JP2010526994A - ニューロトリプシンのインビボ活性を検出するための方法、ニューロトリプシン関連性障害の診断および監視における方法の使用およびバイオマーカーとしてのアグリンのＣ末端２２ｋＤａフラグメントの使用 - Google Patents

Abstract

ニューロトリプシンのインビボ活性を検出するための方法であって、アグリンの２２ｋＤａフラグメントの量を患者から採取したサンプル中で測定し、サンプル中のアグリンの２２ｋＤａフラグメントの測定した量を使用してニューロトリプシンの活性が計算される方法、ニューロトリプシン関連性障害を診断および監視するための前記方法の使用、およびニューロトリプシン関連性障害のためのバイオマーカーとしての２２ｋＤａフラグメントの使用を提供する。

Description

本発明は、ニューロトリプシンのインビボ（生体内）活性を検出するための方法、すべてが酵素であるニューロトリプシンの活性に直接的もしくは間接的に関連する様々な診断的または臨床的適応におけるバイオマーカーとしての該方法の使用およびアグリンのＣ末端２２ｋＤａフラグメントの使用に関する。

バイオマーカーは、疾患または治療の間に進行中の生物学的現象について報告する。バイオマーカーは、正常もしくは病理生物学的プロセスの、または治療介入への薬理学的応答のインジケーターとして客観的に測定および評価できる任意の特性であると定義されている。種々のタイプのバイオマーカーは、分子的特性、生理学的パラメーター（例えば、血圧、心拍数）について報告する、またはイメージング情報を提供する。重要なことに、それらは「転帰」について、例えば分子的、細胞的、もしくは生理学的機序の結果について、治療的利点について、または治療介入のリスクについての情報を提供する。有用なバイオマーカーは、２つの基準を満たさなければならず、疾患または治療の間に進行中の生物学的機序に関連していなければならず、そして臨床転帰と統計的に相関していなければならない。

ニューロトリプシンは、トリプシン様セリンプロテアーゼである。ニューロトリプシンは、固有のドメイン組成を示す（Ｐｒｏｂａ ｅｔ．ａｌ．，１９９８）。ニューロトリプシンは、プロリンリッチな塩基性セグメント、１つのクリングル・ドメイン、４つのスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン、およびプロテアーゼドメインからなる。

ニューロトリプシンは、主として大脳皮質、海馬および小脳扁桃のニューロン内で発現する（Ｇｓｃｈｗｅｎｄ ｅｔ．ａｌ．，１９９７）。免疫電子顕微鏡検査によって、ニューロトリプシンは、どちらも非対称性（興奮性）および対称性（抑制性）シナプスであるシナプス前膜およびシナプス前活性帯に局在化された（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ．ａｌ．，２００２）。

ニューロトリプシンは、神経精神病学的障害ならびに神経系の外側での障害において重要な役割を果たす。

近年、ニューロトリプシンは、精神遅滞の重篤な常染色体劣勢型の原因であると同定された（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ．ａｌ．，２００２）。ニューロトリプシン依存性精神遅滞に罹患している個人は、ニューロトリプシン遺伝子の第７エクソンにおける４ｂｐ欠失を示し、触媒ドメインが欠如する短縮タンパク質を生じさせる。罹患した個人における疾患の病態生理学的表現型および発症年齢は、ニューロトリプシンを例えば神経発達の後期中のシナプス再組織化および成人シナプス可塑性などの適応シナプス機能の調節因子であると特徴付けている。罹患した個人は、初期１８カ月間は精神運動の正常な発達を示した後、年齢がほぼ２歳になると精神遅滞の初発症候を示した。これは、例えばより高度の認知機能を確立および／または維持するために必要とされる適応シナプス機能のように、ニューロトリプシン機能が脳の発達の後期において極めて重要であることを示している。

国際公開第２００６／１０３２６１号パンフレットでは、トランスジェニックマウスの運動ニューロン中でのニューロトリプシンの過剰発現は神経筋接合部の変性を生じさせ、順に除神経筋線維の死を引き起こすことが証明されている。筋線維消失は、高齢者において見いだされる骨格筋減少症と呼ばれる筋萎縮のタイプに特徴的である。このため、ニューロトリプシンの阻害は年齢依存性筋線維脱神経、筋線維消失、および骨格筋萎縮に有益な作用を及ぼすことができたと想定されている。

また別のデータ（Ａｉｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００５）は、セリンプロテアーゼ類に血管機能および血管新生においてニューロトリプシンのような潜在的役割があることを示唆している。

代謝においてニューロトリプシンが中心的役割を果たすことを考えると、患者におけるニューロトリプシン関連性障害を決定および監視すること、またはインビボでのニューロトリプシンの状態に医薬品が及ぼす作用を評価することが各々望ましい。

本発明者らは、ニューロトリプシンのインビボ活性を決定するためにアグリンの２２ｋＤａフラグメントが脳脊髄液（ＣＳＦ）中、または血液中、もしくは尿中で測定される請求項１に記載の方法、およびニューロトリプシン関連性障害を診断および監視するための請求項３に記載の該方法の使用によって本発明の目的を実現できることを見いだした。本発明はさらにまた、請求項８に記載の特殊バイオマーカーとしてのアグリンの２２ｋＤａフラグメントの使用も含んでいる。

また別の独立請求項は、ニューロトリプシンの活性に物質が及ぼす作用を確定するための臨床または前臨床試験におけるバイオマーカーとしてのアグリンの２２ｋＤａフラグメントの使用、請求項１に記載の方法における参照物質としての組み換え技術によって調製されたアグリンの２２ｋＤａフラグメントの使用、および天然もしくは組換え抗体またはその他の特異的結合タンパク質を生成するための標的としての組み換え技術もしくは化学合成によって調製されたアグリンの２２ｋＤａフラグメントもしくはその一部分の使用に向けられる。

