KR102144047B1 - 퇴행성 신경질환 진단용 조성물 - Google Patents

퇴행성 신경질환 진단용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102144047B1
KR102144047B1 KR1020180127656A KR20180127656A KR102144047B1 KR 102144047 B1 KR102144047 B1 KR 102144047B1 KR 1020180127656 A KR1020180127656 A KR 1020180127656A KR 20180127656 A KR20180127656 A KR 20180127656A KR 102144047 B1 KR102144047 B1 KR 102144047B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cox2
acetylation
sphk1
app
mice
Prior art date
Application number
KR1020180127656A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190110927A (ko
Inventor
배재성
진희경
이주연
Original Assignee
경북대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 경북대학교 산학협력단 filed Critical 경북대학교 산학협력단
Priority to US16/982,500 priority Critical patent/US20210003595A1/en
Priority to PCT/KR2019/003284 priority patent/WO2019182371A1/ko
Priority to EP19771942.0A priority patent/EP3769758A4/en
Publication of KR20190110927A publication Critical patent/KR20190110927A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102144047B1 publication Critical patent/KR102144047B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/164—Amides, e.g. hydroxamic acids of a carboxylic acid with an aminoalcohol, e.g. ceramides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90241—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90245—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/10—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material acylation, e.g. acetylation, formylation, lipoylation, myristoylation, palmitoylation

Abstract

본 발명은 퇴행성 신경질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 COX2의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 퇴행성 신경질환에서 COX2의 아세틸화는 현저히 저하되어 있기 때문에 COX2의 아세틸화 여부는 퇴행성 신경질환 진단마커로 활용이 될 수 있으며, 이를 이용하여 퇴행성 신경질환을 더욱 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.

Description

퇴행성 신경질환 진단용 조성물{Composition for diagnosing neurodegenerative disorder}
본 발명은 퇴행성 신경질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 COX2의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머(Alzheimer's disease, 이하 ‘AD'라 함)는 가장 일반적인 형태의 치매로서, 세포 밖 아밀로이드 플라그 및 응집된 아밀로이드 β(Aβ)로 이루어진 세포 내 신경섬유매듭의 축적이 특징적으로 나타나 결과적으로 인지 장애 및 치매 증상이 유발된다. 이러한 특징들 이외에도, 일반적으로 Aβ와 밀접하게 관련이 되어 있는 신경 아교세포(glia cell)(특히, 미세아교세포)의 조절장애 역시 관찰이 된다.
알츠하이머와 같은 퇴행성 신경질환 환자의 뇌에서 기능이 상실된 미세아교세포는 Aβ의 축적에 반응하거나 및/또는 감소된 Aβ 식작용에 의해 전-염증성(pro-inflammatory) 사이토카인들을 분비함으로써 질환의 진행에 관여하고 있다. 미세아교세포의 기능 상실은 또한 만성적인 염증반응을 유발하기도 한다. 이러한 염증반응의 해결은 염증성 반응의 최종 단계에 있으며, Lipoxin A4(LxA4), Resolvin E1(RvE1) 및 Resolvin D1(RvD1)을 포함하는 SPMs(specialized proresolving mediator)라고 불리는 신경염증 종결 조절인자에 의해 염증성 반응이 해소될 수 있다. 이는 M1 표현형에서 M2로 편향되어 활성화된 표현형으로의 전환, 전-염증성 사이토카인의 하향조절(downregulation) 및 사멸세포 및 찌꺼지의 제거와 같은 신경아교세포의 기능을 회복시키는 결과를 가져온다. 최근 연구에 따르면, AD 환자에서 염증반응의 해소 기능 (SPMs)이 실조되어 있다는 것이 보고되고 있다.
스핑고신 카이나제(Sphingosine kinase, 이하 'SphK'라 함) 1 및 2는 스핑고신을 염증반응을 조절하는 것으로 알려져 있는 생리활성 지질인 스핑고신-1-포스페이트(S1P)로 전환하는데 관여하고 있는 핵심 효소이다. 최근, 염증반응에서 SphK의 역할이 다양한 질병(천식, 류마티스 관절염 등)에 관한 연구 주제가 되고 있다. 그러나, AD 환자의 뇌에서 신경염증반응에 대한 SphK의 역할은 충분히 연구가 되어 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 퇴행성 신경질환에서 SphK1의 역할을 밝히기 위해서 예의 노력을 기울인 결과, SphK1은 COX2(cyclooxygenase 2)의 아세틸화를 증가시킴으로써 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하고, 결과적으로 M2-유사한 표현형의 미세아교세포로의 전환을 유도함으로써 발휘된다는 것을 발견하였다. 또한, AD의 뇌에서 SphK1을 증가시키면 COX2의 아세틸화가 증가되고, 결과적으로 신경아교세포를 통한 Aβ 식작용이 개선되어 인지 장애를 개선할 수 있다는 것을 확인하였다. 더 나아가, 알츠하이머 동물모델의 미세아교세포 및 단핵구에서 COX2의 아세틸화가 저하되어 있으며, 이는 COX2 단백질의 565번째 세린에서 나타난다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 COX2(cyclooxygenase-2)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 COX2(cyclooxygenase-2)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료에서 COX2의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 COX2의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 퇴행성 신경질환으로 진단하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 COX2(cyclooxygenase-2)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 COX2(cyclooxygenase-2)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료에서 COX2의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 COX2의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 퇴행성 신경질환으로 진단하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 COX2(cyclooxygenase-2)의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 알츠하이머 동물모델에서 분리한 신경세포에 [14C]acetyl-CoA을 처리하고 COX2를 정제하여 아세틸화 정도를 분석해 본 결과, 야생형 마우스와 비교해, 알츠하이머 동물모델의 신경세포에서는 낮은 정도의 COX2 아세틸화가 나타났고, 야생형 마우스의 신경세포에서는 COX2의 아세틸화가 증가되어 있는 것을 확인하였다.
한편, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 신경세포에서 COX2의 아세틸화는 SphK1에 의해 매개가 되는 것으로서 SphK1의 발현이 저하되면 COX2 아세틸화 및 염증반응을 해소하는 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 저하되어 비정상적인 염증반응들이 일어나 알츠하이머-유사의 병변이 나타난다는 것이 확인되었다. 반면에, SphK1의 발현이 증가되면 신경세포에서 COX2 아세틸화 및 염증반응을 해소하는 신경염증 종결 조절 인자의 분비 증가되고, 미세아교세포의 기능 회복 및 이로 인한 Aβ 식작용이 향상되어 결과적으로 알츠하이머-유사 병변이 완화된다는 것이 확인되었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면 이러한 SphK1에 의한 COX2의 아세틸화는 COX2의 아미노산 서열 중 565번째 세린(S565)에서 나타난다는 것이 확인되었다.
이러한 실험결과들을 근거로, 본 발명자는 COX2의 아세틸화 여부, 바람직하게는 COX2의 565번째 세린(S565)에서의 아세틸화 여부가 퇴행성 신경질환 진단에 유용하게 활용이 될 수 있을 것으로 판단하였다.
이에, 본 발명의 일실시예에서 본 발명자는 565번째 세린이 아세틸화된 COX2에 특이적으로 결합하는 항체를 제작한 후, 알츠하이머 동물모델의 뇌에서 분리한 미세아교세포(microglia) 및 혈액에서 분리한 단핵구(monocyte)에서 발현되는 COX2의 아세틸화 여부를 면역형광염색법 및 웨스턴 블롯을 통해 확인해 본 결과, 알츠하이머 동물모델의 미세아교세포 및 단핵구에서 COX2 565번째 세린(S565)의 아세틸화가 야생형 동물의 그것과 비교하여 현저히 저하되어 있음이 확인되었다.
또한, 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 미세아교세포에 아밀로이드 베타를 처리하여 신경 염증성 환경을 조성한 경우, 그렇지 않았을 때와 비교하여 COX2 565번째 세린(S565)의 아세틸화가 현저히 저하되는 것이 확인되었다.
따라서, COX2의 아세틸화 수준을 측정할 수 있는 제제, 바람직하게는 COX2 565번째 세린(S565)의 아세틸화 수준을 측정할 수 있는 제제는 퇴행성 신경질환의 진단에 매우 유용하게 활용이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 COX2의 아미노산 서열은 GeneBank accession No.AAR23927.1, No.AAA58433.1, No. AAA57317.1 등을 통해서 확인할 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 1로 표시되는 하기 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
[서열번호 1]
mlaralllca vlalshtanp ccshpcqnrg vcmsvgfdqy kcdctrtgfy gencstpefl
triklflkpt pntvhyilth fkgfwnvvnn ipflrnaims yvltsrshli dspptynady
gyksweafsn lsyytralpp vpddcptplg vkgkkqlpds neiveklllr rkfipdpqgs
nmmfaffaqh fthqffktdh krgpaftngl ghgvdlnhiy getlarqrkl rlfkdgkmky
qiidgemypp tvkdtqaemi yppqvpehlr favgqevfgl vpglmmyati wlrehnrvcd
vlkqehpewg deqlfqtsrl iligetikiv iedyvqhlsg yhfklkfdpe llfnkqfqyq
nriaaefntl yhwhpllpdt fqihdqkyny qqfiynnsil lehgitqfve sftrqiagrv
aggrnvppav qkvsqasidq srqmkyqsfn eyrkrfmlkp yesfeeltge kemsaeleal
ygdidavely pallvekprp daifgetmve vgapfslkgl mgnvicspay wkpstfggev
gfqiintasi qslicnnvkg cpftsfsvpd peliktvtin asssrsgldd inptvllker
stel
본 발명에서 상기 COX2의 아세틸화 수준을 측정하는 제제는 아세틸화된 COX2에 특이적인 항체, 항체의 단편 또는 압타머일 수 있다.
