PT1990420E - Método para a detecção da actividade in vivo da neurotripsina, utilização do método e utilização do fragmento de 22 kda c-terminal de agrina como biomarcador no diagnóstico e monitorização de distúrbios relacionados com a neurotripsina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A DETECÇÃO DA ACTIVIDADE IN VIVO DA NEUROTRIPSINA, UTILIZAÇÃO DO MÉTODO E UTILIZAÇÃO DO FRAGMENTO DE 22 KDA C-TERMINAL DE AGRINA COMO BIOMARCADOR NO DIAGNÓSTICO E MONITORIZAÇÃO DE DISTÚRBIOS RELACIONADOS COM A NEUROTRIPSINA" CAMPO DA INVENÇÃO: A invenção refere-se a um método para a detecção da actividade in vivo de neurotripsina, à utilização de tal método e à utilização do fragmento de 22 kDa C-terminal de agrina como biomarcador em diferentes aplicações de diagnóstico ou clinicas, todas, directa ou indirectamente, relacionadas com a actividade da enzima neurotripsina.

Os biomarcadores relatam sobre fenómenos biológicos em curso no seio de uma doença ou tratamento. Um biomarcador é definido como qualquer caracteristica que pode ser objectivamente medida e avaliada como um indicador de um processo biológico normal ou patológico ou de uma resposta farmacológica a uma intervenção terapêutica. Tipos distintos de biomarcadores relatam sobre caracteristicas moleculares, parâmetros fisiológicos (por exemplo, pressão sanguínea, frequência cardíaca) ou proporcionam informação de imagiologia. Facto importante, eles proporcionam informação sobre um "resultado": e. g., sobre o resultado de um mecanismo molecular, celular ou fisiológico, sobre um beneficio terapêutico ou sobre o risco de uma intervenção terapêutica. Os biomarcadores úteis devem satisfazer dois critérios, os mesmos devem estar 1 associados aos mecanismos biológicos em curso no seio de uma doença ou tratamento e devem correlacionar-se estatisticamente com o resultado clínico. A neurotripsina é uma protease da serina semelhante a tripsina. Mostra uma composição de domínio única (Proba et al., 1998). Consiste num segmento básico rico em prolina, um domínio kringle, quatro domínios de receptor captador rico em cisteína (SRCR) e um domínio de protease. A neurotripsina é predominantemente expressa em neurónios do córtex cerebral, do hipocampo e da amígdala (Gschwend et al., 1997). Por intermédio de microscopia imunoelectrónica, a neurotripsina foi localizada na membrana pré-sináptica e na zona activa pré-sináptica das sinapses assimétricas (excitatórias) e simétricas (inibitórias) (Molinari et al., 2002). A neurotripsina desempenha um importante papel em distúrbios neuropsiquiátricos, assim como em distúrbios fora do sistema nervoso.

Recentemente, a neurotripsina foi identificada como uma causa de uma forma recessiva autossómica grave de retardação mental (Molinari et al., 2002). Os indivíduos sofrendo de retardação mental dependente de neurotripsina mostram uma deleção de 4 pb no 7o exão do gene de neurotripsina, resultando numa proteína encurtada desprovida do domínio catalítico. O fenótipo patofisiológico e a idade de início da doença em indivíduos afectados caracterizam a neurotripsina como um regulador de funções sinápticas adaptativas, tal como a reorganização de sinapse, durante estádios tardios do neurodesenvolvimento e plasticidade sináptica adulta. Após 2 desenvolvimento psicomotor normal nos primeiros 18 meses, os indivíduos afectados mostraram os primeiros sinais de retardação mental quando tinham em torno de 2 anos de idade, isto indica que a função de neurotripsina é crucial em estádios tardios do desenvolvimento do cérebro, como, e. g., para funções sinápticas adaptativas requeridas para estabelecer e/ou manter funções cognitivas superiores.

No documento WO 2006/103261 mostra-se que a superexpressão de neurotripsina em motoneurónios de murganhos transgénicos resulta numa degenerescência da junção neuromuscular que, por sua vez, causa a morte das fibras musculares desnervadas. A perda de fibra muscular é característica para o tipo de atrofia muscular verificada em humanos idosos, designada sarcopenia. Por conseguinte, foi postulado que a inibição de neurotripsina poderia ter um efeito benéfico sobre a desnervação de fibra muscular dependente de idade, perda de fibra muscular e atrofia de músculo esquelético.

Dados adicionais (Aimes et al., 2005) sugerem um potencial papel para proteases da serina, como a neurotripsina, na função vascular e angiogénese.

Em consideração do papel central da neurotripsina no metabolismo, é desejável determinar e monitorizar distúrbios relacionados com a neurotripsina em doentes ou avaliar o efeito de medicamentos sobre o estado da neurotripsina in vivo, respectivamente. 3

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os requerentes verificaram que o objectivo da invenção pode ser realizado por um método de acordo com a reivindicação 1, no qual o fragmento de 22 kDa de agrina é medido no sangue ou urina, com o fim de determinar a actividade ín vivo da neurotripsina e pela utilização de tal método de acordo com a reivindicação 3 para diagnóstico e monitorização de distúrbios relacionados com a neurotripsina. A invenção abrange, adicionalmente, a utilização do fragmento de 22 kDa de agrina como biomarcador especial de acordo com a reivindicação 8.

Uma reivindicação independente adicional é dirigida à utilização do fragmento de 22 kDa de agrina como biomarcador em estudos clinicos ou pré-clinicos, para estabelecer o efeito de substâncias sobre a actividade da neurotripsina.

As formas de realização preferidas da invenção são abordadas nas reivindicações dependentes.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Fig. 1 mostra a sequência de proteína da agrina humana (SEQ ID N° 1) . 0 comprimento completo do precursor não processado é de 2045 aminoácidos. Na porção de sequência mostrada, a posição de sítios de clivagem α e β está assinalada. Além disso, estão assinaladas algumas subsequências referidas nos exemplos. A sequência do fragmento de 22 kDa de agrina é mostrada em negrito. 4 A Fig. 2A é uma representação esquemática da organização de domínio de agrina e localização dos seus sítios de clivagem dependentes da neurotripsina. A agrina tem uma massa de proteína nuclear de, aproximadamente, 220 kDa. É uma proteína multidomínio, composta por 9 domínios FS (semelhante a folistatina), 2 domínios LE (semelhante a EGF de laminina), um domínio SEA (enterocinase de proteína espermática e agrina), 4 domínios EG (semelhante ao factor de crescimento epidérmico) e 3 domínios LG (globular de laminina). Em ambos os lados do domínio SEA verifica-se uma região S/T (rica em serina/treonina). A agrina existe em várias isoformas, e. g., uma isoforma segregada com um domínio N-terminal de agrina (NtA) e uma isoforma transmembranar de tipo II com um segmento N-terminal transmembranar (TM) fixando a sua ancoragem na membrana plasmática. Variantes de excisão da fracção C-terminal: uma inserção de 4 aminoácidos de comprimento no sítio A/y e as três inserções diferentes no sítio B/z compostos por 8, 11 ou 19 (8+11) aminoácidos. A neurotripsina cliva a agrina em dois sítios. Um sítio (designado sítio a) está localizado entre a arginina 1102 (R1102) e a alanina 1103 (A1103) . O outro sítio (designado sítio β) está localizado entre a lisina 1859 (K1859) e a serina 1860 (S1860) . Os números de aminoácido referem-se a agrina segregada (variante de excisão A0B0) do ortólogo humano (UniProtKB/Swiss-Prot 000468). A clivagem de agrina por neurotripsina gera um fragmento N-terminal nas gamas de 110-400 kDa (em virtude de níveis diferenciais de hidratos de carbono), um fragmento central de aprox. 90 kDa e um fragmento C-terminal de 22 kDa. 5 A Fig. 2B mostra de que modo a neurotripsina cliva a agrina in vitro. Análise de transferência de Western de células HeLa co-transfectadas com combinações de agrina membranar (+), neurotripsina de tipo selvagem (wt), neurotripsina inactiva (S/A) e pcDNA3.1 vazio (-).

Os sobrenadantes (S) e lisados celulares (CL) foram analisados com anticorpos anti-agrina dirigidos contra a extremidade C de agrina. Painel superior: A transfecção apenas de agrina resultou num sinal acima de 250 kDa no lisado celular. Após co-transfecção com neurotripsina de tipo selvagem, a agrina de comprimento completo foi clivada, resultando em fragmentos correndo a 22, 90 e 110 kDa no sobrenadante. Não se verificou clivagem após co-transfecção com neurotripsina inactiva. Painel inferior: Controlo para expressão de neurotripsina com anticorpos contra neurotripsina. A Fig. 3 mostra a estrutura de dominio de agrina transmembranar. Estão indicadas as sequências dos sitios de clivagem α e β e os fragmentos C-terminais resultando da clivagem da neurotripsina. TM, segmento transmembranar; FS, repetição rica em cisteina semelhante a folistatina; LE, dominio semelhante a EGF de laminina; S/T, região rica em serina/treonina; SEA, dominio de enterocinase de proteina espermática e agrina; EG, dominio semelhante ao factor de crescimento epidérmico (EGF); LG, dominio globular de laminina; círculos únicos, sítios de glicosilação N-ligada; círculos múltiplos, sítios de conjugação de glicano. A Fig. 4 mostra que a neurotripsina cliva a agrina in vivo. Análise de transferência de Western de tecido de murganhos 6 de tipo selvagem (wt) e deficientes em neurotripsina (KO) . 0 produto de clivagem de agrina de 90 kDa foi detectado em cérebro, rim e pulmão de murganhos de tipo selvagem mas estava ausente em deficientes em neurotripsina. Resultados semelhantes foram obtidos para o fragmento de agrina de 22 kDa, excepto para o pulmão. A β-actina foi utilizada como um controlo de carregamento. A Fig. 5 A, B mostra que a estimulação química de potenciação prolongada induz um aumento em actividade proteolítica de neurotripsina. A Fig. 5 A é uma transferência de Western para agrina (painel superior) e β-actina (painel inferior) em fatias de hipocampo sem estimulação (No Stim) e estimuladas pela combinação de picrotoxina, forscolina e rolipram (PFR). A intensidade de sinal do fragmento de 90 kDa de agrina, clivado por neurotripsina, em hipocampo estimulado por PFR, é mais intensa do que no controlo não estimulado. A Fig. 5 B mostra a razão da intensidade de sinal do fragmento de 90 kDa de agrina, normalizado por intensidade de sinal de β-actina. A média das intensidades de sinal nos controlos não estimulados foi fixada em 1. Três experiências independentes mostraram um aumento significativo de 30% do fragmento de agrina por estimulação PFR, comparativamente com controlos não estimulados (p < 0,05, pelo teste t de Student). A Fig. 6 demonstra de que modo a estimulação química de potenciação prolongada aumenta o número de filopódios num modo dependente de neurotripsina. 7 0 histograma mostra os números de filopódios (Fil) por 1 pm de dendrite apical secundária (Dend) de neurónios piramidais CAI de hipocampo sob quatro condições diferentes. Em murganhos de tipo selvagem (w.t.), a estimulação por uma combinação de picrotoxina, forscolina e rolipram (PFR) induziu um aumento significativo no número de filopódios, em comparação com os controlos não estimulados (No Stim; p < 0,01, pelo teste t de