本発明の好ましい実施形態は、従属請求項において取り扱われる。

ヒトアグリンのタンパク質配列（配列番号１）を示す図である。未処理前駆体の全長は、２，０４５アミノ酸である。図示した配列部分では、αおよびβ開裂部位の位置がマークされている。さらに、実施例において言及する一部の部分配列もマークされている。アグリンの２２ｋＤａフラグメントの配列は、ボールド体で示されている。 アグリンのドメイン組織化およびそのニューロトリプシン依存性開裂部位の局在化の略図表示である。アグリンは、約２２０ｋＤａのコアタンパク質質量を有する。アグリンは、９つのＦＳ（ホリスタチン様）ドメイン、２つのＬＥ（ラミニン−ＥＧＦ様）ドメイン、１つのＳＥＡ（精子タンパク質エンテロキナーゼおよびアグリン）ドメイン、４つのＥＧ（表皮増殖因子様）ドメイン、および３つのＬＧ（ラミニン球状）ドメインからなるマルチドメインタンパク質である。ＳＥＡドメインの両側では、Ｓ／Ｔ（セリン／トレオニンリッチ）領域が見いだされる。 アグリンは幾つかのアイソフォームで、例えばＮ末端アグリン（ＮｔＡ）ドメインを備える分泌されたアイソフォームおよび原形質膜内にその足場を固定するＮ末端膜貫通（ＴＭ）セグメントを備えるＩＩ型膜貫通型アイソフォームで存在する。Ｃ末端成分のスプライス変異体、Ａ／ｙ部位での４アミノ酸長鎖インサート、およびＢ／ｚ部位での３つの相違するインサートは８、１１または１９（８＋１１）アミノ酸から構成された。ニューロトリプシンは、２つの部位でアグリンを開裂する。１つの部位（α部位と称する）は、アルギニン１１０２（Ｒ１１０２）とアラニン１１０３（Ａ１１０３）との間に位置する。もう１つの部位（β部位と称する）は、リシン１８５９（Ｋ１８５９）とセリン１８６０（Ｓ１８６０）との間に位置する。アミノ酸数は、ヒトオルトログ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｏ００４６８）の分泌型アグリン（スプライス変異体Ａ０Ｂ０）に関する。ニューロトリプシンによるアグリンの開裂は、１１０〜４００ｋＤａ（相違する炭水化物レベルに起因する）の範囲内にあるＮ末端フラグメント、約９０ｋＤａの中間フラグメントおよび２２ｋＤａのＣ末端フラグメントを生成する。 ニューロトリプシンがインビトロ（試験管内）でアグリンを開裂する方法を示した図である。膜結合アグリン（＋）、野生型ニューロトリプシン（ｗｔ）、不活性ニューロトリプシン（Ｓ／Ａ）、およびエンプティｐｃＤＮＡ３．１（−）の組み合わせでコトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のウエスタンブロット分析。上清（Ｓ）および細胞溶解液（ＣＬ）は、アグリンのＣ末端に向けられた抗アグリン抗体を用いて分析された。上方パネル：アグリン単独のトランスフェクションは、細胞溶解液中で２５０ｋＤａを超えるシグナルを生じさせた。野生型ニューロトリプシンを用いてコトランスフェクトすると、全長アグリンが開裂され、上清中において２２、９０および１１０ｋＤａでランするフラグメントが生じた。不活性ニューロトリプシンを用いたコトランスフェクション後には開裂は見いだされなかった。下方パネル：ニューロトリプシンに対する抗体を用いたニューロトリプシン発現のためのコントロール。 膜貫通型アグリンのドメイン構造を示した図である。ニューロトリプシン開裂の結果として生じたαおよびβ開裂部位ならびにＣ末端フラグメントの配列が示されている。ＴＭ、膜貫通セグメント；ＦＳ、ホリスタチンに類似するシステインリッチリピート；ＬＥ、ラミンＥＧＦ様ドメイン；Ｓ／Ｔ、セリン／トレオニンリッチ領域；ＳＥＡ、精子タンパク質、エンテロキナーゼおよびアグリンドメイン；ＥＧ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）様ドメイン；ＬＧ、ラミン球状ドメイン；一重丸、Ｎ−結合型グリコシル化部位；多重丸、グリカン付着部位。 ニューロトリプシンがインビボでアグリンを開裂することを示した図である。野生型（ｗｔ）およびニューロトリプシン欠損性（ＫＯ）マウス由来の組織のウエスタンブロット分析。９０ｋＤａアグリン開裂産物は、野生型マウスの脳、腎臓、および肺の中で検出されたが、ニューロトリプシン欠損性では存在しなかった。肺を除いて、２２ｋＤａアグリンフラグメントについても類似の結果が得られた。βアクチンは、ローディングコントロールとして使用された。 長期間増強の化学的刺激がニューロトリプシンのタンパク質分解活性の増加を誘導することを示した図である。 図５Ａは、刺激なし（Ｎｏ Ｓｔｉｍ）ならびにピクロトキシン、ホルスコリン、およびロリプラムの組み合わせ（ＰＦＲ）によって刺激された海馬スライスにおけるアグリン（上方パネル）およびβアクチン（下方パネル）のウエスタンブロット分析である。ＰＦＲ刺激海馬内のニューロトリプシンにより開裂されたアグリンの９０ｋＤａフラグメントのシグナル強度は、刺激なしコントロールにおけるよりはるかに強度である。 図５Ｂは、βアクチンシグナル強度により標準化されたアグリンの９０ｋＤａフラグメントのシグナル強度の比率を示している。刺激なしコントロールにおけるシグナル強度の平均値は、１に設定した。３件の独立実験は、刺激なしコントロールに比較してＰＦＲ刺激によるアグリンフラグメントの有意な３０％増加を示した（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によるとｐ＜０．０５）。 長期間増強の化学的刺激がニューロトリプシン依存方法で糸状仮足の数を増加させる方法を示している。 このヒストグラムは、４種の相違する条件下で海馬ＣＡ１錘体ニューロンの二次先端樹状突起（Ｄｅｎｄ）１μｍ当たりの糸状仮足（Ｆｉｌ）の数を示している。野生型マウス（ｗｔ）では、ピクロトキシン、ホルスコリン、およびロリプラム（ＰＦＲ）の組み合わせによる刺激は、刺激なしコントロールに比較して糸状仮足の数の有意な増加を誘導した（Ｎｏ Ｓｔｉｍ；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によるとｐ＜０．０１）。これとは対照的に、ニューロトリプシン欠損性マウス（ｎｔｄ）は、ＰＦＲ刺激による糸状仮足の数における有意な変化を示さなかった。 ニューロトリプシン欠損性マウス（ｎｔｄ）における海馬ＣＡ１錘体ニューロンの二次先端樹状突起（Ｄｅｎｄ）１μｍ当たりの糸状仮足（Ｆｉｌ）の数を示しているヒストグラムである。ＰＦＲ刺激単独（ＰＦＲ）は、刺激なしコントロール（Ｎｏ Ｓｔｉｍ）に比較して糸状仮足の数の有意な増加を誘導しなかった。ピクロトキシン、ホルスコリン、およびロリプラム（ＰＦＲ）ならびに２２ｋＤａフラグメントの共投与（ＰＦＲ＋２２−ｋＤａ）は、糸状仮足の数における化学的刺激誘導性増加を救済した（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によるとＮｏ ＳｔｉｍおよびＰＦＲに対してｐ＜０．００１）。さらに、ＰＦＲ刺激を行わなかった２２ｋＤａフラグメント（２２−ｋＤ ｆｒａｇ）もまた糸状仮足の数における有意な増加を誘導した（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によるとＮｏ Ｓｔｉｍに対して、ｐ＜０．００１）。 そこで、アグリンの２２ｋＤａフラグメントは、ニューロトリプシン欠損性マウスにおける糸状仮足の数の増加を誘導する。 野生型（＋／＋）およびニューロトリプシン欠損性（−／−）マウスの脳ホモジネートについてのウエスタンブロット分析を示す図である。アグリンの２２ｋＤａフラグメントは、野生型マウスにおいてしか検出されないことを留意されたい。これは、２２Ｄａフラグメントが実際にアグリンのニューロトリプシン依存性開裂の結果であることを示している。 野生型（＋／＋）、ホモ接合性ニューロトリプシン欠損性（−／−）、およびヘテロ接合性ニューロトリプシン欠損性（＋／−）マウスの血清についてのウエスタンブロット分析を示す図である。アグリンの２２ｋＤａフラグメントは、機能的ニューロトリプシンを発現するマウス（＋／＋および＋／−）においてしか存在しないことが示されている。 さらに図８Ａ、Ｂの両方から、アグリンの２２ｋＤａフラグメントがマウスの脳ホモジネート中および血液中において存在することは明白である。 １カ月間〜８６年間の年齢範囲にあるヒトのＣＳＦサンプルについてのウエスタンブロット分析を示す図である。各レーンでは、１０μＬのヒトＣＳＦを分析した。市販で入手できる勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮｕＰＡＧＥ、４〜１２％）を使用した。免疫検出は、アグリンの２２ｋＤａフラグメントに対する抗体Ｒ１３９を用いて実施した。神経発達中のニューロトリプシンの上昇した発現レベルによると、アグリンのニューロトリプシン依存性２２ｋＤａフラグメントは、２〜９月齢の年齢で最も豊富である。 ヒトＣＳＦにおいて見いだされる２２ｋＤａフラグメントのＬＣ／ＭＳ分析を示す図である。提示した配列は、２２ｋＤａフラグメントおよびβ開裂部位に先行する５つのアミノ酸を含んでいる（配列部分２）。数人の個人のＣＳＦサンプルをプールし、ウエスタンブロット分析により同定した２２ｋＤａフラグメントを富裕化するためにそれらのタンパク質をクロマトグラフィーによって分離した。２２ｋＤａフラグメントが富裕な画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し、ＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。２種のペプチド、ペプチド＃１（配列部分３）および＃２（配列番号４）が同定された。どちらもアグリンの２２ｋＤａフラグメントに局在化された。 図９ＡおよびＢは、アグリンの２２ｋＤａフラグメントがどちらもヒト脳脊髄液（ＣＳＦ）中で検出できることを示している。 アグリンの２２ｋＤａフラグメントについて免疫応答性の強力なバンドを示しているクロマトグラフィーによって処理されたヒト血清のウエスタンブロット分析を示す図である。しかしその同一性についての最終確認はＭＳ分析を必要とするが、本試験の結果はアグリンの２２ｋＤａフラグメントをヒト血清中で見いだせるという強力な証拠である。

本発明の方法においてバイオマーカーとして使用されるプロテオグリカンであるアグリンのＣ末端２２ｋＤａフラグメントは、その固有の処理酵素であるニューロトリプシンによるアグリンのタンパク質分解性開裂の１つの自然に生成された産物である。

アグリンは、明確に特性付けられた分子である（Ｂｅｚａｋｏｖａ ｅｔ．ａｌ．，２００３；Ｓａｎｅｓ ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ，，２００１）。アグリンは、約２２０ｋＤａのコアタンパク質質量を有する。アグリンは、数種のアイソフォームおよびスプライス変異体で存在する。

