KR102192454B1 - Prox1을 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PROX1의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물, 및 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트, 상기 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법, 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공함으로서, 천식에서 발현이 변화하는 PROX1의 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.
아울러, 본 발명의 천식 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는 천식의 초기 진단방법이다.

Description

PROX1을 포함하는 천식 진단용 바이오마커 및 이의 용도{A biomarker for diagnosing asthma comprising PROX1 and the uses thereof}

본 발명은 천식 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트, 상기 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

천식(asthma)은 만성 기도 염증 및 기도과민성을 특징으로 하는 폐질환으로, 대기오염물질, 황사, 알러젠(allergen) 등에 의하여 발생한다. 특히, 천식은 호흡곤란을 야기하는 염증성 호흡기 질환으로 우리나라 인구 중 약 300만명이 천식을 앓고 있다. 천식은 색색거리는 천명, 호흡곤란, 재채기, 심한 경우 산소부족으로 인한 청색증 및 흉통을 나타내는 질환으로 최근 들어 대기오염 및 각종 화학물질에 대한 노출로 인하여 급격히 증가하고 있으며, 특히 소아에서 발병률이 증가하고 있고 식습관의 변화 및 서구화에 따라 증가하고 있는 추세이다. 그러나 천식 환자들에서는 질병의 원인 및 발병기전이 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 이러한 발병 기전 중에 Th2(T helper type 2) 타입의 면역반응이 항진되어 이에 따라 인터루킨(interluekin)-4, 5, 13 등의 분비가 증가되게 되며, 이러한 반응과 연계하여 호산구를 비롯한 많은 염증세포들이 폐조직 내로 이동 및 침윤하게 된다. 또한 염증세포들은 다양한 전염증인자 및 화학주성인자들을 방출하여, 염증반응을 더욱 악화시키며, 기도 내 배상세포의 점액분비를 증가시키고, 기도 과민성을 야기하게 된다. 이러한 일련의 반응으로 인하여 천식환자들은 호흡곤란, 청색증 및 흉통 등의 임상증상을 나타내게 된다.

현재, 천식의 치료에 사용되고 있는 약물은 스테로이드제제, 기관지 확장제 및 항염증제가 주로 사용되고 있다. 스테로이드제제와 항염증제의 경우 면역반응 및 염증반응 억제를 통하여 천식치료에 사용되고 있으며, 기관지 확장제의 경우 호흡곤란 등의 임상증상이 발현 시에 이를 상쇄시키고자 사용되고 있다. 현재 가장 광범위하게 사용되고 있는 흡입형 코르티코스테로이드(corticosteroid) 제제는 뛰어난 치료 효과를 나타내지만 장기적으로 사용할 경우 용량과 사용시간에 비례하여 부신 억제, 골밀도 감소, 성장 장애, 눈과 피부의 합병증, 콜라겐의 합성 증가 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또한, 살메테롤(salmeterol)과 포르메테롤(formeterol)과 같은 지속성 베타-2 길항제(beta-2 agonist)는 천식 발작에 대해 예방 효과를 나타내지만 경우에 따라서는 환자를 사망케 할 수도 있다고 경고된 바 있다. 그리고 장기 사용시 부작용이 발견되어 천식치료제로서 사용이 제한적이다.

현재까지 개발된 천식 치료제는 여러 가지 부작용들을 가지고 있는 바, 천식을 조기에 발견하여 치료하는 것이 무엇보다 중요하다. 이에, 천식을 조기에 진단할 수 있는 바이오마커의 발굴이 시급한 실정이다.

대한민국 공개특허 제10-2016-0141075호

본 발명의 하나의 목적은, PROX1의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서, PROX1의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 상기 천식 진단용 조성물은 PROX1의 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물일 수 있다.

본 발명에서 용어, “천식”은 기관, 기관지, 세기관지, 그리고 폐포로 이어지는 기도의 염증반응과 이로 인한 기도조직의 손상 및 변화를 특징으로 하는 여러 가지 질환들을 통칭하는 포괄적인 질환명이다(Wardlaw A 등, Clin Exp Allergy 2005;35:1254-62). 구체적으로, 천식은 폐 속에 있는 기관지가 아주 예민해진 상태로, 때때로 기관지가 좁아져서 숨이 차고 가랑가랑하는 숨소리가 들리면서 기침을 심하게 하는 증상을 나타내는 질환으로, 기관지의 알레르기 염증 반응 때문에 발생하는 알레르기 질환이다. 천식의 대표적인 증상은 호흡곤란, 기침, 천명(쌕쌕거리는 거친 숨소리) 등이며, 좁아진 기관지를 짧은 시간 내에 완화시키는 증상 완화제(기관지 확장제) 또는 기관지의 알레르기 염증을 억제하여 천식발작을 예방하는 질병 조절제(항염증제, 류코트리엔 조절제) 등이 대표적인 치료제로 사용된다. 본 발명에서 상기 천식은 기관지성 천식, 알러지성 천식, 아토피형 천식, 비아토피형 천식, 운동유발 천식, 아스피린 천식, 심인성 천식 또는 폐포성 천식일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 실시예에서 OVA를 이용하여 33일차의 급성 천식 마우스 모델, 80일차의 만성천식 모델을 제조하였다. 33일차의 급성 천식마우스 모델에서는 염증세포의 수가 급격하게 증가하였으나, 45일차 및 80일차의 만성 천식 마우스 모델에서는 염증세포의 수가 감소하였으며, 기도 과민성 역시 이와 유사하게 급성 천식에서 가장 높게 나타났으며, 만성화되면서 기도과민성이 다소 감소되는 것을 확인하였다. 기관지 재형성(remodeling) 지표로 콜라겐 침착과 고블렛 세포의 수를 분석한 결과, 33일차(급성천식) 및 45일차의 천식 마우스 모델에서 콜라겐 침착과 고블렛 세포의 수가 대조군(sham)과 비교하여 증가하는 것을 확인하였으며, 80일차 만성 천식 마우스 모델에서 33일차 및 45일차 천식 마우스 모델과 비교하여 콜라겐 침착 및 고블렛 세포의 수가 크게 증가하였음을 확인하였다. 즉, 천식이 만성화되면서 기관지 재형성이 증가됨을 확인하였다.

따라서 본 발명의 천식은 급성 천식과 만성 천식을 포함할 수 있다.

상기 급성천식은 천식 발병 초기 단계로, 알레르기성 물질 등의 외부 인자에 의해 급성으로 유발되며, 염증세포의 수가 급격히 증가하는 것을 특징으로 한다.

상기 만성천식은 천식이 유발된 후 천식 증상이 4주 이상 지속되어 만성화된 상태를 의미한다. 급성천식과 비교하여 고블렛 세포 수 및 콜라겐 침착이 높은 것은 특징으로 한다.

본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 천식의 발병 여부를 확인하는 것으로서, 천식의 발병 여부를 조기에 확인 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "PROX1"은 프로스페로 호메오상자 단백질 1(Prospero homeobox protein 1)을 코딩하는 유전자이다. 상기 PROX1는 호메오상자(homeobox) 전사인자 패밀리이며, 발달과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 각기 다른 기관(대장, 뇌, 혈액, 유방, 간, 췌장, 식도)의 암에서 PROX1의 발현이 변화함이 보고되어 있다. 그러나 천식에서 PROX1의 정확한 역할은 알려진바 없다. 본 발명에서는 천식과 PROX1의 관계를 최초로 규명하였다.

상기 PROX1을 코딩하는 유전자의 구체적인 염기서열 및 단백질 정보는 NCBI에 공지되어 있다(gene accession No. 601546).

본 발명의 일실시예에서, OVA로 만성 알레르기성 천식 모델 마우스를 제조하였으며, 만성 알레르기성 천식 모델 마우스의 폐에서 PROX1 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로 급성 천식에서 만성천식으로 천식이 만성화 되면서 PROX1 단백질 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 PROX1 단백질을 이용하여 천식을 진단할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로 천식의 만성화됨에 따라 PROX1의 발현이 점차 증가하는 것을 확인하였는바, PROX1을 이용하여 천식의 진행정도(급성 천식 또는 만성 천식)를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "마커(marker)"란 정상군 개체와 천식을 가진 개체를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 본 발명의 천식을 가지는 개체에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 유전자, 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 등과 같은 유기 생체 분자들을 모두 포함한다. 특히 본 발명에서는 천식을 가지는 개체에서 변화되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용된 용어 "mRNA 수준 측정"이란 천식을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

바람직하게 천식 진단을 위하여, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 PROX1의 단백질의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프라이머 쌍"은 표적 유전자 서열을 인지하는 정방향 및 역방향의 프라이머로 이루어진 모든 조합의 프라이머쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성을 부여할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브 분자의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA (peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체외에서 제조된 것을 포함하는 것으로 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 유전자들의 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 유전자 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용된 용어 "단백질 수준 측정"이란 천식 진단을 위하여 생물학적 시료에서 천식 진단용 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 마커 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있으며, 바람직하게는 항체를 이용하지 않고 단백질 발현 수준 자체를 측정한다.

상기 단백질 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

천식 진단을 위하여 바람직하게 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 PROX1의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 PROX1의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명은 다른 양태로서, 상기 천식 진단용 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트를 제공한다.

바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다.

또한, 바람직하게, 상기 천식 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

바람직하게, 상기 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. RT-PCR (역전사 중합효소반응) 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 각 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

바람직하게 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 신속한 테스트를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 래피드(rapid) 키트 일 수 있다. 래피드 키트는 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로 셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수패드와 샘플 패드 등 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명은 다른 양태로서, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

바람직하게, 본 발명의 방법은 생물학적 시료로부터 PROX1의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계, 및 상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법일 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 천식 발병에 의해 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 PROX1은 모두 정상 대조군과 비교하여, 천식이 있는 개체에서 유전자 발현 수준 또는 해당 단백질의 발현 수준이 변화하는 특징을 가지므로, 상기 수준이 변화하면 천식으로 진단할 수 있다.

또한, 천식 의심 개체의 분리된 시료의 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높은 경우 천식으로 판단할 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 상기 유전자의 발현 수준은 mRNA 발현 수준을 측정하거나 비교할 수 있다.

상기 mRNA 발현 수준 측정 또는 비교는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩 등을 사용할 수 있으나, 본 발명은 이들에 제한되는 것이 아니다. 상기 측정 방법들을 통하여 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 천식 환자의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 이들 발현량 정도를 비교함으로써 천식 발병 여부를 진단 또는 예측할 수 있다.

바람직하게 본 발명의 상기 단백질 발현 수준은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 측정 및 비교할 수 있다. 상기 항체와 생물학적 시료 내의 해당 단백질이 항원-항체 복합체를 형성하도록 하고, 이를 검출하는 방법을 이용한다.

본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LCMS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는, PROX1의 단백질 발현 수준 자체를 측정 및 비교하기 위해서, 웨스턴 블랏 또는 면역조직화학 분석을 사용하였다. 따라서 상기 단백질 발현 수준은 바람직하게는 웨스턴 블랏 또는 면역조직화학 분석을 이용하는 것 일 수 있다.

본 발명은 다른 양태로서 천식 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 천식 치료제의 스크리닝 방법은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에 천식 치료제 후보물질을 처리하는 단계, 상기 후보물질 처리군에서 PROX1의 단백질의 발현수준을 측정하는 단계, 및 상기 측정된 PROX1의 단백질의 발현수준이 후보물질을 처리하지 않은 대조군보다 감소하면 상기 후보물질을 천식 치료제로 선택하는 단계를 포함한다.

본 발명의 용어, "천식 치료제 후보물질"은 통상적인 선정방식에 따라 천식 치료의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 또는 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명에서 발현 수준 측정은 PROX1의 단백질의 발현수준을 측정하는 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "대조군"이란 천식 치료제 후보물질을 처리하지 않은 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물로 상기 후보물질을 처리한 군과 병렬 관계에 속하는 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물을 의미한다.

본 발명의 “천식 치료제의 스크리닝 방법”은, 천식에 PROX1의 발현이 관련됨을 확인함으로써, PROX1의 발현을 치료제 후보물질을 처리하지 않은 대조군 세포와 비교하는 방식으로 고안되었다.

천식을 예방 또는 치료할 수 있는 후보물질의 부재 하에 분리된 세포, 분리된 조직 또는 인간을 제외한 동물에서의 PROX1의 단백질의 수준을 측정하고, 또한, 상기 후보물질의 존재 하에서 PROX1 단백질의 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 상기 후보물질이 존재할 때의 PROX1의 단백질의 수준이 상기 후보물질의 부존재 하에서의 수준보다 감소시키는 물질을 천식의 예방 또는 치료용 제제로 예측할 수 있다.

상기 분리된 세포로는 인체에서 분리된 프라이머리(primary) 세포일 수 있으며, 인간 기관지 상피세포주(normal human bronchial epithelial cells, NHBE), 인간 폐 미세혈관내피세포주(Human fetal lung fibroblast cells, MRC-5), 선암 인간 폐포 기저막 상피세포주(adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549), 인간 제대 정맥 내피세포주(human umbilical vein endothelial cells, EA.hy926), 또는 Ad12-SV40 2B로 형질전환 된 기관지 상피세포(Bronchial Epithelial cells transformed with Ad12-SV40 2B, BEAS-2B) 같은 확립된 세포주를 사용할 수도 있다.

상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명은, 천식 진단용 조성물을 제공한다. 구체적으로 천식에서 발현이 변화하는 PROX1의 단백질 또는 그 유전자의 발현 수준을 측정 및 비교함으로서, 천식의 조기진단 및 질병 정도를 유의적으로 예측 또는 파악할 수 있다.

아울러, 본 발명의 진단용 조성물은 비침습성 진단을 가능하게 하여 혈액, 뇨 검사 등으로 간단하고 유효성 있는, 천식의 초기 진단을 제공할 수 있다.

도 1은 알레르기성 급성과 만성 천식 마우스 모델의 제조 방법을 나타낸 것이다.
도 2의 왼쪽은 각 OVA로 천식을 유발한 33일차, 45일차, 80일차의 천식 마우스 모델에서 기도과민성을 분석한 결과이다. 오른쪽은 33일차 45일차 80일차의 천식 마우스 모델 기관지 페포세척액 증가된 염증세포의 수를 분석한 것이다.
도 3은 33일차, 45일차, 80일차의 천식 마우스 모델에서 분리한 폐 조직에서 고블렛 세포의 수와 콜라겐 침착 정도를 분석한 것이다.
도 4는 33일차, 45일차, 80일차의 천식 마우스 모델에서 분리한 폐 조직에서 PROX1의 단백질 발현을 분석한 것이다.
도 5는 33일차, 45일차, 80일차 천식 마우스 모델에서 분리한 폐 조직의 면역조직화학염색(immunohistochemical staining)하여 상피(epithelium) 및 혈관(vessel)을 PROX1의 발현을 분석한 결과이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

<실시예 1> 알레르기성 급성/만성 천식 동물모델의 제조

PROX1과 천식의 관계를 확인하고자, 알레르기성 급성 천식 모델과 만성 천식모델을 제조하였다. 도 1은 알레르기성 급성 및 만성 천식 마우스 모델의 제조 방법이다.

생후 6주된 암컷 BALB/c 마우스에 0일과 14일에 V 등급의 계란(chicken egg)의 오브알브민(ovalbumin, OVA) 50 ㎍을 복강내 주사하여 감작하였다. 상기 OVA는 100㎕ 인산완충식염수(Delbecco’s phosphate buffered saline, D-PBS)과 10㎎의 수산화알루미늄으로 유화시켜 사용하였다.

다음으로 마우스는 28일부터 30일째에 50㎕ D-PBS에 녹인 Ⅲ 등급의 오브알부민(시그마) 150㎍을 비강투여(intranasal challenges) 하였다.

천식의 진행단계에 따른 분석을 위해 33일차(급성 천식), 45일차, 80일차(만성 천식)로 마우스를 나누었다.

급성 천식 마우스 모델(33일차)은 32일차에 OVA를 비강투여(intranasal challenges) 하여 제조하였으며, 45일차 천식 마우스 모델은 상기 급성 천식 마우스 모델(33일차)에서 추가적으로 44일차에 OVA를 비강투여하여 제조하였다.

만성천식 마우스 모델(80일차)은 상기 45일차 모델에 추가적으로 52일 내지 77일차에 OVA를 비강투여하고, 79일차에 OVA를 비강투여하여 제조하였다.

이후 이들 천식모델을 이용하여 기도과민성 평가를 수행하였으며 33일, 45일, 88일째에 안락사 시켜 기관지폐포세척술 및 병리 조직학적 분석을 수행하였다.

한편, 대조군 마우스는 식염수(saline)를 이용하여 감작하고, 비강투여 하였다.

<실시예2> 기도과민성, 폐포세척액, 형태분석(AHR, BALF, morphology analysis)

상기 제조된 동물모델에 각 32일차, 44일차 또는 79일차에 0, 5, 20, 또는 100 mg/㎖의 메타콜린(Sigma-Aldrich)을 투여한 후, 기도과민증(airway hyperresponsiveness, AHR)을 평가하였다.

기도과민성 평가 다음날, 2.5㎎/㎏의 틸레타민(tiletamine)과 자일라진(xylazine)(Zoletil and lumpum; 바이엘 코리아, 서울, 대한민국)으로 마취시키고, 기관지페포 세척액을 회수하고, 원심분리한 후 상층액(supernatant)을 분석 전에 -20℃에서 보관하였다. 세포 계수를 위해 세포 펠렛(pellet)을 현탁하고, 세포분별(cell differential)을 위해 사이토스핀(cytospin) 슬라이스를 제조하였다(500세포/마우스, Diff-Quick-staining).

폐 조직은 채취하여 4% 인산염 완충 파라포름알데히드에 고정시키고, 파라핀 왁스에 포매(embedding) 하였고, 조직학적 평가를 위해 4㎛의 절편을 채취하고 헤마톡실린과 에오신으로 염색(H&E stain) 후 공초점 이미지(confocal imaging) 분석을 수행하였다.

또한 콜라겐 분석을 위해 트리크롬 염색(trichrome stain) 및 서콜 어세이(sircol assay)를 수행하였다.

고블렛 세포(Goblet cell)의 수를 분석하고자 과요오드산-쉬프(periodic-acid-Schiff, PAS) 염색을 수행하였다.

도 2의 왼쪽은 천식 마우스 모델의 기도과민성 측정결과이다. 측정결과, 대조군(Sham)과 비교하여 OVA 감작한 마우스에서 모두 기도과민성이 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로 33일차(급성 천식)에서 기도 과민성이 가장 높음을 확인하였으며, 45일차에서 80일차(만성 천식)로 진행되면서 기도과민성이 급성천식(33일차)에 비해 감소되는 것을 확인하였다.

도 2의 오른쪽은 기관지세포액의 염증세포 분석결과이다. 분석결과, 33일차의 급성 모델에서 염증세포가 가장 많음을 확인하였으며, 45일 이후로 천식이 만성화되면서 염증세포의 수가 감소되는 것을 확인하였다.

도 3은 천식마우스 모델에서 분리한 폐조직을 H&E, PAS 및 트리크롬(Trichrome) 염색하여, 점액질 세포(고블렛 세포)와 콜라겐 침착 정도를 분석한 결과이다. PAS 염색을 통해 고블렛 세포를 분석한 결과, OVA 비처리 대조군(Sham)과 비교하여 천식 마우스모델에서 고블렛 세포가 증가하는 것을 확인하였으며, 특히 80일차의 마우스가 33일, 45일 마우스와 비교하여 현저히 고블렛 세포가 증가하는 것을 확인하였다.

또한 트리크롬 염색하여 콜라겐 증착을 분석한 결과에서 역시 위와 유사하게 천식에서 콜라겐 증착이 증가하고, 80일차 천식 모델에서 콜라겐 침착이 가장 높음을 확인하였다.

<실시예3> 천식 마우스 모델에서 분리된 폐조직의 PROX1 단백질 발현 분석

다음으로, 천식의 진행(만성화)에서 PROX1 단백질 발현 변화를 확인하고자 웨스턴 블랏 및 면역 조직화학 염색을 수행하였다.

먼저 50 mM Tris-HCL (pH 7.4), 50mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 0.5 mM EDTA와 100mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)를 증류수에 용해시켜 단백질 용해 용액(protein lysis solution)을 제조하였다.

제조한 단백질 용해 용액을 폐조직에 넣고 균질화시킨 후, 4℃에서 14000rpm으로 30분간 원심분리하여 불용성 물질(insouble material)을 수집하였다.

마우스 폐의 단백질은 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분리하고 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 트랜스퍼하고, 상기 멤브레인을 실온에서 2시간 동안 5% 소 혈청 알부민 (BSA)을 포함하는 0.1% Tween-20을 함유하는 트리스 완충 식염수(TBS)로 막을 블로킹하였다. 다음으로 4℃에서 하루밤 동안 PROX1 항체(1:1000)로 인큐베이션 시킨 후, HRP-접합된 2차 항체로 인큐베이션 하였고, WEST-ZOL 플러스 웨스턴 블랏 검출 시스템(iNtRon, 성남, 대한민국)을 이용하여 검출하였다. 정량적 농도법으로 상대적인 단백질 수준을 판단하였고 데이터는, 베타-액틴 (Sigma-Aldrich)으로 표준화하였다.

분석결과는 도 4와 같다. 도 4에서 천식 마우스 모델에서 분리한 폐조직에서 서 PROX1의 상대적 발현이 대조군(Sham)과 비교하여 증가하는 것을 확인하였으며, 33일의 급성 모델과 비교하여 45일, 80일에 PROX1 단백질의 상대적 발현이 증가하는 것을 확인하였는바, 천식이 진행(만성화)되면서 PROX1의 발현이 증가함을 확인하였다.

또한, 도 5에서 면역 조직화학 염색 결과, 천식 마우스모델(33일, 45일, 80일)에서 분리한 폐조직의 혈관 및 상피에서 PROX1이 증가하는 것을 확인하였다.

이상의 실시예에서 천식 마우스 모델에서 PROX1 단백질의 발현이 증가함을 확인하는 것을 확인하였고, 천식이 진행(만성화)됨에 따라서 PROX1 단백질의 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 즉, PROX1가 천식에 발병 및 진행에 관여함을 확인하였다. 따라서 PROX1의 발현이 증가하는 경우, 천식으로 진단할 수 있다.

Claims (12)

1. PROX1 단백질 또는 이의 유전자의 mRNA의 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 천식 진단용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것인, 천식 진단용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인, 천식 진단용 조성물.
4. 제1항에 따른 조성물을 포함하는, 천식 진단용 키트.
5. 제4항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트인 것인, 천식 진단용 키트.
6. 폐 조직에서 분리된 생물학적 시료로부터 PROX1의 단백질 또는 이의 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   상기 단계에서 측정된 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
7. 제6항에 있어서, 천식 의심 개체의 분리된 시료의 상기 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준이, 정상 대조군 시료의 단백질의 발현 수준 또는 유전자의 발현 수준보다 높을 경우 천식으로 판단하는 것을 특징으로 하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
10. 제6항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정은 해당 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하는 것인, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
11. 제6항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학(immunohistochemistry) 분석, 면역세포화학(immunocytochemistry) 분석, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏, 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 천식 진단을 위한 정보의 제공 방법.
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