Student) . Em contraste, os murganhos deficientes em neurotripsina (ntd) não mostraram alteração significativa no número de filopódios por estimulação PFR. A Fig. 7 é um histograma mostrando os números de filopódios (Fil) por 1 pm de dendrite apical secundária (Dend) de neurónios piramidais CAI do hipocampo em murganhos deficientes em neurotripsina (ntd). A estimulação PFR isolada (PFR) não induziu um aumento significativo no número de filopódios, em comparação com controlos não estimulados (No Stim). A co-administração de picrotoxina, forscolina e rolipram (PFR) e do fragmento de 22 kDa (PFR+22-kDa) resgatou o aumento induzido por estimulação quimica no número de filopódios (p < 0,001 vs No Stim e PFR, pelo teste t de Student) . Além disso, o fragmento de 22 kDa sem estimulação PFR (22-kD frag) também induziu um aumento significativo no número de filopódios (p < 0,001 vs No Stim, pelo teste t de Student).

Por este motivo, o fragmento de 22 kDa de agrina induz um aumento no número de filopódios em murganhos deficientes em neurotripsina. A Fig. 8A é uma análise de transferência de Western do homogeneizado de cérebro de um murganho de tipo selvagem (+/+) e de um murganho deficiente em neurotripsina (-/-). Notar que o fragmento de 22 kDa de agrina é apenas detectado no murganho de tipo selvagem. Isto indica que o fragmento de 22 kDa é, de facto, o resultado de clivagem dependente de neurotripsina de agrina. A Fig. 8B é uma transferência de Western de soro sanguíneo de um murganho de tipo selvagem (+/+), um murganho deficiente em neurotripsina homozigótico (-/-) e um murganho deficiente em neurotripsina heterozigótico (+/-). Mostra-se que o fragmento de 22 kDa de agrina está apenas presente em murganhos expressando neurotripsina funcional (+/+ e +/-).

Além disso, a partir de ambas as Figs. 8 A, B é evidente que o fragmento de 22 kDa de agrina está presente em homogeneizado de cérebro e em sangue do murganho. A Fig. 9A é uma transferência de Western de amostras CSF de humanos na gama de idades entre 1 mês e 86 anos. Em cada corredor, foram analisados 10 pL de CSF humano. Foi utilizado um gradiente de gel de SDS-PAGE comercialmente disponível (NuPAGE, 4-12%). A imunodetecção foi realizada com o anticorpo R139 contra o fragmento de 22 kDa de agrina. De acordo com o elevado nível de expressão de neurotripsina durante o desenvolvimento neural, o fragmento de 22 kDa dependente de neurotripsina de agrina é mais abundante nas idades de 2 e 9 meses. A Fig. 9B é uma análise de LC/MS do fragmento de 22 kDa verificado em CSF humano. A sequência apresentada compreende o fragmento de 22 kDa e os cinco aminoácidos 9 precedendo o sítio de clivagem β (SEQ ID N° 2) . As amostras CSF de vários indivíduos foram agregadas e as suas proteínas cromatograficamente separadas, com o fim de enriquecer para o fragmento de 22 kDa identificado por transferência de Western. A fracção enriquecida para o fragmento de 22 kDa foi cortada de um gel de SDS-page e submetida a análise de LC/ESI/MS/MS. Foram identificados dois péptidos, péptido N° 1 (SEQ ID N° 3) e N° 2 (SEQ ID N° 4) . Ambos foram localizados no fragmento de 22 kDa de agrina.

Ambas as Fig. 9A e B mostram que o fragmento de 22 kDa de agrina pode ser detectado no fluido cerebrospinal humano (CSF) . A Fig. 10 é uma transferência de Western de soro sanguíneo humano cromatograficamente processado, mostrando uma forte banda imunorreactiva para o fragmento de 22 kDa de agrina. A confirmação final da sua identidade irá requerer análise de MS, contudo, os presentes resultados são um forte elemento de evidência de que o fragmento de 22 kDa de agrina pode ser verificado no soro sanguíneo humano.

DESCRIÇÃO O fragmento de 22 kDa C-terminal do proteoglicano agrina, utilizado no método da invenção e como biomarcador, é um produto naturalmente gerado da clivagem proteolítica da agrina pela sua enzima de processamento única, neurotripsina. 10 A agrina é uma molécula bem caracterizada (Bezakova et al., 2003; Sanes e Lichtman, 2001). Tem uma massa de proteína nuclear de, aproximadamente, 220 kDa. A agrina existe em várias isoformas e variantes de excisão.

Como está ilustrado na Fig. 2A, a agrina é clivada pela protease de serina neurotripsina em dois sítios homólogos, designados sítios de clivagem α e β. A clivagem de agrina por neurotripsina resultante de co-expressão das duas proteínas em células HeLa liberta três fragmentos de agrina o do sobrenadante de cultura (Exemplo 1 e Fig. 1B) . O fragmento de 22 kDa vai desde o sítio de clivagem β até à extremidade C de agrina. O fragmento de 90 kDa abarca desde o sítio de clivagem α até ao β, enquanto o fragmento de 110 kDa vai desde o sítio de clivagem α até à extremidade C e, deste modo, é o resultado de clivagem incompleta no sítio β. O fragmento N-terminal permanece com as células e, provavelmente, é rapidamente degradado por meio de endocitose.

Ambos os sítios de clivagem foram inequivocamente identificados e verificados como sendo homólogos e conservados em evolução (Exemplo 2). O termo fragmento de 22 kDa de agrina, se utilizado neste pedido, abarca desde o sítio de clivagem β até à extremidade C de agrina e deverá abranger todas as diferentes isoformas e variantes de excisão do fragmento ocorrendo in vivo. Em alguns pedidos, o domínio G de laminina C-terminal (LG3) de agrina é referido como fragmento de 20 kDa. A proteína visada por este termo é estruturalmente equivalente ao fragmento utilizado de acordo com a invenção, mas foi gerada artificialmente como uma proteína recombinante, correspondendo ao domínio LG C-terminal 11 de agrina para efeitos de teste da sua função. Em contraste, é um aspecto essencial que o domínio LG C-terminal de agrina seja naturalmente separado do resto da molécula de agrina por clivagem proteolítica dependente de neurotripsina. Apenas após clivagem proteolítica no denominado sítio de clivagem β, o fragmento de 22 kDa de agrina se torna móvel e se transloca do sítio da sua geração para o fluido cerebrospinal ou o sangue, onde pode ser detectado com base em métodos de detecção estabelecidos e, deste modo, servir como um biomarcador.

Do documento WO 2006/103261, anteriormente citado, conhece-se um método de teste para determinar o efeito de substâncias de inibição sobre a actividade de neurotripsina. Um protocolo típico do método conhecido prevê que a substância de inibição seja incubada juntamente com neurotripsina e agrina e a quantidade de clivagem de agrina é determinada com base em medição de fragmentos gerados pela actividade proteolítica de neurotripsina. O método conhecido refere-se a um ensaio enzimático in vitro, com um número limitado de agentes de reacção. Uma vez que a situação in vivo é muito mais complexa, não se poderia esperar que um fragmento especial de agrina também pudesse ser verificado no CSF ou no sangue e utilizado como um biomarcador in vivo, com o fim de relatar sobre actividade in vivo de neurotripsina no cérebro e em tecidos extraneurais, respectivamente. Em primeiro lugar, da clivagem in vitro de uma proteína ou péptido, não se pode concluir que a clivagem também ocorre in vivo. A clivagem in vitro é uma reacção experimental artificial. É alcançada através da colocação da enzima proteolítica e uma proteína em conjunto num tubo de ensaio e da incubação das mesmas em conjunto, de modo a permitir que a 12 reacção de clivagem ocorra. A clivagem in vivo de uma proteína ou péptido, em contraste, requer que seja co-localizada com uma determinada enzima proteolítica no espaço e tempo, para que a reacção se realize. Por exemplo, pode ser demonstrado in vitro que a agrina pode ser clivada pela protease de serina pancreática tripsina. Contudo, a tripsina não consegue clivar a agrina in vivo, em virtude de a agrina não estar co-localizada in vivo com a tripsina. Os requerentes verificaram que a inactivação selectiva de neurotripsina por direccionamento génico abole completamente a clivagem de agrina (Exemplo 3) . Isto indica que apenas a neurotripsina pode clivar a agrina in vivo, enquanto outras proteases da serina semelhantes a tripsina, tal como tripsina, que podem clivar a agrina in vitro, não clivam a agrina in vivo. Em segundo lugar, mesmo conforme o facto de que a clivagem in vivo de agrina por neurotripsina se verifica em tecido homogeneizado, não se pode prever se um fragmento dependente de neurotripsina de agrina será verificado no CSF ou no sangue. No CSF e sangue, a agrina de comprimento completo e o fragmento de 90 kDa são apenas verificados em quantidades insignificantes. A neurotripsina não é detectável no CSF e no sangue. Por conseguinte, a clivagem de agrina por neurotripsina não ocorre no CSF nem no sangue, mas no interior dos tecidos neurais e não neurais, onde a agrina e neurotripsina se encontram em superfícies celulares ou na matriz extracelular. Por conseguinte, a ocorrência do fragmento de 22 kDa no CSF e sangue é, definitivamente, uma observação sem precedentes e não trivial. Em favor desta conclusão, pode ser notado que nem o fragmento N-terminal nem o fragmento de 90 kDa central de agrina surgem no CSF ou sangue após a sua geração por neurotripsina. Por conseguinte, dos três fragmentos de agrina que são gerados por actividade proteolítica de neurotripsina, apenas o fragmento 13 de 22 kDa é eficientemente translocado para dentro de CSF e sangue, enquanto os outros dois fragmentos o não são. A ocorrência do fragmento de 22 kDa de agrina no CSF e no sangue reflecte o nivel de actividade de neurotripsina no cérebro e em tecidos não neurais, respectivamente.

