KR101296511B1 - 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물 및 바이오 마커 검출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물, 바이오 마커를 이용하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 키트, 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 검출방법을 제공한다. 본 발명은 공기 중 나노 입자 또는 미세입자와 관련된 단백질 발현 차이를 밝힌 최초의 결과이고, 본 발명의 단백질들을 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단하여 공기 중 나노 입자의 독성을 감지하는 바이오 마커로 이용할 수 있다.

Description

공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물 및 바이오 마커 검출방법{BIOMARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING EXPOSURE TO NANO PARTICLE IN AIR AND THE METHOD FOR DETECTING USING THE SAME}

본 발명은 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커에 관한 것이다.

광범위한 역학조사 결과 공기 중의 나노입자에의 노출기간과 심폐질병과 폐암사망률과 연관성이 있음이 알려져 있다. 그러나, 공기로 운반되는 미세나노입자의 물리적, 화학적 특성과 이로 인한 질병발생의 메카니즘은 잘 알려져 있지 않다. 최근 나노 입자에 의한 건강 위해성은 활성산소(ROS)의 형성에 의해 개시되는 산화성 스트레스에서 유래 된다고 알려져 있다. ROS는 산화 환원 반응의 상태 변화를 유발하고, 이로 인해 염증반응과 세포자살 경로의 연쇄 반응이 일어난다. 산화적 스트레스와 염증은 DNA 가닥의 파괴와 산화적 DNA 손상의 유발과 관련되어 있으며, 발암과도 연관되어 있는 것으로 보여진다.

최근에, 공기 중의 초미세입자 혹은 나노 먼지 (0.1 um 이하)에 대한 우려가 많은데 초미세입자는 사람의 폐에 들어왔을 때 작은 크기와 큰 표면적 때문에 폐 깊숙이 침전될 수 있으므로 큰 입자보다 더 위험할 수가 있다. 최근 공기 중 큰 입자가 주로 폐의 독성을 나타내는 반면에 초미세입자는 주로 국소성 빈혈/재관류 현상을 일으키는 것으로 보고되었다. 즉 입자의 크기에 따라 유발되는 질병이 서로 다를 가능성이 제시되고 있다.

최근 제조 나노 입자의 생산이 급격히 증가하면서, 제조 나노 입자의 잠재적 독성은 중요한 사안으로 여겨지고 있어서 제조 나노 입자의 독성자료 많은 편이다.

많은 사람들이 일상적으로 공기 중 나노 입자에 노출되어 있다. 그러나 나노입자에의 노출 정도는 질량 측면에서는 낮지만, 입자 수, 크기, 그리고 표면적 기준으로는 매우 클 수 있다. 또한 공기 중 나노입자의 독성은 입자 크기뿐만 아니라 화학적 조성의 차이 때문에 서로 다른 지역에서 수집된 나노입자의 독성은 서로 다를 수 있다.

그러나 공기 중 나노입자의 잠재적 독성에 대한 연구는 거의 진행되지 않아서 공기 중 나노입자의 위해성 관련 자료는 거의 없다. 게다가, 공기 중 나노 입자의 노출에 따른 전체단백질 분석에 관한 정보도 전부 알려지지 않았다. 그래서 나노 입자 노출과 관련된 마커를 개발할 필요가 있었다.

본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물, 상기 바이오 마커를 이용하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 키트, 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 다음으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 포함하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물: (1) ATP/GTP 결합 단백질 유사 5 이소폼 3(ATP/GTP binding protein-like 5 isoform 3, Genbank 등록 번호 NP_001030584); (2) 케라틴 7(Keratin 7, Genbank 등록 번호 NP_005547); (3) 케라틴 17(Keratin 17, Genbank 등록 번호 NP_000413); (4) 케라틴 8(Keratin 8, Genbank 등록 번호 AAA35763); (5) 미오신 XVIIIB, 이소폼 CRA_d(Myosin XVIIIB, isoform CRA_d, Genbank 등록 번호 EAW59706); (6) 케라틴 18(Keratin 18, Genbank 등록 번호 CAA31377); (7) 켈치 단백질 유사 단백질; BAA77027 유사 단백질(Similar to Kelch proteins; similar to BAA77027, Genbank 등록 번호 AAF03529); (8) 아넥신 A2, 이소폼 CRA_c(Annexin A2, isoform CRA_c, Genbank 등록 번호 EAW77587); (9) MBD1-포함 크로마틴 결합 팩터 2(MBD1-containing chromatin associated factor 2, Genbank 등록 번호 AAT66299); (10) 케라틴 1(Keratin 1, Genbank 등록 번호 AF237621_1); (11) 인간 유전적 이상과 관련된 트리오세포스페이트 이소머라제(Triosephosphate isomerase related human genetic disorders, Genbank 등록 번호 1HTI_A); 및 (12) 비멘틴(Vimentin, Genbank 등록 번호 AAA61279)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 검출방법을 제공한다.