상기 “항체(antibody)”는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 상기 항체는 아세틸화된 COX2 이외에는 비아세틸화 COX2 및 다른 단백질에는 결합하지 않는다. 바람직하게는, 본 발명에서의 상기 항체는 565번째 세린이 아세틸화된 COX2 이외에 다른 위치에서의 아미노산이 아세틸화된 COX2에는 결합하지 않는 항체일 수 있다.
상기 항체는 565번째 세린이 아세틸화된 COX2의 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다.
또는, 565번째 세린이 아세틸화된 COX2의 에피토프(epitope) 부위를 포함하는 단백질의 단편을 이용하여 아세틸화된 COX2 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, 아세틸화된 COX2에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉, 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 아세틸화된 COX2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
가장 바람직하게는, 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되는 COX2 단백질에서 565번째 세린의 아세틸화를 포함하는 펩타이드 단편으로서, 본 발명의 항체는 상기 서열번호 2와 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 85% 이상의 서열 동일성, 더 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 본 발명자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드, 즉 서열번호 1로 표시되는 COX2 단백질의 560-570번째 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서 565번째 세린이 아세틸화 되어 있는 펩타이드를 에피토프(epitope)로 인식하는 항체를 제작하였고, 상기 항체가 565번째 세린이 아세틸화된 COX2에는 결합하지만 565번째 세린이 아세틸화되지 않은 COX2에는 결합하지 않는다는 것을 확인함으로써 상기 항체의 특이성 및 상기 에피토프의 유용성을 확인하였다.
본 발명에서 상기 “압타머(aptamer)”는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA 를 말한다. 압타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다. 본 발명에서 상기 압타머는 아세틸화된 COX2에 결합할 수 있는 것이라면 그 종류 및 형태가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 파킨슨병(Parkinson’s disease), 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(Olivopontocerebellar Atrophy), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽병(Niemann-Pick disease), 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 COX2의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트에는 COX2의 아세틸화 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 아세틸화된 COX2를 마커로 인식하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 키트는 웨스턴 블롯, 면역형광염색, ELISA 등을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 이들 키트는 아세틸화된 COX2 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 아세틸화된 COX2 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 이들 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 상기 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 키트는 비-아세틸화 및 아세틸화 COX2 단백질에 모두 결합할 수 있는 항체, 항체의 단편 또는 압타머를 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 본 발명의 키트는 전체 COX2의 발현수준 대비 아세틸화된 COX2의 수준의 비율을 확인할 수 있도록 하여 퇴행성 신경질환을 보다 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 생물학적 시료를 제공하는 단계; (b) 상기 시료에서 COX2의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 COX2의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 퇴행성 신경질환으로 진단하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명자는 아세틸화된 COX2가 퇴행성 신경 질환의 진단 마커로서 기능할 수 있음을 처음 발견하였고, 이에 COX2의 아세틸화 수준을 측정하여 퇴행성 신경 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 (a) 단계에서 생물학적 시료란 혈액, 혈구, 뇌 조직, 신경세포, 뇌척수액, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 바람직하게는 혈액, 혈구, 뇌 조직, 신경세포, 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 알츠하이머 동물모델의 뇌 조직에서 분리한 미세아교세포(microglia) 뿐만 아니라 혈액에서 분리한 단핵구(monocyte)에서도 COX2의 565번째 세린에서의 아세틸화 수준이 야생형 마우스와 비교해 현저히 저하되어 있음이 확인되었으며, 이러한 결과는 곧 혈액을 통해서도 비침습적으로 퇴행성 신경질환을 진단할 수 있다는 것을 의미하므로, 매우 놀라운 발견이라 할 수 있다.
본 발명의 상기 (b) 단계에서 COX2의 아세틸화 정도를 측정하는 방법은 방사선자동사진법, 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법, 분자량 분석법, 액체 색층 분석 매스 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역형광염색법, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에서는 [14C]acetyl-CoA 존재 하에서 반응시킨 신경세포의 COX2 단백질을 면역침강법을 이용하여 분리 후, [14C]에 대해 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법을 사용하여 COX2의 아세틸화 정도를 평가하거나, 565번째 세린이 아세틸화된 COX2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 알츠하이머 동물모델의 뇌 조직 또는 미세아교세포에서 COX2의 아세틸화 수준을 면역형광염색법 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
본 발명의 상기 (c) 단계에서는 상기 (b) 단계의 방법으로 측정한 피검체의 COX2 아세틸화 정도를, 동일한 방법으로 측정한 정상인의 COX2 아세틸화 수준과 비교한다. COX2의 아세틸화 수준이 건강한 정상인에 비하여 감소한 피검체는 퇴행성 신경 질환에 걸린 것으로 판정할 수 있다.
상기 (c) 단계에서 COX2의 아세틸화 수준은 (아세틸화 COX2의 발현 수준/전체 COX2의 발현 수준)으로 정량화하여 비교할 수 있다.
한편, 본 발명의 일실시예에 따르면 알츠하이머 동물 또는 신경 염증성 환경에 노출이 된 신경세포에서는 COX2의 아세틸화 및 신경염증 종결 인자의 분비가 야생형과 비교해 현저히 감소되어 있는 것이 확인되었으며, 이러한 현상은 SphK1의 발현 수준과도 밀접하게 관련이 있는 것으로 확인이 되었다.
따라서, 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 수득한 생물학적 시료에서 COX2의 아세틸화 정도를 측정하고, 동일 시료에서 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 추가로 측정한 결과 COX2의 아세틸화 정도 및 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군과 비교하여 감소되어 있다면 해당 환자에게서 퇴행성 신경질환이 진행되고 있음을 보다 정확하게 진단할 수 있다.
이 경우, 상기 SphK1의 mRNA 발현량 측정은 RT-PCR, 정량적 또는 반정량적 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative RT-PCR), 정량적 또는 반정량적 리얼 타임 RT-PCR(Quentitative or semi-Quentitative real-time RT-PCR), 노던 블롯(northern blot) 및 DNA 또는 RNA 칩(chip) 등을 이용하여 측정될 수 있으며, 상기 SphK1의 단백질 발현량 측정은 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩 등을 이용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 수득한 생물학적 시료에서 SphK1의 mRNA 또는 단백질의 발현 및 COX2의 아세틸화가 저하되어 있을 뿐만 아니라, 신경염증 종결 조절 인자의 분비량이 감소되어 있는 것을 추가로 확인한다면 보다 더 정확하게 퇴행성 신경질환이 진행되고 있는지 여부를 판정할 수 있다.
본 발명에 따르면, 퇴행성 신경질환에서 COX2의 아세틸화는 현저히 저하되어 있기 때문에 COX2의 아세틸화 여부는 퇴행성 신경질환 진단마커로 활용이 될 수 있으며, 이를 이용하여 퇴행성 신경질환을 더욱 신속하고 정확하게 진단할 수 있다.
도 1a~1f는 SphK1이 Acetyltransferase로서 COX2의 S565에 아세틸화 시키는 것을 나타내는 결과이다.
도 1a, b는 SphK1과 acetyl-CoA의 결합(a) 및 해리도(b)를 평가한 결과이다.
도 1c는 SphK1, acetyl-CoA, sphingosine의 존재하에 COX2 아세틸화를 평가한 결과이다([14C] 아스피린을 처리한 시험군을 양성 대조군으로 설정).
도 1d는 LC-MS/MS를 이용해 SphK1, acetyl-CoA 및/또는 sphingosine의 존재하에 COX2의 아세틸화에 의한 분자량 변화를 확인한 결과이다.
도 1e는 LC-MS/MS를 이용해 SphK1, acetyl-CoA 및/또는 sphingosine의 존재하에 COX2의 S565 잔기에 아세틸화가 일어나는 것을 확인한 결과이다.
도 1f는 COX2단백질의 S565에 돌연변이를 일으켰을 때, 아세틸화가 잘 일어나지 않는 것을 확인한 결과이다.
도 2a~2d는 SphK1을 억제하였을 때, COX2 아세틸화의 감소에 의해 신경염증 종결 조절 인자가 감소됨을 나타내는 결과이다.
도 2a는 야생형(WT) 신경세포에 SphK1 siRNA를 처리 하였을 때, SphK1 및 SphK2의 발현을 평가한 결과이다.
도 2b는 신경세포에 SphK1 siRNA를 처리 하였을 때, COX2 단백질의 아세틸화를 확인한 결과이다([14C] 아스피린을 처리한 야생형 신경세포을 양성 대조군으로 설정).
도 2c는 신경세포에 SphK1 siRNA를 처리 하였을 때, LxA4, RvE1 및 RvD1 등 신경염증 종결 조절 인자(SPMs) 분비를 확인한 결과이다.
도 2d는 신경세포에 SphK1 siRNA를 처리 하였을 때, LC-MS/MS를 이용하여 15-R-LxA4의 분비를 확인한 결과이다.
도 3a~3c는 APP/PS1 마우스는 COX2 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자(SPMs) 분비가 감소되어 있고, 이러한 감소는 SphK1의 과발현에 의해 개선된다는 것을 확인한 결과이다.