Fazendo referência à actividade de neurotripsina no cérebro, os requerentes foram os primeiros a mostrar que homogeneizados de cérebro de murganhos de tipo selvagem contêm o fragmento de 22 kDa de agrina que, em contraste, não se verifica em homogeneizados de cérebro de murganhos deficientes em neurotripsina (Exemplo 3) . Além disso, os requerentes foram capazes de demonstrar a presença do fragmento de 22 kDa de agrina em preparações de sinapses isoladas, denominadas sinaptossomas. Esta observação indica que o fragmento de 22 kDa derivado de cérebro de agrina tem origem em sinapses onde a neurotripsina é segregada e encontra a agrina no espaço extracelular. Após clivagem local de agrina na sinapse, ou na vizinhança da sinapse, o fragmento de 22 kDa transloca-se selectivamente para o CSF. Por conseguinte, o nivel do fragmento de 22 kDa de agrina no CSF relata sobre a actividade de neurotripsina na sinapse de SNC.

Fazendo referência à actividade de neurotripsina em tecidos não neurais, os requerentes mostraram que a neurotripsina é expressa no rim e no pulmão e que a clivagem dependente de neurotripsina de agrina no rim e pulmão gera fragmentos de agrina de 90 kDa e 22 kDa. Em virtude de tanto o rim como o pulmão serem tecidos altamente vascularizados, é muito provável que, pelo menos parte, do fragmento de 22 kDa de agrina que se verifica no sangue tenha origem no rim e/ou no pulmão. Por 14 conseguinte, o nível de fragmento de 22 kDa verificado no sangue relata sobre a actividade de neurotripsina no rim e/ou pulmão.

Uma fracção do fragmento de 22 kDa de agrina verificado no sangue tem origem, muito provavelmente, na junção neuromuscular. Os requerentes verificaram que a neurotripsina derivada de motoneurónio que é transportada ao longo dos nervos motores para os músculos esqueléticos cliva a agrina na junção neuromuscular. 0 fragmento de 22 kDa de agrina que é libertado na NMJ transloca-se, muito provavelmente, para dentro do sangue. Por conseguinte, o nível de fragmento de 22 kDa de agrina verificado no sangue também relata sobre a actividade de neurotripsina na NMJ. A avaliação da actividade de neurotripsina no cérebro ou em tecidos extraneurais, por meio de medição dos níveis do fragmento de 22 kDa de agrina no CSF e no sangue, respectivamente, permite tirar conclusões sobre estados fisiológicos ou patológicos dependentes da neurotripsina.

Os requerentes reconheceram a neurotripsina como um promotor de plasticidade sináptica no SNC. Demonstraram que a promoção de plasticidade sináptica por neurotripsina depende da clivagem de agrina, resultando na geração e na libertação do fragmento de 22 kDa C-terminal (Exemplo 4) . Por sua vez, o fragmento de 22 kDa tem actividade estimuladora de sinapse e, deste modo, promoção de plasticidade. Utilizando um sistema de modelo experimental baseado em fatias de tecido de hipocampo, os requerentes verificaram que a promoção de filopódios após indução de potenciação prolongada foi abolida em murganhos deficientes em neurotripsina (Exemplo 5). Também verificaram que o fragmento de 22 kDa gerado por neurotripsina por meio de 15 clivagem de agrina é instrumental na promoção dependente de neurotripsina de plasticidade sináptica, através do aumento do número de filopódios dendríticos (Exemplo 6). Os filopódios dendríticos são precursores de sinapses. 0 aumento dos filopódios dendríticos promove a reorganização dos circuitos sinápticos no SNC. Experiências com hipocampos de murganhos deficientes em neurotripsina mostraram que, sem a geração dependente de neurotripsina do fragmento de 22 kDa de agrina, a promoção dependente de actividade de filopódios dendríticos não é funcional. Por este motivo, uma relação directa entre um estado patológico dependente de neurotripsina e o fragmento de 22 kDa de agrina pôde ser estabelecida num modelo animal. Esta observação em murganhos está em boa conformidade com a observação realizada em indivíduos humanos deficientes em neurotripsina, indicando que a plasticidade sináptica adaptativa não é funcional sem neurotripsina e resulta uma forte deficiência em função cerebral superior (cognitiva), também denominada retardação mental (Molinari et al., 2002). Por conseguinte, a monitorização da actividade de neurotripsina em sinapses por meio de medição do fragmento de 22 kDa de agrina no CSF permite o diagnóstico de desregulações de funções sinápticas dependentes da neurotripsina, tal como a plasticidade sináptica dependente de neurotripsina.

Em experiências adicionais, mostrou-se que o fragmento de 22 kDa de agrina pode ser detectado no sangue ou CSF de murganhos e assim como de doentes humanos. Os anticorpos para a detecção do fragmento de 22 kDa de agrina são gerados, em primeiro lugar através de produção do fragmento de 22 kDa recombinante de agrina (Exemplo 7) e, depois, utilização do mesmo para qualquer um dos métodos geralmente utilizados para produção de anticorpos (Exemplo 8) . 16

Foi demonstrada a utilização de anticorpos contra o fragmento de 22 kDa de agrina, a sua presença em homogeneizado de cérebro e sangue do murganho (Exemplo 9), assim como em CSF humano (Exemplo 10) e sangue (Exemplo 11). Isto torna o fragmento um biomarcador adequado para aplicações de rotina.

Consequentemente, a invenção abrange um método para determinar in vivo a actividade de neurotripsina através de medição da quantidade do fragmento de 22 kDa de agrina numa amostra de doente. Através da utilização deste método, os distúrbios relacionados com neurotripsina podem ser diagnosticados ou monitorizados e, em geral, o fragmento pode ser utilizado como biomarcador para todos os distúrbios relacionados com neurotripsina.

Tais distúrbios podem ser, especialmente, doenças causadas por desregulação de neurotripsina, onde o termo "desregulação" abrange não apenas processos regulatórios ao nível genético, mas também pode reflectir processos metabólicos influenciando a actividade de neurotripsina.

Num exemplo preferido, o fragmento de agrina é utilizado como biomarcador para doenças ou distúrbios do sistema neural ou neuromuscular relacionados com neurotripsina, tais como retardação mental dependente de neurotripsina e sarcopenia, a atrofia de músculo esquelético de pessoas idosas, respectivamente. O fragmento de 22 kDa de agrina pode ser utilizado para diagnóstico dos distúrbios ou doenças mencionados. Além do diagnóstico, também é possível utilizar o biomarcador em questão 17 para monitorização da tendência ou processo de uma doença relacionada com neurotripsina.

Como anteriormente referido, parece que uma ampla variedade de doenças ou distúrbios pode ser relacionada com a enzima neurotripsina ou sua actividade. Por conseguinte, uma importante abordagem terapêutica é descobrir substâncias que influenciem, especialmente inibam, a actividade de neurotripsina in vivo. Também neste contexto, i. e., em estudos clínicos ou pré-clínicos realizados para determinar a possível aplicabilidade de substâncias como, e. g., inibidor de neurotripsina, o fragmento de 22 kDa de agrina pode ser utilizado como biomarcador. A concepção de tais estudos não representa um problema para alguém especialista na técnica. É adequada qualquer concepção que possibilite a medição in vivo do fragmento de 22 kDa de agrina em doentes que sejam tratados com diferentes substâncias, seleccionadas pela sua possível acção sobre a neurotripsina.

Uma vantagem principal na utilização do fragmento de 22 kDa de agrina como biomarcador é que este fragmento pode ser detectado no sangue ou CSF, os quais são ambos fluidos corporais que podem ser analisados em aplicações de rotina. A detecção do fragmento pode ser realizada por métodos habituais conhecidos na técnica, como ELISA, técnicas de imunotransferência (transferência de Western), RIA, citometria de fluxo, polarização de fluorescência, aglutinação de látex, ensaio de fluxo lateral, ensaio imunocromatográfico, imunochips, imunotestagem de tiras ou tecnologia baseada em esferas, em combinação com qualquer outro método (e. g., quimioluminescência, Luminex), para citar apenas alguns exemplos. 18

Uma vantagem principal em trabalhar com sangue ou CSF é que apenas o fragmento de 22 kDa de agrina é libertado após clivagem proteolitica por neurotripsina nos tecidos mencionados. A molécula completa de agrina não está presente ou está apenas num grau negligenciável no sangue ou CSF, de modo que a detecção do fragmento no sangue pode ser realizada com anticorpos que não devem necessariamente diferenciar entre a agrina completa e o seu fragmento de 22 kDa.