본 발명은 공기 중 나노 입자 또는 미세입자와 관련된 단백질 발현 차이를 밝힌 최초의 결과이고, 본 발명의 단백질들을 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단하여 공기 중 나노 입자의 독성을 감지하는 바이오 마커로 이용할 수 있다.

도 1은 공기 중 나노 입자의 추출과정을 나타낸 것이다.
도 2는 공기 중 나노입자를 사람 기관지 상피 세포에 20ug/ml가 되게 처리하였을 때 세포독성을 나타낸 것이다.
도 3과 도 4는 13개의 단백질이 대조군과 공기 중 나노입자인 PM_{0 .056} 처리 후에 나타나는 발현의 차이를 보이는 것을 나타낸 것이다.
도 5는 도 4의 단백질을 확대한 것이다.
도 6은 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통해서 케라틴 17 및 아넥신 A2가 나노입자처리에 의해 증가함을 재확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 공기 중 나노 입자에 노출된 대상의 생물학적 시료에서 노출되지 않은 대상에 비해 특이적으로 발현되는 단백질을 스크리닝하여, 하기의 표 1에 기재된 단백질을 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커로 확보하였다.

용어 "바이오 마커"란 정상 세포에 비하여 공기 중 나노 입자에 노출된 세포, 조직 등에서 증가 또는 감소를 보여 노출 여부를 진단할 수 있는 유기 생체 분자 물질을 의미하며, 본 발명에서는 표 1에 기재된 바이오 마커들의 발현을 단백질 수준에서 확인함으로써, 노출 여부를 진단할 수 있었다. 이때, 분석에 사용되는 단백질의 수는 제한되지 않으며, 목적에 맞게 하나 이상의 단백질을 적합하게 선택할 수 있다.

본 발명의 일 실시예는 (1) ATP/GTP 결합 단백질 유사 5 이소폼 3(ATP/GTP binding protein-like 5 isoform 3, Genbank 등록 번호 NP_001030584); (2) 케라틴 7(Keratin 7, Genbank 등록 번호 NP_005547); (3) 케라틴 17(Keratin 17, Genbank 등록 번호 NP_000413); (4) 케라틴 8(Keratin 8, Genbank 등록 번호 AAA35763); (5) 미오신 XVIIIB, 이소폼 CRA_d(Myosin XVIIIB, isoform CRA_d, Genbank 등록 번호 EAW59706); (6) 케라틴 18(Keratin 18, Genbank 등록 번호 CAA31377); (7) 켈치 단백질 유사 단백질; BAA77027 유사 단백질(Similar to Kelch proteins; similar to BAA77027, Genbank 등록 번호 AAF03529); (8) 아넥신 A2, 이소폼 CRA_c(Annexin A2, isoform CRA_c, Genbank 등록 번호 EAW77587); (9) MBD1-포함 크로마틴 결합 팩터 2(MBD1-containing chromatin associated factor 2, Genbank 등록 번호 AAT66299); (10) 케라틴 1(Keratin 1, Genbank 등록 번호 AF237621_1); (11) 인간 유전적 이상과 관련된 트리오세포스페이트 이소머라제(Triosephosphate isomerase related human genetic disorders, Genbank 등록 번호 1HTI_A); 및 (12) 비멘틴(Vimentin, Genbank 등록 번호 AAA61279)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질, 구체적으로는 1개 내지 12개의 단백질을 포함하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다. 상기 바이오 마커 조성물은 공기 중 나노 입자 노출에 의한 폐 독성 진단용 바이오 마커 조성물일 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 (2) 케라틴 7(Keratin 7, Genbank 등록 번호 NP_005547); (3) 케라틴 17(Keratin 17, Genbank 등록 번호 NP_000413); 및 (8) 아넥신 A2, 이소폼 CRA_c(Annexin A2, isoform CRA_c, Genbank 등록 번호 EAW77587); 으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 필수적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공기 중 나노 입자에 노출 진단용 바이오 마커 중의 케라틴 7(스팟 2와 스팟 10)은 공기중 나노 입자에 의해 발현이 감소되었다.또한, 케라틴 8(스팟 4),케라틴 17(스팟 3)와 케라틴 18(스팟 6), 케라틴 1(스팟 11)은 발현이 증가하였다. 케라틴은 조직 특이적이고 분화 의존적인 방법으로 다양한 형태로 발현된다. 케라틴 중간 필라멘트는 상피 세포의 주요한 세포골격 구성 요소이고, 그것들은 유형 I (KRT9-KRT20)과 유형 II (KRT1-KRT8) 중간 필라멘트 단백질의 혼합 중합체로서 구성된다. 케라틴의 발현은 다양한 발암물질의 검출에서 폭넓게 사용되는데 왜냐하면 세포골격의 발현은 주로 종양 형성과정에서 보존되기 때문이다.

