ES2350254T3 - Procedimiento para la detección de la actividad in vivo de la neurotripsina, uso del procedimiento y uso del fragmento c-terminal de 22kda de la agrina como biomarcador en el diagnóstico y el control de trastornos relacionados con la neurotripsina. - Google Patents
Procedimiento para la detección de la actividad in vivo de la neurotripsina, uso del procedimiento y uso del fragmento c-terminal de 22kda de la agrina como biomarcador en el diagnóstico y el control de trastornos relacionados con la neurotripsina. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento para la detección de la actividad in vivo de la neurotripsina, en el que se mide la cantidad del fragmento de 22 kDa de la agrina en una muestra tomada de un paciente, y se usa la cantidad medida del fragmento de 22 kDa de la agrina en la muestra para calcular la actividad de la neurotripsina, siendo la muestra sangre u orina.
Description
Procedimiento para la detección de la actividad
in vivo de la neurotripsina, uso del procedimiento y uso del
fragmento C-terminal de 22 kDa de la agrina como
biomarcador en el diagnóstico y el control de trastornos
relacionados con la neurotripsina.
La invención se refiere a un procedimiento para
la detección de la actividad in vivo de la neurotripsina, al
uso de dicho procedimiento y al uso del fragmento
C-terminal de 22 kDa de la agrina como biomarcador
en diferentes aplicaciones diagnósticas o clínicas, todas directa o
indirectamente relacionadas con la actividad de la enzima
neurotripsina.
Los biomarcadores informan sobre fenómenos
biológicos en curso durante una enfermedad o tratamiento. Un
biomarcador se define como cualquier característica que puede ser
medida y evaluada objetivamente como indicador de un proceso
biológico normal o patológico o de una respuesta farmacológica a una
intervención terapéutica. Distintos tipos de biomarcadores informan
sobre características moleculares, parámetros fisiológicos (por
ejemplo, presión arterial, frecuencia cardiaca), o proporcionan
información a través de imágenes. Importantemente, proporcionan
información sobre una "consecuencia": por ejemplo, sobre el
resultado de un mecanismo molecular, celular o fisiológico, sobre
un beneficio terapéutico o sobre el riesgo de una intervención
terapéutica. Los biomarcadores útiles deberían satisfacer dos
criterios, deben estar asociados con los mecanismos biológicos en
curso durante una enfermedad o tratamiento, y se deben correlacionar
estadísticamente con las consecuencias clínicas.
La neurotripsina es una serina proteasa de tipo
tripsina. Muestra una composición de dominio única (Proba y col.,
1998). Está formada por un segmento básico rico en prolina, un
dominio kringle, cuatro dominios tipo secuestrante
ricos en cisteína (scavenger receptor
cysteine-rich, SRCR), y un dominio de
proteasa.
La neurotripsina se expresa predominantemente en
las neuronas de la corteza cerebral, el hipocampo y la amígdala
(Gschwend y col., 1997). Mediante inmunoelectromicroscopía se
localizó la neurotripsina en la membrana presináptica y la zona
presináptica activa tanto de las sinapsis asimétricas (excitatorias)
como de las sinapsis simétricas (inhibidoras) (Molinari y col.,
2002).
La neurotripsina juega un importante papel en
los trastornos neuropsiquiátricos, así como en trastornos fuera del
sistema nervioso.
Recientemente se identificó la neurotripsina
como una causa de una forma autosómica recesiva grave de retraso
mental (Molinari y col., 2002). Los individuos que padecen retraso
mental dependiente de neurotripsina muestran una delección de 4 pb
en el 7º exón del gen de la neurotripsina, que da como resultado una
proteína más corta que carece de dominio catalítico. El fenotipo
fisiopatológico y la edad de aparición de la enfermedad en los
individuos afectados caracteriza a la neurotripsina como un
regulador de las funciones sinápticas de adaptación, tal como la
reorganización de las sinapsis durante las etapas tardías del
neurodesarrollo y la plasticidad sináptica del adulto. Tras un
desarrollo psicomotor normal en los primeros 18 meses, los
individuos afectados mostraban los primeros signos de retraso
mental cuando tenían alrededor de 2 años de edad. Esto indica que
la función de la neurotripsina es crucial en las etapas tardías del
desarrollo cerebral, como por ejemplo para las funciones sinápticas
de adaptación requeridas para establecer y/o mantener las funciones
cognitivas superiores.
En el documento WO2006/103261 se muestra que la
sobreexpresión de la neurotripsina en motoneuronas de ratones
transgénicos da como resultado una degeneración de la unión
neuromuscular, que a su vez provoca la muerte de las fibras
musculares desnervadas. La pérdida de fibra muscular es
característica del tipo de atrofia muscular encontrada en los
ancianos humanos, denominada sarcopenia. Por lo tanto, se ha
postulado que la inhibición de la neurotripsina podría tener un
efecto beneficioso sobre la desnervación de la fibra muscular
dependiente de la edad, la pérdida de fibra muscular y la atrofia
musculoesquelética.
Datos adicionales (Aimes y col., 2005) sugieren
un potencial papel de las serina proteasas, como la neurotripsina,
en la función vascular y la angiogénesis.
En vista del papel central de la neurotripsina
en el metabolismo, es deseable determinar y controlar las
alteraciones relacionadas con la neurotripsina en pacientes, o
evaluar el efecto de los medicamentos sobre el estado de la
neurotripsina in vivo, respectivamente.
Los inventores han averiguado que el objeto de
la invención puede realizarse mediante un procedimiento según la
reivindicación 1, en el que se mide el fragmento de 22 kDa de la
agrina en sangre u orina con objeto de determinar la actividad in
vivo de la neurotripsina, y mediante el uso de dicho
procedimiento según la reivindicación 3 para el diagnóstico y el
control de las alteraciones relacionadas con la neurotripsina. La
invención cubre adicionalmente el uso del fragmento de 22 kDa de la
agrina como biomarcador especial según la reivindicación 8.
\newpage
Una reivindicación independiente adicional está
dirigida al uso del fragmento de 22 kDa de la agrina como
biomarcador en estudios clínicos o preclínicos para establecer el
efecto de las sustancias sobre la actividad de la neurotripsina.
Las formas de realización preferidas de la
invención se abordan en las reivindicaciones secundarias.
La Fig. 1 muestra la secuencia proteica de la
agrina humana (ID. SEC. Nº: 1). La longitud completa del precursor
sin procesar es de 2.045 aminoácidos. En la porción de secuencia
mostrada están marcadas las posiciones de los sitios de escisión
\alpha y \beta. Adicionalmente se marcan algunas subsecuencias
mencionadas en los ejemplos. La secuencia del fragmento de 22 kDa de
la agrina se muestra en negrita.
La Fig. 2A es una representación esquemática de
la organización del dominio de la agrina y la localización de sus
sitios de escisión dependientes de neurotripsina. La agrina tiene
una masa proteica nuclear de aproximadamente 220 kDa. Es una
proteína multidominio formada por 9 dominios FS (de tipo
folistatina, follistatin-like), 2 dominios LE
(de tipo laminina-EGF,
laminin-EGF-like), un dominio
SEA (enterocinasa de proteína de esperma y agrina, sperm protein
enterokinase and agrin), 4 dominios EG (de tipo factor de
crecimiento epidérmico, epidermal growth
factor-like) y 3 dominios LG (globulares de
laminina, laminin globular). A ambos lados del dominio SEA se
encuentra una región SIT (rica en serina/treonina,
serine/threonine-rich).
La agrina existe en varias isoformas, por
ejemplo, una isoforma es secretada con un dominio de agrina
N-terminal (NtA) y un tipo de isoforma H
transmembranal con un segmento transmembranal
N-terminal (TM) que asegura su anclaje en la
membrana plasmática. Variantes de corte y empalme de la fracción
C-terminal: un inserto de 4 aminoácidos en el sitio
A/y, y los tres diferentes insertos en el sitio B/z formado por 8,
11 ó 19 (8+11) aminoácidos. La neurotripsina escinde la agrina en
dos sitios. Un sitio (denominado sitio \alpha) está localizado
entre la arginina 1102 (R1102) y la alanina 1103 (A1103). El otro
sitio (denominado sitio \beta) está localizado entre la lisina
1859 (K1859) y la serina 1860 (S1860). Los números de aminoácidos se
refieren a la agrina secretada (variante de corte y empalme A0B0)
del ortólogo humano (UniProtKB/Swiss-Prot O00468).
De nuevo, la escisión por la neurotripsina genera un fragmento
N-terminal en los intervalos de
110-400 kDa (debido a niveles diferenciales de
carbohidratos), un fragmento intermedio de aproximadamente 90 kDa y
un fragmento C-terminal de 22 kDa.