図２Ａに示したように、アグリンはαおよびβ開裂部位と称する２つの相同部位でセリンプロテアーゼであるニューロトリプシンにより開裂される。ＨｅＬａ細胞における２種のタンパク質の共発現の結果として生じるニューロトリプシンによるアグリンの開裂は、培養上清中へのアグリンの３つのフラグメントを遊離させる（実施例１および図１Ｂ）。２２ｋＤａフラグメントは、アグリンのβ開裂部位からＣ末端までの範囲に及ぶ。９０ｋＤａのフラグメントはαからβ開裂部位の範囲に及ぶが、そこで他方α開裂部位からＣ末端の範囲に及ぶ１１０ｋＤａフラグメントは、β部位での不完全の開裂の結果である。Ｎ末端フラグメントは細胞とともに残存し、おそらくはエンドサイトーシスによって高速分解される。

どちらの開裂部位も明白に同定され、相同であり、進化中には保存されることが見いだされた（実施例２）。

用語「アグリンの２２ｋＤａフラグメント」は、本出願において使用される場合はアグリンのβ開裂部位からＣ末端に及び、インビボで発生するフラグメントのすべての相違するアイソフォームおよびスプライス変異体を含むものとする。一部の刊行物では、アグリンのＣ末端ラミニンＧドメイン（ＬＧ３）は、２０ｋＤａフラグメントと呼ばれている。この用語が意味するタンパク質は、構造に関しては本発明によって使用されるフラグメントと同等であるが、その機能を試験する目的でアグリンのＣ末端ラミニンＬＧドメインに対応する組換えタンパク質として人工的に生成されてきた。これとは対照的に、アグリンのＣ末端ＬＧドメインがニューロトリプシン依存性タンパク質分解開裂によりアグリン分子の残りから分離されることは、本明細書に提示した本発明の必須態様である。アグリンの２２ｋＤａフラグメントは、いわゆるβ開裂部位でのタンパク質分解性開裂後にのみ移動性になり、その生成部位から脳脊髄液または血液中へ転位し、そこで確立された検出方法に基づいて検出できるのでバイオマーカーとして機能できる。

上述した国際公開第２００６／１０３２６１号パンフレットから、阻害物質がニューロトリプシンの活性に及ぼす作用を決定するための試験方法は公知である。公知の方法の典型的なプロトコールは、阻害物質がニューロトリプシンおよびアグリンと一緒にインキュベートされることを提供し、アグリンの開裂の量は、ニューロトリプシンのタンパク質分解活性によって生成されたフラグメントの測定に基づいて決定される。

公知の方法は、限定された数の反応パートナーを用いたインビトロ酵素アッセイに関する。インビボでの状況ははるかに複雑であるので、脳および神経外組織中でのニューロトリプシンのインビボ活性について報告するために、アグリンの特殊フラグメントもＣＳＦまたは血液中で見いだしてインビボバイオマーカーとして使用できると予想することはできなかった。第１に、タンパク質またはペプチドのインビトロ開裂から、開裂がインビボでも発生するとは結論付けることができない。インビトロ開裂は、人工の実験反応である。インビトロ開裂は、タンパク質分解酵素とタンパク質とを試験管内に一緒に入れ、開裂反応を発生させるためにそれらを一緒にインキュベートする工程によって達成される。これとは対照的に、タンパク質またはペプチドのインビボ開裂は、反応を発生させるためには、空間および時間において所定のタンパク質分解酵素と共局在化することを必要とする。例えば、アグリンを膵セリンプロテアーゼトリプシンによって開裂できることはインビトロで証明できる。しかし、トリプシンはアグリンをインビボでは開裂できないが、それはアグリンがインビボではトリプシンと共局在化していないからである。本発明者らは、遺伝子ターゲティングによるニューロトリプシンの選択的不活性化がアグリンの開裂を完全に無効にすることを見いだした（実施例３）。これは、インビボではニューロトリプシンしかアグリンを開裂できず、他のトリプシン様セリンプロテアーゼ類、例えばインビトロでアグリンを開裂できるトリプシンはインビボではアグリンを開裂しないことを示している。第２に、ニューロトリプシンによるアグリンのインビボ開裂がホモジナイズ化された組織中で見いだされるという事実からさえ、アグリンのニューロトリプシン依存性フラグメントがＣＳＦまたは血液中で見いだされるかどうかを予測することはできない。ＣＳＦおよび血液中では、全長アグリンおよび９０ｋＤａフラグメントは、極めてわずかな量でしか見いだされない。ニューロトリプシンは、ＣＳＦおよび血液中では検出不能である。このため、ニューロトリプシンによるアグリンの開裂は、ＣＳＦ中でも血液中でも発生しないが、細胞表面上または細胞外マトリックス内でアグリンおよびニューロトリプシンが遭遇する神経および非神経組織の内部では発生する。このため、ＣＳＦおよび血液中の２２ｋＤａフラグメントの発生は、明確に前例がなく重要な観察である。この結論を支持して、アグリンのＮ末端フラグメントも中央９０ｋＤａフラグメントもニューロトリプシンによるそれらの生成後にはＣＳＦまたは血液中では出現しないと述べることができる。このため、ニューロトリプシンのタンパク質分解活性により生成されるアグリンの３つのフラグメント中、２２ｋＤａフラグメントだけがＣＳＦおよび血液中へ効率的に転位され、他の２つのフラグメントは転位されない。

ＣＳＦおよび血液中のアグリンの２２ｋＤａフラグメントの発生は、脳および非神経組織各々におけるニューロトリプシン活性のレベルを反映する。

脳内でのニューロトリプシン活性に関して、本発明者らは、最初に野生型マウスの脳ホモジネートが、ニューロトリプシン欠損性マウスの脳ホモジネート中では対照的に見いだされないアグリンの２２ｋＤａフラグメントを含有することを証明した（実施例３）。さらに、本発明者らは、シナプトソームと呼ばれる単離シナプスの調製物中でのアグリンの２２ｋＤａフラグメントの存在を証明することができた。この観察所見は、脳由来のアグリンの２２ｋＤａフラグメントが、ニューロトリプシンが分泌されるシナプスを起源とし、細胞外空間内でアグリンと遭遇することを示している。シナプスまたはシナプスの近位でのアグリンの局所的開裂後に、２２ｋＤａフラグメントはＣＳＦへ選択的に転位する。このため、ＣＳＦ中のアグリンの２２ｋＤａフラグメントのレベルは、ＣＮＳシナプスでのニューロトリプシン活性について報告する。

非神経組織中でのニューロトリプシン活性に関して、本発明者らは、ニューロトリプシンが腎臓および肺で発現すること、ならびに腎臓および肺におけるアグリンのニューロトリプシン依存性開裂が９０ｋＤａおよび２２ｋＤａのアグリンフラグメントを生成することを証明した。腎臓および肺はどちらも高度に血管化された組織であるので、血液内で見いだされるアグリンの２２ｋＤａフラグメントの少なくとも一部が腎臓および／または肺を起源とする可能性は極めて高い。このため、血液中で見いだされる２２ｋＤａフラグメントのレベルは、腎臓および／または肺におけるニューロトリプシン活性について報告する。

血液中で見いだされるアグリンの２２ｋＤａフラグメントの画分は、神経筋接合部を起源とする可能性が極めて高い。本発明者らは、運動神経に沿って骨格筋へ運ばれる運動ニューロン由来ニューロトリプシンが神経筋接合部でアグリンを開裂することを見いだした。ＮＭＪで遊離されるアグリンの２２ｋＤａフラグメントは、血液中へ転位する可能性が最も高い。このため、血液中で見いだされるアグリンの２２ｋＤａフラグメントのレベルは、ＮＭＪでのニューロトリプシン活性についても報告する。

ＣＳＦおよび血液中のアグリンの２２ｋＤａフラグメントのレベルを測定することによる脳中または神経外組織中でのニューロトリプシン活性の評価は、各々ニューロトリプシン依存性の生理学的または病理学的状態についての結論を引き出すことを可能にする。

本発明者らは、ニューロトリプシンがＣＮＳ中でのシナプス可塑性の促進因子であると認識した。本発明者らは、ニューロトリプシンによるシナプス可塑性の促進はアグリンの開裂に左右され、これはＣ末端２２ｋＤａフラグメントの生成および遊離を生じさせることを証明した（実施例４）。２２ｋＤａフラグメントは、シナプス刺激性を有し、したがって可塑性促進性活性を有する。海馬組織スライスに基づく実験モデル系を使用して、本発明者らは、長期間増強の誘導後の糸状仮足促進がニューロトリプシン欠損性マウスにおいて無効にされることを見いだした（実施例５）。本発明者らは、アグリンの開裂を介するニューロトリプシンによって生成された２２ｋＤａフラグメントは、樹状糸状仮足の数を増加させることを通してシナプス可塑性のニューロトリプシン依存性促進において有益であることもまた見いだした（実施例６）。樹状糸状仮足は、シナプスの前駆体である。樹状糸状仮足の増加は、ＣＮＳにおけるシナプス回路の再組織化を促進する。ニューロトリプシン欠損性マウスの海馬を用いた実験は、アグリンの２２ｋＤａフラグメントのニューロトリプシン依存性生成を伴わないと、樹状糸状仮足の活性依存性促進は機能的ではないことを証明した。そこで、病理的ニューロトリプシン依存性状態とアグリンの２２ｋＤａフラグメントとの直接的関連を動物において確立することができよう。マウスにおけるこの観察所見は、適応シナプス可塑性がニューロトリプシンを伴わないと機能的ではないこと、そして精神遅滞とも呼ばれるより高度の（認知）脳機能における強度の欠損性が生じるという、ニュートリプシンが欠損するヒト個体において行われた観察所見に明確に一致している（Ｍｏｌｉｎａｒｉ ｅｔ．ａｌ．，２００２）。このため、ＣＳＦ中でのアグリンの２２ｋＤａフラグメントを測定することによるシナプスでのニューロトリプシンの活性を監視することは、例えばニューロトリプシン依存性シナプス可塑性などのニューロトリプシン依存性シナプス機能のダウンレギュレーションの診断を許容する。