Os anticorpos ou outros tipos de proteínas de ligação específicas que se ligam selectivamente ao fragmento de 22 kDa de agrina podem ser gerados por qualquer pessoa das técnicas conhecidas na técnica (Roque et al., 2004; Gill e Damle, 2006). De um modo preferido, os anticorpos naturais ou recombinantes ou outras proteínas de ligação específicas são gerados através da utilização de um fragmento de 22 kDa de agrina ou uma sua porção, preparado por técnicas recombinantes ou síntese química como um alvo. O fragmento de 22 kDa de agrina, como definido na presente invenção, é o fragmento de 22 kDa de agrina humana de SEQ ID N° 12 que pode, adicionalmente, conter as inserções de 8, 11 ou 19 (8+11) aminoácidos de isoformas de agrina no sítio B/z. Na agrina humana, o sítio B/z está localizado no domínio LG3, entre os aminoácidos Serl884 e Glul885 (Fig. 1 e UniProtKB/Swiss-Prot 000468). As sequências inseridas podem ser ELANEIPV (B/z 8; SEQ ID N° 13), PETLDSGALHS (B/z 11; SEQ ID N° 14) OU ELANEIPVPETLDSGALHS (B/z 19; SEQ ID N° 15) . Na presente divulgação, o termo fragmento de 22 kDa de agrina também inclui variantes da proteína definida por SEQ ID N° 12 ou as correspondentes isoformas com 8, 11 ou 19 aminoácidos 19 adicionais, em que um ou mais, em particular um, dois, três ou quatro aminoácidos são substituídos por outros aminoácidos e/ou em que até doze aminoácidos são delecionados na extremidade C ou na extremidade N ou em que até 30 aminoácidos são adicionados na extremidade N. Tais aminoácidos adicionais na extremidade N estão, e. g., presentes em virtude do método de preparação por síntese e expressão recombinante em células adequadas. Um exemplo de uma tal proteína, estando sob a definição de fragmento de 22 kDa de agrina é a proteína preparada de acordo com o Exemplo 7 de SEQ ID N° 12 que contém, adicionalmente, uma cauda 8xHis com um ligante glicina-serina (GS), de modo a simplificar a purificação e quatro aminoácidos adicionais na extremidade N-terminal. As proteínas que são glicosiladas ou, de outro modo, modificadas durante a expressão em células eucarióticas ou outras, também estão incluídas na presente definição de fragmento de 22 kDa de agrina.

Os anticorpos ou outras proteínas de ligação dirigidos contra o fragmento de 22 kDa de agrina também podem ser gerados através da utilização de apenas uma porção do fragmento de 22 kDa de agrina, por exemplo, um péptido de 18 aminoácidos com uma sequência retirada da sequência do fragmento de 22 kDa de agrina.

Adicionalmente, está abrangido pela invenção que um fragmento de 22 kDa de agrina, preparado por técnicas recombinantes, é utilizado como uma referência no método de acordo com a reivindicação 1 como uma referência. 20 EXEMPLOS :

Exemplo 1: A co-transfecção de agrina com neurotripsina em células eucarióticas resulta em clivagem de agrina em dois sítios

De modo a testar a agrina como um substrato para neurotripsina, células HeLa foram transfectadas com a isoforma transmembranar de agrina de rato (x4y8), isoladamente ou juntamente com neurotripsina de tipo selvagem (wt) ou uma forma inactiva de neurotripsina (S/A), em que o sitio activo Ser foi mutado para Ala.

Para expressão de neurotripsina, a região codificante de neurotripsina humana de comprimento completo (CAA04816) foi inserida dentro do vector pcDNA3.1 (Invitrogen). A neurotripsina cataliticamente inactiva (S/A) foi gerada através de mutação de Ser8256 em Ala, por meio de PCR de extensão de sobreposição. Para expressão da ligação de agrina membranar de comprimento completo, a sequência codificante que vai desde Meti a Proi948 de agrina de rato (P25304, isoforma 4, variante de excisão y4z8) foi inserida no pcDNA3.1. As células HeLa foram cultivadas até 60-80% de confluência em placas de cultura de 12 poços (Corning) com DMEM suplementado com FCS a 10% (Biochrom) . Polietilenimina (PEI) foi utilizada como reagente de transfecção, como descrito em Baldi et al., 2005. A mistura de transfecção foi removida 4-6 h após transfecção, por lavagem uma vez com solução salina tamponada com fosfatos (PBS) . Após 48 h em DMEM sem FCS, o meio foi recolhido e as células foram lisadas em NaCl a 150 mM, EDTA a 0,5 mM, glicerol a 10%, Triton-X-100 a 1% em Tris-HCl a 20 mM, pH 7,4. Para a análise de produtos de clivagem, os 21 sobrenadantes e lisados celulares foram separados num gel NuPAGE a 4-12% (Invitrogen) e analisados por imunodetecção.

Em lisados de células transfectadas apenas com agrina, uma mancha superior a 250 kDa, caracteristica para agrina de comprimento completo, foi detectada em transferências de Western com anticorpos dirigidos contra a sua fracção C-terminal (Fig. 2A) . O mesmo sinal também se verificou em lisados de células co-transfectadas com neurotripsina inactiva. Quando a neurotripsina de tipo selvagem foi co-transfectada com agrina, não se verificou sinal de agrina no lisado celular. Contudo, verificaram-se novas bandas de 110, 90 e 22 kDa no sobrenadante de cultura. Nenhum destes fragmentos de agrina se verificou nos sobrenadantes de co-transfecções com a forma inactiva de neurotripsina. Em conjunto, estes resultados demonstraram que a neurotripsina proteoliticamente activa clivou a agrina, resultando na libertação de três fragmentos C-terminais para o sobrenadante de cultura.

Exemplo 2: Os dois sítios de clivagem dependentes da neurotripsina de agrina são homólogos e evolutivamente conservados

De modo a determinar os sítios de clivagem dependente de neurotripsina de agrina, a neurotripsina foi co-expressa em células HEK293T com uma forma transmembranar de comprimento completo de agrina de rato (variante de excisão y4z8) ou com o fragmento C-terminal de agrina compreendendo os domínios LG2, EG4 e LG3 utilizando transfecção PEI (Baldi et al., 2005). Após 3 dias, os sobrenadantes foram recolhidos. Para a purificação do fragmento de 90 kDa, 11 sobrenadantes de células transfectadas 22 com agrina de comprimento completo foram carregados sobre uma coluna de heparina sepharose CL-6B (GE Healthcare), equilibrada com NaCl a 150 mM em Tris-HCl a 20 mM, pH 7,5. As proteínas foram eluídas num gradiente de 150 mM a 1 M de NaCl em Tris-HCl a 20 mM, pH 7,5. O fragmento de 22 kDa foi purificado por meio da sua StrepTag C-terminal, a partir de 24 mL de meio de células transfectadas com o fragmento C-terminal de agrina com uma coluna StrepTactin (IBA), de acordo com a recomendação do fabricante. Para a sequenciação N-terminal por degradação Edman, as amostras peptídicas foram separadas em géis NuPAGE a 4-12%, electrotransferidas sobre uma membrana de PVDF e analisadas num Sequenciador Procise 492 cLC (Applied Biosystems) no Functional Genomics Center Zurich.

Deste modo, a sequência N-terminal ASCYN SPLGCCSDGK (SEQ ID N° 5) foi verificada para o fragmento de 90 kDa e SVGDLETLAF (SEQ ID N° 6) para o fragmento de 22 kDa. Por conseguinte, um sítio de clivagem está localizado entre o primeiro segmento S/T e o domínio SEA, C-terminalmente de Arg995 na sequência PIER-ASCY (SEQ ID N° 7, Fig. 3). O segundo sítio de clivagem foi localizado entre o quarto domínio semelhante a EGF e o domínio LG3, C-terminalmente de Lysi754 na sequência LVEK-SVGD (SEQ ID N° 8, Fig. 3) . Os números de aminoácidos referem-se a agrina de rato ancorada a membrana (P25304; variante de excisão x4y0) . Designou-se a ligação físsil entre R995 e A996 como sítio de clivagem α e a ligação físsil entre K1754 e S1755 como sítio de clivagem β.

Um alinhamento (Tabela 1) das duas sequências de clivagem de agrina de rato, com segmentos correspondentes de diversas espécies de vertebrados, mostrou uma conservação estringente dos aminoácidos flanqueando os sítios de clivagem. 23

Tabela 1 2 4

Sítio a Sítio β Espécie P5 P4 P3 P2 PI i Pl' P2' P3' P4' P5' P5 P4 P3 P2 Pl 1 Pl' P2' P3' P4' P5' Homo sapiens P P V E R 1 A s c Y N G L V E K 1 S A G D V Pan troglodytes P P V E R 1 A s c Y N G L V E K 1 S A G D V Bos taurus L P M E R 1 A s c Y N G L I E K 1 S A G D L Canis famliaris P P M E R 1 A s c Y N G L I E K 1 S A G D V Rattus norvegicus P P I E R 1 A s c Y N G L V E K 1 S V G D L Mus msculus P P I E R 1 A s c Y N G I V E K 1 S V G D L Gallus gallus P A I E R 1 A T c Y N V I I E K 1 a A G D A Discopyge omata V P N E R 1 S T c D N A L E E K 1 S A S G S Rana pípíens A T I E K 1 S A G S S Danio rerio T I F E K 1 S A G D T Consenso P P I E R I A s c Y N G L V E K 1 S A G D V L A M 1 S T D A I I 1 A V S G L V V 1 V T E 1 S S Ni T F 1 T

Alinhamento de sequências de agrina de diferentes espécies. Para comparação dos resíduos de aminoácidos circundando a ligação físsil dos sítios de clivagem α e β, foi utilizada a terminologia de Schechter e Berger (1967) . Pl denota o resíduo N-terminal e Pl' o resíduo C-terminal preso na ligação físsil. Os resíduos flanqueantes na direcção N-terminal são denotados P2, P3, . . . Pn, os resíduos flanqueantes na direcção C-terminal são denotados P2', P3', ... Pn'.

Como é evidente a partir da Tabela 1, o sítio α tinha um Arg estritamente conservado em Pl e um Glu em P2. 0 sítio β tinha um Lys estritamente conservado em Pl e um Glu em P2. Os resíduos na posição P3 eram mais variáveis, enquanto os resíduos predominantemente apoiares se verificaram em P4 de ambos os sítios. No sítio C-terminal da ligação físsil, os resíduos Pl' e P2' são bem conservados em cada lado, predominantemente com uma sequência Ala-Ser no sítio α e uma sequência Ser-Ala no sítio β. Verificaram-se resíduos bem conservados mas distintos em P3' e P4' dos dois sítios.

Resumindo, as sequências consenso do sítio α e β exibem um perfil idêntico, com uma conservação estrita do resíduo Pl e P2, uma ocupação variável da posição P3 e um elevado grau de conservação em P4, Pl', P2' e P3'. 0 perfil grosseiro das sequências consenso individuais dos sítios α e β é mantido, quando uma sequência consenso combinada dos dois sítios de clivagem é gerada (Tabela 2), confirmando a homologia entre as sequências de clivagem individuais nos sítios α e β. 25

Tabela 2 Sequência consenso combinando os sítios de clivagem a e β.