도 3a는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스에서 유래한 신경세포에서 COX2 단백질의 아세틸화 어세이를 수행한 결과이다. [14C] 아스피린을 처리한 신경세포을 양성 대조군으로 설정했다.
도 3b는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스에서 래한 신경세포의 CM에서 LxA4 및 RvE1의 단백질량을 측정한 결과이다.
도 3c는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스에서 래한 신경세포에서 LC-MS/MS를 이용하여 15-R-LxA4의 양을 특정한 결과이다.
도 4a~4c는 APP/PS1 마우스에서 증가된 SphK1에 의해 분비된 신경염증 종결조절 인자는 신경염증을 감소시킨다는 것을 확인한 결과이다.
도 4a는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포(Iba1)의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 이를 정량화한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 4b는 마우스의 뇌 피질에서 별아교세포(GFAP)의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 이를 정량화한 결과(오른쪽)을 나타낸 결과이다.
도 4c는 마우스의 뇌에서 M1 및 M2 염증성 마커의 mRNA 발현수준을 평가한 결과이다(M1 마커: TNF-a, IL-1b, IL-6 and iNOS, 면역조절 인자 : IL10, M2 마커: IL-4, TGF-b and Arg1).
도 5a~5f는 증가된 SphK1에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자가 미세아교세포의 식작용을 개선시킨다는 것을 확인한 결과이다.
도 5a는 APP/PS1 및 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 Aβ 플라크 주위의 미세아교세포를 확인한 결과이다.
도 5b는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 미세아교포의 식작용 능력을 확인한 결과이다.
도 5c는 APP/PS1 및 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포의 리소좀 내에서 Aβ 플라크가 소화되는 것으로 확인한 결과이다.
도 5d, e는 야생형, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스의 미세아교세포에서 Aβ 분해 효소 (NEP, MMP9 및 IDE) 및 식작용 마커 (CD36)의 발현을 확인한 결과이다.
도 5f는 APP/PS1 및 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌 피질에서 식작용이 일어난 Aβ 플라크의 크기를 확인한 결과이다.
도 6a~6i는 APP/PS1 마우스에서 증가된 SphK1에 의해 분비된 신경염증 종결 조절인자가 AD 병변을 감소시킨다는 것을 나타낸 결과이다.
도 6a는 APP/PS1 및 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌 수질 및 해마에서 티오플라빈 S(ThioS, Aβ 플라크)의 면역형광염색을 나타내는 도면과(왼쪽), Aβ가 차지하고 있는 면적을 정량한 결과이다(오른쪽, n=6/그룹).
도 6b, c는 마우스 뇌에서 Aβ40 및 Aβ42의 축적을 면역형광염색(b) 또는 ELISA 키트(c)로 분석한 결과이다.
도 6d는 맥관장애 정량화한 결과이다.
도 6e는 타우 단백질 정량화한 결과이다.
도 6f-i는 각 동물군의 뇌 피질에서 시냅토파이신(f), MAP2(g), 시냅신1 (h) 또는 PSD95 (i)를 면역형광염색 및 정량화하여 나타낸 결과이다.
도 7a~7h은 APP/PS1 마우스에서 SphK1 과발현에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자의 증가가 인지 기능을 회복시켰음을 나타낸 도면이다.
도 7a는 야생형 (n = 14), APP/PS1 (n = 12), APP/PS1/SphK1 tg (n = 12), 및 SphK1 tg (n = 13) 마우스의 모리스 워터 메이즈 테스트를 통한 학습 및 기억력 평가 결과이다.
도 7b~d는 시험 11일째에 표적 플랫폼에서 소요된 시간(b), 다른 사분면에서 소요된 시간(c)을 측정하고, 경로의 길이, 수영속도 및 60초 동안에 각각의 동물이 작은 타겟 지역으로 들어간 횟수(d)를 측정한 결과이다.
도 7e는 테스트 10일째에 수영 경로를 나타낸다.
도 7f는 fear conditioning 시험 동안에 contextual 및 tone task 결과를 나타낸 것이다.
도 7g는 오픈필드 테스트 동안에 벽면 및 중심부에서 소요된 시간을 측정한 결과와 중심부의 비율을 나타낸 결과이다.
도 7h는 오픈필드 테스트 동안에 마우스의 이동 경로를 나타낸 것이다.
도 8a~8d은 SphK1에 의해 생성된 COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비 촉진한다는 것을 나타낸 도면이다.
도 8a는 COX2 아세틸화제의 화학구조를 나타낸 도면이다.
도 8b는 COX2 아세틸화제 처리에 의한 신경염증 종결 조절 인자(SPMs) 분비를 확인한 결과이다.
도 8c는 N-acetyl sphingosine이 COX2 아세틸화를 일으키는 것을 확인한 결과이다.
도 8d는 LC-MS/MS를 이용해 N-acetyl sphingosine의 존재하에 COX2의 S565 잔기에 아세틸화가 일어나는 것을 확인한 결과이다.
도 9a~9d는 COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비 촉진하여 알츠하이머 동물모델의 AD 병변을 감소한다는 것을 나타낸 도면이다.
도 9a는 야생형, APP/PS1, APP/PS1에 N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine 유도체) 및 S1P를 주사한 마우스의 뇌 피질에서 미세아교세포(Iba1)의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 이를 정량화한 결과(오른쪽)를 나타낸 것이다.
도 9b는 마우스의 뇌 피질에서 별아교세포(GFAP)의 면역형광 이미지(왼쪽) 및 이를 정량화한 결과(오른쪽)을 나타낸 결과이다.
도 9c는 APP/PS1 및 APP/PS1에 N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine 유도체) 및 S1P를 주사한 마우스의 뇌 수질 및 해마에서 티오플라빈 S(ThioS, Aβ 플라크)의 면역형광염색을 나타내는 도면과(위쪽), Aβ가 차지하고 있는 면적을 정량(아래쪽)한 결과이다.
도 9d는 야생형, APP/PS1, APP/PS1에 N-acetyl sphingosine, FTY720 (sphingosine 유도체) 및 S1P를 주사한 마우스의 모리스 워터 메이즈 테스트를 통한 학습 및 기억력 평가 결과이다.
도 10은 ac-S565 항체가 특이적으로 COX2의 S565 잔기의 아세틸화를 검출하는 것을 확인한 결과이다(N-AS: N-acetyl sphingosine).
도 11a은 야생형(WT) 및 APP/PS1 마우스에서 유래한 미세아교세포에서 발현하는 COX2 단백질 및 COX2의 S565 아세틸화 정도를 형광면역염색법을 통해 확인하고, 도 11b는 이를 정량화하여 나타낸 결과이다. (n=6/그룹).
도 12a는 야생형 및 APP/PS1 마우스에서 유래한 미세아교세포에 발현하는 COX2 단백질 및 COX2의 S565 아세틸화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 확인하고, 도 12b는 이를 정량화하여 나타낸 결과(b)이다. (n=6/그룹).
도 13a는 아밀로이드 베타를 처리한 사람 유래의 미세아교세포에서 발현하는 COX2 단백질 및 COX2의 S565 아세틸화 정도를 형광면역염색법을 통해 확인하고, 도 13b는 이를 정량화하여 나타낸 결과(b)이다. (n=4/그룹).
도 14a는 아밀로이드 베타를 처리한 사람 유래의 미세아교세포에서 발현하는 COX2 단백질 및 COX2의 S565 아세틸화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 확인하고, 도 14b는 이를 정량화하여 나타낸 결과(b)이다. (n=4/그룹).
도 15a는 야생형 및 APP/PS1 마우스에서 유래한 혈구세포에서 발현하는 COX2 단백질 및 COX2의 S565 아세틸화 정도를 웨스턴블롯을 통해 확인하고, 도 15b는 이를 정량화여 나타낸 결과이다. (n=3/그룹).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법
1. 마우스
IACUC(Kyungpook National University Institutional Animal Care and Use Committee)에서 마우스 실험에 대한 승인을 받았다. C57BL/6 마우스(Charles River, UK)를 바탕으로 APPswe(hAPP695swe) 또는 PS1(presenilin-1M146V)를 과발현시킨 형질전환 마우스 라인을 이용하였다[이하, APP 마우스: APPswe를 과발현하는 마우스, PS1 마우스: presenilin-1M146V를 과발현하는 마우스; GlaxoSmithKline]
SphK1 tg (SphK1 유전자 과발현 마우스)와 APP 마우스 및 APP/PS1 마우스와 교배시켜 APP/PS1/SphK1 tg 마우스를 제조하였다.
2. 마우스 혈액으로의 단핵구 분리
심장채혈을 통하여 마우스의 혈액을 채취한 후, 채취한 혈액 양의 10배에 해당하는 양의 Ammonium chloride를 넣어주어 혈액내의 적혈구를 용해시킨다. 적혈구를 용해시킨 혈액을 원심분리하여 상층액을 제거 후, 단핵구를 분리하였다.
3. ac-S565 항체 제작
서열번호 1의 COX2 단백질의 565번째 세린(S565)의 아세틸화 여부를 검출할 수 있는 항체를 제작하고자, 서열번호 2로 표시되는 N-GCPFTSacFSVPD-C 서열의 펩타이드를 제작하고 운반체 단백질(keyhole limpet hemocyanin)과 접합시킨 후, 준비한 상기 펩타이드를 하기 표 1과 같은 면역 진도표에 따라 토끼에 면역화하여 토끼 다클론 항체를 제작하였다.