また別の実験では、アグリンの２２ｋＤａフラグメントはマウスおよびヒト患者の血液またはＣＳＦ中で検出できることが証明された。アグリンの２２ｋＤａフラグメントを検出するための抗体は、最初にアグリンの組換え２２ｋＤａフラグメントを生成し（実施例７）、その後にそのフラグメントを抗体産生のために一般に使用される方法のいずれか１つを用いることで生成される（実施例８）。

アグリンの２２ｋＤａフラグメントに対する抗体を使用して、マウスの脳ホモジネートおよび血液中（実施例９）ならびにヒトＣＳＦ（実施例１０）および血液（実施例１１）中におけるその存在が証明された。これは、このフラグメントをルーチン用途のために適切なバイオマーカーにさせる。

したがって本発明は、患者サンプル中でのアグリンの２２ｋＤａフラグメントの量を測定することによってニューロトリプシンのインビボ活性を決定するための方法を含んでいる。この方法を使用することによってニューロトリプシン関連性障害を診断または監視することができ、このフラグメントは、一般にはすべてのニューロトリプシン関連性障害のためのバイオマーカーとして使用できる。

そのような障害は、特別にはニューロトリプシンのダウンレギュレーションによって誘発される疾患であってよく、このとき用語「ダウンレギュレーション」は遺伝子レベル上の調節プロセスを含むだけではなく、ニューロトリプシンの活性に影響を及ぼす代謝プロセスに反映することができる。

本発明の好ましい実施形態では、アグリンフラグメントは、例えばニューロトリプシン依存性神経遅滞およびサルコペニア、高齢者の骨格筋萎縮などのニューロトリプシンに関連する神経または神経筋系の疾患もしくは障害のバイオマーカーとして使用される。

アグリンの２２ｋＤａフラグメントは、上述した障害または疾患を診断するために使用できる。診断とは別に、ニューロトリプシンに関連した疾患の傾向またはプロセスを監視するために問題のバイオマーカーを使用することもまた可能である。

上述したように、広範囲の疾患もしくは障害は酵素ニューロトリプシンまたはその活性と結び付けることができると思われる。このため１つの重要な治療的アプローチは、インビボでニューロトリプシンの活性に影響を及ぼす、特別には阻害する物質を見いだすことである。さらにこの状況では、すなわち例えばニューロトリプシン阻害剤としての物質の可能性のある適用性を決定するために実施された臨床または前臨床試験において、アグリンの２２ｋＤａフラグメントはバイオマーカーとして使用できる。そのような試験の設計は、当業者にとっての問題を表していない。それらがニューロトリプシンに及ぼす可能性がある作用のために選択された様々な物質で治療される患者におけるアグリンの２２ｋＤａフラグメントのインビボ測定を可能にするあらゆる設計が適合する。

バイオマーカーとしてのアグリンの２２ｋＤａフラグメントを使用することにおける１つの主要な利点は、このフラグメントがどちらもルーチン用途において分析できる体液である血液またはＣＳＦ中で検出できることである。フラグメントの検出は、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット（ウエスタンブロット）技術、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、蛍光偏光、ラテックス凝集法、ラテラルフローアッセイ、免疫クロマトグラフィーアッセイ、免疫チップ法、ディップスティック免疫試験、または一部の例だけを挙げれば任意の他の方法（例、化学発光、Ｌｕｍｉｎｅｘ）と併用したビーズをベースとする技術のような当分野において公知の通常の方法によって実施できる。

血液またはＣＳＦを用いて作業することの１つの主要な利点は、上述した組織中でのニューロトリプシンによるタンパク質分解性開裂後にはアグリンの２２ｋＤａフラグメントしか遊離されないことである。全アグリン分子は、血液またはＣＳＦ中には存在していない、または極めてわずかな程度にしか存在していないので、血液中のフラグメントの検出は全アグリンとその２２ｋＤａフラグメントとを必ずしも鑑別できない抗体を用いて実施することができる。

アグリンの２２ｋＤａフラグメントへ選択的に結合する抗体またはその他の種類の特異的結合タンパク質は、当業者であれば誰でも生成することができる（Ｒｏｑｕｅ ｅｔ．ａｌ．，２００４；Ｇｉｌｌ ａｎｄ Ｄａｍｌｅ，２００６）。好ましくは天然または組換え抗体もしくはその他の特異的結合タンパク質は、標的として組み換え技術もしくは化学合成によって調製されるアグリンの２２ｋＤａフラグメントまたはその一部分を使用することによって生成される。

本発明に規定したアグリンの２２ｋＤａフラグメントは、配列番号１２のヒトアグリンの２２ｋＤａフラグメントであり、これはさらにＢ／ｚ部位でアグリンアイソフォームの８、１１または１９（８＋１１）個のアミノ酸インサートを含んでいてよい。ヒトアグリンでは、Ｂ／ｚ部位は、ＬＧ３ドメイン内でアミノ酸Ｓｅｒｌ８８４とＧｌｕｌ８８５との間に局在する（図１およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｏ００４６８）。挿入配列は、ＥＬＡＮＥＩＰＶ（Ｂ／ｚ ８；配列番号１３）、ＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ（Ｂ／ｚ １１；配列番号１４）またはＥＬＡＮＥＩＰＶＰＥＴＬＤＳＧＡＬＨＳ（Ｂ／ｚ １９；配列番号１５）であってよい。本発明では、用語「アグリンの２２ｋＤａフラグメント」は配列番号１２によって規定されたタンパク質の変異体または８、１１もしくは１９の追加のアミノ酸を備える対応するアイソフォームをさらに含んでいるが、このとき１つ以上、特別には１、２、３または４つのアミノ酸は他のアミノ酸で置換される、および／または１２個までのアミノ酸はＣ末端もしくはＮ末端のいずれかで欠失される、または３０個までのアミノ酸がＮ末端で付加される。Ｎ末端でのそのような追加のアミノ酸は、例えば適切な細胞中での組換え合成および発現による調製方法に起因して存在する。アグリンの２２ｋＤａフラグメントの定義下に入れられるそのようなタンパク質の例は、精製を単純化するためにグリシン−セリン（ＧＳ）リンカーを備える８ｘＨｉｓタグおよびＮ末端での４個の追加のアミノ酸をさらに含有している、実施例７によって調製された配列番号１２のタンパク質である。真核細胞内での発現中にグリコシル化さもなければ修飾されるタンパク質もまた、アグリンの２２ｋＤａフラグメントの本定義に含まれている。

アグリンの２２ｋＤａフラグメントに対して向けられた抗体またはその他の結合タンパク質は、アグリンの２２ｋＤａフラグメントの一部分だけ、例えばアグリンの２２ｋＤａフラグメントの配列から取り出された配列を備える１８アミノ酸のペプチドを使用して生成することもできる。

さらに、組み換え技術によって調製されたアグリンの２２ｋＤａフラグメントは、キャリブレーション目的で請求項１に記載の方法における参照物質として使用されることもまた本発明に含まれる。

（真核細胞中でのアグリンとニューロトリプシンとのコトランスフェクションは２つの部位でのアグリン開裂を生じさせる）
ニューロトリプシンのための基質としてのアグリンを試験するために、ＨｅＬａ細胞をラットアグリン（ｘ４ｙ８）単独、または野生型ニューロトリプシン（ｗｔ）もしくは活性部位ＳｅｒがＡｌａへ突然変異したニューロトリプシンの不活性形（Ｓ／Ａ）のいずれかと一緒の膜貫通アイソフォームを用いてトランスフェクトした。