P5 P4 P3 P2 PI 4 PI' P2' P3' P4 ' P5 ' consenso combinado P P P I E R 4 S A G D N G L V K 4 A S C Y V A I M 4 T S G L V A N 4 V S S T T E 4 T L F 4 A

Exemplo 3: A clivagem dependente de neurotripsina de agrina ocorre in vivo e não se verifica em murganhos deficientes em neurotripsina

Foram investigados diferentes tecidos de murganhos de tipo selvagem e deficientes em neurotripsina para a presença de fragmentos de agrina. Cérebro, pulmão e rim foram isolados de murganhos, de 10 dias de idade, de tipo selvagem e deficientes em neurotripsina. Aproximadamente 1 g de cada tecido foi homogeneizado com um homogeneizador Potter em 1 mL de tampão de lise (sacarose a 320 mM, HEPES a 5 mM, pH 7,4), contendo um cocktail de inibidores de protease (Sigma). Os lisados celulares (40 pg de rim, 80 pg de cérebro/pulmão) foram analisados para expressão de neurotripsina e clivagem de agrina utilizando imunotransferência. A β-actina foi sondada na membrana lavada da imunotransferência de agrina. Como mostrado na Fig. 4, foi detectada forte imunorreactividade para agrina de comprimento completo em cérebro, rim e pulmão de murganhos de tipo selvagem. Nestes tecidos também se verificou o produto de clivagem de 26 90 kDa de agrina. O produto de clivagem de 22 kDa era facilmente detectável no cérebro e rim, mas estava ausente no pulmão. Em murganhos deficientes em neurotripsina não era detectável imunorreactividade de agrina a 22 kDa ou 90 kDa. Estes resultados demonstram que a clivagem de agrina por neurotripsina ocorre in vivo e, além disso, a ausência de produtos de clivagem em murganhos deficientes em neurotripsina indica que a clivagem de agrina depende estritamente de neurotripsina.

Exemplo 4: A indução de potenciação prolongada (LTP) resulta em actividade proteolítica aumentada de neurotripsina em tecido de SNC, resultando na geração de fragmentos de agrina, incluindo o fragmento de 22 kDa. O efeito de uma actividade neural semelhante a aprendizagem sobre a actividade proteolítica de neurotripsina é demonstrado pela indução de potenciação prolongada (LTP) em fatias de tecido da região CAI do hipocampo. Presentemente, a LTP é a correlação mais largamente aceite de aprendizagem e memória ao nível celular, molecular e electrofisiológico (Martin et al., 2000). De modo a maximizar o número de sinapses participando em LTP, foi utilizado um protocolo químico para indução de LTP (Otmakhov et al., 2004) com uma combinação de picrotoxina (50 μΜ), forscolina (50 μΜ) e rolipram (0,1 μΜ) . A combinação destes compostos induz forte LTP perdurando durante várias horas, sem requerer qualquer estimulação eléctrica.

Para preparar as fatias de hipocampo, o hipocampo, juntamente com o córtex cerebral adjacente, é rapidamente dissecado de murganhos C57BL/6 de 4-5 semanas de idade, depois cortado verticalmente em relação ao eixo comprido do hipocampo 27 em fatias de 400 pm de espessura utilizando um cortador de tecidos mecânico Mcllwain (The Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd.). As fatias são transferidas para dentro de fluido cerebrospinal artificial (ACSF) sem cálcio (NaCl a 120 mM, KC1 a 3 mM, NaH2P04 a 1,2 mM, NaHC03 a 23 mM, glucose a 11 mM, MgCl2 a 2,4 mM) oxigenado por 95% de 02/5% de C02 e incubado, durante uma hora, à temperatura ambiente, com o fim de proporcionar tempo suficiente para que o tecido de cérebro recupere da lesão de dissecção. Após uma pré-incubação, as fatias são incubadas em ACSF com cálcio, durante 20 minutos (NaCl a 120 mM, KC1 a 3 mM, NaH2P04 a 1,2 mM, NaHCCb a 23 mM, glucose a 11 mM, CaCl2 a 4 mM) . A LTP química é, depois, induzida na fatia por incubação com uma combinação de picrotoxina a 50 μΜ, forscolina a 50 μΜ e rolipram a 0,1 μΜ (estimulação PFR), durante 16 minutos.

Para examinar a actividade proteolitica de neurotripsina em fatias, o processamento proteolítico do seu substrato, agrina, é avaliado por transferência de Western. Imediatamente após a estimulação PFR, as fatias são homogeneizadas em Triton X-100 a 1%, sacarose a 0,32 M, EDTA a 0,5 mM, HEPES a 5 mM, pH 7,4. Os detritos são removidos por centrifugação (16000xg, durante 30 minutos, a 4 °C). As proteinas do sobrenadante (75 pg de proteína) são electroforeticamente separadas em gel de poliacrilamida de SDS a 10%, depois, electrotransferidas para uma membrana de PVDF. Subsequentemente, a membrana é imersa dentro de metanol, durante 10 segundos e seca para bloqueamento. Após o bloqueamento, a membrana é incubada com um anticorpo policlonal de coelho anti-agrina purificado por afinidade (R132; 1 pg/mL), diluído em solução salina tamponada com Tris (TBS; NaCl a 0,15 M, Tris-HCl a 10 mM, pH 8,0,) contendo Tween-20 a 0,1% (TTBS) . O R132 reconhece o fragmento de 90 kDa central de agrina que é gerado por clivagem de agrina no sítio α e β por 28 neurotripsina. Após lavagem 3 vezes, durante 10 minutos em TTBS, a membrana é incubada, de um dia para o outro, a 4 °C, em TTBS contendo um anticorpo igG anti-coelho conjugado com peroxidase (Sigma; diluído 1:10000), depois, lavada 3 vezes em TTBS e uma vez em TBS. Subsequentemente, a membrana é imersa num substrato quimioluminescente (CHEMIGLOW; Alpha Innotech Corporation), durante 5 minutos, para visualizar o fragmento de agrina. O sinal quimioluminescente foi detectado com um Chemilmager (Alpha Biotech).

Como mostrado na Figura 5A, a quantidade do fragmento de agrina de 90 kDa dependente de neurotripsina é aumentada por estimulação PFR (PFR), comparativamente com controlo não estimulado (No Stim). Este aumento é estatisticamente significativo, como determinado pelo teste t de Student (3 experiências independentes de transferência utilizando diferentes amostras; p < 0,05; Figura 5B) . Este resultado indica que a estimulação PFR induz um aumento em actividade proteolítica dependente de neurotripsina. O aumento na quantidade do fragmento de 90 kDa de agrina também indica um aumento do fragmento de 22 kDa, o fragmento C-terminal de agrina, em virtude de o fragmento de 90 kDa de agrina não poder ser gerado sem a geração do fragmento de 22 kDa. 29

Exemplo 5: 0 aumento induzido de actividade da actividade proteolitica de neurotripsina e a resultante geração do fragmento de 22 kDa de agrina em tecido de SNC resulta num número aumentado de filopódios dendríticos.

De modo a possibilitar a investigação de filopódios dendríticos, uma linha de murganho transgénica expressando a proteína verde fluorescente (GFP) ou a proteína verde fluorescente direccionada para membrana (mGFP) em neurónios únicos sob o controlo do promotor Thy-1, é cruzada com uma linha de murganho deficiente em neurotripsina. Os murganhos transgénicos expressando GFP ou mGFP são gerados como anteriormente descrito (Feng et al., 2000; De Paola et ai., 2003) . Os murganhos deficientes em neurotripsina expressando GFP ou mGFP são gerados através do cruzamento de murganhos deficientes em neurotripsina com murganhos transgénicos expressando GFP ou mGFP em neurónios únicos. Os murganhos deficientes em neurotripsina homozigóticos superexpressando mGFP e os correspondentes murganhos de tipo selvagem superexpressando mGFP são utilizados na análise seguinte com a idade de 5-6 semanas.

As fatias de hipocampo agudo são preparadas e estimuladas por PFR, como descrito no Exemplo 4. Imediatamente após o período de estimulação, as fatias são fixadas por incubação em paraformaldeído a 4%, sacarose a 4%, solução salina tamponada com fosfatos (PBS) a 0,1 M, pH 7,4, de um dia para o outro, a 4 °C. Após lavagem em PBS, as fatias são montadas em lâminas e cobertas com lamelas em meio de montagem Vectashield (Vector Laboratory Inc.). Os sinais fluorescentes nas dendrites apicais secundárias de neurónios piramidais CAI de hipocampo expressando mGFP são observados utilizando um microscópio confocal (Leica) e 30 são recolhidas imagens em série a intervalos de 0,1221 pm. A partir destas, são reconstruídas imagens tridimensionais utilizando o modo Surpass Volume no software de imagiologia Imaris (Bitplane AG) . O número de filopódios típico é manualmente contado num comprimento de 30-40 pm ao longo de 12-20 dendrites independentes, através de inspecção das imagens tridimensionais de todas as direcções. Os filopódios dendríticos são identificados de acordo com os seguintes critérios morfológicos: 1) uma protrusão de membrana dendrítica é categorizada como um filopódio se o seu comprimento for, pelo menos, duas vezes o comprimento médio das espinhas na mesma dendrite; 2) a razão do diâmetro de cabeça para o diâmetro de pescoço é menor que 1.2:1, e 3) a razão do comprimento de filopódios para o diâmetro de pescoço é superior a 3:1 (Grutzendler et al., 2002).