케라틴 7(스팟 2와 스팟 10)은 원래 중피 조직에서 발현되는 55 kDa 유형-II 케라틴으로 설명된다. 케라틴 7은 종종 배아 형성 과정에서 처음으로 발현되는 상피 케라틴 8/18과 공동으로 발현된다. 유형-II 중간 필라멘트 단백질인 케라틴 8은 대부분의 상피 악성 종양에서 지속적으로 발현된다. 어떤 사람의 폐의 비늘 모양의 세포 암종과 위의 선종에서는 케라틴 8의 농도가 매우 높으며, 세로 자살이 억제되는 결과를 보여준다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공기 중 나노 입자에 노출 진단용 바이오 마커 중의 미오신 XVIIIB(스팟 5)는 공기중 나노 입자에 의해 발현이 증가하였다. 액틴을 기반으로 하는 세포성 운동 단백질을 구성하는 미오신 MVIIIB는 ATP를 이용하여 세포질 분열, 식균작용, 그리고 트래픽킹(trafficking)과 같은 진핵세포 운동성에 근본적인 역할을 한다. 이 단백질은 단세포와 다세포의 발달과 분화 조절의 타이밍 결정에 관여하기도 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공기 중 나노 입자에 노출 진단용 바이오 마커 중의 켈치(Kelch) 모티프를 포함하는 단백질 그룹인 켈치 단백질(스팟 7)은 공기중 나노 입자에 의해 발현이 증가하였다. 켈치 도메인은 5~7개의 켈치 세트가 반복되어 β프로펠러 삼차구조가 형성될 때 일반적으로 나타난다.켈치 단백질의 기능은 명확하지 않으나 액틴 구조와 연관되는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공기 중 나노 입자에 노출 진단용 바이오 마커 중의 아넥신 A2 단백질(스팟 8)은 공기중 나노 입자에 의해 발현이 증가하였다. 아넥신 A2는 외포작용, 상피세포의 운동성, 세포막과 연결된 단백질 복합체와 액틴 세포골격과의 연결, 섬유소 분해 그리고 이온채널의 형성을 포함하는 다양한 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 게다가 아넥신 A2는 인지질에 붙은 Ca^{2 +} 의존성 단백질로 세포성장 조절과 신호전달 경로에 중요한 역할을 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공기 중 나노 입자에 노출 진단용 바이오 마커 중의 MBD1(스팟 9)은 공기중 나노 입자에 의해 발현이 감소되었다. MBD1은 메틸화된 CpG에 붙는 도메인을 갖는 단백질의 일부로서 메틸화된 프로모터와 메틸화되지 않은 프로모터의 번역을 억제하는 것으로 알려져 있다. 메틸화된 CpG 부분은 메틸화된 CpG에 붙는 도메인을 가지는 단백질 인자에 의해 인지된다. 지금까지 포유류에서 다섯 종류의 MBD인 MeCP2, MBD1, MBD2, MBD3 그리고 MBD4가 알려졌다. 이들 중에 MBD1은 유전자 활동을 조절하기 위해 국부적 염색체 상태를 형성하고 유지하는데 중요한 역할을 하는 것을 보고됐다. 변역 조절 이외에도 MBD1은 메틸화에 의해 혹은 산화적인 요인에 의해 손상된 퓨린을 제거하는 메틸퓨린 DNA 글리코실화 효소와 상호작용을 통한 DNA 수선과 관련이 있다. 게다가 MBD 단백질은 인간의 암 세포주의 동일한 메틸화된 프로모터에서 발견된다.

최근 환경적인 요인이 후성유전 경로의 비정상적인 변화에 연관이 있다고 알려져 있다. 비록 후성유전의 변화가 미미하고 매우 느리게 진행되어 환경적 요인, 후성유전의 변화와 질환 사이의 확실한 관계를 설명하기 어렵지만 후성유전적인 변화는 질환과 환경적 요인사이의 상관관계를 잘 설명해준다. MBD1의 발현이 공기 나노입자에 노출되면서 감소되었다는 사실은 공기 중 나노입자에 의해 후성 유전경로가 변화되었을 가능성을 시사한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공기 중 나노 입자에 노출 진단용 바이오 마커 중의 3탄당인산 이성질화효소인 TPI(스팟 12)는 공기중 나노 입자에 의해 발현이 증가하였다. 3탄당인산 이성질화효소는 3-인산 D-글리세르알데하이드와 인산 다이하이드록시아세톤의 상호전환을 촉매하는 glycolygic 효소이다. TPI 기능장애의 특징은 만성 용혈성 빈혈, 신경계 장애, 그리고 동형접합체와 이형접합체 복합체의 빠른 사멸을 일으킨다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공기 중 나노 입자에 노출 진단용 바이오 마커 중의 비멘틴(스팟 13)은 공기중 나노 입자에 의해 발현이 증가하였다. 세포질성 중간섬유 단백질인 비멘틴은 상피세포에서 발현되지 않는 간충직 세포의 표지자이다. 하지만 최근 상피 암세포에서도 VIM의 발현은 중간엽 이행을 통한 국부적인 침입, 전이성암과 연관이 있음을 보여주었다. 비정상적인 VIM 과발현과 암전이와의 관련성은 흑색종, 유방암, 자궁암, 간암 그리고 전립선암에서 보고되었다. 또한 비멘틴 과발현은 상피에서 기원하는 많은 암 뿐만 아니라 폐암에서도 증가하였다. 본 연구에서 비멘틴은 공기중 나노입자에 의해 중가하였다.