Figure 112018105241163-pat00001
4. SphK siRNA 처리
SphK1 siRNA (Dharmacon SMART pool) 및 siRNA 대조군 (Dharmacon)을 E18 C57BL/6 마우스의 신경세포에 48시간 동안 처리 하였다. 신경세포를 수집하여 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자를 분석 하였다.
5. 면역형광법
마우스의 대뇌 및 해마를 고정 후, 아밀로이드-β(Aβ) 42에 대한 항-20G10(마우스, 1:1000) 및 Aβ 40에 대한 항-G30(토끼, 1:1000), 항-MAP2(닭, 1:2000), 항-Synaptophysin(마우스, 1:100), 항-Synapsin1(토끼, 1:500), 항-PSD95(마우스, 1:100), 항-Iba-1(토끼, 1:500), 항-GFAP(토끼, 1:500)을 함께 배양하였다. 상기 부위를 Fluoview SV1000 이미징 소프트웨어(Olympus FV1000, Japan)를 장착한 레이저 스캐닝 공초점 현미경 또는 Olympus BX51 현미경을 이용하여 분석하였다. Metamorph software(Molecular Devices)를 이용하여 총 조직의 넓이에 대한 염색된 부위의 넓이의 퍼센트를 정량화 하였다.
또한, 야생형 및 APP/PS1 9개월 마우스의 대뇌조직과 인간유래 미세아교세포를 항-ac-S565(토끼, 1:100), 항-COX2(마우스, 1:500, Thermo Fisher Scientific), 항-Iba1(염소, 1:500, Abcam)을 함께 배양하였다. 상기 대뇌조직 및 인간유래 미세아교세포를 MetaMorph(Molecular Devices, USA)를 이용하여 항-COX2 및 항-Iba1에 염색된 세포 중 항-ac-S565, 항-COX2 및 항-Iba1에 염색된 세포의 퍼센트를 정량화하고 분석하였다.
6. 정량적 리얼타임 PCR
상업적으로 이용 가능한 RNeasy 키트 (QIAGEN)를 이용하여 제조사의 메뉴얼에 따라 RNA를 추출하였다. cDNA는 상업적으로 이용 가능한 cDNA 키트 (Takara Bio Inc.)를 이용하여 전체 RNA 5μg 으로부터 합성되었다. 정량적 리얼타임 PCR은 Corbett research RG-6000 real-time PCR instrument을 이용하여 수행했다.
7. 웨스턴블롯
웨스턴 블롯팅을 이용하여 상기 단백질들의 발현을 분석하였다. 우선CD36(Novus biolobicals) 및 β-액틴(Santa Cruz)에 대한 항체를 이용하였고, 밀도 정량화(densitometric quantification)는 ImageJ 소프트웨어(US National Institutes of Health)를 이용하여 수행하였다.
또한, 재조합 COX2 단백질을 aspirin, N-acetyl sphingosine(Sigma, 01912, N-AS)와 반응하여 웨스턴 블롯 샘플을 준비하였다. 그리고 야생형 및 APP/PS1 9개월 마우스의 대뇌로부터 미세아교세포를 분리하여, 웨스턴블롯 샘플을 준비하였으며, 미세아교세포(Applied Biologics Materials, USA)를 아밀로이드 베타와 함께 배양한 후, 웨스턴 블롯 샘플을 준비하였다. 상기 준비한 웨스턴 블롯 샘플을 폴리아크릴아마이드 젤에서 전기영동을 하여 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로오스 필터에 옮긴 후 항-ac-S565(토끼, 1:500), 항-COX2(토끼, 1:1,000, Abcam), 항-actin(마우스, 1:1,000, Santa Cruz) 항체와 결합시킨 후, 2차 항체를 이용하여 밴드를 형상화하고, ImageJ(National Institutes of Health, USA)를 이용하여 정량화하고 분석하였다.
8. 면역효소검사법
상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트(Biosource)를 이용하였고, 마우스의 반구를 균질화하여 0.02M의 구아니딘(guanidine)을 포함하는 완충액에 넣어 Aβ ELISA를 위한 시료를 준비 하였다. 신경염증 종결조절 인자 측정을 위해서는 마우스 대뇌로부터 신경세포를 배양 후 Conditioned media (CM)를 준비하였다. 이 후, 제조사의 메뉴얼에 따라, Aβ 및 SPM에 대한 ELISA를 수행하였다.
9. 행동실험
학습 및 기억에 대한 잠재적 효과를 확인하기 위하여, MWM(Morris water maze)와 fear conditioning 실험을 수행하였다. MWM는 마우스에 대하여 10일 동안 하루에 4번씩 과제를 학습시켰고, 11일째 되는 날에 플랫폼을 제거하고, 탐침시험(probe trial)을 수행하였다. Fear conditioning은 첫째 날은 마우스를 conditioning chamber에 넣고, 소리 자극(10 kHz, 70 dB) 및 전기자극(0.3 mA, 1 s)을 주었다. 둘째 날은 첫째 날과 같은 conditioning chamber에서 자극 없이 공간에 대한 기억력을 확인했고, 셋째 날은 다른 conditioning chamber에서 소리자극만 주었을 때 두려움에 대한 기억력 테스트를 수행하였다. 운동능력과 즉각적인 활동력을 평가하기 위한 오픈필드 테스트를 수행하였다. 오픈필드 테스트는 마우스를 10분 동안 사각형의 박스에 넣어 전반적인 운동은력과 시간 및 거리를 측정하였다.
10. COX2 아세틸화 정도 측정 방법
[14C]acetyl-CoA 존재 하에서 37℃ 1시간 반응시킨 신경세포의 COX2 단백질을 면역침강법을 이용하여 분리한 후, [14C]에 대해 liquid scintillation counting을 수행하였다.
11. Acetyltransferase의 효소학적 분석
SphK1의 acetyl-CoA 결합 활성을 10mM sphingosine의 존재 하에서 필터 결합 분석으로 분석 하였다. SphK1에 대한 [3H] acetyl-CoA의 결합 속도 (Vbinding)를 acetyl-CoA 농도로 나타내었다. 포화 플롯의 비선형 회귀 분석은 Kcat (촉매 상수) 및 KM (Michaelis-Menten 상수)를 이용하여 acetyl-CoA 및 SphK1 결합 활성을 나타내었다.
12. LC-MS/MS
신경세포에서 SphK1과 신경염증 종결조절 인자의 분비의 관계를 확인하기 위해, 9개월 된 WT, APP/PS1, APP/PS1/SphK1 tg 및 SphK1 tg 마우스로부터 신경세포를 분리하였다. 신경세포를 초음파 처리하고 2.5mM acetyl-CoA (Sigma) (24시간, 37℃)와 함께 배양하였다. 또한, CM은 SphK1 siRNA 또는 대조군 siRNA로 처리한 신경세포로부터 수확 하였다. 각각의 세포 용해물 또는 CM의 200㎕ 분액을 15-S-LxA4-d5 (내부 표준, Cayman chemical) 용액 100㎍/㎖ 100㎕, 1% 포름산 용액 100μl 및 600μl의 물을 혼합 한 후, 에틸아세테이트 4ml를 첨가 하였다. vortexing과 centrifuging (13,200 rpm) 후 각각 10 분 동안, 혼합물을 2 시간 동안 deep freezer에서 동결시켰다. 유기 상층액을 분리하고, 질소 기류 하에서 건조시켰다. 남은 용액을 LC-MS/MS 시스템에 주입 된 60% 아세토니트릴 용액으로 재구성 하였다. 이 샘플은 Agilent 1290 HPLC 시스템에 연결된 Agilent 6470 Triple Quad LC-MS/MS 시스템 (Agilent, Wilmington, DE, USA)을 사용하여 15-R-LxA4 농도 분석을 수행하였다.
COX2의 아세틸화 부위를 확인하기 위해 trichroloacetic acid (Merck)로 COX2 효소를 침전시키고 건조시켰다. 건조 된 추출물을 10μL의 5M 우레아 용액에 재현탁하고 37℃에서 0.1M 암모늄바이카보네이트 완충액을 1μg 트립신 (Promega)과 함께 16시간 동안 배양했다. 그런 다음 샘플을 1M DTT (GE Healthcare)로 실온에서 1시간 동안 처리 한 다음 1M iodoacetamide (Sigma)로 1시간 동안 알킬화시켰다. 시퀀싱을 위해 단백질 샘플을 ZORBAX 300SB-C18 컬럼에 로드했다. BioTools 3.2 SR5 (Bruker Daltonics)로 펩타이드를 확인하였다.
13. COX2 아세틸화제 처리
신경염증 종결조절 인자 측정을 위해서는 마우스 대뇌로부터 신경세포를 배양 후 10nM N-acetyl sphingosine 1 phsosphate (Toronto Research chemicals, C262710) 및 N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912)를 처리하여 CM을 준비하였다. COX2 아세틸화 분석을 위해서는 마우스 대뇌로부터 신경세포를 배양 후 2uCi [14C]N-acetyl sphingosine (ARC, ARC1024) 처리하여 준비하였다. 또한, 인 비보(In vivo) 실험을 위하여는 7개월령의 APP/PS1 마우스에 5mg/kg N-acetyl sphingosine (Sigma, 01912), 1mg/kg FTY720 및 3uM S1P를 4주 동안 매일 복강주사를 통해 주입하였다.