Os resultados indicam que, sob a estimulação PFR, o número de filopódios dendríticos no hipocampo de murganhos de tipo selvagem (WT) está aumentado, em comparação com controlos não estimulados. A análise estatística utilizando dados de 12-20 dendrites independentes mostra um aumento significativo no número de filopódios pela estimulação PFR (p < 0,01 pelo teste t de Student; Figura 6). Em contraste, a estimulação química por PFR não altera o número de filopódios em murganhos deficientes em neurotripsina (ntd) (Figura 6). Isto indica que a neurotripsina é requerida para o aumento impulsionado por actividade no número de filopódios. Resumindo, estes resultados indicam que a actividade proteolítica aumentada de neurotripsina em neurónios do SNC resulta num número aumentado de filopódios dendríticos. 31

Exemplo 6: A administração do fragmento de 22 kDa de agrina a neurónios do SNC resulta num número aumentado de filopódios dendríticos. 0 fragmento de 22 kDa, o fragmento C-terminal de agrina, é gerado naturalmente pela actividade proteolítica de neurotripsina no sítio de clivagem β de agrina. 0 fragmento de 22 kDa recombinante de agrina é produzido como descrito no Exemplo 7) . Para investigar se a geração do fragmento de 22 kDa por neurotripsina está envolvida no aumento impulsionado por actividade no número de filopódios dendríticos, os filopódios ao longo de dendrites de neurónios CAI de hipocampo são contados em fatias agudas tratadas com fragmento de 22 kDa, de murganhos deficientes em neurotripsina homozigóticos, expressando GFP ou mGFP em neurónios únicos. Os murganhos deficientes em neurotripsina são gerados como descrito no Exemplo 9. Os murganhos transgénicos expressando GFP ou mGFP são gerados como anteriormente descrito (Feng et ai., 2000; De Paola et ai., 2003). Os murganhos deficientes em neurotripsina expressando GFP ou mGFP são gerados através do cruzamento de murganhos deficientes em neurotripsina com murganhos transgénicos expressando GFP ou mGFP em neurónios únicos. As fatias de hipocampo agudas são preparadas a partir de murganhos deficientes em neurotripsina, superexpressando mGFP, como descrito no Exemplo 4. Estas fatias são divididas em 4 grupos, com o fim de as submeter a 4 diferentes condições de estimulação: sem estimulação (No Stim), incubação com PFR (PFR), incubação com fragmento de 22 kDa e PFR (22-kDa frag + PFR), e incubação com fragmento de 22 kDa (22-kDa frag). As condições experimentais, designadas 22-kDa frag e 22-kDa frag + PFR, contêm fragmento de 22 kDa humano, de rato ou de murganho (preparado como descrito no Exemplo 7), a uma concentração de 32 22 nM em ACSF oxigenado. Imediatamente após o período de estimulação (16 minutos), as fatias são fixas, montadas em lâminas e são tiradas imagens seriais a 0,1221 pm de dendrites apicais secundárias de neurónios expressando GFP por microscopia confocal, como descrito no Exemplo 5. Os filopódios são contados em 14-20 dendrites apicais secundárias (cada 30-40 pm de comprimento) de neurónios piramidais CAI, após reconstrução de imagens tridimensionais com o software de imagiologia Imaris.

Como mostrado na Figura 7, o aumento do número de filopódios dendríticos após estimulação PFR é perdido em murganhos deficientes em neurotripsina (este efeito também foi mostrado no Exemplo 5 e na Figura 6). Contudo, a adição de fragmento de 22 kDa a pfr restabelece o aumento no número de filopódios em fatias de hipocampo de murganhos deficientes em neurotripsina para o mesmo nível, como verificado com PFR em murganhos de tipo selvagem (p < 0,001 por teste t de Student) . Isto demonstra que o aumento impulsionado por actividade em filopódios está dependente da geração de fragmento de 22 kDa por clivagem proteolítica dependente de neurotripsina de agrina (que não ocorre em murganhos deficientes em neurotripsina). Além disso, a administração do fragmento de 22 kDa humano recombinante purificado, a 22 nM, isoladamente (sem PFR) induz um aumento significativo em filopódios na ausência de indução LTP química por PFR. O efeito de indução de filopódios do fragmento de 22 kDa também é observado na ausência do estímulo de indução de LTP, indicando que o fragmento de 22 kDa é um mediador a jusante do efeito de indução de filopódios de LTP. Em suma, estes resultados indicam que o fragmento de 22 kDa actua como um indutor de filopódios. 33

Exemplo 7: Clonagem, expressão e purificação do fragmento C-terminal de 22 kDa de agrina humana. 0 ADN de BAC, com o número de acesso BC007649, tendo a região 3' do ADNc de agrina humana como inserção, é utilizado para gerar um fragmento de adn codificando para o último domínio LG de agrina por amplificação por PCR. Os iniciadores de PCR utilizados são (SEQ ID N° 9) 5 '-GGG CGA GTT AAC CAC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT TCA GCG GGG GAC GTG GAT ACC TTG GC-3', introduzindo um sítio Hpal (5' humanC) e

(SEQ ID N° 10) 5' -TTA CCT GCG GCC GCT CAT GGG GTG GGG CAG GGC CGC AGC TC -3', introduzindo um sítio Notl (3' humanC).

Utilizando esta estratégia, é inserida a sequência de ADN que codifica uma cauda 8xHis N-terminal. O produto de PCR resultante é clivado com as enzimas de restrição Notl e Hpal (em negrito nas sequências iniciadoras) e clonado no vector ρΕΑΚδ, contendo a sequência codificante para o péptido sinal de calsintenina 1 humana, cortado com as mesmas enzimas de restrição. A construção resultante, pEAK8-fragmento de 22 kDa, contém a região codificante da sequência sinal de calsintenina 1 humana como um sinal de secreção para o fragmento de 22 kDa. A clonagem, assim como a amplificação do plasmídeo, são realizadas em E. coli. Para a síntese de proteína eucariótica, células 293T HEK são transfectadas utilizando o método de fosfato de cálcio. Durante a tradução em células 293T HEK, o péptido sinal é clivado. A proteína segregada resultante tem uma sequência, em que a sequência líder ARVNHHHHHH HH (SEQ ID N° 11), é ligada à extremidade N de uma sequência obtida por clivagem de agrina dependente de neurotripsina no sítio β, compreendendo o domínio LG 3 e a extremidade C de agrina de SEQ ID N° 12. 34

SAGDVDTLAFD GRTFVEYLNA VTESEKALQS NHFELSLRTE ATQGLVLWSG KATERADYVA LAIVDGHLQL· SYNLGSQPW LRSTVPVNTN RWLRWAHRE QREGSLQVGN EAPVTGSSPL GATQLDTDGA LWLGGLPELP VGPALPKAYG TGFVGCLRDV WGRHPLHLL EDAVTKPELR PCPTP

Este polipéptido tem uma massa molecular de, aproximadamente, 20 kDa sem a cauda ARVN-8xHis N-terminal. A massa total incluindo a cauda tem cerca de 21,5 kDa.

Para produção de proteína, células 293T HEK são cultivadas até 80% de confluência em sete placas de cultura de 500 cm2 (Corning), com 100 mL de meio DMEM (GIBCO) suplementado com FCS a 10% cada. Para transfecção, 35 mL de CaCl2 a 500 mM e 35 mL de tampão HBS (HEPES a 50 mM, NaCl a 140 mM, Na2HPC>4 a 1,5 mM, pH 7,1) são equilibrados, à temperatura ambiente. Dois mg de ADN da construção de expressão pEAK8-fragmento de 22 kDa são adicionados à solução de CaCl2 e misturados com o tampão HBS. A mistura de transfecção é incubada a temperatura ambiente, durante 30 min. Para transfecção de uma placa de 500 cm2 de células HEK, 10 mL da mistura de transfecção são adicionados, gota a gota, à cultura e incubados durante 4 h, a 37 °C. A mistura de transfecção é, depois, removida através de lavagem uma vez com PBS e adição de meio DMEM, sem FCS. Após 60 h, o meio condicionado é recolhido e filtrado utilizando um filtro de 0,22 pm Steritop (Millipore). O sobrenadante é dialisado contra Tris-HCl a 20 mM, NaCl a 400 mM, pH 8,5 e submetido a purificação IMAC utilizando uma coluna Ni-NTA (HisSelect de 10 mL, Sigma-Aldrich) num sistema de cromatografia liquida BioLogic (Biorad). O meio condicionado e dialisado é carregado com um caudal de 5 mL/min, a coluna é lavada com 20 CV de Tris-HCl a 20 mM, NaCl a 400 mM, pH 8,5. Para eluição, é 35 utilizado um gradiente linear de 0 a 250 mM de imidazole em tampão de lavagem para 10 volumes de coluna. As fracções contendo o fragmento de 22 kDa recombinante puro são agregadas, concentradas com 15 mL de um concentrador de vórtice (Millipore) e o tampão é trocado com uma coluna NAP 25 (Pharmacia) para MOPS a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH 7,5. A proteína purificada é congelada em azoto liquido e armazenada a -80 °C. O fragmento de 22 kDa gerado desta forma contém uma cauda 8xHis N-terminal, seguida dos residuos P' do sitio de clivagem β e da extremidade C natural de agrina.

De modo semelhante, um fragmento de 22 kDa recombinante de agrina de rato ou murganho compreendendo a mesma estrutura de dominio é clonado, expresso e purificado.

Também é possível construir um fragmento de 22 kDa com outras caudas ou um variante sem cauda do fragmento de 22 kDa, com técnicas de clonagem padrão. A expressão é alcançada em sistemas celulares eucarióticos ou procarióticos padrão e a purificação da proteína desejada é alcançada por cromatografia liquida padrão ou por reenrolamento a partir de corpos de inclusão.

Para gerar um fragmento de 22 kDa que seja idêntico à forma verificada in vivo, a cauda His N-terminal é omitida e o fragmento de 22 kDa é gerado a partir de qualquer tipo de ADNc codificando um fragmento C-terminal de agrina, compreendendo o domínio LG3 e o sítio de clivagem β de agrina (e. g., agrina de comprimento completo ou o fragmento de 44 kDa C-terminal) por digestão com neurotripsina in vitro ou durante expressão de agrina ou do fragmento de 44 kDa de agrina. O fragmento de 22 kDa é purificado como anteriormente descrito. 36

Exemplo 8: Geração de anticorpos policlonais contra o fragmento de 22 kDa de agrina.

Os anticorpos policlonais contra o domínio LG3 de agrina são gerados através da imunização de coelhos com 50 pg de dominio LG3 de agrina de rato. O anticorpo resultante é útil para a detecção de agrina de comprimento completo humana, de murganho ou de rato, assim como para a detecção de fragmentos de agrina contendo o dominio LG3 de agrina.