ニューロトリプシンを発現させるために、全長ヒトニューロトリプシンのコーディング領域（ＣＡＡ０４８１６）をｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）内に挿入した。触媒不活性のニューロトリプシン（Ｓ／Ａ）は、オーバーラップエクステンションＰＣＲによってＳｅｒ_８２５をＡｌａへ突然変異させることによって生成した。膜結合全長アグリンを発現させるために、ラットアグリンのＭｅｔ_１〜Ｐｒｏ_１９４８の範囲に及ぶコーディング配列（Ｐ２５３０４、アイソフォーム４、スプライス変異体ｙ４ｚ８）をｐｃＤＮＡ３．１内に挿入した。ＨｅＬａ細胞は、１０％ ＦＣＳを補給したＤＭＥＭ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ社）を含む１２ウェル培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）内で６０〜８０％のコンフルエンシーへ培養させた。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、Ｂａｌｄｉ ｅｔ．ａｌ．，２００５に記載されたようなトランスフェクション試薬として使用した。トランスフェクション混合物は、トランスフェクションの４〜６時間後にリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）を用いて１回洗浄する工程により取り除いた。ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ中での４８時間培養後に、培地を採取し、細胞を１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００（ｐＨ７．４）中に溶解させた。開裂産物を分析するために、上清および細胞溶解液を４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で分離し、免疫検出法によって分析した。

アグリン単独を用いてトランスフェクトした細胞の溶解液中において、全長アグリンに特徴的な２５０ｋＤａを超えるスメアは、そのＣ末端部分に対して立てられた抗体を用いたウエスタンブロットにおいて検出された（図２Ａ）。同一シグナルは、不活性ニューロトリプシンとともにコトランスフェクトされた細胞の溶解液中でも見いだされた。野生型ニューロトリプシンがアグリンとともにコトランスフェクトされた場合は、アグリンシグナルは細胞溶解液中で見いだされなかった。しかし、１１０、９０、および２２ｋＤａの新規バンドが培養上清中で見いだされた。これらのアグリンフラグメントは、ニューロトリプシンの不活性形を用いたコトランスフェクションの上清中では全く見いだされなかった。まとめると、これらの結果は、タンパク質分解活性のニューロトリプシンがアグリンを開裂させ、結果として培養上清中への３つのＣ末端フラグメントの遊離を生じさせることを証明した。

（アグリンの２つのニューロトリプシン依存性開裂部位は相同であって進化的に保存されている）
アグリンのニューロトリプシン依存性開裂部位を決定するために、ＰＥＩトランスフェクション法を使用して、ラットアグリンの膜貫通全長形（スプライス変異体ｙ４ｚ８）またはＬＧ２、ＥＧ４、およびＬＧ３ドメインを含むアグリンのＣ末端フラグメントのいずれかを用いてニューロトリプシンをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で共発現させた（Ｂａｌｄｉ ｅｔ．ａｌ．，２００５）。３日後、上清を採取した。９０ｋＤａフラグメントを精製するため、全長アグリンでトランスフェクトした細胞の１Ｌの上清を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中の１５０ｍＭ ＮａＣｌを用いて平衡化させたヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上に装填した。タンパク質は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で１５０ｍＭから１ＭのＮａＣｌへの勾配で溶出させた。２２ｋＤａフラグメントは、製造業者の勧告にしたがってＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎカラム（ＩＢＡ社）を用いてアグリンのＣ末端フラグメントでトランスフェクトした細胞の２４ｍＬ培地からそのＣ末端ＳｔｒｅｐＴａｇによって精製した。Ｅｄｍａｎ分解によるＮ末端シーケンシングのために、ペプチドサンプルは４〜１２％ ＮｕＰＡＧＥゲル上で分離し、ＰＶＤＦ膜上へ電気移動させ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｚｕｒｉｃｈ（チューリッヒ機能的ゲノミクスセンター）でＰｒｏｃｉｓｅ ４９２ ｃＬＣシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）上で分析された。

この方法で、Ｎ末端配列ＡＳＣＹＮ ＳＰＬＧＣＣＳＤＧＫ（配列番号５）は９０ｋＤａフラグメントに対して、およびＳＶＧＤＬＥＴＬＡＦ（配列番号６）は２２ｋＤａフラグメントに対して見いだされた。このため、１つの開裂部位は、第１Ｓ／Ｔセグメントと配列ＰＩＥＲ−ＡＳＣＹ（配列番号７、図３）内のＡｒｇ_９９５のＣ末端にあるＳＥＡドメインとの間に局在化された。第２の開裂部位は、第４ＥＧＦ様と配列ＬＶＥＫ−ＳＶＧＤ（配列番号８、図３）内のＬｙｓ_１７５４のＣ末端にあるＬＧ３ドメインとの間に局在化された。アミノ酸数は、膜固定ラットアグリンに関する（Ｐ２５３０４；スプライス変異体ｘ４ｙ０）。本発明者らは、Ｒ_９９５とＡ_９９６との間の切断可能な結合をα開裂部位と命名し、Ｋ_１７５４とＳ_１７５５との間の切断可能な結合をβ開裂部位と命名した。

ラットアグリンの２つの開裂配列と様々な脊椎動物種の対応するセグメントとのアラインメント（表１）は、開裂部位をフランキングするアミノ酸の厳密な保存を証明した。

表１から明白であるように、α部位はＰ１において厳密に保存されたＡｒｇとＰ２において厳密に保存されたＧｌｕとを有していた。β部位は、Ｐ１において厳密に保存されたＬｙｓとＰ２において厳密に保存されたＧｌｕとを有していた。Ｐ３位置での残基はより変動性であったが、他方主として無極性残基は両方の部位のＰ４で見いだされた。切断可能な結合のＣ末端側では、Ｐ１’およびＰ２’残基は、主としてα部位ではＡｌａ−Ｓｅｒ配列およびβ部位ではＳｅｒ−Ａｌａ配列が各部位で良好に保存されている。良好に保存されたが別個の残基は、２つの部位のＰ３’およびＰ４’で見いだされた。

これらを要約すると、αおよびβ部位のコンセンサス配列は、Ｐ１およびＰ２残基の厳密な保存、Ｐ３位置の可変性の占有、ならびにＰ４、Ｐ１’、Ｐ２’、およびＰ３’での高度の保存を伴う同一プロファイルを示す。αおよびβ部位の個別コンセンサス配列の全プロファイルは、２つの開裂部位の結合コンセンサス配列が生成された場合に維持され（表２）、これはαおよびβ部位での個別開裂配列間の相同性を確証している。

（アグリンのニューロトリプシン依存性開裂はインビボで発生してニューロトリプシン欠損性マウスでは見いだされない）
本発明者らは、アグリンフラグメントの存在について野生型およびニューロトリプシン欠損性マウス由来の相違する組織について調査した。脳、肺、および腎臓は１０月齢の野生型およびニューロトリプシン欠損性マウスから単離した。約１ｇの各組織はＰｏｔｔｅｒホモジナイザーを用いてプロテアーゼ阻害剤のカクテル（Ｓｉｇｍａ社）を含有する１ｍＬの溶解バッファー（３２０ｍＭスクロース、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））中でホモジナイズした。細胞溶解液（４０μｇの腎臓、８０μｇの脳／肺）は、免疫ブロッティング法を使用してニューロトリプシン発現およびアグリン開裂について分析した。βアクチンは、アグリン免疫ブロット法の剥離膜上で精査した。図４に示したように、全長アグリンについての強度の免疫応答性は、野生型マウスの脳、腎臓、および肺中で検出された。これらの組織中では、本発明者らは、アグリンの９０ｋＤａ開裂産物もまた見いだした。２２ｋＤａ開裂産物は、脳および腎臓中では容易に検出可能であったが、肺中には存在しなかった。ニューロトリプシン欠損性マウスでは、アグリン免疫応答性は、２２ｋＤａまたは９０ｋＤａで検出可能であった。これらの結果は、ニューロトリプシンによるアグリン開裂はインビボで発生し、さらにニューロトリプシン欠損性マウスにおける開裂産物の不在は、アグリン開裂がニューロトリプシンに厳密に依存することを示している。

（長期増強（ＬＴＰ）の誘導はＣＮＳ組織中でのニューロトリプシンの増加したタンパク質分解活性を生じさせ、結果として２２ｋＤａフラグメントを含むアグリンフラグメントの生成を生じさせる）
学習様神経活性がニューロトリプシンのタンパク質分解活性に及ぼす作用は、海馬のＣＡ１領域の組織スライス内での長期増強（ＬＴＰ）の誘導によって証明される。現時点で、ＬＴＰは、細胞、分子および電気生理学的レベルで最も広汎に認められた学習および記憶との相関物である（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ．ａｌ．，２０００）。ＬＴＰに参加するシナプスの数を最大化するために、ＬＴＰ誘導の化学的プロトコール（Ｏｔｍａｋｈｏｖ ｅｔ．ａｌ．，２００４）がピクロトキシン（５０μＭ）、ホルスコリン（５０μＭ）、およびロリプラム（０．１μＭ）の組み合わせとともに使用された。これらの化合物の組み合わせは、電気刺激を全く必要とせずに数時間にわたり持続する強力なＬＴＰを誘導する。

