを基質として作用し、これをセラミドと
フォスフォコリンとに分解する反応を触媒する酵素であ
る。

【０００７】本発明治療剤の神経細胞変性・死滅抑制作
用は、以下のようにして確認することができる。神経細
胞としては、哺乳類、好ましくはラット胎仔（妊娠２１
日令）より得られる上頚神経節の神経細胞を用いること
ができる。細胞死とは、この神経細胞をＮＧＦ存在下で
６〜１０日培養した後に、ＮＧＦを培地中より除去する
ことにより惹起される神経細胞のプログラム細胞死をい
う。神経細胞の培養方法及び細胞死の惹起方法として
は、ジャーナル オブ セルバイオロジー、１０６巻、
８２９〜８４４頁に記載されるマーティン他の方法が挙
げられる。具体的には、化合物を200 mMとなるようにジ
メチルスルフォキシド(DMSO)に溶解して得られたストッ
ク溶液を培地に添加することにより、培地中の化合物濃
度を120 μM 〜240 μM に保つ。スフィンゴミエリナー
ゼは、100 U/mLのストック溶液（ベーリンガーマンハイ
ム社製）を培地に添加することにより、培地中の酵素濃
度を12.5〜100 mU/mL に保つ。上記操作の後４８時間の
時点で、形態学的及び生化学的に細胞の生存が確認され
た場合に細胞死を抑制したと判定する。形態学的細胞生
存の確認方法としては、ジャーナル オブ セル バイ
オロジー、１０６巻、８２９〜８４４頁に記載されるマ
ーティン他の方法が、また、生化学的細胞生存の確認方
法としては、ジャーナル オブ セル バイオロジー、
１２３巻、１２０７〜１２２２頁に記載されるデックワ
ース他の方法（エムティーティーアッセイ）がある。

【０００８】本発明の神経細胞変性・死滅抑制剤は、上
記の上頚神経節神経細胞を上述の培養系でＮＧＦ存在下
に６〜１０日培養した後に、ＮＧＦを培地中より除去す
ることにより惹起される神経細胞のプログラム細胞死
を、細胞死惹起後４８時間の時点で少なくとも７０％以
上抑制するものであることが好ましい。上記試験におい
て、本発明の神経細胞変性・死滅抑制剤を添加しない場
合、細胞死惹起後４８時間における細胞生存率は、通
常、播種時の２０％以下に過ぎない。

【０００９】本発明の神経細胞変性・死滅抑制剤は、神
経細胞の変性・死滅を伴う疾患（例えばアルツハイマー
病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、抗癌剤性末
梢神経ニューロパチー、糖尿病性末梢神経ニューロパチ
ー、脊椎損傷などの外傷性神経障害など）の治療剤とし
て有用である。また、本発明の神経細胞変性・死滅抑制
剤は、他の神経細胞死抑制剤（例えば前述した公知の各
種蛋白性因子又は将来知られうるほかの神経細胞死抑制
剤）と併用して、又はそれらとの合剤として用いてもよ
い。

【００１０】本発明の神経細胞変性・死滅抑制剤は、経
口的又は非経口的に投与することができる。すなわち、
通常用いられる投与形態、例えば錠剤、カプセル剤、顆
粒剤、散剤等として経口投与することができ、あるいは
液剤、乳剤、懸濁液剤、リポソーム剤として筋肉内注射
又は皮下注射することができ、また、坐剤として直腸投
与することができる。このような剤形は、医薬として許
容される通常の担体、賦型剤、結合剤、安定剤、緩衝
剤、溶解補助剤、等張剤等と本発明の有効成分を配合す
ることにより製造することができる。投与量、投与回数
は、患者の症状、症歴、年齢、体重、投与形態等によっ
て異なるが、例えば成人に経口投与する場合、通常、１
日当たり５〜５００mg、好ましくは１０〜１００mgの範
囲で適宜調節して、１回又は数回に分けて投与すること
ができる。

【００１１】

【実施例】

実施例１ Ｎ−アセチルスフィンゴシンによる神経細胞
死抑制 （１）神経細胞の培養 エスディー系ラット胎仔（妊娠２１日令）の上頚神経節
を摘出し、血管・脂肪組織を取り除いた後、1 mg/ml コ
ラゲナーゼ含有Ｌ１５培地中で３７℃、３０分間処理す
る。コラゲナーゼ含有Ｌ１５培地を除去し、新鮮なＬ１
５培地を加える。この操作を３回繰り返すことでコラゲ
ナーゼを洗い去った後、ピペッティングにより単細胞懸
濁液を調製する。これをＡＭ１００培地（10% 非働化ウ
シ胎仔血清、100 ng/ml ＮＧＦ、を含むＭＥＭ（Gibco
社製））で約3,000 細胞／100 μL となるように希釈す
る。これを、ラット尾腱コラーゲンでコートした９６穴
培養プレート（コーニング社製）に、約3, 000細胞／ウ
ェル／100 μL となるように播種し、このプレートをCO
₂ インキュベータ（５％CO₂ 、37℃）内に置き、で６〜
１０日培養した。培地交換は２〜３日毎に行なった。 （２）神経細胞死の惹起 上述の培養後、培地をＡＭＯ培地（10% 非働化ウシ胎仔
血清、0 ng/ml ＮＧＦ、を含むＭＥＭ（Gibco 社製））
に交換し、同時に終濃度0.5%となるように抗ＮＧＦ抗血
清を添加した。 （３）神経細胞死の抑制 上記（２）の方法で神経細胞死を惹起すると同時に、培
地に該当化合物を添加する。