14.통계학적 분석
두 그룹의 비교를 위하여 학생의 T-test를 수행하는 반면, 다수의 그룹의 비교를 위해서는 SAS 통계학적 패키지 (release 9.1; SAS Institute Inc., Cary, NC)에 따라서 Tukey’s HSD 테스트 및 분산 테스트의 반복측정분석을 수행하였다. *p<0.05, ***p<0.001 를 유의적인 것으로 간주하였다.
실험결과
1. SphK1는 acetyltransferase로서 COX2의 S565 잔기에 아세틸화를 유도함
SphK1의 acetyltransferase 활성을 확인하기 위해, 효소로부터의 아세틸기의 결합 및 해리 분석을 수행 하였다. SphK1에 아세틸기의 결합은 acetyl-CoA의 농도가 증가함에 따라 포화되어 KM 및 Kcat 값은 각각 58.2㎛ 및 0.0185min-1이었다 (도 1a). 평형 투석 실험 후, 결합된 아세틸기는 또한 농도 의존적으로 경쟁적인 유리 acetyl-CoA의 존재하에 acetyl-CoA:SphK1 복합체로부터 해리되었다. acetyl-CoA와 SphK1의 이러한 해리는 높은 억제제 농도로 포화되어 6.8㎛의 KD 값을 나타내었다 (도 1b). KM 값 (즉, 결합 친화성)과 비교하여 더 낮은 KD (즉, 해리 상수) 값은 SphK1의 acetyltransferase 특성을 제시 하였다.
다음으로, COX2와 관련하여 SphK1의 acetyltransferase 활성을 확인하기 위해, 정제된 SphK1을 sphingosine의 존재 또는 부재하에 COX2 및 [14C] acetyl-CoA와 함께 배양 후 아세틸화를 측정하였다. 또한 COX2 S516 잔기에 아세틸화를 일으킨다고 알려진 아스피린을 양성대조군으로 사용하여 아세틸화 정도를 확인하였다. 도 1c의 결과를 참고하면, SphK1이 Sphingosine 존재 하에서 COX2에 대해 아스피린보다 더 높은 수준의 아세틸화를 유도하는 것을 확인할 수 있으며, 이는 SphK1이 acetyltransferase 활성을 나타내어 sphingosine 또는 sphingosine 중간체를 통해 COX2에 아세틸화를 유도할 수 있음을 나타낸다(도 1c).
마지막으로, SphK1에 의해 아세틸화된 COX2의 아세틸화 위치를 확인하기 위해 SphK1, acetyl-CoA 및 sphingosine을 COX2에 처리하였다.
위와 같이, SphK1, acetyl-CoA 및 sphingosine을 처리한 COX2는 아세틸기를 갖고, sphingosine 없이 처리한 COX2는 아세틸기를 갖고 있지 않았다. 또한, SphK1의 존재 하에서 COX2의 펩타이드 560-GCPFTSFSVPDPELIK-575에 대한 세린 565 (S565)가 아세틸화 된 것으로 확인되었다 (도 1d,e). 이의 인과 관계를 확립하기 위해 본 발명자는 COX2의 S565를 Ala 565 잔기 (S565A)로 돌연변이 시킨 후, 아세틸화 분석을 수행했다. 야생형의 COX2는 SphK1과 sphingosine에 의해 아세틸화되었지만 S565A 돌연변이된 COX2는 SphK1 존재 하에서 아세틸화가 감소되었으며, 이러한 결과는 COX2의 S565가 SphK1 매개 COX2 아세틸화의 주요 표적 부위임을 나타낸다(도 1f). 특히 SphK1에 의한 COX2 S565의 아세틸화는 아스피린이 아세틸화 시키는 위치(S516)와는 다른 위치임을 확인 하였다.
2. 신경세포에서 SphK1을 억제하였을 때, COX2 아세틸화의 감소에 의해 신경염증 종결 조절 인자 분비 감소를 초래함
신경세포에서 SphK1과 COX2 아세틸화의 상관관계를 보다 직접적으로 확인하기 위해, 야생형 신경세포에 SphK1 siRNA로 처리하고 COX2 아세틸화를 확인하였다. SphK1 siRNA를 처리한 신경세포에서 COX2 아세틸화가 감소하는 것을 확인 하였다 (도 2b).
다음으로 COX2 아세틸화에 의한 신경염증 종결 조절인자의 변화를 관찰하였다. SphK1 siRNA를 처리한 신경세포로부터 유래한 CM에서 신경염증 종결 조절 인자인 LxA4 및 RvE1이 감소되어 있음을 확인하였다(도 2c).
또한, LC-MS/MS를 이용하여 신경염증 종결 조절 인자를 측정하였을 때, COX2 아세틸화에 의해 생성되는 15-R-LxA4가 SphK1 siRNA를 처리한 신경세포에서 감소되어 있었다(도 2d). 즉, SphK1을 억제하였을 때, COX2 아세틸화의 감소에 의해 신경염증 종결 조절 인자(특히 15-R-LxA4)가 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.
3. 알츠하이머 동물모델은 COX2 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자 분비가 감소되어 있고, 이는 SphK1 과발현에 의해 개선됨
본 발명자들은 SphK1 siRNA 처리한 후 나타나는 상기 결과들이 알츠하이머 동물 모델에서도 일어나는지 확인하기 위해 9개월령 마우스에서 분리한 신경세포에 [14C]acetyl-CoA을 처리하고, COX2를 정제하여 아세틸화 정도를 분석하였다. 야생형 마우스와 비교해, APP/PS1 마우스의 신경세포에서는 낮은 정도의 COX2 아세틸화가 나타났고, APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 신경세포에서는 COX2의 아세틸화가 증가되어 있었다(도 3a).
LxA4 및 RvE1 발현량은 야생형 신경세포로부터 유래한 CM에서보다 APP/PS1 신경세포로부터 유래한 CM에서 현저히 감소되어 있었으며, APP/PS1/SphK1 tg 신경세포로부터 유래한 CM에서는 회복되어 있었다(도 3b). 또한, LC-MS/MS를 이용하여 신경염증 종결 조절 인자를 측정 하였을 때, COX2 아세틸화에 의해 생성되는 15-R-LxA4가 알츠하이머 동물모델에서 감소되어 있었으며, SphK1을 과발현 하였을 때 회복되어 있었다(도 3c). 즉, 알츠하이머 동물모델에서 COX2 아세틸화 및 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 감소되어 있고, 이는 SphK1의 과발현에 의해 개선될 수 있음을 의미한다.
4. 증가된 SphK1이 APP/PS1 마우스에서 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경 염증을 조절함
본 발명자들은 증가된 SphK1이 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서, 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 관찰하였다. APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 미세아교세포와 별아교세포의 현저한 저하를 나타내었다(도 4a,b). 게다가, APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 전-염증성 M1 마커들과 면역 조절 사이토카인들의 감소를 나타냈으며, 항-염증성 M2 마커들의 발현이 증가되어 있었다(도 4c).
종합적으로, 이러한 결과들은 SphK1 과발현은 COX2의 아세틸화를 유도함으로써 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하여 AD 뇌에서 염증 반응을 개선할 수 있음을 나타낸다.
5. SphK1 과발현에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자는 미세아교세포의 Aβ식작용을 조절함
증가된 SphK1에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자가 Aβ로 미세아교세포의 모집(recruitment)를 회복시키는지 여부를 판단하기 위해, 플라크 주변의 미세아교세포의 숫자를 정량화했다. 그 결과, APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 미세아교세포의 모집이 증가되어 있었다(도 5a).
그 다음으로, 뇌 절편을 이용하여 식세포 어세이를 수행하였다. APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 식세포 작용을 나타내는 미세아교세포의 수가 증가되어 있었다(도 5b). 이러한 효과를 더 알아보기 위하여, 미세아교세포의 Aβ 식작용성을 in vivo로 평가하였다. APP/PS1/SphK1 tg 뇌는 리소좀 및 Aβ와 함께 염색되는 미세아교세포의 수가 증가되어 있었다. 중요한 것은, 미세아교세포 내의 파고리소좀(phagolysosome)은 APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 피질에서 증가되어 있었다. 플라크와 연관된 미세아교세포 분석 결과, SphK1이 과발현된 APP/PS1 마우스에서 파고리소좀에 함입된 Aβ를 포함하고 있는 세포의 비율이 증가한 것으로 나타났다. 파고리소좀에 포함된 Aβ의 양이 APP/PS1/SphK1 tg 마우스의 뇌에서 증가되어 있었다(도 5c).
다음으로, Neprilysin(NEP), matrix metallopeptidase 9(MMP9), 인슐린 분해 효소(IDE) 등 Aβ 분해 효소의 발현을 분석 하였다. 이러한 효소들의 발현량은 변하지 않았지만, 미세아교세포의 식작용이 일어날 때 증가하는 것으로 알려진 CD36은 APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 회복되었다(도 5d,e).
한편, 미세아교세포의 식자용은 Aβ 플라크의 core 보다 Aβ의 외부 부분의 감소를 유도한다고 알려져 있다. 이에 따른 Aβ 플라크 형태 분석에서 APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 작은 (<25 ㎛) 플라크를 유의하게 증가시켰고, 중형 (25-50 ㎛) 및 대형 (> 50 ㎛) 플라크는 유의하게 감소되어 Aβ의 외측 부분이 미세 아교에 의해 식작용 되었다는 것을 확인하였다(도 5f).
이상의 결과를 통해, 증가된 신경세포의 SphK1은 COX2의 아세틸화를 증가시킴으로써 신경염증 종결 조절 인자의 분비가 증가되어, 결과적으로 APP/PS1 마우스에서 미세아교세포의 Aβ 식작용이 증대 되었음을 알 수 있었다.