海馬スライスを調製するために、海馬を隣接脳皮質と一緒に４〜５週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスから迅速に切除し、ＭｃＩｌｗａｉｎ機械的組織チョッパー（Ｔｈｅ Ｍｉｃｋｌｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社）を使用して海馬の長手軸に対して垂直に厚さ４００μｍのスライスへ切片作製する。これらのスライスは、カルシウムを含まない、９５％ Ｏ_２／５％ ＣＯ_２で酸素化した人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２３ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１１ｍＭグルコース、２．４ｍＭ ＭｇＣｌ_２）中へ移し、脳組織が解剖損傷から回復するために十分な時間を提供するために、室温で１時間にわたりインキュベートした。プレインキュベーション後、これらのスライスは２０分間にわたりカルシウムを含むＡＣＳＦ（１２０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、２３ｍＭ ＮａＨＣＯ_３、１１ｍＭグルコース、４ｍＭ ＣａＣｌ_２）中でインキュベートする。次に１６分間にわたり５０μＭピクロトキシン、５０μＭホルスコリン、および０．１μＭロリプラムの組み合わせと一緒にインキュベーションすること（ＰＦＲ刺激）によってスライス内で化学的ＬＴＰを誘導する。

スライス内のニューロトリプシンのタンパク質分解活性を試験するためには、その基質であるアグリンのタンパク質分解処理をウエスタンブロット分析によって評価する。ＰＦＲ刺激の直後に、スライスは、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．３２Ｍスクロース、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中でホモジナイズする。破片は、遠心分離（４℃で３０分間にわたり１６，０００×ｇ）によって除去する。上清のタンパク質（７５μｇのタンパク質）は、１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳動法により分離し、次にＰＶＤＦ膜へ電気移動させる。引き続いて、膜をメタノール中に１０秒間浸漬し、ブロッキングのために乾燥させる。ブロッキング後、膜は、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＴＢＳ）を含有するＴｒｉｓ緩衝食塩液（ＴＢＳ；０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））中で希釈したアフィニティ精製ウサギ抗アグリンポリクローナル抗体（Ｒ１３２；１μｇ／ｍＬ）とともにインキュベートした。Ｒ１３２は、ニューロトリプシンによるαおよびβ部位でのアグリンの開裂により生成されるアグリンの中央９０ｋＤａフラグメントを認識する。ＴＴＢＳ中で１０分間にわたり３回洗浄した後、膜はペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社；１：１０，０００に希釈）とコンジュゲート化した抗ウサギＩｇＧ抗体を含有するＴＴＢＳ中において４℃で一晩インキュベートし、次にＴＴＢＳ中で３回、ＴＢＳ中で１回洗浄する。続いて、アグリンフラグメントを可視化するために５分間にわたり化学発光基質（ＣＨＥＭＩＧＬＯＷ；Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）中に浸漬する。化学発光シグナルは、ＣｈｅｍｉＩｍａｇｅｒ（Ａｌｐｈａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を用いて検出した。

図５Ａに示したように、ニューロトリプシン依存性９０ｋＤａアグリンフラグメントの量は、非刺激コントロール（Ｎｏ Ｓｔｉｍ）と比較してＰＦＲ刺激（ＰＦＲ）によって増加する。この増加は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって決定されるように、統計的有意である（相違するサンプルを用いた３例の独立ブロッティング実験；ｐ＜０．０５；図５Ｂ）。この結果は、ＰＦＲ刺激がニューロトリプシン依存性タンパク質分解活性の増加を誘導することを示している。アグリンの９０ｋＤａフラグメントの量の増加はさらにまた、アグリンのＣ末端フラグメントである２２ｋＤａフラグメントの増加も示すが、それはアグリンの９０ｋＤａフラグメントが２２ｋＤａフラグメントの生成を伴わずに生成されることはあり得ないからである。

（ニューロトリプシンのタンパク質分解活性および結果として生じるＣＮＳ組織中のアグリンの２２ｋＤａフラグメントの生成の活性誘導性増加は、樹状糸状仮足の数の増加を生じさせる）
樹状糸状仮足の調査を可能にするために、Ｔｈｙ−１プロモーターの制御下で単一ニューロン内において緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または膜標的化緑色蛍光タンパク質（ｍＧＦＰ）を発現するトランスジェニックマウス系をニューロトリプシン欠損性マウス系と交配させる。ＧＦＰまたはｍＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスは、以前に記載されたように生成する（Ｆｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，２０００；Ｄｅ Ｐａｏｌａ ｅｔ．ａｌ．，２００３）。ＧＦＰまたはｍＧＦＰを発現するニューロトリプシン欠損性マウスは、ニューロトリプシン欠損性マウスと、単一ニューロン中でＧＦＰまたはｍＧＦＰを発現するトランスジェニックマウス系と交配させることによって生成される。以下の分析では、ｍＧＦＰを過剰発現するホモ接合性ニューロトリプシン欠損性マウスおよび対応するｍＧＦＰを過剰発現する野生型マウスを５〜６週齢で使用する。

急性海馬スライスは、実施例４に記載したように調製し、ＰＦＲによって刺激する。刺激期間の直後に、スライスは４℃で４％パラホルムアルデヒド、４％スクロース、０．１Ｍリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で一晩インキュベーションすることによって固定する。ＰＢＳ中での洗浄後、スライスをスライド上に封入し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）中でカバースリップを被せた。ｍＧＦＰを発現する海馬ＣＡ１錘体ニューロンの二次先端樹状突起内の蛍光シグナルは、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ社）を用いて観察し、０．１２２１μｍの間隔で連続画像を収集する。これらからＩｍａｒｉｓイメージングソフトウエア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ ＡＧ社）のＳｕｒｐａｓｓ Ｖｏｌｕｍｅモードを使用して三次元画像を再構成する。典型的な糸状仮足の数は、全方向から三次元画像を検査することによって１２〜２０本の独立樹状突起に沿って３０〜４０μｍの長さに渡って手作業で計数する。樹状糸状仮足は、以下の形態学的基準にしたがって同定する。１）樹状膜突出部は、その長さが同一樹状突起上の棘の平均長の少なくとも２倍である場合に糸状仮足であると分類される；２）頭径対首径の比率は、１．２：１より小さい、３）糸状仮足長対首径の比率は、３：１より大きい（Ｇｒｕｔｚｅｎｄｌｅｒ ｅｔ．ａｌ．，２００２）。

これらの結果は、ＰＦＲ刺激下では、野生型（ＷＴ）マウスの海馬中の樹状糸状仮足の数は、非刺激コントロール中と比較して増加することを示している。１２〜２０の独立樹状突起からのデータを使用した統計的分析は、ＰＦＲ刺激による糸状仮足の数における有意な増加を示している（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によるとｐ＜０．０１；図６）。これとは対照的に、ＰＦＲによる化学的刺激は、ニューロトリプシン欠損性マウス（ｎｔｄ）マウスにおける糸状仮足の数を変化させない（図６）。これは、ニューロトリプシンが糸状仮足の数における活性駆動増加のために必要とされることを示している。これを要約すると、これらの結果は、ＣＮＳニューロンにおけるニューロトリプシンの増加したタンパク質分解活性が増加した樹状糸状仮足の数を生じさせることを示している。