La Fig. 2B muestra cómo la neurotripsina escinde
la agrina in vitro. Análisis por inmunotransferencia Western
de células HeLa transfectadas simultáneamene con combinaciones de
agrina unida membrana (+), neurotripsina natural (wt), neurotripsina
inactiva (S/A), y pcDNA3.1 vacío (-). Se analizaron los
sobrenadantes (S) y los lisados celulares (cell lysates, CL)
con anticuerpos anti-agrina dirigidos contra el
C-terminal de la agrina. Panel superior: la
transfección de la agrina sola dio como resultado una señal por
encima de 250 kDa en el lisado celular. Tras la transfección
simultánea con neurotripsina natural, la agrina completa se
escindió, dando como resultado fragmentos que se desarrollaban a 22,
90 y 110 kDa en el sobrenadante. No se encontró escisión tras la
transfección simultánea con neurotripsina inactiva. Panel inferior:
control de la expresión de la neurotripsina con anticuerpos contra
neurotripsina.
La Fig. 3 muestra la estructura del dominio de
la agrina transmembranal. Se indican las secuencias de los sitios de
escisión \alpha y \beta y los fragmentos
C-terminal resultantes de la escisión por la
neurotripsina. TM, segmento transmembranal; FS, repetición rica en
cisteína similar a la folistatina; LE, dominio de laminina de tipo
EGF; SIT, región rica en serina/treonina; SEA, proteína de esperma,
enterocinasa y dominio de agrina; EG, dominio de tipo del factor de
crecimiento epidérmico (epidermal growth factor, EGF; LG,
dominio globular de laminina; círculos individuales, sitios de
glucosilación unidos por N; círculos múltiples, sitios de fijación
de glucano.
La Fig. 4 muestra que la neurotripsina escinde
la agrina in vivo. Análisis mediante inmunotransferencia
Western de tejido procedente de ratones normales para neurotripsina
(wild-type, wt) y deficientes en
neurotripsina (KO). El producto de escisión de la agrina de 90 kDa
se detectó en cerebro, riñón y pulmón de los ratones normales, pero
estaba ausente en los deficientes en neurotripsina. Se obtuvieron
resultados similares para el fragmento de agrina de 22 kDa excepto
para el pulmón. Se usó \beta-actina como control
de carga.
Las Figs. 5A, B muestran que la estimulación
química de la potenciación a largo plazo induce un aumento en la
actividad proteolítica de la neurotripsina.
La Fig. 5A es una inmunotransferencia Western de
la agrina (panel superior) y de la \beta-actina
(panel inferior) en cortes de hipocampo sin estimulación (No Stim) y
estimulados mediante la combinación de picrotoxina, forskolina y
rolipram (PFR). La intensidad de la señal del fragmento de 90 kDa de
la agrina escindido por la neurotripsina en el hipocampo estimulado
mediante PFR es más intensa que en el control no estimulado.
La Fig. 5B muestra la proporción de la
intensidad de la señal del fragmento de 90 kDa de la agrina
normalizada mediante la intensidad de la señal de la
\beta-actina. La media de las intensidades de
señal en los controles no estimulados se estableció en 1. Tres
experimentos independientes mostraron un significativo incremento
del 30% del fragmento de agrina mediante estimulación con PFR en
comparación con los controles no estimulados (p < 0,05 mediante
la prueba de la t de Student).
\newpage
La Fig. 6 muestra cómo la estimulación química
de la potenciación a largo plazo aumenta el número de filopodios de
una forma dependiente de la neurotripsina.
El histograma muestra el número de filopodios
(Fil) por 1 \mum de dendritas apicales secundarias (Dend) de
neuronas piramidales CA1 del hipocampo en cuatro condiciones
diferentes. En ratones naturales (w.t.), la estimulación mediante
una combinación de picrotoxina, forskolina y rolipram (PFR) indujo
un aumento significativo en el número de filopodios en comparación
con los controles no estimulados (No Stim; p < 0,01 mediante la
prueba de la t de Student). Por el contrario, los ratones
deficientes en neurotripsina (ntd) no mostraron un cambio
significativo en el número de filopodios mediante la estimulación
con PFR.
La Fig. 7 es un histograma que muestra el número
de filopodios (Fil) por 1 \mum de dendritas apicales secundarias
(Dend) de neuronas piramidales CA1 del hipocampo en ratones
deficientes en neurotripsina (ntd). La estimulación sólo con PFR
(PFR) no indujo un aumento significativo en el número de filopodios
en comparación con los controles no estimulados (No Stim). La
administración simultánea de picrotoxina, forskolina y rolipram
(PFR) y el fragmento de 22 kDa (PFR + 22 kDa) rescató el aumento
inducido por la estimulación química en el número de filopodios (p
< 0,001 frente a No Stim y PFR mediante la prueba de la t
de Student). Además, un fragmento de 22 kDa sin estimulación con PFR
(22 kD frag) también indujo un aumento significativo en el número de
filopodios (p < 0,001 frente a No Stim mediante la prueba de la
t de Student). Por lo tanto, el fragmento de 22 kDa de la
agrina induce un aumento en el número de filopodios en ratones
deficientes en neurotripsina.
La Fig. 8A es un análisis mediante
inmunotransferencia Western de un homogeneizado cerebral de un ratón
natural (+/+) y un ratón deficiente en neurotripsina (-/-). Nótese
que el fragmento de 22 kDa de la agrina sólo se detecta en el ratón
natural. Esto indica que el fragmento de 22 Da es, de hecho, el
resultado de la escisión dependiente de neurotripsina de la
agrina.
La Fig. 8B es una inmunotransferencia Western de
suero sanguíneo de un ratón natural (+/+), un ratón homocigótico
deficiente en neurotripsina (-/-) y un ratón heterocigótico
deficiente en neurotripsina (+/-). Se muestra que el fragmento de 22
kDa de la agrina sólo está presente en ratones que expresan una
neurotripsina funcional (+/+ y +/-). Adicionalmente, a partir de
ambas Figs. 8 A, B, es evidente que el fragmento de 22 kDa de la
agrina está presente en el homogeneizado cerebral y en la sangre del
ratón.
La Fig.9A es una inmunotransferencia Western de
muestras de LCR de seres humanos en unos intervalos de edades de
entre 1 mes y 86 años. En cada carril se analizaron 10 \mul de LCR
humano. Se usó un gel de gradiente de SDS-PAGE
(NuPAGE, 4-12%) disponible comercialmente. La
inmunodetección se realizó con el anticuerpo R139 contra el
fragmento de 22 kDa de la agrina. Dado el elevado nivel de expresión
de la neurotoxicidad durante el desarrollo neural, el fragmento de
22 kDa de la agrina dependiente de la neurotripsina es más abundante
a las edades de 2 y 9 meses.
La Fig 9B es un análisis mediante CL/EM del
fragmento de 22 kDa hallado en LCR humano. La secuencia presentada
comprende el fragmento de 22 kDa y los cinco aminoácidos que
preceden al sitio de escisión \beta (ID. SEC. Nº: 2). Las muestras
de LCR de varios individuos se agruparon, y sus proteínas se
separaron cromatográficamente con objeto de enriquecerlas en el
fragmento de 22 kDa identificado mediante inmunotransferencia
Western. La fracción enriquecida en el fragmento de 22 kDa se cortó
a partir de un gel de SDS-PAGE y se sometió a un
análisis mediante CL/ESI/EM/EM. Se identificaron dos péptidos,
péptido #1 (ID. SEC. Nº: 3) y #2 (ID. SEC. Nº: 4). Ambos estaban
localizados en el fragmento de 22 kDa de la agrina.
Ambas Figs. 9A, B muestran que el fragmento de
22 kDa de la agrina puede ser detectado en líquido cefalorraquídeo
(LCR) humano.
La Fig. 10 es una inmunotransferencia Western de
suero sanguíneo humano tratada cromatográficamente que muestra una
fuerte banda inmunorreactiva para el fragmento de 22 kDa de la
agrina. La confirmación final de su identidad requerirá un análisis
mediante EM, no obstante, los actuales resultados son una fuerte
muestra de prueba de que el fragmento de 22 kDa de la agrina puede
ser hallado en suero sanguíneo humano.
El fragmento C-terminal de 22
kDa del proteoglucano agrina usado en el procedimiento de la
invención y como biomarcador, es un producto generado de forma
natural por la escisión proteolítica de la agrina por su única
enzima de tratamiento, la neurotripsina.
La agrina es una molécula bien caracterizada
(Bezakova y col., 2003; Sanes y Lichtman, 2001). Tiene una masa
proteica nuclear de aproximadamente 220 kDa. La agrina existe en
diversas isoformas y variantes de empalme.
Según se ilustra en la Fig. 2A, la agrina es
escindida por la serín-proteasa neurotripsina en dos
sitios homólogos, denominados sitios de escisión \alpha y
\beta. La escisión de la agrina por la neurotripsina resultante
de la expresión simultánea de las dos proteínas en células HeLa
libera tres fragmentos de agrina en el sobrenadante del cultivo
(Ejemplo 1 y Fig. 1B). El fragmento de 22 kDa se extiende desde el
sitio de escisión \beta hasta el C-terminal de la
agrina. El fragmento de 90 kDa abarca desde el sitio de escisión
\alpha al \beta, mientras que el fragmento de 110 kDa se
extiende desde el sitio de escisión \alpha hasta el
C-terminal, y por lo tanto, es el resultado de la
escisión incompleta en el sitio \beta. El fragmento
N-terminal permanece en las células y es
probablemente degradado rápidamente mediante endocitosis.