본 발명의 일 실시예에 따른 공기 중 나노 입자에 노출 진단용 바이오 마커 중의 ATP/GTP 바인딩 단백질 유사 5 이소폼 3(스팟 1)은 공기중 나노 입자에 의해 발현이 감소하였다. 바인딩 단백질 유사 5 는 시토졸릭 카르복시펩티다제 유사 단백질 5(cytosolic carboxypeptidase-like protein 5)로서 단백질 펩티드결합의 C-말단부분을 가수분해하는 효소이며 가수분해를 통한 단백질의 활성화반응에서 중요한 기능을 한다.

본 발명의 일실시예에 따른 바이오 마커는 공기 중 나노 입자 노출 여부를 검출하는 데에 사용할 수 있는 한 천연의 아미노산 서열의 아미노산 잔기가 다른 잔기로 치환, 결실 및/또는 첨가되어 다양하게 변형된 형태일 수 있다. 또한, 인산화, 당화, 메틸화, 파네실화 등의 변형이 일어난 형태일 수도 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 하기 표 1에 기재된 단백질 중 하나 이상, 구체적으로는 1개 내지 12개의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 검출용 조성물을 제공한다. 상기 바이오 마커 검출용 조성물은 상기 단백질 수준을 측정하는 제제, 구체적으로 항체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 완전한 형태의 항체뿐 아니라, 항체 분자의 기능적 단편도 포함한다.

다클론 항체는 상기한 바이오 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다. 단클론 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 단클론 항체는 마커 단백질을 이용하여 재조합 조합 면역글로불린 라이브러리(예, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 검색한 다음, 마커 단백질에 결합하는 면역글로불린 라이브러리 일원을 분리함으로써, 동정 및 분리할 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리 제조 및 스크리닝 키트를 상업적으로 구입가능하다.

또한, 본 발명의 일 실시예는 하기 표 1에 기재된 단백질 중 하나 이상, 구체적으로는 1개 내지 12개의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 키트를 제공한다. 상기 진단용 키트는 공기 중 나노 입자 노출에 의한 폐 독성 진단용 키트일 수 있다.

"키트"는 본 발명의 마커를 특이적으로 검출하기 위한 한가지 이상의 시약, 예컨대 항체, 핵산 프로브 등을 포함하는 임의의 제조물(예, 패키지 또는 용기)로 의도된다. 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 유니트(unit)로서 조성하거나, 분배하거나 또는 판매할 수 있다.상기 진단용 키트는 상기 바이오 마커 검출용 조성물에 당분야에서 널리 사용되는 다른 구성 성분 또는 장치를 추가적으로 포함하여 응용, 제작될 수 있다. 단백질에 대한 특이적인 항체 및, 추가적으로, 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소 및 그의 기질을 포함하는 ELISA용의 키트로 제작될 수 있다. 또 다른 예로서, 단백질 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 단백질 칩용 키트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 표 1에 기재된 단백질 중 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 생물학적 시료를 반응시키는 단계; 및 상기 반응에 의해 형성된 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 검출방법을 제공한다. 상기 바이오 마커 검출방법은 공기 중 나노 입자 노출에 의한 폐 독성 진단용 바이오 마커 검출방법일 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 양을 대조군과 비교하는 단계의 구체적 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등의 다양한 ELISA 방법을 포함한다.

본 발명의 일실시예에 따른 바이오 마커 검출방법에서 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로부터 선택할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제, GDPase, RNase, 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으나 이에 한정되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 항원-항체 복합체 형성을 검출하기 위해 비색법(colorimetric method), 전기화학법(electrochemical [0069] method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)로부터 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 생물학적 시료는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커를 검출할 수 있는 세포, 조직 또는 체액 샘플을 의미하고, 구체적으로, 혈액, 뇨, 림프, 여성 체액, 생검, 땀, 대변, 눈물 또는 객담을 들 수 있다.