（ＣＮＳニューロンへのアグリンの２２ｋＤａフラグメントの投与は樹状糸状仮足数の増加を生じさせる）
アグリンのＣ末端フラグメントである２２ｋＤａフラグメントは、アグリンのβ開裂部位でのニューロトリプシンのタンパク質分解活性により自然に生成される。アグリンの組換え２２ｋＤａフラグメントは、実施例７において記載した通りに生成する。ニューロトリプシンによる２２ｋＤａフラグメント生成が樹状糸状仮足の数における活性駆動増加に関係しているかどうかを調査するために、海馬ＣＡ１ニューロンの樹状突起に沿った糸状仮足を、単一ニューロン中のＧＦＰまたはｍＧＦＰを発現するホモ接合性ニューロトリプシン欠損性マウス由来の２２ｋＤａフラグメント処置急性スライス中で計数する。ニューロトリプシン欠損性マウスは、実施例９に記載したとおりに生成する。ＧＦＰまたはｍＧＦＰを発現するトランスジェニックマウスは、以前に記載されたように生成する（Ｆｅｎｇ ｅｔ．ａｌ．，２０００；Ｄｅ Ｐａｏｌａ ｅｔ．ａｌ．，２００３）。ＧＦＰまたはｍＧＦＰを発現するニューロトリプシン欠損性マウスは、ニューロトリプシン欠損性マウスと、単一ニューロンにおいてＧＦＰまたはｍＧＦＰを発現するトランスジェニックマウス系と交配させることによって生成する。急性海馬スライスは、実施例４に記載したようにニューロトリプシン欠損性のｍＧＦＰを過剰発現するマウスから調製する。これらのスライスは、それらを４種の刺激条件に曝露させるために４群に分割する。刺激なし（Ｎｏ Ｓｔｉｍ）、ＰＦＲとのインキュベーション（ＰＦＲ）、２２ｋＤａフラグメントおよびＰＦＲの両方とのインキュベーション（２２ｋＤａ ｆｒａｇ＋ＰＦＲ）、ならびに２２ｋＤａフラグメントとのインキュベーション（２２ｋＤａ ｆｒａｇ）。２２ｋＤａ ｆｒａｇおよび２２ｋＤａ ｆｒａｇ＋ＰＦＲと指定した実験条件は、酸素化ＡＣＳＦ中での２２ｎＭの濃度でヒト、ラット、またはマウス２２ｋＤａフラグメント（実施例７に記載したとおりに調製した）を含有している。刺激期間（１６分間）の直後に、実施例５に記載したとおりにスライスを固定し、スライド上に封入し、共焦点顕微鏡によってＧＦＰを発現するニューロンの二次先端樹状突起から０．１２２１μｍで連続画像を入手する。糸状仮足は、Ｉｍａｒｉｓイメージングソフトウエアを用いた三次元画像の再構成後に、ＣＡ１錘体ニューロンの１４〜２０の二次先端樹状突起（各３０〜４０μｍ長）中で計数する。

図７に示したように、ＰＦＲ刺激後の樹状糸状仮足の数の増加は、ニューロトリプシン欠損性マウスにおいては見られない（この作用は、実施例５および図６においても示した）。しかし、ＰＦＲへの２２ｋＤａフラグメントの添加は、野生型マウスにおいてＰＦＲを用いて見いだされたレベルと同一レベルへのニューロトリプシン欠損性マウスからの海馬スライス内の糸状仮足の数の増加を再確立する（Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によるとｐ＜０．００１）。これは、糸状仮足の数における活性駆動増加がアグリンからのニューロトリプシン依存性タンパク質分解性開裂による２２ｋＤａフラグメントの生成に依存すること（これは、ニューロトリプシン欠損性マウスでは発生しない）を証明している。さらに、２２ｎＭの精製組換えヒト２２ｋＤａフラグメント単独（ＰＦＲを含まない）の投与はＰＦＲによる化学的ＬＴＰの非存在下で糸状仮足の有意な増加を誘導する。２２ｋＤａフラグメントの糸状仮足誘導作用は、ＬＴＰ誘導性刺激の非存在下においても観察されるが、これは２２ｋＤａフラグメントがＬＴＰの糸状仮足誘導作用の下流メディエーターであることを示している。要するに、これらの結果は、２２ｋＤａフラグメントが糸状仮足誘導因子として機能することを示している。

（ヒトアグリンの２２ｋＤａ Ｃ末端フラグメントのクローニング、発現および精製）
アクセッション番号ＢＣ００７６４９を備える、インサートとしてのヒトアグリンのｃＤＮＡの３’領域を有するＢＡＣ ＤＮＡを使用して、ＰＣＲ増幅によりアグリンの最終ＬＧドメインをコードするＤＮＡフラグメントを生成する。使用されるＰＲＣプライマーは、
ＨｐａＩ部位（５’ヒトＣ）を導入している、（配列番号９）５’−ＧＣＧ ＣＧＡ ＧＴＴ ＡＡＣ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＴＣＡ ＧＣＧ ＧＧＧ ＧＡＣ ＧＴＧ ＧＡＴ ＡＣＣ ＴＴＧ ＧＣ−３’、および
ＮｏｔＩ部位（３’ヒトＣ）を導入している、（配列番号１０）５’−ＴＴＡ ＣＣＴ ＧＣＧ ＧＣＣ ＧＣＴ ＣＡＴ ＧＧＧ ＧＴＧ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＣ ＴＣ−３’である。

この戦略を使用して、Ｎ末端８ｘＨｉｓタグをコードするＤＮＡ配列を挿入する。結果として生じるＰＣＲ産物は、制限酵素ＮｏｔＩおよびＨｐａＩ（プライマー配列中でボールド体により表記した）を用いて開裂され、同一制限酵素を用いたヒトカルシンテニン−１のシグナルペプチドに対するコーディング配列を含有するｐＥＡＫ８ベクター内にクローニングする。結果として生じる構築体ｐＥＡＫ８−２２ｋＤａフラグメントは、２２ｋＤａフラグメントに対する分泌シグナルとしてのヒトカルシンテニン−１のシグナル配列のコーディング領域を含有している。プラスミドのクローニングならびに増幅は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中で実施する。真核生物タンパク質合成のためには、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、リン酸カルシウム法を用いてトランスフェクトする。ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞における翻訳中に、シグナルペプチドは開裂される。結果として生じる分泌タンパク質は、リーダー配列ＡＲＶＮＨＨＨＨＨＨ ＨＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）が配列番号１２のアグリンのＬＧ３ドメインおよびＣ末端を含むβ部位でのニューロトリプシン依存性アグリン開裂によって入手されるＮ末端に結合されている配列を有する。
ＳＡＧＤＶＤＴＬＡＦＤ ＧＲＴＦＶＥＹＬＮＡ ＶＴＥＳＥＫＡＬＱＳ ＮＨＦＥＬＳＬＲＴＥ ＡＴＱＧＬＶＬＷＳＧ ＫＡＴＥＲＡＤＹＶＡ ＬＡＩＶＤＧＨＬＱＬ ＳＹＮＬＧＳＱＰＶＶ ＬＲＳＴＶＰＶＮＴＮ ＲＷＬＲＶＶＡＨＲＥ ＱＲＥＧＳＬＱＶＧＮ ＥＡＰＶＴＧＳＳＰＬ ＧＡＴＱＬＤＴＤＧＡ ＬＷＬＧＧＬＰＥＬＰ ＶＧＰＡＬＰＫＡＹＧ ＴＧＦＶＧＣＬＲＤＶ ＶＶＧＲＨＰＬＨＬＬ ＥＤＡＶＴＫＰＥＬＲ ＰＣＰＴＰ

このポリペプチドは、Ｎ末端ＡＲＶＮ−８ｘＨｉｓタグを伴わない約２０ｋＤａの分子量を有する。タグを含む総質量は、約２１．５ｋＤａである。

タンパク質産生のためには、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞は、各々１０％ＦＣＳが補給された１００ｍＬ ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）を含む５００ｃｍ^２の７枚の培養皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）において８０％コンフルエンシーへ培養する。トランスフェクションのためには、３５ｍＬの５００ｍＭ ＣａＣｌ_２および３５ｍＬのＨＢＳバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ７．１））を室温へ平衡化させる。ｐＥＡＫ８−２２ｋＤａフラグメント発現構築体の２ｍｇのＤＮＡをＣａＣｌ_２溶液に加え、ＨＢＳバッファーと混合する。トランスフェクション混合物は、３０分間にわたり室温でインキュベートする。ＨＥＫ細胞の５００ｃｍ^２培養皿をトランスフェクトするために、１０ｍＬのトランスフェクション混合物を培養へ滴下し、３７℃で４時間インキュベートする。トランスフェクション混合物は次にＰＢＳを用いて１回洗浄し、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ培地の添加によって除去する。６０時間後、馴化培地を採取し、Ｓｔｅｒｉｔｏｐ ０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濾過する。上清は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）に対して透析し、ＢｉｏＬｏｇｉｃ液体クロマトグラフィーシステム（Ｂｉｏｒａｄ社）上でＮｉ−ＮＴＡカラム（１０ｍＬ ＨｉｓＳｅｌｅｃｔ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用してＩＭＡＣ精製を受けさせる。馴化および透析培地は５ｍＬ／分の流量で装填し、カラムは２０ＣＶの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８．５）で洗浄する。溶出については、１０カラム容量について０〜２５０ｍＭイミダゾールの線形勾配を使用する。純粋組換え２２ｋＤａフラグメントを含有する画分をプールし、１５ｍＬスピン濃縮装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて濃縮し、バッファーはＮＡＰ ２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１０ｍＭ ＭＯＰＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）と交換する。精製タンパク質は液体窒素中で冷凍し、−８０℃で貯蔵する。この方法で生成された２２ｋＤａフラグメントは、Ｎ末端８ｘＨｉｓタグ、それに続いて開裂部位βのＰ’残基およびアグリンの天然Ｃ末端を含有している。