Ambos sitios de escisión fueron identificados
inequívocamente y se encontró que eran homólogos y estaban
conservados en la evolución (Ejemplo 2).
El término fragmento de 22 kDa de la agrina, si
se usa en esta solicitud, abarca desde el sitio de escisión \beta
hasta el C-terminal de la agrina, y debe englobar
todas las diferentes isoformas y variantes de empalme del fragmento
que aparece in vivo. En algunas publicaciones, el dominio
C-terminal de laminina G (LG3) de la agrina se
denomina fragmento de 20 kDa. La proteína denotada mediante este
término es estructuralmente equivalente al fragmento usado según la
invención, pero ha sido generada artificialmente como una proteína
recombinante correspondiente al dominio LG del
C-terminal de la agrina para el propósito de ensayar
su función. Por el contrario, es un aspecto esencial que el dominio
LG del C-terminal de la agrina esté separado de
forma natural del resto de la molécula de agrina mediante una
escisión proteolítica dependiente de neurotripsina. Sólo después de
la escisión proteolítica en el denominado sitio de escisión \beta,
el fragmento de 22 kDa de la agrina se hace móvil y se transloca
desde el sitio de su generación hacia el líquido cefalorraquídeo o
la sangre, donde puede ser detectado según unos procedimientos de
detección establecidos, y sirve por lo tanto como biomarcador.
A partir del documento WO2006/103261 mencionado
anteriormente se conoce un procedimiento de ensayo para determinar
el efecto de sustancias inhibidoras sobre la actividad de la
neurotripsina. Un protocolo típico del procedimiento conocido
estipula que la sustancia inhibidora es incubada junto con la
neurotripsina y la agrina, y la cantidad de escisión de la agrina
se determina en base a la medida de los fragmentos generados por la
actividad proteolítica de la neurotripsina.
El procedimiento conocido se refiere a un ensayo
enzimático in vitro con un número limitado de compañeros de
reacción. Dado que la situación in vivo es bastante más
compleja, no podría esperarse que un fragmento especial de la
agrina también pudiera encontrarse en el LCR o la sangre y usarse
como un biomarcador in vivo, con objeto de informar sobre la
actividad in vivo de la neurotripsina en el cerebro y en
tejidos extraneurales, respectivamente. En primer lugar, a partir
de la escisión in vitro de una proteína o un péptido, no
puede concluirse que la escisión también se produce in vivo.
La escisión in vitro es una reacción experimental
artificial. Se consigue juntando la enzima proteolítica y una
proteína en un tubo de ensayo e incubándolos para permitir que se
produzca la reacción de escisión. La escisión in vivo de una
proteína o péptido requiere, por el contrario, que esté localizado
simutáneamente con una enzima proteolítica dada en el espacio y del
tiempo, con objeto de que la reacción tenga lugar. Por ejemplo,
puede demostrarse in vitro que la agrina puede ser escindida
por la serín-proteasa pancreática tripsina. Sin
embargo, la tripsina no puede escindir la agrina in vivo,
porque la agrina no está localizada simultáneamente in vivo
con la tripsina. Los inventores hallaron que la inactivación
selectiva de la neurotripsina mediante reconocimiento génico abole
completamente la escisión de la agrina (Ejemplo 3). Esto indica que
sólo la neurotripsina puede escindir a la agrina in vivo,
mientras que otras serín-proteasas de tipo tripsina,
tales como la tripsina, que pueden escindir la agrina in
vitro, no escinden la agrina in vivo. En segundo lugar,
incluso a partir del hecho de que se encuentra una escisión in
vivo de la agrina por la neurotripsina en tejido homogeneizado,
no puede predecirse si se encontrará un fragmento dependiente de
neurotripsina de la agrina en el LCR o la sangre. En el LCR y en
sangre, la agrina completa y el fragmento de 90 kDa sólo se
encuentran en cantidades despreciables. La neurotripsina no es
detectable en el LCR ni en la sangre. Por lo tanto, la escisión de
la agrina por la neurotripsina no se produce ni en el LCR ni en la
sangre, sino en el interior de los tejidos neurales y no neurales
en los que la agrina y la neurotripsina se encuentran sobre las
superficies celulares o en la matriz extracelular. Por lo tanto, la
presencia del fragmento de 22 kDa en LCR y en sangre es
definitivamente una observación sin precedentes y no trivial. Como
apoyo de esta conclusión, puede mencionarse que ni el fragmento
N-terminal ni el fragmento intermedio de 90 kDa de
la agrina aparecieron en el LCR ni en la sangre tras su generación
por la neurotripsina. Por lo tanto, de los tres fragmentos de
agrina que son generados por la actividad proteolítica de la
neurotripsina, sólo el fragmento de 22 kDa es translocado
eficientemente al LCR y la sangre, mientras que los otros dos
fragmentos no lo son.
La presencia del fragmento de 22 kDa de la
agrina en el LCR y en la sangre refleja el nivel de actividad de la
neurotripsina en el cerebro y en tejidos no neurales,
respectivamente.
Con respecto a la actividad de la neurotripsina
en el cerebro, los inventores fueron los primeros en demostrar que
los homogeneizados cerebrales de ratones naturales contienen el
fragmento de 22 kDa de la agrina, que por el contrario no se
encuentra en homogeneizados cerebrales de ratones deficientes en
neurotripsina (Ejemplo 3). Adicionalmente, los inventores fueron
capaces de demostrar la presencia del fragmento de 22 kDa de la
agrina en preparaciones de sinapsis aisladas, denominadas
sinaptosomas. Esta observación indica que el fragmento cerebral de
22 kDa de la agrina se origina en la sinapsis, donde la
neurotripsina es secretada y se encuentra con la agrina en el
espacio extracelular. Tras la escisión local de la agrina en la
sinapsis o en las proximidades de la sinapsis, el fragmento de 22
kDa se transloca selectivamente al LCR. Por lo tanto, el nivel del
fragmento de 22 kDa de la agrina en el LCR informa sobre la
actividad de la neurotripsina en las sinapsis del SNC.
Con respecto a la actividad de la neurotripsina
en tejidos no neurales, los inventores mostraron que la
neurotripsina es expresada en el riñón y el pulmón, y que la
escisión de la agrina dependiente de la neurotripsina en el riñón y
el pulmón genera fragmentos de agrina de 90 kDa y 22 kDa. Dado que
tanto el riñón como el pulmón son tejidos altamente vascularizados,
es muy probable que al menos el fragmento de 22 kDa de la agrina que
se encuentra en la sangre proceda del riñón y/o el pulmón. Por lo
tanto, el nivel del fragmento de 22 kDa hallado en la sangre informa
sobre la actividad de la neurotripsina en el riñón y/o el
pulmón.
Una fracción del fragmento de 22 kDa de la
agrina encontrada en la sangre se origina muy probablemente en la
unión neuromuscular. Los inventores encontraron que la neurotripsina
derivada de motoneuronas que es transportada a lo largo de los
nervios motores hacia los músculos esqueléticos escinde la agrina en
la unión neuromuscular. El fragmento de 22 kDa de la agrina que es
liberado en la unión neuromuscular se transloca muy probablemente a
la sangre. Por lo tanto, el nivel del fragmento de 22 kDa de la
agrina hallado en la sangre también informa sobre la actividad de la
neurotripsina en la unión neuromuscular.
La evaluación de la actividad de la
neurotripsina en el cerebro o en tejidos extraneurales mediante la
medición de los niveles del fragmento de 22 kDa de la agrina en el
LCR y en la sangre, respectivamente, permite extraer conclusiones
sobre los estados fisiológicos o patológicos dependientes de la
neurotripsina.