Exemplo 9: O fragmento de 22 kDa de agrina pode ser detectado em homogeneizado de cérebro e sangue do murganho

Foi investigada a ocorrência dos fragmentos de agrina na fracção solúvel de homogeneizados de cérebro e no soro sanguíneo do murganho. Para detecção, foram utilizados anticorpos específicos, purificados por afinidade, gerados no laboratório das requerentes, contra os fragmentos de 90 kDa e de 22 kDa. O fragmento de 22 kDa poderia ser facilmente detectado em transferências de Western, tanto em homogeneizados de cérebro como soro sanguíneo (Fig. 8). Os homogeneizados de cérebro incluídos de murganhos deficientes em neurotripsina homozigóticos (-/- na Fig. 8, A e B) não continham o fragmento de 22 kDa, ao passo que a forma heterozigótica de murganhos deficientes em neurotripsina (+/- na Fig. 8B) mostrou o fragmento de 22 kDa a um nível reduzido. Em conjunto, estes resultados indicam que o fragmento de 22 kDa detectado por transferência de Western se deve à acção de neurotripsina e que pode ser detectado na fracção solúvel do homogeneizado de cérebro, assim como no soro sanguíneo. 37

Exemplo 10: O fragmento de 22 kDa de agrina é verificado em CSF humano

Também foram testadas amostras humanas, i. e., urina, sangue e fluido cerebrospinal para a presença de fragmentos de agrina dependentes da neurotripsina. Até agora, não se verificou qualquer evidência para a presença do fragmento de 110 kDa ou de 90 kDa em qualquer dos fluidos corporais. Contudo, verificou-se o fragmento de 22 kDa tanto no fluido cerebrospinal como no soro sanguíneo.

Como mostrado na Fig. 9A, verificou-se um sinal imunorreactivo para o fragmento de 22 kDa de agrina em todas as idades testadas, variando entre uma criança de 1 mês de idade, passando por estádios de desenvolvimento adicionais e idade adulta, até ao CSF de uma mulher de 86 anos de idade. Como esperado, com base no padrão de expressão temporal de neurotripsina, com uma expressão máxima durante o desenvolvimento pós-natal precoce, verificou-se a quantidade mais elevada do fragmento de 22 kDa de agrina no CSF de crianças de 2 e 9 meses de idade. Interessantemente, um nível claramente elevado do fragmento de 22 kDa foi verificado na mulher de 86 anos de idade. Contudo, definitivamente mais amostras irão ter que ser medidas, com o fim de tirar conclusões para a relevância biológica ou patofisiológica desta observação.

Para verificar a identidade da banda imunorreactiva de 22 kDa, a proteína subjacente foi isolada de fluido cerebrospinal e submetida a uma análise de LC/ESI/MS/MS. Para efeitos de identificação da proteína inequivocamente, com base na sua sequência peptídica parcial, foi fragmentada por uma digestão tríptica. Os fragmentos resultantes foram, depois, separados por 38 cromatografia líquida e submetidos a uma análise de MS/MS. Como mostrado na Fig. 9B, foram detectados dois péptidos correspondendo exactamente à sequência de aminoácidos dos primeiros 27 aminoácidos (péptido N° 1 compreendendo 13 aminoácidos (SEQ ID N° 3); péptido N° 2 compreendendo 14 aminoácidos (SEQ ID N° 4)) do fragmento de 22 kDa de agrina humana. Ambos os péptidos terminam com um aminoácido básico, confirmando a sua natureza tríptica. 0 péptido N° 1 começa no sítio de clivagem P dependente de neurotripsina de agrina. Não se verificou qualquer péptido localizado fora das margens do fragmento de 22 kDa de agrina. Em conjunto, estes resultados confirmam a identidade da banda imunorreactiva de 22 kDa verificada nas transferências de Western, como o fragmento de 22 kDa dependente de neurotripsina de agrina. Estes resultados indicam o CSF como um compartimento repórter para monitorização da actividade de neurotripsina no cérebro.

Exemplo 11: O fragmento de 22 kDa de agrina pode ser detectado em sangue humano A pesquisa para fragmentos dependentes da neurotripsina de agrina também foi estendida a amostras extraneurais. Como mostrado na Fig. 10, a transferência de Western de soro sanguíneo humano mostrou uma clara banda imunorreactiva. Contudo, o sinal detectado no soro sanguíneo foi menos intenso do que aquele verificado no CSF. Para detecção inequívoca, foi requerida uma separação cromatográfica e enriquecimento diferencial das proteínas séricas para revelar um sinal (seta na Fig. 10) . O trabalho actualmente em curso visa a validação estrutural da identidade da banda imunorreactiva de 22 kDa como um derivado de agrina. Proporcionada a confirmação bem-sucedida, 39 o soro sanguíneo também será utilizado como um compartimento repórter para monitorização de neurotripsina in vivo. Os dados quantitativos sobre o fragmento de 22 kDa no soro sanguíneo irão permitir retirar conclusões da actividade de neurotripsina na junção neuromuscular e em tecido extraneural, tais como o rim e o pulmão. REFERÊNCIAS:

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<210> 1 <211> 2045 <212> PRT <213> Homo sapiens 42 < 4 Ο Ο > 1

Met Ala Gly Arg ser HÍS pro Gly pro Leu Arg pro Leu Leu pro Leu 1 5 10 15 Leu Vai Vai Ala Ala cys val Leu Pro Gly Ala Gly Gly Thr Cys Pro 20 25 30 Glu Arg Ala 35 Leu Glu Arg Arg Glu 40 Glu Glu Ala Asn val 45 val Leu Thr Gly Thr vai Glu Glu ile Leu Asn val Asp Pro val Gin HÍS Thr Tyr 50 55 60 Ser Cys Lys vai Arg vai Trp Arg Tyr Leu Lys Gly Lys Asp Leu val 65 70 75 80 Ala Arg Glu Ser Leu Leu Asp Gly Gly Asn Lys val val ile Ser Gly 85 90 95 phe Gly ASp Pro 100 Leu ile cys Asp Asn 105 Gin val ser Thr Gly 110 ASP Thr Arg 11 e Phe Phe vai Asn Pro Ala Pro Pro Tyr Leu Trp Pro Ala His 115 120 125 Lys Asn Glu Leu Met Leu Asn Ser Ser Leu Met Arg Ile Thr Leu Arg 130 135 140 Asn Leu Glu Glu vai Glu Phe Cys val Glu Asp Lys Pro Gly Thr His 145 150 155 160 Phe Thr Pro vai Pro Pro Thr Pro Pro Asp Ala Cys Arg Gly Met Leu 165 170 175 Cys Gly Phe Gly 180 Ala val Cys Glu Pro 185 Asn Ala Glu Gly Pro 190 Gly Arg Ala Ser Cys Vai Cys Lys Lys Ser Pro Cys Pro Ser val val Ala Pro 195 200 205 vai cys Gly Ser ASP Ala ser Thr Tyr Ser Asn Glu Cys Glu Leu Gin 210 215 220 Arg Ala Gin Cys Ser Gin Gin Arg Arg Ile Arg Leu Leu Ser Arg Gly 225 230 235 240 pro cys Gly ser Arg Asp Pro Cys Ser Asn val Thr cys ser Phe Gly 245 250 255 Ser Thr Cys Ala Arg Ser Ala ASp Gly Leu Thr Ala ser Cys Leu Cys 260 265 270 Pro Ala Thr Cys Arg Gly Ala Pro Glu Gly Thr val cys Gly ser ASp 275 280 285 Gly Ala Asp Tyr Pro Gly Glu cys Gin Leu Leu Arg Arg Ala cys Ala 290 295 300 43

Arg Gin Glu Asn val Phe Lys Lys Phe ASp Gly pro cys Asp pro cys 305 310 315 320 Gin Gly Ala Leu Pro Asp Pro Ser Arg Ser Cys Arg val Asn Pro Arg 325 330 335 Thr Arg Arg Pro Glu Met Leu Leu Arg pro Glu Ser Cys ΡΓΟ Ala Arg 340 345 350 Gin Ala Pro Val cys Gly Asp Asp Gly val Thr Tyr Glu Asn Asp cys 355 360 365 Vai Met Gly Arg Ser Gly Ala Ala Arg Gly Leu Leu Leu Gin Lys val 370 375 380 Arg Ser Gly Gin cys Gin Gly Arg Asp Gin cys Pro Glu Pro cys Arg 385 390 395 400 Phe Asn Ala Val Cys 405 Leu Ser Arg Arg Gly 410 Arg Pro Arg cys Ser 415 Cys CL VI < Arg vai Thr cys Asp Gly Ala Tyr Arg Pro val cys Ala Gin Asp 420 425 430 Gly Arg Thr Tyr Asp Ser Asp Cys Trp Arg Gin Gin Ala Glu Cys Arg 435 440 445 Gin Gin Arg Ala ile Pro Ser Lys His Gin Gly Pro cys Asp Gin Ala 450 455 460 Pro Ser Pro Cys Leu Gly Val Gin cys Ala Phe Gly Ala Thr Cys Ala 465 470 475 480 vai Lys Asn Gly Gin Ala Ala Cys Glu cys Leu Gin Ala cys ser ser 485 490 495 Leu Tyr Asp Pro Val Cys Gly Ser ASD Gly Val Thr Tyr Gly Ser Ala 500 505 510 cys Glu Leu Glu Ala Thr Ala cys Thr Leu Gly Arg Glu lie Gin val 515 520 525 Ala Arg Lys Gly Pro Cys Asp Arg Cys Gly Gin Cys Arg Phe Gly Ala 530 535 540 Leu Cys Glu Ala Glu Thr Gly Arg Cys val Cys Pro Ser Glu Cys val 545 550 555 560 Ala Leu Ala Gin Pro Val cys Gly Ser Asp Gly His Thr Tyr Pro ser 565 570 575 Glu cys Met Leu HÍS val HÍS Ala Cys Thr His Gin ile ser Leu His 580 585 590 vai Ala Ser Ala Gly pro Cys Glu Thr Cys Gly Asp Ala val Cys Ala 595 600 605 Phe Gly Ala val cys Ser Ala Gly Gin Cys val Cys Pro Arg cys Glu 610 615 620 His Pro Pro Pro Gly Pro Val Cys Gly Ser Asp Gly val Thr Tyr Gly 625 630 635 640 44