6. SphK1 과발현에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자는 마우스의 AD 병변을 완화함
APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 증가된 SphK1 활성에 의해 분비된 신경염증 종결 조절 인자가 AD의 병변에 어떠한 영향을 끼치는지를 알아보기 위하여, 첫 번째로 Aβ 프로파일을 규명하였다. Aβ40 및 Aβ42의 티오플라빈 S(ThioS)염색, 면역형광 염색 및 ELISA 실험 결과, APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 Aβ가 현저히 낮은 것으로 나타났다(도 6a~c). APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서 뇌의 아밀로이드 맥관장애(angiopathy) 역시 감소되어 있었다(도 6d). 야생형 마우스와 비교해 APP/PS1 마우스에서 시냅토파이신, MAP2, 시냅신1 및 PSD95 라벨 밀도가 감소되어 있었다. 그러나, APP/PS1/SphK1 tg 마우스에서는 야생형의 그것과 유사한 정도로 라벨 밀도가 회복되어 있었다(도 6f~i).
7. SphK1 과발현에 의해 분비된 신경염증 조절 인자는 알츠하이머 동물모델의 인지기능을 회복시킴
본 발명자들은 또한 학습과 기억의 변화를 평가하기 위하여 모리스 워터 메이즈 실험 및 fear conditioning 실험을 수행하였다. 주령이 오래된 APP/PS1 마우스는 기억 형성에서 심각한 문제를 나타낸 반면에, APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 이러한 문제가 어느 정도 완화되어 있는 것을 확인할 수 있었다(도 7a~f).
운동능력과 즉각적인 활동력을 평가하기 위하여, 오픈필드 테스트를 수행하였다. APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 향상된 운동능력 및 즉각적인 활동력을 나타내었다 (도 7g~h).
종합적으로, 이러한 결과들은 APP/PS1 마우스와 비교해 APP/PS1/SphK1 tg 마우스는 신경세포에서 SphK1의 발현이 증가되어 있고, 이로 인해 COX2의 아세틸화가 증가되어, 결과적으로 Aβ의 축적이 감소되고 학습 및 기억능력이 향상되었다는 것을 나타낸다.
8. SphK1에 의해 생성된 COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진시킴
본 발명자는 상기 실험결과들을 바탕으로 COX2의 아세틸화를 유도할 수 있는 화합물이 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료효과를 나타낼 것인지 여부를 직접적으로 확인하기 위해 일련의 실험을 진행하였다.
구체적으로, 본 발명자는 N-acetyl sphingosine 1 phsosphate 및 N-acetyl sphingosine이 COX2의 아세틸화를 유도할 수 있을 것으로 예상하였고, 이를 이용하여 이하 실험을 진행하였다(도 8a).
우선, 상기 선정된 화합물들이 신경세포에서 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진하는지 확인하기 위해서, APP/PS1 신경세포에 N-acetyl sphingosine 1 phsosphate 또는 N-acetyl sphingosine을 처리한 후 신경염증 종결 조절 인자의 발현량을 확인 하였다. 그 결과, APP/PS1 마우스의 신경세포에서 LxA4 및 RvE1 발현량이 N-acetyl sphingosine 1 phsosphate 또는 N-acetyl sphingosine을 처리 하였을 때 회복되는 것을 확인하였다(도 8b).
다음으로는 상기 화합물들에 의한 신경염증 종결 조절 인자 분비가 COX2 아세틸화 증가에 의한 것인지 확인하기 위해서 C14이 부착된 N-acetyl sphingosine을 이용하여 확인하였고, C14 N-acetyl sphingosine은 위에서 확인한 SphK1, acetyl-CoA 및 sphingosine을 혼합한 샘플보다도 더 많은 아세틸화가 일어나는 것을 확인하였다(도 8c). 또한, N-acetyl sphingosine의 존재 하에서 COX2의 펩타이드 560-GCPFTSFSVPDPELIK-575에 대한 세린 565 (S565)가 아세틸화된 것으로 확인되었다 (도 8d).
즉, 상기 화합물들은 COX2 아세틸화를 유도하여 신경염증 종결 조절 인자의 분비를 촉진하며, 특히 이러한 아세틸화는 COX2의 S565에서 나타난다는 것을 직접적으로 확인함으로써 퇴행성 신경질환의 치료에 있어서 COX2의 S565 아세틸화가 매우 핵심적인 치료 타겟이 될 수 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.
9. COX2 아세틸화제는 신경염증 종결 조절 인자 분비를 촉진하여 알츠하이머 동물모델의 AD 병변을 감소시킴.
본 발명자들은 상기 실험을 통해 확인한 COX2 아세틸화제 중 하나인 N-acetyl sphingosine을 APP/PS1 동물모델에 주사하여 AD 병변을 확인 하였다. 먼저 N-acetyl sphingosine가 신경염증 종결 조절 인자를 분비함으로써 신경염증반응에 미치는 영향을 판단하기 위해서, 미세아교세포와 별아교세포의 변화를 관찰하였다. N-acetyl sphingosine을 주사한 APP/PS1 마우스는 APP/PS1 마우스와 비교해 미세아교세포와 별아교세포의 현저한 저하를 나타내었다(도 9a,b). 또한 APP/PS1 마우스와 비교해 N-acetyl sphingosine을 주사한 APP/PS1 마우스에서 Aβ의 양이 현저히 낮은 것으로 나타났고, 기억력 및 인지력이 개선되는 것을 확인 하였다(도 9c,d). 그러나 sphingosine 유도체인 FTY720 및 S1P를 주사하였을 때에는 알츠하이머 동물 모델과 비교하여 미세아교세포와 별아교세포의 활성에 차이를 보이지 않았고, Aβ 침착 감소 및 기억력 개선 효과도 나타나지 않았다(도 9a, b).
이상의 결과를 통해, COX2 아세틸화제는 FTY720과 같은 sphingosine 유도체 및 S1P와 달리 신경염증 종결 조절 인자를 분비를 촉진하여 APP/PS1 마우스에서 신경염증 감소, Aβ 침착 감소 및 기억력 개선 등과 같이 AD 병변을 감소시키는 효과를 나타낸다는 것을 확인하였다.
10. COX2 단백질에서 아세틸화된 S565 잔기를 특이적으로 인식하는 항체(ac-S565)의 제작 및 효능 검증
본 발명자는 상기 실시예 결과들을 근거로 서열번호 1로 표시되는 COX2 단백질에서 아세틸화된 S565를 특이적으로 인식하는 항체를 제작하여 이하 실험에 사용하고자 하였다.
구체적으로, 서열번호 2의 펩타이드를 제작한 후 토끼에 상기 펩타이드를 주사하여 면역화 한 후, 토끼 혈청으로부터 다클론 항체를 분리, 정제하였다(이하 “ac-S565 항체”라 함).
한편, 상기 실험결과를 참고하면 COX2 단백질은 아스피린에 의해서는 S516 잔기에 아세틸화가 일어나고, S565에는 아세틸화가 일어나지 않는다. 그러나 N-acetyl sphigosine(N-AS)에 의해서는 특이적으로 COX2의 S565 잔기에 아세틸화가 일어난다.
이러한 결과에 근거하여, 본 발명자들은 재조합 COX2 단백질에 acetyl transfer를 처리하지 않거나, 아스피린 또는 N-AS를 처리한 후 ac-S565 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 진행하여 COX2의 S565 아세틸화 여부를 확인해 보았다.
그 결과, acetyl transfer를 처리하지 않거나 아스피린을 처리한 COX2에서는 ac-S565 항체를 이용한 웨스턴 블롯 실험에서 밴드가 거의 검출이 되지 않았으나, N-AS를 처리한 COX2에서는 밴드가 강하게 나타나는 것을 확인하였다(도 10). 이러한 결과를 통해 상기 제작된 ac-S565 항체가 COX2의 S565 아세틸화 여부를 특이적으로 검출할 수 있다는 것을 확인할 수 있었으며, 더 나아가 N-AS가 COX2의 S565를 아세틸화 시키는 물질이라는 것을 다시 확인할 수 있었다.
11. 알츠하이머 동물모델의 뇌조직에서 COX2의 S565 아세틸화 감소 확인
본 발명자들은 상기 제작된 ac-S565 항체를 이용하여, 야생형 마우스(WT)와 알츠하이머 동물모델(APP/PS1)의 뇌 조직에서 COX2 S565 아세틸화 정도를 형광면역염색법을 통해 확인하였다.
그 결과, 야생형 마우스와 비교하여 알츠하이머 동물의 뇌 조직 미세아교세포에서 COX2의 발현은 증가되어 있고, COX2의 S565 아세틸화는 감소되어 있는 것을 확인 하였다. 즉, 이러한 결과는 알츠하이머 동물모델의 미세아교세포에서 COX2의 S565 아세틸화가 감소되어 있다는 것을 나타낸다(도 11a, b).
본 발명자들은 알츠하이머 동물모델의 미세아교세포에서 COX2 S565 아세틸화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 재확인하였다.
그 결과, 상기 형광면역염색결과와 마찬가지로 야생형 마우스에 비하여 알츠하이머 동물의 미세아교세포에서 COX2의 발현은 증가되어 있고, COX2의 S565 아세틸화는 감소되어 있는 것을 확인 하였다. 이러한 결과는 알츠하이머 동물모델의 미세아교세포에서 COX2의 S565 아세틸화가 감소되어있는 것을 나타낸다(도 12a, b).