【００１２】（４）神経細胞死抑制の検出・定量 神経細胞死抑制の確認即ち生細胞の検出は、位相差顕微
鏡下での形態観察により行なった。生細胞は、丸く、大
きく、明位相細胞体及び良く発達した神経突起ネットワ
ークを有するのに対して、死細胞は萎縮した暗位相細胞
体を有し、神経突起ネットワークも崩壊していた。一
方、培地からＮＧＦを除去すると同時に120 μM のＮ−
アセチルスフィンゴシンを添加した場合には、丸く、大
きく、phase brightな細胞体及び良く発達した神経突起
ネットワークが保持され、細胞死が抑制されることが示
された。Ｎ−アセチルスフィンゴシンの細胞死抑制活性
の容量反応曲線を図１に示した。ここでは、ミトコンド
リアの酵素活性をエムティーティーアッセイ（前述）に
て測定し、細胞生存率の指標とした。具体的には、培地
に終濃度0.2mg/mlとなるように１−（４，５−ジメチル
チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾ
リウムブロミドを加え、３７℃で３０分間インキュベー
トする。その後、培地を除去すると共にジメチルスルフ
ォキシド100 μL を加え、生成したフォルマザンを可溶
化する。波長570 nmで吸光度を測定し、生成したフォル
マザン量、即ちミトコンドリアの酵素活性を定量する。
Ｎ−アセチルスフィンゴシンが容量依存的に細胞死を抑
制することが示された。

【００１３】実施例２ Ｎ−ヘキサノイルスフィンゴシ
ンによる神経細胞死抑制 実施例１と同様の方法で、Ｎ−ヘキサノイルスフィンゴ
シンが神経細胞死を容量依存的に抑制することが示され
た（図２）。細胞の生存はエムティーティーアッセイに
て定量した。

【００１４】実施例３ Ｎ−オクタノイルスフィンゴシ
ンによる神経細胞死抑制 実施例１と同様の方法で、Ｎ−オクタノイルスフィンゴ
シンが神経細胞死を容量依存的に抑制することが示され
た（図３）。細胞の生存はエムティーティーアッセイに
て定量した。

【００１５】実施例４ スフィンゴミエリナーゼによる
神経細胞死 実施例１と同様の方法で、スフィンゴミエリナーゼが神
経細胞死を容量依存的に抑制することが示された（図
４）。細胞の生存はエムティーティーアッセイにて定量
した。

【００１６】

【発明の効果】本発明の神経細胞の変性又は死滅抑制剤
を用いれば、神経細胞死を抑制することができる。従っ
て、本発明製剤は、神経細胞の変性・死滅を伴う疾患
（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性
側索硬化症などの神経変性疾患、脊椎損傷などの外傷性
神経細胞死、および、抗癌剤などの副作用としてのある
いは糖尿病性の末梢神経ニューロパチー等）の治療方法
として利用されうる。

【００１７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＮＧＦ除去により惹起されるラット胎仔交感神
経細胞死に対するＮ−アセチルスフィンゴシンの抑制効
果の容量依存性を示す図である。

【図２】ＮＧＦ除去により惹起されるラット胎仔交感神
経細胞死に対するＮ−ヘキサノイルスフィンゴシンの抑
制効果の容量依存性を示す図である。

【図３】ＮＧＦ除去により惹起されるラット胎仔交感神
経細胞死に対するＮ−オクタノイルスフィンゴシンの抑
制効果の容量依存性を示す図である。

【図４】ＮＧＦ除去により惹起されるラット胎仔交感神
経細胞死に対するスフィンゴミエルナーゼの抑制効果の
容量依存性を示す図である。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｎ−アシルスフィンゴシンまたはスフィ
   ンゴミエリナーゼを含有する神経細胞の変性又は死滅抑
   制剤。
2. 【請求項２】 神経細胞の変性もしくは死滅を伴う神経
   系の疾患又は障害の治療剤である請求項１記載の神経細
   胞の変性又は死滅抑制剤。
3. 【請求項３】 神経系の疾患又は障害が、神経系の変性
   性疾患である請求項２記載の治療剤。
4. 【請求項４】 神経系の疾患又は障害が、神経系への損
   傷によるものである請求項２記載の治療剤。
5. 【請求項５】 損傷が、外傷、手術、梗塞、感染及び悪
   性腫瘍からなる群から選択される事象によって引き起こ
   される損傷である請求項４記載の治療剤。
6. 【請求項６】 神経系の疾患又は障害が、有毒薬剤への
   露出によって引き起こされる疾患又は障害である請求項
   ２記載の治療剤。
7. 【請求項７】 神経系の疾患又は障害が、栄養不全によ
   って引き起こされる疾患又は障害である請求項２記載の
   治療剤。
8. 【請求項８】 アルツハイマー病、パーキンソン病、筋
   萎縮性側索硬化症、抗癌剤性末梢神経ニューロパチー、
   糖尿病性末梢神経ニューロパチー又は外傷性神経障害の
   治療剤である請求項１記載の神経細胞の変性又は死滅抑
   制剤。