Ser Ala cys Glu Leu Arg Glu Ala Ala cys Leu Gin Gin Thr Gin Ile 645 650 655 Glu Glu Ala Arg Ala Gly Pro cys Glu Gin Ala Glu cys Gly ser Gly 660 665 670 Gly ser Gly ser Gly Glu Asp Gly ASP cys Glu Gin Glu Leu Cys Arg 675 680 685 Gin Arg 690 Gly Gly Ile Trp Asp 695 Glu ASP Ser Glu Asp 700 Gly Pro Cys val Cys Asp Phe Ser Cys Gin Ser val Pro Gly Ser Pro val Cys Gly Ser 705 710 715 720 Asp Gly Val Thr Tyr 725 Ser Thr Glu Cys Glu 730 Leu Lys Lys Ala Arg 735 Cys Glu Ser Gin Arg Gly Leu Tyr Val Ala Ala Gin Gly Ala Cys Arg Gly 740 745 750 pro Thr Phe Ala Pro Leu Pro Pro Val Ala Pro Leu His Cys Ala Gin 755 760 765 Thr Pro Tyr Gly Cys cys Gin Asp Asn ile Thr Ala Ala Arg Gly val 770 775 780 Gly Leu Ala Gly cys Pro Ser Ala cys Gin Cys Asn Pro His Gly Ser 785 790 795 800 Tyr Gly Gly Thr cys ASp pro Ala Thr Gly Gin Cys Ser cys Arg pro 805 810 815 Gly vai Gly Gly Leu Arg cys Asp Arg Cys Glu pro Gly Phe Trp Asn 820 825 830 Phe Arg Gly Ile Val Thr Asp Gly Arg Ser Gly Cys Thr Pro cys Ser 835 840 845 cys Asp Pro Gin Gly Ala val Arg ASp Asp cys Glu Gin Met Thr Gly 850 855 860 Leu Cys ser cys Lys Pro Gly val Ala Gly Pro Lys cys Gly Gin cys 865 870 875 880 Pro ASP Gly Arg Ala 885 Leu Gly pro Ala Gly 890 Cys Glu Ala Asp Ala 895 Ser Ala Pro Ala Thr Cys Ala Glu Met Arg cys Glu Phe Gly Ala Arg Cys 900 905 910 vai Glu Glu ser Gly ser Ala HlS Cys val cys Pro Met Leu Thr Cys 915 920 925 pro Glu Ala Asn Ala Thr Lys val Cys Gly Ser Asp Gly val Thr Tyr 930 935 940 Gly Asn Glu Cys Gin Leu Lys Thr Ile Ala cys Arg Gin Gly Leu Gin 945 950 955 960 ile Ser Ile Gin Ser Leu Gly pro cys Gin Glu Ala val Ala Pro Ser 965 970 975 45

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Leu Pro 1280 Ser Ser Ala val Thr 1285 Pro Arg Ala Pro His 1290 Pro Ser His Thr ser 1295 Gin pro val Ala Lys 1300 Thr Thr Ala Ala Pro 1305 Thr Thr Arg Arg Pro 1310 Pro Thr Thr Ala Pro 1315 Ser Arg val Pro Gly 1320 Arg Arg pro pro Ala 1325 Pro Gin Gin Pro Pro 1330 Lys Pro Cys Asp Ser 1335 Gin Pro cys Phe His 1340 Gly Gly Thr cys Gin 1345 ASp Trp Ala Leu Gly 1350 Gly Gly Phe Thr cys 1355 ser cys pro Ala Gly 1360 Arg Gly Gly Ala Val 1365 Cys Glu Lys vai Leu 1370 Gly Ala Pro val Pro 1375 Ala Phe Glu Gly Arg 1380 Ser Phe Leu Ala Phe 1385 pro Thr Leu Arg Ala 1390 Tyr His Thr Leu Arg 1395 Leu Ala Leu Glu Phe 1400 Arg Ala Leu Glu pro 1405 Gin Gly Leu Leu Leu 1410 Tyr Asn Gly Asn Ala 1415 Arg Gly Lys Asp Phe 1420 Leu Ala Leu Ala Leu 1425 Leu ASp Gly Arg vai 1430 Gin Leu Arg Phe Asp 1435 Thr Gly Ser Gly Pro 1440 Ala val Leu Thr Ser 1445 Ala val Pro Val Glu 1450 Pro Gly Gin Trp His 1455 Arg Leu Glu Leu Ser 1460 Arg His Trp Arg Arg 1465 Gly Thr Leu ser val 1470 Asp Gly Glu Thr pro 1475 val Leu Gly Glu ser 1480 Pro Ser Gly Thr ASp 1485 Gly Leu Asn Leu Asp 1490 Thr Asp Leu Phe val 1495 Gly Gly val Pro Glu 1500 Asp Gin Ala Ala Vai 1505 Ala Leu Glu Arg Thr 1510 phe val Gly Ala Gly 1515 Leu Arg Gly cys ile 1520 Arg Leu Leu ASP val 1525 Asn Asn Gin Arg Leu 1530 Glu Leu Gly ile Gly 1535 pro Gly Ala Ala Thr 1540 Arg Gly Ser Gly Val 1545 Gly Glu Cys Gly Asp 1550 His Pro Cys Leu Pro 1555 Asn Pro Cys His Gly 1560 Gly Ala Pro cys Gin 1565 Asn Leu Glu Ala Gly 1570 Arg Phe His Cys Gin 1575 Cys Pro Pro Gly Arg 1580 Val Gly Pro Thr Cys 1585 Ala Asp Glu Lys Ser 1590 Pro Cys Gin Pro Asn 1595 Pro cys His Gly Ala 1600 Ala Pro cys Arg Val 1605 Leu Pro Glu 47

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<210> 2 <211> 191 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

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<210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 ser Ala Gly Asp vai Asp Thr Leu Ala Phe Asp Gly Arg 1 5 10

<210> 4 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

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< 210 > 5 <211> 15 <212> PRT <213> Rattus rattus < 4 Ο Ο > 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 6

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<210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 7

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<211> 8 <212> PRT <213> Rattus rattus < 4 Ο Ο > 8

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<210> 10 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador 52 < 4 Ο Ο > 10 ttacctgcgg ccgctcatgg ggtggggcag ggccgcagct c 41 <210> 11 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Marcador His <400> 11

Ala Arg Vai Asn His hís His His His His His His 1 5 10

<210> 12 <211> 186 <212> PRT <213> Homo sapiens 53 <400> 12

Ser Ala Gly ASp val Asp Thr Leu Ala phe Asp Gly Arg Thr Phe val 1 5 10 15 Glu Tyr Leu Asn Ala val Thr Glu Ser Glu Lys Ala Leu Gin Ser Asn 20 25 30 HlS Phe Glu Leu Ser Leu Arg Thr Glu Ala Thr Gin Gly Leu val Leu 35 40 45 Trp Ser Gly Lys Ala Thr Glu Arg Ala Asp Tyr val Ala Leu Ala Ile 50 55 60 Vai ASp Gly HlS Leu Gin Leu Ser Tyr Asn Leu Gly Ser Gin Pro Val 65 70 75 80 vai Leu Arg ser Thr Val Pro Val Asn Thr Asn Arg Trp Leu Arg Val 85 90 95 vai Ala His Arg Glu Gin Arg Glu Gly Ser Leu Gin Val Gly Asn Glu 100 105 110 Ala pro val Thr Gly Ser Ser Pro Leu Gly Ala Thr Gin Leu Asp Thr 115 120 125 Asp Gly 130 Ala Leu Trp Leu Gly 135 Gly Leu Pro Glu Leu 140 pro val Gly Pro Ala Leu Pro Lys Ala Tyr Gly Thr Gly Phe val Gly cys Leu Arg Asp 145 150 155 160 val val Val Gly Arg His Pro Leu His Leu Leu Glu ASP Ala val Thr 165 170 175 iys ΡΓΟ Glu Leu Arg Pro cys pro Thr Pro 180 185

<210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Inserção de Aminoácido 54 < 4 Ο Ο > 13

Glu Leu Ala Asn Glu ile Pro vai 1 5 < 210 > 14 <211 > 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Inserção de Aminoácido < 4 0 0 > 14 ΡΓΟ Glu Thr Leu Asp ser Gly Ala Leu His ser 1 5 10 <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Inserto de Aminoácido 55 < 4 Ο Ο > 15

Glu Leu Ala Asn Glu lie Pro vai Pro Glu Thr Leu Asp ser Gly Ala 15 10 15

Leu His ser

Lisboa, 27 de Outubro de 2010 56

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a detecção da actividade in vivo de neurotripsina, em que a quantidade do fraqmento de 22 kDa de agrina é medida numa amostra retirada de um doente e a quantidade medida do fragmento de 22 kDa de agrina na amostra é utilizada para calcular a actividade de neurotripsina, com a amostra sendo sangue ou urina.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual um fragmento de 22 kDa de agrina, preparado por técnicas recombinantes, é utilizado como uma referência.
3. 3. Utilização do método de acordo com a reivindicação 1, para diagnóstico e monitorização de distúrbios relacionados com neurotripsina.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, para diagnóstico e monitorização de doenças causadas por desregulação de neurotripsina.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 3 ou 4, para diagnóstico e monitorização de doenças relacionadas com neurotripsina e distúrbios do sistema neural e do sistema neuromuscular.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 3 ou 4, para diagnóstico e monitorização de doenças e distúrbios relacionados com neurotripsina de sistemas não neurais, especialmente do rim e do pulmão. 1
7. 7. Utilização do método de acordo com a reivindicação 1 em estudos clínicos ou pré-clínicos, para estabelecer o efeito de substâncias sobre a actividade de neurotripsina.
8. 8. Utilização do fragmento de 22 kDa de agrina, detectado no sangue ou urina numa amostra retirada de um doente, como biomarcador para distúrbios relacionados com neurotripsina.
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, para diagnóstico e monitorização de doenças causadas por desregulação de neurotripsina.
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 8 ou 9, para diagnóstico e monitorização de doenças e distúrbios relacionados com neurotripsina do sistema neuronal e do sistema neuromuscular.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 8 ou 9, para diagnóstico e monitorização de doenças e distúrbios relacionados com neurotripsina de sistemas não neurais.
12. 12. Utilização do fragmento de 22 kDa de agrina, detectado no sangue ou urina numa amostra retirada de um doente, como biomarcador em estudos clínicos ou pré-clínicos, para estabelecer o efeito de substâncias sobre a actividade de neurotripsina. Lisboa, 27 de Outubro de 2010 2