이와 같은 결과를 통해, COX2의 S565 아세틸화 정도를 분석함으로써 퇴행성 신경질환을 진단할 수 있음을 확인할 수 있다.
12. 아밀로이드 베타를 처리한 미세아교세포에서 COX2의 S565 아세틸화 감소 확인
본 발명자들은 사람 유래의 미세아교세포에 아밀로이드 베타를 처리하여 신경 염증성 환경을 조성한 후, COX2의 S565 아세틸화 정도를 형광면역염색을 통해 확인하였다.
그 결과, 아밀로이드 베타를 처리하였을 때 미세아교세포에서 COX2의 발현은 증가되어 있고, COX2의 S565 아세틸화는 감소되어 있는 것을 확인 하였다. 이러한 결과는 아밀로이드 베타 축적에 따른 신경 염증성 환경에서 COX2의 S565 아세틸화 정도가 감소된다는 것을 의미한다(도 13a, b).
본 발명자들은 사람 유래 미세아교세포에 아밀로이드 베타를 처리하여 신경 염증성 환경 조성 후, COX2의 S565 아세틸화 정도를 웨스턴블롯을 통해 재확인하였다.
그 결과, 상기 형광면역염색결과와 마찬가지로 아밀로이드 베타를 처리하였을 때 미세아교세포에서 COX의 발현은 증가되어 있고, COX2의 S565 아세틸화는 감소되어 있는 것을 확인 하였다. 이러한 결과는 아밀로이드 베타 축적에 따른 신경 염증성 환경에서 COX2의 S565 아세틸화 정도가 감소된다는 것을 의미한다(도 14a, b).
이와 같은 결과를 통해, COX2의 S565 아세틸화 정도를 분석함으로써 퇴행성 신경질환을 진단할 수 있음을 확인할 수 있다.
13. 알츠하이머 동물모델의 혈구세포(단핵구)에서 웨스턴 블롯을 통한 COX2 S565 아세틸화 감소 확인
본 발명자들은 미세아교세포 뿐 아니라, 혈액의 혈구세포(단핵구, monocyte)에서 COX2 S565 아세틸화 정도 분석에 의한 퇴행성 신경질환 진단 가능성을 확인하기 위하여 알츠하이머 동물모델(APP/PS1)의 혈구세포(단핵구, monocyte)에서 COX2의S565 아세틸화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다.
그 결과, 상기 결과와 마찬가지로 야생형 마우스에 비하여 알츠하이머 동물의 혈구세포(단핵구, monocyte)에서 COX2의 발현은 증가되어 있고, COX2의 S565 아세틸화는 감소되어 있는 것을 확인 하였다. 이러한 결과는 알츠하이머 동물모델의 미세아교세포 뿐 아니라 혈구세포(단핵구, monocyte)에서도 COX2의 S565 아세틸화가 감소되어 있는 것을 나타내며, 혈액의 혈구세포(단핵구, monocyte)에서 COX2 S565 아세틸화 정도를 분석함으로써, 퇴행성 신경질환을 용이하게 진단할 수 있을 것으로 판단해 볼 수 있다(도 15a, b).
본 발명에 따르면, 퇴행성 신경질환에서 COX2의 아세틸화는 현저히 저하되어 있기 때문에 COX2의 아세틸화 여부는 퇴행성 신경질환 진단마커로 활용이 될 수 있으며, 이를 이용하여 퇴행성 신경질환을 더욱 신속하고 정확하게 진단할 수 있어 산업상 이용가능성이 우수하다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for diagnosing neurodegenerative disorder <130> NP17-0087P2 <150> KR 1020180032669 <151> 2018-03-21 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 604 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human cyclooxygenase 2 (COX2) <400> 1 Met Leu Ala Arg Ala Leu Leu Leu Cys Ala Val Leu Ala Leu Ser His 1 5 10 15 Thr Ala Asn Pro Cys Cys Ser His Pro Cys Gln Asn Arg Gly Val Cys 20 25 30 Met Ser Val Gly Phe Asp Gln Tyr Lys Cys Asp Cys Thr Arg Thr Gly 35 40 45 Phe Tyr Gly Glu Asn Cys Ser Thr Pro Glu Phe Leu Thr Arg Ile Lys 50 55 60 Leu Phe Leu Lys Pro Thr Pro Asn Thr Val His Tyr Ile Leu Thr His 65 70 75 80 Phe Lys Gly Phe Trp Asn Val Val Asn Asn Ile Pro Phe Leu Arg Asn 85 90 95 Ala Ile Met Ser Tyr Val Leu Thr Ser Arg Ser His Leu Ile Asp Ser 100 105 110 Pro Pro Thr Tyr Asn Ala Asp Tyr Gly Tyr Lys Ser Trp Glu Ala Phe 115 120 125 Ser Asn Leu Ser Tyr Tyr Thr Arg Ala Leu Pro Pro Val Pro Asp Asp 130 135 140 Cys Pro Thr Pro Leu Gly Val Lys Gly Lys Lys Gln Leu Pro Asp Ser 145 150 155 160 Asn Glu Ile Val Glu Lys Leu Leu Leu Arg Arg Lys Phe Ile Pro Asp 165 170 175 Pro Gln Gly Ser Asn Met Met Phe Ala Phe Phe Ala Gln His Phe Thr 180 185 190 His Gln Phe Phe Lys Thr Asp His Lys Arg Gly Pro Ala Phe Thr Asn 195 200 205 Gly Leu Gly His Gly Val Asp Leu Asn His Ile Tyr Gly Glu Thr Leu 210 215 220 Ala Arg Gln Arg Lys Leu Arg Leu Phe Lys Asp Gly Lys Met Lys Tyr 225 230 235 240 Gln Ile Ile Asp Gly Glu Met Tyr Pro Pro Thr Val Lys Asp Thr Gln 245 250 255 Ala Glu Met Ile Tyr Pro Pro Gln Val Pro Glu His Leu Arg Phe Ala 260 265 270 Val Gly Gln Glu Val Phe Gly Leu Val Pro Gly Leu Met Met Tyr Ala 275 280 285 Thr Ile Trp Leu Arg Glu His Asn Arg Val Cys Asp Val Leu Lys Gln 290 295 300 Glu His Pro Glu Trp Gly Asp Glu Gln Leu Phe Gln Thr Ser Arg Leu 305 310 315 320 Ile Leu Ile Gly Glu Thr Ile Lys Ile Val Ile Glu Asp Tyr Val Gln 325 330 335 His Leu Ser Gly Tyr His Phe Lys Leu Lys Phe Asp Pro Glu Leu Leu 340 345 350 Phe Asn Lys Gln Phe Gln Tyr Gln Asn Arg Ile Ala Ala Glu Phe Asn 355 360 365 Thr Leu Tyr His Trp His Pro Leu Leu Pro Asp Thr Phe Gln Ile His 370 375 380 Asp Gln Lys Tyr Asn Tyr Gln Gln Phe Ile Tyr Asn Asn Ser Ile Leu 385 390 395 400 Leu Glu His Gly Ile Thr Gln Phe Val Glu Ser Phe Thr Arg Gln Ile 405 410 415 Ala Gly Arg Val Ala Gly Gly Arg Asn Val Pro Pro Ala Val Gln Lys 420 425 430 Val Ser Gln Ala Ser Ile Asp Gln Ser Arg Gln Met Lys Tyr Gln Ser 435 440 445 Phe Asn Glu Tyr Arg Lys Arg Phe Met Leu Lys Pro Tyr Glu Ser Phe 450 455 460 Glu Glu Leu Thr Gly Glu Lys Glu Met Ser Ala Glu Leu Glu Ala Leu 465 470 475 480 Tyr Gly Asp Ile Asp Ala Val Glu Leu Tyr Pro Ala Leu Leu Val Glu 485 490 495 Lys Pro Arg Pro Asp Ala Ile Phe Gly Glu Thr Met Val Glu Val Gly 500 505 510 Ala Pro Phe Ser Leu Lys Gly Leu Met Gly Asn Val Ile Cys Ser Pro 515 520 525 Ala Tyr Trp Lys Pro Ser Thr Phe Gly Gly Glu Val Gly Phe Gln Ile 530 535 540 Ile Asn Thr Ala Ser Ile Gln Ser Leu Ile Cys Asn Asn Val Lys Gly 545 550 555 560 Cys Pro Phe Thr Ser Phe Ser Val Pro Asp Pro Glu Leu Ile Lys Thr 565 570 575 Val Thr Ile Asn Ala Ser Ser Ser Arg Ser Gly Leu Asp Asp Ile Asn 580 585 590 Pro Thr Val Leu Leu Lys Glu Arg Ser Thr Glu Leu 595 600 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epitope for S565 acetylated COX2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> The X at position 6 is acetylated serine <400> 2 Gly Cys Pro Phe Thr Xaa Phe Ser Val Pro Asp 1 5 10

Claims (9)

  1. 서열번호 1로 표시되는 COX2(cyclooxygenase-2)의 565번째 세린(S565)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 제제는 565번째 세린(S565)이 아세틸화된 서열번호 1로 표시되는 COX2에 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증(ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 니만픽병, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 서열번호 1로 표시되는 COX2(cyclooxygenase-2)의 565번째 세린(S565)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는 퇴행성 신경질환 진단용 키트.