상기 검출방법에서 상기 바이오 마커는 (3) 케라틴 17(Keratin 17, Genbank 등록 번호 NP_000413); (4) 케라틴 8(Keratin 8, Genbank 등록 번호 AAA35763); (5) 미오신 XVIIIB, 이소폼 CRA_d(Myosin XVIIIB, isoform CRA_d, Genbank 등록 번호 EAW59706); (6) 케라틴 18(Keratin 18, Genbank 등록 번호 CAA31377); (7) 켈치 단백질 유사 단백질; BAA77027 유사 단백질(Similar to Kelch proteins; similar to BAA77027, Genbank 등록 번호 AAF03529); (8) 아넥신 A2, 이소폼 CRA_c(Annexin A2, isoform CRA_c, Genbank 등록 번호 EAW77587); (10) 케라틴 1(Keratin 1, Genbank 등록 번호 AF237621_1); (11) 인간 유전적 이상과 관련된 트리오세포스페이트 이소머라제(Triosephosphate isomerase related human genetic disorders, Genbank 등록 번호 1HTI_A); 및 (12) 비멘틴(Vimentin, Genbank 등록 번호 AAA61279)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질이며, 검출 대상의 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군에 비해 증가한 경우 공기 중 나노 입자에 노출된 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 검출방법에서 상기 바이오 마커는 (1) ATP/GTP 결합 단백질 유사 5 이소폼 3(ATP/GTP binding protein-like 5 isoform 3, Genbank 등록 번호 NP_001030584); (2) 케라틴 7(Keratin 7, Genbank 등록 번호 NP_005547); 및 (9) MBD1-포함 크로마틴 결합 팩터 2(MBD1-containing chromatin associated factor 2, Genbank 등록 번호 AAT66299)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질이며, 검출 대상의 생물학적 시료 내의 상기 단백질 발현량이 대조군에 비해 감소한 경우 공기 중 나노 입자에 노출된 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 검출 대상의 생물학적 시료와 대조군 간의 발현량의 차이는 절대적 또는 상대적 차이로 비교될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 세포주 배양 및 공기중 나노입자 처리

본 발명에서는 사람 폐 세포, 즉 기관지 상피세포인 BEAS-2B (Human Bronchial Epithelial cell line)를 사용하였다. BEAS-2B 세포는 ATCC number CRL-9609^™으로 ATCC에서 구입하였으며, -190℃의 액체질소에서 냉동 보관하여 사용하였다. 150 mm culture dish에 배지와 세포를 넣어준 뒤 5% CO₂, 37℃배양기에서 배양하였고 도립현미경과 hematocytometer를 이용하여 세포 배양 상태와 세포 수를 측정하였다. 세포에 영양분을 공급하기 위해 BEGM (Bronchial Epithelial Growth Media, Lonza) 배지에 1% antibiotics (penicillin-streptomycin)이 첨가된 배지를 제조하여 세포 배양액으로 사용하였다.

사람 기관지 상피세포 (BEAS-2B)를 150 mm 세포 배양 플라스크에 세포수를 3×10⁶ cells이 되도록 배지와 함께 넣어 5% CO₂, 37 ℃배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 세포에 각각 광양과 아산에서 포집된 나노 필터에서 추출한 공기중 나노입자 355 ug을 세포에 24 시간 동안 처리하였다. 나머지 대조군은 빈여지를 DMSO로 추출한 용액을 사용하였다.

2. 세포 수 측정

세포 수의 측정은 hemocytometer와 trypan-blue를 이용한 세포 수 측정방법을 이용하였다. Trypsin-EDTA 용액을 처리한 뒤, 분리한 세포 배양액 10 ul와 trypan-blue solution [0.4% (w/v) trypan-blue, 0.8% (w/v) NaCl, 0.06% (w/v) KH₂PO₄, 0.05% (w/v) methylene-p-hydroxybenzonate (pH 7.2)] 10 ul를 잘 혼합한 후 혼합액 10 ul를 hemocytometer에 취해 역상 현미경을 이용하여 세포수를 측정하였다. Hemocytometer의 0.1 mm³의 4 구간을 정해 청색으로 염색되지 않고 살아있는 세포 수를 측정하였다.

3. 나노입자의 추출

나노입자 측정기에 의해 포집한 공기 중 나노입자 필터인 <56 nm 를 각각 15 tube에 담은 후 DMSO 1 을 넣고 10분간 vortexer로 섞은 후 1시간 동안 초음파진동을 가하여 DMSO에 떨어져 나오는 물질로 실험을 진행하여 영향을 관찰하였다. 도 1은 공기 중 나노입자의 추출 과정을 나타낸 것이다.

4. 세포수확 및 단백질 정량

사람 기관지 상피세포 (BEAS-2B)를 3×10⁶ cells가 되도록 배지에 넣고 150 mm 야노에 24 시간 배양 후 각각의 세포에 빈여지와 355 ug의 공기중 나노입자로 각 24 시간동안 처리하였다. 세포를 1X PBS, 1/2 PBS, 1/10 PBS로 세척하고 스크래퍼를 이용하여 세포를 수거 후 4, 15,000 rpm에서 15 분 동안 원심분리하였다. 분리된 세포에 7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 100 mM DTT가 포함되어 있는 rehydration 용액을 넣고 초음파 분쇄기를 이용하여 세포 혼합액을 파쇄하고 4, 15,000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 상층액만 얻었다. 얻은 상층액에 대한 단백질의 정량은 표준 단백질로 BSA (bovine serum albumin)를 사용하여 Bio-rad사의 protein assay 시약 200 와 BSA를 0-60 mg/ml의 농도로 반응시킨 후 15 분 후에 595 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 작성 후 시료를 동일한 조건으로 측정하여 단백질 농도를 결정하였다.

5. SDS-PAGE 전기영동

각 시료는 단백질 정량 후에 0.06 M Tris-HCl (pH 6.8), 2% SDS, 14.4 mM β-머캡토에탄올(mercaptoethanol), 25% 글리세롤(glycerol), 0.1% 브로모페놀 블루(bromophenol blue)가 들어있는 샘플 버퍼(sample buffer)와 잘 섞은 후 물에서 중탕하여 5 분간 가열한 후 단백질을 완전히 변성시켰다. 시료와 표준 단백질 시료를 5% 아크릴아마이드로 된 패스트(fast) 겔과 스태킹(stacking) 겔 그리고 10%로 된 세퍼레이팅(separating) 겔을 포함하는 평판 겔에 주입하여 전기이동을 수행하였으며 전개 용매는 192 mM glycine과 10% SDS (w/v)가 포함되어 있는 25 mM Tris-HCl 완충용액 (pH 8.3)을 사용하였다.

6. 웨스턴 블롯에 의한 분석

나노입자를 처리한 세포에 용균 버퍼 [50 mM Tris, 1% PMSF, 1% Triton X-100]를 1 ml씩 첨가하여 세포를 융해하였다. 융해된 액은 원심 분리하여 세포 부산물을 제거한 후 상등액을 취해 단백질 정량을 실시하였다. 그 후 동일양의 각 단백질 시료를 시료용 완충용액 [0.05 M Tris-Cl 완충용액 (pH 6.8). 2% SDS, 5% β-머캡토에탄올, 10% 글리세롤, 0.001% 브로모페놀 블루]과 혼합한 후 100에서 5 분간 가열하여 단백질을 완전히 변성시켰다. 시료와 표준단백질을 5% 아크릴아마이드로 된 스태킹 겔과 10% 아크릴아마이드로 된 러닝 겔에서 분리하였다. 분리된 단백질을 블랏팅 키트에 트랜스퍼 버퍼(transfer buffer) (192 mM glycine, 25 mM Tris, 20% methanol)를 채운 상태에서 PVDF 멤브레인으로 1 시간 동안 250 mA로 이동시켰다. 5% 탈지용액에 넣어 상온에서 2 시간 동안 반응시킨 후 TBST로 씻은 다음 케라틴 7, 케라틴 17, 그리고 아넥신 A2 로 4에서 하루 동안 반응시켰다. TBST로 10 분씩 수 회 세척 후 홀스라디쉬 퍼옥시데이즈 이차항체와 실온에서 1 시간 동안 반응시켰다. TBST로 10 분씩 수회 세척 후 멤브레인을 ECL 용액에서 3 분간 반응시킨 후 X-ray 필름에 노출시켜 시그널을 검출하였다.

7. 이차원 전기영동

7-1. 등전점 전기영동

나노입자가 처리된 세포의 단백질 양이 300 이 되게 하였고, 250 의 리하이드레이션(rehydration) 용액 (7 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% CHAPS, 0.5% 암폴리츠(ampholytes), 100 mM DTT, 0.01% 브로모페놀 블루)을 사용하여 단백질을 녹였다. 250 의 리하이드레이션 용액에 녹아있는 각 조건의 단백질을 IPG 홀더에 주입하였고, 등전점 전기영동을 위하여 단백질이 가진 pH에 따라 이동할 수 있도록 만들어진 13 cm 고정된 드라이 스트립(immobilized dry strip) (pH 3-10 NL, Amer sham Bioscience)를 이용하여 12 시간 동안 리하이드레이션 시켰다. 200 V/200 Vh, 500 V/500 Vh, 1,000 V/1,000 Vh, 8,000 V/13,500 Vh, and 8,000 V/100,000 Vh 조건에서 단백질이 가진 pH에 따라 전기장에서 이동시켰다.

7-2. 평형화

등전점 전기영동이 끝난 스트립은 평형화 완충용액 [6 M 우레아, 0.375 M Tris-HCl (pH 8.8), 2% SDS, 20% 글리세롤, 5 mM 트리부틸포스핀, 2.5% 아크릴아마이드, 0.01% 브로모페놀 블루]에 스트립을 넣고 20 분간 2 회 평형화를 실시하였다.

7-3. 2-차원 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동

12.5% 아크릴아마이드 겔을 만든 후 등전점 전기이동을 완료한 스트립을 겔 위에 얹고, 그 위에 1% 아가로오스 겔로 고정시킨 뒤 이차원 전기이동을 실시하였다. 15 분 동안 겔 당 25 mA씩 전류를 주어 우선 전개시킨 후, 5시간 동안 겔 당 50 mA씩 전류를 주어 단백질을 분자량에 따라 이동시켰다.

7-4. 겔 염색 및 탈색

전개가 끝난 겔을 쿠마시에 블루 G-250 염색 용액 (34% 메탄올, 0.1% 쿠마시에 G-250, 17% 암모늄 설페이트, 3% 인산)을 사용하여 겔에서 분리된 단백질을 확인할 수 있도록 12 시간 이상 염색한 후 5% 아세트산을 사용하여 탈색하였다.

7-5. 겔 이미지 분석

겔 이미지 분석을 위해 UMAX powerLoook 1100으로 염색한 겔을 스캔한 후 Image Master^TM (2D software, Amersham)으로 이미지 분석을 실시하였다. 정확한 분석을 위하여 한 조건 당 3 장의 겔을 분석하였다.

8. MALDI-TOF 분석

단백질 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF (Amersham Bioscience)을 사용하였다. 로크펠러(Rockfeller) 대학에서 제작한 ProFound (Webpro Found.exe)를 사용하여 분석된 펩타이드 질량값들을 데이터베이스를 통해 조사하였고 그 결과를 바탕으로 단백질을 동정하였다. GSNO에 의해 변화된 스팟을 선택한 후 분석을 하기 위해 겔에서 스팟을 오려낸 다음 튜브에 담은 후 30 mM 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide)와 100 mM 소디움 티오설페이트(sodium thiosulfate)를 1 : 1로 섞어 단백질 스팟이 들어있는 튜브에 첨가하였다. 염색시약이 사라질 때까지 방치하고 증류수를 이용하여 염색시약이 완전히 제거될 때까지 세척하였다. 200 mM 암모늄 바이카보네이트(ammonium bicarbonate)에서 20 분 동안 반응시킨 후 증류수로 세척하였다. 겔 조각이 불투명한 흰색이 될 때까지 아세토니트릴로 탈수시킨 후 진공 원심 분리기에 튜브를 넣고 30 분간 겔을 건조하였다. 5-10 ng/ml의 트립신과 암모늄 바이카보네이트를 넣고 37℃에서 12 시간 이상 방치하였다. 이후 5% TCA가 들어있는 H₂O : 아세토니트릴 (50 : 50)용액을 10-20 ml 넣고 펩타이드 절편들을 3 회 반복하여 추출하였다. 추출액을 진공 원심분리기에 넣고 2 시간 동안 건조시킨 후 MALDI-TOF를 이용하여 분석하였다.

9.결과

MOUDI와 나노-MOUDI의 개발로 0.056 um (56nm)이하의 크기를 가진 나노입자와 0.1 um (100nm)이하의 크기를 가진 초미세입자가 서로 선별분리될 수 있게 되었다. 따라서 공기 중 초미세입자는 초미세입자 (PM_{0 .1})뿐만 아니라 나노입자(PM_{0 .056})로 다시 나뉠 수 있다. 본 발명에서는 MOUDI 샘플러를 사용하여 공기중 0.056um 이하의 지름을 가진 PM_{0 .056} 나노 입자를 수집했다. 공기 중 나노 입자의 독성을 이해하기 위해 PM_0.056에 의해 기관지 상피 세포에서 공기 중 나노입자 처리에 의해서 서로 차별적으로 발현되는 단백질을 분석했다. PM_{0 .056}에서 Mn, Zn, Ni, Cu, Pb, Cr 같은 다양한 중금속들이 검출되었다.

도 2에서는 공기 중 나노입자 처리에 의하여 세포의 생존율이 저하됨을 보여준다. 공기 중 나노입자를 세포에 20ug/ml가 되게 처리하였을 때 약 30%의 세포독성을 나타낸 것이다.

도 3는 대조군을 나타낸 것이고 도 4은 13개의 단백질이 공기 중 나노입자인 PM_0.056 처리 후에 발현차이를 보이는 것을 나타낸 것이다. 도 5에서는 차별적 발현 변화를 보이는 단백질을 확대한 것을 나타내었다.

하기 표에 공기 중 나노 입자 처리에 의해 차별적 발현 변화를 보이는 단백질을 나타내었다.

스팟 넘버	단백질 명칭	등록 번호	Mass/pI	Score	Queries matched	발현 변화
1	ATP/GTP binding protein-like 5 isoform 3	NP_001030584	79965/ 8.87	79	9	↘
2	Keratin 7	NP_005547	51354/ 5.40	82	9	↘
3	Keratin 17	NP_000413	48076/ 4.97	78	8	↗
4	Keratin 8	AAA35763	53529/ 5.52	65	11	↗
5	Myosin XVIIIB, isoform CRA_d	EAW59706	272115/6.47	72	15	↗
6	Keratin 18	CAA31377	47305/ 5.27	114	14	↗
7	Similar to Kelch proteins; similar to BAA77027	AAF03529	70112/ 5.78	70	7	↗
8	Annexin A2, isoform CRA_c	EAW77587	32429/ 5.93	151	14	↗
9	MBD1-containing chromatin associated factor 2	AAT66299	75616/ 7.96	76	9	↘
10	Keratin 7	NP_005547	51354/ 5.40	90	8	↘
11	Keratin 1	AF237621_1	65978/ 8.16	243	13	↗
12	Triosephosphate isomerase related human genetic disorders	1HTI_A	26522/ 6.51	82	5	↗
13	Vimentin	AAA61279	53681/5.03	156	7	↗