同様に、同一ドメイン構造を含むラットまたはマウスアグリンの組換え２２ｋＤａフラグメントをクローニングし、発現させ、そして精製する。

標準クローニング技術を用いて他のタグを備える２２ｋＤａフラグメントまたは２２ｋＤａフラグメントのタグなし変異体を構築することもまた可能である。発現は標準真核または原核細胞系において達成され、所望のタンパク質の精製は、標準液体クロマトグラフィーまたは封入体からのリフォールディングのいずれかによって達成される。

インビボで見いだされる形態と同一である２２ｋＤａフラグメントを生成するためには、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグを取り除き、２２ｋＤａフラグメントは、インビトロでニューロトリプシンを用いた消化によって、またはアグリンもしくは４４ｋＤａアグリンフラグメントの発現中に、ＬＧ３ドメインおよびアグリンの開裂部位β（例えば、全長アグリンまたは４４ｋＤａのＣ末端フラグメント）を含むアグリンのＣ末端フラグメントをコードする任意の種類のｃＤＮＡから生成する。２２ｋＤａフラグメントは、上述したように精製する。

（アグリンの２２ｋＤａフラグメントに対するポリクローナル抗体の生成）
アグリンのＬＧ３ドメインに対するポリクローナル抗体は、５０μｇのラットアグリンＬＧ３ドメインを用いてウサギを免疫することによって生成する。結果として生じる抗体は、ヒト、マウスまたはラット全長アグリンを検出するため、ならびにアグリンのＬＧ３ドメインを含有するアグリンフラグメントを検出するために有用である。

（アグリンの２２ｋＤａフラグメントはマウスの脳ホモジネートおよび血液中で検出できる）
本発明者らは、マウスの脳ホモジネートの可溶性画分中および血清中でのアグリンフラグメントの発生について調節した。検出するために、本発明者らは９０ｋＤａおよび２２ｋＤａフラグメントに対して本発明者らの検査室で生成した特異的なアフィニティ精製抗体を使用した。２２ｋＤａフラグメントは、脳ホモジネートおよび血清の両方のウエスタンブロット上で容易に検出できた（図８）。ホモ接合性ニューロトリプシン欠損性マウスに含まれた脳ホモジネート（図８ＡおよびＢにおける−／−）は２２ｋＤａフラグメントを含有していなかったが、他方ニューロトリプシン欠損性マウスのヘテロ接合性形（図８Ｂにおける＋／−）は、減少したレベルの２２ｋＤａフラグメントを示した。まとめると、これらの結果は、ウエスタンブロット分析によって検出される２２ｋＤａフラグメントがニューロトリプシンの作用に起因すること、そして脳ホモジネートならびに血清の可溶性画分中で検出できることを示している。

（アグリンの２２ｋＤａフラグメントはヒトＣＳＦ中で見いだされる）
本発明者らは、さらにニューロトリプシン依存性アグリンフラグメントの存在についてヒトサンプルを、すなわち尿、血液、および脳脊髄液を試験した。今までのところ、本発明者らは、体液のいずれかにおける１１０ｋＤａまたは９０ｋＤａフラグメントの存在についての証拠を何も見いださなかった。しかし、本発明者らは、脳脊髄液および血清の両方において２２ｋＤａフラグメントを見いだした。

図９Ａに示したように、アグリンの２２ｋＤａフラグメントについての免疫応答性シグナルは、１カ月齢の小児からその後の発達段階および成人期を通して８６歳の女性のＣＳＦまでの範囲に及ぶ、試験した全年齢で見いだされた。初期出生後発達中のピーク発現を伴うニューロトリプシンの時間的発現パターンに基づいて予測されるように、本発明者らは、２カ月齢〜９カ月齢の小児のＣＳＦ中で最高量の２２ｋＤａフラグメントを見いだした。興味深いことに、８６歳の女性において２２ｋＤａフラグメントの明白に上昇したレベルが見出された。しかし、この観察所見の生物学的または病態生理学的重要性についての結論を引き出すためには、明確により多くのサンプルを測定しなければならない。

２２ｋＤａ免疫応答性バンドの同一性を検証するために、本発明者らは、脳脊髄液から基礎のタンパク質を単離し、それにＬＣ／ＥＳＩ／ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。明白にその部分ペプチド配列をベースとするタンパク質を同定するために、それをトリプシン消化によってフラグメント化した。結果として生じたフラグメントを次に液体クロマトグラフィーによって分離し、ＭＳ／ＭＳ分析にかけた。図９Ｂに示したように、ヒトアグリンの２２ｋＤａフラグメントの第１の２７アミノ酸（１３アミノ酸（配列番号３）を含むペプチド＃１；１４アミノ酸（配列番号４）を含むペプチド＃２）と正確にマッチする２つのペプチドが検出された。どちらのペプチドも塩基性アミノ酸で終了するが、これはそれらのトリプシン性を確証している。ペプチド＃１は、アグリンのニューロトリプシン依存性β開裂部位から始まる。アグリンの２２ｋＤａフラグメントの両端の外側に位置するペプチドは見いだされなかった。まとめると、これらの結果は、ウエスタンブロットにおいて見いだされた免疫応答性２２ｋＤａバンドがアグリンのニューロトリプシン依存性２２ｋＤａフラグメントと同一であることを確証している。これらの結果は、ＣＳＦが脳内のニューロトリプシンの活性を監視するためのレポーター区画であることを示している。

（アグリンの２２ｋＤａフラグメントはヒト血液中で検出できる）
アグリンのニューロトリプシン依存性フラグメントについての探索を神経外サンプルにまで拡大した。図１０に示したように、ヒト血清のウエスタンブロット分析は、明白な免疫応答性バンドを示した。しかし、血清中で検出されたシグナルは、ＣＳＦ中で見いだされたシグナルより低強度であった。明確な検出のためには、シグナルを解明するために血清タンパク質のクロマトグラフィー分離および示差的濃縮が必要とされた（図１０における矢印）。現在進行中の研究は、免疫応答性２２ｋＤａバンドがアグリンの誘導体と同一であることに関する構造的検証を目的としている。確証に成功すれば、血清もまたインビボでのニューロトリプシンを監視するためのレポーター区画として使用できよう。血清中の２２ｋＤａフラグメントに関する定量的データは、神経筋接合部、ならびに例えば腎臓および肺などの神経外組織でのニューロトリプシン活性についての結論を引き出すことができる。

［参考文献］

Claims (14)

1. ニューロトリプシンのインビボ活性を検出するための方法であって、アグリンの２２ｋＤａフラグメントの量を患者から採取したサンプル中で測定し、前記サンプル中のアグリンの２２ｋＤａフラグメントの測定した量を使用してニューロトリプシンの活性を計算する方法。
2. 前記２２ｋＤａフラグメントを測定する前記サンプルが、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、またはリンパ液である請求項１に記載の方法。
3. ニューロトリプシン関連性障害を診断および監視するための請求項１または２に記載の方法の使用。
4. ニューロトリプシンの脱調節によって誘発される疾患を診断および監視するための請求項３に記載の使用。
5. 神経系および神経筋系のニューロトリプシン関連性疾患および障害を診断および監視するための請求項３または４に記載の使用。
6. 非神経系、特に腎臓および肺のニューロトリプシン関連性疾患および障害を診断および監視するための請求項３または４に記載の使用。
7. ニューロトリプシンの活性に物質が及ぼす作用を確定するための臨床または前臨床試験における請求項１または２に記載の方法の使用。
8. ニューロトリプシン関連性障害についてのバイオマーカーとしてのアグリンの２２ｋＤａフラグメントの使用。
9. ニューロトリプシンの脱調節によって誘発される疾患を診断および監視するための請求項８に記載の使用。
10. 神経系および神経筋系のニューロトリプシン関連性疾患および障害を診断および監視するための請求項８または９に記載の使用。
11. 非神経系のニューロトリプシン関連性疾患および障害を診断および監視するための請求項８または９に記載の使用。
12. ニューロトリプシンの活性に物質が及ぼす作用を確定するための臨床または前臨床試験におけるバイオマーカーとしてのアグリンの２２ｋＤａフラグメントの使用。
13. 請求項１に記載の方法における参照物質としての、組み換え技術によって調製されたアグリンの２２ｋＤａフラグメントの使用。
14. 天然の抗体もしくは組換え抗体またはその他の特異的結合タンパク質を生成するための標的としての組み換え技術または化学合成によって調製される、アグリンの２２ｋＤａフラグメントまたはその一部分の使用。

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