  7. (a) 퇴행성 신경질환이 의심되는 환자로부터 제공된 시료에서 서열번호 1로 표시되는 COX2(cyclooxygenase-2)의 565번째 세린(S565)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 단계; 및
    (b) 상기 COX2의 아세틸화 수준이 정상 대조군 시료보다 낮을 경우 퇴행성 신경질환으로 진단하는 단계를 포함하는, 퇴행성 신경질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 COX2의 565번째 세린(S565)에서의 아세틸화 수준을 측정하는 방법은 방사선자동사진법, 액체섬광계수(liquid scintillation counting)법, 분자량 분석법, 액체 색층 분석 매스 분석법, 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역형광염색법, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈구, 뇌 조직, 신경세포, 뇌척수액, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 분비물, 질 분비물 및 소변으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020180127656A 2018-03-21 2018-10-24 퇴행성 신경질환 진단용 조성물 KR102144047B1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/982,500 US20210003595A1 (en) 2018-03-21 2019-03-21 Composition for diagnosis of degenerative neurological diseases
PCT/KR2019/003284 WO2019182371A1 (ko) 2018-03-21 2019-03-21 퇴행성 신경질환 진단용 조성물
EP19771942.0A EP3769758A4 (en) 2018-03-21 2019-03-21 COMPOSITION FOR DIAGNOSIS OF DEGENERATIVE NEUROLOGICAL DISEASES

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20180032669 2018-03-21
KR1020180032669 2018-03-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190110927A KR20190110927A (ko) 2019-10-01
KR102144047B1 true KR102144047B1 (ko) 2020-08-12

Family

ID=67987374

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180127656A KR102144047B1 (ko) 2018-03-21 2018-10-24 퇴행성 신경질환 진단용 조성물
KR1020190032028A KR102235660B1 (ko) 2018-03-21 2019-03-20 Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190032028A KR102235660B1 (ko) 2018-03-21 2019-03-20 Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (4)

Country Link
US (3) US11899025B2 (ko)
EP (2) EP3791869A4 (ko)
KR (2) KR102144047B1 (ko)
WO (3) WO2019182191A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190110938A (ko) * 2018-03-21 2019-10-01 경북대학교 산학협력단 Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210270834A1 (en) * 2018-06-08 2021-09-02 Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Composition for diagnosing diseases associated with cox2 overexpression and screening method therefor
US20230125690A1 (en) * 2019-09-20 2023-04-27 Jae-sung Bae Antibody for detecting acetylation of cox2 protein, and uses thereof
EP4039267A4 (en) * 2019-11-07 2022-11-23 Amyloid Solution Inc. COMPOSITION, COMPRISING TMEM176B, OR AN EXPRESSION OR ACTIVITY REGULATOR THEREOF, USED AS AN ACTIVE SUBSTANCE, FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF A DEGENERATIVE BRAIN DISEASE
CN112029738B (zh) * 2020-08-18 2022-04-29 浙江省人民医院 人parkin蛋白乙酰化及其在药物制备中的应用
EP4219443A4 (en) * 2020-10-13 2024-04-17 Lg Chemical Ltd METHOD FOR PREPARING INTERMEDIATE FOR SYNTHESIS OF SPHINGOSINE-1-PHOSPHATE RECEPTOR AGONIST

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH08113535A (ja) 1994-10-13 1996-05-07 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 神経細胞の変性または死滅抑制剤
US6649362B2 (en) 1997-09-08 2003-11-18 Medvet Science Pty. Ltd. Screening method for an agent having an effect on a sphingosine kinase signaling pathway
AU2899900A (en) * 1999-03-02 2000-09-21 Nps Allelix Corp. Cloned human sphingosine kinase homologues
CN1951899B (zh) * 2000-02-16 2012-02-01 布里格姆及妇女医院股份有限公司 阿司匹林触发的脂质介体
AUPQ744700A0 (en) * 2000-05-11 2000-06-01 Medvet Science Pty. Ltd. A method of treatment and agents useful for same
AU2003292636A1 (en) * 2002-12-27 2004-07-29 The New Industry Research Organization Cell growth inhibitor using sphingosine kinase 2, method of constructing fused protein having its nuclear localization signal, method of screening drug candidate, and screening kit
US20050002859A1 (en) 2003-06-25 2005-01-06 Vanderbilt University COX-2-targeted imaging agents
WO2008094713A2 (en) * 2007-01-31 2008-08-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Detection and treatment of neurodegenerative tauopathies
KR101845552B1 (ko) * 2010-11-19 2018-04-04 가톨릭대학교 산학협력단 뇌손상 질환 진단용 마커로서의 Ｌｉｎ-28의 용도
US20130251731A1 (en) * 2012-03-22 2013-09-26 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Tau Acetylation in the Pathogenesis of Alzheimers Disease and Other Related Tauopathies
KR101508560B1 (ko) * 2012-05-24 2015-04-06 (주) 노바렉스 당세라마이드 유도체를 포함하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방 또는 치료 효과를 나타내는 약학적 조성물
KR101521117B1 (ko) * 2013-05-07 2015-05-18 경북대학교 산학협력단 Ａｓｍ 억제제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물
US9218169B2 (en) 2013-11-19 2015-12-22 Google Inc. Callpath finder
WO2017103892A2 (en) * 2015-12-16 2017-06-22 Hsrx Group, Llc Composition for treating and preventing neurological diseases, neuroinflammation, and alzheimer's disease
US10224181B2 (en) 2016-04-20 2019-03-05 Varian Semiconductor Equipment Associates, Inc. Radio frequency extraction system for charge neutralized ion beam
WO2019182191A1 (ko) * 2018-03-21 2019-09-26 경북대학교 산학협력단 C0x2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BioChimie, 93, 46-51쪽(2011.) 1부.*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190110938A (ko) * 2018-03-21 2019-10-01 경북대학교 산학협력단 Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102235660B1 (ko) 2018-03-21 2021-04-02 경북대학교 산학협력단 Cox2 아세틸화제를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019182371A1 (ko) 2019-09-26
EP3769758A4 (en) 2022-03-02
US11899025B2 (en) 2024-02-13
KR102235660B1 (ko) 2021-04-02
WO2019182191A1 (ko) 2019-09-26
US20210003595A1 (en) 2021-01-07
EP3791869A4 (en) 2022-03-09
EP3791869A1 (en) 2021-03-17
EP3769758A1 (en) 2021-01-27
KR20190110938A (ko) 2019-10-01
KR20190110927A (ko) 2019-10-01
US20210003594A1 (en) 2021-01-07
US20240125804A1 (en) 2024-04-18
WO2019182370A1 (ko) 2019-09-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102144047B1 (ko) 퇴행성 신경질환 진단용 조성물
Wegiel et al. Link between DYRK1A overexpression and several-fold enhancement of neurofibrillary degeneration with 3-repeat tau protein in Down syndrome
WO1991016628A1 (en) Purification, detection and methods of use of protease nexin-2
WO1999050300A1 (en) Method of identifying, diagnosing and treating synuclein positive neurodegenerative disorders
Liu et al. Interacting with α7 nAChR is a new mechanism for AChE to enhance the inflammatory response in macrophages
Wu et al. Pyroglutamate-modified amyloid-β protein demonstrates similar properties in an Alzheimer's disease familial mutant knock-in mouse and Alzheimer's disease brain
Lee et al. Enzyme-linked immunosorbent assays for alpha-synuclein with species and multimeric state specificities
Houri et al. The Coxsackievirus and Adenovirus Receptor (CAR) undergoes ectodomain shedding and regulated intramembrane proteolysis (RIP)
WO2008043725A1 (en) Biomarker in inflammatory disorders
Maj et al. Novel insights into the distribution and functional aspects of the calcium binding protein secretagogin from studies on rat brain and primary neuronal cell culture
EP1303537B1 (en) Ho-1 suppressor as a diagnostic and prognostic test for dementing diseases
Parisiadou et al. Homer2 and Homer3 interact with amyloid precursor protein and inhibit Aβ production
KR100884487B1 (ko) 인자 ⅶ-활성화 프로테아제의 돌연변이체 및 특이적 항체를 포함하는 진단학적 조성물
KR101682728B1 (ko) 신경변성 질환에 대한 진단적/예후적 지표로서 글루타미닐 사이클라제
JP2001519894A (ja) リソソーム蓄積症の早期検出法
Govoni et al. Defective Protein Kinase C α Leads to Impaired Secretion of Soluble β‐Amyloid Precursor Protein from Alzheimer's Disease Fibroblasts a
JP2010526994A (ja) ニューロトリプシンのインビボ活性を検出するための方法、ニューロトリプシン関連性障害の診断および監視における方法の使用およびバイオマーカーとしてのアグリンのＣ末端２２ｋＤａフラグメントの使用
EP4101465A1 (en) Determination agent and determination method for tauopathy and dementia-related diseases
KR101997142B1 (ko) 넥틴-4를 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도
JPH06503647A (ja) ヒトホスホリパーゼ活性化タンパク質および慢性関節リウマチの診断の方法
WO2012081433A1 (ja) アミロイドβ神経障害バイオマーカー
EP1112496B1 (de) Diagnostisches verfahren zur erkennung einer pankreasfunktionsstörung
KR102192454B1 (ko) Prox1을 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도
KR102145438B1 (ko) 퇴행성 뇌질환 발병 위험성 예측용 조성물 및 이를 이용한 퇴행성 뇌질환의 발병 위험성 예측 방법
JP2023017805A (ja) 神経学的状態検出のためのＳ１００β及びアイソフォーム

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant