KR101900428B1 - 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공기오염물질 노출 여부 판단을 위한 바이오마커에 관한 것으로, 본 발명에 따른 바이오마커인 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴, 또는 모에신 단백질은 공기오염물질인 예를 들어, 아크롤레인에 대한 노출에 의해 발현이 증가하므로, 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커 및 이를 이용한 확인 방법 {BIOMARKER FOR IDENTIFICATION OF EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS AND METHOD OF IDENTIFYING EXPOSURE TO AIR POLLUTANTS USING THE SAME}

본 발명은 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커에 대한 것으로, 구체적으로 공기오염물질인 아크롤레인에 노출이 되었는지를 판단하기 위한 바이오마커에 관한 것이다.

흡연은 전 세계 사망률의 주요 위험 요인이다. 흡연은 천식의 증상 조절을 어렵게 만들며, 천식치료제에 대한 치료반응을 약화시킨다. 천식을 가지고 있는 비흡연자들과 비교했을 때, 천식을 가지고 있는 흡연자들은 악화된 천식의 증상 조절, 급격히 쇠퇴된 폐 기능, 높은 사망률을 보인다. 스테로이드 치료 및 금연은 천식의 증상을 개선시킬 수 있고, 폐 기능을 향상시킬 수 있다. 경미한 수준에서 치명적인 수준까지 이르는 모든 천식 환자들의 기도에서 혈관의 누출 및 혈장 충혈 등이 보고되었다(Harkness LM et al., 2015, Pharmacol Ther, 148:17-33).

혈관을 생성하기 위해서는, 내피세포의 증식 및 이동을 필요로 하며, 혈관그물의 팽창적 증가를 위한 내피세포 증식의 중요성은 오랫동안 알려져 왔다. 상기 내피는 혈관 및 림프관 내부를 덮고 있는 세포의 단일층이다. 이러한 세포층은 기저막에 부착되어, 혈액과 조직 사이의 물질교환에 참여한다. 내피세포는 혈관 기능 조절, 새로운 혈관의 생성 및 손상된 혈관의 회복에서 중요한 역할을 한다. 내피세포는 성장 인자, 혈관에 작용하는 중재자, 응고 및 섬유소분해 단백질, 그리고 면역 인자와 같은 다수의 생물학적 중재자를 방출한다. 이러한 세포는 혈관 벽의 안정성 및 완전한 상태를 반영하여 보통 잠잠한 상태에 있다.

한편, 상온에서 휘발성인 아크롤레인(2-propenal)은 눈 및 호흡기도에 매우 자극적인 α, β-불포화 알데하이드이다. 아크롤레인은 조리용 기름 ? 지방을 300℃ 이상에서 가열하는 경우 생성될 수 있고, 가정에서 바이오매스를 연료로 사용하여 요리하는 경우 생성될 수 있으며, 환경 속의 담배 연기에 존재한다. 이는 레스토랑 업무 현장에서 상당한 건강상의 위험요소이다. 아크롤레인은 만성 기도 질환을 악화시키며, 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환 환자의 가래 및 응축된 날숨에서 수치가 증가한다(Corradi M et al., 2004, Eur Respir J, 24:1011-7).

Harkness LM et al., 2015, Pharmacol Ther, 148:17-33 Corradi M et al., 2004, Eur Respir J, 24:1011-7

이에, 본 발명자들은 공기오염물질인 아크롤레인의 노출 여부를 판단하기 위한 마커를 개발하고자, 프로테오믹 접근법을 사용하여 시간 및 양에 따른 아크롤레인의 노출이 단백질의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 연구한 결과, 아크롤레인에 노출된 마우스의 폐에서 특정 단백질들의 발현이 증가됨에 따라 상기 특정 단백질들이 공기오염물질 노출 여부 확인에 탁월한 효과가 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 공기오염물질 노출 여부를 판단하기 위한 바이오마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바이오마커를 검출하는 제제를 포함하는 공기오염물질 노출 확인용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 공기오염물질 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 바이오마커의 발현량을 확인하는 것을 포함하는 공기오염물질 노출에 대한 정보의 제공 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오마커의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된 공기오염물질 노출 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 공기오염물질인 아크롤레인의 노출 여부 확인용 바이오마커로서, 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴, 또는 모에신을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴, 또는 모에신의 유전자 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 공기오염물질인 아크롤레인의 노출 여부 확인용 키트를 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 공기오염물질 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 상기 바이오마커의 유전자 발현량을 측정하는 단계 및 그 발현량을 정상 대조군의 발현량과 비교하는 단계를 포함하는 공기오염물질 노출 여부 판단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴, 또는 모에신의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된 공기오염물질 노출 확인용 DNA 마이크로어레이칩을 제공한다.

본 발명에 따른 바이오마커인 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴, 또는 모에신 단백질은 공기오염물질, 예를 들어, 아크롤레인에 대한 노출에 의해 발현이 증가하므로, 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1a 및 도 1b는 아크롤레인 30 nM (도 1a) 및 300 nM (도 1b)을 각각 처리한 인간 폐 미세혈관 내피세포를 2차원 전기 영동 하여 나타낸 것이다. 아크롤레인이 처리되지 않은 세포 용해물의 2-D PAGE 이미지는 마스터 겔 및 참조 맵으로 사용되었다.
도 2는 인간 폐 미세혈관 내피세포에 아크롤레인 30 nM을 처리한 후 8시간 및 24시간이 되었을 때, 11개 단백질의 유의미한 차등 발현 (>3배 변화)을 집락 분석하여 나타낸 그래프이다. 각각의 단백질 발현 프로필은 집락 분석에 의해 분류되었다. NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 의해 명명된 단백질이 각 군집에서 보여진다.
도 3은 인간 폐 미세혈관 내피세포에 아크롤레인 300 nM을 처리한 후 8시간 및 24시간이 되었을 때, 10개 단백질의 유의미한 차등 발현 (>3배 변화)을 집락 분석하여 나타낸 그래프이다. 각각의 단백질 발현 프로필은 집락 분석에 의해 분류되었다. NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 의해 명명된 단백질이 각 군집에서 보여진다.
도 4a는 천식 모델의 실험 프로토콜이고, 도 4b 및 4c는 아크롤레인 및 Sham 처리된 마우스의 폐 조직 내 모에신 발현을 웨스턴 블롯과 면역조직화학적 염색으로 각각 확인한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 일 측면으로, 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질을 포함하는, 공기오염물질 노출 여부 확인용 바이오마커를 제공한다.

트로포마이오신 베타 체인 (Tropomyosin beta chain, 트로포2)은 베타-트로포마이오신 (β-Tropomyosin)으로도 알려져 있으며, 트로포2 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 상기 단백질은 액틴 필라멘트를 안정화시키고 근육 수축을 조절한다. 상기 단백질의 서열은 NP_001288156.1(NCBI)를 참고할 수 있다.

비멘틴 (Vimentin, VIM)은 섬유아세포, 백혈구세포 등의 간엽계 세포에 특이적인 중간경 필라멘트 단백질이다. 중간경 필라멘트는 미세소관 및 액틴 미세필라멘트와 함께 세포 골격을 구성한다. 상기 단백질은 세포 형태의 유지, 세포질의 온전한 상태, 및 세포 골격 상호 작용의 안정화를 담당한다. 또한, 상기 단백질은 면역 반응에 관여하며, 리소좀부터 에스테르화 반응의 장소까지 저밀도 리포단백질 (LDL) 유래 콜레스테롤의 수송을 조절한다. 상기 단백질의 서열은 NP_003371.2(NCBI)를 참고할 수 있다.

모에신 (Moesin, MSN)은 막-조직화 연장 스파이크 단백질(membrane-organizing extension spike protein)을 나타내며, 에즈린 (ezrin) 및 라딕신 (radixin)과 함께 ERM족에 속한다. ERM 단백질은 원형질 막과 액틴-기반 세포 골격 (actin-based cytoskeletons) 간의 가교 단백질로서 작용한다. 모에신은 사상위족 (filopodia) 및 세포 간의 인식 및 신호, 그리고 세포 운동에 중요한 역할을 하는 기타 막의 돌출부에 집중되어있다. 상기 단백질의 서열은 EAX05399.1(GenBank)를 참고할 수 있다.

또한, 본 명세서에서 사용된 용어 "공기오염물질"은 아크롤레인일 수 있으며, 아크롤레인은 자극성의 지방이 타는 듯한 역한 냄새를 지닌 가장 간단한 불포화 알데히드 화합물로서, 반응성이 매우 강력해서 자연계에서 생성되는 즉시 다른 물질과 반응할 수 있다. 점막에 자극성을 지니고 있어 노출에 유의하여야 하며, 상온에서 중합하는 성질을 지니고 있어 약간 끈적한 노란색 물질로 변한다. 공기 중에 2 ppm 정도만 존재해도 독성 반응을 일으킬 수 있고, 항암제 중 하나인 싸이클로포스파마이드의 대사 산물로 생성되기도 한다. 아크롤레인은 호흡기계 자극 및 심혈관계 이상을 유발할 수 있으며, 담배 중의 아크롤레인이 폐암과 관련되어 있다는 주장도 있다. 아크롤레인은 눈, 피부, 점막, 폐를 자극할 수 있으며 고농도 노출에 의한 중추신경계 억제 증상이 나타날 수 있다. 강한 자극성을 가지고 있으며 노출시 드물게 사망을 유발할 수 있다. 또한, 아크롤레인은 주로 아크릴산의 합성 중간체 또는 소독제로, 급성 흡인 노출은 상기도의 염증과 정체의 원인이 되며, 흡인에 의한 호흡곤란 또는 흉부 긴장이 나타날 수 있다.

본 발명은 다른 측면으로, 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴 및 모에신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는, 공기오염물질 노출 확인용 키트를 제공한다.

상기 검출 제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명은 또 다른 측면으로, 1) 공기오염물질 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴, 또는 모에신의 유전자 발현량을 측정하는 단계, 2) 상기 유전자 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계, 및 3) 상기 유전자 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 공기오염물질에 노출되었다고 판정하는 단계를 포함하는, 공기오염물질 노출에 대한 정보의 제공 방법을 제공한다.

상기 유전자 발현량을 측정하는 단계에서 2차원 겔 전기 영동법 (Two-dimensional (2-D) Electrophoresis), MALDI-TOF MS (Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 또는 웨스턴 블롯 분석법 (Western Blot Analysis)이 사용될 수 있다.

2차원 겔 전기 영동법은 상이한 원리의 전기영동을 조합하여 2차원적으로 전개시키는 겔 전기 영동법으로서, 많은 성분으로 구성된 시료를 분리하는 데 사용한다. 등전점과 분자량의 차이에 따라 단백질을 2차원적으로 분리할 수 있기 때문에 고 분리능의 전기영동도를 얻을 수 있다.

말디토프 질량 분석법 (MALDI-TOF MS)은 분자량이 비교적 큰 시료와 매트릭스가 혼합된 결정체에 레이저를 조사하여 이온화시킨 후, 전하를 띤 이온들을 비행시간형(time-of-flight) 질량 분석기에 통과시켜 검출기까지 도달하는 시간을 측정하여 분자량을 분석하는 장치이다. 또한, MALDI-TOF MS는 열분해와 같은 극단적인 조건이 필요하지 않고 컬럼 (column)을 사용하지 않아 상대적으로 다루기 쉬운 질량 분석법이다. 상기 분석법은 단백질이나 DNA 단편의 분자량을 측정하는데 광범위하게 사용된다.

웨스턴 블롯 분석법은 널리 알려진 분석 기술 중 하나로, 찾고자 하는 단백질을 표적화하는 항체를 이용하여 항원-항체 반응을 통해 특정한 단백질을 검출해내는 기법이다. 특정 단백질을 주어진 조직 샘플에서 찾고자 할 때 이용되는 이 기법은, 전기 영동으로 순수 단백질 또는 변성된 단백질을 삼차원 형태 그대로 크기 별로 분리한 후, 단백질들을 막(membrane)에 전달하고 막에 인지물질 (probe)이 붙어있는 항체들을 처리함으로써 목적하는 특정 단백질을 찾는 과정을 거친다.

상기 트로포2, VIM, 또는 MSN의 유전자 발현량을 측정하는 단계는 상기 유전자의 mRNA의 측정을 통해 수행될 수 있다. 또한, 상기 단계에서 상기 트로포2, VIM, 또는 MSN 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 프라이머를 이용할 수 있다. “프라이머” 또는 “프로브”는 주형과 상보적으로 결합할 수 있고 역전사효소 또는 DNA 중합효소가 주형의 복제를 개시할 수 있도록 하는 자유 3말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열을 의미한다. 상기 유전자들의 공지된 서열 정보를 기반으로, 당 분야에 잘 알려진 기술들을 이용하여 상기 프로브 또는 프라이머를 용이하게 제조할 수 있다.

mRNA 수준에서의 검출, 발현량 또는 패턴의 검출을 위해 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)/중합효소연쇄반응, 경쟁적 RT-PCR, 실시간 RT-PCR, Nuclease 보호 분석 (NPA) 예를 들면, RNase, S1 nuclease 분석, in situ 교잡법, DNA 마이크로어레이칩, 또는 노던 블롯 등을 이용한 방식이 사용될 수 있다. 이러한 분석법들은 공지된 것이며, 또한 시중의 키트를 사용하여 수행될 수 있고, 당업자라면 본 발명의 실시를 위해 적절한 것을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들면 노던블랏은 세포에 존재하는 전사체의 크기를 알 수 있으며, 다양한 프로브를 사용할 수 있는 장점이 있으며, NPA는 다중 마커 분석에 유용하며, in situ 교잡법은 mRNA와 같은 전사체의 세포 또는 조직내 위치 파악에 용이하며, 역전사 중합효소연쇄반응은 적은 양의 시료 검출에 유용하다. 또한 본 발명에 따른 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 유래의 mRNA 또는 cRNA와 같은 핵산과 특이적으로 결합하는 결합제제 또는 결합제제를 포함하는 어레이가 사용될 수 있다.

상기 바이오마커의 검출 방법에 사용되는 시약 또는 물질은 공지된 것으로서, 예를 들면 mRNA의 존재 여부와 그 양을 RT-PCR로 측정하기 위한 방법에서 검출시약으로는 예를 들면 중합효소, 마커의 mRNA에 특이적인 프로브 및/또는 프라이머쌍을 포함한다. 상기 검출 시약은 신호검출을 위해 발색, 발광 또는 형광물질과 같은 것으로 표지될 수 있다.

상기 검출 시약은 검출에 사용되는 구체적 방법에 따라 검출을 위해 직접적 또는 샌드위치 형태로 간접적으로 표지될 수 있다. 직접적 표지방법의 경우, 어레이 등에 사용되는 혈청 시료는 Cy3, Cy5와 같은 형광 표지로 표지된다. 샌드위치의 경우, 표지되지 않은 혈청 시료를 먼저 검출 시약이 부착된 어레이와 반응시켜 결합시킨 후, 표적 단백질을 표지된 검출 항체와 결합시켜 검출한다. 샌드위치 방식의 경우, 민감도와 특이성을 높일 수 있어, pg/mL 수준까지 검출이 가능하다. 그 외 방사능 물질, 발색물질, 자기성 입자 및 고밀도 전자 입자 등이 표지물질로 사용될 수 있다. 형광 광도는 스캐닝 콘포칼 현미경이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 애피메트릭스사(Affymetrix, Inc.) 또는 에이질런트 테크놀로지스사(Agilent Technologies, Inc) 등에서 입수할 수 있다.

한편, 상기 단계의 개체에서 트로포2 또는 VIM이 발현된 경우, 30 nM 이상의 공기오염물질에 노출되었음을 알 수 있고, 개체에서 MSN이 발현된 경우, 300 nM 이상의 공기오염물질에 노출되었음을 알 수 있다. 이는 본원 실시예 2에 자세하게 기술되어있다.

또한, 본 발명은 또 다른 측면으로, 트로포마이오신 베타 체인, 비멘틴, 또는 모에신의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된, 공기오염물질 노출 확인용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

준비예 1. 세포 배양 및 아크롤레인 자극

하기 실시예에서 사용한 1차 인간 폐 미세혈관 내피세포(HMVEC-L) (Lonza, 스위스) (5000 cells/cm²)를 EGM^TM-2MV BulletKit^TM(Lonza, Basel, 스위스)에서 배양했다. 37℃, 5% CO₂의 조건에서 세포가 90% 융합에 도달할 때까지 배지를 48시간마다 교체했다. 상기 세포들을 150 cm²의 플레이트에 시딩(seeding) 하였다. 이후, 상기 HMVEC-L을 0.1% FBS와 함께 EGM^TM-2MV에서 30분동안 재배양하였고, 다양한 농도의 아크롤레인을 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 상태의 배양기에서 8시간 및 24시간 동안 배양하였다.

준비예 2. 2차원 (2-D) 전기영동 및 이미지 분석

세포 배양액을 원심분리하여 HMVEC-L 세포를 수확하였고, 5 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl, 1% Triton X-100, 및 2 mM PMSF를 포함하는 용해 완충액으로 파쇄시켰다. 상기 세포 용해물을 12,000 × g에서 30분동안 원심분리한 후, 상청액 부분을 수득하였다. 단백질 농도는 BCA 분석 키트(Pierce)로 측정하였다. Immobiline DryStrips(Amersham Biosciences)을 IPGphor system(Amersham Biosciences)에서 추출된 1 mg의 단백질을 가지고 수행되는 등전점전기영동(IEF)에 사용하였다. IEF 분리 이후, 상기 단백질들을 2차원 겔에서 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis)에 의해 분리하였다.

이미지 분석을 위해, 제조자의 지시에 따라 상기 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250을 사용하여 시각화하였다. 상기 2-D 겔은 ImageScanner (Amersham Biosciences)의 전송 모드로 스캔하였다. 스팟 검출 및 매칭은 ImageMaster 2D version 5.0 (Amersham Biosciences)을 사용하여 실시하였다. 디지털화된 이미지들은 스팟의 면적(스팟의 "용적")뿐만 아니라 광학밀도를 통합시키면서 2-D 스팟의 강도를 측정하기 위해 ImageMaster 프로그램을 사용하여 분석하고 표준화하였다. 상기 강도 측정값들을 표준화하고, 통계분석을 위해 SPSS 12.0으로 전송하였다.

준비예 3. MALDI-TOF MS 분석에 의한 단백질 식별 및 데이터베이스 서칭

하기 실시예에서 사용한 질량 분석법(MS)은 연세 프로테옴 연구원(YPRC, 한국)에서 실시하였다. SF 및 혈청 펩타이드 프로파일은 MALDI-TOF/TOF 질량 분석기(4800 ABSciex, 미국)로 분석하였다. 샘플제조 시, 수지에 부착된 불순물들을 제거하기 위해 70% ACN이 포러스팁(Porous tip)을 통해 흐르게 하였다. 그 다음, 산성 상태를 만들기 위해 2% 포름알데히드 용액을 컬럼에 통과시켰다. 이러한 사전 처리 후에, 분석할 샘플들을 컬럼에 통과시켰다. 이후, 염 및 화학물질과 같은 불순물들을 제거하기 위해 세척제 (2% FA)를 사용하였다. 마지막으로, 용출 완충액을 한 방울씩 사용하여 수지에 부착된 상기 펩타이드를 용출시켰다.

준비예 4. 데이터베이스 서치 및 단백질 식별

MS 및 MS/MS 데이터를 인간 단백질의 MSDB(Main storage data base) 단백질 서열 데이터베이스를 사용하는 Mascot software(Matrix Science; http://www.matrixscience.com)에 의한 후속 검색에 사용하였다.

준비예 5. 아크롤레인 노출 및 조직학적 검사

순천향대학교 부천병원의 실험동물운영위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 연구를 실시하였고, SPF(Specific pathogen free) 조건에서 마우스들을 보관하였다. 하기 실시예에서, 생후 6-8주된 BALB/c 암컷 마우스들(n = 8 마우스; Orient Bio, Sungnam, 한국)을 사용하였다. 필터된 공기(대조군), 난백 알부민 (3 ug/ul) 또는 아크롤레인 (5 ppm, 6 h)에 상기 마우스들을 노출시킨 후, 관찰하였다.

폐 조직에서 아크롤레인에 의해 유도된 변화들을 조사하기 위해, 마우스들에게 2.5 mg/kg 틸레타민 (tiletamine) 및 자일라진 (xylazine) (Zoletil and lumpum; Bayer Korea Co., Seoul, 한국)을 복강 내 주사하여 마취시켰다. 그 다음날, 기관지허파꽈리 세척액 (Bronchoalveolar lavage fluid, BALF)을 수득하고, 원심분리한 후, 그 상청액을 -20℃에서 보관하였다. 세포 수를 알아보기 위해 세포 펠렛(Cell pellet)을 1.05X PBS에 재현탁하고, 세포 감별(Cell differential)을 위해, 세포원심분리기(Cytospin) 슬라이드를 만들었다 (500 세포/마우스, Diff-Quick-staining). 폐의 일부분을 4% 인산염 완충 파라포름알데히드로 고정하였고, 파라핀에 포매 처리하였으며, 절편을 만들어 염색하였다.

고정된 폐는 Ca²⁺, Mg²⁺, 6.1 mM D-글루코즈, 및 0.33 mM 소듐 피루베이트 (DPBS; Cat. No. 14287-080, Life Technologies, Carlsbad, CA)를 포함하는 둘베코 인산염 완충 식염수로 헹구었고, 단계별 농도의 에탄올 용액(30-70%)으로 건조시켰으며, 파라핀 블록(Hypercenter XP, Shandon, Ramsey, MN)에 포매하였다. 상기 폐 조직을 절단하였고(4 ㎛), 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색하였다. 무세포 상청액 내의 전체 단백질은 소혈청알부민을 표준으로 사용하는 바이신코니닉 산 분석법(bicinchoninic acid assay, BCA; Thermo Scientific, 미국)을 이용하여 측정하였다.

준비예 6. 모에신 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석

추출된 폐 조직을 증류수에 50 mM Tris-HCL(pH 7.4), 50 mM NaCl, 0.1% SDS, 1% Triton X-100, 0.5 mM EDTA, 및 100 mM PMSF를 포함하는 단백질 용해 용액에서 균질화하였고, 4℃에서 30분동안 14000 rpm으로 원심분리하였으며, 불용성 물질들을 수득하였다. 단백질을 10% SDS-PAGE에 의해 분획화하였고 PVDF 막(millipore)으로 전달하였다. 상기 막을 5% BSA를 포함하는 TBS에서 1시간동안 차단하였고, 4℃에서 하룻밤 동안 다클론성의 토끼 항-모에신(anti-MOESIN) 항체(1:1000 희석) (EP1863Y, abcam)와 함께 배양하였다. 막을 0.01% 트윈-20을 포함하는 TBS로 10분씩 3회 세척하여 결합하지 않은 1차 항체를 제거하였다. 이후, 상기 막을 염소 항-토끼(goat anti-rabbit) 항체(Alexa Fluor® 488, abcam)와 함께 1시간동안 배양하였다. 모에신의 ECL 검출은 제조자의 지시(Roche Applied Science)에 따라 실시되었다.

준비예 7. 면역조직화학적 염색에 의한 아크롤레인에 노출된 마우스의 폐 조직 내 모에신 발현 분석

모에신의 분비를 조사하기 위해 마우스 폐 절편으로부터 파라핀을 제거하였고, 단계별 농도의 에탄올로 다시 수화하였다. 4 ㎛ 조직절편 슬라이드를 30분동안 0.3% H₂O₂-메탄올로 처리하여 내인성 페록시다아제를 차단한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 모에신 항체(1:100 희석, abcam)와 함께 배양하였다. Tris-완충 식염수로 헹군 뒤, 상기 슬라이드들을 아비딘-비오틴 과산화효소 복합체(ABC 키트, Vector Laboratory, Burlingame, CA)와 함께 배양하였다. 발색반응은 액체 DAB+ 기질 키트 (Golden Bridge International Inc, Mukilteo, WA)의 염색에 의해 증가하였다. 면역조직화학적 염색 이후, 상기 슬라이드들을 헤리스(Herris)의 헤마톡실린으로 1분동안 대조염색하였다.

준비예 8. 통계분석

SPSS 14.0 software를 사용하여 통계분석을 실시하였다. 2-D 겔상의 스팟 강도의 차이는 지속적인 데이터를 위한 non-parametric Kruskal-Wallis H 테스트를 사용하여 세 개의 독립적인 집단들 또는 시료들 사이에서 비교하였다. 차이점들이 유의미하게 발견될 경우, Mann-Whitney U 검사 (two-sample rank sum test)를 두 집단의 밀도 및 농도 차이에 적용하였다. 모든 데이터들은 중간값 (사분위수 범위)으로 나타내었으며, 유의성은 p < 0.05으로 정의하였다.

실시예 1. 2-D 전기영동 및 단백질 동정

HMVEC-L 세포를 30 nM 및 300 nM 아크롤레인으로 처리한지 8시간 및 24시간 후에 단백질의 차등 발현을 확인하기 위해 프로테오믹 접근법을 사용하였다. 단백질 분획을 분별 원심분리법에 의해 수득하였고, 처리 당 여섯 개의 복제 겔을 사용하여 2-D 전기영동법으로 분리하였다. 처리 이전 HMVEC-L 세포들의 프로테오믹 프로필의 대표적인 이미지를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이, 각 겔에서 총 427개 (중간값, 425; 범위, 400-460)의 단백질 스팟들이 검출되었다. 확인된 모든 스팟들은 10-200 kDa의 분자 질량 범위와 함께 pH 3-10 범위에 국한되었다. 2-D 겔 이미지는 마스터 겔 및 참조 맵으로서 사용하였다. 아크롤레인 처리된 세포 추출물의 2-D PAGE는 30 nM에서 11개의 스팟, 300 nM에서 10개의 스팟을 나타내었고, 아크롤레인을 처리한 지 8시간 및 24 시간이 되었을 때 3배 이상 변화하였다. 상기 스팟들을 겔로부터 잘라내었고, 겔에서 단백질을 소화시키기 위해 트립신과 함께 배양하였으며, 그 후 MALDI-TOF MS를 사용하여 분석하였다.

실시예 2. 집락 분석 (Cluster Analysis)

계층적 군집 기법을 사용하여 유의한 (p< 0.05) 차등 발현을 나타낸 21개 단백질의 발현 프로필을 시각화하였다. 군집으로부터 네 개의 기본적인 프로필 패턴을 확인할 수 있었다: 일시적인 증가 (도 2 and 도 3, Group A), 지속적인 증가 (도 2 and 도 3, Group B), 일시적인 감소 (도 2 and 도 3, Group C), 및 지속적인 감소 (도 2 and 도 3, Group D).

2.1. HMVEC-L 세포의 아크롤레인 30 nM 처리

HMVEC-L 세포에 아크롤레인 30 nM을 처리한 경우, 이차원 겔에서 11개의 단백질 스팟들을 변화시켰으며, 이들을 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석하였다. 상기 단백질들은 산화 방지제(아데닐릴 시클라아제 관련 단백질 (CAP), 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)), 신호 전달(아넥신 A5 (ANXA5), 14-3-3 단백질 엡실론 동등형(YWHAE), 개시 인자 4D (eIF-4D)), 세포 골격(트로포마이오신 베타 체인 (트로포2) 및 비멘틴 (VIM)), 단백질 전달(포스포리파아제 A2 (PLA2)), 접촉 환원(글루타티온 S-전이 효소 P (GST-π)) 단백질들을 포함했다.

상기 단백질들을 지속적인 증가, 일시적인 증가, 일시적인 감소, 및 지속적인 감소와 같은 시간경과에 따른 발현 패턴의 양상변화에 의해 네 개의 집단으로 분류하였다. 이를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타나는 바와 같이, 아데닐릴 시클라아제 관련 단백질 (CAP), 아넥신 A5 (ANXA5), 14-3-3 단백질 엡실론 동등형(YWHAE), 포스포리파아제 A2 (PLA2), 개시 인자 4D (eIF-4D) 및 피브린 베타는 group A에, 트로포마이오신 베타 체인 (트로포2) 및 비멘틴 (VIM)은 group B에 포함되었다. 또한, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH) 및 글루타티온 S-전이 효소 P (GST-π)의 일시적인 감소가 group C에서 관찰되었고, 글루타티온 S-전이 효소 P (GST-π)의 지속적인 감소가 group D에서 관찰되었다.

2.2. HMVEC-L 세포의 아크롤레인 300 nM 처리

HMVEC-L 세포에 아크롤레인 300 nM을 처리한 경우, 이차원 겔에서 10개의 단백질 스팟들이 변화되었으며, 이들을 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석하였다. 상기 단백질들은 신호 전달(아넥신 A1 (ANXA1), 14-3-3 단백질 엡실론 동등형 (YWHAE), 아넥신 A5 (ANXA5), 글루코즈-조절된 단백질 78 전구체(부분)(GRP78)), 세포 골격(트로포마이오신 4 (TPM4), 모에신, 동등형 CRA_b (MSN)), 단백질 전달(71Kd 열 충격 동족 단백질 (HSP7C)), 접촉 환원(글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)) 단백질들을 포함했다.

상기 단백질들을 지속적인 증가, 일시적인 증가, 일시적인 감소, 및 지속적인 감소와 같은 시간경과에 따른 발현 패턴의 양상변화에 의해 네 개의 집단으로 분류하였다. 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타나는 바와 같이, 아넥신 A1 (ANXA1), 71Kd 열 충격 동족 단백질 (HSP7C), 트로포마이오신 4 (TPM4), 14-3-3 단백질 엡실론 동등형 (YWHAE), 아넥신 A5 (ANXA5)는 group A에, 모에신, 동등형 CRA_b (MSN)는 group B에 분류되었다. 글루코즈-조절된 단백질 78 전구체(부분)(GRP78)의 일시적인 감소가 group C에서, 글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소 효소 (GAPDH)의 지속적인 감소가 group D에서 각각 관찰되었다.

실시예 3. 아크롤레인 처리된 마우스의 폐에서 모에신 발현 HMVEC-L 세포의 확인

아크롤레인으로 체내 자극한 이후, 폐 조직에서 모에신 발현이 증가되는지를 확인하기 위해, 마우스를 난백 알부민 (3 ug/ul) (OVA)에 3일동안 또는 아크롤레인 5 ppm에 5시간씩 3일간 노출시켰다.

구체적으로, 0일 및 14일에 BALB/c 마우스에게 Saline 또는 OVA를 복강 내 주사하였고, 이들을 세 그룹으로 나누었다(대조군(Sham), OVA처리군(OVA/OVA), 아크롤레인 처리군(OVA/ACR)). 21일 내지 23일에 매일, 대조군 마우스는 여과된 공기에 노출시켰고, OVA처리군 마우스에게는 OVA 3 ㎍/㎕를 복강 내 주사하였으며, 아크롤레인 처리군 마우스에게는 OVA 처리 1시간 후에 아크롤레인 5 ppm을 호흡 노출 시켰다(도 4a).

대조군, OVA 처리군 또는 아크롤레인 처리군 마우스로부터 추출된 폐 세포를 단백질 발현 분석하였다 (도 4b). 또한, OVA 처리군, 아크롤레인 처리군 및 대조군 마우스의 폐 조직을 비오틴이 부착된 항-염소 모에신 항체 (biotinylated anti-goat MOESIN antibody) (1:100 희석)와 함께 배양하였고, 아비딘-비오틴 과산화효소 복합체 키트 및 3,3'-디아미노벤지딘 테트라클로라이드 (Zymed Laboratories Inc.) 염색을 이용하고 대조염색으로서 헤마톡실린을 사용하여 모에신을 검출하였다 (도 4c).

도 4a 내지 도 4c에 나타난 바와 같이, 대조군 마우스 집단과 비교했을 때 OVA 및 아크롤레인에 노출된 마우스 집단의 폐 세포 내 모에신 발현이 더 증가하였다 (도 4b). 기관지 폐포 세척액의 평가는 대조군 마우스 집단의 세포 수와 비교했을 때 아크롤레인 노출된 마우스 집단에서 증가된 총 세포 수 및 감별 세포 계수 (Differential cell counts)를 보였다 (도 4c). 폐 내 기관지에서 모에신 단백질의 발현은 면역조직화학적 염색을 이용하여 조사하였다. 대조군, OVA 처리군 및 아크롤레인 처리군 마우스의 폐 용해물 (20 ug of protein/lane)의 균질 현탁액을 웨스턴 블롯 분석한 결과, 대조군 마우스와 비교했을 때 아크롤레인 처리된 마우스의 폐 내에서 모에신 단백질이 현저히 증가한 것으로 나타났다 (도 4a). 모에신은 내피세포, 기관지 및 세기관지의 상피세포, 및 염증세포에서 관찰되었다 (도 4b).

Claims (14)

1. 트로포마이오신 베타 체인을 포함하는, 아크롤레인 노출 확인용 바이오마커.
   
2. 삭제
3. 트로포마이오신 베타 체인 또는 이를 코딩하는 유전자를 검출하는 제제를 포함하는, 아크롤레인 노출 확인용 키트.
   
4. 삭제
5. 제3항에 있어서,
   상기 검출 제제가 트로포마이오신 베타 체인을 코딩하는 유전자에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머 또는 프로브인, 아크롤레인 노출 확인용 키트.
   
6. 제3항에 있어서,
   상기 검출 제제가 트로포마이오신 베타 체인에 특이적으로 결합하는 항체인, 아크롤레인 노출 확인용 키트.
   
7. 1) 아크롤레인 노출이 의심되는 개체로부터 분리된 시료에서 트로포마이오신 베타 체인의 유전자 발현량을 측정하는 단계;
   2) 상기 유전자 발현량과 정상 대조군 시료의 발현량을 비교하는 단계; 및
   3) 상기 유전자 발현량이 대조군에 비해 높은 경우, 개체가 아크롤레인에 노출되었다고 판정하는 단계를 포함하는, 아크롤레인 노출에 대한 정보의 제공 방법.
   
8. 삭제
9. 제7항에 있어서,
   상기 유전자 발현량 측정이 2차원 겔 전기 영동법 (Two-dimensional (2-D) Electrophoresis), MALDI-TOF MS (Matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry) 및 웨스턴 블롯 분석법 (Western Blot Analysis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 아크롤레인 노출에 대한 정보의 제공 방법.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 유전자 발현량을 측정하는 단계가 상기 유전자의 mRNA의 측정을 통해 수행되는, 아크롤레인 노출에 대한 정보의 제공 방법.
    
11. 제7항에 있어서,
    개체에서 트로포마이오신 베타 체인이 발현된 경우, 30 nM 이상의 아크롤레인에 노출되었다는 정보를 제공하는 단계를 추가적으로 포함하는, 아크롤레인 노출에 대한 정보의 제공 방법.
    
12. 삭제
13. 트로포마이오신 베타 체인의 유전자 또는 그와 상보적인 핵산이 집적된, 아크롤레인 노출 확인용 DNA 마이크로어레이 칩.
14. 삭제

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