표 1을 보면 PM0.056 처리에 의하여 사람 기관지 상피세포인 BEAS-2B 세포에서 케라틴 1, 8, 17, 18의 발현증가와 케라틴 7의 발현감소가 일어났다. 미오신 XVIIIB, 아넥신 A2, 켈치 단백질 유사 단백질; BAA77027 유사 단백질, TPI(3탄당인산 이성질화효소), 비멘틴의 발현은 PM_{0 .056}에 의해 발현이 증가하였다. MBD1, ATP/GTP 바인딩 단백질 유사 5 이소폼 3는 발현이 감소하였다.

도 6은 항체를 사용한 웨스턴 블롯을 통해서 케라틴 17 및 아넥신 A2가 나노입자처리에 의해 증가함을 재확인한 결과이다. 케라틴 7은 나노입자 처리에 의하여 감소함을 알 수 있다. 이러한 결과는 단백체학 기술을 사용한 마커 발굴 방법이 웨스턴 블럿에 의하여 검정됨을 보여주는 결과이다

본 연구결과는 PM_{0 .056}의 노출에 따른 단백질 발현의 차이를 밝힌 첫 번째 단백체 연구이다. 본 연구에서 확인된 13개 스팟으로 나타난 12종의 단백질은 공기 중 나노입자의 잠재적인 독성을 나타내는 바이오마커 후보로 이용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

1. 다음의 단백질을 포함하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물:
   (1) ATP/GTP 결합 단백질 유사 5 이소폼 3(ATP/GTP binding protein-like 5 isoform 3, Genbank 등록 번호 NP_001030584);
   (5) 미오신 XVIIIB, 이소폼 CRA_d(Myosin XVIIIB, isoform CRA_d, Genbank 등록 번호 EAW59706);
   (7) 켈치 단백질 유사 단백질; BAA77027 유사 단백질(Similar to Kelch proteins; similar to BAA77027, Genbank 등록 번호 AAF03529);
   (9) MBD1-포함 크로마틴 결합 팩터 2(MBD1-containing chromatin associated factor 2, Genbank 등록 번호 AAT66299);
   (11) 인간 유전적 이상과 관련된 트리오세포스페이트 이소머라제(Triosephosphate isomerase related human genetic disorders, Genbank 등록 번호 1HTI_A); 및
   (12) 비멘틴(Vimentin, Genbank 등록 번호 AAA61279).
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은
   (2) 케라틴 7(Keratin 7, Genbank 등록 번호 NP_005547);
   (3) 케라틴 17(Keratin 17, Genbank 등록 번호 NP_000413);
   (4) 케라틴 8(Keratin 8, Genbank 등록 번호 AAA35763);
   (6) 케라틴 18(Keratin 18, Genbank 등록 번호 CAA31377);
   (8) 아넥신 A2, 이소폼 CRA_c(Annexin A2, isoform CRA_c, Genbank 등록 번호 EAW77587);및
   (10) 케라틴 1(Keratin 1, Genbank 등록 번호 AF237621_1)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 바이오 마커 조성물.
   
3. 다음의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 키트:
   (1) ATP/GTP 결합 단백질 유사 5 이소폼 3(ATP/GTP binding protein-like 5 isoform 3, Genbank 등록 번호 NP_001030584);
   (5) 미오신 XVIIIB, 이소폼 CRA_d(Myosin XVIIIB, isoform CRA_d, Genbank 등록 번호 EAW59706);
   (7) 켈치 단백질 유사 단백질; BAA77027 유사 단백질(Similar to Kelch proteins; similar to BAA77027, Genbank 등록 번호 AAF03529);
   (9) MBD1-포함 크로마틴 결합 팩터 2(MBD1-containing chromatin associated factor 2, Genbank 등록 번호 AAT66299);
   (11) 인간 유전적 이상과 관련된 트리오세포스페이트 이소머라제(Triosephosphate isomerase related human genetic disorders, Genbank 등록 번호 1HTI_A); 및
   (12) 비멘틴(Vimentin, Genbank 등록 번호 AAA61279).
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 단백질은
   (2) 케라틴 7(Keratin 7, Genbank 등록 번호 NP_005547);
   (3) 케라틴 17(Keratin 17, Genbank 등록 번호 NP_000413);
   (4) 케라틴 8(Keratin 8, Genbank 등록 번호 AAA35763);
   (6) 케라틴 18(Keratin 18, Genbank 등록 번호 CAA31377);
   (8) 아넥신 A2, 이소폼 CRA_c(Annexin A2, isoform CRA_c, Genbank 등록 번호 EAW77587);및
   (10) 케라틴 1(Keratin 1, Genbank 등록 번호 AF237621_1)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 공기 중 나노 입자 노출 여부 진단용 키트.
   
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