Los inventores reconocieron la neurotripsina
como un promotor de la plasticidad sináptica en el SNC. Demostraron
que la promoción de la plasticidad sináptica por la neurotripsina
depende de la escisión de la agrina, dando como resultado la
generación y liberación del fragmento C-terminal de
22 kDa (Ejemplo 4). A su vez, el fragmento de 22 kDa tiene una
actividad estimulante de las sinapsis y, por tanto, promotora de la
plasticidad. Usando un sistema modelo experimental basado en cortes
de tejido de hipocampo, los inventores averiguaron que la promoción
de los filopodios tras la inducción de una potenciación a largo
plazo era abolida en los ratones deficientes en neurotripsina
(Ejemplo 5). También averiguaron que el fragmento de 22 kDa generado
por la neurotripsina mediante la escisión de la agrina es decisivo
en la promoción dependiente de neurotripsina de la plasticidad
sináptica mediante el aumento en el número de filopodios dendríticos
(Ejemplo 6). Los filopodios dendríticos son precursores de las
sinapsis. El aumento en los filopodios dendríticos promueve la
reorganización de los circuitos sinápticos en el SNC. Experimentos
con hipocampos de ratones deficientes en neurotripsina mostraron
que sin la generación dependiente de neurotripsina del fragmento de
22 kDa de la agrina, la promoción dependiente de la actividad de
los filopodios dendríticos no es funcional. Por lo tanto, en un
modelo animal podría establecerse una conexión directa entre el
estado patológico dependiente de la neurotripsina y el fragmento de
22 kDa de la agrina. Esta observación se corresponde en ratones con
la observación hecha en individuos humanos deficientes en
neurotripsina, lo que indica que la plasticidad sináptica adaptable
no es funcional sin la neurotripsina, y que da como resultado una
importante deficiencia en las funciones cerebrales superiores
(cognitivas), denominado también retraso mental (Molinari y col.,
2002). Por lo tanto, el control de la actividad de la neurotripsina
en las sinapsis mediante la medición del fragmento de 22 kDa de la
agrina en el LCR permite el diagnóstico de desregulaciones de
funciones sinápticas dependientes de la neurotripsina, tales como la
plasticidad sináptica dependiente de la neurotripsina.
En experimentos adicionales se demostró que el
fragmento de 22 kDa de la agrina puede detectarse en la sangre o en
el LCR de ratones, así como de pacientes humanos. Los anticuerpos
para la detección del fragmento de 22 kDa de la agrina se generan
produciendo en primer lugar el fragmento recombinante de 22 kDa de
la agrina (Ejemplo 7) y usándolo después en uno cualquiera de los
procedimientos usados habitualmente para la producción de
anticuerpos (Ejemplo 8).
Usando los anticuerpos contra el fragmento de 22
kDa de la agrina, se demostró su presencia en homogeneizado cerebral
y sanguíneo del ratón (Ejemplo 9), así como en LCR (Ejemplo 10) y en
sangre (Ejemplo 11) humanos. Esto hace que el fragmento sea un
biomarcador adecuado para aplicaciones rutinarias.
Consecuentemente, la invención engloba un
procedimiento para determinar la actividad in vivo de la
neurotripsina midiendo la cantidad del fragmento de 22 kDa de la
agrina en la muestra de un paciente. Mediante el uso de este
procedimiento pueden diagnosticarse o controlarse trastornos
relacionados con la neurotripsina, y en general el fragmento puede
usarse como biomarcador para todos los trastornos relacionados con
la neurotripsina.
Algunos trastornos pueden ser especialmente
enfermedades causadas por la desregulación de la neurotripsina,
donde el término "desregulación" no sólo engloba a procesos
reguladores a nivel genético, sino que también puede reflejar
procesos metabólicos que influyen en la actividad de la
neurotripsina.
En un Ejemplo preferido, se usa el fragmento de
agrina como biomarcador de enfermedades o alteraciones del sistema
neural o neuromuscular relacionadas con la neurotripsina, tales como
el retraso mental dependiente de neurotripsina y la sarcopenia, la
atrofia musculoesquelética de ancianos, respectivamente.
El fragmento de 22 kDa de la agrina puede usarse
para diagnosticar los trastornos o las enfermedades mencionadas.
Aparte del diagnóstico, también es posible usar el biomarcador en
cuestión para controlar la tendencia o el proceso de una enfermedad
relacionada con la neurotripsina.
Según se mencionó anteriormente, parece que
puede relacionarse una amplia variedad de enfermedades o trastornos
con la enzima neurotripsina o su actividad. Una metodología
terapéutica importante es, por lo tanto, encontrar sustancias que
influyan, especialmente que inhiban, la actividad de la
neurotripsina in vivo. También en este contexto, es decir,
en estudios clínicos o preclínicos realizados para determinar la
posible aplicabilidad de sustancias, como por ejemplo, un inhibidor
de la neurotripsina, puede usarse el fragmento de 22 kDa de la
agrina como biomarcador. El diseño de dichos estudios no representa
un problema para una persona experta en la materia. Es adecuado
cualquier diseño que permita la medición in vivo del
fragmento de 22 kDa de la agrina en pacientes que son tratados con
diferentes sustancias elegidas por su posible acción sobre la
neurotripsina.
Una ventaja importante al usar el fragmento de
22 kDa de la agrina como biomarcador es que este fragmento puede
ser detectado en sangre o en LCR, siendo ambos fluidos corporales
que pueden analizarse de forma rutinarias. La detección del
fragmento puede realizarse mediante procedimientos habituales
conocidos en la materia, tales como ELISA, técnicas de
inmunotransferencia (inmunotransferencia Western), RIA, citometría
de flujo, polarización de fluorescencia, aglutinación en látex,
ensayo de flujo lateral, ensayo inmunocromatográfico, inmunochips,
inmunoensayos de tiras reactivas o tecnología basada en perlas, en
combinación con cualquier otro procedimiento (por ejemplo,
quimioluminiscencia, Luminex), por citar sólo algunos ejemplos.
Una ventaja importante de trabajar con sangre o
con LCR es que el fragmento de 22 kDa de la agrina sólo se libera
tras la escisión proteolítica por la neurotripsina en los tejidos
mencionados. La molécula de agrina completa no está, o sólo está
presente en una cantidad despreciable, en sangre o en LCR, por lo
que la detección del fragmento en sangre puede realizarse con
anticuerpos que no deben diferenciar necesariamente entre la agrina
completa y su fragmento de 22 kDa.
Los anticuerpos u otros tipos de proteínas de
unión específicas que se unen selectivamente al fragmento de 22 kDa
de la agrina, pueden generarse mediante cualquiera de las técnicas
conocidas en la materia (Roque y col., 2004; Gill y Damle, 2006).
Preferiblemente se generan anticuerpos naturales o recombinantes u
otras proteínas de unión específicas mediante el uso del fragmento
de 22 kDa de la agrina o una porción del mismo, preparados mediante
técnicas recombinantes o mediante síntesis química como un
objetivo.
El fragmento de 22 kDa de la agrina, según se
define en la presente invención, es el fragmento de 22 kDa de la
agrina humana de la ID. SEC. Nº: 12, que adicionalmente puede
contener los insertos de aminoácidos 8, 11 ó 19 (8 + 11) de las
isoformas de la agrina en el sitio B/z. En la agrina humana, el
sitio B/z está localizado en el dominio LG3, entre los aminoácidos
Ser1884 y G1u1885 (Fig. 1 y UniProtKB/Swiss-Prot
O00468). Las secuencias insertadas pueden ser ELANEIPV (B/z 8; ID.
SEC. Nº: 13), PETLDSGALHS (B/z 11; ID. SEC. Nº: 14) o
ELANEIPVPETLDSGALHS (B/z 19; ID. SEC. Nº: 15). En la presente
revelación, el término fragmento de 22 kDa de la agrina también
incluye variantes de la proteína definidas por la ID. SEC. Nº: 12 o
las correspondientes isoformas con 8, 11 ó 19 aminoácidos
adicionales, en el que uno o más, en particular uno, dos, tres o
cuatro aminoácidos, son sustituidos por otros aminoácidos, y/o en
la que hasta dos aminoácidos son eliminados, bien en el
C-terminal o bien en el N-terminal,
o en el que se añaden hasta 30 aminoácidos en el
N-terminal. Dichos aminoácidos adicionales en el
N-terminal están presentes, por ejemplo, debido al
procedimiento de preparación mediante síntesis recombinante y
expresión en células adecuadas. Un ejemplo de dicha proteína bajo la
definición de fragmento de 22 kDa de la agrina es la proteína
preparada según el Ejemplo 7 de la ID. SEC. Nº: 12, que
adicionalmente contiene una etiqueta 8 x His con un conector de
glicina-serina (GS) para simplificar la
purificación, y cuatro aminoácidos adicionales en el extremo
N-terminal. Las proteínas que son glucosiladas o
modificadas de otro modo durante su expresión en células eucariotas
u otras también están incluidas en la presente definición de
fragmento de 22 kDa de la agrina.
Los anticuerpos u otras proteínas de unión
dirigidos contra el fragmento de 22 kDa de la agrina también pueden
generarse usando únicamente una porción del fragmento de 22 kDa de
la agrina, por ejemplo, un péptido de 18 aminoácidos con una
secuencia tomada a partir de la secuencia del fragmento de 22 kDa de
la agrina.
Adicionalmente, está cubierto por la invención
que un fragmento de 22 kDa de la agrina preparado mediante técnicas
recombinantes se use como referencia en el procedimiento según la
reivindicación 1 como referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Para ensayar la agrina como sustrato de la
neurotripsina se transfectaron células HeLa con la isoforma
transmembranal de agrina de rata (x4y8) sola o junto con la
neurotripsina natural (wt) o una forma inactiva de neurotripsina
(S/A), en la que el sitio activo Ser estaba mutado a Ala.
Para la expresión de la neurotripsina se insertó
la región codificante de la neurotripsina humana completa
(CAA04816) en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Se generó una neurotripsina catalíticamente inactiva (S/A) mutando la Ser_{825} a Ala mediante una PCR de extensión por solapamiento. Para la expresión de la agrina completa unida a membrana se insertó la secuencia codificante que varía desde la Met_{1} hasta la Pro_{1948} de agrina de rata (P25304, isoforma 4, variante de corte y empalme y4z8) en el pcDNA3.1. Las células HeLa se cultivaron hasta una confluencia del 60-80% en placas de cultivo de 12 pocillos (Corning) con DMEM complementado con FCS al 10% (Biochrom). Se usó polietilenimina (PEI) como reactivo de transfección según se describe en Baldi y col., 2005. La mezcla de transfección se retiró 4-6 h después de la transfección lavándola una vez con disolución salina tamponada con fosfato (phosphate-buffered saline, PBS). Después de 48 h en DMEM sin FCS, el medio se recogió y las células se lisaron en NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, glicerol al 10%, Triton-X-100 al 1% en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4. Para el análisis de los productos de escisión, se separaron los sobrenadantes y los lisados celulares en un gel NuPAGE al 4-12% (Invitrogen) y se analizaron mediante inmunodetección.
(CAA04816) en el vector pcDNA3.1 (Invitrogen). Se generó una neurotripsina catalíticamente inactiva (S/A) mutando la Ser_{825} a Ala mediante una PCR de extensión por solapamiento. Para la expresión de la agrina completa unida a membrana se insertó la secuencia codificante que varía desde la Met_{1} hasta la Pro_{1948} de agrina de rata (P25304, isoforma 4, variante de corte y empalme y4z8) en el pcDNA3.1. Las células HeLa se cultivaron hasta una confluencia del 60-80% en placas de cultivo de 12 pocillos (Corning) con DMEM complementado con FCS al 10% (Biochrom). Se usó polietilenimina (PEI) como reactivo de transfección según se describe en Baldi y col., 2005. La mezcla de transfección se retiró 4-6 h después de la transfección lavándola una vez con disolución salina tamponada con fosfato (phosphate-buffered saline, PBS). Después de 48 h en DMEM sin FCS, el medio se recogió y las células se lisaron en NaCl 150 mM, EDTA 0,5 mM, glicerol al 10%, Triton-X-100 al 1% en Tris-HCl 20 mM, pH 7,4. Para el análisis de los productos de escisión, se separaron los sobrenadantes y los lisados celulares en un gel NuPAGE al 4-12% (Invitrogen) y se analizaron mediante inmunodetección.
En los lisados de las células transfectadas con
agrina sola se detectó una mancha por encima de 250 kDa,
característica de la agrina completa, en las inmunotransferencias
Western con anticuerpos dirigidos contra su fracción
C-terminal (Fig. 2A). También se encontró la misma
señal en los lisados de células transfectadas simultáneamene con
neurotripsina inactiva. Cuando se transfectó simultáneamente
neurotripsina natural con agrina, no se encontró señal de la agrina
en el lisado celular. Sin embargo se encontraron nuevas bandas de
110, 90 y 22 kDa en el sobrenadante del cultivo. Ninguno de estos
fragmentos de agrina se encontró en los sobrenadantes de las
transfecciones simultáneas con la forma inactiva de la
neurotripsina. En su conjunto, estos resultados demuestran que la
neurotripsina proteolíticamente activa escindió la agrina, dando
como resultado la liberación de tres fragmentos
C-terminales al sobrenadante del cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar los sitios de escisión de la
agrina dependientes de neurotripsina, se expresó simultáneamente la
neurotripsina en células HEK293T bien con una forma transmembranal
completa de agrina de rata (variante de corte y empalme y4z8) o
bien con el fragmento C-terminal de la agrina que
comprende los dominios LG2, EG4 y LG3, usando una transfección PEI
(Baldi y col., 2005). Después de 3 días se recogieron los
sobrenadantes. Para la purificación del fragmento de 90 kDa, se
cargó 1 l de sobrenadante de células transfectadas con la agrina
completa en una columna de heparina sefarosa CL-6B
(GE Healthcare) equilibrada con NaCl 150 mM en
Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. Las proteínas se eluyeron
en un gradiente desde 150 mM hasta 1 M de NaCl en
Tris-HCl 20 mM, pH 7,5. El fragmento de 22 kDa se
purificó a través de su StrepTag C-terminal a partir
de 24 ml de medio de células transfectadas con el fragmento
C-terminal de la agrina con una columna StrepTactin
(IBA), según las recomendaciones del fabricante. Para la
secuenciación N-terminal mediante degradación de
Edman, las muestras de péptidos se separaron en geles NuPAGE al
4-12%, se electrotransfirieron sobre una membrana
PVDF y se analizaron con un secuenciador Procise 492 cLC (Applied
Biosystems) en el Functional Genomics Center Zurich.
De este modo, se encontraron las secuencias
N-terminales ASCYN SPLGCCSDGK (ID. SEC. Nº: 5) para
el fragmento de 90 kDa y SVGDLETLAF (ID. SEC. Nº: 6) para el
fragmento de 22 kDa. Por lo tanto, un sitio de escisión está
localizado entre el primer segmento SIT y el dominio SEA,
C-terminalmente de la Arg_{995} en la secuencia
PIER-ASCY (ID. SEC. Nº: 7; Fig. 3); el segundo sitio
de escisión estaba localizado entre los dominios cuarto de tipo
EGF-like y LG3, C-terminalmente de
la Lys_{1754} en la secuencia LVEK-SVGD (ID. SEC.
Nº: 8, Fig. 3). Los números de aminoácidos se refieren a la agrina
de rata anclada a membrana (P25304; variante de corte y empalme
x4y0). Los inventores denominaron el enlace escísil entre R_{995}
y A_{996} como sitio de escisión \alpha, y el enlace escísil
entre K_{1754} y S_{1755} como sitio de escisión \beta.
Una alineación (Tabla 1) de las dos secuencias
de escisión de la agrina de rata con los correspondientes segmentos
de varias especies de vertebrados mostró una estricta conservación
de los aminoácidos flanqueantes de los sitios de escisión.
Alineación de las secuencias de agrina de
diferentes especies. Para comparar los residuos de aminoácidos que
rodean el desenlace escísil de los sitios de escisión \alpha y
\beta, los inventores usaron la terminología de Schechter y
Berger (1967). P1 denota el residuo N-terminal y P1'
el C-terminal implicados en el enlace escísil. Los
residuos flanqueantes en la dirección N-terminal se
denotan como P2, P3, ... Pn, los residuos flanqueantes en la
dirección C-terminal se denotan como P2', P3', ...
Pn'.
Como se desprende de la Tabla 1, el sitio
\alpha tenía una Arg estrictamente conservada en P1 y una Glu en
P2. El sitio \beta tenía una Lys estrictamente conservada en P1 y
una Glu en P2. Los residuos en la posición P3 eran más variables,
mientras que los residuos predominantemente apolares se encontraron
en P4 de ambos sitios. En el lado C-terminal del
enlace escísil, los residuos P1' y P2' están bien conservados en
cada sitio, predominantemente con una secuencia
Ala-Ser en el sitio \alpha y una secuencia
Ser-Ala en el sitio \beta. Se encontraron
residuos bien conservados pero distintos en P3' y P4' de los dos
sitios.
En resumen, las secuencias consenso de los
sitios \alpha y \beta muestran un perfil idéntico, con una
estricta conservación del residuo P1 y P2, una ocupación variable de
la posición P3 y un alto grado de conservación en P4, P1', P2' y
P3'. El perfil general de las secuencias consenso individuales de
los sitios \alpha y \beta se mantiene cuando se genera una
secuencia consenso combinada de los dos sitios de escisión (Tabla
2), confirmando la homología entre las secuencias de escisión
individuales en los sitios \alpha y \beta.
Secuencia consenso que combina los sitios de
escisión \alpha y \beta.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores investigaron diferentes tejidos
procedentes de ratones naturales y deficientes en neurotripsina
para buscar la presencia de fragmentos de agrina. Se aislaron
cerebro, pulmón y riñón a partir de ratones naturales y deficientes
en tripsina de 10 días de edad. Se homogeneizó aproximadamente 1 g
de cada tejido con un homogeneizador Potter en 1 ml de tampón de
lisis (sacarosa 320 mM, HEPES 5 mM, pH 7,4) que contenía una mezcla
de inhibidores de proteasa (Sigma). Se analizaron los lisados
celulares (40 \mug de riñón, 80 \mug de cerebro/pulmón) para
buscar la expresión de la neurotripsina y la escisión de la agrina
usando inmunotransferencia. Se sondeó la
\beta-actina en la membrana desnuda del
inmunotransferido de agrina. Como se muestra en la Fig. 4, se
detectó una fuerte inmunorreactividad para la agrina completa en
cerebro, riñón y pulmón de los ratones naturales. En estos tejidos
también encontraron los inventores el producto de escisión de 90 kDa
de la agrina. El producto de escisión de 22 kDa era fácilmente
detectable en cerebro y riñón, pero estaba ausente en el pulmón. En
ratones deficientes en neurotripsina no había inmunorreactividad
para la agrina detectable a 22 kDa o a 90 kDa. Estos resultados
demuestran que la escisión de la agrina por la neurotripsina se
produce in vivo, y, adicionalmente, la ausencia de productos
de escisión en ratones deficientes en neurotripsina indica que la
escisión de la agrina depende estrictamente de la neurotripsina.
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El efecto de una actividad neural de tipo
aprendizaje sobre la actividad proteolítica de la neurotripsina es
demostrado mediante la inducción de la potenciación a largo plazo
(LTP) en cortes tisulares de la región CA1 del hipocampo.
Actualmente, la LTP es la correlación más ampliamente aceptada entre
aprendizaje y memoria a nivel celular, molecular y
electrofisiológico (Martin y col., 2000). Para maximizar el número
de sinapsis que participan en la LTP se usó un protocolo químico
para la inducción de la LTP (Otmakhov y col., 2004) con una
combinación de picrotoxina (50 \muM), forskolina (50 \muM), y
rolipram (0,1 \muM). La combinación de estos compuestos induce una
fuerte LTP que dura varias horas sin requerir ninguna estimulación
eléctrica.
Para preparar los cortes de hipocampo, el
hipocampo, junto con la corteza cerebral adyacente, se diseccionan
rápidamente a partir de ratones C57BL/6 de 4-5
semanas de edad, y después se cortan verticalmente en el eje largo
del hipocampo en cortes de 400 \mum de espesor usando un cortador
tisular mecánico Mcllwain (The Micide Laboratory Engineering Co.
Ltd.). Los cortes se transfieren a líquido cefalorraquídeo
artificial (LCRA) sin calcio (NaCl 120 mM, KCl 3 mM,
NaH_{2}PO_{4} 1,2 mM, NaHCO_{3} 23 mM, glucosa 11 mM,
MgCl_{2} 2,4 mM) oxigenado mediante 95% de O_{2}/5% de
CO_{2}, y se incuban durante una hora a temperatura ambiente, con
objeto de proporcionar el tiempo suficiente para que el tejido
cerebral se recupere de las lesiones de la disección. Después de
una preincubación, los cortes se incuban en LCRA con calcio durante
20 minutos (NaCl 120 mM, KCl 3 mM, NaH_{2}PO_{4} 1,2 mM,
NaHCO_{3} 23 mM, glucosa 11 mM, CaCl_{2} 4 mM). Entonces se
induce una LTP química en el corte mediante incubación con una
combinación de picrotoxina 50 \muM, forskolina 50 \muM y
rolipram 0,1 \muM (estimulación PFR) durante 16 minutos.
Para examinar la actividad proteolítica de la
neurotripsina en los cortes, se evalúa el tratamiento proteolítico
de su sustrato, la agrina, mediante inmunotransferencia Western.
Inmediatamente después de la estimulación con PFR, los cortes se
homogeneizaron en Triton X-100 al 1%, sacarosa 0,32
M, EDTA 0,5 mM, HEPES 5 mM, pH 7,4. Los desechos se eliminan
mediante centrifugación (16.000 x g durante 30 minutos a 4ºC). Las
proteínas del sobrenadante (75 \mug de proteína) se separan
electroforéticamente en gel de SDS-poliacrilamida al
10%, y después se electrotransfieren a una membrana de PVDF.
Subsiguientemente, la membrana se sumerge en metanol durante 10
segundos y se seca para bloquear. Después del bloqueo, la membrana
se incuba con un anticuerpo policlonal anti-agrina
de conejo purificado por afinidad (R132; 1 \mug/ml) diluido en
disolución salina tamponada con Tris
(Tris-buffered saline, TBS; NaCl 0,15 M,
Tris-HCl 10 mM, pH 8,0,) que contiene un 0,1% de
Tween-20 (TTBS). El R132 reconoce el fragmento
intermedio de 90 kDa de la agrina que es generado mediante la
escisión de la agrina en los sitios \alpha y \beta por la
neurotripsina. Después de lavar 3 veces durante 10 minutos con
TTBS, la membrana se incuba hasta el día siguiente a 4ºC en TTBS que
contiene un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado
con peroxidasa (Sigma; diluido 1:10.000), después se lava 3 veces
con TTBS y una vez con TBS. Subsiguientemente, la membrana se
sumerge en sustrato quimioluminiscente (CHEMIGLOW; Alpha Innotech
Corporation) durante 5 minutos para visualizar el fragmento de
agrina. La señal quimioluminiscente se detectó con un Chemilmager
(Alpha Biotech).
Según se muestra en la Figura 5A, la cantidad
del fragmento de 90 kDa de la agrina dependiente de neurotripsina
aumenta mediante la estimulación con PFR (PFR) en comparación con el
control no estimulado (No Stim). Este aumento es estadísticamente
significativo, según se determina mediante la prueba de la t
de Student (3 experimentos de inmunotransferencia independientes
usando muestras diferentes; p < 0,05; Figura 5B). Este resultado
indica que la estimulación mediante PFR induce un aumento en la
actividad proteolítica dependiente de la neurotripsina. El aumento
en la cantidad del fragmento de 90 kDa de la agrina también indica
un aumento del fragmento de 22 kDa, el fragmento
C-terminal de la agrina, porque el fragmento de 90
kDa de la agrina no puede generarse sin la generación del fragmento
de 22 kDa.
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Para permitir la investigación de los filopodios
dendríticos se cruzó una línea de ratones transgénicos que expresan
la proteína fluorescente verde (GFP) o la proteína fluorescente
verde dirigida a membrana (mGFP) en neuronas individuales bajo el
control del promotor Thy-1, con una línea de ratones
deficientes en neurotripsina. Los ratones transgénicos que
expresaban la GFP o la mGFP se generan según se describió
previamente (Feng y col., 2000; De Paola y col., 2003). Los ratones
deficientes en neurotripsina que expresan la GFP o la mGFP se
generan cruzando ratones deficientes en neurotripsina con ratones
transgénicos que expresan la GFP o la mGFP en neuronas
individuales. Los ratones homocigóticos deficientes en neurotripsina
que sobreexpresan la mGFP y los correspondientes ratones naturales
que sobreexpresan la mGFP se usan en el análisis siguiente a la edad
de 5-6 semanas.
Se prepararon cortes agudos de hipocampo y se
estimularon mediante PFR según se describe en el Ejemplo 4.
Inmediatamente después del periodo de estimulación, los cortes se
fijan mediante incubación en paraformaldehído al 4%, sacarosa al
4%, disolución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M, pH 7,4,
hasta el día siguiente a 4ºC. Después de lavar con PBS, los cortes
se montan en el portaobjetos y se cubren con el cubreobjetos con
medio de montaje Vectashield (Vector Laboratory Inc.). Las señales
fluorescentes de las dendritas apicales secundarias de las neuronas
piramidales CA1 del hipocampo que expresan la mGFP se observan
usando un microscopio confocal (Leica), y se recogen series de
imágenes a unos intervalos de 0,1221 \mum. A partir de éstas se
reconstruyen imágenes tridimensionales usando el modo Surpass Volume
del programa informático de tratamiento de imágenes Imaris
(Bitplane AG). El número de filopodios dendríticos se cuenta
manualmente para una longitud de 30-40 \mum a lo
largo de 12-20 dendritas independientes,
inspeccionando las imágenes tridimensionales en todas direcciones.
Los filopodios dendríticos son identificados según los siguientes
criterios morfológicos: 1) una protrusión en la membrana dendrítica
se categoriza como filopodio si su longitud es de al menos dos
veces la longitud media de las crestas en la misma dendrita; 2) la
proporción entre el diámetro de la cabeza y el diámetro del cuello
es menor de 1,2:1, y 3) la proporción entre la longitud del
filopodio y el diámetro del cuello es mayor de 3:1 (Grutzendler y
col., 2002).
\newpage
Los resultados indican que, bajo una
estimulación con PFR, el número de filopodios dendríticos en el
hipocampo de ratones naturales (WT) aumenta en comparación con los
controles no estimulados. El análisis estadístico usando datos de
12-20 dendritas independientes muestra un aumento
significativo en el número de filopodios mediante la estimulación
PFR (p < 0,01 mediante la prueba de la t de Student;
Figura 6). Por el contrario, la estimulación química con PFR no
altera el número de filopodios en los ratones deficientes en
neurotripsina (ntd) (Figura 6). Esto indica que la neurotripsina es
necesaria para el aumento en el número de filopodios impulsado por
la actividad. En resumen, estos resultados indican que el aumento en
la actividad proteolítica de la neurotripsina en las neuronas del
SNC da como resultado un aumento en el número de filopodios
dendríticos.
\vskip1.000000\baselineskip
El fragmento de 22 kDa, el fragmento
C-terminal de la agrina, es generado de forma
natural por la actividad proteolítica de la neurotripsina en el
sitio de escisión \beta de la agrina. El fragmento recombinante de
22 kDa de la agrina es producido según se describe en el Ejemplo
7). Para investigar si la generación del fragmento de 22 kDa por la
neurotripsina está implicada en el aumento impulsado por la
actividad en el número de filopodios dendríticos, se cuentan los
filopodios a lo largo de las dendritas de las neuronas del hipocampo
CA1 en cortes agudos tratados con el fragmento de 22 kDa de ratones
homocigóticos deficientes en neurotripsina que expresan la GFP o la
mGFP en neuronas individuales. Los ratones deficientes en
neurotripsina son generados según se describe en el Ejemplo 9. Los
ratones transgénicos que expresan la GFP o la mGFP son generados
según se describió previamente (Feng y col., 2000; De Paola y col.,
2003). Los ratones deficientes en neurotripsina que expresan la GFP
o la mGFP son generados mediante el cruce de ratones deficientes en
neurotripsina con ratones transgénicos que expresan la GFP o la
mGFP en neuronas individuales. Se preparan cortes agudos de
hipocampo a partir de ratones deficientes en neurotripsina que
sobreexpresan la mGFP, según se describe en el Ejemplo 4. Estos
cortes se dividen en 4 grupos con objeto de someterlos a 4
condiciones de estimulación diferentes: sin estimulación (No Stim),
incubación con PFR (PFR), incubación con el fragmento de 22 kDa y
con PFR (22 kDa frag + PFR) e incubación con el fragmento de 22 kDa
(22 kDa frag). Las condiciones experimentales designadas como 22
kDa frag y 22 kDa frag + PFR contienen el fragmento de 22 kDa
humano, de rata o de ratón (preparado según se describe en el
Ejemplo 7) a una concentración de 22 nM en LCRA oxigenado.
Inmediatamente después del periodo de estimulación (16 minutos),
los cortes se fijan, se montan sobre portaobjetos y se toman
imágenes en serie a 0,1221 \mum a partir de dendritas apicales
secundarias de neuronas que expresan la GFP mediante microscopía
confocal, según se describe en el Ejemplo 5. Los filopodios se
cuentan en 14-20 dendritas apicales secundarias
(cada una de 30-40 \mum de largo) de neuronas
piramidales CA1 tras la reconstrucción de las imágenes
tridimensionales con el programa informático de tratamiento de
imágenes
Imaris.
Imaris.
Según se muestra en la Figura 7, el aumento en
el número de filopodios dendríticos tras la estimulación con PFR se
pierde en ratones deficientes en neurotripsina (este efecto también
se mostró en el Ejemplo 5 y en la Figura 6). Sin embargo, la
adición del fragmento de 22 kDa al PFR restablece el aumento en el
número de filopodios en cortes de hipocampo procedentes de ratones
deficientes en neurotripsina hasta el mismo nivel al encontrado con
PFR en ratones naturales (p < 0,001 mediante la prueba de la
t de Student). Esto demuestra que el aumento impulsado por
la actividad en los filopodios es dependiente de la generación del
fragmento de 22 kDa mediante la escisión proteolítica dependiente de
neurotripsina a partir de la agrina (lo que no sucede en ratones
deficientes en neurotripsina). Adicionalmente, la administración de
22 nM de fragmento de 22 kDa humano recombinante purificado solo
(sin PFR) induce un aumento significativo en los filopodios en
ausencia de inducción química de la LTP mediante PFR. El efecto
inductor de filopodios del fragmento de 22 kDa también se observa
en ausencia de los estímulos inductores de la LTP, lo que indica que
el fragmento de 22 kDa es un mediador de flujo descendiente del
efecto inductor de los filopodios de la LTP. En resumen, estos
resultados indican que el fragmento de 22 kDa actúa como un inductor
de los
filopodios.
filopodios.
\vskip1.000000\baselineskip
Se usa BAC DNA con número de acceso BC007649,
con la región 3' del ADNc de agrina humana como inserto, para
generar un fragmento de ADN que codifica para el último dominio LG
de la agrina mediante amplificación por PCR. Los cebadores de PCR
usados son
(ID. SEC. Nº: 9) 5'-GCG CGA
GTT AAC CAC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAT TCA GCG GGG GAC GTG
GAT ACC TTG GC-3', introduciendo un sitio HpaI (5'
humanC), y
(ID. SEC. Nº: 10) 5'-TTA CCT
GCG GCC GCT CAT GGG GTG GGG CAG GGC CGC AGC
TC-3', introduciendo un sitio Nod (3' humanC).
\vskip1.000000\baselineskip
Usando esta estrategia se inserta la secuencia
de ADN que codifica para una etiqueta 8 x His
N-terminal. El producto de la PCR resultante es
escindido con las enzimas de restricción NotI y HpaI (en negrita en
las secuencias de nucleótidos) y clonado en el vector pEAK8 que
contiene la secuencia codificante para el péptido de señalización
del corte de la calsintenina-1 humana con las mismas
enzimas de restricción. El fragmento constructo resultante
pEAK8-22-kDa contiene la región
codificante de la secuencia de señalización de la
calsintenina-1 humana, así como la señal de
secreción del fragmento de 22 kDa. La clonación, así como la
amplificación del plásmido se realiza en E. coli. Para la
síntesis proteica eucariota, se transfectan células HEK 293T usando
el procedimiento del fosfato cálcico. Durante la traducción en las
células HEK 293T, el péptido de señalización es escindido. La
proteína secretada resultante tiene una secuencia en la que la
secuencia líder ARVNHHHHHH HH (ID. SEC. Nº: 11) está conectada al
N-terminal de la secuencia obtenida mediante la
escisión de la agrina dependiente de la neurotripsina en el sitio
\beta que comprende el dominio LG 3 y el
C-terminal de la agrina de la ID. SEC. Nº: 12.
SAGDVDTLAFD GRTFVEYLNA VTESEKALQS NHFELSLRTE
ATQGLVLWSG KATERADYVA LAIVDGHLQL SYNLGSQPVV
LRSTVPVNTN
RWLRVVAHRE QREGSLQVGN EAPVTGSSPL GATQLDTDGA
LWLGGLPELP VGPALPKAYG TGFVG
CLRDV VVGRHPLHLL EDAVTKPELR PCPTP
CLRDV VVGRHPLHLL EDAVTKPELR PCPTP
\vskip1.000000\baselineskip
Este polipéptido tiene una masa molecular de
aproximadamente 20 kDa sin la etiqueta N-terminal
ARVN-8 x His. La masa total incluyendo la etiqueta
es de aproximadamente 21,5 kDa.
Para la producción de proteínas se cultivaron
las células HEK 293T hasta una confluencia del 80% en siete placas
de cultivo de 500 cm^{2} (Corning) con 100 ml de medio DMEM
(GIBCO) complementado con FCS al 10% cada uno. Para la transfección
se equilibran 35 ml de CaCl_{2} 500 mM y 35 ml de tampón HBS
(HEPES 50 mM, NaCl 140 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, pH 7,1) hasta
la temperatura ambiente. Se añaden dos mg de ADN de constructo de
expresión del fragmento pEAK8-22-kDa
a la disolución de CaCl_{2} y se mezclan con el tampón HBS. La
mezcla de transfección se incuba a temperatura ambiente durante 30
min. Para la transfección de una placa de 500 cm^{2} de células
HEK, se añaden gota a gota al cultivo 10 ml de la mezcla de
transfección y se incuba durante 4 h a 37ºC. Entonces la mezcla de
transfección se extrae lavando una vez con PBS y añadiendo medio
DMEM sin FCS. Después de 60 h se recoge el medio condicionado y se
filtra usando un filtro Steritop 0,22 \mum (Millipore). El
sobrenadante se dializa frente a Tris-HCl 20 mM,
NaCl 400 mM, pH 8,5, y se somete a una purificación por IMAC usando
una columna Ni-NTA (10 ml HisSelect,
Sigma-Aldrich) en un sistema de cromatografía
líquida BioLogic (Biorad). El medio condicionado y dializado se
carga con una tasa de flujo de 5 ml/min, la columna se lava con 20
CV de Tris-HCl 20 mM, NaCl 400 mM, pH 8,5. Para la
elución se usa un gradiente lineal desde 0 hasta 250 mM de imidazol
en tampón de lavado para 10 volúmenes de columna. Las fracciones que
contienen el fragmento recombinante puro de 22 kDa se agrupan, se
concentran con un concentrador rotacional de 15 ml (Millipore) y el
tampón se intercambia con una columna NAP 25 (Pharmacia) a MOPS 10
mM, NaCl 100 mM, pH 7,5. La proteína purificada se congela en
nitrógeno líquido y se almacena a -80ºC. El fragmento de 22 kDa
generado de este modo contiene una etiqueta 8 x His
N-terminal seguida por los residuos P' del sitio de
escisión \beta y el C-terminal natural de la
agrina.
De forma similar, se clona, expresa y purifica
un fragmento recombinante de 22 kDa de agrina de rata o ratón que
comprende la misma estructura de dominio.
También es posible construir un fragmento de 22
kDa con otras etiquetas o una variante sin etiquetas del fragmento
de 22 kDa con técnicas de clonación estándar. La expresión se
consigue en sistemas celulares eucariotas o procariotas estándar, y
la purificación de la proteína deseada se consigue mediante
cromatografía líquida estándar o mediante replegamiento a partir de
cuerpos de inclusión.
Para generar un fragmento de 22 kDa que sea
idéntico a la forma encontrada in vivo, se omite la etiqueta
de His N-terminal y se genera el fragmento de 22 kDa
a partir de cualquier tipo de ADNc que codifique para un fragmento
C-terminal de la agrina que comprenda el dominio LG3
y el sitio de escisión \beta de la agrina (por ejemplo, la agrina
completa o el fragmento de 44 kDa C-terminal)
mediante digestión con neurotripsina in vitro o durante la
expresión de la agrina o del fragmento de 44-kDa de
la agrina. El fragmento de 22 kDa se purifica según se describió
anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
Se generan anticuerpos policlonales contra el
dominio LG3 de la agrina inmunizado conejos con 50 \mug de dominio
LG3 de agrina de rata. El anticuerpo resultante es útil para la
detección de la agrina completa humana, de ratón o de rata, así como
para la detección de los fragmentos de agrina que contienen el
dominio LG3 de la agrina.
\vskip1.000000\baselineskip
Los inventores investigaron la presencia de los
fragmentos de agrina en la fracción soluble de homogeneizados
cerebrales y en el suero sanguíneo del ratón. Para la detección los
inventores usaron anticuerpos específicos purificados mediante
afinidad generados en el laboratorio de los inventores contra el
fragmento de 90 kDa y el fragmento de 22 kDa. El fragmento de 22
kDa podría ser fácilmente detectado en las inmunotransferencias
Western de ambos homogeneizados cerebrales y en el suero sanguíneo
(Fig. 8). Los homogeneizados cerebrales incluidos de los ratones
homocigóticos deficientes en neurotripsina (-/- en la Fig. 8, A y B)
no contenían el fragmento de 22 kDa, mientras que la forma
heterocigótica de los ratones deficientes en neurotripsina (+/- en
la Fig. 8B) mostraba el fragmento de 22 kDa a un nivel reducido.
Conjuntamente, estos resultados indican que el fragmento de 22 kDa
detectado mediante inmunotransferencia Western es debido a la acción
de la neurotripsina, y que puede ser detectado en la fracción
soluble del homogeneizado cerebral, así como en el suero
sanguíneo.
\vskip1.000000\baselineskip
También los inventores ensayaron muestras
humanas, es decir, orina, sangre y líquido cefalorraquídeo, para
investigar la presencia de fragmentos de agrina dependientes de
neurotripsina. Hasta el momento los inventores no habían hallado
ninguna evidencia de la presencia del fragmento de 110 kDa o de 90
kDa en ninguno de los fluidos corporales. Sin embargo, encontraron
el fragmento de 22 kDa tanto en el líquido cefalorraquídeo como en
el suero sanguíneo.
Según se muestra en la Fig. 9A, se encontró una
señal inmunorreactiva para el fragmento de 22 kDa de la agrina en
todas las edades ensayadas, que variaban desde un niño de un mes,
pasando por etapas adicionales del desarrollo y la edad adulta,
hasta el LCR de una mujer de 86 años. Según se esperaba en base al
patrón de expresión temporal de la neurotripsina, con un pico de
expresión durante el desarrollo postnatal temprano, los inventores
encontraron la mayor cantidad del fragmento de 22 kDa de la agrina
en el LCR de niños de 2 y 9 meses de edad. Interesantemente, se
encontró un nivel claramente elevado del fragmento de 22 kDa de la
mujer de 86 años. Sin embargo, definitivamente tendrán que medirse
más muestras con objeto de extraer conclusiones sobre la relevancia
biológica o fisiopatológica de esta observación.
Para verificar la identidad de la banda
inmunorreactiva de 22 kDa, los inventores aislaron la proteína
subyacente a partir del líquido cefalorraquídeo y la sometieron a
un análisis mediante CL/ESI/EM/EM. Con el propósito de identificar
inequívocamente la proteína en base a su secuencia peptídica
parcial, se fragmentó mediante una digestión tríptica. Entonces los
fragmentos resultantes se separaron mediante cromatografía líquida y
se sometieron a un análisis mediante EM/EM. Según se muestra en la
Fig. 9B, se detectaron dos péptidos que se correspondían
exactamente con la secuencia de aminoácidos de los primeros 27
aminoácidos (péptido #1 que comprende 13 aminoácidos (ID. SEC. Nº:
3); péptido #2 que comprende 14 aminoácidos (ID. SEC. Nº: 4)) del
fragmento de 22 kDa de la agrina humana. Ambos péptidos terminaban
en un aminoácido básico, lo que confirmaba su naturaleza tríptica.
El péptido #1 comienza en el sitio de escisión \beta de la agrina
dependiente de la neurotripsina. No se encontró ningún péptido
ubicado fuera de los márgenes del fragmento de 22 kDa de la agrina.
Conjuntamente, estos resultados confirman la identidad de la banda
inmunorreactiva de 22 kDa encontrada en inmunotransferencias
Western como el fragmento de 22 kDa de la agrina dependiente de la
neurotripsina. Estos resultados señalan al LCR como el compartimento
informador para el control de la actividad de la neurotripsina en el
cerebro.
\vskip1.000000\baselineskip
La búsqueda de fragmentos de la agrina
dependientes de neurotripsina también se extendió a muestras
extraneurales. Según se muestra en la Fig. 10, la
inmunotransferencia Western de suero sanguíneo humano mostró una
clara banda inmunorreactiva. Sin embargo, la señal detectada en
suero sanguíneo era menos intensa que la encontrada en el LCR. Para
una detección inequívoca se requirió una separación cromatográfica y
un enriquecimiento diferencial de las proteínas séricas para
revelar una señal (flecha en la Fig. 10). El trabajo que se está
realizando actualmente aspira a la validación estructural de la
identidad de la banda inmunorreactiva de 22 kDa como un derivado de
la agrina. Suponiendo una confirmación con éxito, el suero sanguíneo
también se usará como un compartimento informador para el control
de la neurotripsina in vivo. Los datos cuantitativos sobre
el fragmento de 22 kDa en suero sanguíneo permitirán extraer
conclusiones sobre la actividad de la neurotripsina en la unión
neuromuscular y en tejido extraneural, tal como el riñón y el
pulmón.
\newpage
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<110> Neurotune AG
\hskip1cmUniversität Zürich
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la detección de
la actividad de la neurotripsina in vivo, uso del
procedimiento ....
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 04398
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2045
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 191
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus rattus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Etiqueta de His
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 186
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto de aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto de aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Inserto de aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (12)
1. Procedimiento para la detección de la
actividad in vivo de la neurotripsina, en el que se mide la
cantidad del fragmento de 22 kDa de la agrina en una muestra tomada
de un paciente, y se usa la cantidad medida del fragmento de 22 kDa
de la agrina en la muestra para calcular la actividad de la
neurotripsina, siendo la muestra sangre u orina.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que se usa un fragmento de 22 kDa de la agrina preparado mediante
técnicas recombinantes, como referencia.
3. Uso del procedimiento según la reivindicación
1 para el diagnóstico y el control de trastornos relacionados con la
neurotripsina.
4. Uso según la reivindicación 3 para el
diagnóstico y el control de enfermedades causadas por la
desregulación de la neurotripsina.
5. Uso según la reivindicación 3 ó 4 para el
diagnóstico y el control de enfermedades y trastornos relacionados
con la neurotripsina del sistema neural y neuromuscular.
6. Uso según la reivindicación 3 ó 4 para el
diagnóstico y el control de enfermedades y trastornos relacionados
con la neurotripsina de sistemas no neurales, especialmente el riñón
y el pulmón.
7. Uso del procedimiento según la reivindicación
1 en estudios clínicos o preclínicos para establecer el efecto de
sustancias sobre la actividad de la neurotripsina.
8. Uso del fragmento de 22 kDa de la agrina,
detectado en sangre u orina en una muestra tomada de un paciente,
como biomarcador para trastornos relacionados con la
neurotripsina.
9. Uso según la reivindicación 8 para el
diagnóstico y el control de enfermedades causadas por la
desregulación de la neurotripsina.
10. Uso según la reivindicación 8 ó 9 para el
diagnóstico y el control de enfermedades y trastornos relacionados
con la neurotripsina del sistema neuronal y neuromuscular.
11. Uso según la reivindicación 8 ó 9 para el
diagnóstico y el control de enfermedades y trastornos relacionados
con la neurotripsina de sistemas no neurales.
12. Uso del fragmento de 22 kDa de la agrina,
detectado en sangre u orina en una muestra tomada de un paciente,
como biomarcador en estudios clínicos o preclínicos para establecer
el efecto de sustancias sobre la actividad de la neurotripsina.
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